PT2150275E - Linhas de células estaminais derivadas de embrião de pato para a produção de vacinas virais - Google Patents

Linhas de células estaminais derivadas de embrião de pato para a produção de vacinas virais Download PDF

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PT2150275E
PT2150275E PT87364915T PT08736491T PT2150275E PT 2150275 E PT2150275 E PT 2150275E PT 87364915 T PT87364915 T PT 87364915T PT 08736491 T PT08736491 T PT 08736491T PT 2150275 E PT2150275 E PT 2150275E
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Majid Mehtali
Fabienne Guehenneux
Karine Moreau
Magali Esnault
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Description

ΡΕ2150275 DESCRIÇÃO "LINHAS DE CÉLULAS ESTAMINAIS DERIVADAS DE EMBRIÃO DE PATO PARA A PRODUÇÃO DE VACINAS VIRAIS" 0 presente invento está relacionado com o desenvolvimento de vacinas virais. Em particular, o invento esná relacionado com o campo da produção industrial de vectores virai s e vacinas, mais espç ' "F i r-< ^ cameme com o uso de linhas celulares de pato derivadas de células estaminais eiruorionárias, que não possuem retrovírus aviários endógenos, para a produção de vectores virais e vírus. 0 invento é particularmente útil para a produção industrial de vacinas virais para a prevenção de infecções virais em seres humanos e animais.
FUNDAMENTO
As vacinas reduzem e previnem eficazmente a doença e morte causadas por muitas infecções virais, tais como, por exemplo, gripe, sarampo, papeira, varíola, febre amarela.
Muitas vacinas virais são actualmente produzidas em ovos de galinha embrionados ou em fibroblastos primários embrionários de galinha isolados a partir de embriões de gadinha. No entanto, a produção de vacinas tem sido ΡΕ2150275 ocasionalmente complicada pela contaminação inadvertida com agentes adventícios que podem ter origem nos substratos de células aviárias usados para propagar as estirpes de vacinas. De facto, a actividade de transcriptase reversa (RT) , uma indicação da presença de retrovírus, foi detectada em vacinas vivas atenuadas derivadas de células de galinha, incluindo Europeus e Americanos da (Hussain et al., 2003,
Heneine, 2001, J. V i jc o sobre a origem da act encontrar am evidênci 3. G6 as produzidas pelos fabricantes febre amarela, papeira e sarampo J. Virol 77:1105-1111; Johnson e 1., 75:3605-3612). Investigações ividade de RT naquelas vacinas partículas contendo RNA de vírus da leucose aviária endógenos (ALV-E) e de vírus aviários endógenos (EAV) (Johnson e Heneine, 2001, J. Virol 75:3605-3612; Tsang et al., 1999. J. Virol 73:5843-5851; Weissmahr et al. , 1997, J. Virol 71:3005-3012). endógenos são expre provirais invólucro os quais ALV-E e EAV são membros de famílias de retrovírus presentes na linha germinativa de galinha. ALV-E ssos a partir de loci ev, os quais são elementos hereditários. Com base nas suas sequências do , ALV-E são diferenciados nos subgrupos A a D e J, dão origem a infecções adquiridas exogenamente.
Enquanto os ALVs exógeno: :ausam varií doenças neo- ;icí tais como miocardite e osteopetrose em aalinhas infectadas, desconhece-se que ALV-E seja patogénico para galinhas. A ausência de potencial oncogénico com as infecções por ALV-E pode ser atribuída à ausência de um oncogene virai e de actividade estimuladora na repetição ΡΕ2150275 terminal longa (LTR) endógena. Foram identificados mais de 20 loci ev diferentes em galinhas White Leghorn /ev-1 a ev-22) . As designações dos loci ev são atribuídas pela ordem de descoberta, os quais são fenotipicamente classificados relativamente aos produtos de genes expressos e à sua capacidade para gerar partículas infecciosas. Os fenótipos ALV-E conferidos por loci ev variam desde partículas infecciosas estruturalmente e enzimaticamente completas até partículas estruturalmente ou enzimaticamente (RT) defec-tivas ou até ausência de expressão proteica detectável. A maioria dos loci ev são estruturalmente incompletos e assim não codificam, todas as sequências necessárias para a produção de partículas virais infecciosas. A estirpe de galinha, designada ev-0, foi obtida através de cruzamento para ser resistente a ALV-E. As galinhas Line-0 não possuem loci ev (i.e. ev-0) mas estão presentes sequências provirais EAV no genoma das galinhas Line 0 (Dunwiddie and Faras, 1985, Proc Natl. Acad. Scr USA, 82: 5097-5101).
Sabe-se pouco acerca da família EAV, a qual é
distinta da família ALV ma s relacionada com esta. Os elementos EAV estão p. resentes em pelo menos 5 0 cópias por genoma de galinha. No entanto. nenhuma das sequências EAV conhecidas representa genomas retrovirais completos e intactos e não foram ainda identificados isolados EAV infecciosos. No entanto, demonstrou-se que EAV é altamente expresso nas células embrionárias derivadas do género aviário, gallus. Weissmahr et ai. (1997, J. Virol 71:3005-3012) mostraram que as partículas da família de retrovírus 4 ΡΕ2150275 endógenos EAV são provavelmente responsáveis por uma grande porção da actividade RT associada a partículas encontrada nos sobrenadantes de fibroblastos embrionários de galinha em cultura. 0 risco de transmissão inadvertida é particularmente elevado para a vacina de vírus vivo atenuado, uma vez que não pode ser sujeito ao procedimento de inactivação e a maioria é injectada no ser humano, ultrapassando assim os mecanismos de protecção imune não específicos. Assim, para assegurar a segurança das vacinas para uso animal e humano, os substratos celulares para a produção de vacinas têm agora de ser testados relativamente à presença de retrovírus competentes para a replicação que possam ser passados para hospedeiros animais ou hospedeiros humanos durante a imunização (série de relatórios técnicos da OMS, 1994).
Por outro lado, os sistemas de produção de ovos de galinha embrionados e de fibroblastos primários embrionários de galinha estão associados a várias limitações graves, incluindo: - um processo de produção demorado, aborrecidos e dispendioso que requer a procura e controlo de qualidade de grandes quantidades de ovos ou CEFs para cada campanha de produção individual; - a necessidade em muitos casos de usar embriões de galinha caros sem patogénios específicos (SPF); - os riscos de fornecimento insuficiente de ovos 5 ΡΕ2150275 em casos de infecções epidémicas em aviários de galinhas dado r ei s; - os preços inflacionados associados ao uso de soro bovino originário de paises sem BSE; - a incsipacidade de usar ovos para a propagação de vírus que sejam altamente virulentos e letais para as galinhas.
Existe portanto uma necessidade urgente de melhorar as actuais tecnologias de produção de vacinas virais com base em ovos ou em f ibroblastos embrionários de galinha. 0 desenvolvimento das plataformas de culturas celulares como uma alternativa aos ovos e sistemas de produção de CEF para a produção de vacinas virais é provavelmente a solução mais rápida e promissora para ultrapassar os actuais entraves à produção de vacinas e constrangimentos temporais. Ainda, o uso de linhas celulares para a produção de vacinas virais, em vez de plataformas de ovos ou CEF, terá as seguintes vantagens adicionais relativamente a segurança da vacina: ausência de antibióticos presentes na formulação de vacina; ausência de necessidade de conservantes tóxicos (tais como timerosal); níveis reduzidos de endotoxinas, ausência da questão de alergia ao ovo; ausência de risco de agentes adventícios/BSE devido à cultura celular em meio sem proteínas e sem soro; maior pureza da preparação de vacinas virais. São exemplos de linhas celulares para a produção de vacinas virais MDCK (células derivadas do rim de cão 6 ΡΕ2150275
Madin-Darby), células PerC6 (células derivadas de células da retina embrionária humana geneticamente modificadas através da inserção de genes EI do adenovirus humano tipo 5) desenvolvidas por CRUCELL (Holanda)), células VERO (células derivadas de células epiteliais de rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops) isolada na Uni versidade de Chiba em Chiba, Japão), BHK21 (células imortalizadas a partir de células de rim de hamster bebé), Nenhuma das linhas celulares disponíveis preenche todos os requisitos médicos, de regulamentação e industriais. Por exempio, a me :ra tas linl í 3. S C Θ .1U .i. 3. ] é tumoriqénica existe uma questão de regulamentação importante acerca do uso de células tumorigénicas para a produção de vacinas humanas; assim, actualmente as autoridades reguladoras são relutantes em aprovar os substratos celulares tumorigénicos para produzir vacinas em massa. Ainda, algumas destas linhas celulares são dependentes de ancoragem, o que constitui um entrave grande para o aumento de escala industrial da produção de vacinas.
Assim, existe a necessidade de desenvolver linhas celulares independentes de ancoragem, sem retrovirus competentes para a replicação, que sejam não tumorigénicas e industrialmente satisfatórias, ou seja susceptíveis à infecção com uma larga gama de vírus. Este é o objectivo do presente invento.
Assim, o inventor tirou partido do seu conheci-mento da biologia aviária e das células estaminais / ΡΕ2150275 embrionárias (ES) aviárias para empreender o desenvolvimento de novas linhas celulares estáveis de pato que permitam a replicação eficiente de um grande grupo de vacinas humanas e veterinárias e candidatos a vacinas. Através da adaptação de um processo proprietário (ver WO 03/076601 e WO 05/007840), o inventor foi capaz de gerar uma série de linhas celulares de pato bem caracterizadas e documentadas (i.e. as células dEBx©) que derivam de células ES de pato, sem passos de imortalização genética, química ou virai e que em cultura não produzem retrovírus competentes para a replicação. roporciona um processo para células aviárias diplóides, células estaminais embrio O presente invento pi obtenção de linhas contínuas de designadas EBx, derivadas de nárias (ES) aviárias, em que as referidas linhas celulares aviárias não produzem partículas de retrovírus endógenos competentes para a replicação.
As linhas celulares do invento são "contínuas" devido a terem as caracteristicas para serem cultivadas in vitro durante um período de tempo extenso. Vantajosamente, as células são capazes de proliferar durante pelo menos 50 gerações, pelo menos 75 gerações, pelo menos 100 gerações, pelo menos 125 gerações, pelo menos 150 gerações, pelo menos 175 gerações, pelo menos 200 gerações, pelo menos 250 gerações. As 250 gerações não constituem, um limite de ΡΕ2150275 tempo, pois as células obtidas ainda estão vivas e ainda podem ser passadas em passagens adicionais. Sem estar limitados por uma teoria, postulámos que as células podem ser cultivadas "continuamente" desde que a telomerase seja expressa pelas células. De facto, assume-se que o nivel elevado de expressão da telomerase das células aviárias do invento seja responsável pela estabilidade genética (i.e. as células aviárias do invento são diplóides) e pelo crescimento celular continuo.
Por "passagem" pretende-se significar a transferências de células, com ou sem diluição, de um recipiente de cultura para outro. Cada vez. que as células são transfer i GãS de um recipier íte para outro, uma porção das células pode perder-se e a ssirn, a diluiçã o das células, deliberada ou não, pode ocorrer. Este termo é sinónimo r\ o '-Λ- termo "subcultura". 0 n- úmero de passagens é o número de vezes que as célula s na cultura, que cresce rn em suspen são ou aderentes, foram subc ultivadas ou passada s para um n ovo recipiente. Este termo não é s inónimo de duplicação da população ou de ger ação que é o tempo neces sário paira uma população celular replicar-se uma vez; ou seja, sensivelmente o tempo para cada uma das células de uma populaição se replicar. Por exemplo, as células ES do passo a) do invento possuem um tempo de duplicação da população (PDT) de cerca de >40 noras. As células EBx aviárias do invento possuem um PDT de cerca de <30 horas; geralmente, para as células EBx© faz-se uma passagem cada 3 gerações. ΡΕ2150275 q 5or "diploidia", pretende-se significar que at o.e ca :élulas do invento possuem duas cópias (2n) cromossoma, geralmente uma da mãe e uma do pai. obtidas pelo processo do invento serem continuas e diplóides (í.e. geneticamente estáveis) constitui uma caracteristica notável e única devido a estes termos serem geralmente antagonistas. Assim, as células de cancro e/ou células imortalizadas obtidas por modificação química, física (irradiação U.V., raios X ou radiação gama, ...) ou genética (transformação com vírus, expressão excessiva de oncogenes, ...) são células contínuas devido a serem capazes de replicar indefinidamente em cultura, mas não são geneticamente estáveis devido a apresentarem cariótipos poliplóides. Por outro lado, as células primárias tais como fibroblastos embrionários de galinha, MRC5, WI38 que são células não transformadas, não são contínuas devido a terem um tempo de vida finito após algumas gerações, mas são células geneticamente estáveis (i.e. diplóides).
No presente invento, os termos "linha celular" e "células" serão usados indistintamente. 0 termo "aviá: , ΪΤ ΪΪ , .ves ou "ava como aqui usado destina-se a ter o mesmo significado e será usado indistintamente. "Aves" refere-se a qualquer espécie, subespécie ou raça de organismo da classe taxonómica "ava". Numa realização preferida, "aves" refere-se a qualquer animal da ordem taxonómica: ΡΕ2150275 - "Anseriformes" (i.e., pato, ganso, cisne e similares) . A ordem Anseriformes possui cerca de 150 espécies de aves em três famílias: Anhimidae (as gritadoras) , Anseranatidae (o ganso "Magpie"), e a Anatidae,, que inclui mais de 140 espécies de aves aquáticas, entre elas os patos, gansos e cisnes. Todas as na ordem estão muito bem adaptadas à existência aquática na superfície da água. Todas possuem membranas interdigitais nas patas para natação eficiente (ainda que subsequentemente algumas se tenham, tornado essencialmente terrestres) . - "Galliformes" (i.e, galinhas, codornízes, perus, faisões e similares) . Os Galliformes é uma ordem de aves contendo galinhas, perus, codornízes e faisões. A nível mundial são encontradas cerca de 256 espécies. - "Columbiformes” (i.e. pombo e similares). A ordem das aves Columbiformes inclui as largamente disseminadas rolaLS e pombos.
No presente invento, pelo termo "partícula retro-virai endógena" ou "partícula de retrovírus endógeno", termos que podem ser usados indístintamente, pretende-se significar uma partícula de retrovírus ou codificada por retrovírus e/ou expressa a partir de sequências provirais de ALV-E ou EAV presentes nalguns genomas de células aviárias. Nas aves, sabe-se que as sequências provirais ALV-E estão presentes no genoma de aves domésticas (excepto ΡΕ2150275 faisão de coleira. Nas provirais EAV estão que inclui a galinha na galinha Line 0), galinha bantarn e aves, sabe-se que as sequências presentes em todo o género gallus doméstica, a galinha Line 0, a galinha bantam, galinha selvagem vermelha, galinha selvagem verde, galinha selvagem cinzenta, galinha selvagem de Ceilão e similares) (ver Resnick et al., 1990, J. Virol., 64:4640-4653).
De acordo com uma realização preferida, as aves do invento são seleccionadas entre as aves que não possuem sequências provirais ALV-E e EAV no seu genoma. Os familiarizados com a matéria são capazes de determinar se as sequências ALV-E e EAV estão presentes num genoma de ave (Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al., 1996). A ave é seleccionada do grupo compreendendo Anseriformes (i.e. pato, ganso, cisne). Assim, as células derivadas de tal ave não produzem partículas endógenas de ALV-E e/ou EAV. Numa realização preferida, a ave do presente invento é nao no seu seleccionada do grupo compreendendo patos, gansos, cisnes. De acordo com uma realização mais preferida, a ave é um pato, mais de preferência pato de Pequim ou pato mudo. De acordo com uma realização mais preferida, a ave é um peito de Pequim. Assim, o presente invento proporciona um processo para a obtenção de linhas celulares contínuas, diplóides, de pato derivadas de células estaminais embrionárias (ES), em que as referidas linhas celulares de pato não produzem partículas de retrovírus endógenas competentes para a replicação. Descreve-se aqui aves que compreendem sequências provirais ALV-E completas ΡΕ2150275 genoma mas eventualmente sequências provirais de EAV. Os familiarizados com a matéria consegue determinar se estão presentes sequências de ALV-E e EAV parciais ou completas num genoma de ave (Johnson and Heneine, 2001) . Foram seleccionadas várias estirpes de galinha através da criação das que não possuem sequências provirais completas de ALV-E (i.e. estirpe ev-0) e portanto não produzem retroparticulas de ALV-E infecciosas, tais como: -Line 0 da galinha doméstica do stock de aves de capoeira East Lansing USDA (estirpe ELL-0). As galinhas East Lansing Line 0 não possuem quaisquer loci virais endógenos (ev) relacionados com. ALV (Dunwiddie and Faras, 1985). - Linhas DE e PE11 do Institut National de la Recherche Agronomique (Domaine de Magneraud, Surgères,
Assim, as células derivadas de aves ev-0 não produzem partículas ALV-E endógenas competentes para a replicação. Descreve-se aqui uma galinha doméstica ev-0 (Gallus Gallus subespécie domesticus), de preferência seleccionadaL entre ELL-0, DE e PE11. sequencia provira. cL S galinhas ev -0 ainda possuem de EAV mas até agora não foram >s EAV infeccio SOS . Assim, descreve-se para obtenção de linhas celulares Q. ÍD galinha d.0 1C ivadas de células aqur um processo pa estaminais embrionários (ES) de estirpes de galinha ev-0, 13 ΡΕ2150275 em que as referidas linhas celulares ev-0 de galinha não produzem partículas de retrovírus endógenos competentes para a replicação.
Descrevem-se aqui aves que compreendem sequências provirais, completas e/ou incompletas, de ALV-E e EAV no seu genoma, irias que são incapazes de produzir retroparticulas competentes para a replicação de ALV-E e EAV. Os familiarizados com a área são capazes de determinar se são produzidas retroparticulas infecciosas e/ou não intecciosas de ALV-E e/ou EAV a partir de células de aves (Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al., 1996). De preferência, a ave é seleccionada do grupo consistindo em galinhas sem agentes patogénicos específicos (SPF), de preferência da estirpe Valo (Lohman) ou Linha 22 (SPAFAS).
Por "competente para a replicação" pretende-se significar que as partículas retrovirais endógenas são intecciosas, ou seja que tais partículas virais são capazes de xnfectar e repiicerem-se em células aviárias do invento. O processo de estabelecimento de linhas celulares contínuas diplóiaes aviárias, designadas EBx©f do invento compreende dois passos: ultura a) isolamento, < estaminais embrionárias de expansão de células aves da ord^m Anseriformes que ião possuem sequências provirais endógenas completas ou um :’,eu fragmento, susceptíveis de produzirem partículas ΡΕ2150275 retrovirais endógenas competentes para a replicação, mais especificamente sequências provirais EAV e/ou ALV-E ou um seu fragmento, num meio de cultura completo contendo IGF-1 e CNTF e na presença de uma camada de células de suporte e suplementado com soro animal; facultativamente, o referido meio de cultura completo pode compreender aditivos, tais como aminoácidos adicionais (i.e. glutamina, aminoácidos não essenciais , piruvato de sódio, beta-mercaptoetanol, vitaminas, hidrolisado de proteínas de origem não animal (i.e. hidrolisado de leveduras, hidrolisados de plantas (soja, trigo, ...) ; b) passagem através de modificação do meio de cultura de forma a obter uma remoção total dos referidos IGF-1 e CTNF, da referida camada de suporte e do referido soro, e, facultativamente, dos referidos aditivos e ainda obtenção de linhas de células aviárias aderentes ou em suspensão, designadas EBx®, que não produzem partículas de retrovírus endógenos competentes para a replicação, capazes de proliferar durante um longo período de tempo num meio basal na ausência de factores de crescimento exógenos, camada de suporte e soro animal. A modificação do meio de cultura do passo b) do processo de estabelecimento de linhas de células EBx®, de forma a obter remoção progressiva ou total dos factores de crescimento, soro e camada de suporte, pode ser feita simultaneamente, sucessivamente ou separadamente. A sequência do desmame do meio de cultura pode ser escolhida 0 1® t' Ύ' 0 * ΡΕ2150275 camada de suporte/soro/factores de crescimento; camada de suporte/factores de crescimento/soro; soro/factores de crescimento/camada de suporte; soro/camada de suporte/factores de crescimento; factores de crescimento/soro/camada de suporte; factores de crescimento/camada de suporte/soro.
Os referidos factores de crescimento são IGF-1 e CNTF. Numa realização preferida, a sequência do desmame é factores de crescimento/camada de suporte/soro. Numa realização preferida, a remoção de aditivos tais como piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais (NNEA), vitaminas, hidrolisado de levedura são realizados após o desmame da com dí de sup< orte 0 antes do desmame do soro i. De prefe- a remi oçâo do hidrolisado de levedura é realizada remoção dO ρ iruvato de sódio, N NEA e vit aminas, De acord ίο com uma reali: zação pp eferida, as e s t arrd _nais embrionári a s a v i a x 'ias de a .cor do com o a) do inver ito são co lhidas í a partir de embrião na pos u u r a, 01 j. se j a qu ando o o vo é post o. De acordo Llier e t al. í í 2 0 0 6, u , Appl. Poult. Rc a s , , 15:219- postur a cor responde às fases d e desenvo Ivimento que uem de acor do q jrj a i classif if cação de Eyal-Giladi ficação de EYAL-GILAD I: EYAL -GILADI and KOCHAN, 1976, «From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick». "General Morphology" Dev. Biol. 49:321-337): - 1 b - ΡΕ2150275
Pato mudo (também designado pato Barbary): fase VI!
Galinha da Guiné: fase VII-VIII
Peru: fase VII-VIII
Pato de Pequim: fase VIII
Galinha: Fase X
Codorniz, japonesa: fase XI
Ganso: fase XI.
De preferência, as células estaminais embrio-nárias (ES) de pato do passo a) são obtidas através da dissociação de embriões de pato de Pequim por volta da fase VIII (postura) da classificação de Eyal-Giladi. Se o ovo posto colhido na postura não estiver suficientemente desenvolvido para colher as células estaminais embrionárias, o ovo posto pode ainda ser incubado entre várias horas (du:: γητί rp 3. 0 ate entre ura p ri n rs d.ras para a matura ciσ. ' j do embrião. De acordo com uma segunda realização, as cél ul as estamina -j Q O :mbri onári; as (ES) de pato do pa sso a) e de urr 1 o at o mudo , Na pos tura, o ovo do pato mudo não es tá suf "i ç rente emente mâQU ro d evido por Θ s tar aproximada imen te na f as e VI I, assim L O ovo é in cubado durante a no ite pa ra mat ur ar 0 ovo at é à fase VIII a X da cia ssifreação de Eya 1- Giladi.
Também emb rion árias (ES) se descreve quando células estaminais de galinha, de preferência da estirpe de galinha ev-0, dissociação de da classificaç do passo a) são obtidas através da embriões aproximadamente na fase X. (postura) o de Eyal-Giladi. ΡΕ2150275
Também se descreve quando as células estaminais embrionárias aviárias de acordo com o passo a) do invento são colhidas a partir do embrião antes da postura. As principais limitações encontradas antes da postura é o facto do ovo ser removido cirurgicamente das galinhas e a quantidade de células ES por embrião ser menos importante. Ainda, nas fases muito precoces do desenvolvimento embrionário das aves, as células ES não estão bem individualizadas tornando dificil a cultura in vitro das células ES.
Também se descreve quando as cél u 1 a s e ' cj tamin a i s ΡΐηΤ rioná r i as go pass o a) do invento podem ser co i: hidas a t'. emb rião a v iário após postura até à ei olosão. No en t anto, a s cél ulas estaminais emb ri .onárias de aves ent ram pro gress iv amente na difere nciação para gerar {•ÇbÍ dos diferenciados; assim, prefere-se colher ES de aves pouco tempo após a postura. Os familiarizados com a área serão capazes de definir a janela temporal após a postura do ovo que permite colher células estaminais embrionárias de aves.
Development
De acordo com uma outra realização, as células do passo a) são uma população de células estaminais embrionárias enriquecidas em células germinais primordiais (PGC). Mais de preferência, as células ES aviárias do passo a) são PGCs purificadas. Nas espécies aviárias, as células germinais primordiais surgem da região central da blastoderme (Ginsburg and Eyal-Glladi 18 ΡΕ2150275 1996 Dev Genet 19(4):290-ltry Sei. 76(8):1084-92). Sm 1 extra-embrionário anterior, serem apanhadas pela vascu- 101 (2) :209-19; Karagenc et al 301; Petitte et al, 1997 Pou seguida movem-se pcira um loca. o crescente germinativo, até latura entre 2,5 e 5 dias de desenvolvimento embrionário para atingir a cristã germinativa. Eles colonizam a cristã germinativa onde eventualmente se diferenciam em oócitos ou espermatócitos (Nieuwkoop and Sutasurya, 1979. The Migration of the primordial germ cells. In: Primordial germ cell in Cnordates. London: Cambridge University Press pll3~ 127) . Os métodos para isolamento de PGCs a partir de embriões de aves dadoras foram descritos na literatura e podem ser facilmente realizados pelos familiarizados com a área. (Ver, e.g. JP924997 publicada em 7 de setembro, 1993 b. N° 05-22794 / » ' f Chang et al. 1 992. Cell Biol. i nt. (2): 143-149 ; Naito et al. 1994 Mol. Repro d. Dev, 39: 3-161 ; Yasuda et al. 1992. J. Rep rod. Fert. 96: 521- 528 Chang et al. 1 992 Cell Biol . Int, Repórter 16(9): 8 53- 7) . D e acordo com uma realização, PGC; s são colhida, s a partir de sangue embrionário colhido da aorta dorsal de um embrião de galinha na fase 12-14 da classificação de Hamburger & Hamilton (Hamburger & Hamilton 1951 A series of normal stages In the development of chick embryo. J. Morphol. 88: 49-92). Numa outra realização preferida, PGCs foram colhidas a partir do crescente germinativo através de dissecção mecânica de embrião de galinha ou a partir das gónadas. No entanto, conforme discutido atrás, são conhecidos outros métodos para o isolamento de PGCs e podem ser usados em alternativa. ΡΕ2150275
As células estaminais embrionárias aviárias são ito compre- caracterizadas por um tempo de duplicação endendo entre 48 e 72 horas em cultura a 39°C,
Sem estar limitado por uma teoria, as condições de cultura celular das células ES aviárias seguido do desmame progressivo de factores de crescimento, camada de suporte, aditivos e soro, permitem adaptar e seleccionar células que mantêm a maioria das características pretendidas das células ES (estabilidade do cariótipo, proliferação indefinita, expressão de marcadores de ES) mas adicionalmente apresentam características boas em termos industriais, como sejam, o crescimento em suspensão até densidades celulares elevadas em meio sem soro. A telo-merase constitui um dos marcadores de ES rnais importantes. Devido à expressão sustentada e continuada da telomerase ao longo das passagens celulares, as células EBx® são contínuas (í.e. imortais) mas adicionalmente são geneticamente estáveis (í.e. diplóides).
