CN101668539A - 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系 - Google Patents

用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系 Download PDF

Info

Publication number
CN101668539A
CN101668539A CN200880013257A CN200880013257A CN101668539A CN 101668539 A CN101668539 A CN 101668539A CN 200880013257 A CN200880013257 A CN 200880013257A CN 200880013257 A CN200880013257 A CN 200880013257A CN 101668539 A CN101668539 A CN 101668539A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
virus
duck
culture medium
posterity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200880013257A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101668539B (zh
Inventor
F·格埃纳克
K·莫罗
M·埃斯诺
M·梅赫泰利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vivalis SA
Original Assignee
Vivalis SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vivalis SA filed Critical Vivalis SA
Publication of CN101668539A publication Critical patent/CN101668539A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101668539B publication Critical patent/CN101668539B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/10—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • C12N15/8636—Vaccina virus vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18451—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本发明涉及开发和生产病毒疫苗。特别地，本发明涉及病毒载体和疫苗的工业生产的领域，更特别地涉及禽胚胎干细胞，优选为源自鸭胚胎干细胞的EBx细胞系在生产病毒载体和病毒之中的用途。本发明特别用于防止人类和动物病毒感染的病毒疫苗的工业生产。

Description

用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
技术领域
本发明涉及发展和生产病毒疫苗。特别地，本发明涉及病毒载体和疫苗的工业生产的领域，更特别地涉及源自不含禽类内源逆转录病毒的胚胎干细胞的鸭细胞系在生产病毒载体和病毒之中的用途。本发明特别用于防止人类和动物病毒感染的病毒疫苗的工业生产。
背景技术
疫苗有效地减少并防止由于很多病毒感染引起的死亡和疾病，例如流感、麻疹、腮腺炎、天花、黄热病。
现在很多病毒疫苗是从含胚的鸡蛋或从鸡胚胎中分离的原代鸡胚胎成纤维细胞产生的。但是，疫苗生产有时无意中被外来的试剂所污染而变得复杂，所述试剂可源自用于繁殖疫苗株的禽类细胞底物。确实在鸡细胞来源的活的、减毒的疫苗中发现了逆转录酶(RT)活性，这指示逆转录病毒的存在，所述疫苗包括欧洲和美国生产者为黄热病、麻疹和腮腺炎生产的那些疫苗，(Hussain等人，2003，J.Virol 77：1105-1111；Johnson et Heneine，2001，J.Virol.，75：3605-3612)。在那些疫苗中对RT活性来源的研究发现了含有来自内源性禽白血病病毒(ALV-E)和内源性禽病毒(EAV)的RNA颗粒的证据(Johnson et Heneine，2001，J.Virol 75：3605-3612；Tsang等人，1999，J.Virol 73：5843-5851；Weissmahr等人，1997，J.Virol71：3005-3012)。
ALV-E和EAV均为存在于鸡种系的内源性逆转录病毒家族的成员。ALV-E是从可遗传的前病毒元件ev位点表达而来。基于其包膜(envelope)序列，ALV-E为从ALV亚组A至D和J(其为外源获得的感染)分化而来。虽然外源性ALV引起感染的鸡中几种肿瘤性(neoplastic)疾病，例如心肌炎和骨骼石化症，但是人们并不知道ALV-E对鸡是病原性的。ALV-E感染没有致癌可能，这可能是由于在内源性长末端重复序列(LTR)中缺少病毒癌基因和增强子活性。已经在白色来亨鸡(White Leghom Chicken)中鉴定了20个以上的不同ev位点(ev-1至ev-22)。ev位点根据发现的顺序命名，并根据其表达的基因产物和其产生感染性颗粒的能力来进行表型分类。ev位点赋予的ALV-E表型从结构或酶学上的完全性感染性颗粒到结构或酶学上(RT-)的缺陷以致无可检测到的病毒蛋白表达。大多数ev位点为结构上不完整的，因此不编码产生感染性病毒颗粒必需的所有序列。已经通过育种获得了对ALV-E呈抗性的鸡的品系，命名为ev-0。品系-0的鸡缺少ev位点(即ev-0)但是在基因组品系0的鸡中存在EAV前病毒序列(Dunwiddie和Faras，1985，Proc Natl.Acad.Sci USA，82：5097-5101)。
对EAV家族知之甚少，其与ALV家族不同，但是相关。每个鸡基因组中至少存在50个拷贝的EAV元件。但是，已知的EAV序列没有一个代表全长和完整的逆转录病毒基因组，目前也没有鉴定出感染性EAV分离体。但是已经表明EAV在源自禽属，原鸡属(Gallus)的胚胎细胞中高度表达。Weissmahr等人(1997，J.Virol71：3005-3012)表明来自EAV内源性逆转录病毒家族的颗粒最有可能与培养的鸡胚胎成纤维细胞上清中发现的大部分颗粒相关的RT活性有关。
无意中传播的风险对于活的减毒病毒疫苗来说是特别高的，因为它们不能进行灭活程序，其大部分被注射到人体，因此越过了非特异性免疫保护机制。因此，为了确保用于动物和人类的疫苗的安全，现在已经测试用于疫苗生产的细胞底物中是否存在可在免疫过程中传入动物或人类宿主的有复制能力的逆转录病毒(WHO technical reports Series，1994)。
另一个方面，含胚的鸡蛋和原代鸡胚胎成纤维细胞生产系统与几个严重的限制相关，包括：
-耗时的、繁琐的、耗费资源的生产过程，对于每个个体生产活动该生产过程需要获得大量鸡蛋或CEF并进行质量控制；
-在很多情况下需要昂贵的特异性无病原(SPF)鸡胚；
-在供体鸡群中发生流行病感染的情况下蛋供应不足的风险；
-与使用源自免除BSE国家的牛血清相关的通货膨胀成本；
-不能够使用蛋用于繁殖对鸡来说高度剧毒和致命的病毒。
因此迫切需要改善现在的基于蛋或鸡胚胎成纤维细胞的病毒疫苗生产技术。细胞培养平台的发展作为蛋和CEF生产系统的替代品来生产病毒疫苗可能是克服目前疫苗生产瓶颈和时间限制的最迅速和有前景的解决方法。此外，使用细胞系用于生产病毒疫苗而不是使用蛋或CEF平台，将具有以下与疫苗安全相关的额外的优点：在疫苗制剂中不存在抗生素添加剂；不需要毒性防腐剂(例如硫柳汞(thiomersal))；内毒素水平降低，无蛋过敏问题；在无蛋白和血清的培养基中通过细胞培养无外来试剂/BSE的风险；病毒疫苗制备物的较高的纯度。
用于制备病毒疫苗的细胞系的例子为：MDCK(源自Madin-Darby狗的肾脏的细胞)，PerC6(源自人胚胎视网膜细胞的细胞，经过插入来自人5型腺病毒的E1基因的遗传修饰)由CRUCELL(Netherland)所研发)，VERO(源自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的肾脏上皮细胞的细胞，在Chiba University in Chiba，Japan分离)，BHK21(来自幼仓鼠肾脏细胞的无限增殖的细胞)。这些可用的细胞系中没有一个满足所有的医学、规章制度和工业要求。例如，这些细胞系多数为致瘤性的，关于使用致瘤性细胞用于人类疫苗生产有重要的规章制度考虑；因此，规章制度部门不愿意允许致瘤性细胞底物用于生产大量疫苗。另外，这些细胞系中有一些为锚定依赖性的，这给工业大规模生产疫苗带来了严重障碍。
因此需要开发锚定非依赖性的细胞系，其无逆转录病毒的复制能力，为非致瘤性的且可适用于工业，易于感染众多病毒。这就是本发明的目的。
因此本发明人利用其在禽类生物学和禽类胚胎干(ES)细胞中的专业知识研发了新型的稳定的鸭细胞系，其能够有效地复制众多人类和兽类疫苗和疫苗候选者。通过修改私人拥有的方法(参见WO 03/076601和WO 05/007840)，本发明人能够产生源自鸭ES细胞的一系列清楚鉴定和记录的鸭细胞系(即
Figure G2008800132573D00031
细胞)，其中没有遗传、化学或病毒永生化的步骤，其在培养物中不产生有复制能力的逆转录病毒。
发明内容
本发明提供了一种获得源自禽胚胎干(ES)细胞的持续的双倍体禽细胞系即EBx的方法，其中所述禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。
本发明所述细胞系为“持续的”，因为其具有在体外培养一段延长的时间的特性。优选地，本发明所述细胞能够增殖至少50代，至少75代，至少100代，至少125代，至少150代，至少175代，至少200代，至少250代。250代不构成时间限制因为所获得的细胞仍然是活的且仍然能够进行进一步传代。不被理论所限制，假定本发明所述细胞能够“持续地”培养只要细胞仍然表达端粒酶。确实，假设本发明所述禽细胞中的高水平端粒酶活性对遗传稳定性(即本发明所述禽细胞为双倍体)和持续性细胞生长负责。
“传代”意思是细胞移植从一个培养器皿中转移到另一个，其中有或没有稀释。应该理解在细胞从一个培养器皿中转移到另一个的任何时候，可能损失一部分细胞，因此，无论是否主动进行，可能会发生细胞的稀释。这个术语与“亚培养”是同义词。传代次数为培养中的细胞(不论是悬浮生长还是粘附生长)被亚培养或转移至新器皿中的次数。这个术语与群体加倍或世代不是同义词，群体加倍或世代是指细胞群体复制一次所需的时间；也就是说，大约为群体中每个细胞复制的时间。例如，本发明步骤a)中的禽类ES细胞具有约＞40小时的群体加倍时间(PDT)。本发明所述禽类EBx细胞具有约＜30小时的PDT；通常对于
Figure G2008800132573D00032
细胞，每三个世代传代一次。
“双倍体”是指本发明所述细胞每个染色体具有两个拷贝(2n)，通常一个来自母代一个来自父代。
本发明所述禽细胞系为持续的和双倍体的(即遗传稳定的)，这个事实构成了显著的和独特的特征，因为这些术语经常为反面词语。因此，通过化学、物理(U.V辐射，X-射线或伽马辐射等)获得的或通过遗传修饰(病毒转化、癌基因过表达)而获得的癌细胞和/或永生化细胞为持续的细胞，因为它们可以在培养中无限复制，但它们不是遗传稳定的，因为它们表现出多倍体染核型。另一个方面，原代细胞例如鸡胚胎成纤维细胞、MRC5、WI38，这些为非转化细胞，不是持续的，因为它们在几代之后具有有限的寿命，但它们是遗传稳定的(即双倍体)细胞。
在本发明中，术语“细胞系”和“细胞”将不加区分地使用。
术语“禽类”、“鸟类(bird)”、“鸟类(aves)”或“鸟类(ava)”在本文中具有相同的意义，将不加区分地使用。“鸟类”是指分类学上鸟纲生物的任何种、亚种或种族。在优选的具体实施方式中，“鸟类”是指分类学目的任何动物：
-“雁形目(Anseriforme)”(即鸭、鹅、天鹅和同类)。雁形目中含有三个家族的约150种鸟类：叫鸭科(Anhimidae(即叫鸭))、鹊雁科(Anseranatidae(鹊鹅))和鸭科(Anatidae)，包括超过140种水鸟，其中包括鸭、鹅、天鹅。该目中的所有物种是非常适合在水面上水栖生存的。所有这些物种都有适合游泳的蹼足(虽然有些物种后来变得主要在陆地上生存)。
-“鸡形目(Galliforme)”(即鸡、鹌鹑、火鸡、雉和同类)。鸡形目是含有鸡、火鸡、鹌鹑和雉的鸟类的目。全世界发现约256个物种。
-“鸽形目(Columbiforme)”(即鸽和同类)。鸟目鸽形目包括非常广的鸽子和家鸽。
在本发明中，术语“内源性逆转录病毒的颗粒”或“内源性逆转录病毒颗粒”为不加区分使用的术语，其意思是由存在于一些禽类细胞基因组中的ALV-E或EAV前病毒序列所编码和/或所表达的逆转录病毒颗粒或逆转录病毒。已知在鸟类中，ALV-E前病毒序列存在于家鸡(除了品系-0的鸡)、红色原鸡(red jungle fowl)和环颈雉(Ringneck Pheasant)的基因组之中。已知在鸟类中，EAV前病毒序列存在于所有的原鸡属中，包括家鸡、品系-0的鸡、红色原鸡、绿色原鸡、灰色原鸡、锡兰原鸡(ceylonese jungle fowl)和同类)(参见Resnick等人，1990，J.Virol.，64：4640-4653)。
根据优选的具体实施方式，本发明所述的鸟选自在基因组中不包含ALV-E和EAV前病毒序列的鸟类。本领域技术人员能够确定在鸟类基因组中是否存在ALV-E和EAV序列(Johnson和Heneine，2001；Weissmahr等人，1996)。优选地，鸟类选自雁形目(即鸭、鹅、天鹅)、火鸡、鹌鹑、日本鹌鹑、珍珠鸡(Guinea Fowl)、孔雀。因此，源自这些鸟类的细胞不产生有复制能力的内源性ALV-E和/或EAV颗粒。在优选的具体实施方式中，本发明所述鸟选自鸭、鹅、天鹅、火鸡、鹌鹑、日本鹌鹑、珍珠鸡或孔雀。根据更优选的具体实施方式，鸟是鸭，更优选为北京鸭(Pekin duck)或番鸭(Muscovy duck)。根据更优选的具体实施方式，鸟是北京鸭。因此，本发明提供了一种获得源自胚胎干(ES)细胞的持续的双倍体鸭细胞系的方法，其中所述鸭细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。
根据第二个优选的具体实施方式，本发明所述鸟选自在基因组中不包含完整ALV-E前病毒序列但是最终包含EAV前病毒序列的鸟类。本领域技术人员能够确定在鸟类基因组中是否存在部分的或完全的ALV-E和EAV序列(Johnson和Heneine，2001)。已经通过育种选择了几个不含有完全ALV-E前病毒序列(即ev-0品系)的鸡品系，因此其不产生感染性ALV-E逆转录病毒颗粒，例如：
-East Lansing USDA家禽贮存的品系0家鸡(ELL-0品系)。East Lansing品系0鸡不含与ALV相关的任何内源性病毒(ev)位点(Dunwiddie和Faras，1985)。
-来自lnstitut National de Ia Recherche Agronomique(Domaine de Magneraud，Surgeres，France)的品系DE和PE11。
因此，源自ev-0鸟类的细胞不产生有复制能力的内源性ALV-E颗粒。根据优选的具体实施方式，鸟类为ev-0家鸡(原鸡属家鸡亚种)，优选选自ELL-0、DE或PE11。
通常，ev-0鸡仍然含有EAV前病毒序列但是到目前为止没有鉴定出感染性EAV分离体。因此，本发明提供了一种获得源自ev-0鸡品系的胚胎干(ES)细胞的持续的双倍体鸡细胞系的方法，其中所述ev-0鸡细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。
根据第三个具体实施方式，本发明所述鸟选自在基因组中包含完整和/或不完整ALV-E和EAV前病毒序列但是不能产生有复制能力的ALV-E和EAV逆转录病毒颗粒的鸟类。本领域技术人员能够确定是否从鸟细胞中产生了ALV-E和/或EAV感染性和/或非感染性逆转录病毒颗粒(Johnson和Heneine，2001；Weissmahr等人，1996)。优选地，鸟类选自特异性无病原(SPF)鸡，优选为Valo品系(Lohman)或品系22(SPAFAS)。
“有复制能力的”意思是内源性逆转录病毒颗粒为感染性的，也就是说这样的逆转录病毒颗粒能够感染本发明所述禽类细胞并在其中复制。
建立本发明所述的持续的双倍体禽细胞系即
Figure G2008800132573D00051
的方法包括两个步骤：
a)在培养基中分离、培养并扩大来自鸟类的胚胎干细胞，所述鸟类不含有那些易于产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒的完整内源性前病毒序列或其片段，更特异地是不含有EAV和/或ALV-E前病毒序列或其片段，所述培养基为完全培养基，其包含所有的允许细胞生长的因子，且存在饲养层，并补充动物血清；可选地，所述完全培养基可包含添加物例如另外的氨基酸(即谷氨酰胺、非必需氨基酸等)、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、维生素、非动物来源的蛋白水解物(即酵母自溶液、植物水解产物(大豆、小麦等))；
b)通过改变培养基进行传代，以完全除去所述因子、所述饲养层和所述血清，和可选的所述添加物，然后获得能够在不含外源性生长因子、饲养层和动物血清的基本培养基中增殖很长一段时间的粘附或悬浮禽类细胞系即
Figure G2008800132573D00052
其不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。
建立细胞系的过程中步骤b)中为了逐渐或全部除去生长因子、血清和饲养层而对培养基的修改可同时、相继或分别进行。去除培养基中的物质可通过下列顺序进行：
-饲养层/血清/生长因子；
-饲养层/生长因子/血清；
-血清/生长因子/饲养层；
-血清/饲养层/生长因子；
-生长因子/血清/饲养层；
-生长因子/饲养层/血清。
在优选的具体实施方式中，去除的顺序为生长因子/饲养层/血清。在优选的具体实施方式中，除去添加物例如丙酮酸钠、非必需氨基酸(NNEA)、维生素、酵母自溶液是在除去饲养层之后和除去血清之前进行的。优选地，除去酵母自溶液是在除去丙酮酸钠、NNEA、维生素之后进行的。
根据优选的具体实施方式，本发明步骤a)所述的禽类胚胎干细胞选自产卵时的禽类胚胎，也就是说当产蛋时。根据Sellier等人(2006，J.Appl.Poult.Res.，15：219-228)，产卵对应于根据Eyal-Giladi分类(EYAL-G I LAD I′s classification：EYAL-GILADI和KOCHAN，1976，《From cleavage to primitive streack formation：acomplementary normal table and a new look at the first stages of the development in thechick》.″General Morphology″Dev.Biol.49：321-337)的下列发育时期：
-番鸭(也称为巴巴里鸭(Barbari duck)：VII期
-珍珠鸡：VII期-VIII期
-火鸡：VII-VIII期
-北京鸭：VIII期
-鸡：X期
-日本鹌鹑：XI期
-鹅：XI期。
优选地，步骤a)的鸭胚胎干(ES)细胞通过分离处于Eyal-Giladi分类的约VIII期(产卵期)的北京鸭胚胎获得。如果在产卵期收集的产下的蛋没有发育至足以收集胚胎干细胞，可进一步孵育所产的蛋，从几个小时(过夜)至1至2天以使胚胎成熟。根据第二个具体实施方式，步骤a)的鸭胚胎干(ES)细胞来自番鸭。在产卵期，番鸭没有足够成熟因为其处于约VII期，因此，将蛋孵育过夜以使蛋成熟至接近Eyal-Giladi分类的VIII期至X期。
优选地，步骤a)的鸡胚胎干(ES)细胞，优选为来自ev-0鸡品系，是通过分离处于约Eyal-Giladi分类的X期(产卵期)的胚胎而获得的。
或者，根据本发明步骤a)所述的禽胚胎干细胞在产卵前的胚胎中收集。在产卵前遇到的主要问题是蛋需要以手术方式从母鸡中除掉，每个胚胎的ES细胞数目不那么重要。此外，在禽类胚胎发育的非常早的时期，ES细胞没有完全个体化，这使得体外培养ES细胞存在困难。本领域技术人员能够确定产蛋前的时间表以允许收集禽ES细胞。
或者，根据本发明步骤a)所述的禽胚胎干细胞可在产卵后直至孵化时从禽胚胎中收集。但是，禽胚胎干细胞将逐步进入分化以产生分化的组织；因此，优选为在产卵后不太长时间内收集禽ES。本领域技术人员能够确定产卵后的时间表以允许收集禽胚胎干细胞。
根据另一具体实施方式，步骤a)的细胞是富含原生殖细胞(PGC)的胚胎干细胞群。更优选地，步骤a)的禽类ES细胞是纯化的PGC细胞。在禽类物种中，原生殖细胞起源于胚层的中心区(Ginsburg和Eyal-Giladi，1987 Development 101(2)：209-19；Karagenc等人，1996 Dev Genet 19(4)：290-301；Petitte等人，1997Poultry Sci.76(8)：1084-92)。然后它们移至前端的胚外位点，生发新月(germinalcrescent)直到被处于胚胎发育的2.5至5天之间的脉管系统收集到达生殖脊。这些细胞定居于生殖嵴并最终分化成为卵母细胞或精母细胞(Nieuwkoop和Sutasurya，1979.The Migration of the primordial germ cells.In：Primordial germ cell in Chordates.London：Cambridge University Press p113-127)。从供体禽类胚胎分离PGC的方法已见于文献并能被本领域技术人员容易地进行(见如公布日为1993年9月7日，公布号为05-227947的JP924997；Chang等人，1992.Cell Biol.Int.19(2)：143-149；Naito等人，1994 Mol.Reprod.Dev.39：153-161；Yasuda等人，1992.J.Reprod.Fert.96：521-528；Chang等人，1992 Cell Biol.Int.Reporter 16(9)：853-857)。根据具体实施方式，PGC细胞是从处于Hamburger和Hamilton分类(Hamburger&Hamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo.J.Morphol.88：49-92)的12-14期的鸡胚背侧主动脉收集的胚胎血液中收集的。在另一优选具体实施方式中，PGC是从生发新月通过机械解剖鸡胚而收集的或从生殖腺收集的。然而，正如上文讨论，其他分离PGC的方法是已知的并可以选择性使用。
这些禽类胚胎干细胞是通过在39℃培养物中介于48至72小时的缓慢双倍时间鉴定的。
不被理论所限，逐步除去生长因子、饲养层、添加物和血清后确定的禽类ES细胞的细胞培养条件允许适应并选择那些保持了ES细胞大多数需要的特性(核型稳定性、无限增殖、ES记号的表达)的细胞，但是还表现出工业上受欢迎的特性，例如在无血清培养基中以高细胞密度悬浮生长。端粒酶构成的最重要的ES记号之一。由于在细胞传代中持续并保持端粒酶表达，
Figure G2008800132573D00071
细胞为持续的(即永生的)但另外是遗传稳定的(即双倍体的)。
更特别地，本发明提供了一种获得源自ES细胞的持续的双倍体禽细胞系的方法，其中所述禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在对应于Eyal-Giladi分类(EYAL-G I LAD I′s classification：EYAL-GILADI和KOCHAN，1976，《From cleavage to primitive streack formation：a complementarynormal table and a new look at the first stages of the development in the chick》.″General Morphology″Dev.Biol.49：321-337)的约VI期和至孵化前，优选在约产卵期，分离鸟胚胎，优选从鸭或ev-0鸡中分离鸟类胚胎，其中所述鸟类的基因组中不含有易于产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒的内源性前病毒序列；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎而获得的禽胚胎干(ES)细胞，所述培养基添加以下物质：
-胰岛素生长因子(IGF-1)和睫状神经营养因子(CNTF)；
-动物血清；和
-可选地，选自下列的生长因子：白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)和成纤维细胞生长因子(FGF)；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于一层饲养细胞上并继续培养ES细胞持续至少一次传代；
d)可选地，在1至约15优选为3至约15次传代的几个传代范围内，从培养基中除去选自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有的生长因子，并继续培养禽类ES细胞至少一个传代。优选地，从培养基中除去选自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有的生长因子是在一个传代时同时进行的。通常，除去IL-6、IL-6R、SCF、FGF在约10至15个传代内进行；
e)从培养基中除去IGF-1和CNTF，并继续培养禽类ES细胞至少一个传代。优选地，从培养基中除去选自IGF-1和CNTF的生长因子是在一个传代时同时进行的。通常，除去IGF-1和CNTF在约15至25个传代内进行。或者，除去IGF-1和CNTF是逐步在几个传代内减少进行的(至少2个传代且约接近15个传代)；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，并继续培养细胞；
g)可选地，逐步降低培养基中添加物的浓度，以在至少一个传代之后完全除去添加物；和
h)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
i)获得能够在不含生长因子、饲养层，可选不含动物血清和添加物的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性禽类细胞系即
Figure G2008800132573D00081
其中所述持续的双倍体禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
j)可选地，进一步使所述粘附性禽
Figure G2008800132573D00082
细胞系适应悬浮培养条件。使细胞培养物适应为悬浮可都在建立
Figure G2008800132573D00083
细胞的过程中进行。例如，使用源自番鸭胚胎干细胞的鸭
Figure G2008800132573D00084
细胞，细胞在除去饲养层之前被适应于悬浮生长。对于源自北京鸭的鸭
Figure G2008800132573D00085
细胞(EB24、EB26、EB66)，细胞在除去血清之前被适应于悬浮生长。
k)可选地，进一步亚克隆所述禽
Figure G2008800132573D00086
细胞，例如通过限制性稀释。在优选的具体实施方式中，本发明涉及一种获得源自禽胚胎干(ES)细胞的持续的双倍体禽细胞系即
Figure G2008800132573D00091
的方法，其中所述禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在约产卵期发育期分离鸟胚胎，其中所述鸟类的基因组中不含有易于产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒的内源性前病毒序列；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的禽胚胎干(ES)细胞，所述培养基至少添加以下物质：
-胰岛素生长因子(IGF-1)和睫状神经营养因子(CNTF)；
-哺乳动物血清例如胎牛血清；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于一层饲养细胞上并继续培养ES细胞持续至少一个传代；
e)从培养基中除去IGF-1和CNTF，并继续培养细胞至少一个传代；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，并继续培养细胞；
g)逐步降低培养基中所述哺乳动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去哺乳动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层和哺乳动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性禽类
Figure G2008800132573D00092
细胞系，其中所述持续的双倍体禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
i)可选地，进一步使粘附性禽
Figure G2008800132573D00093
细胞系适应悬浮培养条件，优选为通过促进作为悬浮物的生长，更优选为将通过步骤h)中获得的粘附性禽
Figure G2008800132573D00094
细胞系转移至比最初的支持物具有较小粘附特性的另一个支持物(即例如超低粘附性支持物)。
当进行使粘附性禽
Figure G2008800132573D00095
细胞系适应悬浮培养条件的步骤j)时，该步骤可在另一个优选的具体实施方式中在步骤g)的逐步降低培养基中哺乳动物血清的浓度之前进行。
