EA021064B1

EA021064B1 - Непрерывные генетически стабильные птичьи клеточные линии, полученные из эмбрионов, способ их получения и их применение для производства вирусных вакцин, рекомбинантных белков и пептидов

Info

Publication number: EA021064B1
Application number: EA200970996A
Authority: EA
Inventors: Фабьен Жеэне; Карин Моро; Магали Эсно; Мажид Метали
Original assignee: Вальнева
Priority date: 2007-04-24
Filing date: 2008-04-23
Publication date: 2015-03-31
Also published as: IL201679A; EP2150275B1; HK1140964A1; IL201679A0; US20160257940A1; BRPI0809842B1; MY151119A; EP1985305A1; NZ581321A; EA200970996A1; KR101624678B1; JP2010524482A; KR20100017340A; HRP20131203T1; CN101668539B; KR20150036788A; CA2684845C; CA2684845A1; US20180135026A1; CN101668539A

Abstract

Данное изобретение относится к разработке и производству вирусных вакцин. В частности, изобретение относится к области промышленного производства вирусных векторов и вакцин, более конкретно к использованию птичьих эмбриональных стволовых клеток, предпочтительно клеточной линии ЕВх®, полученной из утиных эмбриональных стволовых клеток, для производства вирусных векторов и вирусов. Изобретение, в частности, можно использовать для промышленного производства вирусных вакцин для предотвращения вирусных инфекций человека и животных.

Description

(57) Данное изобретение относится к разработке и производству вирусных вакцин. В частности, изобретение относится к области промышленного производства вирусных векторов и вакцин, более конкретно к использованию птичьих эмбриональных стволовых клеток, предпочтительно клеточной линии ЕВх®, полученной из утиных эмбриональных стволовых клеток, для производства вирусных векторов и вирусов. Изобретение, в частности, можно использовать для промышленного производства вирусных вакцин для предотвращения вирусных инфекций человека и животных.

Данное изобретение относится к разработке и изготовлению вирусных вакцин. В частности изобретение относится к области промышленного производства вирусных векторов и вакцин, более конкретно к использованию клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток утки, которые не содержат птичьих эндогенных ретровирусов, для производства вирусных векторов и вирусов. Изобретение, в частности, может быть применено в промышленном производстве вирусных вакцин для профилактики вирусных инфекций человека и животных.

Предшествующий уровень техники

Вакцины эффективно уменьшают и предотвращают смерть и заболеваемость многими вирусными инфекциями, такими как, например, грипп, корь, эпидемический паротит, оспа, желтая лихорадка.

Много вирусных вакцин в настоящее время производится в оплодотворенных куриных яйцах или в первичных фибробластах куриных эмбрионов, выделенных из куриных эмбрионов. Тем не менее, производство вакцин иногда осложняется случайным загрязнением случайными агентами, которые могут возникнуть из птичьих клеточных субстратов, использованных для размножения вакцинных штаммов. В самом деле, обратнотранскриптазная (КТ) активность, указывающая на наличие ретровирусов, была обнаружена в полученных с помощью куриных клеток живых ослабленных вакцинах против желтой лихорадки, кори и эпидемического паротита, в том числе европейского и американского производства (Никкаш е! а1., 2003, 1. νίτοί 77:1105-1111; 1ойикои е! Непеше, 2001, 1. νίτοί., 75:3605-3612). Исследования происхождения КТ-активности в этих вакцинах доказали наличие частиц, содержащих РНК от эндогенного вируса птичьего лейкоза (ΆΤν-Ε) и эндогенного птичьего ретровируса (ΕΑν) (1ойикои е! Неиеше, 2001, 1. νίτοί 75:3605-3612; Ткапд е! а1., 1999, 1. νίτοί 73:5843-5851; АйккшаЪг е! а1., 1997, 1. νίτοί 71:3005-3012).

ΑΣν-Ε и ΕΑν являются членами семейств эндогенных ретровирусов, имеющихся в куриной зародышевой линии. ΑΕν-Ε экспрессируется в еу-локусах, которые являются наследуемыми провирусными элементами. На основании их конвертированных последовательностей, ΑΕν-Ε были дифференцированы на подгруппы ΑΕν-Ε от А до Ό и 1, которые являются экзогенными приобретенными инфекциями. Хотя экзогенные ΑΕν являются у зараженных кур причиной ряда опухолевых заболеваний, таких как миокардит и остеопетроз, о патогенности ЛЬУ-Е для кур ничего не известно. Отсутствие онкогенного потенциала у ΑΣν-Ε -инфекций может быть связано с отсутствием как вирусных онкогенов, так и энхансерной активности в эндогенных длинных концевых повторах (ЬТК). Более 20 различных еу-локусов было выявлено у белых кур Ливорно (с еу-1 по еу-22). Εν-локусные обозначения давались в порядке обнаружения и были фенотипически отнесены к категориям в связи с генными продуктами, которые они экспрессировали, и их способностью генерировать инфекционные частицы. В ΑΕν-Е фенотипах, присвоенных еу-локусам в диапазоне от структурно и ферментативно полных инфекционных частиц до структурно или ферментативно (КТ-) дефектных, не было обнаружено вирусной экспрессии белка. Большинство еулокусов являются структурно неполными и, следовательно, не кодируют все последовательности, необходимые для продукции инфекционных вирусных частиц. Путем размножения были получены куриные породы, устойчивые к ΑΕν-Ε и названные еу-0. У кур линии 0 отсутствовали еу-локусы (т.е. еу-0), но в геноме кур линии 0 были представлены ΕΑν-провирусные последовательности (ПииМйЙ1е апй Ратак, 1985, Ртос ИаН. Лсай. 8οΐ υδΑ, 82: 5097-5101).

Немногое известно о семействе ΕΑν, которое отличается от семейства ΑΣν, но связано с ним. ΕΑν-элементы присутствуют в количестве по меньшей мере 50 копий на один куриный геном. Тем не менее, ни одна из известных последовательностей ΕΑν не отображает интактный ретровирусный геном полной длины, и ни один из инфекционных ΕΑν-изолятов еще не был идентифицирован. Однако было показано, что ΕΑν высоко экспрессируется в эмбриональных клетках, полученных из птиц рода ОаИик. Аеюктайг и др. (1997, 1. νίτοί 71:3005-3012) показали, что частицы из семейства эндогенных ретровирусов ΕΑν чаще всего отвечают за большую часть КТ-активности, связанной с частицами, наблюдаемой в супернатантах культивируемых фибробластов куриного эмбриона.

Риск случайной передачи особенно велик для живых ослабленных вирусных вакцин, поскольку они не могут быть подвергнуты процедуре инактивации, и большинство из них вводят человеку инъекционно, то есть минуя неспецифические иммунные защитные механизмы. Таким образом, чтобы обеспечить безопасность вакцин для применения у животных и человека, клеточные субстраты для производства вакцины в настоящее время должны быть проверены на наличие способных к репликации ретровирусов, которые могут быть переданы хозяевам в виде животного или человека в ходе иммунизации (серия технических докладов ВОЗ, 1994).

С другой стороны, системы производства оплодотворенных куриных яиц и первичных фибробластов куриного эмбриона связаны с рядом серьезных ограничений, включая:

длительный, громоздкий и ресурсно-затратный способ изготовления, который требует приобретения и контроля качества большого количества яиц или ΟΕΡ для каждой отдельной производимой партии; в ряде случаев необходимость использования дорогостоящих свободных от специфического патогена (ЗРР) куриных эмбрионов;

риск недостаточной поставки яиц в случае эпидемии инфекций в стае куриных доноров; инфляция издержек, связанная с использованием бычьих сывороток, полученных из стран, свобод- 1 021064 ных от ΒδΕ (бычьей губчатой энцефалопатии);

невозможность использования яиц для размножения вирусов, которые высоко вируленты и смертельны для кур.

Поэтому существует срочная необходимость улучшения имеющихся вирусных технологий производства вакцин на основе яиц или фибробластов куриных эмбрионов. Развитие клеточно-культуральных платформ в качестве альтернативы производственным системам с яйцами и СЕР для производства вирусных вакцин, вероятно, является самым быстрым и перспективным решением для преодоления узких мест нынешнего производства вакцин и нехватки времени. Кроме того, использование для производства вирусных вакцин клеточных линий, а не яиц или СЕР-платформ, будет иметь следующие дополнительные преимущества в связи с безопасностью вакцины: отсутствие добавок антибиотиков в вакцинном составе; отсутствие необходимости в токсичных консервантах (например тиомерсале); снижение уровней эндотоксина, отсутствие вопроса аллергии на яйца; отсутствие риска попадания случайного агента/ΒδΕ из клеточной культуры в безбелковые и бессывороточные среды; более высокая чистота приготовления вирусной вакцины.

Примерами клеточных линий для продукции вирусных вакцин являются МЭСК (клетки, полученные из почки собаки Мадин-Дарби), РегСб (клетки, полученные из человеческих эмбриональных клеток сетчатки, генетически модифицированных путем вставления генов Е1 от аденовируса человека 5 типа, разработанные СКиСЕЬЬ (Нидерланды)), УЕКО (клетки, полученные из эпителиальных клеток почек африканской зеленой мартышки (СегсорйЬесик аеШюрк), выделенные в Университете Чиба, Япония), ВНК21 (клетки, полученные иммортализацией клеток почек детенышей хомяков). Ни одна из доступных клеточных линий не удовлетворяет всем медицинским, нормативным и промышленным требованиям. Например, большинство этих клеточных линий являются онкогенными, и существует значительная нормативная обеспокоенность по поводу использования онкогенных клеток в продукции человеческих вакцин; поэтому сегодня регулирующие органы неохотно утверждают онкогенные клеточные субстраты для массового производства вакцин. Кроме того, некоторые из этих клеточных линий являются субстратзависимыми, что является серьезным препятствием для промышленного линейного увеличения производства вакцины.

Таким образом, существует необходимость в разработке субстрат-независимых клеточных линий без способных к репликации ретровирусов, которые являются неонкогенными, промышленно совместимыми и восприимчивыми к инфицированию широким спектром вирусов. Это является целью данного изобретения.

Таким образом, изобретатель воспользовался своим опытом в области птичьей биологии и птичьих эмбриональных стволовых (Εδ, етЪгуошс Чет) клеток для разработки новых стабильных клеточных линий утки, которые делают возможной эффективную репликацию большой группы человеческих и ветеринарных вакцин и кандидатов в вакцины. Путем адаптации своих собственных способов (см. АО 03/07бб01 и АО 05/007840) изобретателю удалось создать серии хорошо охарактеризованных и документированных клеточных линий утки (т.е. клеток άΕΒχ®), которые получены из утиных клеток Εδ без каких-либо этапов генетической, химической или вирусной иммортализации и которые не продуцируют в культуре способных к репликации ретровирусов.

Описание

Данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий, названных ЕВх, полученных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (Εδ), которые не продуцируют эндогенных ретровирусных частиц, способных к репликации.

Клеточные линии изобретения являются непрерывными, поскольку они обладают характеристиками, необходимыми для культивирования ίη νίίτο в течение продолжительного периода времени. Преимущественно клетки изобретения способны к пролиферации в течение по меньшей мере 50 поколений, по меньшей мере 75 поколений, по меньшей мере 100 поколений, по меньшей мере 125 поколений, по меньшей мере 150 поколений, по меньшей мере 175 поколений, по меньшей мере 200 поколений, по меньшей мере 250 поколений. 250 поколений не составляют временное ограничение, поскольку полученные клетки до сих пор живы и их все еще можно пассировать в дополнительных пассажах. Без связи с теорией допускается, что клетки изобретения можно культивировать постоянно до тех пор, пока клетка экспрессирует теломеразу. Действительно, предполагается, что высокий уровень экспрессии теломеразы в птичьих клетках изобретения отвечает за генетическую стабильность (т. е. птичьи клетки изобретения являются диплоидными) и непрерывный клеточный рост.

Под пассажем понимают перенос трансплантата клеток, с или без разбавления, из одного культурального сосуда в другой. Следует понимать, что пока клетки переносят из одного сосуда в другой, определенная часть клеток может быть потеряна и, следовательно, может возникнуть разбавление клеток, преднамеренное или нет. Этот термин является синонимом термина субкультура. Количество пассажей представляет собой количество раз, которое клетки в культуре, растущие в суспензии или на подложке, были субкультивированы или перенесены в новый сосуд. Этот термин не является синонимом удвоения популяции или поколения, которое представляет собой время, необходимое для однократного воспроизведения клеточной популяции; то есть, грубо говоря, время, необходимое для воспроизведения каждой

- 2 021064 клетки популяции. Например, время удвоения популяции (ΡΌΤ, ροριιίαΐίοη ДоиЫшд Оте) для птичьих Е8клеток на этапе а) изобретения составляет около > 40 ч. Птичьи ЕВх-клетки изобретения имеют ΡΌΤ около < 30 ч; обычно для клеток ЕВх® делают один пассаж каждые три поколения.

Под диплоидным подразумевается, что клетки изобретения имеют две копии (2п) каждой хромосомы, как правило, по одной от матери и от отца.

Тот факт, что птичьи клеточные линии ЕВх® изобретения являются непрерывными и диплоидными (т.е. генетически стабильными), представляет собой замечательную и уникальную особенность, так как эти условия обычно антагонистичны. Таким образом, раковые клетки и/или иммортализованные клетки, полученные химической, физической (УФ-облучение, рентгеновские лучи или гамма-излучение и т.д.) или генетической модификации (вирусная трансформация, сверхэкспрессия онкогенов и т.д.), являются непрерывными клетками, так как они способны к бесконечному воспроизведению в культуре, но они не являются генетически стабильными, потому что демонстрируют полиплоидные кариотипы. С другой стороны, первичные клетки, например фибробласты куриных эмбрионов,

МКС5, ^У138. которые являются ^трансформированными клетками, не являются непрерывными, поскольку они имеют конечную продолжительность жизни после нескольких поколений, но они являются генетически стабильными (т.е. диплоидными) клетками.

В данном изобретении термины клеточная линия и клетки будут использоваться неконкретно.

Подразумевается, что термины птичий, птица, атеФ или ауа, используемые в данном документе, имеют одно и то же значение и будут использоваться неконкретно. Термин птицы относится к организму любого вида, подвида или рода таксономического класса ауа. В предпочтительном воплощении термин птицы относится к любому животному таксономического отряда:

АпкегИогтек (т.е. утки, гуси, лебеди и родственные им). Отряд Гусеобразные содержит около 150 видов птиц из трех семейств: АпЫтМае (шпоровые гуси, крикуны), Апкегапайбае (полулапчатый гусь) и АпаОДае. которое включает более 140 видов водоплавающих птиц, среди них утки, гуси и лебеди. Все виды в отряде высоко адаптированы к существованию на водной поверхности. Все являются лапчатыми для эффективного плавания (хотя некоторые из них впоследствии стали главным образом наземными).

ОаШГогтек (то есть куры, перепелы, индейки, фазаны и родственные им). Курообразные представляют собой отряд птиц, включающий кур, индеек, перепелок и фазанов. Около 256 видов встречается во всем мире.

СокипЫГоппеФ (т.е. голуби и родственные им). Отряд птиц Со1итЫГогте8 включает в себя очень широкий спектр голубей.

В данном изобретении под термином эндогенная ретровиральная частица или эндогенная ретровирусная частица понимается ретровирусная частица или ретровирус, закодированный и/или экспрессированный АЬУ-Е или ЕАУ провирусными последовательностями в геномах некоторых птичьих клеток. У птиц АЬУ-Е-провирусные последовательности, как известно, присутствуют в геноме домашних кур (за исключением кур линии 0), красной джунглевой курицы и кольцо-шейного фазана. Как известно, ЕАУпровирусные последовательности присутствуют у всех птиц рода да11и8, который включает домашнюю курицу, курицу линии 0, красную джунглевую курицу, зеленую джунглевую курицу, серую джунглевую курицу, цейлонскую джунглевую курицу и их родственников (см. Реыйск е1 а1., 1990, 1. Уио1., 64:46404653).

В соответствии с предпочтительным воплощением птицу изобретения выбирают среди птиц без АЬУ-Е- и ЕАУ-провирусных последовательностей в геноме. Специалист в данной области способен определить, присутствуют ли АЬУ-Е- и ЕАУ-последовательности в геноме птицы (1оЬп8оп апД Непеше, 2001; ^е188таЬг е1 а1., 1996). Предпочтительно птицу выбирают из группы, состоящей из АшепГогтех (например утки, гуси, лебеди), индеек, перепелов, японского перепела, цесарки, павлина. Таким образом, клетки, полученные от таких птиц, не продуцируют способных к репликации эндогенных АЬУ-Е- и/или ЕАУ-частиц. В предпочтительном воплощении птицу данного изобретения выбирают из группы, включающей уток, гусей, лебедей, индеек, перепелов и японских перепелов, цесарок и павлинов. В соответствии с наиболее предпочтительным воплощением птица является уткой, более предпочтительно пекинской или мускусной уткой. В соответствии с более предпочтительным воплощением птица является пекинской уткой. Таким образом, изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (Е8), которые не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц.

В соответствии со вторым предпочтительным воплощением птицу изобретения выбирают среди птиц, которые не имеют полные АЬУ-Е-провирусные последовательности в геноме, но имеют в конечном итоге ЕАУ-провирусные последовательности. Специалист в данной области способен определить, частичные или полные АЬУ-Е- и ЕАУ-последовательности присутствуют в геноме птицы ПоНшоп апД Непеше, 2001). Несколько куриных пород было выбрано путем разведения тех особей, которые не содержат полных АЬУ-Е-провирусных последовательностей (т.е. штамм еу-0) и поэтому не продуцируют инфекционные АЬУ-Е-ретровирусные частицы, например:

домашняя курица линии 0 с фермы домашней птицы Еа§1 Ьаикшд υδΌΛ (порода ЕЬЬ-0). Куры ли- 3 021064 нии 0 Еак! Ьапкшд не содержат никаких эндогенных вирусных (еу) локусов, связанных с АЬУ (Όιιη\γίύύίι; апб Рагак, 1985);

линии ΌΕ и РЕ11 из ΙπκΙίΙιιΙ Ыайопа1 бе 1а РесНегсНе Адгопотц]ие (Поташе бе Мадпегаиб, Сюржер, Франция).

Таким образом клетки, полученные от еу-0 птиц, не продуцируют способных к репликации эндогенных ЛЬУ-Е частиц. В соответствии с предпочтительным воплощением птица представляет собой домашнюю курицу еу-0 (Оа11ик Оа11ик подвид ботекйсик), предпочтительно выбранную среди ЕЬЬ-0, ΌΕ и РЕ11.

Как правило, курицы еу-0 по-прежнему содержат ЕАУ-провирусную последовательность, но до сих пор не были выявлены никакие инфекционные ЕАУ-изоляты. Таким образом, данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных куриных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЕЗ) куриных пород еу-0, где указанные куриные клеточные линии еу-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц.

В соответствии с третьим воплощением птицу изобретения выбирают среди птиц, которые содержат в своем геноме полные и/или неполные АЬУ-Е- и ЕАУ-провирусные последовательности, но которые не могут продуцировать способных к репликации АЬУ-Е- и ЕАУ-ретровирусных частиц. Специалист в данной области способен определить, продуцируют ли указанные птичьи клетки инфекционные и/или неинфекционные ретровирусные частицы АЬУ-Е и/или ЕАУ Цойпкоп апб Непеше, 2001; \УейктаНг е! а1., 1996). Предпочтительно птицу выбирают из группы, состоящей из кур, свободных от специфического патогена (ЗРР), предпочтительно из кур породы Уа1о (ЬоЬтап) или линии 22 (ЗРАРАЗ).

Термин способный к репликации означает, что эндогенные ретровирусные частицы являются инфекционными, т.е. можно сказать, что такие ретровирусные частицы способны инфицировать птичьи клетки изобретения и реплицироваться в них.

Способ создания непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий изобретения, названных ЕВх®, состоит из двух этапов:

a) выделение, культивирование и размножение эмбриональных стволовых клеток птиц, которые не содержат полные эндогенные провирусные последовательности или их фрагменты, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, более конкретно ЕАУ- и/или АЬУЕ-провирусных последовательностей или их фрагментов, в полной культуральной среде, содержащей все факторы для их роста, в присутствии фидерного (питательного) слоя и с добавлением животной сыворотки; возможно указанная полная культуральная среда может содержать добавки, такие как дополнительные аминокислоты (т.е. глутамин, заменимые аминокислоты и т.д.), пируват натрия, бетамеркаптоэтанол, витамины, белковый гидролизат неживотного происхождения (т.е. дрожжевого, растительного (соя, пшеница и т.д.));

b) пассаж путем модификации культуральной среды, чтобы получить полное выведение указанных факторов, указанного фидерного слоя и указанной сыворотки и возможно указанных добавок, и дальнейшее получение прикрепленных или суспендированных птичьих клеточных линий, названных ЕВх®, которые не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, способны к пролиферации в течение длительного периода времени в основной среде в отсутствие экзогенных факторов роста, фидерного слоя и животной сыворотки.

Модификация культуральной среды этапа Ь) способа создания клеточных линий ЕВх® таким образом, чтобы получить постепенное или полное выведение факторов роста, сыворотки и фидерного слоя, может быть сделана одномоментно, последовательно или по частям. Последовательность истощения культуральной среды может быть выбрана среди следующих:

фидерный слой/сыворотка/факторы роста; фидерный слой/факторы роста/сыворотка; сыворотка/факторы роста/фидерный слой; сыворотка/фидерный слой/факторы роста; факторы роста/сыворотка/фидерный слой; факторы роста/фидерный слой/сыворотка.

В предпочтительном воплощении последовательность выведения представляет собой последовательность факторы роста/фидерный слой/сыворотка. В предпочтительном воплощении выведение добавок, таких как пируват натрия, заменимые аминокислоты (КПЕА), витамины, дрожжевой гидролизат, производится после выведения фидерного слоя и до выведения сыворотки. Предпочтительно выведение дрожжевого гидролизата производится после выведения пирувата натрия, ККЕА и витаминов.

В соответствии с предпочтительным воплощением птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии с этапом а) изобретения забирают из птичьих эмбрионов при откладке яиц, то есть когда яйца отложены. В соответствии с ЗеШег е! а1. (2006, 1. Арр1. РоиН. Кек. 15:219-228) яйцекладка соответствует следующим этапам развития в соответствии с классификацией Эяль-Г илади (классификация Еуа1-Ойабг Е¥АЬ-О1ЕАЭ1 апб КОСНАЫ, 1976, Ргот с1еауаде !о рпниНуе к!геаск Рогтайоп: а сотр1етеп1агу погта1 !аЬ1е апб а пе\у 1оок а! !йе йгк! к!адек оР !йе беуе1ортеп! ш !йе сЫск. Оепега1 Могрйо1оду Эеу. Вю1.

- 4 021064

49:321-337):

мускусная утка (также называемая утка ВагЪап): этап VII цесарка: этап VII - VIII индейка: этап УП-УШ пекинская утка: этап VIII курица: этап X японский перепел: этап XI гусь: этап XI.

Предпочтительно утиные эмбриональные стволовые клетки (Е§) этапа а) получают путем диссоциации эмбриона(ов) пекинской утки в районе этапа VIII (яйцекладки) по классификации Эяль-Гилади. Если отложенное яйцо, собранное при яйцекладке, не достаточно развито для забора эмбриональных стволовых клеток, то отложенное яйцо можно дальше инкубировать в течение периода от нескольких часов (в течение ночи) до одного или двух дней до созревания эмбриона. В соответствии со вторым воплощением утиные эмбриональные стволовые клетки (Е§) этапа а) получены от мускусной утки. При яйцекладке эмбрион мускусной утки не достаточно зрелый, поскольку яйцекладка проходит примерно на этапе VII, поэтому яйцо инкубируют в течение ночи для созревания яйца до этапа VШ-Х по классификации Эяль-Гилади.

Предпочтительно куриные эмбриональные стволовые клетки (Е§) этапа а), предпочтительно от куриной породы еу-0, получают путем диссоциации эмбриона(ов) в районе этапа X (яйцекладки) по классификации Эяль-Гилади.

С другой стороны, птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии с этапом а) изобретения забирают из эмбрионов до откладки яиц. Основные ограничения забора до откладки яиц заключаются в том, что яйцо должно быть получено от курицы хирургическим путем, и в том, что количество Е§клеток в эмбрионе значительно меньше. Кроме того, на очень ранних стадиях развития птичьего эмбриона Е§-клетки не так детально охарактеризованы, что делает трудным культивирование клеток Е§ ίη νίίτο. Специалист в данной области может определить срок до откладки яиц, что позволяет забирать птичьи Е§-клетки.

С другой стороны, птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии с этапом а) изобретения могут быть получены из птичьего эмбриона после откладки яиц до вылупления. Однако птичьи эмбриональные стволовые клетки будут постепенно вступать в дифференцировку для создания дифференцированных тканей; поэтому предпочительно забирать птичьи Е§ в течение недолгого периода после откладки. Специалист в данной области может определить срок после откладки яиц, что позволяет забирать птичьи эмбриональные стволовые клетки.

В соответствии с другим воплощением клетки этапа а) являются популяцией эмбриональных стволовых клеток, обогащенной первичными (примордиальными) зародышевыми клетками (РОС, ρπιηοιΆιΙ дегт се11). Более предпочтительно птичьи Е§-клетки этапа а) являются очищенными РОС. У птиц различных видов первичные зародышевые клетки развиваются из центральной области бластодермы (ОшзЪигд апб Еуа1-ОПабк 1987 ^еνе1ορтеηί 101(2):209-19; Кагадепс еί а1, 1996 Эе\' Оеηеί 19(4):290-301; Ре11Пе еί а1, 1997 Рои11гу 8ск 76(8): 1084-92). Затем они перемещаются в переднюю, внеэмбриональную, часть зародышевого полумесяца до тех пор, пока не собираются сосудами между 2,5 и 5 днями эмбрионального для связи с зародышевым хребтом. Они колонизируют зародышевый хребет, где в конечном итоге дифференцируются в ооциты или сперматоциты (№еи^коор апб §Щазшуа, 1979. Тке ΜίβΗΐΙίοη οί 1ке рптогб1а1 дегт се11з. Ш: ΡπιηοιΑιΙ дегт се11 ίη С1югба1ез. Εοηάοη: СатЪпбде ипщегебу Ргезз р113-127). Способы выделения РОС из донорных птичьих эмбрионов были представлены в литературе и могут быть легко выполнены специалистом в данной области (см., например, 1Р924997, опубликованный 7 сентября 1993, публикация № 05-227947; СЬалд οί а1. 1992. Се11 Вю1. ШЕ 19(2): 143-149; №ίίο οί а1. 1994 Μο1. Кергоб. Эе\'. 39: 153-161; Уазиба еί а1. 1992. I. Кергоб. Рей. 96: 521-528; Скаид еί а1. 1992 Се11 Вю1. ШЕ Кеροιίοτ 16(9): 853-857). В соответствии с воплощением РОС забирают из эмбриональной крови, забранной из спинной аорты куриного эмбриона на стадии 12-14 по классификации Гамбургера и Гамильтона (НатЪигдег & Η-ιππΕοη 1951 А зепез οί ηοηη;·ι1 8ίаде8 ίη 1ке беνе1ορтеηί οί сЫск етЪгуц. I. Μοη3ΐιο1. 88: 49-92). В другом предпочтительном воплощении РОС забирали из зародышевого полумесяца путем механического вскрытия куриного эмбриона или из половых желез. Однако, как говорилось выше, известны и другие способы выделения РОС, которые могут быть использованы в качестве альтернативы.