Ma is especificamente, o presente invento pro- porciona um processo para. obtenção de linhas celulares contínuas dip' lordes de aves derivadas de células ES, em que as refer idas linhas celulares de aves não produzem partículas retrovirais endógenas competentes para a repli-cação, o referido processo compreendendo os seguintes passos de: - 2 0 - ΡΕ2150275 a ) isolamento do embrião de aves, de preferên cia a partir de pato, numa fase do desen volvimento que compreende ap r o x i ma damen t e a fase VI da c _L3.SS1£1C3.Ç-clO de Eyal-Giladi (EYAL-GILADI's classificat ion: EYAL-GILADI and KOCHAN, 1976, «From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick». "Gener al Morphology" Dev. Biol., 49:321- -337) e a ntes da eclosão, de preferência aproximadamente quando da postura, em que r·', vj genoma da referida ave não possui sequências provirais endógenas susceptíveis de produzir partículas retroviriais endógenas competentes para a replicação; b) suspensão de células estaminais embrionárias aviárias (ES) obtidas através da dissociação de embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com: - factor de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1) e factor neurotrófico ciliar (CNTF); - soro animal. c) sementeira da suspensão de células ES obtidas no passo b) numa camada de células de suporte e ainda cultura das células ES durante pelo menos uma passagem; e) remoção de IGF-1 e de CNTF do meio de cultura e ainda cultura das células ES aviárias durante pelo menos uma passagem. De preferência, a remoção dos factores de crescimento seleccionados do grupo compreendendo IGF-1 e CNTF do meio de cultura é realizada simultaneamente, durante uma passagem. Geralmente, a remoção de IGF-1 e CNTF é realizada por volta da passagem N°15 a N°25. Como alternativa, a remoção de IGF-1 e de CNTF é realizada por - 21 - ΡΕ2150275 redução progressiva ao longo de várias passagens (em pelo menos 2 passagens e até aproximadamente 15 passagens); f) redução progressiva da concentração das células de su .porte no meio de cultura de forma a obter uma remoção total da camada oe su porte após várias passagens e ainda c ultura das células; g) facultativament e, redução prog ressiva da concent racão de aditivos no meio d-θ cultura de forma a obter uma remoção total dos aditivos após pelo menos uma passagem; e h) facultativamente, redução progressiva da concentração de soro animal no meio de cultura de forma a obter uma remoção total de soro animal após várias passagens; e i) obtenção de linhas celulares aviárias, designadas EBx®, derivadas de células ES capazes de proliferar num meio basal na ausência de factores de crescimento, camada de suporte, facultativamente sem soro animal e aditivos e em que as referidas linhas celulares continuas, diplóides, aviárias não podem produzir partículas de retrovirus endógenos competentes para a replicação; j) facultativamente, ainda adaptação das referidas linhas celulares aviárias EBx® a condições de cultura em suspensão. 0 passo de adaptação da cultura celular a suspensão pode ocorrer ao longo do processo de estabelecimento das células EBx®. Por exemplo, com as células de pato EBx© derivadas de células estaminais embrionárias de pato mudo em , as células foram adaptadas ao crescimento 22 ΡΕ2150275 suspensão antes da remoção da camada de suporte. Para as células EB® de pato (EB24, EB2 6, EB66) derivadas de pato de Pequim,. as células foram adaptadas ao crescimento em suspensão antes da remoção do soro animal. k) facultativamente, ainda subclonagem das referidas células EBx®, por exemplo por diluição limite.
Numa realização preferida, o presente invento está relacionado com um processo para obtenção de linhas celulares continuas diplóides aviárias, designadas EBx®, derivadas de células estaminais embrionárias (ES) aviárias, em. que as referidas linhas celulares aviárias não produzem partículas de retrovírus endógeno competente para a replicação e o referido processo compreendendo os passos de: a) iso lamento < '10 embri .ao cio i aves numa fase do olv imento ] por volta i d; a pos tura, e. m qr le o genoma da da ave nã o possui s e qu e n cias provirais endógen a s tív eis de produzir pa rtí cu lais ret rovi rais endógenas Ο τ® Τ' es paira a replic aca o e e m que a ref erida a v θ é da ordem Anseriformes; b) suspensã o de células estaminais embrion árias aviárias (ES) obu r das através da dissociação de embriõ es do passo a) num me i o de cultura basal suplementado com pelo menos: - factor de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1) e factor neurotrófico ciliar (CNTF); 23 ΡΕ2150275 c) sementeira da suspensão de células ES obtidas no passo b) numa camada de células de suporte e ainda cultura das células ES durante pelo menos uma passagem; e) remoção de IGF-1 e de CNTF do meio de cultura e ainda cultura das células durante pelo menos uma passagem; f) redução progressiva da concentração das remoção de suporte no meio de cultura de f o rma a obter uma total da camada de sup orte apó s várias passagens e Itura das células; g) facultativamen ^ ^ f 1C Θ du Ç ci O progress iva oa con o do referido soro G0 mamífere ) do meio de cultura de forma a obter uma remoção total do soro de mamífero após várias passagens; e h) obtenção de linhas celulares aviárias, desi- riva das Gt í célula s ES capaz es de prolife sra na au sê^ci^. de fac tores dc 5 c rescimer ito te e soro de mami: te ro, e em qr le a s referida . e s cor -1 ti .nuas, d ipl óides, a vi -árias nã produzem partículas de retrovirus endógenos competentes para a replicaçao; 1) facultativamente, ainda adaptação das linhas celulares aviárias EBx© aderentes a condições de cultura em suspensão, de preferência através da promoção do cresci-mento em suspensão, mais de preferência através da transferência das linhas celulares aviárias EBx© aderentes obtidas no passo h) para um outro suporte tendo carac-teristicas de aderência inferiores ao suporte inicial (i.e. como seja suporte de aderência ultra baixo ("Ultra Low")). - 24 - ΡΕ2150275 0 passo j) de adaptação das linhas celulares aviárias EBx© aderentes a condições de cultura em suspensão, quando realizado, pode ser efectuado numa outra rea-
lização preferida antes do pas so g) da red ução progress í Vd da cone entração de soro de mam: Lfero no meio de cultura. Também, é G6SC Ί rito qu ando o meio de c ultura ba sal no pass o b) do pro cesso para obtenção de linh as célula vps aviária s continuas dip. lordes de acordo com o prese nte invento , é ainda supleme untado com um f âC lO. r ae crescimento selecci onado no gri ιρο compreendendo in terls suei: na 6 (IL- a \ Ό , , recepto r de interleucina 6 (IL-6R), factor das célu las estaminais (SCF) e f act ; o r de crescimento de fibroblas tos (FGF) e o referido proce sso aii nda compr eend e o passo d) de: d) facult a u .1 v a mente, remoção de t o dos os facto res de cres cimento sei' eccioi nados do grupo corm pree: ndendo IL -6, IL-6R, SCF, FGF dc d me i o de c sultura ( a a i nda cultura G 3. S células ES durante pelo menos i jma passa ,gem. Numa real izaça o ma i s preferida, q uando o passo d) é reali zaaof o p 3. s so e) de re moção de IGF 1 e de CNTF GO meio de cultura, é efectuado a seguir ao passo d) de remoção da totalidade dos factores de crescimento selec-cionados do grupo compreendendo IL-6, IL-6R, SCF, FGF do me i o de cu 11u ra .
De acordo com o invento, "meio de cultura basal" significa um meio de cultura com uma formulação clássica de ΡΕ2150275 rrLeio que permite, por si só, pelo menos a sobrevivência das células e ainda melhor, o crescimento celular. Exemplos de meios basais são BME (meio basal de Eagle) , MEM (meio mínimo de Eagle), meio 199, DMEM (Meio de Eagle modificação de Dulbecco). GMEM (meio de Eagle modificação de Glasgow), DMEM-HamF12, Ham-F12 e Ham-FlO, meio de Dulbecco modificação de Iscove, meio MacCoy 5A. RPMI 1640, GTM3. O meio basal compreende sais inorgânicos (por exemplo: CaCI.2, KCI, NaCl, NaHCOs, NaH2P04, MgS04,...), aminoácidos, vitaminas (tiamina, riboflavina, ácido fólico, D-Ca pantotenato,...) e outros componentes tais como glucose, beta-mer-captoetanol, piruvato de sódio. De preferência, o meio basal é um meio sintético. A Tabela 1 apresenta a composição de DMEM/HAMF12:
Tabela 1: Formulação de DMEM-HAMF12 (mg/ml)
Sais Inorgânicos
Moreto de cálcio anidro 116,60 íitrato Férrico(III) * 9H20 0,05 íulf ato Férrico(II) * 7H20 0,417 u o r e t o de Potássio 311,80 Sulfato Cúprico(II)*5H20 0,0013 'loreto de Magnésio·6H20 61,20 íulf ato de Magnésio anidros 48, 84 'loreto de sódio 6996,00
Di-hidrogeno-fosfato de sódio»H20 62,50
Di-hidrogeno-fosfato di-sódico anidro 71, 02
Su1fato de zinco·7Η2O 0,432 200,00
Hidrogeno-carbonato de sódio ΡΕ2150275 26
Aminoácidos 4,45 147.50 7.50 6,65 31,29 17,56 7,35 365,00 18,75 31,48 54,47 59, 05 91,25 17.24 ^ à « / j- 17.25 26, 25 53, 45 9, 02 3 8,70 52, 85 L-Alanina L-Arginina * HC1 L-Asparagina ® H2O Ácido L-Aspártico L-Cistina * HC1 * Η·>0 L-Cisteina * 2HC1 Ácido L-Glutâmico L-Glutamina em E15-813 G1icina L-Histidina · HC1 * H20 L-Isoleucina L-Leucina
L-Lisina * KCI L-Metionina L-Fenilalanina L-Prolina L-Serina L-Treonina L-Triptofano L-Tirosina L-Valina
Vitaminas D ( + )-Biotina r, KJ f 0035 D- Pantotenato de cálcio Δ f 24 Cloreto de Colina 8, 98 Ácido Fólico 2, 65 ΡΕ2150275 27
Mio-Inositol 12, 60 Nicotinamida 2,0 2 Piridoxal * HC1 2,00 Piridoxina * HC1 0,031 Timidina 0,365 Vitamin BI2 0, 68
Outros componentes D-Glucose anidra 3151, Hipoxantina 2,10 Ácido D L- 6 8-L i p 6 i co 0,105 Á c i d o L i n ó 1 e i c o 0,042 Vermelho de fenol 8,10 Piitrescina · 2HC1 0,081 Piruvato de sódio 55, 0 0
Ainda, o meio basal do invento pode ser complementado com aditivos seleccionados no seguinte grupo: L-glutamina 0,1 a 5 rnM, de preferência L-glutamina entre 2 e 3 mM; - piruvato de sodro w, 6 o a 2 mM, de preferência piruvato de sódio entre 0,1 mM e 1 mM; - 0,1 a 2,5% de aminoácido s não essenciais, de preferência cerca de 1% de aminoácidos não essencieLis - 0,1 a 2,5% de vitaminas, de preferência cerca de 1% de vitaminas - beta-mercaptoetanol 0,05 a 5 mM, de preferência cerca de 0,16 mM; - hidrolisado de proteína de origem não animal. -28- ΡΕ2150275
Para o estabelecimento de células de pato EBx® do invento, o meio basal é, de preferência complementado com hidrolisado de proteína de origem não animal. Os hidro-lisados de proteína de origem não animal são seleccionados do grupo consistindo em triptona de bactérias, triptona de levedura, hidrolisados vegetais, tais como hidrolisados de soja ou uma mistura dos mesmos. Numa realização preferida, os hidrolisados de proteína de origem não animal é hidrolisado de levedura. 0 termo "hidrolisado" inclui uma digestão enzimática de peptona de soja ou extracto de leve d ura. 0 hidrolisadc ) pode se: r: obtido a partir: de uma plura 1idade de preparações de peptona de S O J cl ou de extra cto de levedura, r espectivamente, que po dem. a i rida ser diger idos er izimati carne n te (por exemplo com ; papaina) e/ou forma dos ρο r autólise , termóli _se e./ou pi asmóli se. Os hidro iibãCÍOS podem também ser e idqui ridos comercia .lmente, t, ais como Ye astolate, H u- ι-í -jf - i r XJ-j -Yeast 412 e Hi-Yea st 444, de f ontes tais como SAFC BioSciences (f Orrnerl y JRH) (Lena xa, KA) , Quest Int ernationaJ _ (Norwicn , N M.)f Organo- Techn ie S.A. (France) oi 2 Deutsche Hefewerke GmbH (Ge rmany) . Fonte s de extractos de levedura estão tam bém descr itas em WO 9 '8/15614 Fontes de extra ctos de le' vedura e de hidro lisados de soja e stão desc ritos em WO 0 0 /03( DOO. Os hidro lisados usados em meios do invento s ãO, de pr eferên- Q-j - purific ados a part .ir de uma fracção ! bru ta, de vido às impurezas qu e possam interferir com uma c ultura ef iciente serem prefe] rencialmente eliminadas durante esta purifi-
cação, melhorando assim a consistência do hidrolisado. A ΡΕ2150275 - 2 9 - purificação pode ser por ultrafiltração ou cromatografia em Sephadex (por exemplo, com Sephadex G25 ou Sephadex G10 ou materiais equivalentes) , cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho ou cromatografia de "fase reversa". De preferência, a purificação é realizada por ultrafiltração usando um filtro de exclusão de 10 kDa. Estes processos são conhecidos na área. Usando estes métodos, podem ser seleccionadas fracções que possuem hidrolisado de soja ou levedura de massa molecular definida. De preferência, as massas moleculares dos hidrolisados de soja e de levedura são, de preferência, entre cerca de 220 e 375 daltons. De preferência, o hidrolisado de levedura está presente no meio de cultura celular. O hidrolisado de levedura 50X (cerca de 200 g/1) obtido por exemplo da SAFC-BIOSCIENCES (Ref 58902C) está presente no meio de cultura celular numa concentração final compreendendo entre cerca de 0,lx e 2x, de preferência cerca de 0,5x a cerca de lx no meio de cultura. O hidrolisado de soja pode também ser adicionado ao meio de cultura celular. O hidrolisado de soja 5 0x obtido por exemplo da SAFC-BIOSCIENCES (Ref 58903C) foi adicionado numa concentração final compreendendo cercsi de 0,1X a 2x, de preferência cerca de lx no meio de cultura. Como alternativa, uma mistura de hidrolisado de soja e de hidrolisado de levedura pode ser adicionada ao meio de cultura celular como descrito em US2004/0077086.
De acordo com o invento, um meio basal preferido é DMEM-HamF12 complementado com L-glutamina 2 mM, piruvato ΡΕ2150275 de sóc 1 mM, aminoá r: ί ππ.ς ao esse 1£ vitaminas, beta-mercaptoetanol 0,16 mm e, iacultativamente, com hidrolisado de levedura IX.
Por "meio de cultura completo" pretende-se significar um meio de cultura basal, complementado ou não, de preferência um meio basal sintético, suplementado com oelo menos um factor de crescimento e soro animal. Exemplos
de meio de cultura completo estão descritos em WO 03/076601, WO 05/007( M0, EP 7 87180, US 6,114,f 6 8, US 5.340.740, US 6, 656, 479, IJS 5, 830,510 e em Pain et ai. (1996, Deveiopment 122:2339-2348). Como alternativa, o meio de cultura completo pode ser um meio condicionado, de preferência meio condicionado de BRL. Como exemplo, meio condicionado de BRL é preparado de acordo com técnicas conhecidas na área, tais como as descritas por Smith e Hooper (1987, Dev. Biol. 121:1-9). Células BPIL estão disponíveis na ATCC com o número de acesso CRL-1442. O meio condicionado pode ser suplementado com factores de crescimento exógenos e soro animal como descrito abaixo. O termo "factores de crescimento" como aqui usado significa factor de crescimento necessário para a sobrevivência e o crescimento de células ES aviárias, não diferenciadas em cultura, num meio de cultura basal. É possível distinguir esquematicamente duas famílias de factores de crescimento: as citocinas e os factores tróficos. As citocinas são principalmente citocinas cuja acção ocorre através de um receptor que está associado à ΡΕ2150275 proteína gp 130. Assim, o factor inibidor de leucemia (LIF), interleucina 11, interleucina 6, receptor da interleucina 6, factor neurotrófico ciliar (CMTF), oncostatina e cardiotrofina possuem um modo de actuação semelhante com o recrutamento, ao nível do receptor, de uma cadeia específica e a combinação do último com a proteína gp 130 na forma monomérica ou por vezes heterodimérica. Os factores tróficos são principalmente factor de células estaminais (SCF), factor de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), de preferência FGF básico (bFGF) ou FGF humano (hFGF). 0 meio de cultur a completo de acordo com ornpreende me i o de c u11u r a ba sal, de preferêm meio basal sintético e pelo menos uma citocina cuja actuação é a .través de um receptor gue esta associado à proteína gpi 30 e/ou pelo menos um fa etor trófico. ue Ό 2Γ Θ f ΘΙΓ ê Π C Ί Ç} — ^ r o mie i o de cultura completo de acordo com 0 invento compreende meio basal e pelo menos um factor de crescimento seleccionado do grupo consistindo em factor inibidor de leucemia (LIF), oncostatina, cardiotrofina, factor de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1), factor neurotrófico ciliar (CNTF). Interleucina 6 (IL-6), receptor de interleucina 6 (IL-6R), factor das células estaminais (SCF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF), interleucina 11 (IL-11). De acordo com uma primeira realização preferida, o meio de cultura completo é meio basal suplementado com soro animal e com pelo menos IGF-1 e CNTF. De acordo com uma segunda realização preferida, o
— Q 9 _ jZ ΡΕ2150275 meio ae cultura completo é meio basal suplementado com soro animal e pelo menos IGF-1, CNTF, IL-6 e IL-6R. De acordo coru uma. terceira realização preferida, o meio de cultura completo e meio basal suplementado com soro animal e pelo IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF. De acordo com realização, o meio de cultura complete η é um meio cultura condicionado compreendendo factores de crescimento (í,e. expresso por células BRL ou STO, por exemplo) e racultativamente suplementado com pelo menos um dos factores de crescimento exógenos seleccionados no grupo consistindo em: LIF, IGF-1,CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-li. A concentração dos factores de crescimento IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11 no meio basal ou no meio de cultura condicionado é constituída por cerca de 0,01 a 10 ng/ml, de preferência 0,1 a 5 ng/ml e, mais de preferência, cerca de 1 ng/ml. O meio de cultura do invento também pode compreender antibióticos, tais como, por exemplo, gentamicina, penicilina e estreptomicina, para evitar a contaminação bacteriana. Qs antibióticos podem ser adicionados ao meio de cultura nas fases iniciais da cultura de células ES. Por :once exemplo, a gentamicina num. ntraçao final de 10 ng/ml, penicilina numa concentração final de 100 U./ml e estreptomicina numa concentração final de 100 yg/ml podem ser adicionados ao meio de cultura. Numa realização preferida, durante os das linhas roeio de cultura e s t ab e1e c i me n t o ’ continuas do não se adicionam antibióticos ao últimos passos do processo de celulares aviárias, diplóides invento. ΡΕ2150275
Durante o processo de estabelecimento de células estaminais embrionárias aviárias do invento, as células são cultivadas numa camada de células de suporte. Mais de preferência, as células de suporte são células animais ou linhas celulares cultivadas para fins de cultura de células ES aviárias. Como alternativa, as células de suporte podem ser substituídas com matriz extracelular mais factores de crescimento ligados. A matriz de suporte daqui em diante refere-se a células de suporte ou a matriz extracelular. A matriz de suporte como aqui usada é construída de acordo com procedimentos conhecidos na área. Como referido atrás, prefere-se que a matriz de suporte seja pré-condicionada. Pelo termo "pré-condicionada” pretende-se significar que a matriz de suporte é cultivada na presença de meio durante um período de tempo antes da deposição das células que têm origem no disco da blastoderme de ovos de aves fertilizados em contacto com a matriz de suporte, e.g. um tempo suficiente para iniciar e estabelecer a produção de, por exemplo, factores de crescimento ou outros factores pela matriz de suporte; geralmente uma matriz de suporte é pré-condicionada pela cultura da matriz de suporte por si só durante um a dois dias antes da deposição das células que têm origem no disco da blastoderme de ovos de aves fertilizados em contacto com a matriz de suporte. As células de suporte, de preferência, compreendem células de fibroblastos de murganho, ridos, mas os fibroblastos quados. Igualmente, ainda
Os fibroblastos STO são prefe-primários são igualmente adeqúe o presente invento seja ΡΕ2150275 descrito referindo o uso de matrizes de suporte de células de murganho, considera- se que matrizes de suporte compreendendo células de outras espécies murin as (e.g. rato); outras espécies de mamífero (e.g. espécies de ungu- lados, bovinos, porcinos); ou espécies aviárias (e.g. Gallinacea, galinha, peru, pato, ganso, codorniz, faisão) podem ser também usadas, Numa outra realização, as células de suporte do invento podem ser transfectadas com vectores de expressão permitindo, por exemplo, a expressão constitutiva de factores de crescimento tais como SCF aviário em Γ-ώ 1 n O -L. o-. las STO. A s s Lm, este ” su port e" produz o factor numa f o rm a que é solúvel e/ou li gada à. membrana. p -i. d. SITI0.0. i ca, Assi m, o pro cess o c le cu ltur a d. r' vO presente 1. nvento pode f acu Itativame: ite coir ipreen .der 0 e s t. a b e 1 e c 1. me r ito de uma mono camada de céli 11 a s de s upor te. AS c e .1 u r a s de suporte S â O mito ticamente inactivadas usando t técnicas co: nvencion ais, Por exemplo, as células suporte oodem se 1 r exposta s a racli açao X oi_ i gai .na (e.g. 400 0 Rí ídi 3 de radi aç ão gama: t ou podem ser tra tada; q d'1 Q ppi ]V[ j_ t ;omicina C (e.g. 10 μ< ç/ml dur ante 2-3 horas) , Os ρ roce idimer : tos G.0 in . a c 11 v a ç a o mitótica das células estão também detalhados na informação tipicamente enviada com as células da American Type Culture Collectron (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 (e.g. as células de suporte STO estão disponíveis com o número de acesso ATCC 1503) , As monocamadas podem ser
cultivadas até cerca de 80% de confluência, de pre ferência até cerca de 9 0 % de de confluência e mais de pre ferência até cerca de 100% de confluência, Apesar da C Q ro j- iguração das células de suporte como monocamada ser a conf .1. p Li .1. Cl Ç- d. O das ΡΕ2150275 preferida paLra a cultura, qualquer configuração adequada e contemplada no âmbito do presente invento. Assim por exemplo, camadas, monocamadas, agrupamentos, agregados ou outras associações ou agrupamentos de células de suporte estão contemplados dentro do âmbito do presente invento e estão particularmente contemplados para caírem dentro do sign ifiçado do termo "matr iz" . 0 me i o de < cultu. ra do invento é suplementado c om soro animal 0 soro animal de preferên C1 cL usado é so ro f e t a 1 animal . Prefere -se o soro fetal bov: Lno , Ainaa, s.ρθs a r do presente invento ser desc: sito usan do o soro fet al bovi no, con sidera-se Q"| -| soro animar i "[ uindo soro de outras espécies animais (e.g. galinha, cavalo, suíno,
ungulado, etc.) pode ser iaua Imen te usgQO . A c oncentração final de soro animal no me i o de cultura compreende entre aproximadamente 1 e 25%, de orpf erência 0pj|· f-' 0 5 % e 2 0%, ma i s de preferência entre 8% e 12%. Na IGàllZâÇâO preferida, a concentração final de soro animal no meio de cultura é de aproximadamente 10%. De acordo com uma realização, o meio de cultura compreende aproximadamente 10% de soro fetal de vitela.
Descreve-se quando a ave do presente invento é seleccionada da Ordem Anseriformes e é, de preferência, um pato, mais de preferência m pato de Pequim e mais de preferência pato de Pequim estirpe Ml4 ou GL30. De acordo com uma segunda realização preferida, a ave do presente invento é um pato mudo. Assim, o presente invento propor- ΡΕ2150275 im primeiro P rocesso para obtenç ão de li nhas s, QipiOi 0.0 S contini ias de pato de rivadas t-í. tf est aminais emb. rionária: 3 (ES), em qu Θ cl s refer Ό. ci. o celi alares de pato não prod' uzem par ticulas 0.0 us endógeno c ompetent· es para a r epli _ C cL Ç õ O e o linhc referido processo compreendendo os passos de: a) isolamento de embriões de pato na postura (i.e. postura do ovo) ou ligeiramente antes ou depois da postura. Facultativamente, o ovo pode ser incubado, geralmente durante a noite, para maturar {i.e. pato mudo); b) suspensão de células estaminais embrionárias de pato (ES) obtidas através da dissociação de embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com. factor de cresc 1 mento 1.1 po 1 nsu 1 ina 1 {IGF-1) , fact.or neurotróf ico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de interleucina 6 (IL-6R), factor das células estaminais (SCF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF) e soro animal; c) sementeira da suspensão de células ES obtidas no passo b) numa camada de células de suporte e ainda cultura das células ES de pato durante pelo menos uma passagem; d) remoção de todos os factores de crescimento seleccionados do grupo compreendendo IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF do meio de cultura ao longo de 1 a aproximadamente 15 passagens, de preferência simultaneamente numa passagem e ainda cultura das células ES de pato durante pelo menos uma passagem; ΡΕ2150275 f) redução progressiva da concentração das células de suporte no meio de cultura, de uma passagem para a seguinte, de forma a obter uma remoção total da camada de suporte após de o a cerca g) concentração de fo rma a várias passagens, de preferência, após cerca de 25 passagens, e ainda cultura das células; facultativamente, redução progressiva da do referido soro de animal do meio de cultura obter uma remoção total do soro animal após varras passagens; e h) obtenção de linhas celulares aderentes de pato derivadas de células ES, designadas EBx© de pato, capazes de proliferar num meio basal na ausência de factores de crescimento, camada de suporte e soro animal, e em. que as referidas linhas celulares continuas diplóides aviárias não produzem partículas de retrovirus endógenos competentes para a replicação; i) facultativamente, ainda adaptação das linhas celulares aderentes de pato a condições de cultura em suspensão. Os aditivos ao mero basal são retirados durante o processo e, de preferência, entre os passos f) e g) ou entre os passos g) e h), A concentração de soro animal no passo b) é, de preferência, entre 5 e 10%. A concentração de factor de crescimento T" 1 ΡΛ L. _!_ k' vj insulina 1 (IGF- -1) , factor neurotró fico ciliar (CNT F) , interleucina 6 (IL-6) , receptor de interleucina 6 (IL -6R), factor das células estaminais ( SCF) e factor de cres cimento de f ibr oblastos (FGF) são, de preferência, cerca de 1 ng/ml. ΡΕ2150275
Descreve- se um segundo processo paLra obtenção G0 linhas celulares continuas dipló ides de pato derivadas de células estaminais embrionárias (ES) , em que as referi '-wi & O linhas celulares de ρει to não produzem pa .rticulas G0 retrovírus endógenos competentes para a replicação e o referido processo compreende os passos de: a) isolamento de embriões de pato na postura (i.e. postura do ovo) ou ligeiramente antes ou depois da postura. Facultativamente, o ovo pode ser incubado, geralmente durante a noite, para maturar {i.e. pato mudo); b) suspensão de células estaminais embrionárias de pato (ES) obtidas através da dissociação dos embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF e soro animal; c) sementeira da suspensão de células ES obtidas no passo b) numa camada de células de suporte e ainda cultura das células ES de pato durante pelo menos uma passagem; d) remoção de todos os factores de crescimento seleccionados do grupo compreendendo IL-6, IL-6R, SCF, FGF do meio de cultura ao longo de 1 a aproximadamente 15 passagens, de preferência simultaneamente numa passagem e ainda cultura das células ES de pato durante pelo menos uma passagem; e) remoção dos factores de crescimento IGF-1 e CNTF do meio de cultura ao longo de 1 a aproximadamente 15 passagens, de preferência simultaneamente numa passagem e ΡΕ2150275 ainda cultura das células ES de pato durante pelo menos uma passagem; f) redução progressiva da concentração das células de suporte no meio de cultura, de uma passagem para a seguinte, de forma a obter uma remoção total da camada de suporte após várias passagens, de preferência, após cerca de 5 a cerca de 25 passagens, e ainda cultura das células; g) facultativamente, redução progressiva da concentração do referido soro de animal do meio de cultura de forma a obter uma remoção total do soro animal após várias passagens; e h) obtenção de linhas celulares aderentes de pato derivadas de células ES, designadas EBx© de pato, capazes de proliferar num meio basal na ausência de factores de crescimento, camada de suporte, facultativamente sem soro animal, e em que as referidas linhas celulares continuas diplóides aviárias não produzem partículas de retrovírus endógenos competentes para a replicação; i) facultativamente, ainda adaptação das linhas celulares aderentes de pato a condições de cultura em suspensão. Os aditivos ao meio basal são retirados durante o processo e, de preferência, entre os passos f) e g) ou entre 0 s pas SOS g) e h) , A cor ícentração de soro an imal no pass o b) é, de pref e rêncisA 0-pj -j- 270 5 e 10 %. As c oncentrações de ! Eli o 1—1 i r CNTF, IL- r -Ό, IL- 6R, SCF, F 1Γ1 T7 Ui são, de preferência, cerca de 1 ng/ml. - 40 - ΡΕ2150275 roporciona um processo :ontinuas diplóides de embrionárias (ES), em de pato não produzem O presente invento também p põLra obtenção de linhas celulares c pato derivadas de células estaminais que as reieridas linhas celulares partículas de retrovírus endógenos competentes para a replicação e o referido processo compreende os passos de: a) isolamento de embriões de pato na postura (i.e. postura do ovo) ou ligeiramente antes ou depois da postura. Facultativamente, o ovo pode ser incubado, geralmente durante a noite, para maturar (i.e. pato mudo); b) suspensão de células estaminais embrionárias de pato (ES) obtidas através da dissociação dos embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com factor ae de crescimento tipo insulina (IGF-1) e factor crescimento neurotrófico ciliar (CNTF) e soro animal; c) no passo b) cultura das passagem; sementeira da suspensão de células ES obtidas numa camada de células de suporte e ainda, células ES de pato durante pelo menos uma d) remoção de todos os factores de crescimento seleccionados do grupo compreendendo IGF-1 e CNTF do meio de cultura ao longo de 1 a aproximadamente 15 passagens, de preferência simultaneamente numa passagem e ainda cultura das células ES de pato durante pelo menos uma passagem; f) redução progressiva da concentração das células de suporte no meio de cultura, de uma passagem para a seguinte, de forma a obter uma remoção total da camada de suporte após várias passagens, de preferência, após cerca de 5 a cerca de 25 passagens, e ainda cultura das células; - 41 - ΡΕ2150275 g) facultativamente, redução progressiva da concentração do referido soro de animal do meio de cultura de forma a obter uma remoção total do soro animal após várias passagens; e h) obtenção de linhas celulares aderentes de pato derivadas de células ES, designadas EBx© de pato, capazes de proliferar num meio basal na ausência de factores de crescimento, camada de suporte, facultativamente sem soro animal, e em que as referidas linhas celulares continuas diplóides aviárias não produzem partículas de retrovirus endógenos competentes para a replicação; i) facultativamente, ainda adaptação das linhas celulares aderentes de pato a condições de cultura em suspensão. Os aditivos do meio basal são retirados durante o processo e, de preferência, entre os passos f) e g) ou entre os passos g) e h), A concentração de soro animal no passo b) é, de preferência, entre 5 e 10%. As concentrações de IGF-1 e CNTF são, de preferência, cerca de 1 ng/ml.