在另一个优选的具体实施方式中，用于获得本发明所述持续的双倍体禽细胞系的方法的步骤b)中的基础培养基进一步补充选自以下的生长因子：白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)和成纤维细胞生长因子(FGF)，且所述的方法进一步包括步骤d)：
d)可选地，从培养基中除去选自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有生长因子，并继续培养ES细胞至少一个传代。
在更加优选的具体实施方式中，当进行步骤d)时，步骤e)的从培养基中除去IGF-1和CNTF的步骤e)是在步骤d)的从培养基中除去选自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有生长因子之后进行。
根据本发明，“基础培养基”是指含有经典培养基配方的培养基，其本身至少使细胞存活和(甚至更好)使细胞生长。基础培养基的例子有BME(基础Eagle培养基)、MEM(最简Eagle培养基)、培养基199、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、GMEM(Glasgow改良Eagle培养基)、DMEM-HamF12、Ham-F12和Ham-F10、Iscove改良Dulbecco培养基、MacCoy 5A培养基、RPMI 1640、GTM3。基础培养基包含无机盐(例如：CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4等)、氨基酸、维生素(硫胺素、核黄素、叶酸、D-泛酸钙等)和其他成分如葡萄糖、β-巯基-乙醇、丙酮酸钠。优选的基础培养基是合成培养基。表1给出了DMEM/HAM F12的成分：
表1：DMEM-HAM F12配方(mg/l)
无机盐
无水氯化钙             116.60
硝酸铁(三价)·9H2O     0.05
硫酸铁(二价)·7H2O     0.417
氯化钾                 311.80
硫酸铜(二价)·5H2O     0.0013
氯化镁·6H2O           61.20
无水硫酸镁             48.84
氯化钠                 6996.00
磷酸二氢钠·H2O        62.50
无水磷酸二氢二钠       71.02
硫酸锌·7H2O           0.432
碳酸氢钠               1200.00
氨基酸
L-丙氨酸               4.45
L-精氨酸·HCl          147.50
L-天冬酰胺·H2O        7.50
L-天冬氨酸             6.65
L-胱氨酸·HCl·H2O     31.29
L-半胱氨酸·2HCl       17.56
L-谷氨酸               7.35
E15-813中的L-谷氨酰胺  365.00
甘氨酸                 18.75
L-组氨酸·HCl·H2O     31.48
L-异亮氨酸             54.47
L-亮氨酸               59.05
L-赖氨酸·HCl          91.25
L-蛋氨酸            17.24
L-苯丙氨酸          35.48
L-脯氨酸            17.25
L-丝氨酸            26.25
L-苏氨酸            53.45
L-色氨酸            9.02
L-酪氨酸            38.70
L-缬氨酸            52.85
维生素
D(+)-生物素         0.0035
D-泛酸钙            2.24
氯化胆碱            8.98
叶酸                2.65
肌醇                12.60
烟碱                2.02
吡哆醛·HCl         2.00
吡哆醇·HCl         0.031
核黄素              0.219
硫胺·HCl           2.17
胸腺嘧啶脱氧核苷    0.365
维生素B12           0.68
其它成分
无水D-葡萄糖        3151.00
次黄嘌呤            2.10
DL-68-硫辛酸        0.105
亚油酸              0.042
苯酚红              8.10
腐胺·2HCl          0.081
丙酮酸钠            55.00
另外，本发明所述基础培养基可补充以下添加物：
-0.1至5mM L-谷氨酰胺，优选为2至3mM L-谷氨酰胺；
-0.05至2mM丙酮酸钠，优选为0.1至1mM丙酮酸钠；
-0.1至2.5％非必需氨基酸，优选为约1％非必需氨基酸；
-0.1至2.5％维生素，优选为约1％维生素；
-0.05至5mM β-巯基-乙醇，优选为约0.16mM β-巯基-乙醇；
-非动物来源的蛋白水解产物。
为了建立本发明所述鸭
Figure G2008800132573D00121
细胞，优选在基础培养基中补充非动物来源的蛋白水解产物。非动物来源的蛋白水解产物选自细菌胰化蛋白胨、酵母胰化蛋白胨、植物水解产物例如大豆水解产物，或其混合物。在优选的具体实施方式中，非动物来源的蛋白水解产物为酵母水解产物。术语“水解产物”包括大豆蛋白胨或酵母提取物的酶消化产物。水解产物可分别从众多大豆蛋白胨或酵母提取物制备物中获得，其可被进一步用酶消化(例如，使用番木瓜蛋白酶)，和/或通过自我分解、热分解和/或胞浆溶解而形成。水解产物还可从商售渠道获得，例如酵母自溶液(Yeastolate)、Hy-Soy、Hy-Yeast 412和Hi-Yeast 444，来源为例如SAFC BioSciences(旧称JRH)(Lenaxa，KA)，Quest International(Norwich，N.Y.)，OrganoTechnie S.A.(法国)或Deutsche Hefewerke GmbH(德国)。酵母提取物的来源也在WO 98/15614中公开。酵母提取物和大豆水解产物的来源也在WO00/03000中公开。本发明的培养基中所用的水解产物优选为从粗制组分中纯化而来，因为在这个纯化过程中优选除去了干扰有效培养的杂质，从而改善了水解产物的一致性。可通过超离心或Sephadex色谱(例如，使用Sephadex G25或Sephadex G10或同等材料)、离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱或“反相”色谱进行纯化。优选地，使用10kDa阙值的滤器通过超滤进行纯化。这些方法在本领域是已知的。使用这些方法，可收集含有确定分子量的大豆或酵母水解产物的组分。优选地，大豆和酵母水解产物的平均分子量优选为大约220至375道尔顿。优选地，酵母水解产物存在于细胞培养基中。从例如SAFC-BIOSCIENCES(Ref 58902C)中获得的酵母水解产物50X(约200g/l)存在于细胞培养基中，其在培养基中的终浓度为约0.1X至2X，优选为约0.5X至约1X。也可向细胞培养基中加入大豆水解产物。从例如SAFC-BIOSCIENCES(Ref 58903C)中获得的大豆水解产物50X被加入到培养基中，其终浓度为约0.1X至2X，优选为约1X。或者，可向细胞培养基中加入大豆水解产物和酵母水解产物的混合物，如US2004/0077086中所描述。
本发明一个优选的基础培养基为DMEM-HamF12，其补充了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％非必需氨基酸、1％维生素、0.16mMβ-巯基-乙醇和可选的1X酵母水解产物。
“完全培养基”是指补充或未补充的基础培养基，优选是基础合成培养基，其补充至少一种生长因子和动物血清。WO 03/076601、WO 05/007840、EP 787180、US 6,114,168、US 5,340,740、US 6,656,479、US 5,830,510和Pain等人的文章(1996，Development 122：2339-2348)中描述了完全培养基的例子。或者，完全培养基可以是条件培养基，优选BRL条件培养基。说到例子，BRL条件培养基根据本领域公认技术制备，如Smith和Hooper的文章中所描述的技术(1987，Dev.Biol.121：1-9)。BRL细胞可从ATCC保藏号CRL-1442的细胞得到。条件培养基可补充下述外源性生长因子和动物血清。
本文所用的术语“生长因子”是指在基础培养基中对于培养的未分化禽类ES细胞的存活和生长必要的生长因子。可以概括地区分两个生长因子家族：细胞因子和营养因子。细胞因子主要是那些通过与gp130蛋白结合的受体发挥其功能的细胞因子。因此，白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素11、白细胞介素6、白细胞介素6受体、睫状神经营养因子(CNTF)、制瘤素(oncostatin)和心营养素(cardiotrophin)具有相似的作用模式，该作用模式为在受体水平上募集特异性链，并且将特异性链以单体形式或有时是异源二聚体的形式与gp130蛋白结合。营养性因子主要是干细胞因子(SCF)、胰岛素生长因子1(IGF-1)和成纤维细胞生长因子(FGF)，优选碱性FGF(bFGF)或人FGF(hFGF)。
本发明所述完全培养基包含基础培养基优选基础合成培养基，以及至少一种细胞因子，所述细胞因子通过与gp130蛋白和/或至少一种营养因子结合的受体而发挥作用。优选地，本发明所述完全培养基包含基础培养基和至少一种生长因子，选自白血病抑制因子(LIF)、制瘤素、心营养素、胰岛素生长因子1(IGF-1)、睫状神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素11(IL-11)。根据第一个优选具体实施方式，完全培养基为补充了动物血清和至少IGF-1和CNTF的基础培养基。根据第二个优选具体实施方式，完全培养基为补充了动物血清和至少IGF-1、CNTF、IL-6和IL-6R的基础培养基。根据第三个优选具体实施方式，完全培养基为补充了动物血清和至少IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF的基础培养基。根据另一个具体实施方式，完全培养基为包含生长因子(即例如由BRL或STO细胞表达的)和可选补充了至少一种选自LIF、IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF、IL-11的外源性生长因子的条件培养基。基础培养基或条件培养基中生长因子IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF、IL-11的浓度为约0.01至10ng/ml，优选为0.1至5ng/ml，更优选为约1ng/ml。
本发明的培养基可另外包含抗生素，例如庆大霉素、青霉素和链霉素以预防细菌污染。可在ES细胞培养早期传代向培养基中加入抗生素。例如，可向培养基中加入终浓度为10ng/ml的庆大霉素、终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素。在优选的具体实施方式中，在本发明的持续双倍体禽细胞系建立过程的晚期步骤中不向培养基中加入抗生素。
在本发明的禽胚胎干细胞建立过程中，在饲养细胞层上培养细胞。更优选地，饲养细胞是为了培养禽ES细胞而培养的动物细胞或细胞系。或者，饲养细胞可被细胞外基质加结合的生长因子所替代。下述饲养基质是指饲养细胞或细胞外基质。本文所用的饲养基质根据本领域已知过程构建。如上所述，优选饲养基质是预先准备好的。术语“预先准备好的”是指在起源于胚层盘(blastoderm disk)受精禽卵的细胞沉积下来与饲养基质接触之前将饲养基质在培养基中培养一段时间，如足以启动和建立通过饲养基质产生例如生长因子或其他因子的一段时间；通常，在起源于胚层盘受精禽卵的细胞沉积下来与饲养基质接触之前一至两天通过培养饲养基质本身而预先准备好饲养基质。饲养细胞优选包含小鼠成纤维细胞。优选STO成纤维细胞，但原代成纤维原细胞也是适合的。而且本发明就小鼠细胞饲养基质的使用已作过描述，应考虑包含来自其他鼠科物种(如大鼠)；其他哺乳动物物种(如有蹄动物、牛、猪类)；或禽类物种(如鸡形目、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉)的细胞的饲养基质也可使用。在另一具体实施方式中，本发明的饲养细胞可以用表达载体转染使得例如生长因子如禽类SCF在STO细胞中呈组成型表达。因此，“饲养层”产生可溶形式的细胞因子和/或附在细胞膜上形式的细胞因子。因此，本发明的培养过程可选地包含建立单层饲养细胞层。用标准方法使饲养细胞不能进行有丝分裂。例如，使饲养细胞暴露于X或伽马射线中(如4000Rads的伽马射线)或可以用丝裂霉素C处理(如用10μg/ml处理2至3小时)。使细胞不能进行有丝分裂的操作还详细见于美国典型微生物保藏中心(ATCC，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)通常附送细胞的信息中(如STO饲养细胞可从ATCC保藏号1503获得)。单细胞层可选地培养至约80％融合度，优选达到约90％融合度，更优选达到约100％融合度。虽然单层饲养细胞的形态是培养物的优选形态，任何合适的形态应视为包含在本发明的范围之内。因此，例如，多层、单层、簇生、聚集或其他联结或成簇的饲养细胞均应视为包含在本发明的范围之内并尤其视为包含在术语“基质”的含义之内。
本发明的培养基添加动物血清。使用的动物血清优选是胎儿动物血清。优选胎牛血清。而且虽然本发明就胎牛血清的使用已作过描述，应考虑也能使用包含来自其他动物物种(如鸡、马、猪、有蹄动物等)血清的动物血清。动物血清在培养基中的终浓度是约1至25％、优选5％至20％，更优选8％至12％。在优选具体实施方式中，培养基中动物血清的终浓度是约10％。根据优选的具体实施方式，培养基包含约10％胎牛血清。
在第一个优选具体实施方式中，本发明的鸟类选自雁形目，优选为鸭，更优选为北京鸭，再更优选为北京鸭品系M14或GL30。根据第二个优选具体实施方式，本发明的鸟类为番鸭。因此，本发明提供了一种获得源自胚胎干(ES)细胞的持续双倍体鸭细胞系的方法，其中所述鸭细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在产卵期(即产卵)，或稍早或稍迟于产卵期，分离鸭胚胎。可选地，将卵孵育至成熟，通常为孵育过夜(即番鸭)；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的鸭胚胎干(ES)细胞，所述培养基补充以下物质：胰岛素生长因子(IGF-1)、睫状神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)和成纤维细胞生长因子(FGF)和动物血清；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于饲养细胞层上并继续培养鸭ES细胞至少一个传代；
d)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去选自IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、FGF的所有生长因子，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养鸭ES细胞至少一个传代；
f)在一个传代至另一个传代的过程中，逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，优选为在约5至约25个传代后完全除去，并继续培养细胞；
g)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层和可选地不含动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性鸭细胞系即鸭
Figure G2008800132573D00151
其中所述持续的双倍体禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
i)可选地，进一步使粘附性鸭细胞系适应悬浮培养条件。
在过程中除去基础培养基的添加物，优选在步骤f)和g)之间或在步骤g)和h)之间除去基础培养基的添加物。
步骤b)中的动物血清浓度优选为5％至10％。胰岛素生长因子(IGF-1)、睫状神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的浓度优选为约1ng/ml。
本发明还提供了第二个获得源自胚胎干(ES)细胞的持续双倍体鸭细胞系的方法，其中所述鸭细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在产卵期(即产卵)，或稍早或稍迟于产卵期，分离鸭胚胎。可选地，将卵孵育至成熟，通常为孵育过夜(即番鸭)；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的鸭胚胎干(ES)细胞，所述培养基补充以下物质：IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF和FGF和动物血清；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于饲养细胞层上并继续培养鸭ES细胞至少一个传代；
d)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去选自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有生长因子，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养鸭ES细胞至少一个传代；
e)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去生长因子IGF-1和CNTF，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养鸭ES细胞至少一个传代；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，优选为在约5至约25个传代后完全除去，并继续培养细胞；
g)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层和可选地不含动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性鸭细胞系即鸭
Figure G2008800132573D00161
其中所述持续的双倍体禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
i)可选地，进一步使粘附性鸭细胞系适应悬浮培养条件。
在过程中除去基础培养基的添加物，优选在步骤f)和g)之间或在步骤g)和h)之间除去基础培养基的添加物。
步骤b)中的动物血清浓度优选为5％至10％。IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF的浓度优选为约1ng/ml。
本发明提供了第三种获得源自胚胎干(ES)细胞的持续双倍体鸭细胞系的方法，其中所述鸭细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在产卵期(即产卵)，或稍早或稍迟于产卵期，分离鸭胚胎。可选地，将卵孵育至成熟，通常为孵育过夜(即番鸭)；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的鸭胚胎干(ES)细胞，所述培养基补充以下物质：胰岛素生长因子(IGF-1)和睫状神经营养因子(CNTF)和动物血清；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于饲养细胞层上并继续培养鸭ES细胞至少一个传代；
d)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去生长因子IGF-1和CNTF，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养鸭ES细胞至少一个传代；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，优选为在约5至约25个传代后完全除去，并继续培养细胞；除去添加物？
g)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层和可选地不含动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性鸭细胞系即鸭
Figure G2008800132573D00162
其中所述持续的双倍体禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
i)可选地，进一步使粘附性鸭
Figure G2008800132573D00163
细胞系适应悬浮培养条件。
在过程中除去基础培养基的添加物，优选在步骤f)和g)之间或在步骤g)和h)之间除去基础培养基的添加物。
步骤b)中的动物血清浓度优选为5％至10％。IGF-1和CNTF的浓度优选为约1ng/ml。
一旦获得了粘附性或悬浮鸭细胞系，本发明方法还包括另外的步骤，使鸭
Figure G2008800132573D00164
细胞适应于在不含非动物来源的蛋白水解产物例如酵母水解产物的细胞培养基中生长。
优选地，本发明所述鸭
Figure G2008800132573D00171
细胞系通过Q-PERT分析不显示逆转录酶活性。此外，通过将本发明所述鸭
Figure G2008800132573D00172
细胞与有ALV复制能力的细胞例如鹌鹑QT6细胞或鸡DF1细胞进行共同培养的实验证明：鸭
Figure G2008800132573D00173
细胞不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。另外，透射电子显微镜(TEM)分析也证明在鸭
Figure G2008800132573D00174
细胞中不存在有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。优选地，本发明所述鸭
Figure G2008800132573D00175
细胞系选自如下所述的鸭EB24、鸭EB26和鸭EB66。
在另一个优选具体实施方式中，本发明的鸟类选自鸡形目，更优选为鸡，优选为ev-0家鸡(原鸡属家鸡亚种)。因此，本发明提供了一种获得源自胚胎干(ES)细胞的持续双倍体ev-0家鸡细胞系的方法，其中所述ev-0家鸡细胞系不产生有复制能力的内源性ALV-E逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在产卵期(即产卵)，或稍早或稍迟于产卵期，分离ev-0家鸡胚胎；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的ev-0家鸡胚胎干(ES)细胞，所述培养基补充以下物质：IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF和FGF和动物血清；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于饲养细胞层上并继续培养ev-0家鸡ES细胞至少一个传代；
d)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去选自IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有生长因子，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养鸡ES细胞至少一个传代；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，优选为在约5至约25个传代后完全除去，并继续培养细胞；
g)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层和可选地不含动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性ev-0家鸡细胞系即EBx ev-0，其中所述持续的双倍体禽细胞系不产生有复制能力的内源性ALV-E逆转录病毒颗粒；
i)可选地，进一步使粘附性禽细胞系EBx ev-0适应悬浮培养条件。
在过程中除去基础培养基的添加物，优选在步骤f)和g)之间或在步骤g)和h)之间除去基础培养基的添加物。
步骤b)中的动物血清浓度优选为5％至10％。IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF和FGF的浓度优选为约1ng/ml。
本发明还提供了第二种获得源自胚胎干(ES)细胞的持续双倍体ev-0家鸡细胞系的方法，其中所述ev-0家鸡细胞系不产生有复制能力的内源性ALV-E逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在产卵期(即产卵)，或稍早或稍迟于产卵期，分离ev-0家鸡胚胎；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的ev-0家鸡胚胎干(ES)细胞，所述培养基补充以下物质：IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF和FGF和动物血清；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于饲养细胞层上并继续培养ev-0家鸡ES细胞至少一个传代；
d)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去选自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有生长因子，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养鸡ES细胞至少一个传代；
e)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去生长因子IGF-1和CNTF，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养ev-0家鸡ES细胞至少一个传代；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，优选为在约5至约45个传代后完全除去，并继续培养细胞；
g)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层和可选地不含动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性ev-0家鸡细胞系，其中所述持续的双倍体ev-0家鸡细胞系即鸡不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
i)可选地，进一步使粘附性ev-0家鸡细胞系适应悬浮培养条件。
在过程中除去基础培养基的添加物，优选在步骤f)和g)之间或在步骤g)和h)之间除去基础培养基的添加物。
步骤b)中的动物血清浓度优选为5％至10％。IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF和FGF的浓度优选为约1ng/ml。
本发明提供了第三种获得源自胚胎干(ES)细胞的持续双倍体ev-0家鸡细胞系的方法，其中所述ev-0家鸡细胞系不产生有复制能力的内源性ALV-E逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在产卵期(即产卵)，或稍早或稍迟于产卵期，分离ev-0家鸡胚胎；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的ev-0家鸡胚胎干(ES)细胞，所述培养基补充以下物质：IGF-1和CNTF和动物血清；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于饲养细胞层上并继续培养ev-0家鸡ES细胞持续至少一个传代；
d)在1至约15个传代的范围内，从培养基中除去生长因子IGF-1和CNTF，优选为同时在一个传代中除去，并继续培养ev-0家鸡ES细胞至少一个传代；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，优选为在约5至约45个传代后完全除去，并继续培养细胞；
g)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层和可选地不含动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性ev-0家鸡细胞系即鸡ev-0，其中所述持续的双倍体鸡细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
i)可选地，进一步使粘附性ev-0家鸡细胞系适应悬浮培养条件。
在过程除去基础培养基的添加物，优选在步骤f)和g)之间或在步骤g)和h)之间除去基础培养基的添加物。
步骤b)中的动物血清浓度优选为5％至10％。IGF-1和CNTF的浓度优选为约1ng/ml。
在另一个优选的具体实施方式中，本发明所述鸟是由特异性无病原(SPF)禽群中获得的家鸡(原鸡属家鸡亚种)。更优选地，鸡品系为白色来亨鸡。已经筛选了SPF鸡蛋确认其不存在已知的鸡细菌病原体和病毒，包括网状内皮组织增殖病毒(REV)和禽外源性白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-J)。本发明所述SPF蛋可以是来自LOHMANN(Cuxhaven，Germany)的VALO蛋或来自CHARLES RIVER(Spafas)的L22蛋。因此，本发明还提供了获得源自胚胎干(ES)细胞的持续双倍体鸡细胞系的方法，其中所述胚胎干细胞从SPF鸡蛋获得，如用ev-0鸡蛋所描述。优选地，从SPF蛋获得的鸡