Эти птичьи эмбриональные стволовые клетки характеризуются долгим временем удвоения, которое составляет от 48 до 72 ч в культуре при 39°С.

Без связи с теорией определенные условия культивирования птичьих клеток Е§ после постепенного выведения факторов роста, фидерного слоя, добавок и сыворотки, позволяют адаптировать и отбирать клетки, которые сохраняют большинство желательных свойств Е§-клеток (стабильность кариотипа, неограниченная пролиферация, экспрессия Е§-маркеров), а кроме того демонстрируют удобные для производства характеристики, такие как рост в суспензии до высокой плотности клеток в бессывороточной среде. Теломераза является одним из наиболее важных Е§-маркеров. Из-за непрерывной и сохраняющей- 5 021064 ся экспрессии теломеразы в течение клеточных пассажей клетки ЕВх® являются непрерывными (т.е. бессмертными), а также являются генетически стабильными (т.е. диплоидными).

Более конкретно данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий, полученных из Εδ-клеток, где указанные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, причем указанный способ состоит из следующих этапов:

a) выделение птичьего эмбриона(ов), предпочтительно от утки или курицы еу-0, на стадии развития в период примерно от стадии VI по классификации Эяль-Гилади (классификация ΕΥΑΕ-ΟΙΕΛΌΓδ: ΕΥΆΕ-ΟΙΕΛΌΙ апб Κϋί'ΉΛΝ. 1976, Ргот с1еауаде 1о рппируе 81геаск Гогтабоп: а еотр1етеи1агу погта1 1аЫе апб а пе\у 1оок а! 1йе йг81 8!аде8 о! 1Пе беуе1ортеп! ίη 1Пе сЫск. Оепега1 Могр1ю1оду Эеу. Вю1., 49:321-337) и до вылупления, предпочтительно в районе откладки яиц, где геном указанной птицы не содержит эндогенные провирусные последовательности, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

b) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых клеток (Εδ), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной:

инсулиновым фактором роста 1 (ЮР-1) и цилиарным нейротрофическим фактором (СЮТР); животной сывороткой; и возможно факторами роста, выбранными из группы, включающей интерлейкин-6 (Ю-6), рецептор интерлейкина-6 (Ю-6К), фактор стволовых клеток (8СР) и фактор роста фибробластов (РСР);

c) посев суспензии Εδ-клеток, полученной на этапе Ь), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование Εδ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

б) дополнительно выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей Ю-6, Ю-6К, δСР, РСР, из культуральной среды в течение нескольких пассажей в диапазоне от 1 до примерно 15 пассажей, предпочтительно от 3 до примерно 15 пассажей, и дальнейшее культивирование птичьих Εδклеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно выведение из культуральной среды всех факторов роста, выбранных из группы, включающей Ю-6, Ю-6К, δСР, РСР, осуществляется одновременно в течение одного пассажа. Как правило, выведение Ю-6, Ю-6К, δСР, РСР производят в районе 10-15 пассажа;

е) выведение 1СР-1 и СЭТР из культуральной среды и дальнейшее культивирование птичьих Εδклеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно выведение из культуральной среды факторов роста, выбранных из группы, включающей 1СР-1 и СЭТР, проводится одновременно в течение одного пассажа. Как правило, выведение 1СР-1 и СЮТР производят в течение пассажей с № 15 по № 25. Альтернативно выведение 1СР-1 и СЭТР осуществляют путем постепенного снижения в течение нескольких пассажей (по меньшей мере 2 пассажей и примерно до 15 пассажей);

!) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;

д) возможно постепенное уменьшение концентрации добавок в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение добавок через по меньшей мере один пассаж; и

Ιι) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде, с тем чтобы получить полное выведение животной сыворотки после нескольких пассажей; и

ί) получение прикрепленных птичьих клеточных линий, названных ЕВх®, полученных из Εδклеток, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя, возможно без животной сыворотки и добавок, где указанные непрерывные диплоидные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

_() возможно дальнейшая адаптация указанных прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх® к условиям суспензионного культивирования. Этап адаптации клеточной культуры к суспензии может происходить в течение всего способа создания клеток ЕВх®. Например утиные клетки ЕВх®, полученные из эмбриональных стволовых клеток мускусной утки, были адаптированы к росту в суспензии перед выведением фидерного слоя. Утиные клетки ЕВх® (ЕВ24, ЕВ26, ЕВ66), полученные от пекинской утки, были адаптированы к росту в суспензии перед выведением животной сыворотки;

к) возможно дальнейшее субклонирование указанных птичьих клеток ЕВх®, например путем ограниченного разбавления. В предпочтительном воплощении данное изобретение связано с способом получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий, названных ЕВх®, полученных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (Εδ), где указанные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, а указанный способ включает следующие этапы:

a) выделение птичьего эмбриона(ов) на стадии развития примерно в период откладки яиц, где геном указанной птицы не содержит эндогенные провирусные последовательности, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

b) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых клеток (Εδ), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной, по меньшей мере:

- 6 021064 инсулиновым фактором роста 1 (ЮР-1) и цилиарным нейротрофическим фактором (СЫТР); и сывороткой млекопитающего, например фетальной бычьей сывороткой;

с) посев суспензии Εδ-клеток, полученной на этапе Ь), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование Εδ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

е) выведение ЮР-1 и СЫТР из культуральной среды и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

ί) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;

д) постепенное уменьшение концентрации указанной сыворотки млекопитающего в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение сыворотки млекопитающего после нескольких пассажей; и

1ι) получение прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх®, полученных из Εδ-клеток, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и сыворотки млекопитающего, и где указанные непрерывные диплоидные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

ί) возможно дальнейшая адаптация указанных прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх® к условиям суспензионного культивирования, предпочтительно путем поддерживания роста в виде суспензии, более предпочтительно путем переноса прикрепленной птичьей клеточной линии ЕВх®, полученной в этапе 1ι). на другую подложку с менее выраженными прикрепляющими свойствами по сравнению с первоначальной подложкой (например, такую как подложка для прикрепления И11та ЬоЮ·

Этап _() адаптации прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх® к условиям суспензионного культивирования при его осуществлении может быть произведен в другом предпочтительном воплощениии перед этапом д) постепенного уменьшения концентрации сыворотки млекопитающего в культуральной среде·

В другом предпочтительном воплощении основная культуральная среда в этапе Ь) способа получения непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий в соответствии с данным изобретением также дополняют фактором роста, выбранным из группы, включающей интерлейкин-6 (1Ь-6), рецептор интерлейкина-6 (1Ь-6К), фактор стволовых клеток ^СР) и фактор роста фибробластов (РОР), и указанный способ дополнительно содержит этап й):

й) возможно выведение из культуральной среды всех факторов роста, выбранных из группы, включающей 1Ь-6, 1Ь-6К, δСР, РОР, и дальнейшее культивирование Εδ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа·

В более предпочтительном воплощении, когда осуществляется этап й), этап е) выведения 1ОР-1 и СЫТР из культуральной среды осуществляется после этапа й) выведения из культуральной среды всех факторов роста, выбранных из группы, включающей 1Ь-6, 1Ь-6К, δСР, РОР·

В соответствии с изобретением основная культуральная среда обозначает культуральную среду с классическим составом среды, которая сама по себе обеспечивает по меньшей мере выживание клеток, а еще лучше рост клеток. Примерами основных сред являются ВМЕ (основная среда Игла), ΜΕΜ (минимальная среда Игла), среда 199, ΌΜΕΜ (среда Игла в модификации Дульбекко), ΟΜΕΜ (среда Игла в модификации Глазго), □ΜΕΜ-ΗαιηΗΣ, Нат-Р12 и Нат-Р10, среда Дульбекко в модификации Искова, среда Маккоя 5А, об/мин 1640, ΟΤΜ3· Основная среда содержит неорганические соли (например: СаС1₂, КС1, ЫаС1, ЫаНСО₃, ЫаН₂РО₄, ΜдδΟ₄ и т.д.), аминокислоты, витамины (тиамин, рибофлавин, фолиевая кислота, Ό-Са пантотенат и т.д.) и другие компоненты, такие как глюкоза, бета-меркаптоэтанол, пируват натрия. Предпочтительно основная среда является синтетической. В табл. 1 приведен состав ΌΜΕΜ/ НΑΜР12·

- 7 021064

Таблица 1. Состав ΌΜΕΜ-ΗΆΜ Р12 (мг/л)

Неорганические соли

Безводный хлорид кальция 116,60

Нитрат железа (III) · 9Н₂О 0,05

Сульфат железа (II) · 7Н₂О 0,417

Хлорид калия 311,80

Сульфат меди(П) * 5Н₂О 0,0013

Хлорид магния · 6Н₂О 61,20

Безводный сульфат магния 48,84

Хлорид натрия 6996,00

Дигидрофосфат натрия · Н₂О 62,50

Безводный гидрофосфат натрия 71,02 Сульфат цинка · 7Н₂О 0,432

Гидрокарбонат натрия 1200,00

Аминокислоты ί-аланин ί-аргинин · НС1 ί-аспарагин · Н₂О ί-аспарагиновая кислота ί-цистин · НС1 · Н₂О ί-цистеин · 2НС1 ί-глутаминовая кислота 1_-глутамин в Е15-813 Глицин ί-гистидин · НС! · Н₂О ί-изолейцин ί-лейцин ί-лизин · НС1 ί-метионин ί-фенилаланин

1_-пролин

1_-серин ί-треонин ί-триптофан ί-тирозин ί-валин

4.45

147.50

7.50 6,65 31,29 17,56 7,35 365,00 18,75 31,48

54.47 59,05 91,25

17.24

35.48

17.25

26.25

53.45 9,02 38,70 52,85

- 8 021064

Витамины
И(+)-биотин	0,0035
Кальция-ϋ пантотенат	2,24
Холина хлорид	8,98
Фолиевая кислота	2,65
Миоинозитол	12,60
Никотинамид	2,02
Пиридоксал · НС1	2,00
Пиридоксин · НС1	0,031
Рибофлавин	0,219
Тиамин · НС1	2,17
Тимидин	0,365
Витамин В12	0,68
Другие компоненты
О-глюкоза безводная	3151,00
Гипоксантин	2,10
ϋΙ.-68-липоевая кислота	0,105
Линолевая кислота	0,042
Фенол красный	8,10
Путресцин · 2НС1	0,081
Пируват натрия	55,00

Кроме того, основная среда изобретения может быть дополнена добавками, выбранными из следующей группы:

0,1-5 мМ Ь-глутамин, предпочтительно 2-3 мМ Ь-глутамин;

0,05-2 мМ пируват натрия, предпочтительно 0,1-1 мМ пируват натрия;

0,1-2,5% заменимые аминокислоты, предпочтительно примерно 1%, заменимые аминокислоты;

0,1-2,5% витамины, предпочтительно примерно 1% витамины;

0,05-5 мМ бета-меркаптоэтанол, предпочтительно примерно 0,16 мМ бета-меркаптоэтанол; белковый гидролизат неживотного происхождения.

Для создания утиных клеток ЕВх® изобретения основную среду предпочтительно дополняют белковым гидролизатом неживотного происхождения. Белковые гидролизаты неживотного происхождения выбирают из группы, включающей бакто-триптон, дрожжевой триптон, растительные гидролизаты, такие как соевые гидролизаты или их смеси. В предпочтительном воплощении белковые гидролизаты неживотного происхождения представляют собой гидролизаты дрожжей. Термин гидролизат включает ферментативное расщепление соевого пептона или дрожжевого экстракта. Гидролизат может быть получен из множества препаратов соевого пептона или дрожжевого экстракта соответственно, которые затем могут быть ферментативно расщеплены (например папаином), и/или образован путем аутолиза, термолиза и/или плазмолиза. Гидролизаты, такие как Уса51о1а1с. Ну-8оу, Ну-Уеа§1 412 и НБУеаЧ 444, также можно получить коммерческим путем, из таких источников как 8АЕС Вю8с1еисе5 (бывший ЖН) (Ленекса, Канзас), ОпеЧ 1и(егиайоиа1 (Норвич, Нью-Йорк), ОтдаиоТесЬше 8.А. (Франция) или Иейзске НеГе\\егке ОшЬН (Германия). Источники дрожжевых экстрактов также раскрыты в \УО 98/15614. Источники дрожжевых экстрактов и соевых гидролизатов также раскрыты в \УО00/03000. Гидролизаты, используемые в средах изобретения, предпочтительно очищены от нерасщепленной фракции, поскольку примеси, которые могут помешать эффективному культивированию, предпочтительно удаляются в ходе этой очистки, тем самым улучшая консистенцию гидролизата. Очистку можно проводить путем ультрафильтрации или хроматографии на сефадексе (например на Сефадексе 025 или Сефадексе О10 или эквивалентных материалах), ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, эксклюзионной хроматографии или обратнофазовой хроматографии. Предпочтительно очистку выполняют путем ультрафильтрации с использованием фильтра для удаления частиц более 10кДа. Эти способы являются известными в данной области. Используя эти способы, можно выбрать фракции, содержащие соевый или дрожжевой гидролизат определенного молекулярного веса. Предпочтительно средний молекулярный вес соевых и дрожжевых гидролизатов находится между примерно 220 и 375 Да. Предпочтительно в клеточной культуральной среде присутствует дрожжевой гидролизат. Дрожжевой гидролизат 50Х (около 200 г/л), полученный, например, из 8АЕС-В1О8С1ЕИСЕ8 (см. 58902С), присутствует в клеточной культу- 9 021064 ральной среде в конечной концентрации от примерно 0,1Х до 2Х, предпочтительно от примерно 0,5Х до примерно 1Х. Также в клеточную культуральную среду может быть добавлен соевый гидролизат. 50Х соевый гидролизат, полученный, например, из δΑΤΟ-ΒΙΟδΟΕΝΟΕδ (см. 58903С), добавляют в культуральную среду до конечной концентрации от примерно 0,1Х до 2Х, предпочтительно примерно 1Х. В качестве альтернативы в клеточную культуральную среду можно добавить смесь соевого и дрожжевого гидролизатов, как описано в υδ2004/0077086.

В соответствии с предпочтительным воплощением основная среда изобретения представляет собой ОМЕМ-НатР12, которая дополнена 2 мМ Ь-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 1% заменимыми аминокислотами, 1% витаминами, 0,16 мМ бета-меркаптоэтанолом и возможно 1Х дрожжевым гидролизатом.

Под полной культуральной средой понимают основную культуральной среду, дополненную или не дополненную, предпочтительно основную синтетическую среду, дополненную по меньшей мере одним фактором роста и животной сывороткой. Пример полной культуральной среды описан в АО 03/076601, АО 05/007840, ЕР 787180, υδ 6114168, υδ 5340740, υδ 6656479, υδ 5830510 и в Раш е! а1. (1996, Оеуе1ортеШ 122:2339-2348). Альтернативно полная культурная среда может быть кондиционной средой, предпочтительно кондиционной средой ΒΡΕ (Ьийа1о га! Пуег. клетки печени крыл линии Буффало). Например, кондиционные среды ВРЬ готовят в соответствии с признанными в данной области техниками, например описанными в διηίίΐι апй Ноорег (1987, Эеу. ΒίοΙ. 121:1-9). ΒΡΕ-клетки можно получить из АТСС под регистрационным номером СРБ-1442. Кондиционная среда может быть дополнена экзогенными факторами роста и животной сывороткой, как описано ниже.

Используемый в данном документе термин факторы роста означает факторы роста, необходимые для выживания и роста недифференцированных птичьих Εδ-клеток в культуре в основной культуральной среде. Можно схематически охарактеризовать два семейства факторов роста: цитокины и трофические факторы. Цитокины являются главным образом такими цитокинами, которые действуют через рецептор, связанный с белком др130. Таким образом, ингибирующий фактор лейкемии (Ь1Р), интерлейкин11, интерлейкин-6, рецептор интерлейкина-6, цилиарный нейротрофический фактор (СКТР), онкостатин и кардиотропин имеют аналогичный механизм действия с увеличением уровня рецепторов к специфической цепи и их комбинации с белком др130 в мономерной, а иногда и гетеродимерной форме. Трофические факторы представляют собой главным образом фактор стволовых клеток (8СР), инсулиновый фактор роста 1 (ЮР-1) и фактор роста фибробластов (РСР), предпочтительно основной РОЕ (ЬРОР) или человеческий РОЕ (ЬРОР).

Полная культуральная среда в соответствии с изобретением включает основную культуральную среду, предпочтительно основную синтетическую среду, и по меньшей мере один цитокин, который действует через рецептор, связанный с белком др130, и/или по меньшей мере один трофический фактор. Предпочтительно полная культурная среда в соответствии с изобретением включает основную среду и по меньшей мере один фактор роста, выбранный из группы, включающей ингибирующий фактор лейкемии (Ь1Р), онкостатин, кардиотропин, инсулиновый фактор роста 1 (1СР-1), цилиарный нейротрофический фактор (ΟΝΤΕ), интерлейкин 6 (1Ь-6), рецептор интерлейкина-6 (1Ь-6Р), фактор стволовых клеток (8СР), фактор роста фибробластов (РСР), интерлейкин-11 (1Ь-11). В соответствии с первым предпочтительным воплощением полная культуральная среда является основной средой, дополненной животной сывороткой и по меньшей мере 1ОР-1 и СЭТР. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением полная культуральная среда является основной средой, дополненной животной сывороткой и по меньшей мере 1ОР-1, СЭТР, 1Ь-6 и 1Ь-6Р. В соответствии с третьим предпочтительным воплощением полная культуральная среда является основной средой, дополненной животной сывороткой и по меньшей мере 1ОР-1, СЭТР, 1Ь-6, 1Ь-6Р, §СР, РСР. В соответствии с другим воплощением полная культуральная среда является кондиционной культуральной средой, содержащей факторы роста (например экспрессируемые клетками ΒΡΣ и δΤΟ) и возможно дополненной по меньшей мере одним экзогенным фактором роста, выбранным из группы, включающей: Ь1Р, 1ОР-1, СЭТР, 1Ь-6, 1Ь-6Р, §СР, РСР, 1Ь-11. Концентрация факторов роста 1СР-1, СЭТР, 1Ь-6, 1Ь-6Р, §СР, РСР, 1Ь-11 в основной среде или в кондиционной культуральной среде составляет примерно от 0,01 до 10 нг/мл, предпочтительно от 0,1 до 5 нг/мл, а более предпочтительно около 1 нг/мл.

Культуральная среда изобретения может также содержать дополнительные антибиотики, такие как, например, гентамицин, пенициллин и стрептомицин, чтобы предотвратить бактериальную контаминацию. Антибиотики можно добавить в культуральную среду на ранних пассажах культуры Εδ-клеток. Например, в культуральную среду можно добавить гентамицин до конечной концентрации 10 нг/мл, пенициллин до конечной концентрации 100 и/мл и стрептомицин до конечной концентрации 100 мкг/мл. В предпочтительном воплощении на поздних этапах способа создания непрерывных диплоидных птичьих клеточных линий изобретения антибиотики в культуральную среду не добавляют.

В способе создания птичьих эмбриональных стволовых клеток изобретения клетки культивировали на слое фидерных клеток. Более предпочтительно фидерные клетки являются животными клетками или клеточными линиями, культивированными для получения культуры птичьих Εδ-клеток. Альтернативно фидерные клетки могут быть заменены внеклеточным матриксом со связанными факторами роста. Фи- 10 021064 дерный матрикс будет соответственно относиться либо к фидерным клеткам, либо к внеклеточному матриксу. Фидерный матрикс, используемый здесь, создавали в соответствии с процедурами, известными в данной области. Как отмечалось выше, предпочтительно фидерный матрикс является предварительно обработанным. Под термином предварительно обработанный подразумевается, что фидерный матрикс культивируют в присутствии сред в течение периода времени до момента сохранения клеток, полученных из бластодермального диска оплодотворенных птичьих яиц в контакте с фидерным матриксом, например в течение времени, достаточного для того, чтобы начать и наладить продукцию фидерным матриксом, например, факторов роста или иных факторов; обычно фидерный матрикс предварительно обрабатывали путем культивирования его самого по себе в течение от одного до двух дней до момента сохранения клеток, полученных из бластодермального диска оплодотворенных птичьих яиц в контакте с фидерным матриксом. Фидерные клетки предпочтительно включают мышиные фибробласты. Предпочтигельными являются δΤΟ-фибробласты, но первичные фибробласты тоже подходят. Кроме того, в то время как данное изобретение было описано в связи с использованием мышиных клеточных фидерных матриц, предполагается, что также могут быть использованы фидерные матриксы, содержащие клетки от других мышиных видов (например, крысы); других видов млекопитающих (например, видов копытных, крупного рогатого скота, свиней) или видов птиц (например ОаШпасеа, курицы, индейки, утки, гуси, перепела, фазана). В другом воплощении фидерные клетки изобретения могут быть трансфицированы вектором(ами) экспрессии, позволяющим(и), например, постоянно экспрессировать в δΤΟ-клетках факторы роста, такие как птичий δСР. Таким образом, этот фидер производит фактор в такой форме, которая является растворимой и/или прикрепленной к плазматической мембране клеток. Таким образом, способ культивирования данного изобретения возможно может включать создание монослоя фидерных клеток. Фидерные клетки митотически инактивируют с помощью стандартных методик. Например, фидерные клетки можно подвергнуть рентгеновскому или гамма-излучению (например гамма-излучению в 4000 рад), либо можно обработать митомицином С (например 10 мкг/мл в течение 2-3 ч). Процедуры митотического инактивования клеток также детально описаны в информации, обычно посылаемой вместе с клетками из Американской коллекции типовых культур (Атепсап Туре СиИиге Со11есйоп, АТСС), 10801 ипАегШу ВоиЮчгФ Мапаккак, Уа. 20110-2209 (например δΤΟ-фидерные клетки находятся в АТСС под регистрационным номером 1503). Монослои возможно могут быть культивированы до конфлюентности примерно 80%, предпочтительно до конфлюентности примерно 90%, а более предпочтительно до конфлюентности примерно 100%. Хотя конфигурация фидерных клеток в виде монослоя является предпочтительной конфигурацией для культуры, в рамках данного изобретения предусматривается любая подходящая конфигурация. Так, например, предполагается, что слои, монослои, кластеры, агрегаты или другие ассоциации или объединения фидерных клеток попадают в рамки данного изобретения и в частности под значение термина матрикс.

Культуральную среду изобретения дополняют животной сывороткой. Животной сывороткой предпочтительно является фетальная животная сыворотка. Предпочтительной является фетальная бычья сыворотка. Кроме того, хотя данное изобретение было описано с использованием фетальной бычьей сыворотки, предполагается, что также может быть использована животная сыворотка от других видов животных (например, курицы, лошади, свиньи, копытных и т.д.). Конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляла примерно от 1 до 25%, предпочтительно от 5 до 20%, более предпочтительно от 8 до 12%. В предпочтительном воплощении конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляла примерно 10%. В соответствии с предпочтительным воплощением культуральная среда содержала примерно 10% фетальной бычьей сыворотки.

В первом предпочтительном воплощении птица данного изобретения выбрана из отряда АпкепГогтек и предпочтительно является уткой, более предпочтительно пекинской уткой, и более предпочтительно пекинской уткой породы М14 или ОЬ30. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением птица данного изобретения представляет собой мускусную утку. Таким образом данное изобретение предлагает первый способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (Εδ), где указанные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц и где указанный способ включает следующие стадии:

a) выделение утиного эмбриона(ов) на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки. Возможно яйца могут быть инкубированы, обычно в течение ночи, до созревания (например у мускусной утки).

b) суспендирование утиных эмбриональных стволовых клеток (Εδ), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной инсулиновым фактором роста 1 (ЮР-1), цилиарным нейротрофическим фактором (СЫТР), интерлейкином-б (1Ь-б), рецептором интерлейкина-б (1Ь-бК), фактором стволовых клеток ^СР), фактором роста фибробластов (РОР) и животной сывороткой;

c) посев суспензии Εδ-клеток, полученной на этапе Ъ), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование утиных Εδ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

ά) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей 1ОР-1, СЫТР, 1Ь-б, 1Ь-бК,

- 11 021064

ЗСР, РОР, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование утиных Εδ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

ί) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, от пассажа к пассажу с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно от 5 до примерно 25 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;

д) возможно постепенное уменьшение концентрации животной сыворотки в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей; и

И) получение прикрепленных утиных клеточных линий, полученных из Εδ-клеток и названных утиными ЕВх®, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

ί) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных утиных клеточных линий к условиям суспензионного культивирования.

Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами ί) и д) или между этапами д) и И).

Концентрация животной сыворотки на этапе Ь) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация инсулинового фактора роста 1 (1ОР-1), цилиарного нейротрофического фактора (СИТР), интерлейкина-6 (1Ь-6), рецептора интерлейкина-6 (1Ь-6К), фактора стволовых клеток (ЗСР) и фактора роста фибробластов (РОР) предпочтительно составляет около 1 нг/мл.

Данное изобретение также предлагает второй способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (Εδ), где указанные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц и где указанный способ включает следующие этапы:

a) выделение утиного эмбриона(ов) на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки. Возможно яйца могут быть инкубированы обычно в течение ночи, до созревания (например у мускусной утки).

b) суспендирование утиных эмбриональных стволовых клеток (Εδ), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной 1ОР-1, СИТР, 1Ь-6, 1Ь-6К, ЗСР, РОР и животной сывороткой;

c) посев суспензии Εδ-клеток, полученной на этапе Ь), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование утиных Εδ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

й) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей 1Ь-6, 1Ь-6К, ЗСР, РОР, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

е) выведение факторов роста 1ОР-1 и СИТР из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

ί) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно после примерно 5-15 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;

Концентрация животной сыворотки на этапе Ь) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация 1ОР-1, СИТР, 1Ь-6, 1Ь-6К, ЗСР и РОР предпочтительно составляет около 1 нг/мл.