Uma ve z obtidas a s linhas celu lares de pato aderentes ou em s- uspensão, o process o dc ' invento pode também compreender o passo aidicional de adaptação das células de pato EBx© ao crescimento no meio de cultura celular sem hidrolisado de proteína de origem não animal, como sejam hidrolisados de levedura.
De preferência as linhas celulares EBx© de pato ΡΕ2150275 do invento não apresentam actividade de transcriptase reversa pela análise Q-PERT. Ainda, não são produzidas partículas de retrovirus endógeno competentes para a replicação pelas células de pato EBx® conforme demonstrado pelas experiências de co-cultura de células EBx® de pato do invento com células competentes para a replicação ALV, tais como células QT6 de codorniz ou células DF1 de galinha, Ainda, a análise por microscopia electrónica de transmissão (TEM) também demonstra a ausência de partículas de retrovirus endógenos competentes para replicação em células de pato EBx®. De preferência, a linha celular de pato EBx® do invento é seleccionada entre EB24 de pato, EB26 de pato e EB66 de pato como aqui descrito a seguir.
Descreve-se também quando a ave do presente invento é seleccionada na Ordem de Galliformes e mais de preferência é uma galinha, de preferência uma galinha doméstica ev-0 (Gallus gallus subespécie domes ti cus) . Assim, o presente invento proporciona um processo para a obtenção de linhas celulares continuas diplóides de galinhas domésticas ev-0 derivadas de células estaminais embrionárias (ES), em que as referidas linhas celulares continuas de galinha doméstica ev-0 não produzem partículas de retrovirus endógenos ALV-E e o referido processo compreendendo os passos de: a) isolamento de embriões de ev-0 na postura (i.e. postura do ovo) ou ou depois da postura; galinha doméstica .igeiramente antes 43 ΡΕ2150275 b) suspensão de células estaminais embrionárias (ES) de galinha doméstica ev-0 obtidas através da dissociação de embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF e FGF e soro animal; C) sementeira da suspensão de células ES obtidas b) numa camada de células de suporte e ainda as células ES de galinha doméstica ev-0 durante cultura daí pelo menos 1 passagem; fores de c res O me n t o GF-1, CNTF, IL -6 , IL- longo de 1 cL ap roxi- . simui . tanea me n te numa ES de galin na du rante d) remoção < seleccionados do grupo 6R, SCF, FGF do meio madamente 15 passagens passagem e ainda cultu pelo menos uma passagem; f) redução progressiva da concentração daí células de suporte no meio de ci íltura, de uma passagem para 3 S 0 QU í i ite, de forma a obter umí i remoç ão total . da camada de suporte após várias passagens, de pre íf erênci a, após cerca de 5 a cerca de 25 passagens, e ainda cultura das células; g) facultativamente, redução progressiva da concentração do referido soro de animal do meio de cultura de forma a obter uma remoção total do soro animal após várias passagens; e h) obtenção de linhas celulares aderentes de galinha doméstica ev-0 derivadas de células ES, designadas EBx©ev-0, capazes de proliferar num me io basal na ausência de factores de crescimento, camada de suporte e soro animal, e em que as referidas 1 z η n a s c e1u1ares c o n tí nu a s 44 ΡΕ2150275 diplóides aviárias não produzem partículas de retrovírus endógenos ALV-E competentes para a replicação; i) facultativamente, ainda adaptação das linhas celulares aderentes aviárias EBx® ev-0 a condições de cultura em suspensão. Os aditivos do meio basal são retirados durante o processo e, de preferência, entre os passos f) e g) ou entre os passos g) e h). A concentração de soro animal no passo b) é, de preferência, entre 5 e 10%. As concentrações de IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF e FGF são, de preferência, cerca de 1 ησ/ml.
Descreve-se um. segundo processo para obtenção de linhas celulares contínuas diplóides de galinhas domésticas ev-Q derivadas de células estaminais ernbrionárias (ES) , em que as referidas linhas celulares contínuas de galinha doméstica ev-0 não produzem partículas de retrovírus endógeno ALV-E e o referido processo compreende os passos de: a) isolamento de embriões de galinha doméstica ev-0 na postura (i.e. postura do ovo) ou ligeiramente antes ou aepois da posuura/ b) suspensão de células estaminais ernbrionárias (ES) de galinha doméstica ev-0 obtidas através da dissociação de embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF e FGF e soro animal ΡΕ2150275 - 4 5 - c) no passo b) cultura das pelo menos 1 d) seleccionados do meio de sementeira da suspensão de células ES obtidas numa camada de células de suporte e ainda células ES de galinha doméstica ev-0 durante passagem; remoção de todos os factores de crescimento do grupo compreendendo IL-6, IL-6R, SCF, FGF cultura ao longo de 1 a aproximadamente 15 passagens, de preferência simultaneamente numa passagem e ainda cultura das células ES de galinha durante pelo menos uma passagem; e) remoção dos factores de crescimento IGF-1 e de CNTF do meio de cultura, ao longo de 1 a cerca de 15 passagens, de preferência simultaneamente durante uma passagem e ainda cultura, das células durante pelo menos uma passagem; f) redução progressiva da concentração das células de suporte no meio de cultura, de uma passagem para a seguinte, de forma a obter uma remoção total da camada de suporte cipós várias passagens, de preferência, após cerca de 5 a cerca de 4b passagens, e ainda cultura das células; g) facultativamente, redução progressiva da concentração do referido soro de animal do meio de cultura de forma a obter uma remoção t otcil do soro animal após λ/árias passagens; e h) obtenção de linhas celulares aderentes de galinha doméstica ev-0 derivadas de células ES capazes de proliferar num meio basal na ausência de factores de rescimento, camada de suporte e, facultativamente, sem -46- ΡΕ2150275 soro animal,. e em que as referidas linhas celulares continuas diplóides de galinha doméstica ev-0, designadas EBx©, não produzem partículas de retrovirus endógenos competentes para a replicação; i) facultativamente, ainda adaptação das linhas celulares aderentes de galinha doméstica ev-0 a condições de cultura em. suspensão. Os aditivos do meio basal são retirados durante o processo e, de preferência, entre os passos f) e g) ou entre os passos g) eh). J\ 11 concentração de preferência, entre 5 e 10% CNTF, IL-6, IL-6R, SCF e FGF 1 ng/ml. oro animar no passo b) é, de As concentrações de IGF-1, são, de preferência, cerca de
Descreve-se um. terceiro processo para obtenção de linhas ceruiares c rinuas diplóides de galinhas domésticas ev-0 derivadas de células estaminais embrionárias (ES), em que as referidas linhas celulares continuas de galinha doméstica ev-0 não produzem partículas de retrovirus endógenos ALV-E e o referido processo compreende os passos de: a) isolamento de embriões de galinha doméstica ev-0 na postura (í.e, postura do ovo) ou ligeiramente antes ou depois da postura; b) suspensão de células estaminais embrionárias (ES) de galinha doméstica. ev-0 obtidas através da dissociação de embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com IGF-1, CNTF e soro animal; 47 ΡΕ2150275 O í sementeira Ll ci. suspensão de células ES obtidas no passo b) numa cama Ο.Θ. de células de suporte e ainda cultura das cérulas iS de galinha doméstica ev-0 durante pelo menos 1 passagem; d) remoção dos factores de crescimento IGF-1 e CNTF do meio de cultura ao longo de 1 a aproximadamente 15 passagens, de preferência simultaneamente numa passagem e ainda cultura das células ES de galinha durante pelo menos uma passagem; f) redução progressiva da concentração das células de suporte no meio de cultura, de uma passagem para a seguinte, de forma a obter uma remoção total da camada de suporte após várias passagens, de preferência, após cerca de 5 a cerca de 45 passagens, e ainda cultura das células; g) facultativamente, redução progressiva da concentração do referido soro de animal do meio de cultura de forma a obter uma remoção total do soro animal após V á ΙΓ 3_ cl S p3-SS8.CfGriS/ Θ h) obtenção de linhas celulares aderentes de galinha doméstica ev-0 derivadas de células ES, designadas EBx® de galinha ev-0, capazes de proliferar num meio basal na ausência de factores de crescimento, camada de suporte e, facultativamente, sem soro animal, e em que sls referidas linhas celulares continuas diplóides de galinha não produzem partículas de retrovírus endógenos competentes para a replicação; aditivos i) facultativamente, celulares aderentes de galinha de cultura em. suspensão. Os ainda adaptação das linhas doméstica ev-0 a condições do meio basal são 48 ΡΕ2150275 retirados durante o processo e, de preferência, entre os passos f) e g) ou entre os passos g) eh). A concentração de soro animar no pa; 0jT0r±cÍ8.f entre 5 0 10%· As concentrações CNTF são, de preferência, cerca de 1 ng/ml. so b) é, de de 5F-1
Descreve-se quando a ave do presente invento é uma galinha doméstica (Gallus gallus subespécie domesticus) obtida de um bando sem patogénios específicos (SPF). Mais de preferência, a estirpe de galinha, é White-Leghorn. Os ovos das galinhas SPF foram testados relativamente à ausência de patogénicos bacterianos e vírus de galinha conhecidos, incluindo vírus da reticuloendoteliose (VER) e o vírus exógeno da leucose aviária (ALV-A, ALV-B, ALV-C, ALV-D, ALV-J) . O ovo SPE do invento pode ser ovo VALO da LOHMANN (Cuxhaven, Germany) ou ovos L22 da CHARLES RIVER (Spafas), Assim, o presente invento também proporciona processos para obtenção ae linhas celulares contínuas drplóides de galinna derivadas de células estaminais embrionárras (aS) ootiaas de ovos de galinha SPF, como descrito com os ovos de galinha ev-0. De preferência, a lxnna celular Eux® ae galmna obtida a partir de ovos spp ^ EBvlS.
As apresentar ac Q-PERT, mas de galinha p0ç}eiri reversa por análiSe las de retrovirus linhas celulares EBx© ividade de transcriptase sem produzirem partici endógenos competentes para a replicaçãc A ausência de 49 ΡΕ2150275 partículas de retrovírus endógenos competentes para a replieação pode ser demonstrada através de experiências de co-cultura de células EBx® ev-0 de galinha do invento com c θ 1 u 1 a s com ALV competente para a replieação. como sej am células QT6 de codorniz ou as células DF1 de galinh
Ainda, a ausência de partículas de retrovírus endógenos em células EBx® ev-0 de galinha pode ser igualmente demonstrado por TEM. A temperatura do corpo das aves é geralmente QQOp .J J * As ;sim, o s pr o o 3 S S os do invento TA r' ϊτ'v- dem tarnb ém compr eend er o P asso p H -j Λ. ion a 1 de reauça o da temperatura da cul tu 1' ã C 01 XX .1. . â I pa: r a 7 7 .J ! c n de f o rma a adaptai : as linh â S celul ares a vi .ár ias do i nve into ac ) cres cimen 10 a 3 7 ° C . De prefe rênc -i- a / a adap taç ão a te rapei: a t u i' a é re ali z a o a â ]p o s o passo de clep I eç· ão d. a c am a da de s u; porte e ant .es da depleç ao de soro. Como alternativa, a adaptação à temperatura é realizada após o passo de depleção de soro ou após o passo de adaptação das linhas celulares à cultura em suspensão.
As linhas estabelecidas EBx® obtidas pelo processo do invento possuem a característica de crescerem como células aderentes ou como células em suspensão num meio de cultura sem factores de crescimento exógenos e soro animal e sem células de suporte. Podem ser usadas diferentes técnicas individualmente ou em combinação para adaptar as células à cultura em suspensão, entre elas:
As células aderentes sao semeadas numa - 5 0 - ΡΕ2150275 acima da con-em suspensão; densidade celular elevada, ligeiramente fluência para forçar ais células a entrarem - As células aderentes são semeadas num meio de cultura celular com uma concentração de soro animal baixa: recipientes
As células aderentes são semeadas em de cultura celular feitos de plástico que não permitem a adesão celular ou uma adesão celular fraca, tais como placas e caixas de petri para bactérias e placas de ligação ultra baixa desenvolvidas por companhias tais como Corning (placas de cultura de tecidos & placas Ref. 3262, 3473, 3471, 3474; Frascos Ref. 3814...) ou Sarstedt (Frascos ref 831810502...); - As células aderentes são semeadas num recipiente de cultura e cultivadas com agitação (aprox. 50 rpm) .
As células EBx®, de preferência EBx® de pato e EBx® de galinha, podem ser cultivadas in vitro durante uma período de tempo considerável. Vantajosamente, as células EBx®, aderentes ou independentes de ancoragem (i.e. em suspensão), obtidas pelo processo do invento são c apazes d· proliferar durante pelo menos 5 0 Cj" Θ T 3. ç Ο Θ S f pelo menos 7 gerações, pelo meno S U U g~ e r a. ç o e s, pelo menos 125 gerações pelo menos 150 gerações, pelo menos 175 gerações, pelo menos 200 gerações, pelo menos 250 gerações. A expressão "linha" é entendida como significando qualquer população de células capaz de proliferar indefinidamente em cultura in vitro, mantendo ao mesmo tempo num grau maior ou menos as - 51 - ΡΕ2150275 mesmas características morfológicas e fenotípicas. Podem ser obtidos clones, por exemplo por diluição limite, a partir das células EBx® do invento. Estes clones são células que são geneticamente idênticas à célula de onde derivam por divisão. 0 presente pedido de patente descreve linhas celulare obtidas células EBx®, sendo diâme s continuas diplóides aviárias, designadas pelo processo do invento, as referidas EBx® individualizadas, redondas e pequenas (i.e. tro aproximado de 10 um) , com um tempo de duplicação de aproximadamente 30 horas ou menos a 37°C ou a 39°C. As células EBx® aviárias, de preferência EBx® de pato ou EBx® de galinha ev-0, expressam um fenótipo de células estaminais embrionárias com as seguintes características: uma elevada proporção de núcleo para cito- sma, - uma actividade de ;elomerase endógena marcadores facultativamente,, podem expressar um ou mais ES adicionais tais como marcadores fosfatase ENS1. :alina, SSEA-1, EMA-' - um tempo de duplicação inferior ao tempo de duplicação das células ES aviárias do passo a) do processo do invento (entre 48 h e 72 h a 39°C) , de aproximadamente 30 horas ou menos (de preferência 24 horas) a 37°C. ret
As referidas células ovírus endógenos competentes não produzem parti para a replicação. ulas de 52 ΡΕ2150275
As linhas celulares EBx® aviárias são capazes de proliferar indefinidamente num meio basal, em particular num meio como seja meio SAFC Exceli, DMEM, GMEM, DMEM-HamF12 ou McCoy, sem factores de crescimento exógenos, soro e/ou camada de suporte inactivada, facultativamente complementado com vários aditivos normalmente usados pelos familiarizados com a matéria. São exemplos de aditivos os aminoácidos não essenciais, vitaminas, piruvato de sódio e antibióticos. As células EBx® de pato do invento possuem a característica notável de crescerem num meio de cultura basal que não é complementado com glutamina. cultura 0 presente pedido celular para manter de patente descreve um meio de células estaminais embrionárias pluripotentes ou multipotentes, de preferência células estaminais (ES) embrionárias de pato pluripotentes ou multipotentes, em cultura num estado indiferenciado. De acordo com uma realização preferida, o presente pedido de patente descreve meio de cultura celular para células estaminais embrionárias de pato, compreendendo um meio de cultura basal, suplementado com soro animal e suplementado com pelo menos IGF-1 e CNTF. De acordo com uma segunda realização preferida, o presente pedido de patente descreve meio de cultura celular para células estaminais embrionárias de pato compreendendo um meio de cultura basal suplementado com soro animal e suplementado com pelo menos IGF-1, CNTF, IL-6, IL6R. De acordo com uma terceira realização preferida, o presente pedido de patente descreve 53 ΡΕ2150275 um meio de cultura celular para células estaminais embrionárias de pato compreendendo um meio de cultura basal suplementado com soro animal e suplementado com pelo menos O O Cl od IGF-1, CNTF, II-6, II-6R, SCF e FGF. Os reteridos meio suficientes psira a manutenção das referidas células ES de pato em cultura durante pelo menos 7 dias, de preferência durante pelo menos 20 dias, de preferência durante pelo menos 100 dias num estado não diferenciado. O referido meio de cultura pode ainda compreender, facultativamente, pelo menos um composto seleccionado do grupo compreendendo interleucina-11, cardiotrofina, oncostatina e factor inibidor de leucemia (LIF). De preferência, o referido meio de cultura ainda compreende hidrolisado de proteína de origem, não animal como anteriormente descrito; mais de preferência é hidrolisado de levedura de origem não animal como anteriormente descrito; mais de preferência, é hidrolisado de levedura numa concentração de IX. O meio de cultura de células ES aviárias (de preferência de pato) pode ainda compreender uma camada de células de suporte. O presente pedido de patente descreve uma cultura sustentada de células ES de pato essencialmente de células ES de pato não diferenciadas expressando o fenótipo de células estaminais com as seguintes características: uma elevada proporção de núcleo para cito > ma, - uma actividade de telomerase endógena f acultat ivamente, podem, expressar um ou mais 54 ΡΕ2150275 marcadores ES adicionais tais como marcadores fosfatase alcalina, SSEA-1, EMA-1, ENS1. - um tempo de duplicação de aproximadamente 40 h a 37°C ou a 39°C.
As referidas células de pato não diferenciadas são capazes de manter o referido fenótipo celular quando crescidas em células de suporte num meio de cultura celular para células estaminais embrionárias de pato como anteriormente descrito. As referidas células de pato não diferenciadas são úteis para produzir patos quiméricos ou transgénicos.
Assim, o presente método de obtenção de patos compreendendo os passos de: pedido de patente descreve um quiméricos, o referido método introdução dt uma cultura ;entadí cavidade subgerminal de obtido no passo a) para células ES como atrás descrito na um embrião de pato recipiente; e b) incubação do embrião eclodir como um patinho; c) selecção do referido patinho quimérico com-preendendo células heterólogas tendo colonizado o referido patinho. O presente pedido de patente descreve um método de obtenção de pato quimérico geneticamente modificado, compreendendo os passo de: 55 ΡΕ2150275 a) introdução de células ES de pato geneticamente modificadas como descrito atrás na cavidade subgerminal de um embrião de pato recipiente; e b) incubação do embrião obtido no passo a) para eclodir como um patinho; c) selecção do referido patinho quimérico compreendendo células heterólogas geneticamente modificadas tendo colonizado o referido patinho. um método quimérico passos: para obt em. que o 0 presente pedido de patente descreve enção de uma progénie do referido patinho referido método compreende os seguintes a) deixar o patinho quimérico seleccionado obtido no passo c) desenvolver-se como uma ave adulta; b) reprodução da referida ave adulta tendo células heterólogas, produzindo assim uma progénie de aves; c) selecção das aves de interesse na progénie. 0 pedido de patente descreve o passo adicional de expressão de um polipéptido heterólogo codificado por um vector de expressão contido nas referidas células Es de pato geneticamente modificadas. De preferência, o polipéptido heterólogo é libertado em fluido biológico do pato, como seja sangue, esperma, urina ou a clara de um ovo de ave em desenvolvimento produzido por uma fêmea do pato geneticamente modificado. - 5 6 - ΡΕ215Ô275 atrás
As células EBx® possuem referidas e são úteis para todas as caracteristicas a produção de produtos omo vacinas virais e péptidos e proteínas recombinantes. 0 presente invento também proporciona um. processo de replicação de um vírus nas linhas celulares c liplóides contínuas EBx® aviárias obtidas por um processo do invento. Mais de preferência, 0 invento proporciona um pro cesso de replicação de um vírus nas linhas celulares diplóides contínuas EBx® aviárias obtidas por um processo do invento, linhas celulares ΞΒχ® de pato que compreendem os passos de: - infecçâo de uma cultura celular EBx© aviária com um vírus de interesse; as referidas células EBx® aviárias sendo, de preferência, cultivadas em meio sem soro animar; - cultura de células EBx® aviárias infectadas de forma a replicar o referido vírus; - colneita do vírus no sobrenadante de cultura celular e/ou dentro das referidas células.
De acordo com uma realização preferida, o referido processo compreende o passo de: num m suspensão, num meio sem soro N°l; vão das referidas células com o vírus siaaae celular é de pelo menos 1,5 a) proliferação da referida EBx© aviária recipiente de cultura b) infec seleccionado quando a dens-milhões de células/ml; 57 ΡΕ2150275 c) facultativamente, pouco antes da infecção, simultaneamente com a infecção ou pouco depois da infecção adição à cultura celular de meio sem soro N°2; e d) ainda cultura das referidas células infectadas de forma a permitir a replicação de vírus; e e) facultativamente, colheita do referido vírus. 0 referido processo do invento pode incluir o passo adicional de adição de enzima proteolítica ao meio de cultura em condições que permitam a propagação do vírus. A enzima proteolítica é seleccionada do grupo consistindo em tripsina, quimotripsina, termolisina, pepsina, pancreatina, papaína, pronase, subtilisina A, elastase, furina e carboxipeptidase. De acordo com uma realização preferida, a enzima é tripsina. De preferência, a enzima proteolítica é uma proteína recombinante produzida num hospedeiro proca-riótico ou em plantas (í.e. Trypzean). A enzima proteolítica pode ser adicionada antes, durante e/ou após a infecção com vírus. De preferência, a adição da enzima proteolítica é realizada após infecção com vírus. A adição da enzima proteolítica ao meio de cultura pode ser realizada uma vez por dia, mais uma vez por dia, ou menos de uma vez por dia até à colheita do vírus. 0 termo "vírus" como aqui usado inclui não só vírus naturais como também vírus atenuados, vírus resultantes da redistribuição de fragmentos genómicos, estirpes vacinais, assim como vírus recombinantes e vectores virais e seus derivados. Os vírus do invento são, 58 ΡΕ2150275 de preferência, seleccionados do grupo compreendendo poxvírus, ortomixovírus, paramixovírus, herpesvírus, hepa-dnavírus, adenovírus, parvovírus, reovírus, circovírus, coronavirus, flavivírus, togavírus, birnavírus e retro-vírus.
Numa realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas virais pertencem à família Poxviridae e mais de preferência aos Chordopoxviridae. Numa realização, os vírus ou os vectores virais relacionados, partículas virais e vacinas virai: un poxvírus, de preferência um avipoxvírus
De acordo com uma é um vír us cia seleccionado entre poxvírus das galinhas (i.e. TROVAC), poxvírus dos canários (i.e. ALVAC), juncopoxvírus, poxvírus dos mainás, poxvírus dos pombos, poxvírus dos psitacideos, poxvírus das codornízes, poxvírus dos pardais, poxvírus dos estorninhos, poxvírus dos perus. realização preferida, o vírus e un: vírus aa vacina seleccionado entre o vírus da vacina estirpe Lister-Elstree, vírus da vacinai modificado como seja vírus da vacina modificado Ankara (MVA) que pode ser adquirido à ATCC (ATCC número VR-1508), NYVAC (Tartaglia et al,, 1992, Virology, 188:217-232), LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi, 1994, Vaccine, 12:675-681), CVI78 (Kempe et al., 1968, Pediatrics 42:980-985) e outros vírus da vacina recombinantes ou não recombinantes.
Numa outra realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as 59 ΡΕ2150275 vacinas pertencem à família Orthomyxoviridae, em particular o vírus da gripe. 0 vírus da gripe é seleccionado do grupo consistindo em vírus da gripe humano, vírus da gripe das aves, vírus da gripe equina, vírus da gripe suína, vírus da gripe felina. O vírus da gripe é, de preferência, seleccionado entre as estirpes A, B e C. Entre as estirpes A, pode-se mencionar vírus com diferentes subtipos de hemagl .utinina e neuraminidase, tais como sem limitação H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N7 e H9N2. Entre as estirpes H1N1, pode-se me π c i o n 3. ir A/Porto
Rico/8/34, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/95, A/ Johannesburg/282/96, A/Texas/36/91, A/Singapore, A/Solomon Islands/03/2006. Entre as estirpes H3N2, pode-se mencionar A/Panama/2007/99, A/Mo s cow/10/99, A/Johannesburg/33/94, A/ Wisconsin/10/04. Entre as estirpes B, pode-se mencionar sem limitações B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99, B/ Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/ 7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/ 166/98, B/Jiangsu/10/03, B/Malaysia. 0 vírus da gripe do invento é seleccionado entre o vírus selvagem, isolado virai primário obtido a partir de indivíduos infectados, vírus recombinantes, vírus atenuados, vírus sensíveis à temperatura, vírus adaptados a temperatura baixa, vírus resultante da redistribuição de segmentos genómicos, vírus obtidos por manipulação genética reversa. Quando o vírus do invento é o vírus da gripe, o processo do invento compreende o passo adicional da adição da enzima proteolítica ao meio de cultura em condições que permitem a propagação do vírus. De acordo com. uma realização preferida, a enzima - o η - ΡΕ2150275 é tripsina. A concentração final de tripsina no meio de cultura celular é de 0,01 yg/ml a 10 yg/ml. Mais de preferência, a concentração final de tripsina no meio de cultura celular inclui 0,01 a 10 usp/ml (usp: unidade farmacopeia US) de preferência entre cerca de 0,05 e 2 usp/ml, mais de preferência entre cerca de 0,3 e 1 usp/ml e mais de preferência cerca de 0,75 usp/ml.
Numa realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas pertencem à família Paramyxoviridae. De preferência, o vírus é um paramixovírus natural ou um paramixovírus recombinante seleccionado do grupo compreendendo o vírus do sarampo, < o vírus da papeira, o vírus da rubéola, o V Sendai, c > vírus s i n c i c i a1 respir atór i o (RSV) , vir. 'U s para-influenza humana tipos I e III, vírus Rinderpest, vírus da diarreia canina, vírus da doença de Newcastle, vírus para-influenza dos patos. De acordo com uma realização preferida, o vírus é 0 vírus do sar ampo Ol vírus do sarampo recomb inante. De ci O O X Ci O com uma 01 realização prerenoa, o vírus é o vírus do sar ampo Ol vírus do sarampo recomb inante. De ci O O X Ci O com uma Ol realização preferida, o vírus Θ o víxus da doen ça Newcastle (NDV) ou um NDV recomb inante. La Sota é im
exemplo de uma estirpe de NDV. Quando o vírus do invento é NDV, o processo do invento compreende de preferência o passo adicional de adição da enzima proteolítica ao meio de cultura em condições que permitem a propagação do vírus. De acordo com uma realização preferida, a enzima é tripsina. A - rc ΡΕ2150275 celular Mais de meio de unidade concentração final de tripsina no meio de cultura compreende entre cerca de 0,01 yg/ml e 10 pg/ml. preferência, a concentração final de tripsina no cultura celular é entre 0,01 e 10 usp/ml (usp: farmacopeia US), de preferência entre cerca de lusp/ml, mais de preferência entre cerca de 0, usp/ml. É interessante que as linhas celulares EBx© do invento que podem crescer em aderência são úteis para fazer a titulação do virus e de preferência a titulação de NDV, num ensaio de placas. De facto, ao contrário de CEFs e de fibroblastos DF1 de galinha para os quais não é possível observar quaisquer efeitos citopáticos, a replicação virai em. células EBx© conduz, à formação de células gigantes características. Ainda, as partículas virais NDV podem ser determinadas por ensaio de também diz respeito ao uso a titulação de vírus, como hemaglutinação. Assim, o invento das células EBx® do invento para s e j a v í r u s N DV.