Figure G2008800132573D00192
细胞系为EBv13。
本发明所述鸡
Figure G2008800132573D00193
细胞系通过Q-PERT分析可能显示出逆转录酶活性，但是不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。可通过将本发明所述鸡
Figure G2008800132573D00194
ev-0细胞与有ALV复制能力的细胞例如鹌鹑QT6细胞或鸡DF1细胞进行共同培养的实验而证明不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。另外，还可通过TEM证明在鸡ev-0细胞中不存在内源性逆转录病毒颗粒。
鸟的体温通常为约39℃。因此，本发明的方法还可以包括将培养温度降低至37℃的另外步骤以使本发明所述禽细胞系适应于在37℃生长。优选地，温度调整在除去饲养层之后和除去血清之前进行。或者，温度调整在除去血清的步骤之后或使细胞系适应悬浮培养的步骤之后进行。
本发明建立的
Figure G2008800132573D00196
细胞系具有以下特性：在不含外源性生长因子和动物血清且不含饲养细胞的培养基中作为粘附细胞或悬浮细胞生长。可单独使用或联合使用不同的技术使细胞适应悬浮培养，其中：
-将粘附性细胞以高细胞密度植入，稍高于细胞融合度以迫使细胞进入悬浮状；
-将粘附性细胞植入含低浓度动物血清的细胞培养基中；
-将粘附性细胞植入塑料制成的不允许细胞粘附或只允许微弱细胞粘附的细胞培养器皿，例如细菌培养碟或培养板，以及由公司像Corning(组织培养碟和培养板，Ref.3262、3473、3471、3474；培养瓶Ref.3814等)或Sarstedt(培养瓶ref831810502等)所研发的超低粘附培养板；
-将粘附性细胞植入器皿中并摇晃培养(约50rpm)。
Figure G2008800132573D00197
细胞，优选鸭
Figure G2008800132573D00198
和鸡
Figure G2008800132573D00199
ev-0可在体外培养一段相当长的时间。有利地，由本发明的方法所获得的粘附性或锚定非依赖性(即悬浮)
Figure G2008800132573D00201
细胞能够增殖至少50代、至少75代、至少100代、至少125代、至少150代、至少175代、至少200代、至少250代。术语“品系”应理解为能够在体外培养中无限增殖同时在或多或少的程度上保持相同的形态学和表型特征的任何细胞群体。可通过例如限制性稀释从本发明所述细胞中获得克隆。这些克隆是与通过分裂产生这些克隆的细胞在遗传上相同的细胞。
本发明还涉及由本发明的方法所获得的持续的双倍体禽细胞系即
Figure G2008800132573D00203
所述
Figure G2008800132573D00204
为小的、圆的(即直径为约10μM)个体化细胞，其在37℃或39℃时的加倍时间为约30小时或30小时以下。禽
Figure G2008800132573D00205
细胞，优选鸭或鸡
Figure G2008800132573D00207
ev-0，表达具有以下特性的胚胎干细胞表型：
-高细胞核-细胞质比；
-内源性端粒酶活性；
-可选地，它们表达一种或多种另外的ES标记例如碱性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、ENS1标记；
-加倍时间小于本发明方法的步骤a)中的禽ES细胞的加倍时间(在39℃时为48小时至72小时)，其加倍时间在37℃时为约30小时或30小时以下(优选24小时)。
所述细胞不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。
本发明所述禽
Figure G2008800132573D00208
细胞系能够在不含外源性生长因子、血清和/或灭活的饲养层，可选地补充了本领域技术人员通常使用的各种添加物的基础培养基特别是例如SAFC Excell培养基、DMEM、GMEM、DMEM-HamF12或McCoy中无限增殖。添加物的例子为非必需氨基酸、维生素、丙酮酸钠和抗生素。本发明所述鸭
Figure G2008800132573D00209
细胞具有在不补充谷氨酰胺的基础培养基中生长的显著特点。
本发明还涉及一种细胞培养基，其保持多能或多能(pluri-or multipotent)禽胚胎干细胞，优选多能或多能鸭胚胎干(ES)细胞，在培养中的未分化状态。根据优选的具体实施方式，本发明涉及用于鸭胚胎干细胞的细胞培养基，其包含补充了动物血清和补充了至少IGF-1和CNTF的基础培养基。根据第二个优选的具体实施方式，本发明涉及用于鸭胚胎干细胞的细胞培养基，其包含补充了动物血清和补充了至少IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R的基础培养基。根据第三个优选的具体实施方式，本发明涉及用于鸭胚胎干细胞的细胞培养基，其包含补充了动物血清和补充了至少IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF和FGF的基础培养基。所述培养基足够保持所述鸭ES细胞在培养中的未分化状态至少7天，优选至少20天，优选至少100天。所述的本发明的培养基还可以包括可选的至少一种选自白细胞介素-11、心营养素、制瘤素和白血病抑制因子(LIF)的化合物。优选地，所述培养基还包括如前所述的非动物来源的蛋白水解产物；更优选地，其为1X浓度的酵母水解产物。本发明所述禽(优选为鸭)ES细胞的培养基还可包括饲养细胞层。
本发明还提供了持续的鸭ES细胞培养物，其实质上由表达具有以下特性的干细胞表型的未分化的鸭ES细胞组成：
-高细胞核-细胞质比；
-内源性端粒酶活性；
-可选地，鸭ES细胞可表达一种或多种另外的ES标记例如碱性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、ENS1标记；
-加倍时间在37℃或39℃时为约40小时。
所述的本发明的未分化鸭细胞当生长于如前所述的鸭胚胎干细胞细胞培养基中的饲养细胞上时能够保持所述的干细胞表型。所述的未分化鸭细胞可用于产生嵌合或转基因鸭。
因此，本发明还涉及一种获得嵌合鸭的方法，所述方法包括以下步骤：
a)向受体鸭胚胎的胚下腔中引入如上所述的持续的鸭ES细胞培养物；和
b)孵育步骤a)中获得的胚胎直至孵化成小鸭子；
c)选择所述嵌合小鸭子，其包含已经在所述小鸭子中定居的异源细胞。本发明还涉及一种获得遗传修饰的嵌合鸭的方法，所述方法包括以下步骤：
a)向受体鸭胚胎的胚下腔中引入如上所述的遗传修饰的鸭ES细胞；和
b)孵育步骤a)中获得的胚胎直至孵化成小鸭子；
c)选择所述嵌合小鸭子，其包含已经在所述小鸭子中定居的经遗传修饰的异源细胞。
本发明还涉及获得所述嵌合小鸭子的子代的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)使所选的步骤c)中获得的嵌合小鸭子成熟为成年鸟；
b)饲养所述的其中具有异源细胞的成年鸟，从而产生鸟子代；
c)在子代中选择目的鸟。
本发明还包括另外的步骤即表达在所述遗传修饰的鸭ES细胞中包含的表达载体所编码的异源多肽。优选地，异源多肽被运送进入鸭的体液，例如血液、精液、尿液或由经遗传修饰的雌鸭所产生的发育中的禽卵的蛋白中。
本发明所述
Figure G2008800132573D00211
细胞具有以上所述所有的特性，且可用于产生生物制品例如病毒疫苗和重组肽和蛋白。
本发明还提供了一种在本发明所述持续的双倍体禽
Figure G2008800132573D00212
细胞系中复制病毒的方法。更优选地，本发明还提供了一种在本发明所述持续的双倍体禽
Figure G2008800132573D00213
细胞系，优选为鸭或鸡
Figure G2008800132573D00214
细胞系中复制病毒的方法，其包括以下步骤：
-以目的病毒感染禽
Figure G2008800132573D00215
细胞培养物；所述禽
Figure G2008800132573D00216
细胞优选为在不含动物血清的培养基中培养；
-培养经感染的禽
Figure G2008800132573D00217
细胞以复制所述病毒；
-收集细胞培养上清液中和/或所述细胞中的病毒。
根据优选具体实施方式，所述方法包括以下步骤：
a)在培养器皿中在无血清的1号培养基中以悬浮方式增殖所述禽
Figure G2008800132573D00221
细胞；
b)当细胞密度为至少1.5×106个细胞/ml时以所选病毒感染所述细胞；
c)可选地，在感染之前不久，感染同时或感染之后不久，向细胞培养物中加入无血清的2号培养基；和
d)进一步培养所述感染的细胞以使病毒复制；和
e)可选地，收获所述病毒。
本发明所述方法包含另外的步骤即在允许病毒繁殖的条件下在培养基中加入蛋白水解酶。蛋白水解酶选自胰蛋白酶、糜蛋白酶(chymotrypsine)、嗜热菌蛋白酶(thermolysine)、胃液素(pepsine)、胰酶(pancreatine)、木瓜蛋白酶(papain)、链霉蛋白酶(pronase)、枯草杆菌蛋白酶A(subtilisineA)、弹性蛋白酶(elastase)、furine和羧肽酶(carboxypeptidase)。根据优选具体实施方式，酶是胰蛋白酶。优选地，蛋白水解酶是由原核宿主或植物产生的重组蛋白(即trypzean)。可在病毒感染之前、感染时和/或感染后加入蛋白水解酶。优选地，加入蛋白水解酶是在病毒感染之后。向培养基中加入蛋白水解酶可每天进行一次、每天进行多次或每天不足一次，直至收获病毒。
本文中所用术语“病毒”不仅包括天然发生的病毒还包括减毒的病毒、重排病毒(reassortant viruse)、疫苗株以及重组病毒及其衍生的病毒载体。本发明所述病毒优选选自痘病毒(poxviruse)、正粘病毒(orthomyxoviruse)、副粘病毒(paramyxoviruse)、疱疹病毒(herpes viruse)、嗜肝病毒(hepadnaviruse)、腺病毒(adenoviruse)、细小病毒(parvoviruse)、呼肠孤病毒(reoviruse)、环状病毒(circoviruse)、冠状病毒(coronaviruse)、黄病毒(flaviviruse)、披膜病毒(togaviruse)、双RNA病毒(birnavriruse)和逆转录病毒。
在优选的具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和病毒疫苗属于痘病毒科(poxviridae)家族，更优选为属于脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxviridae)。在一个具体实施方式中，病毒或相关病毒载体、病毒颗粒和病毒疫苗为痘病毒，优选为禽痘病毒(avipoxvirus)，选自鸡痘病毒(fowlpox virus)(即TROVAC)、金丝雀痘病毒(即ALVAC)、雪鸡痘病毒(juncopox virus)、八哥痘病毒(mynahpoxvirus)、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、麻雀痘病毒、椋鸟痘病毒(starlingpoxvirus)或火鸡痘病毒。根据另一个优选具体实施方式，病毒为牛痘病毒，其选自Lister-Elstree牛痘病毒株、修饰的牛痘病毒例如修饰的牛痘病毒Ankara(MVA)，其可由ATCC(ATCC号VR-1508)，NYVAC(Tartaglia等人，1992，Virology，188：217-232)，LC16m8(Sugimoto et Yamanouchi，1994，Vaccine，12：675-681)，CVI78(Kempe等人，1968，Pediatrics 42：980-985)获得，以及其它重组的或非重组牛痘病毒。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于正粘病毒家族，特别是流感病毒。流感病毒选自人类流感病毒、禽流感病毒、马流感病毒、猪流感病毒、猫流感病毒。流感病毒优选选自株A、B和C。在株A中，根据血凝素和神经氨糖酸苷酶(neuraminidase)而列出不同的亚型，例如而不限于H1N1、H2N2、H3N2、H4N2、H4N6、H5N1、H5N2、H7N7et H9N2。在H1N1株中，可列出A/Porto Rico/8/34、A/New Caledonia/20/99、A/Beijing/262/95、A/Johannesburg/282/96、A/Texas/36/91、A/Singapore、A/Solomon Islands/03/2006。在H3N2株中，可列出A/Panama/2007/99、A/Moscow/10/99、A/Johannesburg/33/94、A/Wisconsin/10/04。在株B中，可列出而不限于B/Porto Rico/8/34、B/Johannesburg/5/99、B/Vienna/1/99、B/Ann Arbor/1/86、B/Memphis/1/93、B/Harbin/7/94、N/Shandong/7/97、B/Hong Kong/330/01、B/Yamanashi/166/98、B/Jiangsu/10/03、B/Malaysia。本发明所述流感病毒选自野生型病毒、从感染个体中获得的原代病毒分离体、重组病毒、减毒病毒、温度敏感性病毒、适应低温的病毒、重排病毒、反向遗传工程化病毒。当本发明所述病毒为流感病毒时，本发明所述方法包含另外的步骤即在允许病毒繁殖的条件下向培养基中加入蛋白水解酶。根据优选具体实施方式，酶为胰蛋白酶。细胞培养基中胰蛋白酶的终浓度为0.01μg/ml直至10μg/ml。更优选地，细胞培养基中胰蛋白酶的终浓度为0.01至10usp/ml(usp：美国药典单位)，优选为约0.05至2usp/ml，更优选为约0.3至1usp/ml，更优选为约0.75usp/ml。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于副粘病毒家族。优选地，病毒为天然发生的副粘病毒或重组副粘病毒，其选自麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、Sendai病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒I和III型、牛瘟(Rinderpest)病毒、犬瘟热病毒、新城疫(Newcastle)病毒、鸭副流感病毒。根据优选的具体实施方式，病毒为麻疹病毒或重组麻疹病毒。根据另一个优选的具体实施方式，病毒为新城疫病毒(NDV)或重组NDV。NDV株的例子为LaSota株。当本发明所述病毒为NDV时，本发明所述方法优选包括另外的步骤即在允许病毒繁殖的条件下向培养基中加入蛋白水解酶。根据优选的具体实施方式，酶为胰蛋白酶。细胞培养基中胰蛋白酶的终浓度为0.01μg/ml直至10μg/ml。更优选地，细胞培养基中胰蛋白酶的终浓度为0.01至10usp/ml(usp：美国药典单位)，优选为约0.3至1usp/ml，更优选为约0.4至0.75usp/ml。有趣的是，本发明所述可粘附生长的
Figure G2008800132573D00231
细胞系可用于在斑检验中进行病毒滴定，优选为NDV滴定。确实，不像CEF和鸡DF1成纤维细胞一样(其中不可能观测到任何引起细胞病变的效应)，在细胞中生长的病毒引起特征性的巨大细胞的形成。另外，NDV病毒颗粒可通过血凝素检验来确定。因此，本发明还涉及本发明所述
Figure G2008800132573D00233
细胞用于病毒滴定例如NDV病毒滴定的用途。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于披膜病毒科家族。优选地，病毒为天然发生的α病毒或重组α病毒，其选自Sinbis病毒、Semliki森林病毒、O’nyong’nyong病毒、Chikungunya病毒、Mayaro病毒、Ross河病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于疱疹病毒家族。优选地，病毒为天然发生的马立克病病毒或重组马立克病病毒。马立克病病毒(MDV)优选选自批准的MDV疫苗株，如FC126(HTV)、SB-1、301B/1、CVI988克隆C、CV1988/C/R6、CVI988/Rispens、R2/23(Md11/75)。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于嗜肝病毒家族。优选地，病毒为天然发生的嗜肝病毒或重组嗜肝病毒，优选选自禽和人类嗜肝病毒。禽嗜肝病毒优选选自鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、苍鹭乙型肝炎病毒和雪雁(SGHBV)。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于双RNA病毒家族，特别是传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease virus)。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于黄病毒家族，特别是登革热病毒、日本脑炎病毒和西尼罗河病毒。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于冠状病毒家族，特别是传染性支气管炎病毒。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于环状病毒家族，特别是鸡贫血病病毒。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于逆转录病毒家族。优选地，病毒为天然发生的逆转录病毒，选自网状内皮组织增殖病毒、鸭传染性贫血病毒、suck脾坏死病毒或其重组逆转录病毒。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于细小病毒家族。优选地，病毒为天然发生的细小病毒例如鸭细小病毒或其重组细小病毒。
在另一个优选具体实施方式中，病毒、相关病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于腺病毒家族。优选地，病毒为天然发生的腺病毒，优选选自鸡腺病毒、鹅腺病毒、鸭腺病毒和鸽子腺病毒或其重组腺病毒。鸡腺病毒的例子为鸡腺病毒1(CELO)、鸡腺病毒5(340)、鸡腺病毒4(KR95)、鸡腺病毒10(CFA20)、鸡腺病毒2(P7-A)、鸡腺病毒3(75)、鸡腺病毒9(A2-A)、鸡腺病毒11(380)、鸡腺病毒6(CR119)、鸡腺病毒7(YR36)、鸡腺病毒8a(TR59)、鸡腺病毒8b(764)和减蛋综合征病毒。鹅腺病毒的例子为鹅腺病毒1、鹅腺病毒2、鹅腺病毒3。鸭腺病毒的例子为鸭腺病毒2。鸽子腺病毒的例子为鸽子腺病毒1。
重组病毒包括但不限于包含异源基因的病毒载体。在一些具体实施方式中，宿主细胞辅助病毒、辅助质粒提供病毒复制的辅助功能。代表性的载体包括但不限于那些感染禽类或哺乳动物细胞的载体。
本发明还涉及本发明所述
Figure G2008800132573D00242
细胞用于复制细胞内细菌例如衣原体、立克次氏体或柯克斯体。
本发明所述
Figure G2008800132573D00251
细胞还可用于生产重组蛋白和肽。本发明还涉及一种生产重组蛋白和肽的方法，包括以下步骤：(i)以表达载体瞬时或稳定转染本发明所述
Figure G2008800132573D00252
细胞而对其进行遗传修饰；(ii)可选地，选择表达所述重组蛋白或肽的
Figure G2008800132573D00253
细胞；(iii)纯化所述肽或蛋白。由
Figure G2008800132573D00254
细胞生产的肽和蛋白也包括在本发明的范围内。
本发明所述培养器皿更优选为选自持续搅拌的槽生物反应器WaveTM生物反应器、BelloTM生物反应器、旋转培养瓶、培养瓶或细胞工厂，(cell factory)。通常，细胞是使用各种大小的T形瓶、转瓶或WaveTM生物反应器从主要或工作细胞瓶中按比例增加而来，优选最终进入生物反应器。然后通常将所得到的细胞悬浮液置入种子生产生物反应器(体积通常为20-30L)进行进一步培养，在一些具体实施方式中，置入更大的生产性生物反应器(体积通常为150-180L或以上)。第二个(较大的)生物反应器与种子生物反应器的体积比为基于细胞系在第一个生物反应器中繁殖的程度，该比例通常为3∶1至10∶1，例如在(6-8)∶1的范围内。根据优选具体实施方式，培养器皿是连续搅拌槽生物反应器，其允许控制温度、通气、pH和其它控制条件且具有合适的用于引入细胞、无菌氧气、各种培养基的入口和用于除去细胞和培养基的出口，以及在生物反应器中搅拌培养基的设备。
根据本发明，“无血清培养基”(SFM)是指随时可用的细胞培养基，也就是说它不需要允许细胞存活和生长的动物血清添加。这种培养基不一定是化学上确定的，可含有各种来源例如植物或酵母来源的水解产物。优选地，所述SFM为满足“非动物来源”，也就是说其不含动物或人类来源的成分(FAO状态：“不含动物来源的”)。在SFM中，天然的血清蛋白被重组蛋白替换。或者，本发明所述SFM不含蛋白(PF培养基：“无蛋白培养基”)和/或化学上确定的(CDM培养基：“化学上确定的培养基”)。SFM培养基具有几个优点：(i)首先是这种培养基的调控顺从性(确实没有被外来试剂例如BSE、病毒所污染的风险)；(ii)优化纯化过程；(iii)由于更确定的培养基，所以在过程中具有更好的重现性。可得到的商售SFM培养基的例子为VP SFM(InVitrogen Ref 11681-020、目录号2003)、Opti Pro(InVitrogen Ref 12309-019、目录号2003)、Episerf(InVitrogen Ref 10732-022、目录号2003)、Pro 293S-CDM(Cambrex ref 12765Q、目录号2003)、LC17(Cambrex RefBESP302Q)、Pro CHO 5-CDM(Cambrex ref12-766Q、目录号2003)、HyQ SFM4CHO(Hyclone RefSH30515-02)、HyQ SFM4CHO-Utility(Hyclone RefSH30516.02)、HyQPF293(Hyclone ref SH30356.02)、HyQ PF Vero(Hyclone Ref SH30352.02)、Excell293培养基(SAFC Biosciences ref 14570-1000M)、Excell 325PF CHO无蛋白培养基(SAFC Biosciences ref 14335-1000M)、Excell VPRO培养基(SAFC Biosciences ref14560-1000M)、Excell 302无血清培养基(SAFC Biosciences ref 14312-1000M)、Excell 65319、Excell 65421、Excell 65625、Excell 65626、Excell 65627、Excell 65628、Excell 65629(JRH Biosciences)、Excell MDCK SFM(SAFC-Biosciences Ref.14581C)、Excell MDCK Prod(Ref.M3678)、基因治疗培养基3(无动物成分)(SIGMA-Aldrich、ref.G-9916或Excell GTM-3)(此后称为G9916培养基)、HYQCDM4HEK-293(Hyclone Ref.SH30859)、HYQ SFM4HEK-293(HYCLONE Ref.SH30521)、AEM(InVitrogen)。根据第一个具体实施方式，1号无血清培养基和2号无血清培养基为相同的培养基。根据第二个具体实施方式，1号无血清培养基和2号无血清培养基具有不同的成分。
本发明所述方法包括除去全部1号无血清培养基或其一部分，然后以2号无血清培养基替换。但是，更方便的是除去1号无血清培养基的重要部分(例如直至约50％)然后以2号无血清培养基补充，同时仍然通过例如旋转滤器(Spinfilter)除去1号培养基。根据优选具体实施方式，直接向1号无血清培养基中加入2号无血清培养基，而不除去一部分1号无血清培养基。向1倍体积的1号无血清培养基中加入0.25至10倍体积的2号无血清培养基。在优选具体实施方式中，向1倍体积的1号无血清培养基中加入约0.5至8倍体积的2号无血清培养基。在更优选具体实施方式中，向1倍体积的1号无血清培养基中加入约3至6倍体积的2号无血清培养基。
1号无血清培养基和/或2号无血清培养基可补充至少一种选自氨基酸、脂肪、脂肪酸、胆固醇、维生素、碳水化合物、非动物来源的蛋白水解产物及其混合物的成分。
或者，本发明所述复制病毒的方法为批次饲养方法，其包含另外的步骤即用至少一种选自氨基酸、脂肪、维生素、碳水化合物、非动物来源的蛋白水解产物、表面活性剂或其混合物的成分来饲养细胞。根据第一个优选的具体实施方式，饲养发生于本发明所述复制病毒方法的步骤a)至d)之间，或者只发生于步骤b)至d)，或者只发生于步骤d)。饲养可在每日的基础上或在连续的基础上进行。当饲养为不连续时，饲养可每天进行一次、每天进行多次或每天不足一次。
本发明所述SFM培养基包含一些成分，包括氨基酸、维生素、有机和无机盐、碳水化合物来源，每种成分以支持体外细胞培养的量存在。但是，为了改善细胞生长或病毒产量，向SFM培养基中加入另外的成分。
向细胞培养物中加入的氨基酸的选择可通过分析培养中的细胞对氨基酸的消耗来确定；这样的消耗由于细胞种类的不同而变化。根据优选的具体实施方式，向培养基中加入的氨基酸可选自天冬酰胺或谷氨酰胺或其混合物。在更优选的具体实施方式中，向鸡EBx细胞培养物中加入谷氨酰胺，谷氨酰胺的给予在步骤a)至d)之间进行以保持培养基中的谷氨酰胺浓度介于约0.5mM至约5mM，优选为约1mM至约3mM，最优选为约2mM。在优选的具体实施方式中，谷氨酰胺的给予在连续的基础上进行。有趣的是，鸭
Figure G2008800132573D00261
细胞不消耗太多的谷氨酰胺，因为鸭细胞具有合成谷氨酰胺的能力。因此，在鸭EBx细胞培养物中可加入或者不加入谷氨酰胺。
根据优选的具体实施方式，向培养基中加入的碳水化合物选自D-葡萄糖、D-蔗糖、D-半乳糖或其混合物。根据更加优选的具体实施方式，所加入的碳水化合物是D-葡萄糖。D-葡萄糖的给予在步骤a)至d)之间，更优选在b)至d)之间进行以保持培养基中的D-葡萄糖浓度介于约0.5g/l至约25g/l的D-葡萄糖，优选为约1g/l至10g/l的D-葡萄糖，最优选为约2至3g/l的D-葡萄糖。在优选的具体实施方式中，D-葡萄糖的给予在连续的基础上进行。
根据优选的具体实施方式，脂肪选自胆固醇、类固醇和脂肪酸例如棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，及其衍生物，或其混合物。更优选地，脂肪酸来自SIGMA-ALDRICH(Ref.F7050)且向培养基中加入约0.35μl/ml的脂肪酸溶液。
培养基可含有辅佐性物质，例如缓冲液物质例如碳酸氢钠、氧化稳定剂、抵消机械压力的稳定剂、或蛋白酶抑制剂。如果需要，可向培养基中加入非离子表面活性剂如聚丙二醇(PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、SYNPERONIC F-68、PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)作为除泡沫剂。这些试剂通常用于保护细胞抵抗通气的副作用，因为不加表面活性剂的话，气泡的上升和破裂可引起那些位于这些气泡(“鼓泡”)表面的细胞的损伤。非离子性表面活性剂的量优选为约0.05至约10g/L，通常为约0.1至约5g/L。根据本发明的另一个优选的具体实施方式，细胞培养基中表面活性剂的浓度可被修改以调整(增加或减少)细胞簇的大小。
根据本发明所述复制病毒的方法的优选的具体实施方式，向细胞培养物中加入2号无血清培养基是在感染步骤b)之后进行，优选为步骤b)之后约0.5至4小时，更优选为步骤b)之后约1小时。根据本发明的另一个具体实施方式，向细胞培养物中加入2号无血清培养基是在感染步骤b)之前进行，优选为步骤b)之前约0.5至约4小时，更优选为步骤b)之前约1小时。根据本发明的另一个具体实施方式，向细胞培养物中加入2号无血清培养基是在感染步骤b的同时进行。步骤b)的病毒感染是以约10至10-8的m.o.i(感染复数(multiplicity ofinfection)))进行，优选为10-1至10-6，更优选为约10-2至10-5，更优选为约10-4。本领域技术人员将根据病毒类型确定最佳的m.o.i。在步骤c)中，感染的细胞优选为培养至少24小时，至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时。当病毒是痘病毒时，感染的细胞至少培养144小时。
在本发明所述方法中，步骤a)的细胞培养物通过批次培养、重复批次培养、馈料批次(fed-batch)培养或灌注培养进行。更优选地，步骤a)的细胞培养物通过馈料批次培养进行。当细胞密度为至少约4,000,000，优选为6,000,000个细胞/ml的时候在批次培养或馈料批次培养方法中进行步骤b)的感染。当使用灌注方法时，当细胞密度为至少8,000,000细胞/ml，优选为约9,000,000至10,000,000个细胞/ml或更高的时候行步骤b)的感染。
步骤a)、b)、c)和d)的无血清培养基的pH值优选为通过生物反应器进行监控。pH值应该介于6.5至7.8，优选为约6.8至7.5，更优选为约7.2。
在本发明的方法中，在收获前步骤d)持续1至10天。根据优选的具体实施方式，在收获前步骤d)持续2至5天。(步骤e)的收获时间根据培养器皿中的细胞密度确定。本发明人现在发现收获病毒的最佳时间为活细胞密度达到其最佳水平且开始由于病毒感染而下降之后的两天。
细胞培养在32℃至39℃的温度进行，取决于病毒的类型。对于生产流感病毒和痘病毒来说，细胞培养感染优选在33℃进行。