Данное изобретение также предлагает третий способ получения непрерывных диплоидных утиных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (Εδ), где указанные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц и где указанный способ включает следующие этапы:

а) выделение утиного эмбриона(ов) на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки. Возможно яйца могут быть инкубированы обычно в течение ночи до созревания (например у мускусной утки).

- 12 021064

b) суспендирование утиных эмбриональных стволовых клеток (ЕЗ), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной инсулиновым фактором роста 1 (ЮР-1), цилиарным нейротрофическим фактором (СЫТР) и животной сывороткой;

c) посев суспензии ЕЗ-клеток, полученной на этапе Ь), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование утиных ЕЗ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

б) выведение факторов роста ЮР-1 и СЫТР из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование утиных ЕЗ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

Р) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно в течение от примерно 5 до примерно 25 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;

И) получение прикрепленных утиных клеточных линий, полученных из ЕЗ-клеток и названных утиными ЕВх®, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные утиные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

ί) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных утиных клеточных линий ЕВх® к условиям суспензионного культивирования.

При получении прикрепленных или суспендированных утиных клеточных линий способ изобретения может также включать дополнительный этап адаптации утиных клеток ЕВх® к росту в культуральной клеточной среде без белкового гидролизата неживотного происхождения, такого как дрожжевой гидролизат.

Предпочтительно утиные клеточные линии ЕВх® изобретения не отображают обратнотранскриптазную активность при анализе Ц-РЕКТ. Кроме того, способные к репликации эндогенные ретровирусные частицы не продуцируются утиными клетками ЕВх®, как об этом свидетельствуют эксперименты совместного культивирования утиных клеток ЕВх® изобретения с клетками, способными к репликации АЬУ, такими как перепелиные ОТ6-клетки или куриные ЭП-клетки. Кроме того, анализ путем трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) также свидетельствует об отсутствии способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц в утиных клетках ЕВх®. Предпочтительно утиные клеточные линии ЕВх® изобретения выбирают среди утиной ЕВ24, утиной ЕВ26 и утиной ЕВ66, как описано далее.

В другом предпочтительном воплощении птица данного изобретения выбрана из отряда ОаШРогтек и более предпочтительной является курица, предпочтительно домашняя курица еу-0 (Оа11ик Оа11ик подвид ботекйсик). Таким образом, данное изобретение предлагает способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий домашней курицы еу-0, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЕЗ), где указанные клеточные линии домашней курицы еу-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц АЬУ-Е и где указанный способ включает следующие этапы:

a) выделение эмбриона(ов) домашней курицы еу-0 на стадии яйцекладки (т.е. откладки яиц) или незадолго до или после яйцекладки;

b) суспендирование эмбриональных стволовых клеток (ЕЗ) домашней курицы еу-0, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной ЮР-1, СЫТЬ, 1Ь-6, 1Ь-6К, ЗСР, РОР и животной сывороткой;

c) посев суспензии ЕЗ-клеток, полученной на этапе Ь), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ЕЗ-клеток домашней курицы еу-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;

б) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей 1ОР-1, СЫТР, РЬ-6, РЬ-6К, ЗСР, РОР, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование куриных ЕЗ-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

Р) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно в течение от 5 до примерно 25 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;

И) получение прикрепленных клеточных линий домашней курицы еу-0, полученных из ЕЗ-клеток и названных ЕВх еу-0, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц АЬУ-Е;

ί) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных птичьих клеточных линий ЕВх еу-0 к условиям суспензионного культивирования.

- 13 021064

Добавки к основной среде выводятся в ходе способа и предпочтительно между этапами Г) и д) или между этапами д) и Н).

Концентрация животной сыворотки на этапе Ь) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация ЮР-1, СЫТР, 1Ь-6, 1Ь-6К, 8СР и РОР предпочтительно составляет около 1 нг/мл.

Данное изобретение также предлагает второй способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий домашней курицы еу-0, полученных из эмбриональных стволовых клеток (Е8), где указанные клеточные линии домашней курицы еу-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц АЬУ-Е и где указанный способ включает следующие этапы:

b) суспендирование эмбриональных стволовых клеток (Е8) домашней курицы еу-0, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной 1ОР-1, СЫТР, 1Ь-6, 1Ь-6К, 8СР, РОР и животной сывороткой;

c) посев суспензии Е8-клеток, полученной на этапе Ь), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование Е8-клеток домашней курицы еу-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;

Д) выведение всех факторов роста, выбранных из группы, включающей 1Ь-6, 1Ь-6К, 8СР, РОР, из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование куриных Е8-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

е) выведение факторов роста 1ОР-1 и СЫТР из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование Е8-клеток домашней курицы еу-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;

Г) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде с тем, чтобы получить полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, предпочтительно в течение от примерно 5 до примерно 45 пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;

Н) получение прикрепленных клеточных линий домашней курицы еу-0, полученных из Е8-клеток, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, где указанные непрерывные диплоидные клеточные линии домашней курицы еу-0, названные куриными ЕВх®, не продуцируют способных к репликации эндогенных АЬУ-Е ретровирусных частиц;

ί) возможно дальнейшая адаптация прикрепленных клеточных линий домашней курицы еу-0 к условиям суспензионного культивирования.

Концентрация животной сыворотки на этапе Ь) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация 1ОР-1, СЫТР, 1Ь-6, 1Ь-6К, 8СР и РОР предпочтительно составляет около 1 нг/мл.

Данное изобретение также предлагает третий способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий домашней курицы еу-0, полученных из эмбриональных стволовых клеток (Е8), где указанные клеточные линии домашней курицы еу-0 не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц АЬУ-Е и где указанный способ включает следующие этапы:

b) суспендирование эмбриональных стволовых клеток (Е8) домашней курицы еу-0, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной 1ОР-1, СЫТР и животной сывороткой;

Д) выведение факторов роста 1ОР-1 и СЫТР из культуральной среды в течение от одного до примерно 15 пассажей, предпочтительно одновременно в течение одного пассажа, и дальнейшее культивирование Е8-клеток домашней курицы еу-0 в течение по меньшей мере одного пассажа;

Н) получение прикрепленных клеточных линий домашней курицы еу-0, полученных из Е8-клеток и названных куриными ЕВх® еу-0, способных к пролиферации в основной среде без факторов роста, фидерного слоя и возможно без животной сыворотки, и где указанные непрерывные диплоидные куриные клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

- 14 021064

Концентрация животной сыворотки на этапе Ь) предпочтительно составляет от 5 до 10%. Концентрация ЮР-1 и ί','ΝΤΡ предпочтительно составляет около 1 нг/мл.

В другом предпочтительном воплощении птицей данного изобретения является домашняя курица (Са11и5 Са11и5 подвид ботекйсик), полученная из стаи птиц, свободных от специфического патогена (ЗРР). Более предпочтительной куриной породой является порода белых кур Ливорно (^Ыке-ЬедЬоги). Куриные яйца ЗРР были проверены на отсутствие известных куриных бактериальных патогенов и вирусов, включая вирус ретикулоэндотелиоза (КЕУ) и экзогенные вирусы птичьего лейкоза (АБУ-А, АЬУ-В, АЬУ-С, АБУ-Ό, АБУ-ί). Яйца ЗРР изобретения могут быть яйцами УАЬО от ΡΘΗΜΑΝΝ (Куксхафен, Германия) или яйцами Ь22 от СНАКБЕЗ К1УЕК (ЗраТак). Таким образом, данное изобретение также предлагает способы получения непрерывных диплоидных куриных клеточных линий, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЕЗ) из куриных яиц ЗРР, как описано для куриных яиц еу-0. Предпочтительно куриная клеточная линия ЕВх®, полученная из яиц ЗРР, представляет собой ΕΒν13.

Куриные клеточные линии ЕВх® изобретения могут отображать обратнотранскриптазную активность при анализе 0-РЕК. но без продукции способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц. Отсутствие способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц может быть продемонстрировано в экспериментах совместного культивирования куриных клеток ЕВх® еν-0 изобретения с клетками, способными к репликации АБУ, такими как перепелиные ОТб-клетки или куриные ЭР1-клеткн. Кроме того, анализ путем трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) также свидетельствует об отсутствии способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц в куриных клетках ЕВх® еν-0.

Температура тела птиц обычно составляет около 39°С. Таким образом, способы изобретения могут также включать дополнительный этап понижения температуры клеточных культур до 37°С в целях адаптации птичьих клеточных линий изобретения к росту при 37°С. Предпочтительно температурная адаптация производится после удаления фидера и до удаления сыворотки. Альтернативно температурная адаптация производится после этапа удаления сыворотки или после этапа адаптации клеточных линий к суспензионному культивированию.

Установленные линии ЕВх® изобретения имеют характерный рост либо в виде прикрепленных клеток, либо в виде суспензии клеток в культуральной среде без экзогенных факторов роста и животной сыворотки и без фидерных клеток. Для адаптации клеток к суспензионному культивированию могут быть использованы отдельно или в комбинации различные методики, среди которых прикрепленные клетки сеяли с высокой плотностью, немного поышенной конфлюентностью клеток для усиления перехода клеток в суспензию;

прикрепленные клетки сеяли в клеточной культуральной среде с низкой концентрацией животной сыворотки;

прикрепленные клетки сеяли в клеточные культуральные сосуды из пластика, на котором невозможна адгезия клеток или слабая адгезия клеток, например бактериальные чашки и платы, платы с ультранизкой прикрепляющей способностью, разработанные такими компаниями как Согшид (чашки и платы для тканевых культур, см. 3262, 3473, 3471, 3474; колбы см. 3814 и т.д.) или ЗагМеШ (сосуды см. 831810502 и т.д.);

прикрепленные клетки сеяли в сосуд и культивировали в условиях перемешивания (прибл. 50 об/мин).

Клетки ЕВх®, предпочтительно утиные ЕВх® и куриные ЕВх® еν-0, могут быть культивированы ίη νίίτο в течение значительного периода времени. Преимущественно прикрепленные или субстратнезависимые (т.е. суспендированные) клетки ЕВх®, полученные в способе изобретения, способны к пролиферации в течение по меньшей мере 50 поколений, по меньшей мере 75 поколений, по меньшей мере 100 поколений, по меньшей мере 125 поколений, по меньшей мере 150 поколений, по меньшей мере 175 поколений, по меньшей мере 200 поколений, по меньшей мере 250 поколений. Под выражением линия понимается любая популяция клеток, способных бесконечно пролиферировать в культуре ίη νίίτο, сохраняя в большей или меньшей степени те же морфологические и фенотипические характеристики. Клоны могут быть получены, например путем ограниченного разведения, из клеток ЕВх® изобретения. Эти клоны представляют собой клетки, которые являются генетически идентичными клетке, из которой они образовались путем деления.

Данное изобретение также относится к непрерывным диплоидным птичьим клеточным линиям, названным ЕВх®, полученным в способе изобретения; указанные ЕВх® являются небольшими, круглыми (т.е. диаметром около 10 мкм), одтельными клетками с временем удвоения около 30 ч или менее при 37 или 39°С. Птичьи клетки ЕВх®, предпочтительно утиные ЕВх® или куриные ЕВх® еν-0, демонстрируют фенотип эмбриональной стволовой клетки со следующими характеристиками:

высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение;

- 15 021064 эндогенная теломеразная активность;

возможно они могут экспрессировать один или более дополнительный Εδ-маркер, например щелочную фосфатазу, маркеры δδΕΑ-1, ЕМА-1, ΕΝδ1;

время удвоения короче времени удвоения птичьих Εδ-клеток этапа а) способа изобретения (от 48 до 72 ч при 39°С), около 30 ч или менее (предпочтительно 24 ч при 37°С.

Указанные клетки не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц.

Птичьи ЕВх® клеточные линии изобретения способны к бесконечной пролиферации в основной среде, в частности в такой среде как δΑΕί'.’ Εxсе11, ΌΜΕΜ, ΟΜΕΜ, ^ΜΕΜ-НатР12 или Маккоя, без экзогенных факторов роста, сыворотки и/или инактивированного фидерного слоя, возможно дополненной различными добавками, обычно используемыми специалистами в данной области. Примерами добавок являются заменимые аминокислоты, витамины, пируват натрия и антибиотики. Утиные клетки ЕВх® изобретения имеют замечательное свойство расти в основной культурной среде, не дополненной глутамином.

Данное изобретение также относится к клеточной культуральной среде для поддержания плюриили мультипотентных птичьих эмбриональных стволовых клеток, предпочтительно плюри- или мультипотентных утиных эмбриональных стволовых клеток (Εδ) в культуре в недифференцированном состоянии. В соответствии с предпочтительным воплощением данное изобретение относится к клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, содержащей основную культуральную среду, дополненную животной сывороткой и по меньшей мере 1ОР-1 и СЭТР. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением данное изобретение относится к клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, содержащей основную культуральную среду, дополненную животной сывороткой и по меньшей мере 1ОР-1, СЭТР, 1Ь-6, 1Ь-6К В соответствии с третьим предпочтительным воплощением данное изобретение относится к клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, содержащей основную культуральную среду, дополненную животной сывороткой и по меньшей мере 1ОР-1, СЭТР, 1Ь-6, ΙΌ-6Κ, δСР и РОР. Указанные среды являются достаточными для поддержания указанных утиных Εδ-клеток в культуре в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно по меньшей мере 20 дней, предпочтительно по меньшей мере 100 дней в недифференцированном состоянии. Указанные культуральные среды изобретения возможно могут также содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей интерлейкин-11, кардиотропин, онкостатин и ингибирующий фактор лейкемии (ЫР). Предпочтительно указанные культуральные среды также содержат белковый гидролизат неживотного происхождения, как описано выше; более предпочтительно это дрожжевые гидролизаты в концентрации 1Х. Культуральная среда птичьих (предпочтительно утиных) Εδ-клеток изобретения может также содержать слой фидерных клеток.

Данное изобретение также предлагает непрерывную утиную культуру Εδ-клеток, состоящую в основном из недифференцированных утиных Εδ-клеток, демонстрирующих фенотип стволовой клетки со следующими характеристиками:

высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение; эндогенная теломеразная активность;

возможно утиные Εδ-клетки могут экспрессировать один или более дополнительный Εδ-маркер, например щелочную фосфатазу, маркеры δδΕΑ-1, ЕМА-1, ΕΝδ1;

время удвоения около 40 ч при 37 или 39°С.

Указанные недифференцированные утиные клетки в соответствии с изобретением способны поддерживать указанный фенотип стволовых клеток при выращивании на фидерных клетках в клеточной культуральной среде для утиных эмбриональных стволовых клеток, как описано выше. Указанные недифференцированные утиные клетки используются для продукции химерных или трансгенных уток.

Таким образом, данное изобретение также относится к способу получения химерной утки, который включает следующие стадии:

a) введение непрерывной утиной Εδ-культуры клеток, описанной выше, в подзародышевую полость реципиентного утиного эмбриона; и

b) инкубация эмбриона, полученного на этапе а), для выведения утенка;

c) выбор указанного химерного утенка, содержащего гетерологичные клетки, которые в нем колонизировались.

Данное изобретение также относится к способу получения генетически модифицированной химерной утки, который включает следующие этапы:

a) введение генетически модифицированных утиных Εδ-клеток, описанных выше, в подзародышевую полость реципиентного утиного эмбриона и

c) выбор указанного химерного утенка, содержащего генетически модифицированные гетерологичные клетки, которые в нем колонизировались.

Данное изобретение также относится к способу получения потомства указанного химерного утенка, который включает следующие этапы:

- 16 021064

a) ожидание созревания выбранного химерного утенка, полученного на этапе с), во взрослую птицу;

b) разведение указанной взрослой птицы, имеющей гетерологичные клетки данного изобретения, и производство таким образом потомства птицы;

c) выбор в потомстве целевых птиц.

Изобретение может включать дополнительный этап экспрессии гетерологичного полипептида, закодированного вектором экспрессии, содержащимся в указанных генетически модифицированных утиных Εδ-клетках. Предпочтительно гетерологичный полипептид вводят в биологические жидкости утки, такие как кровь, сперму, мочу или белок развивающегося птичьего яйца, производимого женской особью генетически модифицированной утки.

Клетки ЕВх® изобретения имеют все вышеупомянутые характеристики и могут использоваться для производства биопрепаратов, таких как вирусные вакцины и рекомбинантные пептиды и белки.

Данное изобретение также предлагает способ репликации вируса в непрерывных диплоидных птичьих клеточных линиях ЕВх® изобретения. Более предпочтительно изобретение предлагает способ репликации вируса в непрерывных диплоидных птичьих клеточных линиях ЕВх® изобретения, предпочтительно утиных или куриных клеточных линиях ЕВх®, который включает следующие этапы:

инфицирование птичьей культуры клеток ЕВх® целевым вирусом; указанные птичьи клетки ЕВх® предпочтительно культивировали в среде без животной сыворотки;

культивирование инфицированных птичьих клеток ЕВх® с целью репликации указанного вируса; сбор вируса в клеточном культуральном супернатанте и/или внутри указанных клеток.

В соответствии с предпочтительным воплощением указанный способ включает следующие этапы:

a) пролиферация указанных птичьих ЕВх® в культивационном сосуде в суспензии в бессывороточной среде №1;

b) инфицирование указанных клеток выбранным вирусом, когда клеточная плотность достигает не менее 1,5 млн клеток/мл;

c) непосредственно перед инфицированием, одновременно с инфицированием или вскоре после инфицирования возможно добавление к клеточной культуре бессывороточной среды № 2 и

б) дальнейшее культивирование указанных инфицированных клеток с целью репликации вируса и е) возможно сбор указанного вируса.

Указанный способ изобретения может включать дополнительный этап добавления протеолитического фермента в культуральную среду в условиях, которые позволят вирусу размножаться. Протеолитический фермент выбирают из группы, включающей трипсин, химотрипсин, термолизин, пепсин, панкреатин, папаин, проназу, субтилизин А, эластазу, фурин и карбоксипептидазу. В соответствии с предпочтительным воплощением фермент является трипсином.

Предпочтительно протеолитический фермент является рекомбинантным белком, произведенным в прокариотическом хозяине или на растениях (например 1гур/еап). Протеолитический фермент можно добавить до, во время и/или после инфицирования вирусом. Предпочтительно добавление протеолитического фермента производится после инфицирования вирусом. Добавление протеолитического фермента в культуральную среду можно выполнять один раз в сутки, более одного раза в сутки или менее одного раза в сутки до того, как вирус не будет забран.

Используемый в данном документе термин вирус включает в себя не только природные вирусы, но также ослабленные вирусы, химерные вирусы, вакцинные штаммы, а также рекомбинантные вирусы и вирусные векторы, полученные от них. Вирус изобретения предпочтительно выбирают из группы, включающей поксвирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, вирусы герпеса, вирусы гепатита, аденовирусы, парвовирусы, реовирусы, цирковирусы, коронавирусы, флавивирусы, тогавирусы, бирнавирусы и ретровирусы.

В предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вирусные, вакцины принадлежат к семейству Рохушбае и более предпочтительно к СНогборохутбае. В одном воплощении вирус или связанные с ним вирусные векторы, вирусные частицы и вирусные вакцины представляют собой Роху1ги8, предпочтительно Лу1роху1ги8, выбранный среди вируса оспы птиц (т.е. ΤΚΌνΆΟ), вируса оспы канареек (т.е. ΑΕνΑΟ), вируса оспы юнко, вируса оспы майны, вируса оспы голубя, вируса оспы попугаев, вируса оспы перепела, вируса оспы скворца, вирус оспы индейки. В соответствии с другим предпочтительным воплощением вирус представляет собой вирус осповакцины, выбранный среди штамма и81ег-Н181гее вируса осповакцины, модифицированного вируса осповакцины, такого как модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара (ΜνΑ), который может быть получен из АТСС (номер АТСС νΚ-1508), NΥVΑС (Тайадйа е! а1., 1992, ^го1о§у, 188:217-232), ЬС16т8 (8υ§ΐто!о е! ΥатаηоисЫ, 1994, Vасс^пе. 12:675-681), 0178 (Кетре е! а1., 1968, Реб1айгс8 42:980-985), и других рекомбинантных или нерекомбинантных вирусов осповакцины.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству ОпНотухоутбае, в частности к вирусу гриппа. Вирус гриппа выбирают из группы, включающей вирус человеческого гриппа, вирус птичьего гриппа, вирус лошадиного гриппа, вирус свиного гриппа, вирус кошачего гриппа. Вирус гриппа предпочтительно выбирают

- 17 021064 среди штаммов А, В и С. Среди штаммов А можно перечислить вирусы с различными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, такими как Η1Ν1, Η2Ν2, Η3Ν2, Η4Ν2, Η4Ν6, Η5Ν1, Η5Ν2, Η7Ν7 и Η9Ν2, но не ограничиваясь ими. Среди штаммов Η1Ν1 можно перечислить А/Пуэрто-Рико/8/34, А/Новая Каледония/20/99, А/Пекин/262/95, А/Йоханнесбург/282/96, А/Техас/36/91, А/Сингапур, А/Соломоновы острова/03/2006. Среди штаммов Η3Ν2 можно перечислить А/Панама/2007/99, А/Москва/10/99, А/ Йоханнесбург/33/94, А/Висконсин/10/04. Среди штаммов В можно перечислить В/Пуэрто-Рико/8/34, В/Йоханнесбург/5/99, В/Вена/1/99, В/Энн-Арбор/1/86, В/Мемфис/1/93, В/Харбин/7/94, Х/Шандонг/7/97, В/Конг Конг/330/01, В/Яманаси/166/98, В/Жиангсу/10/03, В/Малайзия, но не ограничиваясь ими. Вирус гриппа изобретения выбирают среди вируса дикого типа, первичного вирусного изолята, полученного от инфицированного индивидуума, рекомбинантного вируса, ослабленного вируса, термочувствительного вируса, адаптированного к низкой температуре вируса, химерного вируса, вируса, спроектированного путем обратной генетики. Когда вирус изобретения является вирусом гриппа, способ изобретения включает дополнительный этап добавления протеолитического фермента в культуральную среду в условиях, которые позволят вирусу размножаться. В соответствии с предпочтительным воплощением фермент является трипсином. Конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде составляет от примерно 0,01 до 10 мкг/мл. Более предпочтительно конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде находится в пределах от 0,01 до 10 изр/мл (изр: фармакологическая единица США), предпочтительно в диапазоне от 0,05 до 2 изр/мл, более предпочтительно в диапазоне от 0,3 до 1 изр/мл и более предпочтительно около 0,75 изр/мл.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Ра^атуxον^^^бае. Предпочтительно вирус является природным парамиксовирусом или рекомбинантным парамиксовирусом, выбранным из группы, включающей вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус Сендай, респираторносинцитиальный вирус (К^, КезрпаГОгу δуηсуίЬ^а1 уагиз), вирус человеческого парагриппа типов I и III, вирус чумы крупного рогатого скота, вирус собачьей чумки, вирус болезни Ньюкасла, вируса утиного парагриппа. В соответствии с предпочтительным воплощением вирус представляет собой вирус кори или рекомбинантный вирус кори. В соответствии с другим предпочтительным воплощением вирус представляет собой вирус болезни Ньюкасла (ΝΟΥ, №\усаз(1е Э|зеазе уагиз) или рекомбинантный ΝΩΥ. Примером штамма ΝΩΧ является штамм ΕαδοΙα. Когда вирусом изобретения является ΝΩΧ, способ изобретения предпочтительно содержит дополнительный этап добавления протеолитического фермента в культуральную среду в условиях, которые позволят вирусу размножаться. В соответствии с предпочтительным воплощением фермент является трипсином. Конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде составляет от примерно 0,01 мкг/мл до 10 мкг/мл. Более предпочтительно конечная концентрация трипсина в клеточной культуральной среде находится в пределах от 0,01 до 10 изр/мл (изр: фармакологическая единица США), предпочтительно в диапазоне от 0,3 до 1 изр/мл, более предпочтительно в диапазоне от 0,4 до 0,75 изр/мл. Интересно, что клеточные линии ЕВх® изобретения, которые могут расти в прикрепленном состоянии, могут использоваться для выполнения титрования вируса и предпочтительно для титрования N^V при анализе бляшкообразования. Действительно, в отличие от СЕР и куриных ΩΡ1 фибробластов, у которых невозможно наблюдать никакие цитопатологические эффекты, вирусный рост в клетках ЕВх® приводит к формированию характерных гигантских клеток. Кроме того, вирусные частицы N^V можно выявлять с помощью анализа гемагглютинации. Таким образом, изобретение также имеет отношение к применению клеток ЕВх® изобретения для титрования вирусов, таких как вирус N^V.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Шдаутбае. Предпочтительно вирус является природным альфавирусом или рекомбинантным альфавирусом, выбранным из группы, включающей вирус Синдбис, вирус леса семлики, вирус лихорадки О'Ньонг-Ньонг, вирус чикунгуньи, вирус Майяро, вирус реки Росс, вирус восточного лошадиного энцефалита, вирус западного лошадиного энцефалита, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Иегрезутбае. Предпочтительно вирус является природным вирусом болезни Марека или рекомбинантным вирусом болезни Марека. Вирус болезни Марека (ΜΩΎ, Магек ^^зеазе униз) предпочтительно выбирают среди лицензированных вакцинных штаммов Μ^V. таких как: РС126 (ΗΓΎ), 8В-1, 301 В/1, 0^988 клон С, С¥1988/С/К6, СVI988/К^зρеηз, К2/23 (Мб11/75).

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Ηеρабηаν^^^бае. Предпочтительно вирус является природным вирусом гепатита или рекомбинантным вирусом гепатита, предпочтительно выбранным среди вирусов птичьего и человеческого гепатита. Вирус птичьего гепатита предпочтительно выбирают из группы, включающей вирус утиного гепатита В (ΩΗΒΎ), вирус гепатита В цапли (ΗΗΒΎ) и вирус гепатита В белого гуся (δΟΗΒΎ).

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные ча- 18 021064 стицы и вакцины принадлежат к семейству Вппаутбае, в частности вирус инфекционного бурсита.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Р1ау1ушбае, в частности вирус лихорадки денге, вирус японского энцефалита и вирус Западного Нила.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Сотоиаутбае, в частности вирус инфекционного бронхита.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Сшсоутбае, в частности вирус куриной анемии.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству РеРоутбае. Предпочтительно вирус является природным ретровирусом, выбранным среди вируса ретикулоэндотелиоза, вируса инфекционной анемии уток, вируса некроза селезенки уток, или его рекомбинантным ретровирусом.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Рагуоутбае. Предпочтительно вирус является природным парвовирусом, таким как утиный парвовирус или его рекомбинантный парвовирус.