Numa outra realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas pertencem à família Togaviridae. De preferência, o vírus é um alfavírus natural ou um alfavírus recombinante seleccionado do grupo compreendendo vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki, vírus o'nyong'nyong, vírus chikungunya, vírus Mayaro, virus Ross river, vírus da encefalite equina do leste, vírus da encefalite equina do oeste, vírus da encefalite equina venezuelana. os vírus, os
Numa outra realização preferida, z - ΡΕ2150275 vectores virais relacionados,· as partículas virais e as vacinas pertencem à família Herpesviridae. De preferência, o vírus é um vírus da doença de Marek natural ou um vírus da doença de Marek recombinante. 0 vírus da doença de Marek iMDV) é de preferência seleccionado entre as estirpes vacinais de MDV aprovadas tais como: FC126 (HTV), SB-1, 301B/1, CVI988 Clone C, CV1988/C/R6, CVI988/Rispens, R2/23 (Mdll/75).
Numa outra realização preferida, os vírus, os ^setores virais relacionados, as partículas virais e as Vacmas pertencem à família Hepadnaviridae. De preferência, ° vírus é um hepadnavírus natural ou um hepadnavírus recom-‘-'-nante, de preferência seleccionado entre hepadnavírus “Viário e humano. 0 hepadnavírus aviário é de preferência Seleccionado do grupo que consiste em vírus da hepatite B d°s patos (DHBV), vírus da hepatite B das garças (HHBV) e do ganso-das-neves (SGHBV).
Numa outra realização preferida, os vírus, os v,2ctores virais relacionados, as partículas virais e as Vacmas pertencem à família Birnaviridae, em particular o Vli'us da doença infecciosa da bursa.
Numa outra realização preferida, os vírus, os V(Sctores virais relacionados, as partículas virais e as Vacinas pertencem à família Flaviviridae, em particular o Vj-rus da dengue, o vírus da encefalite japonesa e o vírus do Nilo Ocidental. 63 ΡΕ2150275
Numa outra realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas pertencem à família Coronaviridae, em particular o vírus da bronquite infecciosa.
Numa outra realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas pertencem à família Circoviridae, em particular o vírus da anemia das galinhas.
Numa outra realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas pertencem à família Retroviridae. De preferência, o vírus e um retrovírus natural seleccionado entre vírus da reticulo-endoteliose, vírus da anemia infecciosa dos patos, vírus da necrose do baço dos patos ou um recombinante destes retrovírus.
Numa outra realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas pertencem à família Parvoviridae. De preferência, o vírus é um parvovírus natural, como seja o parvovírus dos -^atos ou um seu recombinante.
Numa outra realização preferida, os vírus, os vectores virais relacionados, as partículas virais e as vacinas pertencem à família Adenoviridae. De preferência, o vírus é um adenovírus natural, de preferência seleccionado ΡΕ2150275 adenovírus dos gansos, dos pombos ou um recorri” novírus das galinhas são o adenovírus das galinhas 1 (CELO), adenovírus das galinhas 4 (KR95), adenovírus das galinhas 10 (CFA20), adenovírus das galinhas 2 (P7-A), adenovírus das galinhas 3 (75) , adenovírus das galinhas 9 (A2-A), adenovírus das galinhas 11 (380), adenovírus das galinhas 6 (CR119), adenovírus das galinhas 7 (YR36), adenovírus das galinhas 8a (TR59), adenovírus das galinhas 8b (764) e vírus do síndrome da queda de postura. Exemplos de adenovírus dos gansos são o adenovírus dos gansos 1, adenovírus dos gansos 2, ade o 0 vi ru s d OS Cf 3 Π S O s 3 . Exemplo c íe adenovír US < dos p atos é 0 ^ de no vi rus G 0 S p 3 L .os 2 Exemplo de adenoví rus dos pombos é o a O «ru n kA ~ j. j. '·_/ v í r us dos ρ ombo s 1 . Ad enovírus r e c o mb inante; 3 incluem mas não Θ S t, 3 O lim it 3 d O S a vectore s v; irais compreendendo um gene hete- rói og 0 * N 3 - igumas realizações, uma ou ma is f unções aux il iare c; * 03X3 3 repl reação do s vírus é pr O p Ο X G xoncid.3 pel 3 S C0i ula .s EBx® do h ospederro, um vírus auxiliar ou um pia sm ídeo auxiliair. V Θ C :tores rep resentativc >s 1 .ncluem mas 113.0 e stão li mitados aos que infect am células a vi árias ou de mam Ί f ero. descreve o uso de bactérias intrace-:>u Coxiella, células lulares O presente pedido de patente EBx® do invento para replicar tais como Chlamydia, Rickettsia - λ í ΡΕ2150275
As células ΕΒχ® obtidas por uni processo do invento podem ser igualmente usadas para produzir proteínas e péptidos recombinantes. 0 invento também está relacionado com um método de produção de proteínas e péptidos recombinantes f os quais incluem os passo de: (1) modificação genética de células EBx® obtidas por um processo do invento através de transfecção transitória ou estável de um vector de expressão; (ir) facultativamente, selecção das células EBx® expressando as referidas proteínas ou péptidos recombinantes; (iii) e purificação dos referidos péptidos e proteínas produz idos ou proteínas. Descrevem-se péptidos pelas células EBx®. 0 recipiente de cultura do invento preferên c r a, s v 1 agitação contínu frascos com agit fábrica de célul •eactor Wave™, biorreac tor Be11o™, nética, frascos para cé lulas e uma carnente, as células são aumentadas mãe ou de um banco de células de trabalho até vários tamanhos de frascos T, frascos rolantes ou biorreactor Wave™ e, de preferência, finalmente até biorreactores. A suspensão de células resultante é então tipicamente introduzida num biorreactor de produção de sementeira (tipicamente 20-30 1 de volume) para posterior cultura e nalgumas realizações, num biorreactor de produção maior (tipicamente 150-180 1 ou mais de volume) . A proporção de volume do segundo biorreactor (maior) relativamente ao biorreactor de sementeira depende do grau em que a linha celular é propagada no primeiro biorreactor, b - ΡΕ2150275 mas é tipicamente entre 3:1 a 10:1, e.g. na gama de (6-8):1. De acordo com uma realização preferida, o recipiente de cultura é um biorreactor de tanque de agitação continua que permite o controlo da temperatura, arejamento, pH e outras condições controladas e que é equipado com entradas adequadas para introdução das células, oxigénio estéril, vários meios de cultura e sardas para remoção das células e meio e meios de agitação do meio de cultura no biorreactor.
De acordo com o presente invento, "meio sem soro (S FM) si .gni f i p a um meio de cultura celul; Çj Ύ' pr onto a US3. Ύ' -L. f 01 -| s Θ CL que não necessita da adição de c 3 0 ro ar, ima .1. f pe rmi t i n do a s obrevivência e crescimento das c ' Cl· lul as . Es -j- Cl· ΠΊΡ io Γ) Â) Ç ) 0 necessariamente um. meio quimic ame nt e de f i n ido Cl· po de con iter hi drolisados de várias origen s f po r ex emp lo de pi 3.ii L .as ou de leveduras. De preferência, o ΓΘ ferie .lo SFM 0 qualificado como "de origem não animal", ou seja que não possui componentes de origem animal ou humana (estatuto FAO: "sem origem animal”). Em SFM, as proteínas nativas do soro são substituídas por proteínas recombinantes. Como alternativa, o meio SFM de acordo com o invento não possui proteína (me i o PF: "meio sem proteína") e/ou é qui: mic amente definido (me i o CDM: "meio quimic ame n t e definido"). Os me i o s SFM apre sentam várias va ntagens: (i) a primeira de todas sendo concordância das entidades reguladoras relativamente a tais meios (de facto não existe risco de contaminação por agentes adventícios tais como BSE, vírus); (ii) a optimi-zação do processo de purificação; (iii) a melhor reprodu-tibilidade no processo devido a melhor definição do meio. f-η ΡΕ2150275 São exemplos de meios SFM comerciais: VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020, catálogo 2003), Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019, catálogo 2003), Episerf (InVitrogen Ref 10732-022, catálogo 2003), pro 293 S-CDM (Cambrex ref 12765Q, catálogo 2003} , LC17 (Cambrex Ref BESP302Q) , Pro C.H05-CDM (Cambrex refl2-766Q, catálogo 2003), HyQ SFM4CHO (Hyclone Ref SH30515-02), HyQ SFM4CHO-Utility (Hyclone Ref
SH30516.02), HyQ PF293 (Hyclone ref SH30356.02), HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02), meio 293 Exceli (SAFC
Biosciences ref 14570-1000M), meio sem proteínas PF CHO Exceli 325 (SAFC Biosciences ref 14335-1000M), meio Exceli VPRO (SAFC Biosciences ref 14560-1000M) , meio sem soro Exceli 302 (SAFC Biosciences ref 14312-1000M) , Exceli 65319, Exceli 65421, Exceli 65625, Exceli 65626, Exceli 65627, Exceli 65628, Exceli 65629 (JRH Biosciences), Exceli MDCK SFM (SAFC-Biosciences Ref. 14581C) , Exceli MDCK Prod (Ref. M3678), Gene Therapy Médium 3 (sem componentes animais) (SIGMA-Aldrich, ref, G-9916 or Exceli GTM-3) (daqui em diante designado meio G9916), HYQ CDM4 HEK-293 (Hyclone Ref. SH30859) , HYQ SFM4 HEK-293 (HYCLONE Ref. SH30521), AEM (InVitrogen). De acordo com a primeira realização preferida, o meio sem soro N°1 e o meio sem soro N°2 são o mesmo meio. De acordo com uma segunda realização preferida, o meio sem soro N° 1 e o meio sem soro N° 2 possuem uma composição diferente. O processo totalidade ou de parte substituição por meio do invento inclui a remoção da do meio sem soro N°l, seguido da sua sem. soro N°2. No entanto, é mais 68 ΡΕ2150275 conveniente remover uma fracção substancial (e.g. até cercai de 50%) do meio sem soro N°1 e depois substitui-lo por meio sem soro N°2 enquanto se está a remover o meio 1, e.g. através de filtro com agitação. De acordo com uma realização preferida, o meio sem soro N°2 é adicionado directamente ao meio sem soro N°1 sem remoção de uma parte do meio sem soro N°l. Entre 0,25 e 10 volumes de meio sem soro N° 2 é adicionado a 1 v o 1 ume de meio sem soro N° 1. Numa realização prefe: v i Ha j_ iUa , entre cerca de 0,5 e 8 volume de me i o sem soro N°2 é adiciona do a 1 volume de meio sem so ro N° 1. Numa r e a1i z a ç ã o ma i s pi :ef ei 'iG3. r snt 1 :e c erca de 3 e b volum es de meio sem soro Nc ’ 2 é 3.0.1. (j 3.. 0 Π 3. do a 1 volume de me i o sem soro N°l. 0 meio sem soro I í°l e/ou o m eio sem soro N ° 2> podem ser suplementados com pelo menos um ingrediente seleccionado do grupo consistindo em aminoácidos, lipidos, ácidos gordos, colesterol, vitaminas, açúcares, hidrolisados de proteína de origem não animal e uma mistura dos mesmos.
Em alternativa, o processo de reolicaçã-o de um vírus do invento é um processo de bloco alimentado de bloco que compreende o passo adicional de alimentação das células com pelo menos um ingrediente seleccionado do grupo consisuindo em aminoacioos, lipidos, vitaminas, açúcares, hidrolisados de proteína de origem não animal, tensioactivo e uma mistura dos mesmos. De acordo com uma primeira realização preferida, a alimentação ocorre durante os
- 69 - esso do invento de replrcaçao de um l apenas durante os passo b) a d) ou Qurante o pass O d ). A alime ΠtdÇaO ΡΕ2150275 pcLSSOS 3.) 3. Ο. / QO pi vírus, como alternat: em alternativa apena pode ocorrer apenas numa base diária ou numa base contínua. Quando a alimentação é descontínua, a alimentação pode ocorrer uma vez por dia, mais de uma vez por dia ou menos de uma vez por dia.
Os meios SFM compreendem uma série de ingredientes, incluindo aminoácidos, vitaminas, sais orgânicos e inorgânicos, fontes de açúcar, cada um dos ingredientes estando presente numa quantidade que suporta a cultura de uma célula in vitro. No entanto, para aumentar o crescimento celular ou a produtividade virai, podem ser adicionados outros ingredientes aos meios SFM, A escolha dos aminoácidos a adicionar à cultura
n 3. cl ci através de uma análise do pelas C Θ Ll -L cl S Γ13. C altura; tal com as espécies 0-0 células, De L Ç cí O preferida, os aminoáci dos iem s er seleccio nado s do gr upo e glutamina ou uma mistura dos ma i s preferida, a glutamina O adicionada para a cultura de células EBx© de galinha e a adição da glutamina é feita durante o passo a) a d) para manter a concentração de glutamina no meio acima de aproximadamente 0,5 mM a 5 mM, de preferência entre cerca de 1 mM e cerca de 3 mM e mais de preferência cerca de 2 ΡΕ2150275 mM. Numa realização preferida, a adição de glutamina ocorre numa base contínua. É interessante que as células EBx® de pato não consomem muita glutamina, devido às células de pato terem capacidade para sintetizar glutamina. Assim, a glutamina pode ou não ser eidicionada à cultura de células EBx® de pato.
De acordo com uma realização preferida, os açúcares adicionados ao meio são seleccionados do grupo co ns is t ί ndo em D-glucose , D-sucrose e D-gala ct . o s e o u uma mi st u r 3. dos mesmos. De acordo com uma rea li . zação m ais pr ef pr· id Ά O Cl f VJ açúcar adiei onado é I i-gi ucose. A a dição de D- gl uc 0 s Θ pode ser realizad a durante o passo a) . a d), mais de pr ef pr ên C -1- ã entre b) e d) para manter a conce: ração de Ό_ gl uc 0 s θ ΤΊ 0 meio entre c erca de 0,5 g / r e z :5 g/1 G0 D- gi uc os e r de preferência e τί 1" τ' 0 Ο Ο 2? Ο a de 1 g /1 e 1 0 g/1 de Γ)_ gi uc os e r de preferência entre ce rca de 2 e 3 g/1 de D- gi uc os 6 · Nun ia realização preferid a, c i âQIÇâO d· e D-g! Luc ose oc or n uma base c o nt í nu a
De acordo com uma realização preferida, os lípidos são seleccionados do grupo consistindo em colesterol, esteróides e ácidos gordos tais como ácido palmítico, ácido palmitóleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico e seus derivad os ou uma rr iistura dos mesmos. Ma is d.e oreferêr icia, os ácidos gordos são da SIGMA- ALDRICH (Re f. F7050) e cerca de 0,35 μΐ/ml de solução de ácidos gordos é adicionado ao meio de cultura. ΡΕ2150275 teLÍs como de sódio, compensar Caso seja O meio pode ainda conter substâncias auxiliares, substâncias tamponantes como sejam o bicarbonato estabilizadores de oxidação, estabilizadores para o stress mecânico ou inibidores de proteases. necessário, pode ser adicionado ao meio um tensioactivo não iónico, como seja polipropilenoglicol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 ou PLURONIC F-108) como agente inibidor da formação de espuma. Estes agentes são geralmente usados para proteger as célu' ias dos efeito s negativos di sem uma ao i. ç a o de ter isioactivo, a bolhas de ar podem levar à dani esiaí si tu; na súper tn arejamento uma vez que, destas ) O -J- ΓΊ 3. S G td ar ("pulverização"). A quantidade de tensioactivo não iónico é, de preferência, entre cerca de 0,05 e cerca de 10 g/1, tipicamente entre cerca de 0,1 e cerca de 5 g/1. De acordo com uma outra realização do invento, a concentração de tensioactivo no meio de cultura celular pode ser modificada para adaptar (i.e. aumentar ou reduzir) o tamanho dos aglomerados de células. De acordo com uma realização do processo de replicação de um vírus do invento, a adição de meio sem soro N°2 à cultura celular, é realizada após o passo de infecção b), de preferência entre cerca de 0,5 e 4 horas após o passo b) e mais de preferência cerca de 1 nora a pós o passo b) . De acordo com uma outra realização do invento, a adição de meio sem soro N°2 à cultura celular, é realizada antes da infecção do passo b) , de preferência entre aproximadamente 0,5 e 4 horas após o passo b) e, mais de preferência cerca de 1 hora antes do passo b). De acordo ΡΕ2150275 com uma outr a realiz cLCcL O ao i nven to , a adição de meio sem soro N°2 à cultura celui .ar r O real i z aaa s r multa: neamente com o ps isso de infecção O \ • 0 P asso b ) da inf ec Ç ã O virai l e real izado a uma m. o. i (mi altiplj c i . daae de i níecção) de apro ximadamente 10 1 a 1 - ò t ma i s dc s pref erênc ia cerca de 10“2 a 10“5 e mai s de pr efer ên cia c :erca de /Λ -4 .Os f ami liarizad·: os com a ár ea d .et ermi narão a m. o. i Q >pt ima de acor do com o tipo de V í r us . No passo c) , as célu las in f ect a das são de prefer 2 4 h, pelo menos 48 h, pe lo π lenos 12 0 h, pelo 4 8 h, pelo menos 72 h, pelo menos 9 6 h, pelo menos 144 h. Quando o vírus é um poxvírus, as células infectadas são cultivadas pelo menos 144 h.
No processo do invento, a cultura celular do passo a) é re alizada através de cu lt ur a el bloco, c em blc 'CO repe tida, c ultura em bloc 0 al imentada ou c de pei :'fut ;ão. Mais d e preferência, { Li cultura ceiui passo a) é reali2 lada através Q0 cultura em alúmen tada. 0 passo de infecção b ) é realizado qu? densid aae celi alar é de pelo menos cerca de 4 milhõí ό r e f e r ênc _ r r a o milhões de células/ml í ma .is de preferê: milhões de células/ml no processo em bloco ou blocu alimentado. Quan< do se usa um processo O0 perfusao, a infecção no passo b) 1 é realizada quando a densi dade celular é de pelo menos O O milhões de células/ml. de preferência cerca de 9 a 1 0 milhões de células/ml 0 π mesmo mais eievadc ΡΕ2150275 Ο ρΗ do meio de cultura sem soro nos passo a) , b), c) e d) é de preferência monitorizado pelo biorreactor, 0 ρΗ deverá ser na gama de 6,5 a 7,8, de preferência cerca de 6,8 a 7,5 e, mais de preferência, cerca de 7,2.
No processo do invento, o passo d) dura 1 a 10 dias antes da colheita. De acordo com uma realização preferida, o passo d) dura 2 a 5 dias antes da colheita. O tempo da colheita (passo e) é definido de acordo com a densidade celular no recipiente de cultura. O inventor encontrou agora que o tempo óptimo para a colheita de vírus é dois dias após a densidade das células viáveis ter atingido o seu nível óptimo e ter começado a decrescer devido à infecção virai. A cultura celular é realizada a uma temperatura compreendida entre 32°C e 39°C dependendo do tipo de vírus. Para a produção do vírus da gripe e dos poxvírus, a infecção da cultura celular é, de preferência, realizada a
As células EBx© possuem a capacidade de crescer em suspensão com células aglomeradas em agregados esparsos de algumas células, até mais de centenas de células. Semi estar limitado por uma teoria, o tamanho dos agregados pode variar de acordo com a composição do meio de cultura celular. Por exemplo, a presença de tensioactivo como seja polipropilenoglicol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 ou PLURONIC F-108), a ΡΕ2150275 agitação, a concentração de iões divalentes, tais como Mg2+ e Ca2+ pode ter um efeito no tamanho dos agregados. 0 inventor encontrou que o rendimento virai pode ser aumentado ao permitir que as células EBx® do invento se agreguem umas às outras peLra forma aglomerados durante pelo menos o p asso a) do processo. Durante o aumento de escala de ampola mãe e ampola do banco de cél .ul as de trabalho ao longo dos vários tamanhos de frascos T 0 garrafas rolantes até aos biorreactores, as cé. geralmente passadas para um rec diluição e m meio fresco quer por .as em suspensão sao ecipiente maior, quer pela ressuspensão do sedimento de células em meio fresco invent or enco: ntrou que H urante as pass agens daí 3 célul as, γ'ρ r·» Qpjnp nd( a-se manter g ra; odes aglomerad o s de c élulas Π cL cultur ci e Para o fazer, melhor não des ) I σ Z G os agrega dos de cél .ul as de f o rrna a au .mentar a repli cação de vírus nas célula S EBx®. Por exen rpl o, durante as fases iniciais da cultur 3. do passo a) e rn frascos T ou garrafas rolant es, recomenda-se diluir a cultura celular para passar aí células para recipientes maiores e não se recomenda centrifugar m f- r im desfazer os aglomerados de células por pipetagem ou a qit a ç a o. No entanto, os aglomerados demasiados grandes podem ser subóptimos para uma produção virai elevada. Consequentemen te, os familiar izados com a área definirão se uma disrupção parcial dos aglomerados, por pipetagem ou agitação, durante as passagens iniciais das células do passo a) pode melhorar o rendimento virai. De acordo com uma realização preferida, os poxvirus e, de preferência, os vírus MVA, ALVAC e poxvirus das galinhas ΡΕ2150275 são obtidos através de um processo do invento que inclui o passo a) de proliferação de EBx® aglomeradas em agregados ruais dispersos de algumas células até mais de pelo menos uma centena células, pelo menos duas centenas de células, pelo menos cinco centenas de células, pelo menos cinco centenas de células, pelo menos um ou mais milhares de células.
Os inventores encontraram que o tamanho dos aglomerados de células, de preferência aglomerados de células EBx®, podem ser dependentes da concentração de iões Mg2+ e Ca2+ no meio de cultura celular. Para as células EBx© de pato, o meio de cultura celular de preferência contém uma concentração de Mg2+ compreendida entre 0,5 mM e 2,5 mm, de preferência cerca de 1,6 mm e a concentração de Ca2+ está compreendida entre 0,01 mM e 0,5 mM, de preferência cerca de 0,1 mM. O pedido de patente descreve o vírus obtido por um processo do invento. O presente invento também está relacionado com a vacina contendo o virus do invento, o odução de u ima vacina virai licação de um vírus de acordo e) da colh seita de v írus c< selecci onado entre fil L·I'ô.ÇgO / s t ab i1i Z S. Ç â O através da adb processo ae em que o ps menos um pas congelação 6 estabilização através da adrçao de agente estabilizador. A colheita do vírus é realizada de acordo com tecnologias conhecidas dos familiarizados com a área. De acordo com uma realização preferida, o passo de colheita b - ΡΕ2150275 do refe rido víru s compreende colhe: ita do ε ÍO.orenaGân te da cultura celular o bti .do a partir da c entrifug; ação oa cu íltura celular , seguido de fi 1tração, concentração , congela ção 0 e s t ab i1: Ização da pr* eparação de viru s atravé s da adiç âO de agentes estabiliz ;ador. Por exemplo, para o vírus oa gri pe ver Furminger. in Ni cho lson, Webster 3. Π ô. H s y (Eds) Textbo ok of infli jenza, cap í tu ulo 24 pp32 4-332. 0 processo de produção de uma vacina virai de acordo com o invento pode igualmente compreender o passo adicional de inactivação do vírus colhido. A inactivação é, de preferência, realizada através de tratamento com formaldeído, beta-propiolactona, éter e detergente (i.e. como seja Tween 80™), brometo de celil-trimetil-amónio (CTAB) e Triton N102, desoxicolato de sódio e tri(N-butil)fosfato.
De acordo com uma outra realização, o pedido de patente descreve um processo de preparação de proteínas antigénicas virais a partir de vírus obtido por um processo do invento, o referido processo compreende os passos adicionais de: a) facultativamente, incubação do sobrenadante de cultura celular compreendendo a totalidade do vírus com uma enzima de restrição de ácido desoxirribonucleico, de preferência DNAses (ver a classificação EC3.1.21 e EC3.1.22) e nucleases (ver a classificação EC3.1.30 e EC3.1.31). De preferência, a enzima de digestão de DNA é a benzonase (nucleasse Benzon) ou DNase I; ΡΕ2150275 catión icos, sem limitação: sal de cet il como se j a CTAB, sal de miristil- -trime ectina , DO Tf IA e Tween™; b) adição de detergente catiónico. São exemplo; de detergente; isolamento de proteínas antigénicas. Este pode ser rea lizado por centrifugação ou ultrafiltração. 0 vírus da vacina pode estar presente como partículas de vírus intacto ou como partículas de vírus desintegrado. De acordo com. uma realização, a vacina é uma vacina morta ou inactivada. De acordo com uma outra realização, a vacina é uma vacina viva atenuada em. que as referidas vacinas compreendem, principalmente sobrenadante da cultura de células EBx obtido pelo processo do invento, de preferência sem soro, facultativamente filtrado e/ou concentrado e compreendendo o referido vírus. De acordo com uma terceira realização, a vacina compreendendo proteínas antigénicas virais obtidas a partir de um vírus preparado de acordo com o processo do invento. 0 invento tornei. possível proporcionar uma vacina compreendendo uma linha de células EBx® infectadas, de preferência EBx® de pato, obtida por um processo do invento e em que a linha celular EBx® infectada, de preferência EBx® de pato, é colhida no passo d), A vacina pode compreender o vírus em combinação com substâncias aceitáveis em termos farmacêuticos que ΡΕ2150275 aumentam a resposta imune. Exemplos não limitantes de substâncias que aumentam a resposta imune compreendem adjuvante incompleto de Freund, saponina, sais de hidróxido de alumínio, lisolectina, polióis plutónicos, polianiões, péptidos, bacilos Calmette-Guerin (BCG) e Corynebacterium parvum. QS-21 é um exemplo de adjuvante sintético. Ainda, proteínas imuno-estimuladoras (interleucinas IL1, IL2, IL3, IL4, IL12, IL13, factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos, ...) podem ser usadas para estimular a resposta imune à vacina. A vacina é, de preferência, uma formulação líquida, uma preparação congelada, uma preparação desidratada e congelada, facultativamente adaptada à administração por V 1. 3. Í Π L, .ΊΓ 3 Γ13. S 3 1. » A vacina é usada para o tratamento profiláctico e/ou terapêutico de um ser humano ou animal infectado por um vírus anteriormente referido. De preferência, a vacina virai é usada de preferência para o tratamento profiláctico e/ou terapêutico de um ser humano infect 3CÍO por um vírus seleccionado entre os V1IUS Q. 3 VdriOiâ^ gr ipe, sarampo, papeira, rubéola, RSV. Como alternativa, 3 v a c r na é, de preferência, usada para o tratamento profiláctico e/ou terapêutico de um animal infectado por um vírus seleccionado entre vírus da gripe, vírus da doença de Newcastle, vírus da síndrome de queda da postura, doença infecciosa da bursa, vírus da bronquite infecciosa, vírus da diarreia canina, vírus da anemia das galinhas. A vacina 79 ΡΕ2150275 virai recombinante do invento pode igualmente ser usada para o tratamento profiláctico e/ou terapêutico de doenças crónicas tais como cancro e doenças infecciosas tais como SIDA.