Figure G2008800132573D00281
细胞具有以很少细胞(多达100个以上的细胞)疏松聚集成细胞簇的悬浮培养方式生长的能力。不被理论所限，细胞簇的大小可根据细胞培养基的成分而变化。例如，表面活性剂例如聚丙二醇(PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、SYNPERONIC F-68、PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)、搅拌、二价例子浓度例如Mg2+和Ca2+的存在可对细胞簇的大小有影响。本发明人现在发现可通过在至少方法的步骤a)中允许本发明所述
Figure G2008800132573D00282
细胞彼此聚集成簇来增加病毒产量。在使用各种大小的T形瓶或转瓶从主要和工作细胞瓶按比例增加至生物反应器过程中，悬浮细胞通常是通过稀释进入新鲜培养基或是通过先离心然后将细胞沉淀重悬进入新鲜培养基中，传代至较大容器。本发明人发现在细胞传代时，推荐的做法是保持大的细胞簇进入培养物。为了这样做，最好不要打乱细胞簇，以便改善
Figure G2008800132573D00283
细胞中的病毒复制。例如，在T形瓶或转瓶中步骤a)培养的最初时期，推荐的做法是稀释细胞培养物而将细胞传入较大的容器，不推荐的做法是离心或者通过吸液或搅拌而打乱细胞簇。但是，太大的簇对于高病毒产生来说不是最理想的。因此，本领域技术人员将确定在步骤a)的最初细胞传代时通过吸液或搅拌而部分打乱簇是否能够改善病毒产量。根据优选的具体实施方式，痘病毒，优选MVA、ALVAC和鸡痘病毒，是通过本发明所述方法中包括步骤a)的增殖成簇的以很少细胞(达至少100个以上的细胞，至少200个细胞，至少500个细胞，至少1000个细胞)疏松聚集的
Figure G2008800132573D00284
来获得的。
本发明人发现
Figure G2008800132573D00285
细胞簇，优选鸭
Figure G2008800132573D00286
细胞簇可能依赖于锚定非依赖性细胞培养基中的Mg2+和/或Ca2+离子浓度。由于太大的簇对于高病毒产量来说不是最理想的，簇的大小可通过调整细胞培养基中的Mg2+和/或Ca2+离子浓度来监视。对于鸭
Figure G2008800132573D00287
细胞，细胞培养基优选含有浓度为0.5mM至2.5mM的Mg2+浓度，优选为约1.6mM；以及0.01mM至0.5mM，优选约0.1mM的Ca2+浓度。
本发明还涉及以本发明所述方法获得的病毒。本发明还涉及含有本发明病毒的疫苗。生产病毒疫苗的方法包括本发明所述复制病毒的方法，其中收获病毒的步骤e)包含至少一个选自过滤、浓缩、冷冻和加入稳定剂进行稳定的步骤。根据本领域技术人员熟知的技术收获病毒。根据优选的具体实施方式，收获所述病毒的步骤包括收集从离心细胞培养物而获得的细胞培养物上清液、然后过滤、浓缩、冷冻、通过加入稳定剂稳定病毒制备物。例如，对于流感病毒来说，参见Furminger，In Nicholson，Webster and Hay(Eds)Textbook of influenza，chapter 24 pp324-332。
本发明所述生产病毒疫苗的方法还可以包括另外的步骤即将收获的病毒灭活。灭活优选为通过使用甲醛、β-丙内酯、乙醚、乙醚和去污剂(即例如Tween 80TM)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和Triton N102、去氧胆酸钠和磷酸三丁酯(tri(N-butyl)phosphate)处理而进行。
根据另一个优选的具体实施方式，本发明还涉及从本发明所述方法获得的病毒制备病毒抗原性蛋白的方法，所述方法包括另外的步骤：
a)可选地，以脱氧核糖核酸限制性酶，优选为DNAse(见EC3.1.21和EC3.1.22分类)和核酸酶(见EC3.1.30和EC3.1.31分类)孵育包含完整病毒的细胞培养上清液。优选地，DNA消化酶是benzonase(Benzon核酸酶)或DNase I；
b)添加阳离子去污剂。阳离子去污剂的例子有但不限于：十六烷基三甲基铵盐例如CTAB，十四烷基三甲基铵盐、脂质体(lipofectine)、DOTMA和TweenTM；
c)分离抗原性蛋白。后者的步骤可通过离心或超滤而进行。
疫苗中的病毒可以作为完整病毒颗粒或作为分解的病毒颗粒存在。根据具体实施方式，疫苗为杀死的或灭活的疫苗。根据另一个具体实施方式，疫苗为活的减毒的疫苗其中所述疫苗主要包含由本发明所述方法获得的EBx细胞培养上清液，优选不含血清，可选为经过滤和/或浓缩的，并包含所述病毒。根据第三个具体实施方式，疫苗包含从本发明所述方法制备的病毒获得的病毒抗原性蛋白。
本发明还涉及提供一种疫苗，其包含由本发明所述方法获得的感染的细胞系
Figure G2008800132573D00291
优选为鸭或ev-0鸡
Figure G2008800132573D00292
其中感染的细胞系
Figure G2008800132573D00293
优选为鸭或ev-0鸡为步骤d)中所收获的。
本发明所述疫苗可包含本发明所述病毒结合药学上可接受的增强免疫反应的物质。增强免疫反应的物质的非限制性例子包括不完全氟氏佐剂、皂角苷、氢氧化铝盐、溶血卵磷脂、plutonic polyol、聚阴离子、肽、卡介苗(BCG)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。合成的佐剂的例子为QS-21。另外，免疫刺激蛋白(白细胞介素Il1、Il2、IL3、IL4、IL12、IL13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等)可用于增强疫苗免疫反应。
本发明所述疫苗优选为液体制品、冷冻制品、脱水和冷冻制品，可选为适应于鼻内给药途径。
本发明所述疫苗用于被前述病毒感染的人或动物的预防性和/或治疗性治疗。优选地，本发明所述病毒疫苗优选用于被选自天花、流感、麻疹、腮腺炎、风疹病毒、RSV感染的人的预防性和/或治疗性治疗。或者，本发明所述病毒性疫苗优选用于被选自流感、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、传染性法氏囊病、感染性支气管炎病毒、犬瘟热病毒、鸡贫血病病毒感染的动物的预防性和/或治疗性治疗。本发明所述重组病毒疫苗还可用于慢性病例如癌症和传染性疾病例如AIDS的预防性和/或治疗性治疗。
本发明所述
Figure G2008800132573D00301
细胞系用于产生和生产重排病毒。具有分段的基因组的病毒例如流感病毒可被重排。当以至少两种不同株的流感病毒同时感染本发明所述
Figure G2008800132573D00302
细胞时，在相同宿主细胞中存在来自不同株的分段基因组的混合物。在病毒组装过程中，理论上可产生基因组片段的所有组合。因此可通过使用例如抗体选择或消除具有所需特性的病毒来分离特异性重排病毒(参见Kilnourne E.D inPlotkin SA and Mortimer E.A.Eds，Vaccines 1994)。本发明所述细胞系还可用于通过反向遗传学产生和生产流感病毒(参见Enami，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：3802-3805(1990)；Enami et Palese，J.Virol.65：2511-2513(1991)；Luytjes，Cell59：1107-1113(1989))。
本发明还涉及本发明所述
Figure G2008800132573D00304
细胞系用作细胞底物以进行病毒滴定。
Figure G2008800132573D00305
细胞将有效地替代现在的用于确定病毒溶液滴度的细胞系统，例如含胚的卵、CEF、DF1细胞和其它。优选的病毒滴定为通过TCID50方法进行(Reed L，Muench H，1938.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.27，493-97)。
本发明还涉及本发明所述
Figure G2008800132573D00306
细胞系用作进行卫生检测的细胞底物。
本发明还涉及含有本发明所述病毒或其成分的诊断性组合物。
以下实施例更详细地解释了本发明。以下制备物和实施例是为了使本领域技术人员更清晰地理解和实践本发明。但是本发明在范围上不被示例性优选的具体实施方式所限制，具体实施方式只是为了解释本发明的单一方面，功能上同等的方法也在本发明的范围内。确实，除了本文所描述的那些以外，来自于前面的描述和附图的各种本发明的变体对本领域技术人员来说将是明显的。对于描述的其余部分，将参考以下附图说明。
附图说明
图1：锚定非依赖性鸡EBx细胞
图1A：无血清培养基中的锚定非依赖性鸡Valo EBv13细胞。在37℃在无血清培养基Excell 65319(SAFC)中悬浮培养EBv13细胞。EBv13细胞具有均一的大小且在培养中以疏松的簇生长。群体加倍时间为约16-18小时，在摇晃的培养瓶容器中细胞密度达到为约4,000,000至5,000,000个细胞/ml。
图1B：无血清培养基中的锚定非依赖性鸡EB品系0细胞。在39℃在无血清培养基Excell 66444(SAFC)中悬浮培养EB品系0细胞。EB品系0细胞具有均一的大小且以宽松的簇生长。
图2：鸡Valo EBx13细胞表达高水平的端粒酶
处于传代p193的EBv13细胞确实表达高水平的端粒酶，表达水平与在处于传代p164(Master cell Bank：MCB)或传代p184(Workin Cell bank：WCB)的鸡EB14-O74细胞(见WO03/076601)的为相同的数量级。鼠胚胎干细胞(mES)用作阳性对照，鼠成纤维细胞(FED)用作阴性对照。
图3A和3B：鸡Valo EBv13细胞对痘病毒的易感性
将EBv13(传代188)以0.4×106细胞/ml植于100ml F175瓶中的40ml SFMExcell培养基65319或G9916SFM培养基(SAFC)中，培养基中补充了4mM谷氨酰胺。在37℃进行细胞生长和以MVA-GFP(MOI 10-2 TCID50/细胞)感染。感染后一个小时，加入60ml的新鲜培养基。
图3A：SFM Excell培养基65319或G9916SFM培养基(SAFC)中的细胞密度动力学。
图3B：SFM Excell培养基65319或G9916SFM培养基(SAFC)中用TCID50/ml表达的MVA生产力。
图4：鸭EBx细胞的透射电子显微镜分析
由A Rivoire博士(Lyon，France)进行dEBx细胞的透射电子显微镜分析。鸭EBx细胞显示出典型的胚胎干细胞形态(即高细胞核-细胞质比)，类似于鼠胚胎干细胞和WO2006/108846中描述的VIVALIS EB14细胞的表型。鸭EBx细胞为小的圆细胞，具有大的细胞核和核仁，具有从细胞膜延伸的短的伪足。它们是高度代谢活性的，具有富含核糖体和线粒体的胞浆。
图5A和5B：鸭EBx细胞系中端粒酶的表达
通过使用罗氏端粒酶检测试剂盒(端粒酶OCR ELISA)研究建立鸭EBx细胞的不同时期的端粒酶表达。
图5A：在不同的粘附性鸭EBx细胞系中发现端粒酶是高度表达的，就像在鸡EBv13细胞中一样。用作阴性对照的鸭上皮细胞不表达端粒酶。
图5B：在建立悬浮鸭EBx细胞的过程中，保持了端粒酶的高度表达。在除去饲养物(feeder)(有或无饲养细胞)期间、在使鸭EB26细胞适应悬浮的过程中和在dEB24et dEB26除去血清之后研究鸭EBx细胞端粒酶的高水平。
鸭EBx细胞例如EB24和EB26表达高水平端粒酶，就像鸡EB14细胞一样。鸭EB66也表达高水平端粒酶(数据未显示)。
图6A和6B：鸭
Figure G2008800132573D00311
细胞未表现出内源性逆转录酶活性
图6A：通过在Clean细胞(FRANCE)中进行直接F-PERT分析(Lovatt等人，1999，J.Virol.Methods，82：185-200)来研究内源性逆转录酶表达。鸭
Figure G2008800132573D00312
细胞系，EB26和EB5-1未表现出内源性逆转录酶(RT)活性。在鸡EB14和EBv13细胞培养物(在不同的传代)中检测到了高水平的RT活性，以及在源自特异性无病原(SPF)鸡品系的鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中检测到了较低程度的RT活性。CEM细胞(其为RTase阴性)用作阴性对照以设定检验的检测限值。
图6B：通过ELISA检验(其检测禽白血病主要衣壳抗原P27)研究鸭和鸡EBx细胞的细胞培养上清液中内源性逆转录病毒颗粒的存在，无论其是复制性(即有复制能力的)或非复制性的。鸭EBx细胞系，EB26和EB5-1，以及鸡EBv13不分泌ALV p27抗原。相反，鸡EB14细胞确实表达ALV p27抗原。
图7A和7B：鸭EBx细胞不分泌复制性禽白血病病毒(ALV)
在Bioreliance(UK)中进行鸭EBx细胞和鹌鹑QT6细胞系的共同培养检验以检测内源的复制性鸭病毒的存在，已知鹌鹑QT6细胞系对内源性和外源性ALV敏感。
图7A：描述了QT6共培养的原理
图7B：通过ELISA检验(其检测禽白血病主要衣壳抗原P27)检测可复制性病毒的存在。
该检验证明所测的鸭
Figure G2008800132573D00321
细胞没有一个分泌复制性ALV。RAV-1病毒(其已知在QT6中复制)用作阳性对照。
图8：在鸭EBx和鸡EB14细胞系中受体SAα2-3和SAα2-6的细胞表面表达
以地高辛标记的植物血凝素(lectin)孵育细胞：Sambuca nigra凝集素(agglutinin)植物血凝素特异性与Sia2-6Gal结合，而山槐(Maackia amurensis)凝集素植物血凝素特异性与Sia2-3Gal结合。根据本领域技术人员熟知的技术使用FITC标记的抗-地高辛抗体来显示与细胞结合的植物血凝素。以荧光细胞分选仪(FACS)对FITC标记的细胞进行计数。人们已经描述的SAα2-3和SAα2-6分子分别是禽和人流感病毒的受体。几乎所有的鸭EBx细胞高度表达细胞表面受体SAα2-3和SAα2-6。
图9A和9B：在感染的鸭EBx细胞中MVA-GFP病毒的繁殖
图9A：在T175搅拌槽培养瓶中在细胞生长SFM培养基中的细胞增殖过程中使鸭
Figure G2008800132573D00322
细胞形成小的簇。然后以10-2 TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染簇，将混合物在生产性SFM培养基中稀释。在37℃6天病毒繁殖期的过程中，每天对UV照射的感染细胞进行照相。在感染后(pi)第4天达到MVA感染的高峰。在pi第6天，感染细胞开始死亡。
图9B：在3L的馈料批次生物反应器中在鸭
Figure G2008800132573D00323
细胞中繁殖的MVA-GFP病毒滴定。(左侧图板)使源自鸭EBx的生物量在Excell生长培养基(SAFC)中在细胞增殖期累积。在第4天，细胞密度达到4,000,000个细胞/ml。然后以10-1TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染细胞，在1.5L的Excell培养基中稀释混合物。在37℃6天的病毒繁殖期中，每日收集样品，在反应动力学终端进行TCID50滴定(右侧图板)。在4p.i.时达到了8.5log TCID50/细胞的产量，对应于205TCID50/细胞的产量。
图10：SFM培养基中钙和镁的浓度对
Figure G2008800132573D00324
细胞簇大小的影响
图10A：首先将鸡EBv13细胞培养于来自SAFC Biosciences的SFM培养基，该培养基包含高浓度的钙离子(Ca2+)(约0.79mM)和镁(Mg2+)离子)；在此培养基中，细胞在培养时产生大的聚集体。
在以包含较低浓度的Ca2+(终浓度0.03mM)和Mg2+(终浓度1.6mM)的同样的SFM培养基改变细胞培养基3天之后，细胞形成较小的聚集体。
图10B：首先将鸭EB24、EB26和EB66细胞培养于来自SAFC Biosciences的SFM培养基，该培养基包含高浓度的钙离子(Ca2+)(约0.79mM)和镁(Mg2+)离子)；在此培养基中，细胞在培养时产生大的聚集体。
在以包含较低浓度的Ca2+(终浓度0.03mM)和Mg2+(终浓度1.6mM)的同样的SFM培养基改变细胞培养基3天之后，细胞形成较小的聚集体。
图11A和11B：在3L的生物反应器中在鸭EBx细胞中产生流感病毒株A
在37℃时使鸭
Figure G2008800132573D00331
的生物量在细胞生长培养基中在细胞增殖期时累积。然后以10-4 TCID50/细胞的A/H1N1/Beijing/262/95或A/H3N2/New York/55/2004流感病毒感染细胞，在1.5L的添加了0.75USP/ml的胰蛋白酶的Excell生产培养基中稀释混合物，将温度降至33℃。在14天的病毒繁殖期中，每日收集样品并储存于-80℃。
图11A：以A/H1N1/Beijing/262/95流感病毒株感染的鸭EBx细胞的生长动力学
左侧图板：细胞密度(菱形，×106个细胞/ml)和病毒滴度(以logTCID50/ml表示)。
右侧图板：细胞总数目(正方形)、存活性(黑色圆圈，％)和血凝素浓度(以μg/ml表示)(红色圆圈，％)。
病毒产量达到每毫升培养上清液20μg的血凝素。
图11B：以A/H3N2/New York/55/2004流感病毒株感染的鸭EBx细胞的生长动力学
左侧图板：细胞密度(菱形，×106个细胞/ml)。
右侧图板：细胞总数目(正方形)、存活性(黑色圆圈，％)和血凝素浓度(以μg/ml表示)(红色圆圈，％)。
病毒产量达到每毫升培养上清液30μg的血凝素。
图12：鸭
Figure G2008800132573D00332
细胞中流感病毒株B的生产
在37℃时使鸭
Figure G2008800132573D00333
的生物量在细胞生长培养基中在细胞增殖期时累积。然后以10-3 TCID50/细胞的B/Jiangsu/10/2003流感病毒感染细胞，在1.5L的添加了0.75USP/ml的胰蛋白酶的Excell生产培养基中稀释混合物，将温度降至33℃。在14天的病毒繁殖期中，每日收集样品并储存于-80℃。
左侧图板：细胞密度(菱形，×106个细胞/ml)。
右侧图板：细胞总数目(正方形)、存活性(黑色圆圈，％)和血凝素浓度(以μg/ml表示)(红色圆圈，％)。
病毒产量达到每ml培养上清液25μg的血凝素。
图13：鸭EB66细胞中NDV生产力和病毒蛋白表达的分析(MOI 10-3，0.75USP/mL胰蛋白酶)
鸭和鸡EBx细胞对NDV La Sota株是敏感的且复制NDV La Sota株。在鸭EB66细胞中生产的NDV的滴度(以TCID50/ml表示)从第0天至pi第2天增长至达到106.83 TCID50/mL的平均值(图13左侧图板)。
Western blot分析(图13右侧图板)显示NDV病毒蛋白(HN，Fo/F，NP和M)的表达。鸭EB66细胞中产生的NDV病毒的病毒蛋白组成与用鸡EB14细胞产生的NDV病毒获得的病毒蛋白组成相类似。另外，鸡和鸭EBx细胞中产生的病毒的释放动力学也类似。
图14：组织培养瓶中的无血清培养基中的鸭EB66细胞(MOI 10-1或10-2)悬浮液中重组麻疹病毒复制的分析
鸭EB66细胞至少是与VERO细胞一样对麻疹病毒感染敏感的。在感染后6天鸭EB66细胞中生产的表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组麻疹病毒的滴度(以TCID50/ml表示)达到了107TCID50/mL。
图15A和15B：鸭EB66细胞中SSEA-1、EMA-1和端粒酶的表达
通过使用罗氏端粒酶检测试剂盒(端粒酶OCR ELISA)研究在摇瓶中培养的不同传代的鸭EB66的端粒酶的表达。通过FACS分析研究在摇瓶中培养的不同传代的鸭EB66的SSEA-1和EMA-1。
图15A：在不同传代(138、144、147、150、154)的悬浮的鸭EB66细胞系中发现端粒酶高度表达。
图15B：在不同传代(138、144、147、150、154)的悬浮的鸭EB66细胞系中发现细胞表面标记SSEA-1和EMA-1高度表达。
图16：鸭EB66细胞的核型分析
鸭EB66细胞的核型分析由Pr.Franck，ENVL，Lyon进行。EB66细胞为双倍体细胞。
实施例
实施例1：来自SPF鸡VALO品系的鸡EBv13细胞系
1.1原始材料
蛋
特异性无病原(SPF)品系称为Valo。Valo品系为白色来亨鸡品系，由Lohmann从德国生产和输送。测试了那些SPF鸡蛋(提供分析合格证)的CAV、禽腺病毒(组1、血清型1-12和组3)、EDS、禽脑脊髓炎病毒、禽白血病病毒/RSV(包括血清型ALV-J)、禽肾炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡痘病毒、感染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、感染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngo TracheitisVirus)、流感病毒A型、马立克氏病病毒、支原体病(Mg+Ms)、鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)、新城疫病毒、网状内皮组织增殖病毒、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、其它沙门氏菌感染、禽鼻气管炎病毒(ART)、副鸡嗜血杆菌(Hemophilus paragallinarum)。Valo鸡蛋只进行净化剂(decontaminant)的消毒以避免在运输过程中操作鸡蛋相关的任何污染风险。
饲养细胞
在建立EBv13的方法的第一个步骤中，鼠源的细胞(STO细胞)用作饲养层以保持鸡干细胞的多能性。在植到塑料上之前使用伽马射线(45至55Gray)使那些饲养细胞的有丝分裂失活。该射线剂量为亚致死剂量，其诱导细胞周期的决定性停滞但仍然允许生长因子和细胞外基质的产生，这些生长因子和细胞外基质对于未分化细胞的细胞生长的促进是必需的。
STO细胞系由A.Bernstein，Ontario Cancer Institute，Toronto，Canada从SIM(Sandos同系繁殖小鼠)小鼠胚胎成纤维细胞的持续系中得到，由美国典型微生物保藏中心(ATCC)(STO产品编号：CRL-1503，批次号1198713)提供。饲养细胞层每周制备两次，通常在星期一和星期四。分离指数期细胞并进行计数。将一部分细胞种植以保持活培养，另一部分进行照射。为了照射，我们准备了管中的10×106个细胞/ml的细胞悬浮液。将细胞暴露于45至55grey的剂量并植在塑料上。植完以后，在最长5天的时间内使用以钝化的饲养细胞包被的碟或板。
培养基
DMEM-HamF 12(Cambrex，Cat noBE04-687)
Optipro培养基(Invitrogen，Cat no12309)
EX-CELLTM65195，60947和65319(SAFC，订制培养基)
添加物
谷氨酰胺(Cambrex，Cat no BE17-605E)
青霉素/链霉素(Cambrex，Cat no BE17-602E))
非必需氨基酸(Cambrex，Cat no BE13-114E)
丙酮酸钠(Cambrex，Cat no BE13-115)
维生素(Cambrex，Cat no 13-607C)
β巯基乙醇(Sigma，Cat no M7522)
缓冲液和固定剂
PBS 1X(Cambrex，Cat no BE17-516F)
多聚甲醛4％(Sigma，Cat no P6148)
KCl 5，6％(Sigma，Cat no P9333)
甲醇/乙酸(3/1)：甲醇(Merck，Cat no K34497209；乙酸Sigma Cat no A6283)
秋水仙胺(Colcemid)，Karyomax(Gibco，Cat no 15212-046)
冷冻保护试剂
二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，Cat no D2650)
因子
使用了两种不同的重组因子：
Figure G2008800132573D00361
重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat no 450-13)
Figure G2008800132573D00362
重组人胰岛素样因子1(IGF-1)(Peprotech Inc，Cat no 100-11)
这两种因子在大肠杆菌细菌中生产。
胎牛血清
未受辐照的胎牛血清(FBS)(JRH，Cat no 12103)
在本程序中使用的未受辐照的血清是在美国收集和生产的。用于收集的动物为经USDA检验的和适于屠宰的。在禽干细胞培养过程中将其加入到培养基中。该批次不进行辐照以避免破坏被鉴定为对保持培养中的干细胞至关重要的关键蛋白或成分。
经辐照的血清(JRH，Cat no 12107)
在本程序中使用的经辐照的批次也是在美国收集的。在用于培养STO或FED细胞(饲养细胞)的DMEM培养基中补充该经辐照的批次。那些细胞不像干细胞一样需要特定质量的血清用于培养中的生长和保持。为了使培养基中的血清高浓度最小化，我们将STO细胞适应于在只有4％的FBS中生长。
分离试剂
链霉蛋白酶(Roche，Cat no 165921)
链霉蛋白酶是由Roche Diagnostics，Germany生产的重组蛋白酶，用于粘附性禽干细胞的分离。
胰蛋白酶EDTA(Cambrex，cat no BE17-161E)
胰蛋白酶用于STO或FED细胞的分离和在晚期传代时用于适应无血清培养基的禽细胞的分离。这种猪来源的酶由经验证的无菌过滤方法，根据cGMP参考条件无菌生产并根据现行E.P.测试。该原材料(在制剂之前经辐照)严格按照9/CFR113.53进行猪细小病毒的测试。
非酶的细胞分离溶液(Sigma，Cat no C5914)
该分离试剂为随时可用的制剂，用于将细胞温和地从培养器皿生长表面中分离下来。配方不含蛋白，并允许在不使用酶的情况下移走细胞。保留细胞蛋白用于依赖细胞表面蛋白识别的可能的免疫化学研究。该酶用于在对生物标记像EMA-1(上皮膜抗原1)和SSEA1(阶段特异性胚胎抗原-1)进行FACS分析前分离细胞。
1.2建立EBv13细胞系的方法
打开鸡蛋，在打开的过程中蛋黄从蛋白中分离出来。使用巴斯德移液管或使用小的吸附性滤纸(Whatmann 3M纸)(事先用打孔器就该滤纸打成穿孔环形式)直接从蛋黄中移出胚胎。穿孔的直径为约5mm。在烤箱中通过干热对这些小环进行灭菌约30分钟。将该小纸环置于蛋黄表面和胚胎正中，因此胚胎被纸环环绕。然后以小的剪刀剪掉纸环，将其除掉的整个置于皮氏培养皿中，以PBS或生理盐水覆盖。因此将由环切下的胚胎在介质中清洗掉多余的蛋黄，以巴斯德移液管收集因此不含多余蛋黄素的胚盘。
将鸡Valo胚胎置于含有生理介质(1X PBS，Tris葡萄糖，培养基等)的管中。然后将Valo胚胎机械分离并在39℃接种到完全培养基中的饲养细胞STO细胞层上。饲养细胞以约2.7×104个细胞/cm2植于瓶中。完全培养基由商售基础培养基DMEM-HamF12组成，其中补充了10％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1和CNTF；和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.2mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.9mM的谷氨酰胺；含有终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素的抗生素初始混合物。在第一次细胞传代后的短时间内即不再向培养基添加抗生素混合物。术语“短时间内”通常应理解为在最初3至5次传代之后。
当来自鸡Valo胚胎的禽ES细胞是从一个培养碟传代至另一个时，培养碟的种植是以约7×104/cm2至8×104/cm2个禽ES细胞在完全培养基中进行。优选地，种植以约7.3×104/cm2(4×106个细胞/55cm2或4×106个细胞/100mm培养碟)进行。禽细胞，优选步骤a)的禽胚胎细胞在几个传代中培养于完全培养基。在第15次传代时，从完全培养基中除去生长因子IGF1和CNTF。在一个传代到另一个传代时，在一个步骤中直接除去。胚胎干细胞，优选禽胚胎干细胞在几个传代中培养于不含IGF1和CNTF生长因子的完全培养基。
然后在除去生长因子IGF1和CNTF之后通过在几个传代中逐渐降低饲养细胞的浓度而除去饲养细胞。实践中，同样浓度的饲养细胞被用于2至4个传代，然后使用较低浓度的饲养细胞持续2至4个传代，以此类推。最初瓶中植入2.7×104个饲养细胞/cm2，然后为约2.2×104个饲养细胞/cm2，然后为约1.8×104个饲养细胞/cm2，然后为约1.4×104个饲养细胞/cm2，然后为约1.1×104个饲养细胞/cm2，然后为约0.9×104个饲养细胞/cm2，然后为约0.5×104个饲养细胞/cm2。然后在瓶中植入6.5×104个禽细胞/cm2至7.5×104个禽细胞/cm2，且无饲养细胞。在约第21个传代开始除去饲养细胞，结束于约65个传代。在除去饲养细胞时，将鸡ValoES细胞以低于步骤a)中的浓度植于培养瓶，浓度为约4×104个细胞/cm2至5×104个细胞/cm2。假设Valo ES细胞在瓶中的饲养细胞浓度降低后不处于好的形状，则将禽细胞在相同浓度的饲养细胞中进一步培养几个传代以进行饲养细胞的消除。
在除去生长因子和饲养细胞后除去血清。在除去血清开始时，培养基由基础商售培养基DMEM-HamF12组成，其中补充了10％胎牛血清；1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.2mM的β-巯基乙醇；终浓度为2.9mM的谷氨酰胺。将鸡Valo细胞适应于无血清培养基生长，分两个步骤进行：第一，将鸡Valo细胞迅速适应于由商售无血清培养基(SFM)，优选为ExCell 60947(SAFCBiosciences)组成的培养基，其中补充了10％胎牛血清和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.2mM的β-巯基乙醇；终浓度为2.9mM的谷氨酰胺。一旦完成向新培养基(DMEM-HamF12至Excell 60947)中的迅速适应，进行第二个步骤即进行在SFM培养基中，缓慢适应于动物血清浓度降低。通过逐渐降低而除去血清，从SFM细胞培养基中的10％血清开始，然后7.5％，然后5％，然后2.5％，然后1.25％，然后0.75％血清浓度，至最终达到SFM细胞培养基中的0％血清。在第103次传代开始除去血清，在第135次传代时结束。