В другом предпочтительном воплощении вирусы, родственные им вирусные векторы, вирусные частицы и вакцины принадлежат к семейству Абеиоутбае. Предпочтительно вирус является природным аденовирусом, предпочтительно выбранным среди аденовируса птиц, аденовируса гусей, аденовируса уток и аденовируса голубей, или его рекомбинантным аденовирусом. Примерами аденовируса птиц являются аденовирус птиц 1 (СЕЬО), аденовирус птиц 5 (340), аденовирус птиц 4 (КК95), аденовирус птиц 10 (СРА20), аденовирус птиц 2 (П7-А), аденовирус птиц 3 (75), аденовирус птиц 9 (А2-А), аденовирус птиц 11 (380), аденовирус птиц 6 (СК119), аденовирус птиц 7 (УК36), аденовирус птиц 8а (ТК59), аденовирус птиц 8Ь (764) и вирус синдрома снижения яйценоскости. Примерами аденовируса гусей являются аденовирус гусей 1, аденовирус гусей 2, аденовирус гусей 3. Примером аденовируса уток является аденовирус уток 2. Примером аденовируса голубей является аденовирус голубей 1.

Рекомбинантные вирусы включают вирусные векторы, содержащие гетерологичный ген, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях вспомогательную функцию (или функции) для репликации вирусов обеспечивает принимающая клета (клетка-хозяин) ЕВх®, вирус-помощник (или хелперный вирус) или плазмида-помощник (или хелперная плазмида). Представленные векторы включают такие векторы, которые инфицируют клетки птиц или млекопитающих, но не ограничиваются ими.

Данное изобретение также относится к применению клеток ЕВх® изобретения для репликации внутриклеточных бактерий, таких как хламидии, риккетсии или коксиеллы.

Клетки ЕВх® изобретения могут также быть использованы для получения рекомбинантных белков и пептидов. Изобретение также относится к способу производства рекомбинантных белков и пептидов, который включает следующие этапы: (ί) генетическая модификация клеток ЕВх® изобретения путем временной или стабильной трансфекции вектора экспрессии; (ίί) возможно выбор клеток ЕВх®, экспрессирующих указанные рекомбинантные белки или пептиды; и (ίίί) очистка указанных пептидов и белков. Пептиды и белки, продуцируемые клетками ЕВх®, также включены в данное изобретение.

Культивационный сосуд изобретения более предпочтительно выбирают среди резервуаров биореактора с непрерывным встряхиванием, биореактора \Уауе™, биореактора Ве11о™, вращающихся колб и клеточных фабрик (се11 ГасЮгу). Как правило, клетки из главного или рабочего клеточного банка постепенно проводят через Т-колбы (колбы для тканевых культур) различных размеров, вращающиеся колбы или биореактор \Уауе™ и предпочтительно заканчивают биореактором. Полученную клеточную суспензию затем обычно подают в биореактор для выращивания посевного материла (продукционный биореактор) (обычно объемом 20-30 л) для дальнейшего культивирования, а в некоторых воплощениях в больший по размеру продукционный биореактор (обычно объемом 150-180 л и больше). Отношение объема второго (большего) биореактора к продукционному биореактору зависит от степени, в которой клеточная линия размножается в первом биореакторе, но обычно составляет от 3:1 до 10:1, например в диапазоне (6-8): 1. В соответствии с предпочтительным воплощением культивационный сосуд является резервуаром биореактора с непрерывным встряхиванием, что позволяет контролировать температуру, аэрацию, рН и другие контролируемые условия, и которая оснащена соответствующим входным отверстием для введения клеток, стерильного кислорода, различных сред для культивирования и выходным отверстием для удаления клеток, сред и средства для перемешивания культуральной среды в биореакторе.

В соответствии с данным изобретением термин бессывороточная среда (8РМ, кегит-Ггее тебшт) обозначает клеточную культуральную среду, готовую к использованию, т.е. она не требует добавления животной сыворотки и позволяет клеткам выживать и расти. Эта среда не имеет строгого химического состава и может содержать гидролизаты различного происхождения, например растительные или дрожжевые. Предпочтительно указанная 8РМ определена как имеющая неживотное происхождение, т.е. она не содержит компонентов животного или человеческого происхождения (статус МСХ: без компонентов животного происхождения). В 8РМ нативные сывороточные белки заменяют рекомбинантными белка- 19 021064 ми. Альтернативно δΡΜ-среда в соответствии с изобретением не содержит белок (РР-среда: безбелковая среда, ρτοΐείη йее тейшт) и/или является химически определенной (ΟΌΜ-среда: химически определенная среда, сЬенисаПу йейпей тейшт). δΡΜ-среды демонстрируют ряд преимуществ: (ί) в первую очередь эти среды удовлетворяют нормативным требованиям (в самом деле, нет опасности контаминации случайными агентами, такими как В8Е, вирусы); (ίί) оптимизация способа очистки; (ίίί) лучшая воспроизводимость способа из-за более определенного состава среды. Примерами коммерчески доступных δΡΜ-сред являются: УР δΡΜ (1пУйтодеп, см. 11681-020, каталог 2003), Ορΐί Рго (1пУйгодеп, см. 12309019, каталог 2003), Ер1вегГ (1пУйтодеп, см. 10732-022, каталог 2003), Рго 293 δ-ΟΌΜ (СатЬгех, см. 12765Р, каталог 2003), ЬС17 (СатЬгех, см. ВЕ8Р302Р), Рго СНО 5-ί'.’ΌΜ (СатЬгех, см. 12-766Р, каталог 2003), Н\О δΡΜ4ΟΗΟ (Нус1опе, см. δΗ30515-02), Н\О δΡΜ^ΗΟ-υϋΙΐίγ (Нус1опе, см. δΗ30516.02), Н\О РР293 (Нус1опе, см. 8Н30356.02), Н\О РР Уего (Нус1опе, см. 8Н30352.02), среда Ехсе11 293 (δΑΡΌ Вювсй епсев, см. 14570-1000Μ), безбелковая среда Ехсе11 325 РР СНО (8АРС Вювшепсев, см. 14335-1000Μ), среда Ехсе11 УРРО (8АРС Вювшепсев, см. 14560-1000Μ), безбелковая среда Ехсе11 302 (8АРС ВювсК епсев. см. 14312-1000Μ), Ехсе11 65319, Ехсе11 65421, Ехсе11 65625, Ехсе11 65626, Ехсе11 65627, Ехсе11 65628, Ехсе11 65629 (1РН Вюваепсев), Ехсе11 ΜΌΟΚ δΡΜ ^АРС-Вюваепсев, см. 14581 С), Ехсе11 ΜΌΟΚ Ргой (См. М3678), среда Оепе ТНегару 3 (без компонентов животного происхождения) (δΙΟΜΑ-Α1άτκΗ, см. 0-9916 или Ехсе11 ΟΤΜ-3) (в дальнейшем называемая средой 09916), НУР ΟΌΜ4 НЕК-293 (Нус1опе, см. 8Н30859), НУО δΡΜ4 НЕК-293 (11УС1.ОУЕ. см. 8Н30521), ΑΕΜ (1пУйгодеп). В соответствии с первым предпочтительным воплощением бессывороточная среда №1 и бессывороточная среда №2 являются одной и той же средой. В соответствии со вторым предпочтительным воплощением бессывороточная среда №1 и бессывороточная среда №2 имеют различный состав.

Способ изобретения включает удаление всей или части бессывороточной среды № 1 с последующей ее заменой бессывороточной средой № 2. Однако более удобно удалять большую долю (например примерно 50%) бессывороточной среды № 1, а затем восполнять ее бессывороточной средой № 2 в то время, пока среда 1 еще удаляется, например через спинфильтр (центрифужный фильтр). В соответствии с предпочтительным воплощением бессывороточную среду № 2 непосредственно добавляют в бессывороточную среду № 1 без удаления части бессывороточной среды № 1. К 1 объему бессывороточной среды № 1 добавляют от 0,25 до 10 объемов бессывороточной среды № 2. В предпочтительном воплощении к 1 объему бессывороточной среды № 1 добавляют от 0,5 до 8 объемов бессывороточной среды № 2. В более предпочтительном воплощении к 1 объему бессывороточной среды № 1 добавляют от 3 до 6 объемов бессывороточной среды № 2.

Бессывороточная среда № 1 и/или бессывороточная среда №2 может быть дополнена по меньшей мере одним компонентом, выбранным из группы, включающей аминокислоты, липиды, жирные кислоты, холестерин, витамины, углеводы, белковые гидролизаты неживотного происхождения, а также их смеси.

Альтернативно способ репликации вируса изобретения является полунепрерывным способом с подпиткой, который включает дополнительный этап подпитки клеток по меньшей мере одним компонентом, выбранным из группы, включающей аминокислоты, липиды, витамины, углеводы, белковые гидролизаты неживотного происхождения, поверхностно-активные вещества и их смесь. В соответствии с первым предпочтительным воплощением подпитку проводят в ходе этапов от а) до й) способа изобретения репликации вируса, альтернативно только в ходе этапов от Ь) до й), или альтернативно в ходе этапа й). Питание может происходить либо на ежедневной основе, либо на постоянной основе. При прерывистом питании оно может происходить один раз в сутки, более одного раза в сутки или менее одного раза в сутки.

δΡΜ-среды изобретения содержат ряд компонентов, включая аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, источники углеводов, каждый ингредиент присутствует в количестве, которое поддерживает культивирование клеток щ νίΙΐΌ. Тем не менее, для улучшения роста клеток или производительности вируса в δΡΜ-среды добавляют дополнительные ингредиенты.

Выбор аминокислот(ы) для добавления к клеточной культуре может быть проведен путем анализа потребления аминокислот клетками в культуре; такое потребление варьирует в зависимости от вида клеток. В соответствии с предпочтительным воплощением аминокислоты, добавленные в среду, могут быть выбраны из группы, включающей аспарагин и глутамин, или их смеси. В более предпочтительном воплощении глутамин добавляют к культуре куриных клеток ЕВх и питание глутамином производится в ходе этапов от а) до й) для сохранения концентрации глутамина в среде между примерно 0,5 мМ и примерно 5 мМ, предпочтительно между примерно 1 мМ и примерно 3 мМ, и наиболее предпочтительно примерно 2 мМ. В предпочтительном воплощении питание глутамином производят на постоянной основе. Интересно, что утиные клетки ЕВх® не потребляют много глутамина, потому что утиные клетки способны синтезировать глутамин. Таким образом, глутамин может быть добавлен или не добавлен в культуру утиных клеток ЕВх.

В соответствии с предпочтительным воплощением углеводы, добавляемые в среду, выбирают из группы, включающей Ό-глюкозу, Ό-сахарозу и Ό-галактозу или их смеси. В соответствии с более предпочтительным воплощением добавленным углеводом является Ό-глюкоза. Подпитка Ό-глюкозой произ- 20 021064 водится в ходе этапов от а) до й), более предпочтительно в ходе этапов от Ь) до й) для сохранения концентрации Ό-глюкозы в среде между примерно 0,5 и 25 г/л Ό-глюкозы, предпочтительно между примерно 1 и 10 г/л Ό-глюкозы, предпочтительно примерно от 2 до 3 г/л Ό-глюкозы. В предпочтительном воплощении подпитку глюкозой производят на постоянной основе.

В соответствии с предпочтительным воплощением липиды выбирают из группы, включающей холестерин, стероиды и жирные кислоты, такие как пальмитиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоты и их производные, или их смесей. Более предпочтительно жирные кислоты получают из δIОМЛ-Α^^ΚIСН (см. Р7050) и добавляют в культуральную среду примерно 0,35 мкл/мл раствора жирных кислот.

Среда может содержать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например бикарбонат натрия, стабилизаторы окисления, стабилизаторы для противодействия механическим нагрузкам или ингибиторы протеаз. При необходимости к среде в качестве антипенного агента может быть добавлено неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как полипропиленгликоль (РЬиКОИ1С Р61, РЬиКОМС Р-68, δ^^ΕΚΟΜ^ Р-68, РРР'КОМС Р-71 или РРР'КОМС Р-108). Эти агенты, как правило, используются для защиты клеток от негативного воздействия аэрации, поскольку без добавления поверхностно-активного вещества поднимающиеся и разрывающиеся пузырьки воздуха могут привести к повреждению тех клеток, которые находятся на поверхности этих пузырьков воздуха (барботирование). Количество неионогенного поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от примерно 0,05 до примерно 10 г/л, как правило от 0,1 до 5 г/л. В соответствии с другим воплощением изобретения концентрация поверхностно-активного вещества в клеточной культуральной среде может быть изменена для адаптации (т.е. увеличения или уменьшения) размера клеточных сгустков.

В соответствии с воплощением способа репликации вируса изобретения добавление бессывороточной среды № 2 в клеточную культуру осуществляют после этапа инфицирования Ь), предпочтительно примерно через 0,5-4 ч после этапа Ь) и более предпочтительно примерно через 1 ч после этапа Ь). В соответствии с другим воплощением изобретения добавление бессывороточной среды № 2 в клеточную культуру осуществляют перед этапом инфицирования Ь), предпочтительно примерно через 0,5-4 ч после этапа Ь), и более предпочтительно примерно за 1 ч до этапа Ь). В соответствии с другим воплощением изобретения добавление бессывороточной среды № 2 в клеточную культуру осуществляют одновременно с этапом инфицирования Ь. Вирусное инфицирование этапа Ь) осуществляют при тюл. (тиШрНсйу οί 1пРес1юп, множественности заражения) примерно от 10 до 10^-8, предпочтительно примерно от 10^-1 до 10^-6, более предпочтительно примерно от 10^-2 до 10^-5 и более предпочтительно примерно 10^-4. Специалист в данной области сможет определить оптимальное значение ιη.ο.ί. в зависимости от типа вируса. На этапе с) инфицированные клетки предпочтительно культивируют в течение по меньшей мере 24 ч, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере 72 ч, по меньшей мере 96 ч, по меньшей мере 120 ч, по меньшей мере 144 ч. Когда вирус представляет собой поксвирус, инфицированные клетки культивируют по меньшей мере 144 ч.

В способе изобретения культивирование клеток этапа а) осуществляют путем полунепрерывного культивирования, полунепрерывного культивирования в отливно-приливом режиме, полунепрерывного культивирования с подпиткой или перфузионного культивирования. Более предпочтительно культивирование клеток на этапе а) осуществляют путем полунепрерывного культивирования. Инфицирование в этапе Ь) выполняют, когда плотность клеток становится по меньшей мере примерно 4 млн, предпочтительно 6 млн клеток/мл, более предпочтительно 8 млн клеток/мл при полунепрерывном культивировании или полунепрерывном культивировании с подпиткой. При использовании перфузионного способа инфицирование на этапе Ь) выполняют, когда плотность клеток становится по меньшей мере примерно 8 млн, предпочтительно примерно от 9 до 10 млн клеток/мл или даже выше.

рН бессывороточной культуральной среды на этапах а), Ь), с) и й) предпочтительно контролируется биореактором. рН должен находиться в диапазоне от 6,5 до 7,8, предпочтительно примерно от 6,8 до 7,5 и более предпочтительно примерно 7,2.

В способе изобретения этап й) длится от 1 до 10 дней до момента сбора. В соответствии с предпочтительным воплощением этап й) длится от 2 до 5 дней до момента сбора. Время сбора (этап е) определяют по плотности клеток в культивационном сосуде. Изобретателем установлено, что оптимальное время для сбора вирусов наступает через два дня после того, как плотность жизнеспособных клеток достигла своего оптимального уровня и начала снижаться из-за вирусной инфекции.

Культивирование клеток выполняют при температуре между 32 и 39°С в зависимости от типа вируса. Для продукции вируса гриппа и поксвируса инфицирование клеточной культуры выполняют предпочтительно при 33°С.

Клетки ЕВх® способны расти в суспензионной культуре с клетками, слипшимися в рыхлые агрегаты из нескольких клеток вплоть до нескольких сотен клеток. Без привязки к какой-либо теории размер сгустка может варьировать в зависимости от состава клеточной культуральной среды. Например на размер сгустка может влиять присутствие поверхностно-активного вещества, такого как полипропиленгликоль (РРР'КОМС Р-61, РРР'КОМС Р-68, δΥ^ΓΕ^^ Р-68, РРР'КОМС Р-71 или РРР'КОМС Р-108), встряхивание, концентрация двухвалентных ионов, таких как Мд²⁴ и Са²'. Изобретателем было установ- 21 021064 лено, что выход вируса можно увеличить, позволяя клеткам ЕВх® изобретения агрегировать друг с другом до формирования сгустков в ходе по меньшей мере этапа а) способа. Во время перехода из сосудов с главным и рабочим банком клеток через Т-колбы различного размера или вращающиеся колбы в биореакторы суспендированные клетки, как правило, переводят в больший сосуд либо путем разведения в свежей среде, либо путем центрифугирования, после которого клеточный осадок ресуспендируют в свежей среде. Изобретателем было обнаружено, что во время клеточных пассажей лучше оставлять большие сгустки клеток в культуре. Чтобы это сделать, лучше не разрушать клеточные сгуски в целях улучшения репликации вируса в клетках ЕВх®. Например, на начальных этапах культивирования этапа а) в Тколбах или вращающихся колбах рекомендуется разводить клеточную культуру для переноса клеток в больший сосуд(ы), и не рекомендуется ни центрифугировать ее, ни разрушать клеточные сгустки пипетированием или встряхиванием. Однако слишком большие сгустки могут быть субоптимальными для высокой вирусной продукции. Следовательно, специалист в данной области сможет определить, может ли частичное разрушение сгустков при пипетировании или встряхивании во время начальных пассажей клеток этапа а) улучшить вирусный выход. В соответствии с предпочтительным воплощением поксвирусы и предпочтительно вирусы МУА, АЬУАС и РоМрох получают в способе изобретения, включающем этап а) пролиферации сгустков ЕВх® в рыхлых агрегатах, содержащих от нескольких клеток до более чем по меньшей мере 100 клеток, по меньшей мере 200 клеток, по меньшей мере 500 клеток, по меньшей мере 1000 клеток.

Изобретателями было обнаружено, что размер сгустков клеток ЕВх®, предпочтительно сгустков утиных клеток ЕВх®, могут зависеть от концентрации ионов Мд²⁴ и/или Са²' в субстрат-независимой клеточной культуральной среде. Поскольку слишком большие сгустки могут быть субоптимальными для высокой вирусной продукции, то размер сгустков можно контролировать путем коррекции концентрации Мд²' и Са²' в клеточной культуральной среде. Для утиных клеток ЕВх® клеточная культуральная среда предпочтительно содержит Мд²' в концентрации от 0,5 мМ до 2,5 мМ, предпочтительно около 1,б мМ, и Са²' в концентрации от 0,01 мМ до 0,5 мМ, предпочтительно около 0,1 мМ.

Изобретение также относится к вирусу, полученному в способе изобретения. Данное изобретение также относится к вакцине, содержащей вирус изобретения. Способ изготовления вирусной вакцины включает способ репликации вируса в соответствии с изобретением, где этап е) сбора вируса включает по меньшей мере один этап, выбранный среди фильтрации, концентрирования, замораживания и стабилизации путем добавления стабилизирующих агентов. Сбор вируса осуществляется в соответствии с технологиями, хорошо известными специалисту в данной области. В соответствии с предпочтительным воплощением этап сбора указанного вируса включает сбор клеточного культурального супернатанта, полученного при центрифугировании клеточной культуры, затем фильтрацию, концентрирование, замораживание и стабилизацию путем добавления стабилизирующих агентов. Например, для вируса гриппа см. Ригтшдег, Ιη №с1ю1коп, АеЪЧег апй Нау (Εάκ) ТеХЪоок оГ тЛиеп/а, глава 24, стр. 324-332.

Способ производства вирусной вакцины в соответствии с изобретением может также включать дополнительный этап инактивации собранного вируса. Инактивацию предпочтительно выполняют путем обработки формальдегидом, бета-пропиолактоном, эфиром, эфиром и поверхностно-активным веществом (например таким как Твин-80™), цетилтриметил-бромидом аммония (СТАВ) и Тритоном № 102, дезоксихолатом натрия и три(Ы-бутил)фосфатом.

В соответствии с другим воплощением изобретение также относится к способу изготовления вирусных антигенных белков из вируса, полученных в способе изобретения, который включает дополнительные этапы:

a) возможно инкубации клеточного культурального супернатанта, содержащего целый вирус с ферментами рестрикции дезоксирибонуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНКазами (см. классификацию ЕС3.1.21 и ЕС3.1.22) и нуклеазами (см. классификацию ЕС3.1.30 и ЕС3.1.31). Предпочтительно ферментом, расщепляющим ДНК, является бензоназа (бензоновая нуклеаза) или ДНКаза Ι;

b) добавления катионного поверхностно-активного вещества. Примеры катионного поверхностноактивного вещества включают цетилтриметиловую соль аммония, например СТАВ, миристилтриметиловую соль аммония, липофектин, ЭОТМА и Твин™, но не ограничиваются ими;

c) выделения антигенных белков. Этот последний этап можно осуществить путем центрифугирования или ультрафильтрации.

Вирус в вакцине может находиться либо в виде интактных вирусных частиц, либо в виде дезинтегрированных вирусных частиц. В соответствии с воплощением вакцина является убитой или инактивированной вакциной. В соответствии с другим воплощением вакцина является живой ослабленной вакциной, которая главным образом состоит из супернатанта клеточной культуры ЕВх, полученного в способе изобретения, предпочтительно без сыворотки, возможно фильтрованной и/или концентрированной и содержащей указанный вирус. В соответствии с третьим воплощением вакцина содержит вирусные антигенные белки, полученные от вируса, изготовленного в соответствии с способом изобретения.

Изобретение также относится к получению вакцины, содержащей инфицированную клеточную линию ЕВх®, предпочтительно утиную или куриную еν-0 ЕВх®, полученную в способе изобретения, где

- 22 021064 инфицированная клеточную линию ЕВх®, предпочтительно утиную или куриную еу-0 ЕВх®, собирают на этапе б).

Вакцина изобретения может содержать вирус изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемыми веществами, которые усиливают иммунный ответ. Неограничивющими примерами веществ, которые повышают иммунный ответ, являются неполный адъювант Фрейнда, сапонин, кристаллогидраты алюминия, лизолецитин, полиолы плутония, полианионы, пептиды, бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) и СогупеЬас!егшт рагуит. Примером синтетического адъюванта является ЦЗ-21. Кроме того, для повышения иммунного ответа на вакцину можно использовать иммуно-стимулирующие белки (интерлейкины 1Ь1, 1Ь2, 1Ь3, 1Ь4, 1Ь12, 1Ь13, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и т.д.).

Вакцина изобретения является предпочтительно жидким составом, замороженным препаратом, дегидрированным и замороженным препаратом, возможно адаптированным к интраназальному способу введения.

Вакцина изобретения применяется в профилактике и/или терапевтическом лечении человека или животного, инфицированного вирусом из перечисленных выше. Предпочтительно вирусная вакцина изобретения применяется для профилактики и/или терапевтического лечения человека, инфицированного вирусом, выбранным среди вирусов оспы, гриппа, кори, эпидемического паротита, краснухи, КЗУ. Альтернативно вакцину изобретения предпочтительно используют для профилактики и/или терапевтического лечения животного, инфицированного вирусом, выбранным среди вируса гриппа, вируса болезни Ньюкасла, вируса синдрома снижения яйценоскости, вируса инфекционного бурсита, вируса инфекционного бронхита, вируса собачьей чумки, вируса куриной анемии. Рекомбинантная вирусная вакцина изобретения может также использоваться для профилактики и/или терапевтического лечения хронических заболеваний, таких как рак, и инфекционных заболеваний, таких как СПИД.

Клеточные линии ЕВх® изобретения используют для создания и производства химерного вируса (ге-аккойеб уник). Вирус с сегментированным геномом, например вирус гриппа, может быть изменен. При одновременном инфицировании клеток ЕВх® изобретения по меньшей мере двумя различными штаммами вируса гриппа, смесь сегментированного генома из двух разных штаммов находится в одной принимающей клетке (клетке-хозяине). В ходе вирусной сборки теоретически могут быть получены все комбинации геномных сегментов. Таким образом конкретные химерные вирусы можно выделить путем отбора или элиминирования вируса с желаемыми признаками, например с помощью антител. Клеточные линии ЕВх®. изобретения также используют для создания и производства вируса гриппа с помощью обратной генетики (см. Епапи. Ргос. Ыа!1. Асаб. Зск ИЗА, 87:3802-3805 (1990); Епат1 е! Ра1еке, I. Уио1. 65:2511-2513 (1991); Ьиу1)ек, Се11 59:1107-1113 (1989)).

Данное изобретение также относится к применению клеточных линий ЕВх® изобретения в качестве клеточного субстрата для выполнения титрования вируса. Клетки ЕВх® будут эффективны в замене существующей клеточной системы, такой как оплодотворенное яйцо, СЕР, клетки ЭР1 и т.д., используемой для определения титра вирусного раствора. Предпочтительно титрование вируса осуществляется способом ТСШ50 (Кееб Ь, МиепсИ Н, 1938. А кипр1е те!Иоб оР екйтайпд ППу регсеп! епброш!к. Ат. 1. Нуд. 27, 493-97).

Данное изобретение относится также к применению клеточных линий ЕВх® изобретения в качестве клеточного субстрата для выполнения санитарного тестирования.

Изобретение также относится к диагностическому составу, содержащему вирусы изобретения или его составные части.

Приведенные ниже примеры объясняют изобретение более подробно. Следующие препараты и примеры даны специалистам в данной области для более четкого понимания и практического применения данного изобретения. Данное изобретение, однако, не ограничено рамками приведенных в пример воплощений, которые предназначены для иллюстрирования только отдельных аспектов изобретения, и способы, которые являются функционально эквивалентными, входят в рамки изобретения. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые описаны в данном документе, будут очевидны специалистам в данной области, исходя из вышеизложенного описания и сопутствующих иллюстраций. Предполагается, что такие модификации подпадают под сферу действия приложенной формулы изобретения. В оставшейся части описания будут даны ссылки на легенды к иллюстрациям ниже.

Графические материалы

Фиг. 1: Субстрат-независимые куриные ЕВх-клетки

Фиг. 1А: Субстрат-независимые куриные клетки Уа1о ЕВу13 в бессывороточной среде. Клетки ЕВу13 инкубировали при 37°С в суспензионной бессывороточной среде Ехсе11 65319 (ЗАРС). Клетки ЕВу13 имели однородные размеры и росли в рыхлых сгустках в культуре. Время удвоения популяции составляло около 16-18 ч, а плотность клеток, достигаемая в перемешиваемых сосудах, составляла около 4-5 млн клеток/мл.