As linhas celulares EBx© são úteis para gerar e produzir virus resultantes de redistribuição de segmentos genómicos. Os vírus com um genoma segmentado, como seja o virus da gripe podem sofrer redistribuição dos segmentos. Quando da infecção simultânea de células EBx© com pelo menos duas estirpes diferentes de vírus da gripe, na mesma célula hospedeira existe uma mistura, de genomas segmentados de duas estirpes diferentes. Durante a montagem dos vírus, todas as combinações de segmentos genómicos podem ser teoricamente geradas. Vírus específicos com redistribuição de segmentos podem assim ser isolados através da selecção ou eliminação de vírus, com um anticorpo por exemplo, com as característrcas pretendidas (Ver Kilnourne E.D em Plotkin SA and Mortimer E.A. Eds, Vaccines 1994). As linhas e produzir Natl. Acad. , j. Vir o í. (1989) ) . celulares EBx® são igualmente úteis para oerar vírus por genética reversa (Ver Enami, Proc. Sei. USA, 87:3802-3805 (1990); Enami et Palese 65:2511-2513 (1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113 u presente pedido de patente descreve o uso de Imhas celulares EBx© do invento como um substrato celular para razer a titulaçao de vírus. As células EBx© subouituirão errcientemente o actual sistema celular, como sejam ovos embrionados, CEFs, células DF1 e outros, usados - 8 0 - ΡΕ2150275 para determinar o título de uma solução virai. De prefe φΟΙΟ50 rência a titulação virai é realizada pelo métodc (Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty pereent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97). O presente pedido de patente descreve o uso de linhas celulares EBx© do invento como um substrato celular para realizar ensaios sanitários. O pedido de patente descreve a composição para diagnóstico contendo vírus do invento ou constituintes dos mesmos.
Os exemplos abaixo explicam o invento ma is detalhadamente. As preparações e exemplos que se seguem são dados para permitir aos familiarizados com a área mais facilmente compreenderem e realizarem o presente invento. O presente invento, no entanto, não está limitado no seu âmbito pelas realizações exemplificadas, as quais pretendem > t r ativa .s apenas de aspec t O o 1 ki5 kJ ~ Lados do inventí qu' e são funcionalmer ite eq uivalentes es tão dentro do dO rnr rento. De f d V-' L- 0 f várias mo ci ifreações do para além das ciCpJ. í descri tas, torneLr-se “ ao s para os familiar izados com a área a partir da 0 dada e dos dese: nhos juntos. Tais modificaç ões -S' e a estar dentre : do âmb i t o das i eivindicac ões apensas. Para o restante da descrição, será feití referência à legenda das figuras abaixo. 81 ΡΕ2150275
FIGURAS FIGURA 1; Células EBx de galinha independentes de ancoragem
Figura IA: Células EBvl3 de galinha Valo independentes de ancoragem em meio sem soro. Células EBvl3 foram cultivadas a 37 °C em suspensão em meio sem soro Exceli 65319 (SAFC). As células Ebvl3 possuem um tamanho homogéneo e crescem como aglomerados esparsos em cultura. 0 tempo de duplicação da população é de aproximadamente 16-18 horas e a densidade celular atingida nos frascos de agitação foi de 4-5 milhões de células/ml.
Figura 1B: células EB Line 0 de galinha independentes de ancoragem em meio sem soro. Células EB Line 0 foram cultivadas a 39°C em suspensão em meio sem soro Exceli 66444 (SAFC) . As células EB Line 0 possuem um tamanho homogéneo e crescem em aglomerados esparsos. FIGURA 2: Células Rbvl3 de galinha Valo expressam niveis elevados de telomerase
As células Ebvl3 na passagem pl93 expressam níveis elevados de telomerase na mesma ordem de grandeza das células de galinha EB14-o74 (ver W003/076601) na passagem pl64 (Banco de células mãe: MCB) ou na passagem pl84 (Banco de células de trabalho: WCB) . Células estaminais embrionárias de murganhos (MES) foram usadas 82 ΡΕ2150275 como controlo positivo e os fibroblastos de murganho (FED) foram usados como controlo negativo. FIGURAS 3A e 3B: Susceptibilidade de Ebvl3 de galinha Valo a poxvírus 106 SFM com MVA- Uma
EbvlS (passagem 188) foram semeadas a 0,4 x células/ml em frascos F175 de 100 ml em 40 ml de meio Exceli 653i9 ou meio SFM G9916 (SAFC) suplementado glutamina 4 mM. O crescimento celular e infecção com GFP (MOI 10-2 TCIDso/célula) foram realizados a 37°C. hora pós-infecção, adicionou-se 60 mi de meio fresco.
Figura. 3Ά: cinética d densidade celular em meio SFM Exceli 65319 ou meio SFM G9916 (SAFC).
Figura 3B: produtividade de MVA expressa em TCIDso/ml em meio SFM Exceli 65319 ou Mero SFM G9916 (SAFC). FIGURA 4: Análise por microscopia electrónica de transmissão de células Sbx de pato A anáLlrse por microscopia electrónica de transmissão de células dEBx foi realizada pelo Dr. A Rivoire (Lyon, France) . As células Ebx de pato apresentam morfologia típica de células estaminais embrionárias (i.e. elevada proporção núcleo-citoplasma) que se assemelha ao tenóripo de células estaminais embrionárias murinas e às 83 ΡΕ2150275 W02006/108846 . As células s redondas com núcleo e pequenos prolongando-se a ião metabolicamente muito células VIVALIS EB14 descritas em Ebx de pato são células pequené nucléolo grandes, com pseudópodes partir da membrana plasmática. ; activas com um citoplasma rico em ribossomas e mitocôndrias. FIGURAS BA e 5B: A expressão de telomerase em linhas celulares Ebx de pato foi investigada usando o kit de detecção da telomerase da Roche (Telomerase OCR ELISA),
Figura 5A: A telomerase encontra-se altamente expressa em diferentes linhas celulares EBx aderentes de pato tal como nas células Ebvl3 de galinha. As células epiteliais de pato usadas como controlo negativo não expressam telomerase.
Figura 5B: Durante o processo de estabelecimento das células EBx de pato em suspensão, mantém-se um nível elevado de expressão de telomerase. 0 nível elevado de telomerase foi estudado em células EBx de pato durante a ausência de células de suporte (com ou sem células de suporte), durante o processo de adaptação das células EB26 de pato a suspensão e após remoção do sor de dEB24 e dEB26. As células EBx de pato, tais como EB24 e EB2 6, expressam nível elevado de telomerase tal como as células EB14 de galinha. As células EB66 de pato também expressam níveis elevados de telomerase (Dados não apresentados). 84 ΡΕ2150275 FIGURAS 6A e 6B: As células EBx® de pato não apresentam actividade de transcriptase reversa endógena
Figura 6A: A expressão de transcriptase reversa endógena foi estudada por análise F-PERT directa (Lovatt et al. , 1999f J. Virol. Methods, 82:185-200) in Clean Cells (FRANGE) . As linhas celulares EBx® de pato, EB26 e EB5-1, não apresentam actividade de transcriptase reversa (RT) endógena. Foram detectados níve is elevados de actividade RT em culturas de células EB14 e Ebvl3 de galinha (em diferentes passagens) as sim como, em menor grau, em fibroblastos embrionários de galinha (CEF) derivados da estirpe de galinha sem patogénicos específicos (SPF). As células CEM, as quais são negativas para RTase, foram usadas como controlo negativo para estabelecer o limite de deteccao do ensaio.
Figura 6B: A presença de partículas de retrovírus endógeno, replicativo (í.e. competente para a replicação) ou não replicativo, no sobrenadante de cultura celular de células EBx de pato e galinha foi investigada por um ensaio de ELISA que detecta o principal antigénio da cápside da leucose aviária P27, As linhas celulares EBx de pato, EB26 e EB5-1, assim como Ebvl3 de galinha não secretam o antigénio ALV p27. Pelo contrário, as células EB14 de galinha expressam o antigénio ALV P27.
FIGURAS 7A e 7B: As células EBx de pato não secretam virus da leucose aviária (ALV) replicativo. O 85 ΡΕ2150275 ensaio de co-cultura de células EBx de pato com a linha celular QT6 de codorniz,, conhecida por ser sensível a ALVs endógenos e exógenos, foi realizado em Bioreliance (UK) para detectar a presença de virus de pato endógenos replicativos. .gura 7A: descreve pnnc da co-cultura QT6. de virus replicativo é que detecta o principal.
Figura 7B: A presença detectada por um ensaio de ELISA cose aviaria p2 antigénio da cápside 0 ensaio demonstra que nenhuma das células EBx© de pato testadas (dEB26 e dEB51) secreta ALV replicativo. Virus RAV-1, que é conhecido por se replicar em QT6, foi usado como um controlo positivo. FIGURA 8: Expressão na superfície celular de receptores Sacc2-3 e Saa2-6 em linhas celulares EBx de pato e EB14 de galinha
As células foram incubadas com lectinas marcadas com digoxigenina: a lectina aglutinina de Sambuca nigra liga-se especificamente a Sia2-6Gal, enquanto a lectina aglutinina de Maackia amurensis liga-se especificamente a Sia2-3Gal. As lectinas que se ligam as células são reveladas com anticorpo anti-digoxigenina marcado com FITC de acordo com. técnicas bem. conhecidas dos familiarizados 86 ΡΕ2150275 com a área. As células marcadas com FITC são contadas com um separador de células fluorescentes (FACS). As moléculas Saa2-3 e Saa2-6 são descritas como sendo os receptores dos vírus da gripe aviária e humana, respectivamente. Quase todas as células EBx de pato expressam níveis elevados dos receptores da superfície celular Saa2-3 e Sac*2-6.
t>X:QV>3.uã.GeLO <20 VlXrUS células EBx de pato infectadas
Figura 9A: EBx® de pato foram deixadas formar pequenos aglomerados em frascos de tanques de agitação T175 durante a proliferação celular num meio de crescimento celular SFM. Os aglomerados foram então infectados com. 10-2 TCID50/célula de vírus MVA-GFP e a mistura foi diluída em meio SFM para produção. Durante um período de propagação de 6 dias a 37°C, foram tiradas diariamente fotografias de células infectadas expostas a IJV. MVA foi atingido ao dia 4 ., as células infectadas O pico de infecção por pós-infecção (pi) . No dia 6 p. começaram a morrer. 4 milhões
Figura 9B: Titulação do vírus MVA-GFP propagado em células EBx® de pato num biorreactor de bloco alimentado de 3 1. (Painel esquerdo) Deixou-se que a biomassa derivada de EBx de pato acumulasse durante a fase de proliferação celular em meio de crescimento Exceli (SAFC) . No dia 4, a densidade celular atingiu 4 milhões de células/ml. As 87 ΡΕ2150275 células foram então infectadas com 10-1 TCIDso/célula de vírus MVA-GFP e a mistura foi diluída em 1,5 1 de meio
Exceli. Durante um período de propagação de 6 dias a 37°C, as amostras foram colhidas diariamente e a titulação por TCID50 (Painel da direita) foi realizada no final da cinética. Uma produção de 8,5 log TCID50/ml foi atingida às 4 h p.i. correspondendo a um rendimento de 205 TCIDso/célula. FIGURA 10: Influência da concentração de cálcio e magnésio em meio SFM no tamanho de aglomerados de células EBx®
D 7\ . \j ri · Célui as Ebvl 3 de galinha f oram meio SFM de SA FC Biosciences qu e centração elevada de iões cálcio (Caz+) magr iésio (Mg2"); n este meio, as cél ulas gran des em cultura. Três dias após ter iltux :a das células co m o mesmo meio SFM d.
(0,03 mM compreendendo uma concentração mais baixa de C tmal) e Mg" (1,6 mM rmal) , as células formam agregados mais pequenos.
Figura 10B: Céxuias EB24, EB26 e EB66 de pato foram primeiro cultivadas no meio SFM da SAFC Biosciences que compreende uma concentração elevada de iões cálcio (Ca' ) (Aprox. U,79 mM) e magnésio (Mg21) ; neste meio, as células produzem grandes agregados em cultura. Três dias após ter mudado o meio de cultura das células com o mesmo 88 ΡΕ2150275 meio SFM compreendendo uma concentração mais baixa de Ca2+ (0,03 mM final) e Mg2" (1,6 mM final), as células formam agregados mais pequenos. FIGURAS 1L& e 11B: Produção de virus da gripe estirpes A em células EBx de pato em biorreactores de 3 1 A biomassa de EBx© de pato foi deixada, acumular a 37°C durante a fase de proliferação celular num meio de crescimento celular. As células foram então infectadas com 1Q“4 TCIDSO/célula de virus da gripe A/HINl/Beijing/262/95 ou A/H3N2/New York/55/2004, a mistura foi diluída em 1,5 1 de meio de produção Exceli suplementado com 0,75 USP/ml de tripsina e a temperatura foi baixada para 33°C. Durante um periodo de propagação do virus de 14 dias, colheram-se amostras diariamente e guardaram-se a -80°C.
Figura 11A: Cinética de crescimento de células EBx de pato infectadas com a estirpe de vírus da grjpo A/H1N1/Beijing/262/95
Painel da esquerda: Densidade celular π J· \ -*- Y-1 O 0.1 i Lj CJ ^ ¥i 106 células.ml-1) e título virai em log TCID50/ml.
Painel da direita: Número total de céiuiao (quadrado), viabilidade (círculos a cheio, %) e n tração de hemaglutinina em yg/ml (círculos vermelhos s-) O rendimento virai atingiu 2 0 yg de hemaglutinina por ml de sobrenadante de cultura. ΡΕ2150275
Figura 11B: Cinética de crescimento de células EBx de pato infectadas com a estirpe de vírus da gripe A/H 3N2/New York/55/200 4 da esquerda: Densidade e título virai em log painei 10 6 c é1u1a s.ml-1 c e 1 u 1 a. r (1 o s a n g o, TCID50/ml. x (quadr tração
Painel da direita: do) , viabilidade (círcul de hemaglutinina em pg/ml Número total de células os a cheio, %) e concen-(círculos vermelhos, %). laglutininc O rendimento virai atingiu 30 pg de por ml de sobrenadante de cultura. FIGURA 12: Produção de vírus da gripe estirpe B em células EBx de pato A biomassa de EBx© de pato foi deixada acumular a 37°C durante a fase de proliferação celular num mero de crescimento celular. As células foram então infectadas com 10-3 TCIDso/célula de vírus da gripe B/Ji angsu/10/20 0 3, a mistura foi diluída em 1,5 1 de meio de produção Exceli suplementado com 0,75 USP/ml de tripsina e a temperatura foi baixada para 33°C. Durante um período de propagação do vírus de 14 dias, colheram-se amostras diariamente e guardaram-se a -80°C.
Painel da esquerda: Densidade celular (losango, x 106 células.ml-1). - 90 - ΡΕ2150275
Painel da direita: Número total de células (quadrado) , viabilidade (circulos a cheio, %) e concentração de hemaglutinina em yg/ml (circulos vermelhos, %). O rendimento virai atingiu 25 yg de hemaglutinina por ml de sobrenadante de cultura, FIGURA 13: Análise da produtividade de NDV e da expressão virai em células EB66 de pato em suspensão (MOI 10-3, 0,75 USP/ml de tripsina) AS célu -i_ a s EBx de pato e de gali nha são sens í ve i s 0 repl ica im a Θ S t -1. rpe NDV La Sota . Os ti tu) LOS (em TCIDsn /m 1) de NDV Pi :odu zidos Cijrj cél ulas EB6 6 de pato d ui rente im de s de r' vV di a 0 at Θ a o dic a 2 pi para at ingir urna ΡΊ.0 di a de 1 0 6, 8 3 TC IDso/ml (Fi gura 13 Painel esque rdo) , A análi .se de transier ência s We ste rn ( Fiai i Tc 13
Painel direito) mostrou expressão das proteínas virais de NDV (HN, Fo/F, NP & Μ), A composição de proteínas virais do virus NDV produzido em células EB66 de pato é semelhante à obtida com virus NDV produzido em células EB14 de galinha. Ainda, a cinética de libertação de virus produzidos em células EBx de galinha e de pato é semelhante. FIGURA 14: Análise da replicação de virus do sarampo recombinante em células EB66 de pato em suspensão (MOI 10-1 ou 10-2) em frascos de cultura de tecido em meio 91 ΡΕ2150275 sem soro. As células EB66 de pato são pelo menos tão sensíveis quanto as células Vero à infecção pelo vírus do sarampo. Os títulos (em TCID50/ml) de vírus do sarampo recombinante expressando a proteína fluorescente verde (GFP) produzidos em células EB66 de pato atingiram 107 TCIDso/ml. no dia 6 pós-infecção. FIGURAS ISA e 15B: Expressão de SSEA-1, EMA-1 & telomerase em células EB66 de pato A expressão da telomerase em diferentes passagens de EB66 de pato cultivadas em garrafas rolantes foi estudada usando o kit de detecção da telomerase dai Roche EMA-1 em diferentes (Telomerase OCR ELISA). SSEA-1 passagens de EB66 de pato cultivadas em garrafas rolantes foram estudados por análise de FACS.
Figura 15A: Observou-se que a telomerase é altamente expressa na linha celular EB66 de pato em diferentes passagens (138, 144, 147, 150, 154).
Figura 15B: Encontrou-se que os marcadores da superfície celular SSEA-1 e EMA-1 são altamente expressos na linha celular EB66 de pato em suspensão em diferentes passagens (138, 144, 147, 150, 154). FIGURA 16: Análise do cariótipo das células EB66 de pato 0 cariótipo células EB66 de pato foi 92 ΡΕ2150275 realizado por Pr. Franck, Lyon. As células EB66 são células diplóides,
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Linha celular Ebvl3 de galinha
derivada de galinhas SPF estirpe VALO
1.1- MATERIAL DE PARTIDA
Ovos
Estirpe sem patogénios específicos (SPF) designada Valo. A estirpe Valo é uma, estirpe Leghorn branca produzida e distribuída por Lohmann da Alemanha. Os ovos de galinhas SPF, fornecidos com um certificado de análise, foram testados para: CAV, adenovírus aviários (grupo 1, serotipos 1-12 e grupo 3) , EDS, vírus da encefalomielite aviária, vírus da leucose aviária/RSV (incluindo o serotipo ALV-J), vírus da nefrite aviária, retrovírus aviário, poxvírus das galinhas, vírus da bronquite infecciosa, vírus da bursite infecciosa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa, vírus da gripe Tipo A, vírus da doença de Marek, micoplasmose (Mg + Ms) , Mycobacterium avium, vírus da doença de Newcastle, vírus da reticulo-endoteliose, Salmonells pullorum, infecções por outras salmonelas, vírus da rinotraqueíte aviária (ART), Hemophilis paragallinarum. Os ovos das galinhas Valo foram apenas submetidos a uma desinfecção com o descontaminante para evitar qualquer 93 ΡΕ2150275 manipulação de ovqs risco de contaminação associado durante o transporte. Células de suporte JNO primem de células Ebvl3, células de origem murina (células STQ) foram usadas como camada de suporte para manter a pluripotência das células estaminais de galinha. As células de suporte foram mitoticamente inactivadas por irradiação gama (4o a 55 Grays) antes da sementeira em plástico. Esta dose de irradiaçao e uma dose suioletal que induz unia paragem definitiva do ciclo celular mas ainda permite a produção ae fa.ctores Qe crescimento e da matriz extra-celular, necessária para a promoção do crescimento celular de células diferenciadas. A linha de células STO foi obtida por A. Bernstein, Ontario Câncer Institute, Toronto, Canada a partir de uma. linha contínua de fibroblastos embrionários de murganhos SIM (murganhos singeneicos Sandos) e foi fornecida pela American Type Culture Collection (ATCC) (STO Número do produto: CRL-1503, Lote número 1198713). Camadas de células de suporte frescas foram preparadas duas vezes por semana, em geral na segunda-feira e quinta-feira. Células em crescimento exponencial foram dissociadas e contadas. Uma parte das células foi semeada para manutenção de culturas viáveis e a outra parte foi irradiada, para a irradiação, preparámos uma suspensão de células de 10x106 células/ml em tubos. As células foram expostas a uma dose ΡΕ2150275 94 de 45 a 5 5 Grays e foram semeadas em pláLStico. Após sementeira, as placas X GV6 Sti Q. cl S com célc ílas de si jporte inactivadas foram usada s durante um máximo c ie 5 dias. DMEM- HamF12 (Cambrex, Cat n° BE04-687) Meio Optipro (Invitrogen, Cat n° 12309) EX-CELL™ 65195,60947 e 65319 :abricado por encomenda) / Q A trr· ^ Orir j
Aditivos 602E) 114 E)
Glutamina (Cambrex, Cat n° BE17-605E) Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat n° BE17- Aminoácidos não essenciais (Cambrex, Cat n° BEI 3- Piruvato de sódio (Cambrex, Cat n°BE13-115) Vitaminas (Cambrex, Cat n° 13-607C) Beta-Mercaptoetanol (Sigma, Cat n° M7522)
Tampões e fixadores PBS IX (Cambrex, Cat n° BE17-516F) Pararormaldeido 4% (Sigma, Cat n° P6148) KCI 5,6% (Sigma, Cat n° P9333) Metanol/ Ácido Acético (3/1): Metanol (Merck, Cat n° K34497209 ; Ácido acético Sigma Cat n°A6283) Colcemida, Karyomax (Gibco, Cat n° 15212-046) ΡΕ2150275 95 Ά /ύ£άτλ f™ £2 ητ*Ί γϊτϊ γγϊ i~ i&f** t" γϊύ* D2650)
Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, Cat
Foram usados dois factores recombinantes diferentes:
Factor neuro trófico ciliar humano recombinante :protech T n ^ Cat n° 450-13) Factor tipo insulina human I (IGF1) (Peprotech i° 100-1 1)
Soro fetal bovino
Soro fetal bovino não irradiado (FBS) (JRH, Cat n0 12103) 0 soro não irradiado usado no programa foi produzido nos Estados U n ido s . Os animais usados para 0. colf ! Θ 11 â . foram, inspe ccionados pela USDA Θ dC0ltt;S para ab ate. Foi adicionado ao meio durante a cultura de célu 1 a s estí aminai: 3 aviárias. Este 1o te não fo i £ submetido a irradiação para evitar a destruição de proteínas criticas ou componentes identificados como essenciais para a manutenção das células estaminais em cultura. ΡΕ2150275 - 96 -
Soro irradiado (JRH, Cat n° 12107) 0 lote irradiado usado neste programa foi também colhido nos Estados Unidos. Este lote irradiado foi adicionado como suplemento meio DMEM usado para a cultura de células STO ou FED (células de suporte) . Aquelas células não requerem como células estaminais uma qualidade especifica de soro para crescimento e manutenção em cultura. Para minimizar a concentração elevada de soro no meio adaptámos as células STO ao crescimento na presença de apenas 4% de FBS.
Agentes de dissociação; - Pronase (Roche, Cat n° 165 921} A pronase é uma protease recombinante produzida pela Roche Diagnostics, Alemanha, usada para a dissociação de células estaminais aderentes de aves. - Tripsina EDTA (Cambrex, cat n° ΞΕ17-161E)
Usou-se tripsina para a dissociação de células STO ou FED e nas últimas passagens para a dissociação de células aviárias adaptadas a meio sem soro. Esta enzima de origem porcina é produzida assepticamente de acordo com condições de referência cGMP por um método de filtração estéril validado e testado de acordo com E.P. corrente. 0 material de partida, irradiado antes da formulação é 97 ΡΕ2150275 testado relativamente a parvovírus porcino em cumprimento estrito de 9/CFR 113.53. - Solução de dissociação celular não enzimãtica (Sigma, Cat N° C5914)
Este agente de dissociação é uma formulação pronta a usar para descolar suavemente células da superfície de crescimento do recipiente de cultura. A fórmula não contém proteína e permite o descolamento das células sem o uso de enzimas. As proteínas celulares são preservadas tornando possível os estudos imunoquímicos que são dependentes do reconhecimento de proteínas da superfície celular. Esta enzima foi usada para. destacar as células antes da análise por FACS de marcadores biológicos tipo EMA-1 (Antigénio da membrana epitelial 1) e SSEA1 (antigénio embrionários específico de fase 1). 1.2 - PROCESSO DE ESTABELECIMENTO DA LINHA CELU- LAR EBV13
Os ovos foram abertos, a gema separada do albúmen durante a abertura. Os embriões foram removidos da gema directamente com a ajuda de uma pipeta de Pasteur ou com a ajuda de um papel de filtro absorvente pequeno (papel Whatman 3M) , cortado na f o rma de um anel perfurado com a ajuda de um punção, o diâmetro da perfuração foi de aproxi-madamente 5 tom. Estes pequenos anéis foram esterilizados usando calor seco durante cerca de 30 minutos numa estufa. 98 ΡΕ2150275 'sso de vifelino, foi colhido com uma pipeta dc E°'e Pe(3ue-o anel de papel foi depositado na superfície da gerna e centrado no embrião que ficou assim rodeado pelo anel de papel. Este último foi então cortado com a ajuda de um pequeno par de tesouras e a totalidade removida foi colocada numa placa de petri, cheia com PBS ou com soro fisiologico. o embrião assim removido pelo anel foi limpo do excesso de gema no meio e o disco embrionário, assim livre do exces:
Pasteur.
Os embriões de galinha Valo foram colocados hum tubo contendo meio fisiológico (PBS IX, Tris Glucose e similares). Os embriões Valo foram então mecanicamente dissociados e inoculados numa camada de células de suporte STO em meio de cultura completo a 39°C. As células de suporte foram semeadas em frasco a cerca de 2,7 x i q4 células/cmb 0 meio de cultura completo é composto por meio basal comercial DMEM-Ham F12 suplementado com 10% de soro fetal de vitela, com IGF1 e CNTF numa concentração final de 1 ng/ml e com 1% de aminoácidos não essenciais, com 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, comi piruvato de sódio numa concentração final de 1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,2 mM, glutamina numa concentração final de 2,9 mM, com uma mistura inicial de antibióticos contendo penicilina numa concentração final de 100 U/ml e estreptomicina numa concentração final de 100 yg/ml. Rapidamente após as primeiras passagens das células, a mistura de antibióticos deixa de ser adicionada ao meio. A expressão "rapidamente" é entendida como significando após as primeiras 3 a 5 passagens em geral. - 99 - ΡΕ2150275
Quando as células E S aviárias de ; embriões de galinh a Valo são ps ssadas de uma plaLca de culturai para Λ1ΤΓ T Í3 ^ ^ W -L. WL f a sementeira das placa s de cultura foi realizadei o ro i—r o cerca de 7 X 104 / cm2 e 8 x 104/cm2 d as células ES a vi árias no meio de cultura completo. De ym K' referência, 3. sementei ra é feita com cerca de 7,3x10 4 / 2 ia / cm (4 x 106 cél ulas/ 5 5 c,m2 ou 4 x 10D células/placa de 100 mm). As cél ulas aviári 3. S ^ de preferência as célul . 3. S embrionár ias a vi árias do pass Q a) são cultivadas du rante vár ias pas sagen s em meio com pleto. Na passagem 15, meio compl eto f o i desp >ro vi do dos f; actores de crescimento TGF1 e CNTF . A dep leção feita direct amente num passo, de uma passagem p ara 0111" ra. A s célu .1. â S e s t ami n a i s emb r i onári a s, de preferênc .1 â f Ά Q cél u i. ã S θ ΓΤ1 b r i o Γ13..1 rias aviárias são cul + ~ ^ /adas dura nte várias passagens no meio completo sem os iactores de crescimento IGF1 e CNTF,
Em seguida a remoção das células de suporte foi realizada após a depleção dos factores de crescimento IGF1 e CNTF através de uma redução progressiva da concentração das células de suporte ao longo de várias passagens. Praticamente, a mesma concentração das células de suporte foi usada durante 2 a 4 passagens, subsequentemente usou-se uma concentração mais baixa das células de suporte durante mais 2 a 4 pas sagens etc 0 frasco foi originalmente semeado q jrj ç&rc a de 2,7 x 104 células de suporte/cm2, depois cerca de 2,2 x 104 células de suporte/cm2, depois cerca de 1,8 x 104 células de suporte/cm2, depois cerca de 100 ΡΕ2150275 a rte/cib , depois cerca de i,l x 1 o4 aepor s cerca de O K.O X 104 célu 1 a s cerca de 0,5 X 104 células de semeara m-se fra scos c om 6,5 x 1 o4 x 104 células aviári as/cm2 e sem depleção das células de supo rte ssagem 21 e ter minou por volta da .epleção das céli alas de suporte, as Valo fo ram seme adas e m frascos de :ão mais baixa do que no passo a) , a s/cm2 a 5 x ' L O4 cé] ..ulas/cmó. Na células de suporte/cnf de suporte/cm", depoi suporte/cm2. Era seguic células aviárias a 7,5 x 1 ES de gali a uma conc( e 4 x 104 ; de a s cél ;rca ES Valo não estarem em boa forma após uma redução da concentração de células de suporte no frasco, em. seguida as células aviárias foram cultivadas durante mais passagens com a mesma concentração de células de suporte antes de prosseguir com a remoção das células de suporte. A depleção de soro foi realizada após a depleção dos factores de crescimento e das células de suporte. No : Ç O 0.ci depleção de soro, o meio de cultura era compo sto meio basal comercial DMEM-HamF 12 suplementado com i n 2- 1 v a soro fetal de vitela e com 1% de aminoáci .dos no. o essenciais, 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, com piruvato de sódio numa concentração final de 1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,2 mM, glutamina numa concentração final de 2, 9 mM. As células de galinha Valo foram adaptadas ao crescimento num meio de cultura sem soro num processo de dois passos: primeiro, as 101 ΡΕ2150275 células de galinha Valo foram rapidamente adaptadas a um meio de cultura composto por meio comercial sem soro (SFM), de preferência ExCell 60947 (SAFC Biosciences) suplementado com 10% de soro fetal de vitela e com 1% de aminoácidos não essenciais, com 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, com piruvato de sódio numa concentração final de 1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,2 mM, glutamina numa concentração final de 2,9 mM. Uma vez efectuada esta rápida adaptação a um novo meio (DMEM-HamF12 para Exceli 60947), foi realizado um segundo passo cons istindo numa adapta ção lenta a concen . t T. Q. Ç ões de cr escentes de soro animal em. me i o SFM . A depleção de s oro f o i realizada atravé is da re duç ão pr ogressiva começando com -j /o o. de soro, depois Ί R 9-/ / O O / dep ois 5 c O f depois 2,5%, dep ois 1,25 %, depois com 0, 7 5 % de sor o em i me i < d de cultura celu lar SFM para atingir 0% de soro em meio de cultura celul ar S FM. A de ipleção de soro começou na pass agei m 103 e terminou na pass agem 135.