当SFM细胞培养基中剩余血清的浓度为0.75％或0％时即去除血清过程的结尾，开始将锚定依赖性EBv13细胞适应于悬浮培养。在几个分离锚定非依赖性EBv13细胞的尝试中，成功了62.5％，得到了悬浮EBv13细胞的不同分离体。根据群体加倍时间(约18小时)、最佳的瓶培养中细胞浓度(约4,000,000个细胞/ml)、细胞存活性、细胞培养物均一性(细胞簇的存在和大小)和细胞操作的容易性而选择了一个EBv13细胞的分离体(图1)。
在除去血清的终端，锚定依赖性鸡Valo细胞即EBv13能够生长于不含生长因子、不含饲养细胞、不含血清的培养基中。然后通过每天逐渐降低细胞培养温度0.5℃/天而将EBv13细胞适应于在37℃生长。
实施例2：来自SPF鸡ELL-0株的鸡EB品系0细胞系
1.1原始材料
蛋
称为ELL-0(East Lansing品系0)的鸡特异性无病原(SPF)株由禽类疾病和肿瘤学实验室(USDA-ARS-MWA，USA)提供。那些SPF鸡蛋由仔细检测了各种禽病原体的群体中产生。所检测的疾病包括：鸡白痢沙门氏菌、鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)、鸡败血支原体(mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体(mycoplasma synoviae)、禽白血病病毒A-D和J，马立克病病毒、网状内皮组织增殖病毒、禽腺病毒、感染性支气管炎、传染性法氏囊病、禽流感病、新城疫病、禽脑脊髓炎和禽逆呼肠孤病毒。品系0鸡蛋只进行消毒剂的消毒以避免在运输过程中操作鸡蛋相关的任何污染风险。
饲养细胞
在建立EB品系0的方法的第一个步骤中，鼠源的细胞(STO细胞)用作饲养层以保持鸡干细胞的多能性。在植到塑料上之前使用伽马射线(45至55Gray)使那些饲养细胞的有丝分裂失活。该射线剂量为亚致死剂量，其诱导细胞周期的决定性停滞但仍然允许生长因子和细胞外基质的产生，这些生长因子和细胞外基质对于未分化细胞的细胞生长的促进是必需的。
STO细胞系由A.Bernstein，Ontario Cancer Institute，Toronto，Canada从SIM(Sandos同系繁殖的小鼠)小鼠胚胎成纤维细胞的持续系中得到，由美国典型微生物保藏中心(ATCC)(STO产品编号：CRL-1503，批次号1198713)提供。饲养细胞层每周制备两次。分离指数期细胞并进行计数。将一部分细胞种植以保持活培养，另一部分进行照射。为了照射，我们准备了管中的10×106个细胞/ml的细胞悬浮液。将细胞暴露于45至55grey的剂量并植在塑料上。植完以后，在最长5天的时间内使用以钝化的饲养细胞包被的碟或板。
培养基
DMEM-HamF 12(Cambrex，Cat no BE04-687)
GTM-3培养基(Sigma，Cat no G9916)
EX-CELLTM 66522，65788和66444培养基(SAFC，订制培养基)
添加物
谷氨酰胺(Cambrex，Cat no BE17-605E)
青霉素/链霉素(Cambrex，Cat no BE17-602E))
非必需氨基酸(Cambrex，Cat no BE13-114E)
丙酮酸钠(Cambrex，Cat no BE13-115)
维生素(Cambrex，Cat no 13-607C)
β巯基乙醇(Sigma，Cat no M7522)
酵母自溶液(SAFC，Cat no 58902C)
缓冲液和固定剂
PBS 1X(Cambrex，Cat no BE17-516F)
冷冻保护试剂
二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，Cat no D2650)
因子
使用了六种不同的重组因子：
Figure G2008800132573D00391
重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat no 450-13)
Figure G2008800132573D00392
重组人胰岛素样因子1(IGF-1)(Peprotech Inc，Cat no 100-11)
Figure G2008800132573D00393
重组人白细胞介素6(IL6)(Peprotech Inc，Cat no 200-06)
Figure G2008800132573D00394
重组人可溶性白细胞介素6受体(sIL6r)(Peprotech Inc，Cat no 200-06R)
重组人干细胞因子(SCF)(Peprotech Inc，Cat no 300-07)
Figure G2008800132573D00396
重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Peprotech Inc，Cat no 100-18B)
除了IL6r之外所有的因子均在大肠杆菌细菌中生产。可溶性IL6r在转染的HEK293细胞中表达。
胎牛血清
未受辐照的胎牛血清(FBS)(SAFC，Cat no 12003)
在本程序中使用的未受辐照的血清是在澳大利亚收集和生产的。用于收集的动物为USDA检验的适于屠宰的。在禽干细胞培养过程中将其加入到培养基中。该批不进行辐射照射以避免破坏被鉴定为对保持培养中的干细胞至关重要的关键蛋白或成分。
经辐照的血清(JRH，Cat no 12007)
在本程序中使用的经辐照的批次是在澳大利亚收集的。在用于培养STO或FED细胞(饲养细胞)的DMEM培养基中补充该经辐照的批次。那些细胞不像干细胞一样需要特定质量的血清用于培养中的生长和保持。为了使培养基中的血清高浓度最小化，我们将STO细胞适应于在只有4％的FBS中生长。
分离试剂
Trypzean(Sigma，cat no T3449)
2.2建立品系0细胞系的方法
按照实施例1.2中所述的方法收集来自品系0的鸡的13个鸡蛋的胚胎。然后，将品系0胚胎置于含有1X PBS的管中，然后将胚胎机械分离并在39℃接种到完全培养基中的饲养细胞STO细胞层上。饲养细胞以约2.7×104个细胞/cm2植于碟中。完全培养基由商售基础培养基DMEM-HamF12组成，其中补充了10％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF、bFGF、IL6、IL6r和SCF；和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.2mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.9mM的谷氨酰胺；1X的酵母自溶液；含有终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素的抗生素初始混合物。在传代7次后不再向培养基添加抗生素的混合物。
当来自鸡品系0胚胎的禽ES细胞是从一个培养碟转移至另一个时，培养碟的种植是以约7×104/cm2至8×104/cm2个禽ES细胞在完全培养基中进行。优选地，种植以约7.3×104/cm2(4×106个细胞/55cm2或4×106个细胞/100mm培养碟)进行。禽细胞，优选步骤a)的禽胚胎细胞在几个传代中培养于补充了10％或15％FBS的完全培养基。在第7次传代时，从完全培养基中除去生长因子bFGF、IL6、IL6r和SCF。在一个传代到另一个传代时，在一个步骤中直接除去。胚胎干细胞，优选禽胚胎干细胞在几个传代中培养于不含那4种生长因子的完全培养基。在第12次传代时，从培养基中除去最后两种因子IGF1和CNTF，在不含因子的情况下扩增细胞。
为了促进细胞生长，连续使用3个基础培养基：从第1次传代到第18次传代使用DMEM Ham F12，从第18次传代到第26次传代使用Exell GTM-3，从第26次传代后使用Excell 66788和Excell 66522的混合物。
在第30次传代后，在几个传代中通过逐渐降低饲养细胞的浓度而除去饲养细胞，然后按照上面描述的逐步过程进行。在这个除去饲养物的过程中，使用Exell66444作为生长培养基将一些能够悬浮生长的细胞分离出来，然后启动血清的去除(图1B)。
实施例3：鸭EBx细胞系EB66
3.1原始材料
鸭蛋
来自北京株GL30的鸭蛋从GRIMAUD FRERES SELECTION(La Corbiére，Roussay France)获得。亲代鸭进行针对以下的疫苗接种：大肠杆菌(EscherichiaColi)(自生的疫苗Coli 01&02)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)(Landavax)、鸭肝炎病毒(Hepatovax)，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax)、禽变性肺病毒(metapneumovirus)(Nemovac)、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌(Salmonella typhimurium&Enteridis)(自生的疫苗)、鸭疫里氏杆菌(Riemerellaantipestifer)(自身菌苗Riemerella)、禽变性肺病毒(灭活的Nobilis RTV)和红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax)。接受以后，受精的北京鸭蛋在次氯化物浴中进行消毒然后以Fermacidal(热)进行消毒以避免与蛋壳上粘附的灰尘相关的任何污染风险。
饲养细胞
在方法的第一个步骤中，鼠源的细胞(STO细胞)用作饲养层以保持鸭干细胞的多能性。在植到塑料上之前使用伽马射线(45至55Gray)使那些饲养细胞的有丝分裂失活。该射线剂量为亚致死剂量，其诱导细胞周期的决定性停滞但仍然允许生长因子和细胞外基质的产生，这些生长因子和细胞外基质对于未分化细胞的细胞生长的促进是必需的。STO细胞由A.Bernstein，Ontario Cancer Institute，Toronto，Canada从SIM(Sandos同系繁殖小鼠)小鼠胚胎成纤维细胞的持续系中得到，由美国典型微生物保藏中心(ATCC)(STO产品编号：CRL-1503，批次号1198713)提供。饲养细胞层每周制备两次。分离指数期细胞并进行计数。将一部分细胞种植以保持活培养，另一部分进行照射。为了照射，我们准备了管中的10×106个细胞/ml的细胞悬浮液。将细胞暴露于45至55grey的剂量并植在塑料上。植完以后，在最长5天的时间内使用以钝化的饲养细胞包被的碟或板。
培养基
EX-CELLTM65788，65319，63066和66444培养基(SAFC，订制培养基)
GTM-3培养基(Sigma，Cat no G9916)
DMEM-HamF12(Cambrex，Cat no BE04-687)
DMEM(Cambrex，Cat no BE12-614F)
添加物
谷氨酰胺(Cambrex，Cat no BE17-605E)
青霉素/链霉素(Cambrex，Cat no BE17-602E))
非必需氨基酸(Cambrex，Cat no BE13-114E)
丙酮酸钠(Cambrex，Cat no BE13-115)
维生素(Cambrex，Cat no 13-607C)
β巯基乙醇(Sigma，Cat no M7522)
酵母自溶液(SAFC，Cat no 58902C)
缓冲液和固定剂
PBS 1X(Cambrex，Cat no BE17-516F)
冷冻保护试剂
二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，Cat no D2650)
因子
使用了两种不同的重组因子：
Figure G2008800132573D00421
重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat no 450-13)
Figure G2008800132573D00422
重组人胰岛素样因子1(IGF-1)(Peprotech Inc，Cat no 100-11)
这两种因子在大肠杆菌细菌中生产。
胎牛血清
未受辐照的胎牛血清(FBS)(JRH，Cat no 12003)
在本程序中使用的未受辐照的血清是在澳大利亚收集和生产的。用于收集的动物为USDA检验的适于屠宰的。在禽干细胞培养过程中将其加入到培养基中。该批不进行辐射照射以避免破坏被鉴定为对保持培养中的干细胞至关重要的关键蛋白或成分。
经辐照的血清(JRH，Cat no 12107)
在本程序中使用的经辐照的批次是在美国收集的。在用于培养STO细胞(饲养细胞)的DMEM培养基中补充该经辐照的批次。那些细胞不像干细胞一样需要特定质量的血清用于培养中的生长和保持。为了使培养基中的血清高浓度最小化，我们将STO细胞适应于在只有4％的FBS中生长。
分离式剂
链霉蛋白酶(Roche，Cat no 165921)
链霉蛋白酶是由Roche Diagnostics，Germany生产的重组蛋白酶，用于粘附性禽干细胞的分离。
胰蛋白酶EDTA(Cambrex，cat no BE17-161E)
胰蛋白酶用于STO细胞的分离和在晚期传代时用于适应于无血清培养基的禽细胞的分离。这种猪来源的酶通过经验证的无菌过滤方法，根据cGMP参考条件无菌制造并根据现行E.P.测试。该原材料(在制剂之前经辐照)严格按照9/CFR113.53进行猪细小病毒的测试。
Trypzean(Sigma，cat no T3449)
Trypzean溶液用在谷类中表达的牛胰蛋白酶重组体配制，并由Sigma Aldrich使用ProdiGene拥有的转基因植物蛋白表达系统生产。优化该产品用于在无血清和补充血清的粘附性细胞培养物中的细胞分离。
非酶解性细胞分离溶液(Sigma，Cat no C5914)
该分离试剂为随时可用的制剂，用于将细胞温和地从培养器皿生长表面中分离下来。配方不含蛋白，并允许在不使用酶的情况下移走细胞。保留细胞蛋白用于进行依赖细胞表面蛋白识别的可能的免疫化学研究。该酶用于在对生物标记像EMA-1(上皮膜抗原1)和SSEA1(阶段特异性胚胎抗原-1)进行FACS分析前分离细胞。
3.2建立鸭EBx细胞系EB66的方法
打开约360个受精的鸭蛋，在打开的过程中蛋黄从蛋白中分离出来。使用小的吸附性滤纸(Whatmann 3M纸)(事先用打孔器就该滤纸打成穿孔环形式)从蛋黄中移出胚胎。穿孔的直径为约5mm。在烤箱中通过干热对这些小环进行灭菌30分钟。在实践中，在胚胎收集的步骤中，将小纸环置于蛋黄表面和胚胎正中，因此胚胎被纸环环绕。然后以小的剪刀剪掉纸环，将其除掉的整个置于注满PBS的皮氏培养皿中。因此在介质中将由环切下的胚胎清洗掉多余的蛋黄，以巴斯德移液管收集不含多余蛋黄素的胚盘。
将鸭胚胎置于含有1X PBS 50ml的管中。然后将鸭胚胎机械分离，用PBS清洗，并在39℃，7.5％CO2接种到完全培养基中钝化的STO细胞饲养层上。饲养细胞以约2.7×104个细胞/cm2植于6孔板或碟中。完全培养基由无血清培养基DMEM-HamF12组成，其中补充了10％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF；和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；终浓度为100U/ml的青霉素；终浓度为100μg/ml的链霉素；1X的酵母自溶液。在第4次传代后的短时间内不再向培养基添加抗生素。
鸭ES细胞在DMEM-Ham F12培养基中培养至第4次传代。第4次传代后，修改基础培养基，DMEM-Ham F12完全培养基被SFM GTM-3培养基替换，SFMGTM-3培养基中补充了10％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF；和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；1X的酵母自溶液。然后在这个新的培养基中在第14次传代中继续培养鸭ES细胞，然后在第18个传代时除去生长因子。从培养基中同时除掉IGF1和CNTF，因此从第19个传代至第24个传代，培养基是GTM-3培养基，其中补充了10％胎牛血清；1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；1X的酵母自溶液。
当来自北京鸭胚胎的鸭ES细胞是从一个培养碟传代至另一个时，培养碟的种植是以约7×104/cm2至12×104/cm2个鸭ES细胞在完全培养基中进行。
然后，在第24次传代后，通过在几个传代中逐渐降低饲养细胞的浓度而除去饲养细胞。最初碟中植入约2.7×104个饲养细胞/cm2，然后在第25次至31次传代为约1.8×104个饲养细胞/cm2，然后在第32次至35次传代为约1.4×104个饲养细胞/cm2，然后在第36次至41次传代为约1×104个饲养细胞/cm2，然后在第42次至44次传代为约0.7×104个饲养细胞/cm2，最终从第45次传代开始只植入禽细胞而无饲养细胞。在除去饲养细胞末尾，碟中植入9×104个禽细胞/cm2至12.7×104个禽细胞/cm2。在第25个传代开始除去饲养细胞，结束于第45个传代。在除去饲养细胞时，将鸭ES细胞以高于步骤a)中的浓度植于培养碟，浓度为约9×104个细胞/cm2至12.7×104个细胞/cm2。
在不含饲养细胞进行几个传代后，研究生长参数(群体加倍时间(PDT)和密度)以确认细胞稳定性和强壮性，并开始除去氨基酸、维生素、β巯基乙醇、丙酮酸钠和酵母自溶液。如果PDT在约40小时以下且细胞密度在约26×104个细胞/cm2以上，则认为细胞足够强壮可以进行这样的去除。
在发育鸭
Figure G2008800132573D00441
细胞即EB66的情况下，从第52次传代开始除去维生素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和β巯基乙醇。从培养基中同时除去所有的这些添加物。因此，从第52个传代至第59个传代，培养基是SFM GTM-3培养基，其中补充了谷氨酰胺、酵母自溶液和FBS。在一小段时间的适应于新培养条件之后，开始降低温度。在第60个传代至第67个传代之间逐渐降低温度。在第67个传代之后细胞能够在37℃生长。在第67个传代之后，基础培养基GTM-3被新的SFM基础培养基替换，称为Excell65788。所以，在第67个传代之后培养基为Excell65788，其中补充了10％的FBS、2.5mM谷氨酰胺和1X酵母自溶液。在第80个传代，将4×106个细胞转移至超低粘附性(ULA)碟并保持恒定摇晃以启动锚定非依赖性细胞生长。为了促进悬浮生长，修改基础培养基，血清的百分率从10％降至5％以植于ULA碟。因此，从第80个传代至第85个传代，培养基是SFM GTM-3，其中补充了5％FBS、2.5mM谷氨酰胺和1X酵母自溶液。从第85个传代后开始缓慢降低EB66细胞悬浮液中的FBS。通过逐渐降低血清而除去血清，从2.5％血清开始，然后是SFM细胞培养基中1.5％的血清浓度，最终至SFM细胞培养基中0％的血清。血清的去除开始于第86个传代，结束于第94个传代。在去除血清的末尾，锚定非依赖性dEB66细胞能够在37℃在不含生长因子、不含饲养细胞的无血清培养基中生长。
在获得能够在37℃在补充了2.5mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生长的EB66鸭细胞之后，通过稀释或逐渐适应于新的SFM配方例如Excell 63066、Excell66444、Excell CHO ACF而进一步进行对SFM培养基的适应。
也可在酵母自溶液存在或不存在的情况下进行悬浮鸭EB66细胞的亚克隆。
实施例4：鸭EBx细胞系EB26
4.1原始材料
鸭蛋、饲养细胞、添加物、缓冲液和固定剂、冷冻保护剂、胎牛血清和分离试剂(与实施例3中的相同)
使用来自北京株GL30的鸭蛋。
培养基
培养基EX-CELL 65319，63066和66444(SAFC，订制培养基)
培养基GTM-3(Sigma，Cat no G9916)
DMEM(Cambrex，Cat no BE 12-614F)
因子
使用了六种不同的重组因子：
重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat no 450-13)
Figure G2008800132573D00452
重组人胰岛素样因子1(IGF-1)(Peprotech Inc，Cat no 100-11)
重组人白细胞介素6(IL6)(Peprotech Inc，Cat no 200-06)
Figure G2008800132573D00454
重组人可溶性白细胞介素6受体(sIL6r)(Peprotech Inc，Cat no 200-06R)
Figure G2008800132573D00455
重组人干细胞因子(SCF)(Peprotech Inc，Cat no 300-07)
Figure G2008800132573D00456
重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Peprotech Inc，Cat no 100-18B)
除了IL6r之外所有的因子均在大肠杆菌细菌中生产。可溶性IL6r在转染的HEK293细胞中表达。
4.2建立鸭细胞系EBx细胞系EB26的方法
按照前述方法从EB66中收集鸭胚胎。将鸭胚胎置于含有1X PBS的50mL的管中。然后将鸭胚胎机械分离，在PBS中洗涤并在39℃，7.5％CO2接种到完全培养基中的钝化的STO细胞饲养层上。饲养细胞以约2.7×104个细胞/cm2植于6孔板或碟中。完全培养基由无血清的GTM3组成，其中补充了5％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF、Il-6、Il-6R、SCF和FGF；和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素；1X的酵母自溶液。在第一次传代后的短时间内即不再向培养基添加抗生素。术语“短时间内”通常应理解为前3至9次传代。鸭ES细胞在完全培养基中培养至第9次传代。第9次传代后，从完全培养基中除去部分因子。因此，从第10个传代至第13个传代，从培养基中除去SCF、Il-6、Il-6r和bFGF，只保持浓度为1ng/mL的重组IGF1和CNTF。然后在第13个传代至第16个传代之间同时降低IGF1和CNTF的浓度，最终至第17次传代时获得能够在不含重组因子时生长的细胞。通过逐渐适应于低浓度因子进行因子的去除。当来自北京鸭胚胎的鸭ES细胞是从一个培养碟传代至另一个时，培养碟的种植是以约7×104/cm2至12×104/cm2个鸭ES细胞在完全培养基中进行。优选地，种植以约7.3×104/cm2(4×106个细胞/55cm2或4×106个细胞/100mm培养碟)进行。在除去重组因子后，在第23次传代时降低酵母自溶液的浓度，达到最终的浓度即0.5X。然后，在第31次传代后，通过在几个传代中逐渐降低饲养细胞的浓度而除去饲养细胞。最初碟中植入约2.7×104个饲养细胞/cm2，然后在第32次至38次传代为约1.8×104个饲养细胞/cm2，然后在第39次至44次传代为约1.4×104个饲养细胞/cm2，然后在第45次至47次传代为约1×104个饲养细胞/cm2，然后在第48次至50次传代为约0.7×104个饲养细胞/cm2，最终从第51次传代开始只植入禽细胞而无饲养细胞。在除去饲养细胞末尾，碟中植入9×104个禽细胞/cm2至12.7×104个禽细胞/cm2。在第32个传代开始除去饲养细胞，结束于第51个传代。在除去饲养细胞时，将鸭ES细胞以高于步骤a)中的浓度植于培养碟，浓度为约9×104个细胞/cm2至12.7×104个细胞/cm2。在不含饲养细胞进行几个传代后，研究生长参数(群体加倍时间(PDT)和密度)以确认细胞稳定性和强壮性，并开始细胞的悬浮培养。如果PDT在约40小时以下且细胞密度在约26×104个细胞/cm2以上，则认为细胞足够强壮可以进行悬浮培养。此外，细胞形态应该是：圆形、有折射力的、非常小且细胞不应该附着于塑料碟太多。
在培育EB26细胞的情况下，从第53次传代开始进行悬浮培养。将7×106个细胞转移至超低粘附性碟并保持约50至70rpm的恒定摇晃。为了后续传代，将细胞以0.4-0.5×106个细胞/ml的浓度植于T175瓶(Sarsted，ref 831812502)。在适应于新培养条件之后的较短时间，细胞PDT从约160小时降至40小时。对于这种良好的进化，在第59次传代，进行新一轮的去除。因此，除去维生素、丙酮酸钠、β-巯基乙醇和非必需氨基酸。因此在第59次传代后，培养基为只补充5％FBS、0.5X酵母自溶液和2.5mM谷氨酰胺。在从已经除去了生长因子、饲养细胞、维生素、非必需氨基酸、丙酮酸钠和β-巯基乙醇的细胞悬浮液中除去血清。通过逐渐降低血清而除去血清，从5％血清开始，然后是SFM细胞培养基中2.5％，然后1.5％的血清浓度，最终至SFM细胞培养基中0％的血清。血清的去除开始于第61个传代，结束于第79个传代。在去除血清的末尾，锚定非依赖性鸭EB26细胞能够在39℃在不含生长因子、不含饲养细胞的无血清培养基中生长。然后在第80次传代通过降低细胞培养温度而将EB26细胞适应于在37℃在不含0.5X酵母自溶液的情况下生长。
在获得能够在37℃在补充了2.5mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生长的EB66细胞之后，通过稀释或逐渐适应于新的SFM配方例如Excell 63066、Excell 66444、Excell CHO ACF而进一步进行适应。也可在酵母自溶液存在或不存在的情况下进行悬浮鸭EB26细胞的亚克隆。
实施例5：鸭EBx细胞系EB24
5.1原始材料
鸭蛋、饲养细胞、添加物、缓冲液和固定剂、冷冻保护剂、胎牛血清和分离试剂(与实施例3中的相同)
使用来自北京株GL30的鸭蛋。
培养基
培养基EX-CELLTM 65319，63066和66444(SAFC，订制培养基)
培养基GTM-3(Sigma，Cat no G9916)
DMEM F 12(Cambrex，Cat no BE04-687)
DMEM(Cambrex，Cat no BE 12-614F)
因子
使用了六种不同的重组因子：
Figure G2008800132573D00471
重组睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat no 450-13)
重组人胰岛素样因子1(IGF-1)(Peprotech Inc，Cat no 100-11)
Figure G2008800132573D00473
重组人白细胞介素6(IL6)(Peprotech Inc，Cat no 200-06)
Figure G2008800132573D00474
重组人可溶性白细胞介素6受体(sIL6r)(Peprotech Inc，Cat no 200-06R)
Figure G2008800132573D00475
重组人干细胞因子(SCF)(Peprotech Inc，Cat no 300-07)
Figure G2008800132573D00476
重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Peprotech Inc，Cat no 100-18B)
除了IL6r之外所有的因子均在大肠杆菌细菌中生产。可溶性IL6r在转染的HEK293细胞中表达。
5.2建立鸭细胞系
Figure G2008800132573D00477
细胞系EB24的方法
按照前述方法从EB66中收集鸭胚胎。将鸭胚胎置于含有1X PBS的50mL的管中。然后将鸭胚胎机械分离，并在39℃，7.5％CO2接种到完全培养基中的钝化的STO细胞饲养层上。饲养细胞以约2.7×104个细胞/cm2植于6孔板或碟中。完全培养基由无血清的DMEM-HamF12组成，其中补充了10％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF、Il-6、Il-6R、SCF和FGF；和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素；1X的酵母自溶液。在细胞第一次传代后的短时间内不再向培养基添加抗生素。术语“短时间内”通常应理解为前3至9次传代。