Фиг. 1В: Субстрат-независимые куриные клетки ЕВ линии 0 в бессывороточной среде. Клетки ЕВ

- 23 021064 линии 0 инкубировали при 39°С в суспензионной бессывороточной среде Ехсе11 66444 (8АРС). Клетки ЕВ линии 0 имели однородные размеры и росли в рыхлых сгустках.

Фиг. 2: Куриные клетки Уа1о ΕΒν13 экспрессируют высокий уровень теломеразы

Клетки ΕΒν13 при пассаже р193 экспрессировали высокий уровень теломеразы того же порядка значений, что и куриные клетки ЕВ14-О74 (см. АО03/076601) при пассаже р164 (главный банк клеток: МСВ) или при пассаже р184 (рабочий банк клеток: АСВ). Мышиные эмбриональные стволовые клетки (шЕ8) использовали в качестве положительного контроля, а мышиные фибробласты (ΡΕΌ) использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг. 3А и 3В: Восприимчивость куриных Уа1о ΕΒν13 к поксвирусу

ΕΒν13 (пассаж 188) сеяли с плотностью 0,4х10⁶ клеток/мл в колбы Р175 объемом 100 мл или в 40 мл среды 8РМ Εxсе11 Мебшш 65319, или в 09916 8РМ Мебшш (8АРС), дополненную 4 мМ глутамином. Клеточный рост и инфицирование МУА-0РР (МО1 10^-2 ТСШ50/клетка) проводили при 37°С. Через час после инфицирования добавляли 60 мл свежей среды.

Фиг. 3А: кинетика клеточной плотности в среде 8РМ Εxсе11 Мебшш 65319 или 09916 8РМ Мебшш (8АРС).

Фиг. 3В: МУА-производительность, выраженная в ТС1Э50/мл, в среде 8РМ Εxсе11 Мебшш 65319 или 09916 8РМ МеФит (8АРС).

Фиг. 4: Анализ трансмиссионной электронной микроскопии утиных ЕВх-клеток

Анализ трансмиссионной электронной микроскопии άΕΒχ-клеток был проведен доктором А КАоше (Лион, Франция). Утиные ЕВх-клетки имели типичную морфологию эмбриональных стволовых клеток (т.е. высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение), которые схожи с фенотипом мышиных эмбриональных стволовых клеток и клеток У1УАЫ8 ΕΒ14, описанных в АО 2006/108846. Утиные ЕВх-клетки представляют собой небольшие круглые клетки с большим ядром и ядрышком, с короткими псевдоподиями, вытягивающимися из плазматической мембраны. Они обладают высокой метаболической активностью и цитоплазмой, богатой рибосомами и митохондриями.

Фиг. 5а и 5Ь: Экспрессия теломеразы в утиных клеточных линиях ЕВх

Экспрессию теломеразы на различных этапах создания утиных клеток ЕВх исследовали с помощью набора для обнаружения теломеразы от КосНе (Те1отега§е ОСК ΕΡΙ8Λ).

Фиг. 5А: Теломераза высоко экспрессирована в различных прикрепленных линиях утиных ЕВхклеточных линиях, как в куриных клетках ΕΒν13. Утиные эпителиальные клетки, используемые в качестве отрицательного контроля, не экспрессируют теломеразу.

Фиг. 5В: В способе создания суспендированных утиных ЕВх-клеток сохраняется высокий уровень экспрессии теломеразы. Высокий уровень теломеразы исследовали в утиных ЕВх-клетках в способе удаления фидера (с фидерными клетками или без них), в способе адаптации утиных клеток ЕВ26 к суспензии и после удаления сыворотки из 6ΕΒ24 и 6ΕΒ26.

Утиные ЕВх-клетки, такие как ЕВ24 и ЕВ26, экспрессируют высокий уровень теломеразы, как куриные клетки ЕВ14. Утиные клетки ЕВ66 также экспрессируют высокий уровень теломеразы (данные не представлены).

Фиг. 6А и 6В: Утиные клетки ЕВх® не проявляют эндогенной обратнотранскриптазной активности

Фиг. 6А: Экспрессию эндогенной обратной транскриптазы исследовали путем прямого Р-ΡΕΚΤ анализа (ЕоуаИ е1 а1., 1999, I. Уио1. МеФойк, 82:185-200) в С1еап Се11§ (Франция). Утиные клеточные линии ЕВх®, ЕВ26 и ЕВ5-1 не проявляли эндогенной обратнотранскриптазной (КТ) активности. Высокий уровень активности КТ-активности был выявлен в куриных клеточных культурах ЕВ14 и ΕΒν13 (в различных пассажах), а также, в меньшей степени, в куриных эмбриональных фибробластах (СΕР), полученных от породы кур, свободных от специфического патогена (8РР). СЕМ-клетки, которые являются КТаза-негативными, использовали в качестве отрицательного контроля для определения предела обнаружения анализа.

Фиг. 6В: Наличие эндогенных ретровирусных частиц, репликативных (т.е. способных к репликации) или не репликативных, в клеточном культуральном супернатанте утиных и куриных ЕВх-клеток исследовали с помощью анализа ИФА, выявляющего основной капсидный антиген Р27 вируса птичьего лейкоза. Утиные клеточные линии ЕВх, ЕВ26 и ЕВ5-1, а также куриные ΕΒν13 не секретируют антиген АЬУ Р27. Напротив, куриные клетки ЕВ 14 экспрессируют антиген АЬУ Р27.

Фиг. 7А и 7В: Утиные ЕВх-клетки не секретируют репликативный вирус птичьего лейкоза (АЬУ)

Анализ совместного культивирования утиных ЕВх-клеток с перепелиной клеточной линией 0Т6, которая, как известно, чувствительна к эндогенным и экзогенным АЬУ, выполняли в Β^ινΕί-ιικ^ (Великобритания) для выявления присутствия эндогенных репликативных утиных вирусов.

Фиг. 7А: описывает принцип совместного культивирования 0Т6.

Фиг. 7В: Наличие репликативного вируса выявляют с помощью анализа ИФА, обнаруживающего основной капсидный антиген Р27 вируса птичьего лейкоза.

Анализ показывает, что никакие из тестируемых утиных клеток ЕВх® (6ΕΒ26 и 6ΕΒ51) не серетируют репликативный АЬУ. В качестве положительного контроля использовали вирус КАУ-1, который,

- 24 021064 как известно, реплицируется в СТ6.

Фиг 8. Экспрессия рецепторов клеточной поверхности 8Аа2-3 и 8Аа2-6 утиными ЕВх и куриными ЕВ14 клеточными линиями.

Клетки инкубировали с лектином, меченым дигоксигенином: лектин 8атЬиса тдта аддйитт специфически связывается с 81а2-6Са1. в то время как лектин Мааскта атигеи818 адд1и1тти специфически связывается с 81а2-3Са1. Лектины, которые прикрепляются к клеткам, выявляют с помощью антител против дигоксигенина, меченных Р1ТС в соответствии с метидиками, хорошо известными специалисту в данной области. Р1ТС-меченые клетки считают способом РАС8 (флуоресцентной сортировки клеток, йиотексеи! се11 зоПег). Молекулы 8Аа2-3 и 8Аа2-6 были описаны как рецепторы для вирусов птичьего и человеческого гриппа, соответственно. Почти все утиные ЕВх-клетки высоко экспрессировали рецепторы клеточной поверхности 8Аа2-3 и 8Аа2-6.

Фиг. 9А и 9В: Размножение вируса МУА-СРР в инфицированных утиных ЕВх-клетках

Фиг. 9А: Утиным ЕВх® давали формировать небольшие сгустки во встряхиваемых колбах Т175 во время клеточной пролиферации в клеточной ростовой среде 8РМ. Затем сгустки инфицировали вирусом МУА-СРР в дозе 10^-2 ТС1Э₅₀/клетка и смесь разбавляли средами для продукции 8РМ. В течение 6 дней периода вирусного размножения при 37°С инфицированные клетки ежедневно фотографировали в УФсвете. Пик МУА-инфекции был достигнут на 4-й день после инфицирования (ρί, ро51-1пГес11Оп). На 6 день ρί инфицированные клетки начинали умирать.

Фиг. 9В: Титрование вируса МУА-СРР, размножившегося в утиных клетках ЕВх® в 3-л биореакторе для полунепрерывного способа (слева). Полученной из ЕВх биомассе давали накопиться во время фазы пролиферации клеток в ростовой среде Ехсе11 (8АРС). На 4 день плотность клеток достигала 4 млн клеток/мл. Затем клетки инфицировали вирусом МУА-СРР в дозе 10^-1 ТСГО₅₀/клетка и смесь разводили в 1,5 л среды Ехсе11. В течение 6 дней периода вирусного размножения при 37°С ежедневно брали пробы на день и в конце проводили титрование ТСГО₅₀ (справа). На 4 день ρ.ί. был достигнут выход 8,5 1од ТСГО50/мл, соответствующий выходу 205 ТСГО₅₀/клетка.

Фиг. 10: Влияние концентрации кальция и магния в среде 8РМ на размер сгустков клеток ЕВх®

Фиг. 10А: Куриные клетки ΕΒν13 вначале культивировали в среде 8РМ от 8АРС Вюкшеисек, которая содержит высокие концентрации ионов кальция (Са²') (примерно 0,79 мМ) и магния (Мд²'); в этой среде клетки образовывали крупные агрегаты в культуре.

Через три дня после того, как клеточную культуральную среду заменяли на такую же 8РМ-среду, которая содержала более низкую концентрацию ионов Са^2' (конечная 0,03 мМ) и Мд^2' (конечная 1,6 мМ), клетки начинали формировать меньшие агрегаты.

Фиг. 10В: Утиные клетки ЕВ24, ЕВ26 и ЕВ66 вначале культивировали в среде 8РМ от 8АРС Вюкаеисек, которая содержит высокие концентрации ионов кальция (Са²') (примерно 0,79 мМ) и магния (Мд^2'); и в этой среде клетки образовывали крупные агрегаты в культуре.

Через три дня после того, как клеточную культуральную среду заменяли на такую же 8РМ-среду, которая содержала более низкую концентрацию ионов Са2^' (конечная 0,03 мМ) и Мд^2' (конечная 1,6 мМ), клетки начинали формировать меньшие агрегаты.

Фиг. 11А и 11В: Производство штаммов вируса гриппа А в утиных клетках ЕВх в 3-л биореакторах

Биомассе утиных ЕВх® давали накопиться при 37°С на этапе клеточной пролиферации в клеточной ростовой среде. Затем клетки инфицировали вирусом гриппа А/НШ1/Пекин/262/95 или А/Н3Ы2/НьюЙорк/55/2004 в дозе 10^-4 ТСГО₅₀/клетка, смесь разводили в 1,5 л среды для продукции Ехсе11, дополненной 0,75 И8Р/мл трипсина, и уменьшали температуру до 33°С. В течение 14 дней периода размножения вируса ежедневно брали образцы и сохраняли их при температуре -80°С.

Фиг. 11А: Кинетика роста утиных ЕВх-клеток, инфицированных штаммом вируса гриппа А/НШ1/Пекин/262/95

Слева: Клеточная плотность (ромб, χ 10⁶ клеток/мл) и вирусный титр в 1одТСГО50/мл.

Справа: Общее количество клеток (квадрат), жизнеспособность (черные круги, %) и концентрация гемагглютинина в мкг/мл (красные круги, %).

Вирусный выход составил 20 мкг гемагглютинина на 1 мл культурального супернатанта.

Фиг. 11В: Кинетика роста утиных ЕВх-клеток, инфицированных штаммом вируса гриппа А/Н3Ы2/Нью-Йорк/55/2004

Слева: Клеточная плотность (ромб, χ10⁶ клеток/мл)

Вирусный выход составил 30 мкг гемагглютинина на 1 мл культурального супернатанта.

Фиг. 12: Производство вируса гриппа штамма В в утиных клетках ЕВх®

Биомассе утиных ЕВх® дали накопиться при 37°С на этапе клеточной пролиферации в клеточной ростовой среде. Затем клетки инфицировали вирусом гриппа В/Жиангсу/10/2003 в дозе 10^-3ТСГО5₀/клетка, смесь разводили в 1,5 л среды для продукции Ехсе11, дополненной 0,75 И8Р/мл трипсина, и уменьшали температуру до 33°С. В течение 14 дней периода размножения вируса ежедневно брали

- 25 021064 образцы и сохраняли их при температуре -80°С.

Слева: Клеточная плотность (ромб, х10⁶ клеток/мл)

Вирусный выход составил 25 мкг гемагглютинина на 1 мл культурального супернатанта.

Фиг. 13: Анализ производительности ΝΏν и экспрессии вирусного белка в суспензии утиных клеток ЕВ66 (ΜΟΙ 10^-3, 0,75 υδΡ/мл трипсина)

Утиные и куриные клетки ЕВх чувствительны к штамму ΝΏν Ьа8о1а и реплицируют его. Титры (в ТСГО50/мл) ΝΏν, продуцированного утиными клетками ЕВ66, увеличивались с 0 до 2 дня ρί до достижения в среднем 10^6,83ТСт50/мл (фиг. 13, слева).

Анализ вестерн-блоттинг (фиг. 13, справа) показал экспрессию вирусных белков ΝΏν (ΗΝ, Ро/Р, ΝΡ и М). Состав вирусных белков вируса ΝΏν, производимого утиными клетками ЕВ66, аналогичен составу, полученному из вируса ΝΏν, производимого в куриных клетках ЕВ14. Кроме того, кинетика высвобождения вирусов, производимых в куриных и утиных ЕВх-клеткиах, схожа.

Фиг. 14: Анализ репликации рекомбинантного вируса кори в суспензии утиных клеток ЕВ66 (ΜΟΙ 10^-1 или 10^-2) в колбах для тканевых культур в бессывороточной среде

Утиные клетки ЕВ66 по меньшей мере столь же чувствительны к инфицированию вирусом кори, как и νΕΚΟ-клетки. Титры (в ТСШ50/мл) рекомбинантного вируса кори, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (СРР), производимый утиными клетками ЕВ66, достигали 10⁷ ТСШ50/мл на 6 день после инфицирования.

Фиг. 15А и 15В: Экспрессия δδΕΑ-1, ЕМА-1 и теломеразы в утиных клетках ЕВ66

Экспрессию теломеразы в различных пассажах утиных ЕВ66, культивированных во вращающихся колбах, исследовали с помощью набора для набора для обнаружения теломеразы от КосЬе (Те1отета§е ОСК ЕЬ1§А). δδΕΑ-1 и ЕМА-1 в различных пассажах утиных ЕВ66, культивированных во вращающихся колбах, исследовали путем анализа РΑСδ.

Фиг. 15А: Было обнаружено, что теломераза высоко экспрессируется в суспензионной утиной клеточной линии ЕВ66 в различных пассажах (138, 144, 147, 150, 154).

Фиг. 15В: Было обнаружено, что маркеры клеточной поверхности δδΕΑ-1 и ЕМА-1 высоко экспрессируются в суспензионной утиной клеточной линии ЕВ66 в различных пассажах (138, 144, 147, 150, 154).

Фиг. 16: Анализ кариотипа утиных клеток ЕВ66

Кариотип утиных клеток ЕВ66 проводил Рг. Ргапск, ΕΝνΕ Лион. ЕВ66 клетки являются диплоидными клетками.

Примеры

Пример 1: куриная клеточная линия ΕΒν13 от куриц δΡΡ породы Vа1о

1.1 - Сырье

Яйца

Свободная от специфического патогена (δΡΡ, δρес^Πс РаФодепе Ргее) порода, называемая Vа1о. Порода Vа1о является породой белых кур Ливорно, производимой и поставляемой ЬоЬтап из Германии. Такие δΡΡ-куриные яйца, снабженные сертификатом анализа, проверяли на: СΑV, птичьи аденовирусы (группа 1, серотипы 1-12 и группа 3), ΕΏδ, вирус птичьего энцефаломиелита, вирусы птичьего лейкоза/Κδν (в том числе серотип АБУЛ), вирус птичьего нефрита, птичьи реовирусы, вирус куриной оспы, вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного бурсита (ΙΒΏν), вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус гриппа типа А, вирус болезни Марека, микоплазмоз (Мд + Μδ), МусоЬасЮгннп ηνίит, вирус болезни Ньюкасла, вирус ретикулоэндотелиоза, δа1тоηе11а ри11огит, другие сальмонеллезные инфекции, вирус птичьего ринотрахеита (АКТ), НеторЬЬик ратадаШпатцт. Куриные яйца Уп1о подвергали только дезинфекции с деконтаминацией, чтобы избежать любого риска контаминации в связи с обращением с яйцами во время транспортировки.

Фидерные клетки

На первом этапе способа создания ΕΒν13, клетки мышиного происхождения ^ТО-клетки) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности куриных стволовых клеток. Эти фидерные клетки митотически инактивировали путем гамма-облучения (от 45 до 55 Грей) перед посевом на пластик. Эта доза облучения является сублетальной дозой, вызывающей окончательное прекращение клеточного цикла, но все же позволяющей продуцировать факторы роста и внеклеточный матрикс, необходимые для ускорения клеточного роста недифференцированных клеток.

Клеточная линия δТΟ была получена А. ВегпЛепт Институт рака в Онтарио, Торонто, Канада из непрерывной линии мышиных эмбриональных фибробластов δΙΜ (нелинейных мышей δаηάо8) и доставлена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер δТΟ: СКЬ-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили два раза в неделю, обычно в понедельник и четверг. Экспоненциально клетки делили на две части и подсчитывали. Часть клеток сеяли для сохранения жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения мы готовили клеточную суспензию с 10х10⁶

- 26 021064 клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали облучению от 45 до 55 Грей и сеяли на пластик. После посева чашки и платы, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 дней.

Среды

ОМЕМ- НатР12 (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ04-687)

Среда Орйрго (1пуйгодеп, каталоговый номер 12309)

ЕХ-СЕЬЬ™ 65195, 60947 и 65319 (8АРС, заказная среда)

Добавки

Глутамин (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ17-605Е)

Пенициллин/стрептомицин (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ17-602Е))

Заменимые аминокислоты (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ13-114Е)

Пируват натрия (СатЬгех, каталоговый номерВЕ13-115)

Витамины (СатЬгех, каталоговый номер 13-607С)

Бета-меркаптоэтанол (81дта, каталоговый номер М7522)

Буферы и фиксаторы

ΡΒ8 1Х (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ17-516Р)

Параформальдегид 4% (81дта, каталоговый номер Р6148)

КС1 5,6% (81дта, каталоговый номер Р9333)

Метанол/уксусная кислота (3/1): Метанол (Мегск, каталоговый номер К34497209

Уксусная кислота (81дта каталоговый номерА6283)

Колцемид, Кагуотах (О1Ьсо, каталоговый номер 15212-046)

Криопротективный агент

Диметилсульфоксид (ЭМ8О) (81дта, каталоговый номер Ό2650)

Факторы

Было использовано два различных рекомбинантных фактора:

рекомбинантный человеческий нейротрофический фактор (СЫТР) (Рерго1есН 1пс, каталоговый номер 450-13) рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (1ОР-1) (Рерго1есН 1пс, каталоговый номер 100-11)

Эти два фактора были произведены в бактериях Е. Сой.

Фетальная бычья сыворотка

Необлученная фетальная бычья сыворотка (ГБ8) (ДКИ, каталоговый номер 12103)

Необлученную сыворотку, используемую в программе, собирали и производили в США. В МСХ животных, используемых для сбора, проверяли и подтверждали их приемлемость для убоя. Сыворотку добавляли в среду в ходе культивирования птичьих стволовых клеток. Эту партию не подвергали облучению, чтобы избежать разрушения необходимых белков или компонентов, определенных как необходимые, для поддержания стволовых клеток в культуре.

Облученная сыворотка ЦРН, каталоговый номер 12107) Облученную партию, используемую в этой программе, также собирали в США. Эту облученную партию вносили в качестве добавки в среду ОМЕМ, используемую для культивирования клеток 8ТО или РЕО (фидерных клеток). Эти клетки как стволовые не требуют специфического качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Чтобы свести к минимуму высокую концентрацию сыворотки в среде, мы адаптировали 8ТО-клетки для роста в присутствии только 4% РВ8.

Диссоциирующие агенты:

Проназа (РосНе, каталоговый номер 165921)

Проназа является рекомбинантной протеазой фирмы РосНе ПхадпокНск, Германия, использующейся для диссоциации прикрепленных птичьих стволовых клеток.

Трипсин-ЭДТА (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ17-161Е)

Трипсин используется для диссоциации клеток 8ТО или РЕО и в последних пассажах для диссоциации птичьих клеток, адаптированных к бессывороточной среде. Этот фермент свиного происхождения производят асептично в соответствии с рекомендованными условиями сОМР (соответствующей практики производства лекарств) с помощью утвержденного способа стерильной фильтрации и тестируют в соответствии с текущим Е.Р. Сырьевой материал, облученный до сборки состава, тестируют на свином парвовирусе в строгом соответствии с 9/СРР 113.53.

Раствор для неферментной клеточной диссоциации (81дта, каталоговый номер С5914)

Этот агент диссоциации представляет собой готовый к использованию состав для осторожного отделения клеток от поверхности роста культурального сосуда. Формула не содержит белков и позволяет удалять клетки без применения ферментов. Клеточные белки сохраняются, делая возможными иммунохимические исследования, которые зависят от распознавания белков клеточной поверхности. Этот фермент используется для отсоединения клетки перед РАС8-анализом биологических маркеров, таких как ЕМА-1 (эпителиальный мембранный антиген 1) и 88ЕА1 (стадиеспецифичный эмбриональный антиген 1).

- 27 021064

1.2 - Способ создания клеточной линии ΕΒν13

Яйца вскрывали, желток отделяли от белка при вскрытии. Эмбрионы извлекали из желтка либо непосредственно, либо с помощью пипетки Пастера, либо с помощью небольшой абсорбирующей фильтровальной бумаги (бумага Ватман 3М), предварительно вырезанной в форме перфорированного кольца с помощью перфоратора. Диаметр перфорации составлял около 5 мм. Эти небольшие кольца стерилизовали сухим теплом в течение примерно 30 мин в термошкафу. Такое небольшое бумажное кольцо располагали на поверхности желтка и центрировали над эмбрионом, который, таким образом, был окружен бумажным кольцом. Эбрион затем вырезали с помощью маленьких ножниц и, целиком удаленный, помещали в чашку Петри, наполненную ΡΒδ или с физиологическим раствором. Эмбрион, извлеченный таким образом с помощью кольца и очищенный от избыточного желтка в среде и эмбрионального диска, таким образом свободный от избыточного вителлина, собирали пипеткой Пастера.

Куриные эмбрионы Уа1о помещали в пробирку, содержащую физиологическую среду (1Х ΡΒδ, Трис, глюкоза, среда и т.д.). Затем эмбрионы Уа1о механически диссоциировали и инокулировали в фидерный слой δΤΟ-клеток в полной культуральной среде при 39°С. Фидерные клетки сеяли в сосуде с плотностью примерно 2,7х10⁴ клеток/см² Полная культурная среда состоит из основной коммерческой среды ΌΜΕΜ-Нат Р12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки с 1СР1 и СЭТР в конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимых аминокислот, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, пируватом натрия в конечной концентрации 1 мМ, бета-меркаптоэтанолом в конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином в конечной концентрации 2,9 мМ, с исходной смесью антибиотиков, содержащей пенициллин в конечной концентрации 100 и/мл и стрептомицин в конечной концентрации 100 мкг/мл. Вскоре после первого пассажа клеток смесь антибиотиков уже не добавляли к среде. Выражение вскоре обычно подразумевает через первые 3-5 пассажей.

Когда птичьи клетки Εδ из куриных эмбрионов Уа1о переносили из одной культуральной чашки в другую, посев культуры в чашку проводили с плотностью примерно от 7х10⁴/см² до 8х10⁴/см² птичьих Εδ-клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно посев производили с плотностью примерно 7,3х10⁴/см² (4х10⁶ клеток/55 см² или 4х10⁶ мм клеток/100 мм чашка). Птичьи клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки этапа а), культивировали в течение нескольких пассажей в полной среде. При пассаже 15 из полной среды удаляли факторы роста 1СР1 и СЭТР. Удаление производили непосредственно в течение одного этапа при переходе от одного пассажа к другому. Эмбриональные стволовые клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки, культивировали в течение нескольких пассажей в полной среде без факторов роста 1СР1 и ΟΝΤΕ.

Затем после удаления факторов роста 1СР1 и СЭТР, удаляли фидерные клетки путем постепенного уменьшения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Практически одинаковую концентрацию фидерных клеток использовали в пассажах с 2 по 4, затем снижали концентрацию фидерных клеток в течение дополнительных 2-4 пассажей, и так далее. Сосуды первоначально засеивали с плотностью около 2,7х10⁴ фидерных клеток/см², затем около 2,2х10⁴ фидерных клеток/см², затем около

1,8х10 фидерных клеток/см , затем около 1,4х10 фидерных клеток/см , затем около 1,1х 10 фидерных 2 4 2 4 2 клеток/см , затем около 0,9х10 фидерных клеток/см , затем около 0,5х10 фидерных клеток/см . Затем засеивали сосуды с плотностью от 6,5х10⁴ птичьих клеток/см² до 7,5х10⁴ птичьих клеток/см² и без фидерных клеток. Удаление фидерных клеток начинали в районе 21 пассажа и заканчивали в районе 65 пассажа. В ходе удаления фидерных клеток куриные Уа1о Εδ-клетки сеяли в культивационный сосуд в более низкой концентрации, чем в этапе а), примерно от 4х10⁴ клеток/см² до 5х10⁴ клеток/см². Предположив, что Уа1о Εδ-клетки не были в хорошей форме после снижения концентрации фидерных клеток в сосуде, птичьи клетки культивировали в течение дополнительных пассажей с такой же концентрацией фидерных клеток, прежде чем продолжать удаление фидерных клеток.

Удаление сыворотки проводили после удаления факторов роста и фидерных клеток. В начале удаления сыворотки культуральная среда содержала основную коммерческую среду ΌΜΕΜ НатР12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, натрия пируват в конечной концентрации 1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,2 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,9 мМ. Куриные клетки Уа1о адаптировали к росту в бессывороточной среде в два этапа: сначала куриные клетки Уа1о быстро адаптировали к культуральной среде, состоящей из коммерческой бессывороточной среды ^РМ), предпочтительно ΕxсеЦ 60947 (δΑΕΌ Βωβ^ηι^) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,2 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,9 мМ. Когда была проведена эта быстрая адаптация к новой среде (от ^ΜΕΜ-НатР12 к Εxсе11 60947), был начат второй этап, состоящий из медленной адаптации к уменьшению концентрации животной сыворотки в среде δРΜ. Удаление сыворотки выполняли путем постепенного уменьшения, начиная с 10% сыворотки, затем 7,5%, затем 5%, затем 2,5%, затем 1,25%, затем 0,75% от концентрации сыворотки в культуральной клеточной среде δРΜ, до достижения в конце концов 0% сыворотки в культуральной клеточной среде δРΜ. Удаление сыворотки начинали в пассаже 103 и заканчивали в пассаже 135.