No final do processo de privação de soro quando a concentração remanescente de soro no meio SFM era 0,75% ou 0%, iniciou-se a adaptação das células EBvl3 dependentes de ancoragem à cultura em suspensão. Entre as várias tentativas realizadas para isolar os isolados EBvl3 independentes de ancoragem, 62,5% das tentativas foram bem sucedidas e permitiram obter isolados diferentes de células EBvl3 em suspensão. Um isolado de células EBvl3 foi seleccionado de acordo com ao tempo de duplicação da população (cerca de 18 h), a concentração celular óptima no ΡΕ2150275 frasco de cultura (c erca de 4 milhões de células/ml), a viabilidade celular, a homogeneidade cia cultura celular (presença e tamanho dos aglomerados de células) e a facilidade de manipular as células (Figura 1),
No final da depleção de soro, as células Valo de galinha dependentes de ancoragem, designadas EBvl3 foram capazes de crescer na ausência de factores de crescimento, na ausência de células de suporte, em meio sem soro. As células EBvl3 foram então adaptadas a crescimento a 37°C, através do decréscimo progressivo da temperatura da cultura celular em. 0,5°C/dia. EXEMPLO 2: Linha celular EB Line 0 de galinha a partir de galinha SPF estirpe ELL-0
2.1 - MATERIAL DE PARTIDA
Ovos A estirpe ELL-0 (East Lansing Line 0) de galinhas sem patogénicos específicos (SPF) foi fornecida pelo Avian Disease and Oncology Laboratory (USDA-ARS-MWA, USA) . Os ovos de galinha SPF, são produzidos a partir de um bando testado intensivamente para vários agentes patogénicos de galinhas. As doenças testadas incluíram: Salmonella pullorum, Salmonella gallinarum, mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, vírus da leucose aviária A-D e J, vírus da doença de Marek, vírus da reticulo-endoteliose, - 103 - ΡΕ2150275 adenovírus aviário,· viras da bronquite infecciosa, vírus da doença infecciosa da bursa, vírus da gripe das aves, vírus da doença de Newcastle, vírus da encefalomielite aviária e reovírus aviário. Os ovos de galinhas Line 0 foram apenas submetidos a desinfecção com o descontaminante para evitar qualquer risco de contaminação associado à manipulação de ovos durante o transporte. Células de suporte
No primeiro de E.b Line 0, células usadas como camada de passo do processo de estabelecimento de origem murina (células STO) toram suporte para manter a pluripotêncra das células estaminais de galinha. As células de suporte foram mitoticamente inactivadas por irradiação gama (45 a 55 Grays) antes da sementeira em plástico. Esta dose de irradiação é urna dose subletal que induz uma paragem definitiva do ciclo celular mas ainda permite a produção de factores de crescimento e da matriz extracelular, necessária para a promoção do crescimento celular de células diferenciadas. A linha de células STO foi obtida por A. Ber-nstein, Ontario Câncer Institute, Toronto, Canada a partir de uma linha contínua de fibroblastos embrionários de murganhos SIM (murganhos singeneicos Sandos) e foi fornecida pela American Type Culture Collection (ATCC) (STO Número do produto: CRL-1503, Lote número 1198713). Camadas de células de suporte frescas foram, preparadas duas vezes 104 ΡΕ2150275 por semana, em geral na segunda-feira e quinta-feira. Células em crescimento contadas. Uma parte deis de culturas viáveis e a irradiação, preparámos 1 células/ml em tubos. As de 45 a 55 Grays e sementeira, as placas exponencial foram dissociadas e células foi semeada para manutenção outra parte foi irradiada, para a uma suspensão de células de 10x106 células foram expostas a uma dose foram semeadas em plástico. Após revestidas com células de suporte inactivadas oram usadas du ante um máximo de 5 dias.
Meios DMEM- HamF12 (Cambrex, Cat n° BE04-687)
Meio GTM-3 (Sigma, Cat n° G9916) mei
Meio EX-CELL™ 66522, 65788 e 66444 (SAFC, fabricado por encomenda)
Aditivos
Glutamina (Cambrex, Cat n° ΒΕΓ/-605Ε) Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat n° BE17- 6 0 2 E) ) 114Ξ)
Aminoácidos não essenciais (Cambrex, Cat n° BE13-
Piruvato de sódio (Cambrex, Cat n°BE13-H5) Vitaminas (cambrex, Cat n° 13-607C) Beta-Mercaptoetanol (Sigma, Cat n° M7522) Yeastolate (SAFC, Cat n° 58902C) ΡΕ2150275
Tampões e fixadores PBS IX (Cambrex, Cat n° BE17-516F)
Agente crioprotector
Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, Cat n° D2650)
Factores
Foram usados seis factores recombinantes diferentes: - Factor neurotrófico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, Cat n° 450-13) - Factor tipo insulina humana I (IGF1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11) - Interleucina 6 recombinante 6 (IL6) (Peprotech
Inc, Cat n° 200-06) - Receptor solúvel da interleucina 6 recombinante (sIL6r) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06 R)
Factor das células estaminais humano recombinante (SCF) (Peprotech Inc, Cat n° 300-07) - Factor do crescimento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF) (Peprotech inc, Cat η ιϋυ-ι8Β)
Soro fetal bovino
Soro fetal bovino não irradiado (FBS) (SAFC, Cat n° 12103) ΡΕ2150275 0 soro não irradiado usado no programa foi colhido e produzido na Austrália, Os animais usados para a colheita foram inspeccionados pela USDA e aceites para abate. Foi adicionado ao meio durante a cultura de células estaminais aviárias. Este lote não foi submetido a irradiação para evitar a destruição de proteínas criticas ou componentes identificados como essenciais para a manutenção das células estaminais em cultura.
Soro irradiado {JRHf Cat n° 12007) 0 lote irradiado usado neste programai foi também colhido na Austrália. Este lote irradiado foi adicionado como suplemento do meio DMEM usado para a cultura de células STO ou FED (células de suporte) . Aquelas células não requerem como células estaminais uma qualidade especifica de soro para crescimento e mar iutenção em cultura. F 'ara minimizar a concentração e1ev a d. a de soro no meio adapt ámo s as células í >T0 ao crescimento n ci presença de apenas 4% de FBS,
Agentes de dissociação: - Trypzean ({Sigma, cat n° T3449) 2,2- PROCESSO DE ESTABELECIMENTO DA LINHA CELLULAR LINE 0
Embriõe ovos galinha Line Λ toram 107 ΡΕ2150275 colnidos ae acordo com o processo descrito no Exemplo 1.2. Em seguida, os embriões Lme 0 foram colocados hum tubo contendo PBS IX. Os embriões foram então mecanicamente dissociados e inocuiados numa camada de células de suporte STO em meio de cultura compl et o a :élulas de suporte foram semeadas em placas a cerca de 2,7 x 104 células/cnf. O meio de cultura completo é composto por meio basal comercial DMEM-Ham F12 suplementado com 10% de soro fetal de vitela, com IGF1, CNTF, bFGF, IL6, IL6r e SCF numa concentração final de 1 ng/ml e com 1% de aminoácidos não essenciais, com 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, com piruvato de sódio numa concentração final de 1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,2 mM, glutamina numa concentração final de 2,9 mM, com Yeastolate IX e com uma mistura inicial de antibióticos contendo penicilina numa concentração final de 100 U./ml e estreptomicina numa concentração final de 100 pg/ml. Após 7 passagens, a mistura de antibióticos deixou de ser adicionada ao meio.
Quando as células ES 3.V ΐ 3.1Γ 13. S de embriões G0 galinha Line 0 são transferidas de uma placa de cultura para outra, a sementeira das placas de cultura foi realizada en tre cerca de 7 x ΐ - 4 , 2 10/cm e 8 x 104/cm2 das células ES a vi árias no meio de cultu ra completo. De células/placa de 100 mm) . preferência, a sementeira é feita com cerca de 7,3xlOVcm2 (4 x 10° células/55 cm2 ou 4 x 10b 108 ΡΕ2150275
As células aviárias, de preferência as células embrionárias aviárias do passo a) são cultivadas durante várias passagens em meio completo suplementado com 10 ou 15% de FBS. Na passagem 7, o meio completo foi desprovido dos factores de crescimento bFGF, IL6, IL6r e SCF. A depleção foi feita directamente num passo, de uma passagem para outra. As células estaminais embrionárias, de preferência, as células embri o n a. r i a s aviárias são cultivadas duran te várias passagens no meio completo ser :i os 4 factores de crescimento. Ma passagem 12, os 2 ú .1 timos factores de crescimento IGF1 e CNTF foram remov: Idos do me i o e as células foram amplificadas sem o factor.
Para promover o crescimento celular usaram-se 3 meios basais sucessivamente: DMEM Ham F12 da passagem 1 até à passagem 18, Exceli GTM-3 da passagem 18 até à passagem 26 e uma mistura de Exceli 66788 e Exceli 66522 após a Dassaaem 26.
Após a passagem. 30, a depleção das células de suporte foi realizada através de um decréscimo progressivo da concentração das células de suporte ao longo de várias passagens seguindo o processo passo a passo anteriormente descrito. Durante esta fase de privação das células de suporte, algumas células capazes de crescer em suspensão foram isoladas usando como meio de crescimento Exceli 66444 e a privação do soro foi iniciada (Figura 1B). ΡΕ2150275 - 10 9 -
EXEMPLO 3: Linha celular ERx de pato EB66 3.1 - MATERIAL DE PARTIDA
Ovos de pato :oram
Ovos de pato da estirpe Peking GL30 adquiridos àGRIMAUD FRERES SELECTION (La Corbière, Roussay France). Os patos parentais foram vacinados contra Escherichia Coli (Autogenous vaccine Coli 01 & 02), Pasteurella multocida (Landavax), hepatite virai dos patos (Hepatovax), Erysipelothrix rhusiopathiae (Ruvax), Avian metapneumovírus aviário (Nemovac), Salmonella typhimurium & Enteridis (vacina autógena), Riemerella antipestifer (Autovacina Riemerella) , metapneumovírus aviário (Nobilis RTV inactivo) e Erysipelothrix rhusiopathiae (Ruvax). Após entrega, os ovos de pato de Pequim fertilizados foram submetidos a uma desinfecção num banho de hipoclorito seguido de descontaminação com Ferinacidal (Thermo) para evitar qualquer risco de contaminação associada a poeiras da casca. Células de suporte (45 a
No primeiro passo do processo de estabelecimento de EB Line 0, células de origem murina (células STO) foram usadas como camada de suporte para manter a pluripotência das células estaminais de galinha. As células de suporte foram mitoticamente inactivadas por irradiação gama 110 ΡΕ2150275 55 Grays) antes da sementeira em plástico. Esta dose de irradiação é uma dose subletal que induz uma paragem definitiva do ciclo celular mas ainda permite a produção de factores de crescimento e da matriz extracelular, necessária para a promoção do crescimento celular de células diferenciadas.
A linha de células STO foi obtida por A. Bernstein, Ontario Câncer Institute, Toronto, Canada a partir de uma linha continua de fibroblastos embrionários de murganhos SIM (murganhos singeneicos Sandos) e foi fornecida pela American Type Culture Collection (ATCC) (STO Número do produto: CRL-1503, Lote número 1198713). Camadas de células de suporte frescas foram preparadas duas vezes por semana, em geral na segunda-feira e quinta-feira. Células em crescimento exponencial foram dissociadas e contadas. Uma parte das células foi semeada para manutenção de culturas viáveis e a outra parte foi irradiada. Para a irradiação, preparámos uma suspensão de células de 10x10° células/ml em tubos. As células foram expostas a uma dose de 4 5 a 55 Grays e foram semeadas em plástico. Após sementeira, as placas revestidas com células de suporte inactivadas foram usadas durante um máximo de 5 dias.
Meio
Meio EX-CELL™ 65788, 65319, 63066e 66444 (SAFC, meio fabricado por encomenda)
Meio GTM-3 (Sigma, Cat n° G9916) ΡΕ2150275 111 DMEM- HamF12 (Cambrex, Cat n° BE04-687) DMEM (Cambrex, Cat n° BE 12-614F)
Aditivos
Glutamina (Cambrex, Cat n° BE17-605E) Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat n° BE17- 602E) 114E)
Aminoácidos não essenciais (Cambrex, Cat n° BE13-
Piruvato de sódio ( Cambrex, Cat n ° 513-115) V i t am i nas (C amb rex, Cat n° 13-607 i ^ \ ^} Beta-Mercaptoetanol (Sigma, Cat n o T\ 47 522)
Yeastolate (SAFC, Cat n° 58902C)
Tampões e fixadores PBS IX (Cambrex, Cat n° BE17-516F)
Agente crioprotector
Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, Cai
Factores
Foram usados dois factores recombinantes diferentes: - Factor neurotrófico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, Cat n° 450-13) ΡΕ2150275 - Factor tipo insulina humana I (IGF1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11)
Estes 2 factores foram produzidos na bactéria E. colí.
Soro fetal bovino
Soro fetal bovino não irradiado (FBS) (JRHf Cat n° 12003) 0 soro não irradiado usado no programa foi colhido e produzido na Austrália. Os animais usados para a colheita foram inspeccionados pela USDA e aceites para abate. Foi adicionado ao meio durante a cultura de células estaminais aviárias. Este lote não foi submetido a irradiação para evitar a destruição de proteínas criticas ou componentes identificados como essenciais para a manutenção das células estaminais em cultura.
Soro irradiado (JRR, cat n° 12007) 0 lote irradiado usado neste programa foi também colhido nos Estaaos Unidos. Este lote irradiado foi adicionado como suplemento cio meio DMEM usado para a cultura de ceiuras SiO (células de suporte). Aquelas células não requerem como células estaminais uma qualidade especifica de soio para crescimento e manutenção em cultura. Para minimizar a concentração elevada de soro no 113 ΡΕ2150275 meio adaptámos as células STO ao crescimento na presença de apenas 4% de FBS.
Agentes de dissociação: - Pronase (Roche, Cat n° 165 921) A pronase é uma protease recombinante produzida pela Roche Diagnostics, Alemanha, usada para a dissociação de células estaminais aderentes de aves. - Tripsina ΕΏΤΑ (Cambrex, cat n° BE17-161E)
Q Π-* ΛΙ ij .i. O :élulas origem
Usou-se tripsina para a dissociação de células FED e nas últimas passagens para a dissociação de aviárias adaptadas a meio sem soro. Esta enzima de porcina é produzida assepticamente de acordo com condições de referência cGMP por um método de filtração estéril validado e testado de acordo com E.P. corrente. 0 material de partida, irradiado antes da formulação é testado relativamente a parvovírus porcino em cumprimento estrito de 9/CFR 113.53. - Trypzean {(Sigma, cat π° T3449) A solução de Trypzean é formulada com uma tripsina bovina recombinante, expressa em milho e fabricada pela Sigma Aldrich usando os Sistema de expressão de proteínas em plantas transgénicas da ProdiGene. Este 114 ΡΕ2150275 produto foi optimizado para dissociação de células em culturas celulares aderentes sem soro e suplementadas com soro. - Solução de dissociação celular não enzimãtica (Sigma, Cat N° C5914)
Este agente de dissociação é uma formulação pronta a usar para descolar suavemente células da superfície de crescimento do recipiente de cultura. A fórmula não contém proteína e permite o descolamento das células sem. o uso de enzimas. As proteínas celulares são preservadas tornando possível os estudos imunoquímicos que são dependentes do reconhecimento de proteínas da superfície celular. Esta enzima foi usada para destacar as células antes da análise por FACS de marcadores biológicos tipo EMA-1 (Antigénio da membrana epitelial 1) e SSEA1 (antigénio embrionários específico de fase 1).
3.2- PROCESSO DE ESTABELECIMENTO DA LINHA CELULAR EBX DE PATO EB66
Cerca de 360 ovos de pato fertilizõidos foram abertos, a gema separada do albúmen durante a abertura. Os embriões foram removidos da gema com a ajuda de um pequeno papel de filtro absorvente (Whatman 3M) , cortado na forma de um anel perfurado com a ajuda de um punção. 0 diâmetro da perfuração foi de aproximadamente 5 mm. Estes pequenos anéis foram esterilizados usando calor seco durante cerca. ΡΕ2150275 de 30 minutos numa estufa. Na prática, durante o passo de colheita do embrião, um pequeno anel de papel foi depositado na superfície da gema e centrado no embrião que ficou assim rodeado pelo anel de papel. Este último foi então cortado com a ajuda de um pequeno par de tesouras e a totalidade removida foi colocada numa placa de petri, cheia com PBS. O embrião assim removido pelo anel foi limpo do excesso de gema no meio e o emononar:
Lssim livre do excesso de vitelino, foi colhido com uma pipeta de Pasteur.
Os embriões de pato foram colocados em tubos de 5 0 ml contendo PBS IX. Os embriões de pato foram então mecanicamente dissociados, lavados com PBS e semeados numa camada inactivada de células de suporte STO em meio de cultura completo a 39°C, 7,5% CO2. As células de suporte foram semeadas em placas de 6 alvéolos a cerca de 2,7 x 104 células/crrh, O meio de cultura completo é composto por meio basal comercial DMEM-Harn F12 suplementado com 10% de soro fetal de vitela, com IGF1 e CNTF, numa concentração final de 1 ng/ml e com 1% de aminoácidos não essenciais, com 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, coi Ti piruvat de sódio r iuma concentração final de 0,1 mM, com beta mereaptoeta nol numa concentração fi nal de 0,5 mM, glutamin numa concentração final de 2,1 mM, penicilina numa concentração final de 100 Τ J/ml, estreptomicina numa concentração final de Ι 0 0 yg/ml e Yeastolate IX. Rapidamente na passagem 4, a mis tura de antibióticos de ixou de ser adicionada ao meio. ΡΕ2150275
As células ES de pato foram cultivadas no meio DMEM-Ham F12 até à passagem 4. Após a passagem 4, o meio de bas e foi I to di ficado e mel .0 DMEM -Ham F12 complet o foi kp Li xd s t 10 1Li 1 Ci o poi : me i o SEM GTM· ~3 suplement 3.CÍO com 1 r\ o_ u o O. e soro f et al de vi .teli a, com IGF I 0 CNTF, numa Q -pj centr ação final de 1 ng/ml e c om 1% de amin oácidos não 0 S S encia IS , com 1% de ml .stura de vitamij nas de origem comei :cia. 1, co m pi ruvato de sódio r iuma conce nt ra ção final de 0,1 mM, com beta- merca ptoeta n Q "j numa c once nt ri ação final d· e 0, 5 mM, glu tamina num 0. concentra Ç à 0 T. i . n a 1 de 2,1 mJ M e Yea stola te 1 X. As cél u 1 a s E S de pato pas sagens ne ste novo de factores de ^ c; , IGF 1 e CNTF foi :am si da passagem 19 até mei o GTM-3 ε ;upl 0 ]T|p Π {" não essencis iis, com com ercial, c om piruv; τ—1 O mM, com beta-mer ; com 10% itíS, com 11 de aminoaciaos ; de mistura de vitaminas de origem ) de sódio numa concentração final de otoetanol numa concentração final de 0,5 mM, glutamina numa concentração final de 2,1 mM e YeastolaLte IX.
Quando as células ES de pato de embriões de pato de Pequim são transferidas de uma placa de cultura para outra, a sementeira das placas de cultura foi realizada entre cerca de 7 x lOVcrrb e 12 x loVcrrb das células ES de pato no meio de cultura completo. ΡΕ2150275
Depois,. após a passagem 24, a depleção das células de suporte foi realizadeL através de uma redução progressiva da concentração das células de suporte. As placas foram originalmente semeadas com cerca de 2,7 x 104 células de suporte/cm2, depois cerca de 1,8 x 104 células de suporte,/ci o γγ Θ n t ,ίγ Θ aS pâSScLC[0nS 25 e 31, depois cerca de 1,4 x 104 cél· u 1 a s de suport e/cm'; en tre as pa; ssagens 32 e 35, depois cerca de 1 x 104 células de supor te/cm2 entre cl S passagens 36 e 41, depois : cerca de 0,7 x 104 células de suporte/crrt entre as passagens 42 e 44 e, finalmente, a partir da passagem 45, as placas foram semeadas apenas com células aviárias e sem células de suporte. No final da depl eção G8- S cê'. lulas de supo rte. as pl aca s foram seme 0. 'd. d O com 9 x 10 4 C* 0 lulas avi -ária s / c.m' 2 a -j- 0 12, 7 X 10 cel ulas aviárias / crró. A depleção das célu las de su .po rte C1 omeçou na pass agem. 2 5 e t ermi.no u n a pa ssag< —ΓΓ 45. Du .T a nte a depl eção das cél' ulas de supo Cd f d í 3 cé l.u.1 a s hi S c ie pa. t O f oram seme adâ S em. pl . a c a s de cul tura numa cc mcent ra ç ao ma i s e 1 e v ada que no passo a) , ce rca de r\ x 1 .O4 cé lu las / c nl· a 12,7 x 1 O4 cé 1 υ 1 as/' cm2
Após várias passagens sem células de suporte, os parâmetros de crescimento (tempo de duplicação da população (PDT) e densidade) foram estudados para confirmar a esta-bilidade e a robustez celulares e para iniciar a privação ácidos, vitaminas, beta-mercaptoetanol, piruvato de de amino sódio e suficien privação celular
Yea .c 3 to late. As cél .ulas f o ram cons ideradas como temen te robus tas Ρ B. x.' a s e r em S3 uorne t. i q a s a. tal se τλ t\ r r Lj . Γ for -j_ JD 00 y J o r a 40 ho ras e a. den si- d a de for s uperior a ce rca oe a o X 104 células /cm2. 118 ΡΕ2150275
No caso do desenvolvimento das presentes células EBx® de pato, designadas EB66, a privação de vitaminas, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e beta-mercaptoetanol foi iniciada na passagem 52. Todos aqueles aditivos foram removidos simultaneamente do meio. Assim, entre a passagem 52 e a passagem 59, o meio de cultura foi SFM GTM-3 suplementado com glutamina, Yeastolate e FBS.
Após um curto periodo de adaptação às novas condições de cultura, iniciou-se o abaixamento da temperatura. Esta redução foi realizada progressivamente entre a passagem. 60 e a passagem. 67. Após a passagem. 67, as células foram capazes de crescer a. 37°C. Após a passagem 67, o meio base GTM-3 foi substituído por um novo meio base SFM designado Exceli 65788. Assim, após a passagem 67, o meio de cultura foi Exceli 65788 suplementado com 10% FBS, glutamina 2,5 mM e Yeastolate Ix. Na passagem 80, 4 x 106 células foram transferidas para uma placa de aderência ultra baixa (Ultra Low Attachrnent (ULA) ) mantida em agitação constante para iniciar o crescimento de células independente de ancoragem. Para promover o crescimento em suspensão, o meio de base foi modificado e a percentagem de soro foi reduzida de 10% para 5% para a sementeira na placa ULA. Assim, entre a passagem 80 e a passagem 85, o meio de cultura foi SFM GTM-3 suplementado com 5% FBS, glutamina 2,5 mM e Yeastolate IX. A redução lenta de FBS foi iniciada na suspensão de células EB66 após a passagem 85. A depleção de soro foi realizada através de uma redução progressiva começando na concentração 2,5% de soro, depois 1,5% de soro em meio de 119 ΡΕ2150275 ^^ltU'3. ceiuiar SFM para finalmente ating: % de soro em mero de cultura celular SFM. A depleçao de soro iniciou-se na passagem 86 e terminou na passagem 94. No final da depleçao de soro, as cé lulas dEB66 ancoragem f0ram capazes de crescer a ? factores de crescimento, na ausência de em meio s<=m soro. Após obtenção de células de capazes de crescer a 3" 1°C em GTM-3 sf; :élulas de suporte, de suplementado com grutamina 2,5 mM, foi feita adaptação a meio SFM através de diluição ou adaptação progressiva em novas formulações de SFM, como por exemplo Exceli 63066, Exceli 66444, Exceli CHO ACF. A subclonagem da suspensão das células BB66 de pato for realizada na presença ou ausência de Yeastolate. EXEMPLO 4: Linha celular EBx de pato EB26
4.1 - MATERIAL DE PARTIDA
Ovos de pato, células de suporte, aditivos, tampões e fixadores, agentes de criopreservaçâo, soro fetal de vitela & agentes de dissociação (Idem como no Exemplo 3).
Foram usados os ovos de pato de Pequim estirpe G.L30 . ΡΕ2150275 - 12 0 -
Meio
Meio EX-CELL™ 65319, 63066 e 66444 (SAFC, meio fabricado por encomenda)
Meio GTM-3 (Sigma, Cat n° G9916)
DMEM (Cambrex, Cat n° BE 12-614F
Factores
Foram usados seis factores recombinantes diferentes: - Factor neurotrófico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, Cat n° 450-13) - Factor tipo insulina humana I (IGF1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11) - Interleucina 6 recombinante 6 (IL6) (Peprotech
Inc, Cat n° 200-06) - Receptor solúvel da interleucina 6 recombinante (sIL6r) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06 R)
Factor das células estaminais humano recombinante (SCF) (Peprotech Inc, Cat n° 300-07) - Factor do crescimento de fibroblastos básico . 8B) humano recombinante (bFGF) (Peprotech Inc, Cat n!