鸭ES细胞在DMEM-Ham F12培养基中培养至第7次传代。第7次传代后，修改基础培养基，DMEM-Ham F12完全培养基被GTM-3培养基替换，GTM-3培养基中补充了10％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF、I1-6、Il-6R、SCF和FGF；1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素；1X的酵母自溶液。因此，在第11次传代时，将血清浓度降低至5％，并从培养基中除去SCF、IL-6、IL6r和bFGF。所以，从第11个传代开始，培养基由下列组成：5％FBS；终浓度为1ng/ml的IGF1和CNTF；1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素；1X的酵母自溶液。在第22次传代时，同时除去IGF1和CNTF。在第22个传代后，GTM-3培养基中不存在重组因子。在第23次传代至第28次传代之间在这样的培养基中保持鸭细胞。当来自北京鸭胚胎的鸭ES细胞是从一个培养碟传代至另一个时，培养碟的种植是以约7×104/cm2至12×104/cm2个鸭ES细胞在完全培养基中进行。优选地，种植以约7.3×104/cm2(4×106个细胞/55cm2或4×106个细胞/100mm培养碟)进行。然后，在第28次传代后，通过在几个传代中逐渐降低饲养细胞的浓度而除去饲养细胞。最初碟中植入约2.7×104个饲养细胞/cm2，然后在第29次至33次传代为约1.8×104个饲养细胞/cm2，然后在第34次至37次传代为约1.4×104个饲养细胞/cm2，然后在第38次至42次传代为约1×104个饲养细胞/cm2，然后在第43次至46次传代为约0.7×104个饲养细胞/cm2，最终从第47次传代开始只植入禽细胞而无饲养细胞。在除去饲养细胞末尾，碟中植入9×104个禽细胞/cm2至12.7×104个禽细胞/cm2。除去饲养细胞在第29个传代开始，结束于第47个传代。在除去饲养细胞时，将鸭ES细胞以高于步骤a)中的浓度植于培养碟，浓度为约9×104个细胞/cm2至12.7×104个细胞/cm2。在不含饲养细胞进行几个传代后，研究生长参数(群体加倍时间(PDT)和密度)以确认细胞稳定性和强壮性，并开始细胞悬浮生长。如果PDT在约40小时以下且细胞密度在约26×104个细胞/cm2以上，则认为细胞足够强壮可以进行悬浮培养。此外，细胞形态应该是：圆形、有折射力的、非常小且细胞不应该附着于塑料碟太多。在培育EB24细胞的情况下，从第48次传代开始进行悬浮培养。将8×106个细胞转移至超低粘附性碟并保持约50至70rpm的恒定摇晃。为了下一次传代，将细胞以0.4-0.5×106个细胞/ml的浓度植于T175瓶(Sarsted，ref 831812502)。在适应于新培养条件之后的较短时间，细胞PDT从约248小时降至128小时，然后进行后续去除步骤。因此，在第52次传代，维生素、非必需氨基酸、丙酮酸钠和β巯基乙醇被除去。对于这种达到44小时的PDT的良好进化，在第56次传代，从第57次传代后，进行血清的去除。因此从第57次传代开始，GTM-3培养基为只补充5％FBS、1X酵母自溶液和2.5mM谷氨酰胺。从已经除去了生长因子、饲养细胞、维生素、非必需氨基酸、丙酮酸钠和β-巯基乙醇的细胞悬浮液中除去血清。通过逐渐降低血清而除去血清，从5％血清开始，然后是SFM细胞培养基中2.5％，然后2％。然后1.5％的血清浓度，最终至SFM细胞培养基中0％的血清。血清的去除开始于第57个传代，结束于第77个传代。在去除血清过程中，也进行在37℃生长的适应。因此在第65次传代，生长于补充了2.5％FBS的培养基的细胞被转移至37℃以避免逐渐的温度变化。在去除血清的末尾，锚定非依赖性鸭EB24细胞能够在37℃在不含生长因子、不含饲养细胞的无血清培养基中生长。
在获得能够在37℃在补充了2.5mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生长的鸭EB24细胞之后，通过稀释或逐渐适应于新的SFM配方例如Excell 63066、Excell 66444、Excell CHO ACF而进行进一步的适应。也进行了悬浮鸭EB24的亚克隆，由于其有效复制病毒的较好表现而选择了鸭EB24-12亚克隆。
实施例6：SPF鸭番鸭EBx细胞系
6.1原始材料
鸭蛋
来自番鸭品系鸭SPF蛋从Le Couvoir de Cerveloup(France)获得。那些SPF鸭蛋由仔细检测了各种禽病原体的群体中产生。所检测的疾病包括：鸡白痢沙门氏菌(Salmonella gallinarum-pullorum)、滑液囊霉形体(Mycoplasma synoviae)、火鸡支原体(Mycoplasma meleagridis)、鸡败血支原体(Mycoplasma galliepticum)、马立克病病毒、禽流感病毒、2型副粘病毒、3型副粘病毒、新城疫病毒、3型腺病毒(EDS)、甘波罗(Gumboro)病、禽呼肠孤病毒、网状内皮组织增殖病毒、禽脑脊髓炎、感染性鼻气管炎(rhinotracheitis)病毒和衣原体病(Chlamydiosis)。番鸭蛋只进行消毒剂的消毒以避免在运输过程中操作鸭蛋相关的任何污染风险。
饲养细胞(参见前面的实施例)
培养基
EX-CELLTM 66444培养基(SAFC，订制培养基)
GTM-3培养基(Sigma，Cat no G9916)
DMEM-HamF 12(Cambrex，Cat no BE04-687)
添加物
谷氨酰胺(Cambrex，Cat no BE17-605E)
青霉素/链霉素(Cambrex，Cat no BE17-602E))
非必需氨基酸(Cambrex，Cat no BE13-114E)
丙酮酸钠(Cambrex，Cat no BE13-115)
维生素(Cambrex，Cat no 13-607C)
β巯基乙醇(Sigma，Cat no M7522)
酵母自溶液(SAFC，Cat no 58902C)
缓冲液和固定剂
PBS 1X(Cambrex，Cat no BE17-516F)
冷冻保护试剂
二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，Cat no D2650)
因子
使用了两种不同的重组因子：
Figure G2008800132573D00501
重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat no 450-13)
重组人胰岛素样因子1(IGF-1)(Peprotech Inc，Cat no 100-11)
这两种因子在大肠杆菌细菌中生产。
胎牛血清
未受辐照的胎牛血清(FBS)(JRH，Cat no 12003)
在本程序中使用的未受辐照的血清是在澳大利亚收集和生产的。用于收集的动物为USDA检验的和适于屠宰的。在禽干细胞培养过程中将其加入到培养基中。该批不进行辐射照射以避免破坏被鉴定为对保持培养中的干细胞至关重要的关键蛋白或成分。
经辐照的血清(JRH，Cat no 12007)
在本程序中使用的经辐照的批次是在澳大利亚收集的。在用于培养STO细胞(饲养细胞)的DMEM培养基中补充该经辐照的批次。那些细胞不像干细胞一样需要特定质量的血清用于培养中的生长和保持。为了使培养基中的血清高浓度最小化，我们将STO细胞适应于在只有4％的FBS中生长。
分离试剂
链霉蛋白酶(Roch e，Cat no 165921)
Trypzean(Sigma，cat no T3449)
6.2建立番鸭EBx细胞系的方法
按照实施例3中描述的方法从20个番鸭受精SPF卵中收集胚胎。将鸭胚胎置于含有1X PBS的50mL的管中。然后将鸭胚胎机械分离，并以PBS洗涤，植于用钝化的STO细胞饲养层包被的12孔培养板的孔中。将鸭胚胎细胞植于完全培养基并在39℃，7.5％5％CO2转移。饲养细胞以约2.7×104个细胞/cm2种植。使用的完全培养基由DMEM-HamF12组成，其中补充了10％胎牛血清；终浓度为1ng/ml的IGF1和CNTF；和1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；终浓度为100U/ml的青霉素和终浓度为100μg/ml的链霉素；1X的酵母自溶液。在第2次传代，以GTM-3基础培养基替换DMEM-HamF12基础培养基。在第4次传代后，不再向培养基中添加抗生素混合物。
鸭ES细胞在GTM-3完全培养基中培养至第8次传代。第8次传代后，IGF1和CNTF的浓度降至0.5ng/ml。继续在此新的培养基中培养鸭ES细胞传代两次，然后在第10次传代除去生长因子。从培养基中同时除去IGF1和CNTF。
因此，从第10次传代至第37次传代，培养基为GTM-3培养基，其中补充了10％胎牛血清；1％非必需氨基酸；1％商业来源的维生素混合物；终浓度为0.1mM的丙酮酸钠；终浓度为0.5mM的β-巯基-乙醇；终浓度为2.1mM的谷氨酰胺；和1X的酵母自溶液。
当来自番鸭胚胎的鸭ES细胞是从一个培养碟传代至另一个时，培养碟的种植是以约12×104/cm2个鸭ES细胞在培养基中进行。有时可使用一些条件培养基用于细胞种植以改善分离后的细胞恢复。
然后，在第37次传代后，在几次传代中通过逐渐降低饲养细胞的浓度而除去饲养细胞，然后进行上面描述的逐步过程。
在去除饲养细胞期间，分离出一些能够悬浮生长的细胞并适应于在无添加物和血清的情况下生长(图4C)。锚定非依赖性番鸭EBx细胞表达ES细胞标记，例如端粒酶、SSEA-1和EMEA-1(数据未显示)。
实施例7：EBx细胞系的鉴定
7.1鸡VALO EBv13细胞的鉴定
7.1.1-端粒酶活性
使用Roche Applied Science研发的Telo TAGGG端粒酶PCR ELISA根据提供者的说明书(Telomeric Repeat Amplification Protocol(TRAP)-Cat.No.11854666910)进行端粒酶的检测。Telo TAGGG端粒酶PCR ELISA允许与非放射性检测结合的端粒酶介导的延伸产物的扩增，按照ELISA程序进行。当在检验中使用1×103个细胞当量时，如果阴性对照的吸收值小于或等于0.25A450nm-A690nm时并且如果阳性对照的吸收值高于或等于1.5A450nm-A690nm时该检验是有效的。如果吸收的差异在0.2A450nm-A690nm单位以上则认为样品是端粒酶阳性的。使用两种对照：阴性对照为鼠成纤维细胞(FED细胞)；阳性对照为FGB8细胞(由Vivalis从129SV小鼠胚胎建立的胚胎干细胞)和以前在WO 03/076601中建立的鸡EB14-O74细胞。
在图2中总结了获得的结果，EBv13确实表达高水平端粒酶，在传代p193和195，端粒酶的活性与一个鸡EB14-O74细胞的端粒酶活性相当。
7.1.2-ES细胞的生物标记
胚胎干细胞的特征为在细胞膜上表达生物标记。通过FACS分析评估了EBv13细胞上EMA-1(上皮膜抗原-1)和SSEA-1(阶段特异性胚胎抗原-1)的表达。以4％PFA(多聚甲醛)固定10分钟后，漂洗细胞样品和对照，然后以EMA-1或SSEA-1的特异性单克隆抗体预先孵育。使用与FITC偶联的第二抗体检测表达所选的2个生物标记的细胞。使用来自Coulter的FACS(荧光激活细胞分选仪)通过流式细胞术分析样品。
FACS分析在作为阴性对照的小鼠成纤维细胞(FED细胞)、作为阳性对照的鼠ES FGB8细胞和作为阳性对照的鸡EB14-O74细胞以及EBx细胞和EBv13细胞上进行。如所预期的那样，FED细胞不表达生物标记而FGB8和EB14-O74细胞表现出重要的染色，对EMA-1来说分别是60.13％和78.7％；对SSEA-1来说分别是94.45％和95％(数据未显示)。鸡valo EBv13细胞群对EMA1没有显示出任何染色(2％)，对SSEA-1为很少的染色(22％)。
7.1.3-核型
进行了核型分析以检查细胞的双倍性和EBv13细胞的禽来源性。收获处于指数生长期的细胞并以秋水仙胺(0.02μg/mL)处理2个小时。洗涤和离心后，使用KCl(0.56％)对细胞进行低渗处理20分钟。然后将EBv13细胞固定于甲醇/乙酸(3/1)并储存于-20℃过夜。第二天，分裂中期点至玻璃，以wright/giemsa溶液染色并在显微镜下观察。观察到了几个系列的分裂中期，这确认了EBv13细胞的鸡来源。没有观察到多倍体的证据。
7.1.4-细胞培养基成分对EBv13细胞簇大小的影响
本发明人发现用于EBx细胞培养和感染的无血清培养基中钙和镁的浓度对于簇的大小有影响。
图10显示当EBv13细胞从高Ca2+和Mg2+浓度转移到低Ca2+和Mg2+浓度的培养基时，簇的大小降低。
7.2-鸭EBx细胞系的鉴定
7.2.1-鸭EBx细胞形态
细胞的透射电子显微镜分析由Dr.A Rivoire(Lyon，France)进行。鸭
Figure G2008800132573D00522
细胞显示出典型的胚胎干细胞形态(即高细胞核-细胞质比)，类似于鼠胚胎干细胞和WO2006/108846中描述的VIVALIS EB14细胞的表型。鸭细胞为小的圆细胞(直径～10μm)，具有大的细胞核和核仁，具有从细胞膜延伸的短的伪足(图4)。它们为高度代谢活性的，具有富含核糖体和线粒体的胞浆。它们含有很多细胞内液泡、非常发达的高尔基体系统和颗粒状内质网。
7.2.2-鸭
Figure G2008800132573D00524
细胞的端粒酶表达
使用罗氏端粒酶检测试剂盒(Telomerase OCR ELISA)研究建立鸭细胞过程中不同阶段的端粒酶的表达。在粘附性鸭
Figure G2008800132573D00526
细胞中，以及在除去饲养物过程中，在将鸭
Figure G2008800132573D00527
细胞适应于悬浮的过程中和在除去饲养物过程中发现端粒酶是高度表达的。图5显示鸭EB24和EB26表达高水平的端粒酶，就像鸡EB14细胞一样。鸭EB66也在所有细胞传代中表达高水平端粒酶。在EB66细胞适应于不同的SFM后在EB66细胞中这种高端粒酶活性是稳定的(图15)。
7.2.3-鸭
Figure G2008800132573D00528
细胞显示出无内源性逆转录酶活性
通过在Clean细胞(FRANCE)中进行直接F-PERT分析(Lovatt等人，1999，J.Virol.Methods，82：185-200)来研究内源性逆转录酶表达。鸭
Figure G2008800132573D00529
细胞系、EB24(数据未显示)、EB66(数据未显示)、EB26和EB51未表现出内源性逆转录酶(RT)活性(图6A)。在鸡EB14细胞培养物中检测到了RT活性，以及在源自特异性无病原体(SPF)鸡株的鸡胚胎成纤维细胞中检测到了较低程度的RT活性。
通过ELISA检验(其检测禽白血病主要衣壳抗原P27)来研究鸭和鸡
Figure G2008800132573D005210
细胞的细胞培养上清液中内源性逆转录病毒颗粒的存在，无论病毒颗粒是复制性或非复制性的(图6B)。所有的鸭细胞系(EB26、EB51、EB24、EB66等)以及鸡EBv13不分泌ALV p27抗原。相反，鸡EB14细胞确实表达ALV p27抗原。
7.2.4-鸭EBx细胞不分泌复制性禽白血病病毒(ALV)
进行了鸭EBx细胞和鹌鹑QT6细胞系的共同培养的检验以检测内源性可复制鸭病毒的存在，已知鹌鹑QT6细胞系对内源性和外源性ALV敏感。图7A描述了QT6共培养的原理。通过ELISA(其检测禽白血病主要衣壳抗原P27)检验可复制性病毒的存在。该检验证明所测的鸭EBx细胞中没有一个分泌复制性(即有复制能力)ALV(图7B)。
7.2.5-鸭EBx细胞表达禽和人类流感病毒受体
鸭EBx细胞上的针对禽(Siaα2-3Gal)和人(Siaα2-6Gal)流感病毒的受体的检测通过使用地高辛标记的植物血凝素(Boehringer)以荧光细胞分选仪分析进行：
Sambuca nigra(SNA)凝集素植物血凝素特异性与Sia2-6Gal结合；
Maackia amurensis(MAA)凝集素植物血凝素特异性与Sia2-3Gal结合。
在10mM HEPES、150mM NaCl pH7.5中洗涤鸡EB14和鸭EBx细胞并以5×106的终浓度重悬于同样的缓冲液。在冰上孵育细胞30分钟，然后在SNA或MAA存在的情况下继续孵育15至30分钟。在10mM HEPES、150mM NaCl pH7.5中洗涤植物血凝素处理的细胞，然后在冰上以FITC标记的抗-地高辛抗体孵育15至30分钟。然后在0.9％的NaCl中洗涤细胞并进行FACS分析。
鸡EB14和EBx细胞表达细胞表面受体，该受体包含带有Siaα2-3Gal和Siaα2-6Gal残基的寡聚糖(图8)。
7.2.6-核型
进行了核型分析以检查细胞的双倍性和鸭EB24和EB66细胞的禽来源性。收获处于指数生长期的细胞并以秋水仙胺(0.6mg/mL)处理3-6个小时。洗涤和离心后，使用KCI(0.56％)对细胞进行低渗处理20分钟。然后将鸭EB24和EB66细胞固定于甲醇/乙酸(3/1)并储存于-20℃过夜。第二天，分裂中期点至玻璃，以wright/giemsa溶液染色并在显微镜下观察。
观察到了几个系列的分裂中期，这确认了EBx细胞的鸭来源。没有观察到多倍体的证据。图16显示了鸭EBx66细胞的双倍体核型(图16)。
实施例6：鸡EBv13细胞系中的痘病毒复制
使用编码GFP基因(绿色荧光蛋白)的重组修饰的安卡拉牛痘(MVA)来研究EBv13细胞对痘病毒感染的易感性。
使用以下方案：在感染前3天，将0.4X106EBv13细胞(传代188)/mL植于T175培养瓶中的40mL的SFM Excell 65319(SAFC)培养基，其中补充了4mM的谷氨酰胺。以10-2 TCID50/细胞的重复性感染进行感染(MVA-GFP贮存液为10e9.7TCID/ml)。感染后一个小时，向培养瓶中加入60ml的新鲜培养基。培养和感染在37℃，7.5％CO2和60rpm的摇晃中进行。感染后每一天均收集细胞悬浮液的等份并冷冻。在动力学末尾，按照TCID50方法进行生产率的评价。简单来说，在DF-1细胞上进行感染性MVA-GFP病毒的滴定。将细胞以15×103细胞/孔植于96孔平底培养板中的DMEM培养基(Biowhittaker)，其中补充了5％胎牛血清(FCS)(SAFC)和2mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker)。24小时后，细胞以DMEM中10倍系列稀释的样品感染并在37℃，5％CO2的潮湿空气中孵育一周。通过显微镜下观察全局性细胞病理效应(CPE)和暴露于UV的感染细胞而测定病毒感染力。然后根据Reed和Muench的方法(1938，A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.27，493-97)计算TCID50滴度。在实验全程监视细胞增殖和存活性。鸡ValoEBv13细胞似乎对MVA-GFP感染为高敏感性(图3A-3B)。
实施例8：鸭EBx细胞系中的痘病毒复制
使用编码GFP的重组修饰的安卡拉牛痘来研究鸭EBx细胞对痘病毒感染的易感性。按照前面对于鸡EBv13细胞所描述的方法进行病毒滴定。
8.1-细胞培养方法
鸭EBx储存于-196℃的液氮中的冷冻管中(20×106细胞/管)。将冷冻管直接在+37℃预热的水浴中融化。然后将细胞悬浮液置于有30ml预热培养基的50ml的无菌管中。离心(300±20g室温，5分钟)后，向沉淀中加入15新鲜培养基并轻轻混匀。使用台盼蓝(Trypan blue)进行样品计数。应有≥20×106细胞和大于70％的存活率以保证良好的培养。
将细胞悬浮液置于T75cm2培养瓶并在+37℃、7.5％CO2空气下在50rpm的轨道振动器上孵育。每日添加新鲜培养基。然后为了植于3L-生物反应器，将细胞传代以增加细胞生物量。需要320×106个细胞以接种于3L-生物反应器。轻轻混合后拿出样品以使用台盼蓝进行计数从而确定细胞密度。制备150mL的细胞混合物以获得生物反应器中800ml最终培养体积中0.4×106细胞/ml的细胞浓度。在植入细胞之前，将容器中的pH设定为7.2(因为pH将被CO2表面喷射所降低)。将pO2设定为50％O2饱和(将质量流量控制器调整为100％，这对应于50ml/min的最大喷洒流速)。在过程开始，由CO2表面喷射控制pH。后来，通过加入7.5％NaHCO3而控制。以0.3ml/min的空气流速开始进行表面充气。基于常规进行细胞计数。
培养三天后细胞密度应该达到4-5×106cells/ml以上。如果达到预期的细胞密度，则在10-4的MOI进行病毒感染。将容器温度设定为33℃。在冰上使病毒株溶化。在10ml的生产培养基中制备感染混合物。将感染混合物接种于生物反应器之后，在1小时内进行病毒吸附。最终的生产培养基这样制备：1.5L的生产培养基中，加入胰蛋白酶以获得容器中0.3U/ml的终浓度(总体为2.3L)。然后加入预热的最终生产培养基。每天从生物反应器中收集约15ml样品以进行细胞计数、细胞形态分析并观察CPE。使用BioProfile Basic软件分析培养全程中的代谢物例如谷氨酸盐、谷氨酰胺、乳酸盐和葡萄糖。如果需要的话调整代谢物的浓度。例如，如果需要的话将谷氨酰胺的浓度调整为2mM。如果需要的话将葡萄糖的浓度调整为2g/L。
在实验末尾使用所收集的所有样品进行病毒滴定。
8.2-结果
8.2.1-3L馈料批次生物反应器中鸭
Figure G2008800132573D00551
细胞的生长动力学
鸭
Figure G2008800132573D00552
细胞在搅拌槽式生物反应器中常规培养。使源于鸭的生物量在37℃在细胞生长培养基中累积直至达到5-6×106的细胞密度。然后将混合物稀释约3至10倍，在10天的时间段内监视细胞生长动力学。在这样的条件下，通常在约第5天至第8天达到12-20×106细胞/ml的细胞密度。因此鸭细胞显示出至少10至15倍的分裂率范围。
8.2.2-MVA-GFP病毒感染鸭EBx细胞过程中培养基成分对簇大小的影响
本发明人发现用于EBx细胞培养和感染的无血清培养基中钙和镁的浓度对于簇的大小有影响。鸭EBx细胞的小簇的存在改善了病毒的感染和繁殖，引起高的MVA病毒滴度(图9A)。
8.2.3-3L-生物反应器中MVA病毒的生产
使鸭
Figure G2008800132573D00555
来源的生物量在Excell 66444生长培养基中在细胞增殖期累积。然后以10-2 TCID50/细胞的MVA-GFP病毒感染细胞并在Excell 66444生产培养基中稀释混合物。加入新鲜Excell培养基之后，在第2天细胞密度下降，在第4天感染的细胞的细胞密度上升并达到12×106细胞/ml。在这样的条件下，MVA-GFP生产率是高的。从感染后第4天开始，MVA-GFP滴度为约108TCID50/ml(图9B)。在鸭
Figure G2008800132573D00556
细胞中得到205TCID50/细胞的MVA-GFP产量。
实施例9：鸭EBx细胞系中流感病毒的生产
9.1-材料和方法
9.1.1-流感病毒感染性检验(TCID50)
在MDCK细胞上进行感染性流感病毒的滴定。简单来说，将细胞以3×103细胞/孔的密度在补充了2.5mM L-谷氨酰胺的UltraMDCK培养基中植于96孔平底培养板中。24小时后，以含有6μg.mL-1胰蛋白酶-EDTA的UltraMDCK中的10倍系列稀释的样品感染细胞，并在33℃，5％CO2潮湿空气中孵育1周。然后在HA检验中使用鸡红血细胞测试病毒复制，根据Reed和Muench的方法(1938)*._*ReedL，Muench H，1938.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.27，493-97计算TCID50滴度。
9.1.2-单向辐射状免疫扩散法(SRID)
按照Wood及其同事描述的方法确定源自流感病毒感染的EB14细胞样品中的血凝素浓度。简单来说，以含有抗流感血清(由NIBSC提供推荐浓度)的琼脂糖凝胶包被玻璃板。设定凝胶之后，在3mm打孔中加入10μL的合适稀释的参考和样品。在室温下潮盒中孵育18-24小时后，将板浸于0.9％NaCl并以蒸馏水洗涤。然后压缩凝胶并干燥。以考马斯兰溶液对板进行染色15分钟，在甲醇和乙酸的混合物脱色两次直至可以看见清晰确定的染色区。将板干燥以后，在两个成直角的方向测定环绕抗原孔的染色区的直径。建立针对表面的抗原稀释的剂量反应曲线，根据标准斜率分析方法计算结果。*Wood JM.等人“An improvedsingle-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutininantigen：application for potency determinations of inactivated whole virus and subunitvaccines”(J.Biol.Stand.，1977，5(3)：237-47)。
9.1.3-流感血凝素蛋白的western blot分析
按照Laemmli UK(1970，Cleavage of structural proteins during the assembly ofthe head of bacteriophage T4.Nature 259：680-685)的描述在10％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE。通过半干式印迹程序(Kyhse-Andersen J(1984)Electroblotting ofmultiple gels：a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins frompolyacrylamide to nitrocellulose(J Biochem Biophys Methods 10：203-209)将变性蛋白(1％SDS，70mM β-巯基乙醇)转移至聚偏二氟乙烯膜(hybond P，Amersham)。在室温下以补充了1％FCS(SAFC)的TBST中的5％脂肪干奶粉组成的混合物中将印迹封闭一个小时。然后将印迹在补充了特异性多克隆抗HA绵羊血清(1∶500(NIBSC)的封闭溶液中孵育过夜。以TBST洗涤印迹6次，然后在室温下在封闭溶液中以hrp偶联的兔抗-绵羊IgG多克隆抗体(1∶5000(Rockland)孵育1个小时。以TBST洗涤印迹6次后，最终以化学发光(ECL kit，Amersham)和胶片(Hyperfilm，Amersham)显示蛋白-偶联物复合体。
9.2-3L生物反应器中鸭
Figure G2008800132573D00561
细胞的流感病毒感染
9.2.1-材料和方法
细胞融化材料
οT75cm2培养瓶(Sarstedt，Cat#831813502)
ο培养基(无血清培养基)
οL-谷氨酰胺200mM(Biowhittaker，Cat#BE17-605E)
ο轨道振动器IKAKS260(Fisher Bioblock，Cat#F35044)
细胞扩增材料
οT175cm2培养瓶(Sarstedt，Cat#831812502)
ο培养基(无血清培养基)：Excell 65319(JRH，Cat#65319-1000M1687)加入2.5mM谷氨酰胺
οL-谷氨酰胺200mM(Biowhittaker，Cat#BE17-605E)
οD(+)葡萄糖(45％)(Sigma，Cat#G8769)
生产材料
ο生产培养基(无血清培养基)：Excell 65629(JRH，Cat#65629)补充2.5mM谷氨酰胺
οL-谷氨酰胺200mM(Biowhittaker，Cat#BE 17-605E)
οD(+)葡萄糖(45％)(Sigma，Cat#G8769)
οTrypzean 1X(Sigma，Cat#T3449)
ο7.5％碳酸氢钠溶液(Sigma，Cat#205-633-8)
ο流感病毒株(冷冻于-80℃)
9.2.2-细胞培养方法
(与实施例7.1中MVA复制方法相同)
在实验末尾使用所收集的所有样品进行病毒滴定、血凝素分析(HAU)和HA抗原定量(western blot，SRID)。
9.3-结果
本发明人证明鸭EBx细胞为用于各种流感病毒株A和B复制的可信赖的和有效的细胞底物。可在各种容器例如培养瓶和旋转器(spinner)(数据未显示)和生物反应器中进行流感病毒的生产。本发明人获得了3L和30L搅拌槽式生物反应器中的可重复性和有效的流感病毒生产的馈料批次过程。使用流感病毒株A和B在培养瓶和生物反应器中常规获得了15mg/l以上和多达50mg/l的血凝素的病毒产量(图11和12)。
实施例10：鸭EBx细胞系中新城疫病毒的复制
使用NDV La Sota株研究了鸭EBx细胞对新城疫病毒感染的易感性
10.1-方法
鸭细胞在37℃和7.5％CO2空气下在60rpm轨道振动器上生长于T175培养瓶中的Excell培养基(SFAC)中。在第0天以0.4×106细胞/mL在40ml新鲜培养基中植入细胞。在37℃，7.5％CO2在摇动下(60rpm)孵育细胞培养物。监视细胞生长动力学直至达到浓度为4×106至6×106细胞/ml的细胞密度(通常在植入后第3天)。在该点，使用NDV La Sota株以两个不同的MOI(10-3和10-4TCID50/细胞)接种细胞并继续在37℃，7.5％CO2在摇动下(60RPM)孵育1个小时。然后加入60mL新鲜的病毒生产培养基将细胞培养物稀释并继续在37℃和7.5％CO2在摇动下(60rpm)进行孵育。在7天的时间内进行细胞生长和病毒生产的动力学。作为蛋白酶的来源，每天向培养基中加入重组胰蛋白酶(SAFC)；测试了两种浓度的胰蛋白酶(0.4和0.75USP/mL)。每天取出等份用于细胞计数、病毒滴定和western blotting分析。
以10％SDS-PAGE分离样品并通过半干技术印迹至PDVF膜(Amersham)。使用针对NDV的鸡多克隆抗血清(1∶2000，CHARLES RIVER laboratories)，然后以碱性磷酸酶-偶联的兔抗-鸡(1∶5000，SIGMA)进行免疫检测。使用ECL-化学发光检测系统试剂盒(ROCHE)检测结合的第二抗体。
10.2-结果
鸭和鸡EBx细胞对NDV La Sota株是敏感的并且复制NDV La Sota株。鸭
Figure G2008800132573D00581
细胞中产生的NDV的滴度(以TCID50/ml表示)从pi第0天至第2天升高，达到106.83 TCID50/mL的平均值(图13左侧图板)。
Western blot分析(图13右侧图板)显示NDV病毒蛋白(HN，Fo/F，NP&M)的表达。鸭细胞中产生的NDV病毒的病毒蛋白组成与使用鸡
Figure G2008800132573D00583
细胞中产生的NDV病毒所获得的病毒蛋白组成相似。此外，鸡和鸭EBx细胞中产生的病毒的释放动力学是相似的。
实施例11：鸭EB66细胞系中麻疹病毒的复制
使用表达绿色荧光蛋白的重组麻疹病毒研究了鸭EB66细胞对麻疹病毒感染的易感性
11.1-方法
EB66细胞在37℃和7.5％CO2空气下在60pm轨道振动器上生长于T175培养瓶中的Excell培养基中。在第0天以0.4×106细胞/mL在40ml新鲜培养基中植入细胞。在37℃，7.5％CO2在摇动下(60pm)孵育细胞。监视细胞生长动力学直至达到浓度为4×106至6×106细胞/ml的细胞密度(通常在植入后第3天)。在该点，使用重组麻疹病毒以两个不同的MOI(10-1和10-2TCID50/细胞)接种细胞并继续在37℃，7.5％CO2在摇动下(60RPM)孵育1个小时。然后加入60mL新鲜的病毒生产培养基将细胞培养物稀释并继续在37℃和7.5％CO2在摇动下(60pm)进行孵育。在7天的时间内进行细胞生长和病毒生产的动力学。每天取出等份用于细胞计数和病毒滴定。
11.2-结果
EB66细胞对麻疹病毒是敏感的并且复制麻疹病毒。在非最优化条件下，EB66细胞中生产的麻疹病毒的滴度(以TCID50/ml表示)达到107TCID50/ml的平均值(图14)。