- 28 021064

В конце способа удаления сыворотки, когда оставшаяся концентрация сыворотки в среде δΓΜ составляла 0,75 или 0%, начинали адаптацию субстрат-зависимых ΕΒν13-клеток к суспензионному культивированию. Среди нескольких осуществленных попыток изолировать субстрат-независимые ΕΒν13изоляты, 62,5% попыток были успешными и позволили получить различные изоляты суспендированных клеток ΕΒν13. Один изолят клеток ΕΒν13 был выбран в соответствии со временем удвоения популяции (около 18 ч), оптимальной концентрацией клеток в культуральном сосуде (около 4 млн клеток/мл), жизнеспособностью клеток, однородностью клеточной культуры (наличием и размером клеточных сгустков) и легкостью манипулирования клетками (фиг. 1).

В конце удаления сыворотки субстрат-зависимые куриные клетки Уа1о, названные ΕΒν13, были способны расти в отсутствие факторов роста, в отсутствие фидерных клеток, в бессывороточной среде. ΕΒν13-клетки затем адаптировали к росту при 37°С путем постепенного снижения температуры культивирования клеток на 0,5°С в день.

Пример 2. Куриная клеточная линия ЕВ линии 0 от δРР-куриной породы ΕΕΒ-0

2.1 - Сырье

Яйца

Свободная от специфического патогена ^РР) куриная порода, называемая ΕΕΕ-0 (БаЧ Ьапвшд Ьше 0), была предоставлена Лабораторией птичьих заболеваний и онкологии (υδΌΑ-ΑΚδ-Μ^Α, США). Эти δРР-куриные яйца были получены от стаи, тщательно проверенной на различные патогены птиц. Протестированные заболевания включали δа1тоηе11а ри11огит, За1топе11а даШпагит, Μусоρ1а5та даШверйсит, Μусор1а5та ч/поХае, вирус птичьего лейкоза Α-Ό и 1, вирус болезни Марека, вирус ретикулоэндотелиоза, птичий аденовирус, вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного бурсита, вирус птичьего гриппа, вирус болезни Ньюкасла, вирус птичьего энцефаломиелита и птичий реовирус. Куриные яйца линии 0 подвергли только дезинфекции с деконтаминацией, чтобы избежать любого риска контаминации в связи с обращением с яйцами во время транспортировки.

Фидерные клетки

На первом этапе способа создания ЕВ линии 0 клетки мышиного происхождения (δΤΟ-клетки) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности куриных стволовых клеток. Эти фидерные клетки митотически инактивировали путем гамма-облучения (от 45 до 55 Грей) перед посевом на пластик. Эта доза облучения является сублетальной дозой, вызывающей окончательное прекращение клеточного цикла, но все же позволяющей продуцировать факторы роста и внеклеточный матрикс, необходимые для ускорения клеточного роста недифференцированных клеток.

Клеточная линия δΤΟ была получена Α. БетЧет, Институт рака в Онтарио, Торонто, Канада из мышиных эмбриональных фибробластов непрерывной линии δΙΜ (нелинейных мышей δаηйо5) и доставлена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер δΤΟ: СКВ-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили два раза в неделю, обычно в понедельник и четверг. Экспоненциально клетки делили на две части и подсчитывали. Часть клеток сеяли для сохранения жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения мы готовили клеточную суспензию с 10х10⁶клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали облучению от 45 до 55 грей и сеяли на пластик. После посева чашки и платы, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 дней.

Среды

ΌΜΕΜ- НатР12 (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ04-687)

Среда ΟΤΜ-3 ^дта, каталоговый номер О9916)

Среда ΕΧ-СЁЬЬ™ 66522, 65788 и 66444 (ЗЛТС, заказная среда)

Добавки

Пируват натрия (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ13-115)

Витамины (СатЬгех, каталоговый номер 13-607С)

Бета-меркаптоэтанол ^дта, каталоговый номер М7522)

Дрожжевой гидролизат (δΑΕί'.’, каталоговый номер 58902С)

Буферы и фиксаторы

ΡΒδ 1Χ (СатЬгех, каталоговый номер ΒΕ17-516Р)

Криопротективный агент

Диметилсульфоксид (ΌΜδΟ) ^дта, каталоговый номер Ό2650)

Факторы

Было использовано шесть различных рекомбинантных факторов:

рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (СОТР) (Рерго!есй 1пс, каталоговый номер 450-13), рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (1ОР-1) (Рерго!есй 1пс, каталого- 29 021064 вый номер 100-11), рекомбинантный человеческий интерлейкин 6 (1Ь6) (Рерго1есй 1пс, каталоговый номер 200-06), рекомбинантный человеческий растворимый рецептор интерлейкина 6 (81Ь6г) (Рерго1есй 1пс, каталоговый номер 200-06К), рекомбинантный человеческий фактор стволовых клеток (ЗСР) (Рерго1есй 1пс, каталоговый номер 300-07), рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (ЬРОР) (РергоЮсй 1пс, каталоговый номер 100-18В).

Все эти факторы, за исключением 1Ь6г, производятся в бактериях Е. сой. Растворимый 1Ь6г экспрессируется в трансфицированных НЕК293-клетках.

Фетальная бычья сыворотка

Необлученная фетальная бычья сыворотка (РВЗ) (ЗАРС, каталоговый номер 12003)

Необлученную сыворотку, используемую в программе, собирали и производили в Австралии. В МСХ животных, используемых для сбора, проверяли и подтверждали их приемлемость для убоя. Сыворотку добавляли в среду в ходе культивирования птичьих стволовых клеток. Эту партию не подвергали облучению, чтобы избежать разрушения необходимых белков или компонентов, определенных как необходимые, для поддержания стволовых клеток в культуре.

Облученная сыворотка (ЛКИ, каталоговый номер 12007)

Облученную партию, используемую в этой программе, собирали в Австралии. Эту облученную партию вводили в качестве добавки в среду ΌΜΕΜ, используемую для культивирования клеток ЗТО или ΒΒΌ (фидерных клеток). Эти клетки как стволовые не требуют специфического качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Чтобы свести к минимуму высокую концентрацию сыворотки в среде, мы адаптировали ЗТО-клетки для роста в присутствии только 4% РВЗ.

Диссоциирующие агенты

Раствор Тгур/еап (З1дта, каталоговый номер Т3449)

2.2 - Способ создания клеточной линии 0

Эмбрионы из 13 яиц куриной линии 0 собирали в соответствии с способом, описанным в примере 1.2. Затем эмбрионы линии 0 помещали в пробирку, содержащую РВЗ 1Х. Затем эмбрионы механически диссоциировали и инокулировали в фидерный слой ЗТО-клеток в полной культуральной среде при 39°С. Фидерные клетки сеяли в чашку с плотностью примерно 2,7х10⁴ клеток/см² Полная культурная среда состоит из основной коммерческой среды ΌΜΕΜ-Нат Р12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки с 1ОР1, СЭТР, ΙΙ-6, ΙΙ-6Κ, ЗСР и РОР в конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимых аминокислот, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, пируватом натрия в конечной концентрации 1 мМ, бета-меркаптоэтанолом в конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином в конечной концентрации 2,9 мМ, дрожжевым гидролизатом 1Х и исходной смесью антибиотиков, содержащей пенициллин в конечной концентрации 100 и/мл и стрептомицин в конечной концентрации 100 мкг/мл. Через 7 пассажей смесь антибиотиков уже не добавляли к среде.

Когда птичьи ΕЗ-клетки из куриных эмбрионов линии 0 переносили из одной культуральной чашки в другую, посев культуры в чашку проводили с плотностью примерно от 7х10⁴/см² до 8х0⁴/см² птичьих ΕЗ-клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно посев производили примерно 7,3х10⁴/см²(4х10⁶ клеток/55см² или 4х10⁶ мм клеток/100 мм чашка). Птичьи клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки этапа а), культивировали в течение нескольких пассажей в полной среде, дополненной 10 или 15% РВЗ. При пассаже 7 из полной среды удаляли факторы роста ЬРОР, 1Ь6, 1Ь6г и ЗСР. Удаление производили непосредственно в течение одного этапа при переходе от одного пассажа к другому. Эмбриональные стволовые клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки, культивировали в течение нескольких пассажей в полной среде без этих 4 факторов роста. При пассаже 12 из среды удаляли 2 последних фактора 1ОР1 и СЭТР и увеличивали число клеток без факторов.

Для ускорения роста клеток последовательно использовали 3 основные среды: ΌΜΕΜ Нат Р12 с 1 пассажа до 18 пассажа, Εxе11 ОΤΜ-3 с 18 пассажа до 26 пассажа и смесь Εxе11 66788 и Εxе11 66522 после 26 пассажа.

После 30 пассажа проводили удаление фидерных клеток путем постепенного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей, следующих поэтапно, как было описано ранее. На этом этапе удаления фидера некоторые клетки, способные расти в суспензии, выделяли с помощью Εχсе11 66444 в качестве ростовой среды и начинали удаление сыворотки (фиг. 1В).

Пример 3. Утиная ЕВх клеточная линия ЕВ66

3.1 -Сырье

Утиные яйца

Утиные яйца от пекинской породы ОЬ3 были получены из ОКШАИО РКВКВЗ ЗΕ^ΕСΤIОN (Ьа СогЫеге, Руасси, Франция). Родительских уток вакцинировали против Вксйепсйна сой (аутогенная вакцина Сой 01 и 02), РаЧешеПа тиЙосЫа (Бапбауах), вирус утиного гепатита (НераЮхах), ВгубреЮйп.х гйикюраЫгае (Китах), птичий метапневмовирус (№тохас), За1топе11а 1ур1йншпит и ВШепйб (аутогенная

- 30 021064 вакцина), Кгетеге11а αηΙίροδΙίΓοΓ (аутовакцина КтетегеПа), птичий метапневмовирус (инактивированный Νοόίΐίδ КТУ) и Ету8гре1о1Ьтгх гНиФораВиае (Киуах). После получения оплодотворенные яйца пекинских уток подвергали дезинфекции в растворе гипохлорида, а затем деконтаминации раствором Ееттасгба1 (ТНегто) для того, чтобы избежать любого риска контаминации грязью, приставшей к скорлупе.

Фидерные клетки

На первом этапе способа клетки мышиного происхождения (8ТО-клетки) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности утиных стволовых клеток. Эти фидерные клетки митотически инактивировали путем гамма-облучения (от 45 до 55 Грей) перед посевом на пластик. Эта доза облучения является сублетальной дозой, вызывающей окончательное прекращение клеточного цикла, но все же позволяющей продуцировать факторы роста и внеклеточный матрикс, необходимые для ускорения клеточного роста недифференцированных клеток. Клеточная линия 8ТО была получена А. Вети51еги, Институт рака в Онтарио, Торонто, Канада из непрерывной линии мышиных эмбриональных фибробластов 8ΙΜ (нелинейных мышей §аибок) и доставлена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер 8ТО: СКЬ-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили два раза в неделю. Экспоненциально клетки делили на две части и подсчитывали. Часть клеток сеяли для сохранения жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения мы готовили клеточную суспензию с 10х10⁶ клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали облучению от 45 до 55 Грей и сеяли на пластик. После посева чашки и платы, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 дней.

Среда

Среда ЕХ-СЕЬЬ™ 65788, 65319, 63066 и 66444 (8АЕС, заказная среда)

Среда СТМ-3 (8гдта, каталоговый номер 09916)

ЭМЕМ-НатР12 (СатЬтех, каталоговый номер ВЕ04-687)

ΌΜΕΜ (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ 12-614Е)

Добавки

Пенициллин/стрептомицин (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ17-602Е)

Витамины (СатЬгех, каталоговый номер 13-607С)

Бета-меркаптоэтанол (8гдта, каталоговый номер М7522)

Дрожжевой гидролизат (8АЕС, каталоговый номер 58902С)

Буферы и фиксаторы

РВ8 1Χ (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ17-516Р)

Криопротективный агент

Диметилсульфоксид (ΌΜ8Ο) (8гдта, каталоговый номер Ό2650)

Факторы

рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (СЭТЕ) (Рерго1есН 1пс, каталоговый номер 450-13);

рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (Ι0Ε-1) (Рерго1есН 1пс, каталоговый номер 100-11).

Эти два фактора производили в бактериях Е. сой.

Фетальная бычья сыворотка

Необлученная фетальная бычья сыворотка (ЕБ8) (8АГС, каталоговый номер 12003)

Облученную партию, используемую в этой программе, собирали в США. Эту облученную партию вводили в качестве добавки в среду ^ΜΕΜ, используемую для культивирования клеток 8ТО (фидерных клеток). Эти клетки как стволовые не требуют специфического качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Чтобы свести к минимуму высокую концентрацию сыворотки в среде, мы адаптировали 8ТО-клетки для роста в присутствии только 4% ЕВ8.

Диссоциирующие агенты:

Проназа (ВосНе, каталоговый номер 165 921)

Проназа является рекомбинантной протеазой фирмы ВосНе Эгадпояйск, Германия, использующейся для диссоциации прикрепленных птичьих стволовых клеток.

- 31 021064

Трипсин используется для диссоциации клеток δΤΟ и в последних пассажах для диссоциации птичьих клеток, адаптированных к бессывороточной среде. Этот фермент свиного происхождения производят асептично в соответствии с рекомендованными условиями сОМР с помощью утвержденного способа стерильной фильтрации и тестируют в соответствии с текущим Е.Р. Сырьевой материал, облученный до сборки состава, тестируют на свином парвовирусе в строгом соответствии с 9/СРК 113.53.

Раствор Тгур/еап ^дта, каталоговый номер Т3449)

Раствор Тгур/еап состоит из рекомбинантного бычьего трипсина, экспрессированного в кукурузе и произведенного δ^дта АИпсН с использованием запатентованной РгоШОепе системы экспрессии трансгенных растительных белков. Этот продукт оптимизировали для диссоциации клеток и в бессывороточной клеточной культуре, и в дополненной сывороткой прикрепеленной клеточной культуре.

Раствор для неферментной клеточной диссоциации ^дта, каталоговый номер С5914)

Этот агент диссоциации представляет собой готовый к использованию состав для осторожного отделения клеток от поверхности роста культурального сосуда. Формула не содержит белков и позволяет удалять клетки без применения ферментов. Клеточные белки сохраняются, делая возможными иммунохимические исследования, которые зависят от распознавания белков клеточной поверхности. Этот фермент используется для отсоединения клетки перед РАСδ-анализом биологических маркеров, таких как ЕМА-1 (эпителиальный мембранный антиген 1) и δδΕА1 (стадиеспецифичный эмбриональный антиген 1).

3.2 - Способ создания утиной ЕВх клеточной линии ЕВбб

Приблизительно 3б0 утиных яиц вскрыли, желток отделили от белка при вскрытии. Эмбрионы удалили из желтка С помощью небольшой абсорбирующей фильтровальной бумаги (бумага Ватман 3М), предварительно вырезанной в форме перфорированного кольца с помощью перфоратора. Диаметр перфорации составлял около 5 мм. Эти небольшие кольца стерилизовали сухим теплом в течение примерно 30 мин в термошкафу. На практике, в ходе этапа забора эмбрионов небольшое бумажное кольцо располагали на поверхности желтка и центрировали над эмбрионом, который, таким образом, был окружен бумажным кольцом. Эбрион затем вырезали с помощью маленьких ножниц и, целиком удаленный, помещали в чашку Петри, наполненную ΡΒδ. Эмбрион, извлеченный таким образом с помощью кольца и очищенный от избыточного желтка в среде и эмбрионального диска, таким образом свободный от избыточного вителлина, собирали пипеткой Пастера.

Утиные эмбрионы помещали в 50 мл пробирку, содержащую 1Х ΡΒδ. Затем утиные эмбрионы механически диссоциировали, отмывали ΡΒδ и сеяли на инактивированный слой фидерных δΤΟ-клеток в полной культуральной среде при 3913, 7,5% СО₂. Фидерные клетки сеяли в б-луночной плате или чашке с плотностью примерно 2,7х10⁴ клеток/см² Полная культурная среда состояла из бессывороточной среды □МНМ-Нат Р12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1ОР1 и СЫТР в конечной концентрации 1 нг/мл, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ, пенициллина в конечной концентрации 100 и/мл, стрептомицина в конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевого гидролизата. Вскоре после четвертого пассажа клеток смесь антибиотиков уже не добавляли к среде.

Утиные Εδ-клетки культивировали в ОМБМ-Нат Р12 среде до 4 пассажа. После пассажа 4 основную среду модифицировали и полную среду □МНМ-Нат Р12 заменяли на среду δРМ ОТМ-3 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1ОР1 и СЫТР в конечной концентрации 1 нг/мл, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ и 1Х дрожжевого гидролизата. Затем утиные Εδ-клетки культивировали в течение 14 пассажей в этой новой культуральной среде, затем на пассаже 18 производили удаление факторов роста.

1ОР1 и СЫТР одновременно удаляли из среды, таким образом с 19 пассажа по 24 пассаж культуральной средой была среда ОТМ-3 с добавлением 10% РΒδ, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бетамеркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ и 1Х дрожжевого гидролизата.

Когда утиные Εδ-клетки из эмбрионов пекинской утки переносили из одной культуральной чашки в другую, посев культуры в чашку проводили с плотностью примерно от 7х10⁴/см² до 12х10⁴/см² утиных Εδ-клеток в полной культуральной среде.

Затем после 24 пассажа, удаляли фидерные клетки путем постепенного уменьшения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Чашки первоначально засеивали с плотностью примерно 2,7х10⁴ фидерных клеток/см², затем примерно 1,8х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 25 и 31, затем примерно 1,4х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 32 и 35, затем примерно 1х 10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 3б и 41, затем примерно 0,7х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 42 и 44, и наконец с 45 пассажа сеяли только птичьи клетки без фидерных клеток. В конце удаления фидера чашки засеивали с плотностью от 9х10⁴ птичьих клеток/см² до 12,7х10⁴ птичьих кле- 32 021064 ток/см² Удаление фидерных клеток начинали на 25 пассаже и заканчивали на 45 пассаже. В ходе удаления фидерных клеток утиные Εδ-клетки сеяли в культуральные чашки в более низкой концентрации, чем на этапе а), примерно от 9 х 10⁴ клеток/см² до 12,7х 10⁴ клеток/см².

Через несколько пассажей без фидерных клеток изучали параметры роста (время удвоения популяции (ΡΌΤ) и плотность), чтобы подтвердить клеточную стабильность и выживаемость и приступить к удалению аминокислот, витаминов, бета-меркаптоэтанола, пирувата натрия и дрожжевого гидролизата. Можно считать, что клетки достаточно выживаемы, чтобы вынести такие удаления, если ΡΌΤ меньше, чем в примерно 40 ч, а плотность клеток выше, чем примерно 26х10⁴ клеток/см².

В случае развития данных утиных клеток ЕВх®, названных ЕВ66, удаление витаминов, пирувата натрия, заменимых аминокислот и бета-меркаптоэтанола начинали при пассаже 52. Все эти добавки удаляли из среды одновременно. Таким образом, между 52 пассажем и 59 пассажем культуральной средой являлась δРΜ ΗΤΜ-3, дополненная глутамином, дрожжевым гидролизатом и ΕΒδ. После короткого периода адаптации к новым условиям культивирования температуру начинали снижать. Это снижение выполняли постепенно между пассажем 60 и пассажем 67. После пассажа 67 клетки были способны расти при температуре 37°С. После пассажа 67 основную среду СТМ-3 заменяли новой основной δРΜ-средой, называемой Εxсе11 65788. Таким образом, после пассажа 67 культуральной средой являлась Εxсе11 65788 с добавлением 10% РΒδ, 2,5 мМ глутамина и 1Х дрожжевого гидролизата. При 80 пассаже 4х10⁶ клеток переносили в чашку с ультранизкой прикрепляющей способностью (иЬА), находящуюся в состоянии постоянного перемешивания для инициирования роста субстрат-независимых клеток. Для улучшения роста в суспензии основную среду модифицировали и снижали процент сыворотки с 10% до 5% для посева в чашку ИЬА. Таким образом, с пассажа 80 до пассажа 85 культуральной средой являлась δРΜ СТМ-3 с добавлением 5% РΒδ, 2,5 мМ глутамина и 1Х дрожжевого гидролизата. Медленное снижение ΕΒδ начинали в клеточной суспензии ЕВ66 после пассажа 85. Удаление сыворотки выполняли путем постепенного снижения концентрации, начиная с 2,5% сыворотки, затем 1,5% от концентрации сыворотки в клеточной культуральной среде, достигая наконец 0% сыворотки в клеточной культуральной среде δРΜ. Удаление сыворотки начинали в пассаже 86 и заканчивали в пассаже 94. В конце удаления сыворотки субстрат-независимые бΕΒ66-клетки были способны расти при температуре 37°С в отсутствие фактора роста, в отсутствие фидерных клеток в бессывороточной среде.

После получения утиных клеток ЕВ66, которые способны расти при 37°С в δРΜ ΗΤΜ-3, дополненной 2,5 мМ глутамином, проводили некоторые дальнейшие адаптации к средам δРΜ путем разведения или постепенной адаптации к новым составам δΕΜ, таким как Εxсе11 63066, Εxсе11 66444, Εxсе11 СНО АСР.

Субклонирование суспензии утиных клеток ЕВ66 также может быть реализовано в присутствии или отсутствие дрожжевого гидролизата.

Пример 4. Утиная ЕВх клеточная линия ЕВ26

4.1 - Сырье

Утиные яйца, фидерные клетки, добавки, буферы и фиксаторы, криопротективные агенты, фетальная бычья сыворотка и диссоциирующие агенты (такие же, как в примере 3).

Использовали утиные яйца от пекинских пород СЬ30.

Среда

Среда ΕΧ-ί'ΈΕΕ 65319, 63066 и 66444 ^АРС, заказная среда)

Среда СТМ-3 ^дта, каталоговый номер С9916)

ΌΜΕΜ (СатЬгех, каталоговый номер ΒΕ 12-614Р)

Факторы

рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (ССТР) (Рерго!есЬ 1пс, каталоговый номер 450-13), рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (1СР-1) (Рерго!есЬ 1пс, каталоговый номер 100-11), рекомбинантный человеческий интерлейкин 6 (ΙΌ6) (Рерго!есЬ 1пс, каталоговый номер 200-06), рекомбинантный человеческий растворимый рецептор интерлейкина 6 (81Ь6г) (Рерго!есЬ 1пс, каталоговый номер 200-06К), рекомбинантный человеческий фактор стволовых клеток ^СР) (Рерго!есЬ 1пс, каталоговый номер 300-07), рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (ЬРСР) (Рерго!есН 1пс, каталоговый номер 100-18В).

4.2 - Способ создания утиной ЕВх клеточной линии ЕВ26

Утиные эмбрионы собирали, как было описано ранее для ЕВ66. Утиные эмбрионы помещали в 50 мл пробирки, содержащие 1Х ΡΒδ. Затем утиные эмбрионы механически диссоциировали, отмывали

- 33 021064

РВ8 и сеяли на инактивированный слой фидерных 8ТО-клеток в полной культуральной среде при 39°С, 7,5% СО₂. Фидерные клетки сеяли в 6-луночные платы или чашки с плотностью примерно 2,7х10⁴ клеток/см² Полная культурная среда состояла из бессывороточной среды 0ТМ-3 с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, Ι0Ρ1, СЫТР, ΙΙ-6, ΙΙ-6Κ, 8СР и Р0Р в конечной концентрации 1 нг/мл, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ, пенициллина в конечной концентрации 100 и/мл, стрептомицина в конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевого гидролизата. Вскоре после первого пассажа клеток смесь антибиотиков уже не добавляли к среде. Выражение вскоре обычно подразумевает через первые 3-9 пассажей. Утиные Е8-клетки культивировали в полной среде до пассажа 9. После пассажа 9 из полной среды частично удаляли факторы. Таким образом, между пассажами 10 и 13 из среды удаляли 8СР, ΙΡ6, ΙΡ6γ и ЬР0Р и только рекомбинантные Ι0Ρ1 и СЫТР сохраняли в концентрации 1 нг/мл. Одновременное уменьшение концентрации Ι0Ρ1 и СЫТР проводили во вторую очередь между пассажами 13 и 16, чтобы в итоге на 17 пассаже получить клетки, способные к росту без рекомбинантных факторов. Удаление факторов проводили путем постепенной адаптации к более низким концентрациям факторов. Когда утиные Е8-клетки из эмбрионов пекинской утки переносили из одной культуральной чашки в другую, посев культуры в чашку проводили с плотностью примерно от 7х10⁴/см² до 12х10⁴/см² утиных Е8-клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно посев производили примерно с плотностью 7,3х10⁴/см²(4 х10⁶ клеток/55 см² или 4х10⁶ мм клеток/100 мм чашка). После удаления рекомбинантных факторов проводили уменьшение дрожжевого гидролизата при пассаже 23 до достижения конечной концентрации 0,5Х. Затем, после пассажа 31, проводили удаление фидерных клеток путем постепенного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Чашки первоначально засеивали с плотностью примерно 2,7х10⁴ фидерных клеток/см², затем примерно 1,8х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 32 и 38, затем примерно 1,4х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 39 и 44, затем примерно 1х 10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 45 и 47, затем примерно 0,7х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 48 и 50, и, наконец, с 51 пассажа сеяли только птичьи клетки без фидерных клеток. В конце удаления фидера чашки засеивали с плотностью от 9х10⁴ птичьих клеток/см² до 12,7х10⁴ птичьих клеток/см². Удаление фидерных клеток начинали на 32 пассаже и заканчивали на 51 пассаже. В ходе удаления фидерных клеток утиные Е8-клетки сеяли в культуральных чашках в более высокой концентрации, чем на этапе а), примерно от 9х10⁴ клеток/см² до 12,7х10⁴ клеток/см². Через несколько пассажей без фидерных клеток изучали параметры роста (время удвоения популяции (РИТ) и плотность), чтобы подтвердить клеточную стабильность и выживаемость и начать клеточный рост в суспензии. Можно считать, что клетки достаточно выживаемы, чтобы вынести культивирование в суспензии, если РИТ ниже, чем примерно 40 часов, а плотность клеток выше, чем примерно 26х 10⁴ клеток/см². Кроме того, морфологически клетки должны быть округлыми, лучепреломляющими, очень маленькими, и они не должны прикрепляться к пластику очень сильно.