Todos estes factores, excepto IL6r, foram produzidos na bactéria E. coli. IL6r solúvel foi expressa em células HEK293 transfectadas, 121 ΡΕ2150275
4.2 PROCESSO.....DE J^T&bELECIMENT0 DE CÉLPLAS EBX DE PATO LINHA EB26
Os embriões de pato foram colhidos como mteriormente descrito para EB6 :olocados em tubos de 50 ml 6. Os embriões de pato foram °ntendo PBS IX. Os embriões de
pato foram então mecanicament e dissociados, lavados com PBS e semeados numa camada inactivan- u , ·, η -, ^
Vci-Cia de células ae suporte STO em meio de cultura completo a ’ον ,-0 . , C, /,5% C02. As células de suporte foram semeadas em plar3c ^ , - , 3 - dCdS de o alvéolos a cerca de 2,7 x rO ^élulao/cm'. O meio de cultura completo é composto por meio GTM-3 suplementado com 5% de soro fetal de vitela, com. T.GF1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF e FGF numa concentração final de 1 ng/ml e com 1% de ami no ácidos não essenciais, com. 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, com piruvato de sódio numa concentração final de 0,1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,5 mM, glutamina numa concentração final de 2,1 mM, penicilina numa concentração finai de 100 U/ml, estreptomb cina numa concentração final de 100 pg/ml e Yeastolate IX. Rapidamente nas primeiras passagens das células, a mistura de antibióticos deixou de ser adicionada ao meio. A expressão "rapidamente" é entendida, em geral, como significando após as 3 a 9 primeiras passagens. As células ES de pato foram cultivadas no meio completo até à passagem 9. Após a passagem 9, o meio completo foi parcialmente depletado de factores. Assim, entre as passagens 10 e 13, SCF, IL6, IL6r e bFGF foram removidos do meio e apenas IGF1 recombinante e NTF foram mantidos numa 1 Ο Ο ΡΕ2150275 concentração de 1 ng/ml. Uma redução simultânea da concentração de IGF1 e CNTF foi em seguida realizadsL entre as passagens 13 e 16 para finalmente se obter células capazes de crescer sem factores recombinantes na passagem 17. A depleção de factores foi feita através de uma adaptação progressiva a concentrações mais baixas de factores. Quando as células ES de embriões de pato de Pequim foram passadas de uma placa de cultura para outra, a sementeiro a das plac a s de cultura foi realiza da entr e cer ca de 7 x 10 4/cm2 θ 12 X Ί n 4 / cm2 das células ES c le pato no me io de cultur a completo • De pref erên c i a, a seme nteira 0 f ei l a com cerca de 7 ',3x10 4/c :m2 (4 x : 106 célula s / 5 5 cirb ou 4 x 1 .o6 cél ulas/p I. a c a de I 10C nm) . Apó s depl eção dos f :ac tor Y'P c ombina: ntes, foi re ali zado uma reduçã o do Yeasto la- te π a pas s a gera 23, ating: Inc Io q -f inal a con centi ração de 0,5 X.
Depois, após a passagem 31, a depleção das células de suporte foi realizada através de uma redução progressiva da concentração das células de suporte ao longo de várias passagens. As placas foram originalmente semeadas com cerca de 2,7 x 104 células de suporte/cm" , depois cercai de ! a 8 x 104 células de supo rte/cm" entre as passagens 32 e 38, depois cerca de 1,4 x 104 células de suporte/cm" entre as passagens 39 e 44, depois cerca de 1 x 104 célu las de suporte/cm"1 entre as passagens 45 e 47 , depois cerca O-0 0,7 x 104 células de suporte/cm2 entre as passagens 48 e 50 e, finalmente, a partir da passagem 51 as placas foram semeadas apenas com células aviárias e sem células de suporte. No final da depleção das células de suporte, as placas foram semeadas com 9 x 104 células aviárias/cm2 até - 123 - ΡΕ2150275 12,7 χ 10' células aviárias/cmz. A depleção das células de suporte começou na passagem 32 e terminou na passagem 51. Durante a depleção das células de suporte, as células ES de pato foram semeadas em placas de cultura numa concentração mais elevada que no passo a), cerca de 9 χ 104 células/cmf a 12,7 χ 104 células/cirh, Após várias passagens sem células de suporte, os parâmetros de crescimento (tempo de duplicação da população (PDT) e densidade) foram estudados para confirmar a estabilidade e a robustez celulares e para iniciar o crescimento celular em suspensão. As células foram consideradas como suficientemente robustas para serem submetidas a tal privação se PDT for inferior a 40 horas e a densidade celular for superior a cerca de 2 6 χ 104 células/cmz. Ainda, a morfologia celular: deverá ser redonda, refringente, muito pequena e as células não deverão aderir demasiado à placa de plástico.
No caso do desenvolvimento das células EB26, a cultura em suspensão for iniciada na passagem 53. 7 x 10° células foram transferidas para uma placa de aderência Ultra Low e mantidas em agitação constante a cerca de 50 a 70 rpm. Para as passage ns seguin semeadas em frascos T175 ( Sarsted concentração entre 0,4 a 0, 5 x 1 í curto período de 3λ1 8.p LclÇ3Q às novas 3, as células foram ref 831812502) numa células/ml. Após um PDT das células baixou de aproximadamente 160 h para 4 0 horas. Considerando esta evolução relativamente boa, na passagem 59, foi efectuada uma nova série de depleções. 12 4 ΡΕ2150275
Assim foram removidos vitaminas, piruvato de sódio, beta-mercaptoetanol e aminoácidos não essenciais. Assim, após a passagem 59, o meio de cultura foi suplementado com 5% FBS, Yeastolate 0,5X e glutamina apenas 2,5 mM. A depleção do soro foi realizada em suspensões celulares já sem factores de crescimento, células de suporte, vitaminas, aminoácidos 113.0 esse ncia i ^, P iruvato de SÓ03 0 e bet a-merca ptoetanol. A L 1 dep leção do so ro foi r ealizada atrav és ΟΘ uma reduç cd. d pro gress iva com eç ando em 5% de soro, depo is O c,9- Ho-oo i— f d 0 f '-J- w r-S ^ is 1,5 r Ge soro em me i o de c ultura celular SFM para finalmen te ati ngir 0% de soro em me i o de cultu ra cel' ular SFM. A dep leção de so ro começo u na pas sagem 61 e terminou na P3S sagem 79. No f inal da depleção de so ro, a s células EB /λ r Z D de pato for am ca pazes de crescer a 8' a o r· y neL ausência de f ac tores de cresc: lmento, na ausência de céli ilas ; de suport e, em meio sem sor o. As céli ilas EB26 foram então adaptadas Cl d crescimento na ausência de Yeastolate 0,5X a 37°C, através da redução da temperatura da cultura celular na passagem 80 .
Após obtenção das células EB26 que são capazes de crescer a 37°C no meio GTM-3 SFM suplementai do com glutamina 2,5 mM, fizeram-se mai s adaptações através da diluição ou adaptação prog ressiva a novas form .ulações SFM como Exceli 63066, Exceli 66444, Exceli CH0 ACF. A sub c1o n agem da suspensão de células EB26 de pato pode também ser realizada na presença ou na ausência de yeastolato#. ΡΕ2150275 - 125 -
EXEMPLO 5: Linha celular BBx de pato EB24 5.1 - MATERIAL DE PARTIDA
Ovos de patof células de suporte, aditivosf tampões e fixadoresf agentes de criopreservação, soro fetal de vitela & agentes de dissociação (Idem como no Exemplo 3) ,
Foram usados os ovos de pato de Pequim estirpe GL30 .
Meio
Meio EX-CELL™ 65319, 63066 e 66444 (SAFC, meio fabricado por encomenda)
Meio GTM-3 (Sigma, Cat n° G9916) DMEM F12 (Cambrex, Cat n° BE04-687)
DMEM (Cambrex, Cat n° BE 12-614F
Factores
Foram usados seis factores recombinantes diferentes : - Factor neurotrófico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, Cat n° 450-13) - Factor tipo insulina humana I (IGF1) (Peprotech
Inc, Cat n° 10 0-11) - 12 6 - ΡΕ2150275
Interleucina 6 recombinante 6 (IL6) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06)
Receptor solúvex da interleucina 6 recombinante (sILor) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06 R)
FaCi.or aas células estaminais humano (SCF) (Peprotech inc, Cat Factor do crescimento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF) (Peprotech Inc, Cat n° 100-18B) recombinante :o.i expressa
Todos esr.es facrores, excepto IL6r, foram produzidos na bactéria E. coli. IL6r solúvel foi células H.EK2 93 transfectadas. 5.2- PROCESSO DE ESTABELECIMENTO DE CÉLULAS EBX® DE PATO LINHA EB24 C3.S de ( > alvéolos a c erca de > de cultura completo é c om- Ham F12 suplementado com Ί r\ o 1 u 'o IGF1 , CN TF,IL-6, IL-6R , SC F e de 1 ng/ml e com 1% de jm 1 % de mistura de vi tami nas de sódio numa con-
Os embriões de pato foram colhidos como ante-riormente descrito para EB66. Os embriões de pato foram colocados em tubos de 50 ml contendo PBS IX. Os embriões de pato foram então mecanicamente dissociados, lavados com PBS e semeados numa camada inactivada de células de suporte STO em meio de cultura completo a 39°C, 7,5% CO?. As células de suporte foram semeadas em pb 2,7 x 104 células/cmz. O mei posto por meio sem soro DMEM de soro fetal de vitela, com FGF numa concentração de origem comercial :om oiruvato 127 ΡΕ2150275 centração final de 0,1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,5 mM, glutamina numa concentração final de 2,1 mM, penicilina numa concentração final de 100 U/ml, estreptomicina numa concentração final de 100 pg./ml e Yeastolate IX. Rapidamente após as primeiras passagens das células, a mistura de antibióticos deixou de ser adicionada ao meio. A expressão "rapidamente" é entendida, em geral, como significando após as 3 a 9 primeiras passagens.
As células ES de pato foram cultivadas no meio completo DMEM-Ham F12 até à passagem 7. Após a passagem 7, o me i o bci.se foi modif: Lcado e o meio completo DMEM-Ham. Τ?"! O f o i substiti lido por m eio comp.1 eto Gj ΓΜ-3 sup leme: ntado com 10% de soro fetal bovi η o, com I GF-1, CNTF, IL 6, I f 1—! QfTT ^ i. e F ’GF numa concentração final de 1 ng/ml, e c om 1 % de amii roác idos não essenc iais , com X *0 G0 mistura G0 vitaminas de ΟΓ. igem comercial / com piruva to de sódio r luma cone :ent X' cL Ç cl O final de 0,1 mM, c om bet a-me rcapt o e t anol r ruma es senciais, com comercial, com de 0, 1 mM, com al. de 0,5 mM, concentração final de 0,5 mM, glutamina numa concentração final de 2,1 mM, penicilina numa concentração final de 100 U/ml, estreptomicina numa concentração final de 100 pg/ml e Yeastolate IX. Assim, na passagem 11, a concentração do soro foi reduzida para b% e SCF, IL6, IL6r e bFGF foram removidos do meio. Assim, a partir da passagem 11, o meio é composto por 5% FCS, com IGF1 e CNTF numa concentração final de 1 ng/ml com 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de mistura de vitaminas de origem cc piruvato de sódio numa concentração final dc beta-mercaptoetanol numa concentração final de 1.2 8 - í concentr ação final de 2,1 mM, penicilina ção final de 100 U/ml, estreptomicina numa final de 100 yg/ml e Yeastolate IX. Na ΡΕ2150275 passagem 22 foi feita uma remoção simultânea de IGF1 e de CNTF. Não estão presentes factores reeombinantes no meio de cultura GTM-3 após a passagem 22. As células de pato foram mantidas nesse meio entre a passagem 23 e a passagem 28. Quando as células ES de pato dos embriões de pato de Pequim foram transferidas de uma placa de cultura para outra, a sementeira das placas de cultura foi realizada entre cerca de 7 x 104/cm2 e 12 x 104/cm2 das células ES de pato no meio de cultura completo. De preferência, a sementeira foi feita com cerca de 7,3x104/cm2 (4 x 10° células/55 cm2 ou 4 x 10b células/placa de 100 mm). Após a passagem 28, a depleção das células de suporte foi realizada através de um decréscimo progressivo da concentração das células de suporte ao longo de várias passagens. As placas foram originalmente semeadas com cerca de 2,7 x 104 células de suporte/cm2, depois cerca de 1,8 x 104 células de suporte/cm2 entre as passagens 29 e 33, depois cerca de 1,4 x 104 células de suporte/cm2 entre as passagens 34 e 37, depois cerca de 1 x 104 células de suporte/cm2 entre as passagens 38 e 42, depois cerca de 0,7 x 104 células de suporte/cib entre as passagens 43 e 46 e, finalmente, a partir da passagem 47, as placas foram semeadas apenas com células aviárias e sem células de suporte. No final da depleção das células de suporte, as placas foram semeadas com 9 x 104 células aviárias/cm2 até 12,7 x 104 células aviárias/cm2. A depleção das células de suporte começou na ΡΕ2150275 passagem 47. Durante a depleção cLS C Θ _!_ U _í_ cL S E S de pato foram ultura numa con centração mais cerca de 9 x 10 4 células/cm2 a passagem 29 e terminou na d cL S C Θ _í_ U _i_ cL S de suporte, semeadas em placas de elevada que no passo a) , 12,7 x 104 células/crrh. Após de suporte, os parâmetros duplicação da população (PDT) para confirmar a estabilidade iniciar o crescimento celul foram consideradas como sufic várias passagens sem células de crescimento (tempo de e densidade) foram estudados e a robustez celulares e para ar em suspensão. As células ientemente robustas para serem
subrnet IClâS cl cultura ei ir. suspensão se PDT for inferior â cerca de 4 0 horas e a densidade cel u .1a r f o r superior â cerca de 2 6 ; κ 104 célul as / circ . Ainda, a mo r p p. i o J- Cy Λ. \J gia ce1u1 â JC deverá ser redonda, refringente, muito pequena e as células não deverão aderir demasiado à placa de plástico. No caso do de s e nv o1v i me n to das células EB24, a cultura em suspensão foi iniciada na passagem 4( 3. 8 x 106 célu iss t. o u am tra nsferidas para uma placa de aderêncra IJlt ra Low e mantidas em agitação constante a cerca de 50 a 70 rpm. Para as passagens seguintes, as células foram semeadas em frascos T175 (Sarsted, ref 831812502) numa concentração entre 0,4 a 0,5 x 106 células/ml. Após um curto período de adaptação às novas condições de cultura, o PDT das células baixou de aproximadamente 248 horas para 128 horas e efectuado então o passo seguinte de depleção. Assim, na passagem 52, foram removidos vitaminas, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio e beta-mercaptoetanol. Considerando a boa evolução do PDT que atingiu 44 horas na passagem. 56, a partir da passagem 57 foi iniciada a 130 ΡΕ2150275 depleção do soro. Assim, a partir da passagem 57, o meio de cultura GTM-3 foi suplementado com 5% FBS, Yeastolate IX e glutamina apenas 2,5 mM. A depleção do soro foi realizada em suspensões celulares já sem factores de crescimento, células de suporte, vitaminas, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio e beta-mercaptoetanol. A depleção do soro foi realizada através de uma redução progressiva começando em 5% de soro, depois 2,5%, depois 1,5% de soro em meio de cultura celular SFM para finalmente atingir 0% de soro em meio de cultura celular SFM. A depleção de soro começou na passagem 57 e terminou na passagem 77. Durante esta depleção do soro, a adaptação ao crescimento a 37°C foi igualmente realizada. Assim, na passagem 65, as células as células a crescerem em meio de cultura suplementado com 2,5% de FBS foram. transferidas a 37 °C evitando uma alteração progressiva da temperatura. No final da depleção de soro, as células EB24 de pato independentes de ancoragem foram capazes de crescer a 37C na ausência de factores de crescimento, na ausência de células de suporte, em mero sem soro.
Após obtenção das células EB24 de pato capazes de crescer a 37°C no meio GTM-3 SFM suplementado com glutamina 2,5 mM, fizeram-se mais adaptações através da diluição ou adaptação progressiva a novas formulações SFM como Exceli 63066, Exceli 66444, Exceli CHO ACF. A subclonagem da suspensão de células EB24 de pato foi efectuada e o subclone EB24-12 foi seleccionado devido ao seu bom desempenho para replicar vírus eficientemente. ΡΕ2150275 131
EXEMPLO 6: Linha celular EBx de pato mudo SPF
6.1 - MATERIAL DE PARTIDA
Ovos de pato:
Ovos de pato SPF de estirpes de pato mudo foram adquiridas a Le Couvoir de Cerveloup (França), Os ovos de pato SPF, foram produzidos a partir de um bando testado intensivamente para vários agentes patogénicos de aves de capoeira. As doenças testadas incluíram: Salmonella gallinarum-pullorum, i Mycoplasma synovi ae, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma galliepticum, vírus da doença de Marek, gripe das aves, Paramixovírus Tipo 2, Paramixoví ru s tipo 3, doença de Newcastle, Adenovírus Tipo 3 (EDS), doença de Gumboro, reovírus aviário, vírus da reticulo-endoteliose, encefalomielite aviária, vírus da rinotraqueíte infecciosa e Clamidiose. Os ovos dos patos-mudos foram apenas submetidos a uma desinfecção com a descontaminação para evitar qualquer risco de contaminação associada à manipulação dos ovos durante o transporte. Células de suporte (ver exemplos anteriores)
Meios
Meio EX-CELL™ 66444 (SAFC, meio fabricado por encomenda) ΡΕ2150275
Meio GTM-3 (Sigma, Cat ri G9916) DMEM HamF12 (Cambrex, Cat n° BE04-687)
Aditivos
Glutamina (Cambrex, Cat n° BE17-605E) Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat ri BE17- 602E) 114E)
Aminoácidos não essenciais (Cambrex, Cat n° BE13-
Piruvato de sódio ( Cambrex, Cat n ° yif 513-115) V i t am i nas (C amb rex, Cat n° 13-607 i ^ \ ^} Beta-Mercaptoetanol (Sigma, Cat n 0 T\ 47 522)
Yeastolate (SAFC, Cat ri 58902C)
Tampões e fixadores PBS IX (Cambrex, Cat n° BE17-516F)
Agente crioprotector
Dimetilsulióxido (DMSO) (Sigma, Cai
Factores
Foram usados dois factores recombinantes diferentes: - Factor neurotrófico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, Cat n° 450-13) 133 ΡΕ2150275
Factor tipo insulina humana I (IGF1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11)
Estes zactores foram produzidos na bactéria COll .
Soro fetal bovino
Soro fetal bovino não irradiado (FBS) (JRH, Cat n° 12003) 0 soro não irradiado usado no programa foi colhido e produzido na Austrália. Os animais usados para a colheita roram inspeccionados pela USDA e aceites para abate. Foi adicionado ao meio durante a cultura de células estaminais aviárias. Este lote não foi submetido a irradiação para evitar: a destruição de proteínas críticas ou componentes identificados como essenciais para a manutenção das células estaminais em cultura.
Soro irradiado (JRH, Cat n° 12007) O lote irradiado usado neste programa foi colhido na Austrália. Este lote irradiado foi adicionado como suplemento do meio DMEM usado para a cultura de células STO (células de suporte). Aquelas células não requerem como células estaminais uma qualidade específica de soro para crescimento e manutenção em cultura. Para minimizar a concentração elevada de soro no mero adaptámos as células STO ao crescimento na presença de apenas 4% de FBS. ΡΕ2150275 134
Agentes de dissociação: - Pronase (Roche, Cat n° 165 921) - Trypzean (Sigma, cat n° T3449)
6.2 - PROCESSO DE ESTABELECIMENTO DE LINHA
CELULAR EBX DE PATO MUDO
Os embriões de 20 ovos SPF fertilizados de pato :o no mudo foram colhidos de acordo com o processo descrii concentração final de 100 pg/ml e Yeastolate
Exemplo 3. Os embriões de pato foram colocados em tubos de 50 ml contendo PBS IX. Os embriões de pato foram então mecanicamente dissociados, lavados com PBS e semeados num alvéolo de uma placa de 12 alvéolos revestida com uma camada inactivada de células de suporte STO. As células embrionárias de pato foram semeadas em meio de cultura completo e transferidas para 39°C, 7,5% C02. As células de suporte foram semeadas a cerca de 2,7 x 10'? células/cm2. O meio de cultura completo usado é composto por DMEM-Í-Iam F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, com IGF1 e CNTF numa concentração final de 1 ng/ml e com 1% de aminoácidos não essenciais, com 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, com piruvato de sódio numa concentração final de 0,1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,5 mM, glutamina numa concentração final de 2,1 mM, ^eniCilina numa concentração final de 100 U/ml, estrepto-micina. numa - 135 - ΡΕ2150275 IX. Na passagei r 2, o meio base : DMEM-HamF12 foi si udstituído por meio base GTM-3. A mistura de antibióticos deixou de ser adicionada ao mei O cipOS ci pôL ssagem 4.
As células ES de peito foram cultivadas no meio completo GTM-3 até à passagem 8. Após a passagem 8, a concentração de IGF-1 e de CNTF foi reduzida para o, 5 ng/ml, As células ES de pato foram ainda cultivadas durante 2 passagens neste novo meio de cultura, depois efectuou-se a depleção de factores de crescimento na passagem 10. IGF1 e CNTF foram removidos simultaneamente do meio.
Assim a partir da passagem 10 até à passagem 37, o meio de cultura foi meio GTM-3 suplementado com 10% FBS, com 1% de aminoácidos não essenciais, com 1% de mistura de vitaminas de origem comercial, com piruvato de sódio numa concentração final de 0,1 mM, com beta-mercaptoetanol numa concentração final de 0,5 mM, glutamina numa concentração final de 2,1 mM e Yeastolate IX.
Quando as células ES de pato isolcidas de embriões de pato mudo foram transferidas de uma placa de cultura para outra, a sementeira foi realizada com cerca de 12 x 10 Vem2 das células ES de pato no meio de cultura. Algum meio condicionado pode ser ocasionalmente usado para a sementeira das células para melhorar a recuperação pós-dissociação.
Depois, após a passagem 37, a depleção das ΡΕ2150275 células de suporte foi realizadeL através de uma redução progressiva da concentração das células de suporte ao longo de várias passagens seguindo o processo passo a passo anteriormente descrito.
Durante esta fase de privação das células de suporte,, algumas células capazes de crescer em suspensão foram isoladas e adaptadas ao crescimento sem aditivos e soro (Figura 4C). As células EBx de pato mudo independentes de ancoragem expressam marcadores de células ES, tais como telomerase, SSEA-1 e MEA-1 (dados não mostrados). EXEMPLO 7: Caracterização de linhas celulares EBx
7.1 - CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS EBV13 DE GALINHAS
VALO 7.1.1 - Actividade de telomerase A detecção de telomerase foi conseguida usando o Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA desenvolvido pela Roche Applied Science (Protocolo de amplificação deis repetições teloméricas, "Telomerie Repeat Amplification Protocol" (TRAP) - Cat. No. 11 854 666 910) de acordo com o protocolo do fornecedor. O Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA permite a amplificação dos produtos de elongação mediada por telomerase combinada com detecção não reactiva seguindo um protocolo de ELISA. O ensaio é válido se o valor de absorvência do controlo negativo for inferior ou igual a ΡΕ2150275 0,25 A4 5 π nm u g 9 9 · - e n e o valor de absorvência do controlo positivo for superior ou igual SL 1,5 A450nm - A690 nm quando se usa 1 x 103 equivalentes de células no ensaio. As amo s t r a s foram consideradas como positivas para a telomerase se a diferença na absorvência for superior a 0,2 unidades A45onra - Aesorim· Foram usados dois controlos: o controlo negativo é fibroblastos murinos (células FED) e os controlos positivos são células FGB8 (células estaminais embrionárias estabelecidas por Vivalis a partir de embriões de murganho 129 SV) e células EB14-074 de galinha anteriormente estabelecidas em WO 03/076601,
Os resultados obtidos estão resumidos na figura N°12. As células EBvl3 expressam níveis elevados de telomerase. Na passagem pl93 e 195, a actividade de telomerase é equivalente à das células de galinha EB14-074.
7.1.2 - Marcadores biológicos das células ES
As células estaminais embrionárias são caracte-rizadas pela expressão de marcadores biológicos expressos na membrana celular. A expressão de EMA-1 (Antigénio da membrana epitelial-1) e SSEA-1 (Antigénio embrionário específico de fase-1) em células EBvl3 foi avaliada por análise de FACS • Após 1 0 min uto; (P a r a f o rmaldeído ) f a s amo str as de lavados e pré- in cubados c om os específ icos de EM A-l ou de S SEA- conjuga do cc un FI TC foi us a do P'c i r a :orpo 138 ΡΕ2150275 expressam os 2 marcadores biológicos seleccionados. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo usando um FACS (Separador de células activado por fluorescência) da Coulter. A análise FACS foi feita em células de fibro-blastos de murganho (células FED) como controlo negativo, células ES FGB8 como controlo positivo, células EB14-074 como controlo positivo de células EBx e células EBvl3. Conforme esperado as células FED não expressam marcadores biológicos enquanto as células FGB8 e EB14-074 apresentam uma coloração importante, respectivamente de 60,13 % e 78,7 para EMA-1 e 94,45 % e 95 % para SSEA-1 (dados não apresentados). A população de células EBvl3 de galinha Valo não apresentam qualquer coloração para EMA1 (2%) e uma muito ligeira para SSEA-1 (22%), 7.1.3 — Cariótipo paira testar A análise do cariótipo foi realiz; 3Bvi: a diploidia da célula e a origem aviária das célula As células na fase exponencial do crescimento foram colhidas e tratadas 2 horas com colcemida (0,02 pg/ml). Após lavagem e centrifugação, realizou-se um choque hipotónico nas células com KC1 (,56%) durante 20 minutos. Subsequentemente, as células EBvl3 foram fixadas em metanol/ácido acético (3/1) e guardadas durante a noite a -20°C. No dia seguinte, a metáfase foi fixada em vidro, corada com solução de Wright/Giemsa e observada ao - 13 9 - ΡΕ2150275 microscópio. Várias séries de metáfases foram observadas confirmando a origem de galinha das células EBvl3. Não se observou evidência de poliploidia. 7.1.4 - Influência da composição do meio de cultura celular no tamanho dos aglomerados de células EBvl3
Os inventores encontraram que a concentração de cálcio e magnésio no meio sem soro usado para a cultura e infecção das células EBx possui um impacto no tamanho dos aglomerados. A Figura 10 mestra o decréscimo no tamanho dos aglomerados quando as células EBvl3 são passadas de um meio com uma concentração elevada de Ca2+ e Mg/+ para. uma concentração baixa.