Claims (23)

1、一种获得源自禽胚胎干细胞(ES)的持续的双倍体禽细胞系即
Figure A2008800132570002C1
的方法，其中所述禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，所述方法包括以下步骤：
a)在约产卵期发育阶段分离鸟胚胎，其中所述鸟的基因组中不含有易于产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒的内源性前病毒序列；
b)在基础培养基中悬浮通过分离步骤a)中的胚胎获得的胚胎干(ES)细胞，所述培养基添加以下物质：
-胰岛素生长因子(IGF-1)和睫状神经营养因子(CNTF)；
-动物血清；和
可选地，选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)或成纤维细胞生长因子(FGF)的生长因子；
c)将步骤b)中获得的ES细胞悬浮液植于饲养细胞层上并继续培养ES细胞至少一个传代；
d)可选地从培养基中除去选自IL-6、IL-6R、SCF、FGF的所有生长因子并继续培养ES细胞持续至少一个传代；
e)从培养基中除去IGF-1和CNTF，并继续培养细胞至少一个传代；
f)逐步降低培养基中饲养细胞的浓度，以在几个传代之后完全除去饲养层，并继续培养细胞；
g)可选地，逐步降低培养基中动物血清的浓度，以在几个传代之后完全除去动物血清；和
h)获得能够在不含生长因子、饲养层，可选地不含动物血清的基础培养基中增殖的源自ES细胞的粘附性禽类
Figure A2008800132570002C2
细胞系，且其中所述持续的双倍体禽细胞系不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；
i)可选地，使粘附性禽细胞系适应悬浮培养条件。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述鸟选自雁形目。
3、根据权利要求2所述的方法，其中所述鸟是鸭，优选为北京鸭。
4、根据权利要求1所述的方法，其中所述鸟选自鸡形目。
5、根据权利要求4所述的方法，其中所述鸟是ev-0家鸡。
6、根据权利要求1至5所述的方法获得的持续双倍体禽细胞系，其中所述禽细胞系的细胞具有至少一个以下特性：
-高细胞核-细胞质比；
-内源性端粒酶活性；
-约10μm的直径；
-在37℃时群体加倍时间为约30小时或30小时以下；
-可选地，所述细胞可表达一种或多种另外的选自碱性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、ENS1的标记；
且其中所述细胞不产生有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。
7、一种在权利要求6所述持续双倍体禽细胞中或在根据权利要求1至5任一项所述的方法获得的持续双倍体禽细胞系中复制病毒的方法，包括以下步骤：
a)以目的病毒感染所述禽细胞；
b)培养所述感染的禽细胞以复制所述病毒；
c)在细胞培养上清液中和/或在所述细胞内收获病毒。
8、根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒选自痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、疱疹病毒、嗜肝病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、环状病毒、冠状病毒、黄病毒、披膜病毒、双RNA病毒或逆转录病毒。
9、根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒是痘病毒或重组痘病毒，选自修饰的安卡拉牛痘(MVA)病毒、Lister-Elstree牛痘病毒、LC16m8牛痘病毒、CVI78牛痘病毒、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒(即ALVAC)、NYVAC、雪鸡痘病毒、八哥痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、麻雀痘病毒、椋鸟痘病毒或火鸡痘病毒。
10、根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒为副粘病毒或重组副粘病毒，优选选自麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、Sendai病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒I和III型、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、新城疫病毒、鸭副流感病毒。
11、根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒为正粘病毒或重组正粘病毒或重排正粘病毒，选自人类流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、猫流感病毒。
12、根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒为披膜病毒，优选选自Sinbis病毒、Semliki森林病毒、O’nyong’nyong病毒、Chikungunya病毒、Mayaro病毒、Ross河病毒、东部马脑脊髓炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒或其重组披膜病毒。
13、根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒为逆转录病毒，选自网状内皮组织增殖病毒、鸭传染性贫血病毒、suck脾坏死病毒或其重组逆转录病毒。
14、根据权利要求7所述的方法，其中病毒为细小病毒，优选为鸭细小病毒或其重组细小病毒。
15、根据权利要求7所述的方法，其中病毒为腺病毒，优选选自鸡腺病毒、鹅腺病毒、鸭腺病毒或鸽子腺病毒或其重组腺病毒。
16、根据权利要求7所述的方法，其中病毒为双RNA病毒，优选为传染性法氏囊病病毒。
17、根据权利要求7所述的方法，其中病毒为黄病毒，优选选自登革热病毒、日本脑炎病毒或西尼罗河病毒。
18、根据权利要求7-17任一项所述的方法获得的病毒。
19、一种包含权利要求18所述病毒的疫苗，如果合适的话该病毒与药学上可接受的增强免疫反应的物质组合。
20、根据权利要求19所述的疫苗，其中病毒选自作为完整病毒颗粒存在的病毒或作为分解的病毒颗粒存在的病毒。
21、一种疫苗，其包含至少一种从权利要求18所述病毒获得的病毒抗原性蛋白，如果合适的话该病毒与药学上可接受的增强免疫反应的物质组合。
22、一种包含禽细胞的疫苗，禽细胞源自权利要求6所述的禽细胞系或是由权利要求1至5任一项所述的方法获得的禽细胞系，并且所述禽细胞被病毒感染。
23、一种生产重组蛋白和肽的方法，包括以下步骤：
a)通过以表达载体瞬时或稳定转染从而对根据权利要求1至5中任一项所述方法获得的或如或权利要求6所述的持续双倍体禽细胞系进行遗传修饰；
b)可选地，选择表达所述重组蛋白或肽的所述经修饰的持续双倍体禽细胞系；和
c)纯化由所述经遗传修饰的持续双倍体禽细胞系所表达的重组肽或蛋白。
CN200880013257.3A 2007-04-24 2008-04-23 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系 Active CN101668539B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07300979.7 2007-04-24
EP07300979A EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2007-04-24 Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
PCT/EP2008/054912 WO2008129058A1 (en) 2007-04-24 2008-04-23 Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101668539A true CN101668539A (zh) 2010-03-10
CN101668539B CN101668539B (zh) 2014-02-19