В случае разработки клеток ЕВ26 культивирование в суспензии начинали при пассаже 53. 7х10⁶клеток переносили в чашку с ультранизкой прикрепляющей способностью, находящуюся в состоянии постоянного перемешивания со скоростью примерно 50-70 об/мин. В течение следующих пассажей клетки сеяли в сосуды Т175 (8аг81еб, см. 831812502) в концентрации между 0,4 и 0,5х10⁶ клеток/мл. После короткого периода адаптации к новым условиям культивирования РИТ клеток уменьшалось со 160 до 40 ч. Касательно такого благоприятного развития, при пассаже 59 проводили новый ряд удалений. Так, удаляли витамины, пируват натрия, бета-меркаптоэтанол и заменимые аминокислоты. Таким образом, после пассажа 59 культуральная среда была дополнена только 5% РВ8, 0,5Х дрожжевым гидролизатом и 2,5 мМ глутамином. Удаление сыворотки проводили из клеточной суспензии, из которой уже удалили роста, фидерные клетки, витамины, заменимые аминокислоты, пируват натрия и бетамеркаптоэтанол. Удаление сыворотки выполняли путем постепенного снижения концентрации, начиная с 5% сыворотки, затем 2,5%, затем 1,5% от концентрации сыворотки в клеточной культуральной среде 8РМ, достигая наконец 0% сыворотки в клеточной культуральной 8РМ-среде. Удаление сыворотки начинали в пассаже 61 и заканчивали в пассаже 79. В конце удаления сыворотки субстрат-независимые ЕВ26-клетки были способны расти при температуре 39°С в отсутствие фактора роста, в отсутствие фидерных клеток в бессывороточной среде. Затем клетки ЕВ26 адаптировали для роста в отсутствие 0,5Х дрожжевого гидролизата при 37°С путем постпенного уменьшения температуры клеточного культивирования в пассаже 80.

После получения клеток ЕВ26, которые способны расти при 37°С в 8РМ 0ТМ-3, дополненной 2,5 мМ глутамина, делали некоторые дальнейшие адаптации путем разведения или постепенной адаптации к новым составам 8РМ, таким как Ехсе11 63066, Ехсе11 66444, Ехсе11 СНО АСР. Субклонирование суспензии ЕВ26 утиных клеток также может быть реализовано в присутствии или отсутствие дрожжевого гидролизата.

- 34 021064

Пример 5. Утиная ЕВх клеточная линия ЕВ24

5.1 - Сырье

Использовали утиные яйца от пекинских пород ОЬ30.

Среда

Среда ΕΧ-СБЬЬ 65319, 63066 и 66444 (δΑΓΌ, заказная среда)

Среда ОТМ-3 (δίβΐηη. каталоговый номер О9916)

ΌΜΕΜ Р12 (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ04-687)

ΌΜΕΜ (СатЬгех, каталоговый номер ΒΕ 12-614Р)

Факторы

рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (СИТР) (Рерго!есй 1пс., каталоговый номер 450-13), рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (ЮР-1) (Рерго!есй 1пс., каталоговый номер 100-11), рекомбинантный человеческий интерлейкин 6 (ΙΌ6) (Рерго!есй 1пс., каталоговый номер 200-06), рекомбинантный человеческий растворимый рецептор интерлейкина 6 (к1Ь6г) (Рерго!есй 1пс., каталоговый номер 200-06К), рекомбинантный человеческий фактор стволовых клеток (ЗСР) (Рерго!есй 1пс., каталоговый номер 300-07), рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (ЬРОР) (Рерго!есй 1пс., каталоговый номер 100-18Б).

Все эти факторы, за исключением 1Ь6г, производятся в бактериях Е. той. Растворимый 1Ь6г экспрессируется в трансфицированных НЕК293-клетках.

5.2 - Способ создания утиной ЕВх клеточной линии ЕВ24

Утиные эмбрионы собирали, как было описано ранее для ЕВ66. Утиные эмбрионы помещали в 50 мл пробирки, содержащие 1Х РВЗ. Затем утиные эмбрионы механически диссоциировали и сеяли на инактивированный слой фидерных δТΟ-клеток в полной культуральной среде при 39°С, 7,5% СО₂. Фидерные клетки сеяли в 6-луночные платы или чашки с плотностью примерно 2,7 х10⁴ клеток/см². Полная культурная среда состояла из бессывороточной среды ΌΜΕΜ-Нат Р12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1ОР1, СИТР, ΙΙ-6, ΙΙ-6Κ, ЗСР и РОР в конечной концентрации 1 нг/мл, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ, пенициллина в конечной концентрации 100 υ/мл, стрептомицина в конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевого гидролизата. Вскоре после первого пассажа клеток смесь антибиотиков уже не добавляли к среде. Выражение вскоре обычно подразумевает через первые 3-9 пассажей.

Утиные Εδ-клетки культивировали в полной среде ΌΜΕΜ-Нат Р12 до пассажа 7. После пассажа 7 основную среду модифицировали и полную среду ΌΜΕΜ-Нат Р12 заменяли полной средой ОТΜ-3 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1ОР1, СИТР, ΙΙ-6, ΙΙ-6Κ, ЗСР и РОР в конечной концентрации 1 нг/мл, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ, пенициллина в конечной концентрации 100 υ/мл, стрептомицина в конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевого гидролизата. Таким образом, в пассаже 11 концентрацию сыворотки уменьшали до 5%, а ЗСР, ΙΙ-6, ΙΙ-6Κ и РОР удаляли из среды. Таким образом, начиная с пассажа 5, среда состояла из 5% РВЗ, ЮР1 и СИТР в конечной концентрации 1 нг/мл, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ, пенициллина в конечной концентрации 100 υ/мл, стрептомицина в конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевого гидролизата. ЮР1 и СИТР одновременно удаляли из среды в пассаже 22. После 22 пассажа в среде ОТΜ-3 отстутствовали рекомбинантные факторы. Утиные клетки поддерживали в такой среде с 23 по 28 пассаж. Когда утиные Εδ-клетки из эмбрионов пекинской утки переносили из одной культуральной чашки в другую, посев культуры в чашку проводили с плотностью примерно от 7х10⁴/см² до 12х10⁴/см² утиных Εδ-клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно посев производили с плотностью примерно 7,3х10⁴/см² (4х10⁶ клеток/55см² или 4 х10⁶ мм клеток/100 мм чашка). Затем, после 28 пассажа, удаляли фидерные клетки путем постепенного уменьшения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Чашки первоначально засеивали с плотностью примерно 2,7 х10⁴ фидерных клеток/см², затем примерно 1,8х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 29 и 33, затем примерно 1,4х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 34 и 37, затем примерно 1х 10⁴фидерных клеток/см² между пассажами 38 и 42, затем примерно 0,7х10⁴ фидерных клеток/см² между пассажами 43 и 46, и наконец с 47 пассажа сеяли только птичьи клетки без фидерных клеток. В конце

- 35 021064 удаления фидера чашки засеивали с плотностью от 9х10⁴ птичьих клеток/см² до 12,7х10⁴ птичьих клеток/см² Удаление фидерных клеток начинали на 29 пассаже и заканчивали на 47 пассаже. В ходе удаления фидерных клеток утиные ЕЗ-клетки сеяли в культуральных чашках в более высокой концентрации, чем на этапе а), примерно от 9х10⁴ клеток/см² до 12,7х10⁴ клеток/см². Через несколько пассажей без фидерных клеток изучали параметры роста (время удвоения популяции (РОТ) и плотность), чтобы подтвердить клеточную стабильность и выживаемость и начать клеточный рост в суспензии. Можно считать, что клетки достаточно выживаемы, чтобы вынести культивирование в суспензии, если РОТ ниже, чем примерно 40 ч, а плотность клеток выше, чем примерно 26х 10⁴ клеток/см². Кроме того, морфологически клетки должны быть: округлыми, лучепреломляющими, очень маленькими, и они не должны прикрепляться к пластику очень сильно. В случае разработки клеток ЕВ24 культивирование в суспензии начинали при пассаже 48. 8х10⁶ клеток переносили в чашку с ультранизкой прикрепляющей способностью, находящуюся в состоянии постоянного перемешивания со скоростью примерно 50-70 об/мин. В течение следующих пассажей клетки сеяли в сосуды Т175 (Загк!еб, см. 831812502) в концентрации между 0,4 и 0,5х10⁶ клеток/мл. После короткого периода адаптации к новым условиям культивирования РОТ клеток уменьшалось с 248 до 128 ч и затем проводили следующий этап удаления. Так, в пассаже 52 удаляли витамины, заменимые аминокислоты, пируват натрия и бета-меркаптоэтанол. Касательно благоприятного изменения РОТ, достигшего 44 часов в пассаже 56, в пассаже 57 начинали удаление сыворотки. Таким образом, с пассажа 57 культуральная среда ОТМ-3 была дополнена только 5% РВЗ, 1Х дрожжевым гидролизатом и 2,5 мМ глутамином. Удаление сыворотки проводили в клеточной суспензии, из которой уже удалили факторы роста, фидерные клетки, витамины, заменимые аминокислоты, пируват натрия и бетамеркаптоэтанол. Удаление сыворотки выполняли путем постепенного снижения концентрации, начиная с 5% сыворотки, затем 2,5%, затем 2%, затем 1,5% от концентрации сыворотки в клеточной культуральной среде ЗРМ, достигая наконец 0% сыворотки в клеточной культуральной ЗРМ-среде. Удаление сыворотки начинали в пассаже 57 и заканчивали в пассаже 77. В ходе удаления сыворотки также проводили адаптацию к росту при 37°С. Таким образом, при пассаже 65 клетки, растущие в культуральной среде, дополненной 2,5% РВЗ, переносили в 37°С, избегая постпенного изменения температуры. В конце удаления сыворотки субстрат-независимые утиные ЕВ24-клетки были способны расти при температуре 37°С в отсутствие фактора роста, в отсутствие фидерных клеток в бессывороточной среде.

После получения утиных клеток ЕВ24, которые способны расти при 37°С в ЗРМ ОТМ-3, дополненной 2,5 мМ глутамином, делали некоторые дальнейшие адаптации путем разведения или постепенной адаптации к новым составам ЗРМ, таким как Ехсе11 63066, Ехсе11 66444, Ехсе11 СНО АСР. Проводили субклонирование суспензии утиных клеток ЕВ24, был выбран утиный субклон ЕВ24-12 из-за его хороших показателей эффективности репликации вирусов.

Пример 6. ЕВх клеточная линия мускусных уток ЗРР

6.1 - Сырье

Утиные яйца:

Утиные ЗРР-яйца от мускусных пород получали из Ье Сонуои бе Сегуе1оир (Франция). Эти утиные ЗРР-яйца были получены от стаи, тщательно проверенной на различные патогены птиц. Протестированные заболевания включали: За1топе11а даШпагит-ри11огит, Мусор1акта купоу1ае, Мусор1акта те1еадпб1к, Мусор1акта даШкерйсит, вирус болезни Марека, вирус птичьего гриппа, парамиксовирус типа 3, вирус болезни Ньюкасла, аденовирус 3 типа (ЕЭЗ). вирус болезни Гамборо, птичий реовирус, вирус ретикулоэндотелиоза, вирус птичьего энцефаломиелита, вирус инфекционного ринотрахеита и хламидиоз. Яйца мускусных уток подвергли только дезинфекции с деконтаминацией, чтобы избежать любого риска контаминации в связи с обращением с яйцами во время транспортировки.

Фидерные клетки (см. предыдущие примеры)

Среды

Среда ЕХ-СЕЬЬ™ 66444 (ЗАРС, заказная среда)

Среда ОТМ-3 (З1дта, каталоговый номер О9916)

ЭМЕМ- НатР12 (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ04-687)

Добавки

Витамины (СатЬгех, каталоговый номер 13-607С)

Бета-меркаптоэтанол (З1дта, каталоговый номер М7522)

Дрожжевой гидролизат (ЗАРС, каталоговый номер 58902С)

Буферы и фиксаторы

РВЗ 1Х (СатЬгех, каталоговый номер ВЕ17-516Р)

Криопротективный агент

Диметилсульфоксид (ЭМЗО) (З1дта, каталоговый номер Ό2650)

- 36 021064

Факторы

рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (СЫТР) (Рерго1есН 1пс, каталоговый номер 450-13);

рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (1ОР-1) (Рерго1есН 1пс, каталоговый номер 100-11).

Эти два фактора производили в бактериях Е. со1Е

Фетальная бычья сыворотка

Необлученная фетальная бычья сыворотка (ЕВ8) (8ЛГС, каталоговый номер 12003)

Облученную партию, используемую в этой программе, собирали в Австралии. Эту облученную партию вводили в качестве добавки в среду ОМЕМ, использованную для культивирования клеток 8ТО (фидерных клеток). Эти клетки как стволовые не требуют специфического качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Чтобы свести к минимуму высокую концентрацию сыворотки в среде, мы адаптировали 8ТО-клетки для роста в присутствии только 4% РВ8.

Диссоциирующие агенты:

проназа (РосНе, каталоговый номер 165921) раствор Тгур/еап (81дта, каталоговый номер Т3449)

6.2 - Способ создания ЕВх клеточной линии мускусных уток

Эмбрионы из 20 оплодотворенных 8РР-яиц от мускусных уток собирали в соотвествии с способом, описанным в примере 3. Утиные эмбрионы помещали в 50 мл пробирки, содержащие 1Х РВ8. Затем утиные эмбрионы механически диссоциировали, отмывали РВ8 и сеяли в 12-луночную плату, покрытую инактивированным слоем фидерных 8ТО-клеток. Утиные эмбриональные клетки сеяли на полную культуральную среду и переносили в 39°С, 5 % СО₂. Фидерные клетки сеяли с плотностью примерно 2,7х10⁴клеток/см². Полная культурная среда состояла из среды ЭМЕМ-Нат Р12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1ОР1, СЫТР в конечной концентрации 1 нг/мл, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бетамеркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ, пенициллина в конечной концентрации 100 и/мл, стрептомицина в конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевого гидролизата. В пассаже 2 основную среду ЭМЕМ-Нат Р12 заменяли основной средой ОТМ3. После четвертого пассажа смесь антибиотиков к среде больше не добавляли.

Утиные Е8-клетки культивировали в полной среде ОТМ-3 до пассажа 8. После пассажа 8 концентрацию 1ОР1 и СЫТР уменьшали до 0,5 нг/мл. Затем утиные Е8-клетки культивировали в течение 2 пассажей в этой новой культуральной среде, затем в пассаже 10 проводили удаление факторов роста. 1ОР1 и СЫТР из среды удаляли одновременно.

Таким образом, между пассажами 10 и 37 культуральной средой была среда ОТМ-3 с добавлением 10% РВ8, 1% заменимых аминокислот, 1% смеси витаминов из коммерческого источника, пирувата натрия в конечной концентрации 0,1 мМ, бета-меркаптоэтанола в конечной концентрации 0,5 мМ, глутамина в конечной концентрации 2,1 мМ и 1Х дрожжевого гидролизата.

Когда утиные Е8-клетки, выделенные из эмбрионов мускусной утки, переносили из одной культуральной чашки в другую, посев в культуральную среду проводили с плотностью примерно 12х10⁴/см²утиных Е8-клеток. Иногда для улучшения восстановления клеток после диссоциации можно использовать какую-либо кондиционную среду.

Затем после пассажа 37 проводили удаление фидерных клеток путем постепенного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей, идущих поэтапно друг за другом в соотвествии с описанным выше способом.

В ходе удаления фидера некоторые клетки, способные к росту в суспензии, выделяли и адаптировали к росту без добавок и своротки (фиг. 4С). Субстрат-независимые ЕВх-клетки мускусных уток экспрессировали маркеры Е8-клеток, такие как теломеразу, 88ЕА-1 и ЕМЕА-1 (данные не показаны).

Пример 7: Характеризация клеточных линий ЕВх

7.1 - Характеризация куриных клеток Уа1о ЕВу13 7.1.1 - Теломеразная активность

Обнаружение теломеразы осуществлялось путем применения анализа Те1о ТАССО Те1отега§е РСР ЕЫ8А, разработанного РосНе АррНеД 8аепсе (Протокол амплификации теломерных повторов (Те1отепс Ререа! АтрИйсайоп Рго1осо1, ТРАР) - каталоговый № 11 854 666 910) в соответствии с протоколом производителя. Анализ Те1о ТАООО Те1отега§е РСР ЕЫ8А позволяет амплифицировать продукты элонгации, опосредованной теломеразой, в сочетании с нерадиоактивной детекцией с последующим протоко- 37 021064 лом ИФА. Анализ является действительным, если значение абсорбции отрицательного контроля менее или равно 0,25 А^^ - Абэо™, и если значение абсорбции положительного контроля выше или равно 1,5 А_450нм - А_690нм при использовании в анализе клеточного эквивалента 1 χ 10³. Образцы считаются теломеразо-положительными, если разница в поглощении выше, чем 0,2 А₄5_0нм - А_690нм единицы. Использовали два контроля: отрицательным контролем являлись мышиные фибробласты (РЕО-клетки), а положительным контролем являлись РОВ§-клетки (эмбриональные стволовые клетки, полученные ^уайз из мышиных эмбрионов 129 δΎ) и куриные клетки ЕВ14-О74, ранее принятые в \УО 03/076601.

Полученные результаты приведены на фиг. 2. ЕВу1-клетки действительно экспрессировали высокий уровень теломеразы. В пассаже р193 и 195 теломеразная активность была эквивалентна одной из куриных клеток ЕВ14-074.

7.1.2 - Биологические маркеры Е§-клеток

Эмбриональные стволовые клетки характеризуются экспрессией биологических маркеров на клеточной мембране. Экспрессия ЕМА-1 (эпителиального поверхностного антигена-1) и 88ЕА-1 (стадиеспецифического эмбрионального антигена-1) на клетках ЕВу13 оценивали посредством РАС8-анализа. После 10 мин фиксации с 4% РРА (пара-формальдегидом) клеточные образцы и контроли промывали и преинкубировали со специфичными моноклональными антителами к ЕМА-1 или 88ЕА-1. Второе антитело, конъюгированное с ПТС, использовали для обнаружения клеток, экспрессирующих два выбранных биологических маркера. Пробы анализировали путем проточной цитометрии с помощью РАС8 (флуоресцентной сортировки активированных клеток) от ΓουΒοί.

РАС8-анализ проводили на мышиных фибробластных клетках (РЕО-клетках) в качестве отрицательного контроля, мышиных клетках Е§ РОВ8 в качестве положительного контроля, куриных клетках ЕВ14-074 в качестве положительного контроля клеток ЕВх и клеток ЕВу13. Как и ожидалось, РЕЭклетки не экспрессировали биологические маркеры, в то время как клетки РОВ8 и ЕВ14-О74 значительно окрашивались соответственно на 60,13% и 78,7% для ЕМА-1 и 94,45% и 95% для 88ЕА-1 (данные не показаны). Популяция куриных клеток Vа1ο ЕВу13 не окрашивалась на ЕМА-1 (2%) и очень легко окрашивалась на 88ЕА-1 (22%).

7.1.3 - Кариотип

Анализ кариотипа проводили для проверки клеточной диплоидности и птичьего происхождения ЕВу13-клеток. Клетки собирали в экспоненциальной фазе роста и в течение 2 ч обрабатывали колцемидом (0,02 мкг/мл). После отмывки и центрифугирования клетки подвергали гипотоническому шоку с КО (0,56%) в течение 20 мин. Впоследствии ЕВу13-клетки фиксировали в метаноле/уксусной кислоте (3/1) и хранили в течение ночи при -20°С. Через день метафазу капали на стекло, окрашивали раствором РайтаГимза и рассматривали под микроскопом. Наблюдали несколько серий метафаз, что подтверждало куриное происхождение ЕВу13-клеток. Не наблюдали никаких доказательств полиплоидии.

7.1.4 - Влияние состава клеточной культуральной среды на размер сгустков клеток ЕВу13

Изобретатели обнаружили, что концентрация ионов кальция и магния в бессывороточной среде, используемой для культивирования и инфицирования клеток ЕВх, влияют на размер сгустков.

На фиг. 10 показано уменьшение размеров сгустков, когда клетки ЕВу13 переносят из среды с высокой концентрацией Са²' и Мд²' в среду с низкой концентрацией.

7.2 - Характеризация утиных клеточных линий ЕВх

7.2.1 - Морфология утиных клеток ЕВх

Трансмиссионную электронную микроскопию клеток бЕВх® проводил доктор А КЕпие (Лион, Франция). Утиные клетки ЕВх® имели типичную морфологию эмбриональных стволовых клеток (т.е. высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение), которые похожи на фенотип мышиных эмбриональных стволовых клеток и клеток VIVА^Iδ ЕВ14, описанных в \УО2006/108846. Утиные клетки ЕВх® являются небольшими округлыми клетками (диаметр примерно 10 мкг) с большим ядром и ядрышком, короткими псевдоподиями, вытягивающимися из плазматической мембраны (фиг. 4). Они обладают высокой метаболической активностью и цитоплазмой, богатой рибосомами и митохондриями. Они содержат многочисленные внутриклеточные вакуоли, хорошо развитый аппарат Гольджи и шероховатый эндоплазматический ретикулум.

7.2.2 - Экспрессия теломеразы утиными клетками ЕВх®

Экспрессию теломеразы на различных этапах создания утиных клеток ЕВх® исследовали с помощью набора для обнаружения теломеразы от ΚοΟκ (ТеЦтетазе ОСК ЕЫ8А). Установлено, что теломераза высоко экспрессируется в прикрепленных утиных клетках ЕВх®, а также во время удаления фидера, в способе адаптации утиных клеток ЕВх® к суспензии и во время удаления фидера.

Фиг. 5 показывает, что утиные ЕВ24 и ЕВ26 экспрессируют высокий уровень теломеразы, как и куриные клетки ЕВ14. Утиные ЕВ66 также экспрессируют высокий уровень теломеразы в течение всех клеточных пассажей. Эта высокая теломеразная активность стабильна в клетках ЕВ66 после адаптации в различных δΕΜ (фиг. 15).

7.2.3 - Утиные клетки ЕВх® не проявляют эндогенной обратнотранскриптазной активности

Экспрессию эндогенной обратной транскриптазы исследовали путем прямого Р-РЕКТ анализа

- 38 021064 (ЬоуаП е! а1., 1999, I. У1то1. МеШоЙ8, 82:185-200) в С1еап Се118 (Франция). Утиные клеточные линии ЕВх®, ЕВ24 (данные не представлены), ЕВ24 (данные не представлены), ЕВ26 и ЕВ51, не проявляют эндогенной обратнотранскриптазной (РТ) активности (фиг. 6А). РТ-активность была обнаружена у куриных клеточных культур ЕВ14, а также, в меньшей степени, у куриных эмбриональных фибробластов, полученных от куриной породы, свободной от специфического патогена ^РР).

Присутствие эндогенных ретровирусных частиц, репликативных или нерепликативных, в клеточном культуральном супернатанте утиных и куриных клеток ЕВх® исследовали путем анализа ИФА, выявляя основной капсидный антиген Р27 вируса птичьего лейкоза (фиг. 6В). Анализ показал, что ни одна из протестированных утиных клеточных линий ЕВх® (ЕВ26, ЕВ51, ЕВ24, ЕВ24 и т.д.), как и куриная ΕΒν13, не секретирует антиген АЬУ р27 (фиг. 7В). Напротив, куриные клетки ΕΒν14 экспрессируют антиген АЬУ р27.

7.2.4 - Утиные клетки ЕВх не секретируют репликативный вирус птичьего лейкоза (АЬУ)

Анализ совместного культивирования утиных ЕВх-клеток с перепелиной клеточной линией ЦТ6, которая, как известно, чувствительна к эндогенным и экзогенным АЬУ, выполняли с целью выявления наличия эндогенных репликативных утиных вирусов. Фиг. 7А описывает принцип совместного культивирования ОТ6. Присутствие репликативного вируса обнаруживают путем анализа ИФА, выявляющего основной капсидный антиген Р27 вируса птичьего лейкоза. Анализ показывает, что никакие протестированные утиные ЕВх-клетки не секретируют репликативный (т.е. способный к репликации) АЬУ (фиг. 7В).

7.2.5 - Утиные клетки ЕВх экспрессируют рецепторы вирусов птичьего и человеческого гриппа

Обнаружение рецепторов к вирусам птичьего ^1аа2-3Са1) и человеческого ^1аа2-6Са1) гриппа на утиных ЕВх-клетках проводили путем анализа флуоресцентной сортировки клеток с помощью лектина, меченого дигоксигенином (ΒοеЬ^^ηде^):

лектин δатЬиса тдта адд1ийтп (^А) специфически связывается с δ^аα2-6Са1; лектин Мааскта атитеп818 адд1ийтп (МАА) специфически связывается с δ^аα2-3Са1.

Куриные ЕВ14 и утиные ЕВх клетки отмывали в 10 мМ ΜΕΡΕδ, 150мМ №-1С1 рН 7,5 и ресуспендировали в том же буфере в конечной концентрации 5х10⁶ Клетки инкубировали 30 мин на льду, затем еще от 15 до 30 мин в присутствии δNΑ или МАА. Обработанные лектином клетки отмывали в 10мМ ΒΕΡΕδ, 150мМ №-1С1 рН 7,5 а затем инкубировали на льду в течение от 15 до 30 мин с Р1ТС-мечеными антителами против дигоксигенина. Затем клетки промывали в 0,9% №С1 и проводили РΑСδ-анализ.

Куриные ЕВ14 и утиные ЕВх-клетки экспрессировали рецепторы клеточной поверхности, содержащие олигосахариды с остатками δ^аα2-6Са1 и δ^аα2-3Са1 (фиг. 8).

7.2.6 - Кариотип

Анализ кариотипа проводили для проверки клеточной диплоидности и птичьего происхождения утиных клеток ЕВ24 и ЕВ66. Клетки собирали в экспоненциальной фазе роста и в течение 3-6 часов обрабатывали колцемидом (0,6 мкг/мл). После отмывки и центрифугирования клетки подвергали гипотоническому шоку с КС1 (0,56%) в течение 20 мин. Впоследствии утиные клетки ЕВ24 и ЕВ66 фиксировали в метаноле/уксусной кислоте (3/1) и хранили в течение ночи при -20°С. Через день метафазу капали на стекло, окрашивали раствором Райта-Гимза и рассматривали под микроскопом.

Наблюдали несколько серий метафаз, что подтверждало утиное происхождение клеток ЕВх. Не наблюдали никаких доказательств полиплоидии. Фиг. 16 показывает диплоидный кариотип утиных клеток ЕВх66 (фиг. 16).

Репликация поксвируса в куриной клеточной линии ΕΒν13

Восприимчивость клеток ΕΒν13 к инфицированию поксвирусом исследовали с помощью модифицированного вируса осповакцины штамма Анкара (МУА), кодирующего ген СРР (зеленый флуоресцентный белок).