7.2 - CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAS CELULARES EBX DE
PATO 7.2.1 - Morfologia das células EBx de pato A análise por microscopia electrónica de transmissão de células dEBx® foi realizada pelo Dr. A Rivoire (Lyon, França). As células EBx© de pato apresentam uma morfologia típica das células estaminais embrionárias (i.e. proporção elevada de núcleo-citoplasma) que se assemelha ao fenótipo das células estaminais embrionárias de murganho e às células VIVALIS EB14 descritas em WO2006/108846. As células EBx® de pato são células pequenas e redondas (diâmetro ~10 pm) com núcleo e nucléolo grandes, - 14 0 - ΡΕ2150275 com pseudópodes pequenos prolongando-se a paLrtir da membrana plasmática (Figura 4). São metabolicamente muito activas com um citoplasma rico em ribossomas e mitocôndrias. Possuem numerosos vacúolos intracelulares, um sistema de Golgi muito desenvolvido e um retículo endoplasmático granuloso. 7.2.2 - Expressão da telomerase das células EBx® de pato A expressão da telomerase durante diferentes fases do estabelecimento das células EBx® de pato foi estudada usando o kit de detecção de telomerase da Roche (Telomerase OCR ELISA). Observou-se que a telomerase é altamente expressa em células aderentes EBx® de pato, assim como durante a privação de células de suporte, durante o processo de adaptação das células EBx® de pato ao crescimento era suspensãc ) e durante a remoção das células de suporte. A Fi .gura o mostra que EB24 e EB26 de pato expressam níveis elevados de telomerase, tal como as células EB14 de galinha. EB66 de pato também expressam níveis elevados de telomerase ao longo das passagens celulares. Esta elevada actividade de telomerase é estável em células EB66 após adaptação em diferentes SFM (Figura 15) . 7.2.3 - As células EBx® de pato não apresentam actividade endógena de transcriptase reversa A expressão de transcriptase reversa endógena foi 141 ΡΕ2150275 investigada por análise directa F-PERT (Lovatt et al,, 1999, J. Virol. Methods, 82:185-200) em células Clean (FRANGE). Linhas celulares EBx© de pato, EB24 (dados não apresentados), EB66 (dados não apresentados), EB26 e EB51 não apresentam actividade de transcriptase reversa (RT) endógena (Figura 6A) , A actividade RT foi detectada em culturas de células EB14 de galinha assim como, em menor grau, em fibroblastos embrionários de galinha derivados de estirpes de galinha sem patogénicos específicos (SPF), A presença de partículas retrovirais endógenas, replicativas ou não replicativas, no sobrenadante de cultura celular de células EBx® de pato e de galinha foi estudada, através de um ensaio de ELISA que detecta o principal antigénio da cápside da leucose aviária P27. Todas as linhas celulares EBx de pato (EB2 6, EB5-1, EB24, EB66...) assim como Ebvl3 de galinha não secretam o antigénio ALV p27. Pelo contrário, as células EB14 de galinha expressam o antigénio ALV P27. 7.2.4 — As células EBx de pato não secretam vírus da leucose aviária (ALV) replicativo 0 ensaio de cocultura de celuicis EBx de pato com a linha celular QT6 de codorniz, conhecida por ser sensível a ALVs endógenos e exógenos, foi realizado para detectar a presença de vírus de pato endógenos replicativos. A Figura 7A descreve o princípio da co-cultura com QT6. a presença de vírus replicativo é detectada por um ensaio de ELISA que 142 ΡΕ2150275 detecta o principail antigénio da eápside da leucose aviária p27 . 0 ensaio demonstra que nenhuma das células EBx© de pato testadas secreta ALV repl icativo (i.e. competente para a rep licação) (Figura 7B) 7.2.5 - As células EBx de pato expressam recepto-res de vírus da gripe das aves e humanos A detecção de receptores dos vírus da gripe das aves (Saa2-3Gal) e humanos (Saa2-6Gal) em células SBx de pato foi realizada por: análise de separação de células fluorescentes usando lectinas marcadas com. digoxigenina (Boehringer): - A lectina aglutinina de Sambuca nigra liga-se especificamente a Siaa2-6Gal; - A lectina aglutinina de Maackía amurensis liga-se especificamente a Siaa2-3Gal. de NaCl e
As células de galinha EB14 e EBx de pato foram laveLdas em í-IEPES 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,5 e ressuspensas no mesmo tampão numa concentração final de 5 x 10°. As células foram incubadas durante 30 min em gel, depois durante mais 15 a 30 minutos na presença de SNA ou ΜΑΆ. As células tratadas com lectina foram lavadas em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,5, antes da incubação em gelo durante 15 a 30 minutos com anticorpo anti-digoxigenina marcado com FiTC. Em seguida as células foram lavadas em 0,9% analisadas por FACS. 143 ΡΕ2150275
As células EB14 de galinha e as células EBx de peito expressam receptores da superfície celular compreendendo oligossacáridos com resíduos Siaa2-6Gal e Siaoí2-3Gal (Figura 8) . 7.2.6 - Cariótipo A análise do cariótipo foi realizada para testar a diploidia celular e a origem aviária das células EB24 e EB66 de pato. As células na fase exponencial do crescimento foram colhidas e tratadas 3 a 6 horas com colcemida (0,6 mg/ml). Após lavagem e centrifugação, foi efectuado um choque hipotónico em células com. KC1 (0,56%) durante 20 minutos. Subsequentemente, as células EB24 e EB66 de pato foram fixadas em metanol/ácido acético (3/1) e guardadas durante a noite a -20°C. No dia seguinte, a rnetáfase foi frxada em vidro, corada com uma solução de Wright/Giemsa e observada ao microscópio.
Observaram-se várias séries de metáfases confirmando a origem de pato das células EBx. Não se observou evidência de poliploidia. A Figura 16 mostra 0 cariótipo dipióide das células EB66 de pato (Figura 16). EXEMPLO 6: Replieaqâo de poxvirus na linha celular EBvl3 de galinha çao A susceptibilidade das células eBv!3 à infecç 144 ΡΕ2150275
Use o orotoco! que da nfecção, 0,4 x élulas se segue: Três dias antes EBvl3 (passagem 188)/ml com poxvírus foi investigada u s cLndo um vírus c Ank. ara modifi cado recombinante (MVA) codificador GFP (Proteína fluorescente verd< -N X — > · foram semeadas em frascos T175 com 40 ml de SFM Exceli 65319 (SAFC) suplementado com Glutamina 4 mM. A infecção foi realizada a uma multiplicidade de infecção de 10-2 TCIDso/célula (o stock MVA-GFP é pelo menos 10e9,7 TCID/ml) . Urna hora pós-infecção, adicionou-se 60 ml de meio fresco ao frasco. A cultura e a infecção foram, efectuadas a CO·: Θ igitc 60 rpm. Todos os dias apóí ',5% inf e cção, foi de célula a> « aval iaçao da Resu midamente 2^03 izada ern plac as de 9 (5 colhida e congelada uma alíquota da suspensão No final da cinética, foi efectuada uma produtividade seguindo o método de TCID50. , a titulação de vírus MVA-GFP infecciosos foi células DF-1. As células foram semeadas em alvéolos de fundo plano a uma densidade de 15 x 103 células/alvéolo em meio DMuM (Biowhitaker) suplementado com 5% de soro feta de vitela (FCS) (SAFC) e qu atro horas ma i s amostras diluídas L-glutamina 2 mM (Biowhitaker). Vinte e tarde, as células foram infectadas com dez vezes sequencialmente em DMEM e incubadas durante uma semana a 37°C, 5% infecciosidade do víru microscópio do efeito infectadas expostas a foram calculados de a C02 numa atmosfera húmida. A s foi medida através de observação ao citopático gloioar (CPE) e as células UV. Em seguida, os títulos de TCID50 cordo com o método de Reed e Muench 145 ΡΕ2150275 (1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97). Ao longo da experiência a proliferação e viabilidade celulares foram monitorizadas. As células EBvl3 de galinha Valo parecem ser altamente sensíveis à infecção por MVA-GFP (Figuras 3A-3B). EXEMPLO 8: Replicação de poxvírus em linhas celulares EBx de pato A susceptibilidade das células EBx de pato à infecção com poxvírus foi estudada usando um vírus da vacina Ankara modificado recombinante codificador de GFP. A titulação do vírus foi realizada como anteriormente descrito para as células de galinha EBvl3. 8.1 - Método de cultura das células
As células EBx de pato foram guardadas em crio-tubos em azoto líquido a -196°C (20 x 106 células/tubo). Os criotubos foram directamente descongelados num banho-maria ά suspensão ae ce pré-aguecido a +37' slulas foi colocada ml de me i o de culti mi n a 30 0 ±20 g, de cultura fresco nte homogene i z ado. ano. A contagem tem m pré-aquecido. Após centrifugação (5 mi amostra foi contada usando azul tr ser 5:20 x 106 células e a viabilidade tem de ser >70% pare garantir uma boa cultura. 14 6 ΡΕ2150275 A suspensão celular foi semeada num frasco T75 cm2 e incubada a +37 °C em atmosfera de 7,5% de C02 numa agitador orbital a 50 rpm. Adicionou-se então meio fresco diariamente. As células foram então passadas para aumentar a biomassa celular para semear um biorreactor de 31. São necessárias 320 x 106 células para inocular um biorreactor de 3 1. Uma amostra foi retirada após mistura suave para fazer a contagem com azul tripano para determinar a densidade celular. Uma mistura de 150 ml de células foi preparada de forma a obter uma concentração de 0,4 x 106 Γ-ώ 1 n O -L. o-. 1 as.rri .1 ! no voí ume final de r·'· - v_. θ'. ltura Gtd 8 v 3 0 ml no bior react or. Antes da sementeira d. 3 s cél . U1.3 S f o pH f o i a j us tado no recipiente a 7,2 (devi do ao pH baixar d evido 3 inje cção de CC'2 na Cm TU í k_> CA G ' erficie). A TA O ir"v- 2 foi estabe le cida em 50% de s a .turação de o2 (o c o n t r o 1 a d o r do f 1 uxo de ma . S S 3 T. o i 3 ’ "j U S tado a 100% que COI :responde a uma . velo cidade máxima de flux o de aspersão de 50 ml.min-1) . No começ o do pr ' O c :esso, o pH j :oi mantrdo pela i n j Θ C Ç 3 O GB co2 na : superfí i cií e, ma i s tard e, é controlado ΟΘ i 3 3CÍJLÇ30 G0 7 i ' ¥ ' 5% de NaKCCU. C ) arej 3 “ ment O '3. g. superfície fo i iniciado com 3 ΤΓ Γ ium fluxo de 0 f 3 ml.min 7 A contaaem das células foi realizadsi de rotina
Após 3 dias de cultura, a densidade celular deverá ser superior a 4-5 x 10° células. ml-1. Se for atingida a densidade celular esperada, a infecção virai é realizada a uma MOI de 10-4. A temperatura do recipiente é estabelecida em 33°C. A mistura de infecção é preparada em 10 ml de meio de produção. Após inoculação da mistura de infecção no biorreactor, a absorção virai é realizada 147 ΡΕ2150275 durante 1 hora. 0 meio de produção final é preparado: e, 1,5 1 de meio de produção, adiciona-se tripsina de forma a obter uma concentração final no recipiente de 0,30,1-1 (2,3 1 na totalidade), 0 meio de produção final pré-aquecido é então adicionado. Todos os dias uma amostra de aproxi-madamente 15 ml é colhida do biorreactor para fazer a contagem, análise da morfologia das células e observar CPE. Os metabolitos tais como glutamato, glutamina, lactato e glucose foram analisados ao longo da cultura com o programa informático BioProfile Basic. A concentração dos metabolitos foi ajustada se necessário. Por exemplo, se necessário a concentração de glutamina é ajustada a 2 rnM. Se necessário, a concentração de glucose é ajustada a 2 g.i"1· fina) A titulação do virus foi realizada experiência usando todas as amostras colhidas. 8.2 - Resultados 8.2.1 - Cinética do crescimento celular de células EBx® de pato num biorreactor de 31 de bloco alimentado
As células EBx® de pato são de rotina cultivadas num biorreactor com agitação no tanque. A biomassa derivada cimento 5- 6.106 3 a 10 g xx .ir s η τι. θ de EBx® de pato acumula-se a 37°C num meio de cres celular até ser atingida uma densidade celular de células/ml. Em seguida a mistura é diluída cerca de vezes e a cinética de crescimento celular é seguida - 148 - ΡΕ2150275 um período de 10 dias. Em tais condições, a densidade celular de 12 a 20 milhões de células/ml é de rotina atingida por volta do dia 5 a 8. Assim, as células EBx© de pato apresentam uma gama de razão de passagem que vai até oelo menos até 10 a 15 vezes. 8.2.2 - Influência da composição do meio de cultura celular no tamanho dos aglomerados de células EBx de pato
Os inventores encontraram que a concentração de cálcio e magnésio no meio sem soro usado para a cultura e infecção das células EBx pode ter impacto no tamanho dos aglomerados. A Figura 10 mostra o decréscimo no tamanho dos aglomerados. A presença de pequenos aglomerados de células EBx de pato melhora a infecção e propagação de vírus, conduzindo a títulos elevados de vírus MVA (Figura 9Ά). 8.2.3 - Produção de virus MVA em biorreactor de 31. A biomassa derivada de EBx® de pato acumulou-se durante a fase de proliíeração celular em meio de crescimento Exceli 66444. As células foram então infectadas com 10-2 TCID50/ceiula de vírus MVA-GiP e a mistura foi diluída em meio de produção Exceli 66444. Após adição de meio Exceli fresco, a densidade celular caiu no dia 2 e no dra 4, a densidade celular dos células infectadas aumentou e atingiu 12 milhões de células/ml. Em. tais condições, a 14 9 - ΡΕ2150275 produtividade de MVA-GFP foi elevada. Uma vez que no dia 4 pós-infecção, o titulo de MVA-GFP é cerca de 108 TCID5o/ml (Figura 9B). Um rendimento de MVA-GFP de 205 TCID5Q/célula foi obtido em células RBx© de pato. em linhas EXEMPLO 9: produção de virus da celulares EBx de pato 9.1 ~ Materiais & Métodos 9.1 — Ensaio de infecciosidade do virus da gripe (TCID50)
Atitulação de vírus da gripe infecciosos foi realizada em. células MDCK. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 alvéolos de fundo plano numa densidade de 3xlOJ células/alvéolo em meio UltraMDCK suplementado com L-glutamina 2,5 mM. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram infectadas com amostras diluídas dez vezes sequencialmente em UltraMDCK contendo 6 pg.ml”1 de tripsina-EDTA e incubadas durante uma semana a 3o°C, 5-¾ CC'2 numa atmosiera húmida. A replicação do virus usando eritroeitos de foi então testada num ensaie galrnua e os títulos TCIluq toram calculados de acordo com o método de Reed e Muench (1938)*._*Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am, J. Hyg. 27, 493-97). ΡΕ2150275 150 9.1.2 - Ensaio de imunodifusão radial simples (SRID) A concentração de hemaglutinina nas amostras derivadas de células EB14 infectadas com vírus da gripe, foi determinada como descrito por Wood e colaboradores*. Resumidamente, placas de vidro foram revestidas com um gel de agarose contendo soro anti-gripe (concentração recomendada fornecida por NIBSC) . Após o gel ter solidificado, 10 μΐ das diluições adequadas da referência e das amostras foram aplicados em poços de 3 mm de diâmetro feitos com punção. Após uma incubação de 18-24 h numa câmara húmida à temperatura ambiente, as placas foram embebidas em 0,9% NaCi e lavadas com água destilada. O gel foi então pressionado e seco. As placas foram coradas com solução de Coomassie Brillliant Blue durante 15 min e descoradas duas vezes numa mistura de metanol e ácido acético até se tornarem visíveis zonas coradas claramente definidas. Após secagem das placas, o diâmetro das zonas coradas que rodeia os poços do antigénio foram medidas em duas direcções em ângulos rectos. As curvas de dose-respostai das diluições de antigénio em função dai. superfície calculados de de razão de single-radial-influenza hae-de t e r m i n a t i o n s foram construídas e os resultados foram acordo com métodos de ensaio padronizados declives. *Wooci JM. Et al. "An improved immunodiffusion technique for the assay of magglutinin antigen: application for potency of inactivated whole virus and subumt vaccines" (J. Biol. Stand., 1977, 5(3):237-47). 151 ΡΕ2150275 9.1.3 - Análise de transferências Western da proteína hemaglutinina do vírus da gripe
Fez-se SDS-PAGE como descrito por Laemmli UK (1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685) em gel de 10% de poliaerilcimidci. As proteínas desnaturadas (1% SDS, β-mercaptoetanol 70 mM) foram transferidas para membrana de polivinilideno (Hybond P, Amersham) através de um procedimento de transferência semi-seca (Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of multiple gels : a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose (J Brochem Biophys Methods 10:203-209). As transferências foram bloqueadas durante 1 h à temperatura ambiente com uma mistura composta por 5% de leite em pó desnatado em TBST suplementado com 1% FCS (SAFC). Em seguida, as transferências foram incubadas durante a noite em solução de bloqueio suplementada com soro policlonal de carneiro específico anti-HA (1:500 (NIBSC). As transferências foram lavadas 6 vezes com TBST e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo policlonal de coelho anti-IgG de carneiro (1:5000 (Rockland) em solução de bloqueio. Após 6 lavagens com TBST, o complexo de proteína-conjugado foi finalmente revelado usando quimioluminescência (kit ECL, Amersham) e filmes (Hyperfilm, Amersham). ΡΕ2150275 152 9.2 - Infecgão com virus da gripe de células BBx® 9.2.1 - Material e equipamento
Material de descongelação das células
Cat# 831813502) soro) littaker, Cat# BE17- - frascos T75 cm2 (Sarstedt, - Meio de cultura (meio sem L-Glutamina 2Q0mM (Biow - Agitador orbital IKA KS260 (Fisher Bioblock, Cat# F35044)
Material de amplificação das células frascos T17 5 cm2 (Sars tedt, Cat# 831812502) Meio de cultura (me i o sem. soro) : Exceli 65319 65319-10 00M1687) com c adição de glutamina para 2,5 rriM. -Glutamina 200mM (Biowhittaker, Cat# BE17-60 5E) D (+) Glucose (45 %) (Sigma, Cat# G8769)
Material de producí:
- Meio de produção (meio sem soro): Exceli 65629 (JRH, Cat# 65629) suplementado com glutamina 2,5 rnM - 1,-Glutamina 200mM (Biowhittaker, Cat# BE17- 605E) 153 ΡΕ2150275 - D (+) Glucose (45 %) (Sigma, Cat# G8769) - Trypzean IX (Sigma, Cat# T3449) - solução de bicarbonato de sódio a 7,5% (Sigma, Cat# 205-633-8) - Estirpe de vírus da gripe (Congelada a -80°C) 9.2.2 - Método de cultura das células (Idem como para a replicação de MVA - Exemplo 7.1)
Titulação de vírus, ensaios de hemaglutinação (HAU) e quantificações de antigénio HA (transferências Western, SRID) foram realizados no final da experiência usando todas as amostras colhidas. 9.3 - Resultados
Os inventores demonstram que as células EBx de pato são um substrato celular reprodutível e eficiente para a replicação de várias estirpes de vírus da gripe A e B. A produção de vírus da gripe pode ser realizada em vários recipientes, tais como frascos e frascos com agitação magnética (dados não apresentados) e biorreactores. Os inventores obtiveram um processo de bloco alimentado reprodutível e eficiente de produção de vírus da gripe em biorreactores de tanque agitado de 3 1 e 30 1. De rotina, obtiveram-se rendimentos virais de 15 mg/1 até 50 mg/1 de 154 ΡΕ2150275 hemaglutinina era irascos e em biorreactores com as estirpes A e B do vírus da gripe (Figuras 11 e 12) , EXEMPLO 10: Replicagão do vírus da doença de
Newcastle em linhas celulares EBx de pa-hn A susceptibilidade das células EBx de pato à intecção com vírus da doença de Newcastle foi estudada usando uma estime NDV La Sota. 10.1 - Métodos
Células EBx® foram crescidas em meio Exceli (SFAC) em frascos T175 a 37°C sob atmosfera de 7,% C02 num agitador orbital a 60 rpm. No dia 0, as células foram semeadas a 0,4 x 106 células/ml em 40 ml de meio fresco. A cultura celular foi incubada a 37°c, 7,5% C02 com agitação (60 rpm). A cinética de crescimento celular foi seguida até a densidade celular atingir uma concentração entre 4 x 106 e 6 x 106 células/ml (geralmente no dia 3 após sementeira). Nessa altura, as células sao inoculadas com a estirpe NDV
La Sota a duas MOI. diferentes (10~ 3 e 10~4 TCIDso/ incubadas durante ma is uma hora a 37 °C, 7,5% agitação ( 60 rpm). As cinéticas de crescimento cel .u2 com celular e de produção de vírus foram realizadas ao longo de 7 dias. Como fonte de protease, adie (SAFC) diariamente ao meio concentrações de tripsina onou-se tripsina recombinante de cultura: foram testadas duas (0,4 e 0,75 USP/ml) . Alíquotas 155 ΡΕ2150275 diárias foram removidas para contagem das células, titulação do vírus e análise de transferências Western.
As amostras foram separadas usando 10% SDS-PAGE e transferidas para membrana PDVF (Amersham) através dsi técnica semi-seca. A imunodetecção foi realizada usando anti-soro policlonal de galina contra NDV (1:2000, CHARLES RIVER laboratories) , seguido de anticorpos de coelho anti-galinha conjugados com fosfatase alcalina (1:5000, SIGMA). O anticorpo secundário ligado foi detectado usando o kit de detecção por quimioluminescência ECL (ROCHE).
As células EBx de pato e de galinha são sensíveis e replicam a estirpe NDV La Sota. Os títulos (em TCID50/ml) de NDV produzido em células EBx® aumentam a partir do dia 0 até ao dia 2 pi para atingir uma média de 10°'OJ TCID5o/ml (Figura 13, painel esquerdo). A análise de transferências Western (Figura 13, painel direito) mostrou a expressão de proteínas virais de NDV (HN, Fo/F, NP & M) . A composição das proteínas virais do vírus NDV7 produzido em células EBx® é semelhante à obtida com o vírus NDV produzido em células EBx® de galinha. Ainda, a cinética de libertação de virus produzidos em células EBx de galinha e de pato é semelhante. 156 ΡΕ2150275 EXEMPLO 11: Replicação do vírus do sarampo em células EB66 dg* pato
Tnnnnnnnnn ' JL-·***********111111111111111111"""""""—"""mnininná» —— com vír sarampo verde. A susceptibilidade das células EB66 à infecção is do sarampo foi estudada usando um vírus do recomjoinante expressando a proteína fluorescente ·1 - Métodos Células EB66 foram crescidas em meio Exceli (em frascos TI75, a 37°C, sob atmosfera de 7,% CO2 num agitador oroital a 60 rpm. No dia 0, as células foram semeadas a 0,4 x 106 células/ml em 40 ml de meio fresco, A cultura celular foi incubada a 37 °C, 7,5% CO2 com agitação (60 rpm), A cinética de crescimento celular foi seguida até a densidade celular atingir uma concentração entre 4 x 1Q6 e 6 x 106 células/ml (geralmente no dia 3 após sementeira). Nessa altura, as células são inoculadas com vírus do sarampo recombinante a duas MOI diferentes (10_1 e 10'2 TCID50/ célula) e incubadas durante mais uma hora a 37°C, 7,5% CO2 com agitação (60 rpm) . Em seguida a cultura celular foi diluída com a adição de 60 ml de meio de produção virai fresco e a incubação continuou a 37°C e com 7,5% CCç, com agitação (60 rpm). As cinéticas de crescimento celular e de produção de vírus foram, realizadas ao longo de 7 dias. Alíquotas diárias foram removidas para contagem das células e titulação do vírus. ΡΕ2150275 157 do saramp TCIDso/ml) uma média Lisboa, 6 11.2 - Resultados
As células EB66 são sensíveis e replicam o virus o. Em condições não optimizadas, os títulos (em de virus do sarampo produzido em EB66 atingiu de 10' TCIDso/ml (Figura 14) . de janeiro de 2014

Claims (4)

  1. ΡΕ2150275 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para obtenção de linhas celulares aviárias continuas, derivadas de células estaminais embrionárias (ES), em que as referidas linhas celulares aviárias são capazes de proliferar num meio basal na ausência de factores de crescimento e camada de suporte e não produzem partículas de retrovírus endógenos competentes para replicação, o referido processo compreendendo os passos de: a) isolamento de um ou mais embriões de aves numa fase do desenvolvimento por volta da postura, em que a referida ave é seleccionada da ordem Anseriformes e o genoma da referida ave não possui sequências provirais endógenas susceptíveis de produzir partículas retrovirais endógenas competentes para a replicação; b) suspensão de células estaminais embrionárias aviárias (ES) obtidas através da dissociação de embriões do passo a) num meio de cultura basal suplementado com: - factor de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1) e factor neurotrófico ciliar (CNTF); - soro animal; c) sementeira da suspensão de células ES obtidas no passo b) numa camada de células de suporte e ainda cultura das células ES durante pelo menos uma passagem; d) remoção de IGF-1 e de CNTF do meio de cultura e ainda cultura das células durante peio menos uma passagem.; ΡΕ2150275 e) redução pro gressiva da concen tração das células de suporte no meio de cultura de forma a obter uma remoção total da camada de suporte após várias passagen S Θ ainda cultura das células; f) obtenção de linhas celulares aviár ias continuas diplórdes ade rentes der ivadas de células ES C3.pciZ0S de proliferar num meio oasal na. ausêncrn de T. cL C t Οr Θ S de crescimento e de uma camada de células de suporte,. em que as referi lQSS 1 iníias celulares aviárias não produzem pa rticulas de retrovirus endógenos competentes para a replrcaçao. 2. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que após o passo e) a concentração de soro animal no meio de cultura é progressivamente reduzida de forma a obter uma remoção total do soro animal após várias passagens. 3. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que as referidas linhas celulares aviárias aderentes são adaptadas a condições de cultura em SliSpSRScLO . 4. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a remoção dos factores de crescimento IFG-1 e CNTF do mero de cultura no passo d) é realizada simultaneamente, ΡΕ2150275 reivn 5. 0 processo de qualquer uma c dicações 1 a 4, em que a referida ave é um pato, 6. 0 processo de acordo com a reivindicação 5, em que o referido pato é um pato de Pequim. 7. 0 processo de acordo com a reivindicação 5, em que o referido pato é um pato mudo. 8. 0 processo de acordo com a reivindicação 7 em. que o ovo do referido pato mudo é incubado para maturar antes do isolamento do embrião de pato. 9. 0 pi :o cesso de ações 1 a 8 em q "1 -| a diplóides contín uas carac terí sticas: - uma ele' vada pr opor - uma d. V-' ividade oe - um diâm etro de apr - um temp o de di ipli a 37°C í s referidas linhas celulares ou menc as referidas células expressam um ou mais marcadores adicionais seleccionados no grupo constituído por fosfatase alcalina, SSEA-1, EMA-1, ENS1 e em que as referidas células não produzem partículas de retrovírus endógenos competentes para a replicação. 4 ΡΕ2150275
  2. 10. Um processo de replicação de um vírus numa linha celular aviária diplóide contínua obtida pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, compreendendo os passos de: a) infecção das referidas células aviárias com um vírus de interesse; b) cultura das referidas células aviárias infectadas de forma a replicar o referido vírus; c) colheita do vírus no sobrenadante da cultura de células e/ou dentro das referidas células. 11. 0 processo de acordo com a reivindicação 10, em. que o referido vírus é seleccionado do grupo compreendendo poxvírus, ortomixovírus, paramixovírus, herpes-vírus, hepadanvírus, adenovírus, parvovírus, reovírus, avivírus, togavírus, birnavírus circovírus, cor o n a ví ru s, e retrovírus.
  3. 12. O processo de acordo com a reivindicação 10, em que o vírus é seleccionado do grupo consistindo em: um poxvírus ou um poxvírus recomblnante seleccionado entre o grupo compreendendo vírus da vacina modificado Ankara (MVA), vírus da vacina Lister-Elstree, vírus da vacina LCl6m8, vírus da vacina CV178, poxvírus das galinhas, poxvírus dos canários (i.e. ALVAC), NYVAC, juncopoxvírus, poxvírus dos mainás, poxvírus dos pombos, 5 ΡΕ2150275 poxvírus dos psitacídeos, poxvírus das codornízes, poxvírus dos pardais, poxvírus dos estorninhos, poxvírus aos perus; _ um paramixovírus ou um paramixovírus recom-binante seleccionado do grupo constituído por vírus do sarampo, vírus da psipeira, vírus da rubeola, vírus Sendai, vírus sincicial respiratório (RSV), vírus da para-influenza humana tipos I e canina, vírus da III, vírus Rinderpest, vírus da diarreia doença de Newcastle, vírus para-influenza dos patos; - um ortomixovírus, um ortomixovírus recombinante ou um ortomixovírus com redistribuição de segmentos genómicos seleccionado entre vírus da gripe humano, vírus da gripe das aves, vírus da gripe equina, vírus da gripe suína, vírus da gripe felina; - urr i togavírus de preferência seleccionado entre vírus Sindbi s, vírus da floresta Semliki, vírus Qfnyonc Vnyong, vírus chikungu nya, vírus Mayaro, vírus Ross river, vírus da encefalite equina do leste, vírus da encefalite equina do oeste, vírus da encefalite equina venezuelana ou um recombinante dos mesmos togavírus; um retrovírus seleccionado entre vírus da reticulo-endoteliose, vírus da anemia infecciosa dos patos, vírus da necrose do baço dos patos ou um recombinante destes retrovírus; um parvovírus dos patos ou um recombinante destes parvovírus; - um adenovírus seleccionado entre adenovírus das galinhas, adenovírus dos gansos, adenovírus dos patos e aaenovírus dos pombos ou um recombinante destes adenovírus; 6 ΡΕ2150275 - um birnavírus, de preferência o virus da doença infecciosa o.a oursaç e um flavivírus, de preferência, seleccionado entre virus da dengue, virus da encefalite japonesa e virus do Nilo Ocidental.
  4. 13. Um processo de produção de proteínas e péptioos recomblnantes, compreendendo os passos de: a. modificação genética das linhas celulares diplóides continuas obtidas pelo processo de acordo com i O. a s reivindica ções 1 «a Q Λ Cl -J f Cl trai /és de tra ns- itói ' ΐ cL O U Θ S L. cL V Θ 1 de um vector de expressão; sei Θ C Ç ã 0 0.3. S .1 nhas cel miares a vi árias gene t i - .. f .i_ Câdá S GXp-í Θ S S 3.Π0.0 as referi aas proteínas ou ombi nantes; e P urificação dos referido s péptidos ou proteínas recomblnantes. Lisboa, 6 de janeiro de 2014
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