Family

ID=38521810

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880013257.3A Active CN101668539B (zh) 2007-04-24 2008-04-23 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系

Country Status (23)

Country Link
US (4) US20100062489A1 (zh)
EP (4) EP1985305A1 (zh)
JP (1) JP5539185B2 (zh)
KR (2) KR101624678B1 (zh)
CN (1) CN101668539B (zh)
AU (1) AU2008240708B2 (zh)
BR (1) BRPI0809842B8 (zh)
CA (1) CA2684845C (zh)
CY (1) CY1114736T1 (zh)
DK (1) DK2150275T3 (zh)
EA (1) EA021064B1 (zh)
ES (2) ES2442009T3 (zh)
HK (1) HK1140964A1 (zh)
HR (1) HRP20131203T1 (zh)
IL (1) IL201679A (zh)
MX (1) MX343247B (zh)
MY (1) MY151119A (zh)
NZ (1) NZ581321A (zh)
PL (1) PL2150275T3 (zh)
PT (1) PT2150275E (zh)
SI (1) SI2150275T1 (zh)
WO (1) WO2008129058A1 (zh)
ZA (1) ZA200908152B (zh)

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102120983B (zh) * 2010-01-07 2013-04-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法
CN103157107A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 普莱柯生物工程股份有限公司 用连续传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗及方法
CN103298936A (zh) * 2010-10-15 2013-09-11 公益财团法人东京都医学综合研究所 具有新型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的重组痘苗病毒
CN105177176A (zh) * 2014-06-13 2015-12-23 亚宝药业太原制药有限公司 一种腺病毒滴度的检测方法
CN105408471A (zh) * 2013-07-25 2016-03-16 国家农艺研究院 用于筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法
CN105473712A (zh) * 2013-08-30 2016-04-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 在细胞培养物中大规模生产病毒
CN106692964A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 扬州大学 一种血清4型禽腺病毒灭活苗及其制备方法
CN108159412A (zh) * 2018-01-12 2018-06-15 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品
CN108187039A (zh) * 2018-03-29 2018-06-22 山东信得动物疫苗有限公司 一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品
CN108220227A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
CN108261543A (zh) * 2018-02-08 2018-07-10 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 传代细胞源nd、ib、ai三联灭活疫苗的制备方法及其应用
CN108977554A (zh) * 2018-09-05 2018-12-11 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 蛋鸭环状RNA circ_13034及其检测试剂、方法与应用
CN109593729A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 肇庆大华农生物药品有限公司 一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用
CN112442486A (zh) * 2020-11-05 2021-03-05 上海奥浦迈生物科技股份有限公司 一种维持体外培养cho dg44细胞后期活率的培养基及其应用
CN113227354A (zh) * 2019-01-17 2021-08-06 勃林格殷格翰动物保健美国公司 用于禽类疫苗生产的无血清培养基及其用途
CN113474449A (zh) * 2018-11-23 2021-10-01 瓦尔尼瓦公司 包括禽类干细胞的食物产品
CN113699119A (zh) * 2020-12-10 2021-11-26 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2836924B1 (fr) 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
RU2473688C2 (ru) * 2006-08-09 2013-01-27 Вивалис Способ получения трансгенных птиц с использованием эмбриональных стволовых клеток
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
AU2009244776B2 (en) * 2008-02-25 2013-03-07 Nanotherapeutics, Inc. Method for producing continuous cell lines
WO2010052214A2 (en) * 2008-11-05 2010-05-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method
EP2379598B1 (en) 2009-01-19 2015-03-11 Innate Pharma Anti-kir3d antibodies
CA2750055A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method for purifying viruses using a density gradient
JP2012525830A (ja) * 2009-05-08 2012-10-25 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 均質化を含む細胞培養からのウイルスの製造方法
CA2760465A1 (en) * 2009-05-12 2010-11-18 Transgene Sa Method for orthopoxvirus production and purification
GB0918830D0 (en) 2009-10-27 2009-12-09 Glaxosmithkline Biolog Niederl Process
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
US8524249B2 (en) 2009-12-15 2013-09-03 University Of Saskatchewan Vaccines for inclusion body hepatitis
US20120309056A1 (en) 2010-02-04 2012-12-06 Leon Arnaud Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells
FR2956409A1 (fr) 2010-02-15 2011-08-19 Univ Claude Bernard Lyon Procedes pour optimiser la production virale par l'inactivation ou l'inhibition du gene hipk2 et cellules modifiees pour la production virale
EP2552490A4 (en) * 2010-03-26 2013-12-18 Emergent Product Dev Gaithersburg Inc INFLUENZA MATRIX 2 PROTEIN ECKTOMOMAS, EXPRESSION SYSTEM THEREFOR AND USES THEREOF
BR112012027643A2 (pt) * 2010-05-03 2016-08-16 Glaxosmithkline Biolog Sa métodos para a inativação de um orthomixovírus, para a preparação de uma vacina, e , composição imunogênica
GB201011502D0 (en) 2010-07-08 2010-08-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
NZ604510A (en) 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use
FR2967072B1 (fr) 2010-11-05 2013-03-29 Univ Dundee Procede pour ameliorer la production de virus et semences vaccinales influenza
WO2012095514A1 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Vivalis Recombinant protein production system
US20140287402A1 (en) 2011-06-27 2014-09-25 Valneva Method for screening cells
WO2013044298A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Cephalon Australia Pty Ltd Antibodies against tl1a and uses thereof
JP2015504413A (ja) 2011-10-28 2015-02-12 パトリス リミテッド Ｐａｔ−ｌｍ１エピトープおよびそれを使用するための方法
AR089231A1 (es) * 2011-12-15 2014-08-06 Amgen Inc Metodo de floculacion
EP2660316A1 (en) 2012-05-02 2013-11-06 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Avian cell line and its use in production of protein
JP5980947B2 (ja) * 2012-11-22 2016-08-31 旭化成メディカル株式会社 高感染価のパルボウイルスの生産方法
KR102204127B1 (ko) 2013-02-01 2021-01-20 키라 바이오테크 피티와이 리미티드 항-cd83 항체 및 이의 용도
SG11201505762XA (en) 2013-02-07 2015-08-28 Csl Ltd Il-11r binding proteins and uses thereof
PL3169341T3 (pl) 2014-07-16 2019-12-31 Transgene Sa Wirus onkolityczny do ekspresji modulatorów punktu kontroli immunologicznej
FR3025107B1 (fr) 2014-08-29 2018-10-05 Calixar Procede de preparation d'un antigene vaccinal, antigene vaccinal obtenu et utilisations
NZ731491A (en) 2014-10-23 2021-12-24 Kira Biotech Pty Ltd Cd83 binding proteins and uses thereof
US10584175B2 (en) 2014-10-23 2020-03-10 La Trobe University FN14-binding proteins and uses thereof
JP6956635B2 (ja) 2014-12-17 2021-11-02 フンダシオン パラ ラ インベスティガシオン メディカ アプリカダ ウィルソン病及び他の状態の処置に使用するための核酸構築物及び遺伝子治療ベクター
IL252917B2 (en) 2014-12-17 2023-10-01 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Vectors and vectors for gene therapy for use in the treatment of Wilson's disease
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
PT3402820T (pt) 2016-01-11 2020-08-20 Forty Seven Inc Anticorpos monoclonais anti-cd47 quiméricos, de ratinho ou humanizados
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
CN107137704B (zh) * 2016-08-20 2020-02-21 山东信得科技股份有限公司 一种鸭2型腺病毒灭活疫苗
RU2756534C2 (ru) * 2016-09-28 2021-10-01 Бавариан Нордик А/С Композиции и способы для повышения стабильности трансгенов в поксвирусах
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
WO2018091680A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Transgene Sa Cowpox-based oncolytic vectors
KR20190097240A (ko) 2016-12-28 2019-08-20 트랜스진 에스.에이. 종양용해성 바이러스 및 치료 분자
CN107058243A (zh) * 2017-03-23 2017-08-18 华南农业大学 一种马立克氏病毒的悬浮培养方法
US11306292B2 (en) 2017-05-15 2022-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2018211419A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
IL308692A (en) 2017-06-07 2024-01-01 Wild Type Inc Meat production outside the organism
EP3641803A2 (en) 2017-06-21 2020-04-29 Transgene Personalized vaccine
WO2019020543A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 Transgene Sa ONCOLYTIC VIRUSES EXPRESSING AGENTS TARGETING METABOLIC IMMUNE MODULATORS
CN107794248A (zh) * 2017-10-24 2018-03-13 广州齐志生物工程设备有限公司 一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法
KR102121042B1 (ko) * 2017-12-06 2020-06-09 이정복 조류의 에그로부터 분리한 세포인 배반엽 전분화능세포, 신경줄기세포, 배아섬유아세포 컨디션드 배지를 유효성분으로 하는 세포 증식, 피부재생 및 주름 개선용 배지 조성물
EP3794127A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 Vivet Therapeutics Gene therapy vectors comprising s/mar sequences
WO2020011754A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Transgene Chimeric vaccinia viruses
US20210275662A1 (en) 2018-07-13 2021-09-09 Valneva Se Method for rescuing and producing a virus in avian cells
EP3617230A1 (en) 2018-09-03 2020-03-04 BioInvent International AB Novel antibodies and nucleotide sequences, and uses thereof
AU2019336940A1 (en) 2018-09-06 2021-03-11 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
BR112021006881A2 (pt) 2018-10-12 2021-07-13 Vivet Therapeutics transgene otimizado por códon para o tratamento de colestase intra-hepática familiar progressiva tipo 3 (pfic3)
WO2020094693A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Vivet Therapeutics Codon-optimized abcb11 transgene for the treatment of progressive familial intrahepatic cholestasis type 2 (pfic2)
CN113302290A (zh) 2018-11-16 2021-08-24 编码治疗公司 治疗威尔逊氏病的组合物和方法
WO2020108735A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Blink Biomedical Sas Antibodies to cytomegalovirus interleukin-10
WO2020117949A1 (en) * 2018-12-06 2020-06-11 Inventprise, Llc Bacterial growth on non-animal derived media
EP3893668A4 (en) 2018-12-12 2022-08-10 Wild Type, Inc. SYNTHETIC FOOD COMPOSITIONS
AU2019412516A1 (en) 2018-12-28 2021-07-15 Transgene M2-defective poxvirus
JP7212588B2 (ja) 2019-06-20 2023-01-25 オルガノ株式会社 水処理装置
AU2020299718A1 (en) 2019-07-02 2022-02-24 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada cPLA2e inducing agents and uses thereof
WO2021180943A1 (en) 2020-03-12 2021-09-16 Bavarian Nordic A/S Compositions improving poxvirus stability
KR20230038496A (ko) 2020-07-13 2023-03-20 트랜스진 면역 억제의 치료
AR123168A1 (es) 2020-08-06 2022-11-02 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Partículas virales para uso en el tratamiento de tauopatías tales como enfermedades de alzheimer mediante terapia génica
US20230265456A1 (en) 2020-08-10 2023-08-24 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Gene therapy vector expressing cyp27a1 for the treatment of cerebrotendinous xanthomatosis
CN112094819B (zh) * 2020-08-13 2022-10-14 浙江美保龙生物技术有限公司 一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法
AR123756A1 (es) 2020-10-09 2023-01-11 UCB Biopharma SRL Construcciones de ácidos nucléicos, vectores virales y partículas virales
EP4267197A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Vivet Therapeutics Minimal bile acid inducible promoters for gene therapy
WO2022148736A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Transgene Vectorization of muc1 t cell engager
CN113278595B (zh) * 2021-04-28 2023-05-09 重庆永健生物技术有限责任公司 一种鸭腺病毒3型菌株、鸭腺病毒卵黄抗体及其制备方法和应用
WO2023025899A2 (en) 2021-08-26 2023-03-02 Transgene Delivery system for targeting genes of the interferon pathway
TW202321458A (zh) 2021-09-22 2023-06-01 瑞典商生物創新國際公司 新穎抗體組合及其用途
AU2022378524A1 (en) 2021-10-28 2024-05-02 UCB Biopharma SRL Nucleic acid constructs, viral vectors and viral particles
WO2023213763A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2024003353A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Transgene Fusion protein comprising a surfactant-protein-d and a member of the tnfsf
CN115449502B (zh) * 2022-08-15 2023-10-20 广东省华晟生物技术有限公司 无血清全悬浮培养型bhk-21-c细胞株及其构建方法与应用
WO2024038175A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Transgene Chimeric poxviruses

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US534740A (en) * 1895-02-26 Indicating door-bell
WO1990001541A1 (en) 1988-08-04 1990-02-22 Amrad Corporation Limited In vitro propagation of embryonic stem cells
US5162215A (en) 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
JPH05227947A (ja) 1992-01-14 1993-09-07 Rikagaku Kenkyusho 鳥類原始生殖細胞の分離方法
WO1993015185A1 (en) 1992-01-27 1993-08-05 North Carolina State University GENE TRANSFER IN POULTRY BY INTRODUCTION OF EMBRYO CELLS $i(IN OVO)
US5340740A (en) 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
WO1994003585A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation A method for maintaining embryonic stem cells and avian factor useful for same
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5589458A (en) 1992-11-13 1996-12-31 Thomas Jefferson University Compounds that inhibit T cell proliferation and methods for using the same
FR2726003B1 (fr) * 1994-10-21 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires
JPH0924997A (ja) 1995-07-11 1997-01-28 Tokico Ltd 出荷装置
DE69738806D1 (de) 1996-10-10 2008-08-14 Invitrogen Corp Tierzellkulturmedium mit pflanzlichen nährstoffen
DE69729839T2 (de) 1996-11-12 2005-07-21 Pfizer Inc. Attenuierter lebender Neospora Impfstoff
AU736087B2 (en) 1997-08-04 2001-07-26 University Of Massachusetts Avian primordial germ cell (PGC) cell line and a method for long term culturing thereof
CA2300336A1 (en) 1997-08-04 1999-02-11 University Of Massachusetts A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of avian embryonic germ (eg) cell lines by prolonged culturing of pgcs, use thereof for cloning and chimerization
US6406909B1 (en) 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
EP1155114B1 (en) 1999-02-11 2007-11-14 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Avian pluripotent embryonic germ cell line
DE19947407C2 (de) 1999-10-01 2002-08-01 Bayerische Motoren Werke Ag Datenbussystem für Kraftfahrzeuge
FR2836924B1 (fr) 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
DK2287288T3 (da) 2002-07-09 2013-01-07 Baxter Int Medium frit for animalsk protein til dyrkning af celler
PL1646715T3 (pl) * 2003-07-22 2010-10-29 Valneva Wytwarzanie pokswirusów za pomocą linii adherentnych lub nieadherentnych komórek ptasich
EP1500699A1 (en) * 2003-07-22 2005-01-26 Vivalis Production of vaccinia virus with adherent or non adherent avian cell lines
EP1528101A1 (en) * 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
FR2884255B1 (fr) * 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
PL1979474T3 (pl) * 2006-01-05 2011-01-31 Transgene Sa Ptasia odwrotna transkryptaza o charakterze telomerazy
WO2007135133A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Vivalis Avian cell lines derived from primordial germ cells useful for the production of substances of interest
RU2473688C2 (ru) 2006-08-09 2013-01-27 Вивалис Способ получения трансгенных птиц с использованием эмбриональных стволовых клеток
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102120983B (zh) * 2010-01-07 2013-04-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法
CN103298936A (zh) * 2010-10-15 2013-09-11 公益财团法人东京都医学综合研究所 具有新型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的重组痘苗病毒
CN103157107A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 普莱柯生物工程股份有限公司 用连续传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗及方法
CN105408471B (zh) * 2013-07-25 2019-01-18 国家农艺研究院 用于筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法
CN105408471A (zh) * 2013-07-25 2016-03-16 国家农艺研究院 用于筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法
CN105473712A (zh) * 2013-08-30 2016-04-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 在细胞培养物中大规模生产病毒
CN105473712B (zh) * 2013-08-30 2022-05-27 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 在细胞培养物中大规模生产病毒
CN105177176A (zh) * 2014-06-13 2015-12-23 亚宝药业太原制药有限公司 一种腺病毒滴度的检测方法
CN106692964A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 扬州大学 一种血清4型禽腺病毒灭活苗及其制备方法
CN108220227A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
CN108159412A (zh) * 2018-01-12 2018-06-15 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品
CN108261543A (zh) * 2018-02-08 2018-07-10 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 传代细胞源nd、ib、ai三联灭活疫苗的制备方法及其应用
CN108261543B (zh) * 2018-02-08 2019-03-08 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 传代细胞源nd、ib、ai三联灭活疫苗的制备方法及其应用
CN108187039A (zh) * 2018-03-29 2018-06-22 山东信得动物疫苗有限公司 一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品
CN108977554A (zh) * 2018-09-05 2018-12-11 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 蛋鸭环状RNA circ_13034及其检测试剂、方法与应用
CN113474449A (zh) * 2018-11-23 2021-10-01 瓦尔尼瓦公司 包括禽类干细胞的食物产品
CN109593729A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 肇庆大华农生物药品有限公司 一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用
CN113227354A (zh) * 2019-01-17 2021-08-06 勃林格殷格翰动物保健美国公司 用于禽类疫苗生产的无血清培养基及其用途
CN112442486A (zh) * 2020-11-05 2021-03-05 上海奥浦迈生物科技股份有限公司 一种维持体外培养cho dg44细胞后期活率的培养基及其应用
CN112442486B (zh) * 2020-11-05 2023-02-10 上海奥浦迈生物科技股份有限公司 一种维持体外培养cho dg44细胞后期活率的培养基及其应用
CN113699119A (zh) * 2020-12-10 2021-11-26 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK2150275T3 (da) 2014-01-13
PL2150275T3 (pl) 2014-03-31
EP2150275A1 (en) 2010-02-10
EP2150275B1 (en) 2013-11-13
CA2684845A1 (en) 2008-10-30
ZA200908152B (en) 2010-04-28
IL201679A (en) 2013-11-28
US20100062489A1 (en) 2010-03-11
BRPI0809842A2 (pt) 2014-09-23
CY1114736T1 (el) 2016-12-14
AU2008240708A1 (en) 2008-10-30
KR20100017340A (ko) 2010-02-16
BRPI0809842A8 (pt) 2019-07-16
NZ581321A (en) 2012-05-25
HK1140964A1 (en) 2010-10-29
AU2008240708B2 (en) 2013-04-18
EP2572727A1 (en) 2013-03-27
KR101624678B1 (ko) 2016-05-26
EA021064B1 (ru) 2015-03-31
US9260694B2 (en) 2016-02-16
ES2574827T3 (es) 2016-06-22
ES2442009T3 (es) 2014-02-07
EA200970996A1 (ru) 2010-04-30
CN101668539B (zh) 2014-02-19
US20140154741A1 (en) 2014-06-05
PT2150275E (pt) 2014-01-10
EP1985305A1 (en) 2008-10-29
US20160257940A1 (en) 2016-09-08
JP2010524482A (ja) 2010-07-22
US20180135026A1 (en) 2018-05-17
BRPI0809842B8 (pt) 2021-05-25
MX2009011505A (es) 2009-11-09
KR20150036788A (ko) 2015-04-07
WO2008129058A1 (en) 2008-10-30
EP2572728A1 (en) 2013-03-27
MY151119A (en) 2014-04-15
US9822345B2 (en) 2017-11-21
BRPI0809842B1 (pt) 2019-09-10
EP2572727B1 (en) 2016-05-18
MX343247B (es) 2016-10-31
JP5539185B2 (ja) 2014-07-02
HRP20131203T1 (hr) 2014-02-14
CA2684845C (en) 2017-12-05
IL201679A0 (en) 2010-05-31
SI2150275T1 (sl) 2014-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101668539B (zh) 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
RU2457253C2 (ru) Способ репликации вируса в птичьих эмбриональных стволовых клетках
PT1646715E (pt) Produção de poxvírus com linhagem das células aviarias aderentes ou não aderentes
AU2011253998A1 (en) Process of manufacturing viral vaccines in suspension avian embryonic derived stem cell lines

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: VALNEVA GMBH

Free format text: FORMER NAME: VIVALIS

CP03 Change of name, title or address

Address after: lyon

Patentee after: VIVALIS

Address before: French race

Patentee before: Vivalis

CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: Lyon, France 69003 Marius Vee Viv Jerzy Merle Avenue oxygen tower 10-12 Lyon World Trade Center

Patentee after: VIVALIS

Address before: Li Ang

Patentee before: VIVALIS

CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: The French at St. El

Patentee after: VIVALIS

Address before: Lyon, France 69003 Marius Vee Viv Jerzy Merle Avenue oxygen tower 10-12 Lyon World Trade Center

Patentee before: VIVALIS