Использовали следующие протоколы: за три дня до инфекции 0,4х10⁶ клеток ΕΒν13 (пассаж 188)/мл сеяли во флакон Т175 на 40 мл среды δРΜ Εxсе11 65319 ^АРС), дополненной 4 мМ глутамином. Инфицирование проводили с множественностью инфицирования 10^-2 ТСГО50/клетка (сток МУА-СРР имеет 10е9,7 ТСГО/мл). Через час после инфицирования в сосуд добавляли 60 мл свежей среды. Культивирование и инфицирование проводили при 37°С, 7,5% СО2 и перемешивали при 60 об/мин. Каждый день после инфицирования собирали и замороживали аликвоту клеточной суспензии. В конце кинетики проводили оценку производительности в соответствии со способом ТСГО50. Кратко говоря, титрование инфекционных вирусов МУА-СРР проводили на клетках ЬР-1. Клетки сеяли в 96-луночные платы с плоским дном с плотностью 15х10³ клеток/лунка в среде ^ΜΕΜ (Ь^уНШакег) с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (РСδ) ^АРС) и 2 мМ Ь-глутамина (Ь^уНШакег). Двадцать четыре часа спустя клетки инфицировали десятикратно последовательно разведенными в ^ΜΕΜ образцами и инкубировали в течение одной недели при температуре 37°С, 5% СО2 в увлажненной атмосфере. Инфективность вируса измеряли путем микроскопического наблюдения распространенного цитопатического эффекта (СРЕ) и УФ-облученных инфицированных клеток. Затем титры ТСГО50 рассчитывали в соответствии с методикой Рида-Мюнха (1938, А 81тр1е тейюй оГ езйтайпд ййу регсеп! епйроиНз. Ат. I. Нуд. 27, 493- 39 021064

97). В течение всего эксперимента наблюдали за клеточной пролиферацией и жизнеспособностью. Куриные клетки Уа1о ЕВу13 представлялись весьма чувствительными к ΜУΑ-ΟΡР инфекции (фиг. 3А-3В).

Пример 8. Репликация поксвируса в утиных клеточных линиях ЕВх

Восприимчивость утиных клеток ЕВх к инфицированию поксвирусом исследовали с помощью модифицированного вируса осповакцины штамма Анкара (ΜΥΑ), кодирующего ген 0РР. Титрование вируса проводили, как было описано ранее для куриных клеток ЕВу13.

8.1 - Способ культивирования клеток

Утиные клетки ЕВх хранили в криопробирках в жидком азоте при -196°С (20х 10⁶ клеток/пробирка). Криопробирку непосредственно размораживали в предварительно нагретом до 37°С сосуде с водой. Клеточную суспензию помещали в 50 мл стерильную пробирку с 30 мл предварительно нагретой питательной среды. После центрифугирования (5 мин при 300 ± 20 д при комнатной температуре) к осадку добавляли 15 мл свежей культуральной среды и мягко гомогенизировали. Образец количественно оценивали с помощью окрашивания трипановым голубым. Для гарантии хорошей культуры количество клеток должно быть >20х 10⁶, а их жизнеспособность должна быть > 70%.

Клеточной суспензией покрывали сосуд Т75 см² и инкубировали при температуре +37°С в атмосфере 7,5% СО2 на орбитальном шейкере при 50 об/мин. Затем ежедневно добавляли свежую среду. Затем клетки пассировали для увеличения клеточной биомассы для посева в 3-л биореактор. Для инокуляции в 3-л биореактор необходимо 320х10⁶ клеток. После мягкого перемешивания брали образец для количественной оценки с помощью трипанового голубого для определения плотности клеток. 150 мл клеточной смеси готовили для того, чтобы получить клеточную концентрацию 0,4х10⁶ клеток/мл в 800 мл конечного объема культуры в биореакторе. Перед посевом клеток рН в сосуде доводили до 7,2 (потому что рН будет уменьшаться при поверхностном поступлении СО2). рО2 доводили до сатурации 50% О2 (регулятор массового расхода газа устанавливали на 100%, что соответствовало максимальному расходу разбрызгивателя до 50 мл/мин). В начале способа рН поддерживали путем подведения СО2 к поверхности, позднее его контролировали добавлением 7,5% ЫаНСО3. Поверхностную аэрацию начинали воздухом со скоростью потока 0,3 мл/мин. Количественную оценку клеток осуществляли на стандартной основе.

После 3 дней культивирования плотность клеток должна была быть выше 4-5х10⁶ клеток/мл. Если ожидаемая плотность клеток была достигнута, вирусное инфицирование проводили с ΜΟI 10^-4. Температуру сосуда устанавливали на 33°С. Штамм вируса размораживали на льду. Инфицирующую смесь готовили в 10 мл среды для продукции. После инокуляции инфицирующей смеси в биореактор в течение 1 часа выполняли адсорбцию вируса. Готовили конечную среду для продукции: в 1,5 л среды для продукции добавляли трипсин для того, чтобы получить конечную концентрацию в сосуде 0,3 υ/мл (2,3 л в целом). Затем добавляли предварительно нагретую конечную среду для продукции. Каждый день из биореактора забирали образец примерно 15 мл для выполнения количественной оценки клеток, для анализа клеточной морфологии и наблюдения СРЕ. Метаболиты, такие как глутамат, глутамин, лактат и глюкозу, анализировали в культуре с помощью программного обеспечения ВюРтоШе Вавю. В случае необходимости корректировали концентрацию метаболитов. Например, при необходимости концентрацию глутамина доводили до 2 мМ. Концентрацию глюкозы при необходимости доводили до 2 г/л.

Титрование вируса осуществляли в конце эксперимента, используя все собранные образцы.

8.2 - Результаты

8.2.1 - Кинетика клеточного роста утиных клеток ЕВх® в 3 л биореакторе полунепрерывного действия с подпиткой

Утиные клетки ЕВх® обычно культивировали в биореакторе со встряхиваемым резервуаром. Полученной из утиных клеток ЕВх® биомассе давали накопиться при 37°С в клеточной ростовой среде до тех пор, пока плотность клеток не достигала 5-6х 10⁶ клеток/мл. Затем смесь разводили примерно в 3-10 раз и изучали кинетику клеточного роста в течение 10-дневного периода. В таких условиях плотность клеток обычно достигала значения от 12 до 20 млн кл/мл примерно на 5-8 день. Таким образом, утиные клетки ЕВх® демонстрировали диапазон коэффициента деления по меньшей мере от 10 до 15 раз.

8.2.2 - Влияние состава клеточной культуральной среды на размер сгустков при инфицировании утиных клеток ЕВх вирусом ΜУΑ-ΟΡР

Изобретатели обнаружили, что концентрация ионов кальция и магния в бессывороточной среде, используемой для культивирования и инфицирования клеток ЕВх, может повлиять на размер сгустков. Наличие небольших сгустков утиных клеток ЕВх повышает инфицирование вирусом и его размножение, что приводит к высоким титрам вируса ΜУΑ (фиг. 9а).

8.2.3 - Продукция вируса ΜУΑ в 3-л биореакторе

Полученной из ЕВх биомассе давали накопиться в фазе клеточной пролиферации клеток в ростовой среде Ехсе11 66444. Клетки инфицировали вирусом ΜУΑ-ΟΡР в дозе 10^-2 ТСГО₅₀/клетка и смесь разводили в среде для продукции Ехсе11 66444. После добавления свежей среды Ехсе11 плотность клеток падала на 2 и на 4 день, плотность инфицированных клеток увеличивалась и достигала 12 млн клеток/мл. В таких условиях производительность ΜУΑ-ΟΡР являлась высокой. Так, на 4-й день после заражения титр

- 40 021064

ΜνΑ-ОРР составлял примерно 10⁸ ΤСI^50/мл (фиг. 9В). В утиных клетках ЕВх® был получен выход ΜνΑ-ОРР 205 Τί'Ι П5( >/клелк;1.

Пример 9. Продукция вируса гриппа в утиных клеточных линиях ЕВх

9.1 - Материалы и методы

9.1.1 -Анализ инфекционности вируса гриппа (ΤΟΌ50)

Титрование инфекционных вирусов гриппа проводили на клетках ΜΌί','Κ (клетках Мадин-Дарби почки собки). Кратко говоря, клетки сеяли в 96-луночные платы с плоским дном с плотностью 3х10³клеток/лунка в среде υΚΐΉΜΟΟΚ, дополненной 2,5 мМ Ь-глутамином. 24 ч спустя клетки инфицировали десятикратно последовательно разведенными в υ1ΐΗΐΜΌί'.'Ι< образцами, содержащими 6 мкг/мл трипсинаЭДТА, и инкубировали в течение одной недели при температуре 33°С, 5% СО₂ в увлажненной атмосфере. Репликацию вируса затем изучали в анализе НА (анализе с гемагглютининами) с помощью куриных эритроцитов и титры Τί'.ΊΌ50 рассчитывали в соответствии с методикой Рида-Мюнха (1938)*._*Кеей Ь, Μικικίι Н, 1938. Α чтр1е те1кой о£ евйтакпд ίίίΐν регсеп! епйротК Αт· 1. Нуд. 27, 493-97.

9.1.2 - Анализ простой радиальной иммунодиффузии (δΚΙΌ)

Концентрацию гемагглютинина в образцах, полученных из инфицированных вирусом гриппа клеток ЕВ14, определяли в соответствии с описанием \Уоой апй со11еадиев*. Кратко говоря, стеклянные пластины покрывали агарозным гелем, содержащим противогриппозную сыворотку (в концентрации, рекомендованной NIΒδС)· После установки геля в перфорированные лунки диаметром 3 мм погружали 10 мкл соответствующих разведений реферанса и образцов. Через 18-24 ч инкубации во влажной камере при комнатной температуре пластины замачивали в 0,9% Ν;·ιΟ и промывали в дистиллированной воде. Затем гель спрессовывали и высушивали. Пластины окрашивали раствором Кумасси бриллиантовым синим в течение 15 мин и отмывали краску дважды в смеси метанола и уксусной кислоты, пока не становились видны четко определенные зоны. После высыхания пластин измеряли диаметр окрашенных зон, окружающих лунки с антигеном, в двух направлениях под прямым углом. Строили кривые доза-реакция разведений антигена против поверхности и рассчитывали результаты в соответствии со стандартными методиками анализа соотношения наклонов. *\Уоой 1Μ. Ε! а1. Απ пнргоуей 51ид1е-гай1а1-1ттипой1££и51оп (ескпкще £ог Не аввау о£ тЛиеп/а каетаддкЮшп апйдеп: аррНсайоп £ог ро!епсу йеЮгттайопв о£ 1пасЛνаΐей \\'1ю1е \агив апй виЬипк уасспюв (1. Βϊθ1. δΕπιΤ, 1977, 5(3):237-47).

9.1.3 - Анализ вестерн-блоттинг белка гемагглютинина вируса гриппа δΌδΤΑΟΕ проводили в соответствии с описанием ЬаеттИ иК (1970, С1еауаде о£ в1гнс1нга1 рго1етв йигшд Не авветЬ1у о£ Не кеай о£ ЬасЮпоркаде Τ4. №-1Шге 259:680-685) в 10% полиакриламидном геле. Денатурированные белки (1% δΌδ, 70 мМ (3-меркаптоэтанол) переносили на мембрану из поливинилидендифторида (куЬопй Р, Лтегвкат) путем процедуры полусухого блоттинга (Кукве-Лпйегвеп 1 (1984) Ε1есι^оЬ1оΗид о£ ти1йр1е де1в: а в1тр1е аррагаШв \уП1юШ Ьийег 1апк £ог гарШ йапвЕег о£ рго1етв Лот ро1уасгукшийе !о шЛосе11и1ове (1 Ьюскет Ьюркув [НеШойв 10:203-209). Блоты блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре смесью, состоящей из сухого молока 5% жирности в ΤΒδΤ, дополненной 1% РСδ (δΑΕС)· Затем блоты инкубировали в течение ночи в блокирующем растворе, дополненном специфической поликлональной анти-НА овечьей сывороткой (1:500) (ΝΙΒδΟ). Блоты промывали 6 раз ΤΒδΤ и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с кгр-конъюгированными кроличьими антиовечьими поликлональными антителами 1дО (1:5000) (Коск1апй) в блокирующем растворе. После 6кратной промывки в ΤΒδΤ конъюгированные с белком комплексы окончательно выявляли с помощью хемилюминесценции (набор ΕίΈ, Лте^βкат) и пленки (НурегШт, Αте^вкат)·

9.2 - Инфицирование вирусом гриппа утиных клеток ЕВх® в 3-л биореакторе

9.2.1 - Материалы и оборудование

Материал для размораживания клеток

Сосуды Т75 см² (ЗалЯей!, каталоговый номер 831813502)

Культуральная среда (бессывороточная среда)

Ь-глутамин 200 мМ (ЬюзукШакег, каталоговый номер ВЕ17-605Е) вращающаяся мешалка ΙΚΑ Κδ260 (Р1вкег Люк^ск, каталоговый номер Р35044)

Материал для амплификации клеток

Сосуды Т75 см² (Хагв1ей1, каталоговый номер 831812502)

Культуральная среда (бессывороточная среда): Εxсе11 65319 (1КН, каталоговый номер 653191000М1687) с добавлением 2,5 мМ глутамина

Ь-глутамин 200 мМ (ЛюзукШакег, каталоговый номер ВЕ17-605Е)

Ό (+) глюкоза (45 %) ^дта, каталоговый номер О8769)

Материал для продукции

Среда для продукции (бессывороточная среда): Εxсе11 65629 (ЖН, каталоговый номер 65629) с добавлением 2,5 мМ глутамина

Ό (+) глюкоза (45%) ^дта, каталоговый номер О8769) раствор Пр/еам 1Χ ^дта, каталоговый номер Т3449)

- 41 021064

7,5% раствор бикарбоната натрия ^дта, каталоговый номер 205-633-8) штамм вируса гриппа (замороженный при -80°С)

9.2.2- Способ клеточного культивирования (такой же, как для репликации МУА - пример 7.1)

Титрование вируса, анализы гемагглютинина (НАи) и количественную оценку НА-антигена (вестерн-блоттинг, δΚΙΏ) проводят в конце эксперимента, используя все собранные образцы.

9.3 Результаты

Изобретатели продемонстрировали, что утиные клетки ЕВх являются надежным и эффективным клеточным субстратом для репликации различных штаммов А и В вируса гриппа. Продукция вируса гриппа может быть выполнена в различных сосудах, таких как колбы, вращающиеся колбы (данные не представлены) и биореакторы. Изобретатели получили репродуктивный и эффективный полунепрерывный способ с подпиткой производства вируса гриппа в 3-л и 30-л биореакторе со встряхиваемым резервуаром. В сосудах и биореакторах со штаммами А и В вируса гриппа (фиг. 11 и 12) обычно получали вирусный выход более 15 и до 50 мг/л гемагглютинина.

Пример 10: Репликация вируса болезни Ньюкасла в утиных клеточных линиях ЕВх

Восприимчивость утиных клеток ЕВх к инфицированию вирусом болезни Ньюкасла исследовали с помощью штамма ΝΏν Б^ШоБт

10.1 -Способы

Утиные клетки ЕВх выращивали в среде Εxсе11 (δΡΛί.’) в сосудах Т175 при температуре 37°С в атмосфере 7,5% СО₂ на орбитальном шейкере со скоростью 60 об/мин. В 0 день клетки сеяли с плотностью 0,4х10⁶ клеток/мл в 40 мл свежей среды. Клеточную культуру инкубировали при 37°С, 7,5% СО2 в условиях встряхивания (60 об/мин). Кинетику клеточного роста соблюдали до тех пор, пока плотность клеток не достигала концентрации от 4х10⁶ до 6х10⁶ клеток/мл (как правило, на 3-й день после посева). В этот момент клетки инокулировали с помощью штамма ΝΏν ^аδоΐа с двумя различными ΜΟΙ (10^-3 и 10^-4ТСГО50/клеток) и инкубировали еще один час при 37°С, 7,5% СО₂ в условиях встряхивания (60 об/мин). Затем клеточную культуру разводили путем добавления 60 мл свежей среды для вирусной продукции и инкубировали при температуре 37°С и 7,5% СО₂ в условиях встряхивания (60 об/мин). Кинетику клеточного роста и вирусной продукции представляли на 7 день. В качестве источника протеазы каждый день в культуральную среду добавляли рекомбинантный трипсин ^АРС); были испытаны две концентрации трипсина (0,4 и 0,75 υδΡ/мл). Ежедневно забирали аликвоты для количественной оценки клеток, титрования вируса и анализа вестерн-блоттинг.

Образцы разделяли с помощью 10% δ^δ-ΡΑСΕ и подвергали блоттингу на мембране ΡΏΥΡ (АтегкЬат) путем полусухой методики. Иммунодетекцию проводили с использованием куриной поликлональной антисыворотки против ΝΏν (1:2000, СЬат1е8 РЕег БаЬога1ог1е5), а затем кроличьей антикуриной, конъюгированной с щелочной фосфатазой (1:5000, δIСΜΑ). Связанные вторичные антитела выявляли с помощью набора для выявления путем усиленной хемилюминесценции ^СЬ-хемилюминесценции) (ΚΟΟΗΕ).

10.2 - Результаты

Утиные и куриные клетки ЕВх чувствительны к штамму ΝΏν Р4^о1а и реплицируют его. Титры (в ТСГО50/мл) ΝΏν, полученные в утиных клетках ЕВх®, увеличивались с 0 дня ко 2 дню ρ.ί., достигая в среднем 10^6,83 ТСШ50/мл (фиг. 13, слева).

Анализ вестерн-блоттинг (фиг. 13, справа) показал экспрессию вирусных белков ΝΏν (ΗΝ, Ро/Р, ΝΡ и М). Состав вирусных белков вируса ΝΏν, полученного в утиных клетках ЕВх®, аналогичен составу белков вируса ΝΏν, полученного в куриных клетках ЕВх®. Кроме того, кинетика высвобождения вируса, полученного в куриных и утиных клетках ЕВх, схожа.

Пример 11. Репликации вируса кори в утиных клетках ЕВ66

Восприимчивость утиных клеток ЕВ66 к инфицированию вирусом кори исследовали с помощью рекомбинантного вируса кори, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок.

11.1 - Способы

Клетки ЕВ66 выращивали в среде Εxсе11 в сосудах Т175 при температуре 37°С в атмосфере 7,5% СО₂ на орбитальном шейкере на скорости 60 об/мин. В день 0 клетки сеяли с плотностью 0,4х10⁶ клеток/мл в 40 мл свежей среды. Клеточную культуру инкубировали при 37°С, 7,5% СО2 в условиях встряхивания (60 об/мин). Кинетику клеточного роста соблюдали до тех пор, пока плотность клеток не достигала концентрации от 4х10⁶ до 6х10⁶ клеток/мл (как правило, на 3-й день после посева). В этот момент клетки инокулировали рекомбинантным вирусом кори с двумя различными ΜΟΙ (10^-1 и 10^-2ТСГО50/клеток) и инкубировали еще один час при 37°С, 7,5% СО₂ в условиях встряхивания (60 об/мин). Затем клеточную культуру разводили путем добавления 60 мл свежей среды для вирусной продукции и инкубировали при температуре 37°С и 7,5% СО₂ в условиях встряхивания (60 об/мин). Кинетику клеточного роста и вирусной продукции представляли на 7 день. Ежедневно забирали аликвоты для количественной оценки клеток и титрования вируса.

11.2 - Результаты

Клетки ЕВ66 чувствительны к вирусу кори и реплицируют его. В неоптимизированных условиях

- 42 021064 титры (в ТСГО50/мл) вируса кори, производимого в клетках ЕВ66, достигают в среднем 10⁷ ТСГО50/мл (фиг. 14).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения непрерывных генетически стабильных птичьих клеточных линий, полученных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (Ε8) и способных к пролиферации в основной среде в отсутствие факторов роста и фидерного слоя, характеризующийся тем, что указанные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, и где указанный способ включает следующие этапы:

a) выделение птичьего эмбриона(ов) на стадии развития примерно в период откладки яиц, где геном указанной птицы не содержит эндогенные провирусные последовательности, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

b) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых клеток (Ε8), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной инсулиновым фактором роста 1 (10Р-1) и цилиарным нейротрофическим фактором (СЫТР); животной сывороткой;

c) посев суспензии Ε8-клеток, полученной на этапе Ь), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование Ε8-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

ά) выведение 10Р-1 и СЫТР из культуральной среды и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

е) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, дающее полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, с получением непрерывных генетически стабильных птичьих клеточных линий.
2. Способ по п.1, в котором дополнительно на стадии е) концентрация животной сыворотки в культуральной среде постепенно уменьшается, с тем чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором указанные прикрепленные птичьи клеточные линии адаптированы к условиям культивирования в суспензии.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором выведение 10Р-1 и СЫТР из культуральной среды на стадии ά) производится одновременно.
5. Способ по любому из пп.1-4, где указанная птица выбрана из отряда Гусеобразные.
6. Способ по п.5, где указанная птица является уткой.
7. Способ по п.6, где указанная утка является пекинской уткой.
8. Способ по п.6, где указанная утка является мускусной уткой.
9. Способ по п.8, где яйцо указанной мускусной утки инкубируют до зрелости перед изолированием утиного эмбриона.
10. Способ по любому из пп.1-4, где указанная птица выбрана из отряда Курообразные.
11. Способ по п. 10, где указанная птица является линией домашней курицы, не содержащей полных А^У-Ε-провирусных последовательностей.
12. Непрерывная генетически стабильная птичья клеточная линия, полученная способом по пп.1-11, где клетки указанной птичьей клеточной линии обладают по меньшей мере одной из следующих характеристик:

высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением; эндогенной теломеразной активностью; диаметром примерно 10 мкм;

временем удвоения популяции примерно 30 ч или менее при 37°С;

и где указанные клетки не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц.
13. Птичья клеточная линия по п.12, где клетки указанной птичьей клеточной линии дополнительно экспрессируют один или более маркер, выбранный из группы, включающей щелочную фосфатазу, 88ΕΛ1, ЕМА-1, ΕΝ8-1.
14. Способ репликации вируса в непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линии по п.12 или 13 или полученной в способе по одному из пп.1-11, включающий следующие этапы:

a) инфицирование указанных птичьих клеток интересующим вирусом;

b) культивирование указанных инфицированных птичьих клеток с целью репликации указанного вируса;

c) сбор вируса в клеточном культуральном супернатанте и/или внутри указанных клеток.
15. Способ по п.14, в котором указанный вирус выбран из группы, включающей поксвирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, вирусы герпеса, вирусы гепатита, аденовирусы, парвовирусы, реовирусы, цирковирусы, коронавирусы, флавивирусы, тогавирусы, бирнавирусы и ретровирусы.
16. Способ по п.15, где вирус представляет собой поксвирус или рекомбинантный поксвирус, вы- 43 021064 бранный из группы, включающей вирус осповакцины штамма Анкара (МУА), вакцинный вирус ЛистераЭлстри, вакцинный вирус ЬС16т8, вакцинный вирус СУ178, вирус оспы птиц, вирус оспы канареек (т.е. АЬУАС), НУУАС, вирус оспы юнко, вирус оспы майны, вирус оспы голубя, вирус оспы попугаев, вирус оспы перепелов, вирус оспы воробьев, вирус оспы скворцов, вирус оспы индеек.
17. Способ по п.15, где вирус представляет собой парамиксовирус или рекомбинантный парамиксовирус, предпочтительно выбранный из группы, включающей вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус Сендай, респираторно-синцитиальный вирус (К8У), вирус человеческого парагриппа I и III типов, вирус чумы крупного рогатого скота, вирус собачьей чумки, вирус болезни Ньюкасла, вирус утиного парагриппа.
18. Способ по п.15, где вирус представляет собой ортомиксовирус, рекомбинантный ортомиксовирус или химерный ортомиксовирус, выбранный среди вируса человеческого гриппа, вируса птичьего гриппа, вируса свиного гриппа, вируса лошадиного гриппа, вируса кошачьего гриппа.
19. Способ по п.15, где вирус представляет собой тогавирус, предпочтительно выбранный среди вируса Синдбис, вируса леса семлики, вируса лихорадки О'Ньонг-Ньонг, вируса чикунгуньи, вируса Майяро, вируса реки Росс, вируса восточного лошадиного энцефалита, вируса западного лошадиного энцефалита, вируса венесуэльского лошадиного энцефалита или этих рекомбинантных вирусов.
20. Способ по п.15, где вирус представляет собой ретровирус, выбранный среди вируса ретикулоэндотелиоза, вируса инфекционной анемии уток, вируса некроза селезенки уток или этих рекомбинантных вирусов.
21. Способ по п.15, где вирус представляет собой парвовирус, предпочтительно утиный парвовирус или рекомбинантный парвовирус.
22. Способ по п.15, где вирус представляет собой аденовирус, предпочтительно выбранный среди аденовируса птиц, аденовируса гусей, аденовируса уток и аденовируса голубей или этих рекомбинантных аденовирусов.
23. Способ по п.15, где вирус представляет собой бирнавирус, предпочтительно вирус инфекционного бурсита.
24. Способ по п.15, где вирус представляет собой флавивирус, предпочтительно выбранный среди вируса лихорадки денге, вируса японского энцефалита и вируса Западного Нила.
25. Вирусный препарат, характеризующийся тем, что он содержит вирус, полученный способом по одному из пп.14-24, и не содержит способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц.
26. Вакцина для профилактики вирусных инфекций, содержащая вирусный препарат по п.25, при необходимости в комбинации с фармацевтически приемлемыми веществами, которые усиливают иммунный ответ.
27. Вакцина по п.26, где вирус выбирают из группы, включающей вирус, присутствующий в виде интактных вирусных частиц, и вирус, присутствующий в виде дезинтегрированных вирусных частиц.
28. Вакцина, содержащая по меньшей мере один вирусный антигенный белок, полученный из вирусного препарата по п.25, при необходимости в комбинации с фармацевтически приемлемыми веществами, которые усиливают иммунный ответ.
29. Вакцина для профилактики вирусных инфекций, содержащая птичьи клетки, полученные из птичьих клеточных линий по п.12 или 13 или полученные в способе по одному из пп.1-11 и инфицированные вирусом.
30. Способ производства рекомбинантных белков и пептидов, который включает этапы:

(a) генетической модификации непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линии по пп.12 или 13 или полученной в способе по одному из пп.1-11 путем временной или стабильной трансфекции вектора экспрессии, кодирующего указанные белки и пептиды;

(b) выбора указанной модифицированной непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линии, экспрессирующей указанные рекомбинантные белки или пептиды; и (c) очистки рекомбинантных пептидов или белков, экспрессирующихся указанной генетически модифицированной непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линией.