JP2002536012A

JP2002536012A - 鳥類の多能性胚性生殖細胞株

Info

Publication number: JP2002536012A
Application number: JP2000598617A
Authority: JP
Inventors: ハン、ジャエ・ヨン; パーク、タエ・スブ
Original assignee: ハン、ジャエ・ヨン; ハンミファーム．シーオー．，エルティーディー．
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 2000-02-11
Publication date: 2002-10-29
Also published as: CN100386429C; AU768357B2; ATE378398T1; CN1373798A; RU2215029C2; EP1155114B1; EP1155114A4; CA2359775C; CA2359775A1; DE60037107D1; AU2578000A; DE60037107T2; EP1155114A1; WO2000047717A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、(a)鳥類の胚性生殖腺から分離した始原生殖細胞(primordial germcell, gPGC)を、細胞成長因子および分化抑制因子を含む培地で培養して胚性生殖（ＥＧ）細胞コロニーを得る段階；(b)得られたＥＧ細胞を栄養補給層(feederlayer)を用いてＥＧ細胞がコロニー化するまで前記段階（ａ）と同様な培地で培養する段階;および(c)ＥＧ細胞を回収し、前記段階（ａ）と同様な培地で継代培養してＥＧ細胞株を確立する段階を含む、鳥類の胚性生殖細胞株を確立するための製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

発明の分野本発明は、確立された鳥類の多能性胚性生殖細胞(embryonic germ cell, EG c
ell)株の製造方法および鳥類の多能性胚性生殖細胞株に関する。

【０００２】

【従来の技術】

発明の背景胚性幹細胞(embryonic stem cell, ES細胞)株は、胚盤胞または桑実胚から分
離された未分化した多能性細胞である。胚性幹細胞は、発生学的研究、全能性(t
otipotent)細胞の特性分析および遺伝子変形家畜を生産するための遺伝子標的な
どに非常に有用であると期待されるが、立証された生殖系列伝達(germ-line tra
nsmission)を有するマウス胚性幹細胞のみが確立され(Evans, M. J. and Kaufma
n, M. H., Nature, 292, 154-156(1981); Bradley et al., Nature, 309, 255-2
56(1984))、マウス以外の他の種においては生殖系列への伝達の限界のため、家
畜を生産するにおいて胚性幹細胞を用いることはまだ実現されていない(First,
N. L. et al., Reprod. Feril. Dev., 6, 553-562(1994); Wheeler, M. B., Rep
rod. Fertil. Dev., 6, 563-568(1994); Giles, J. R. et al., Mol. Reprod. D
ev., 36, 130-138(1993); and Doetschman, T. C. et al., Dev. Biol., 127, 2
24-227(1988))。

【０００３】最近は、性的に成熟した後発達した精子や卵子細胞の前駆細胞である始原生殖
細胞(primordial germ cells, PGCs)が多能性を有する新しい幹細胞として提供
されている。始原生殖細胞に由来する幹細胞は、胚性生殖細胞(embryonic germ
cell, EG細胞)と呼ばれる(Resnick, J. L. et al., Nature, 359, 550-551(1992
);およびMatsui, Y. et al., Cell, 70, 841-847(1992))。マウス始原生殖細胞
は、分裂抑制処理したＳＴＯ細胞を基底細胞とし、幹細胞成長因子（Stem cell
factor；ＳＣＦ）、血漿白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor；ＬＩＦ
)および塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；ｂＦＧ
Ｆ）の三つの重要な成長因子を添加した培地で成功的に培養された(Godin, J. R
. et al., Mol. Reprod. Dev., 36, 130-138(1991); Dolci, S. et al., Nature
, 352, 809-811(1991); Matsui, Y. et al., Nature, 353, 750-752(1991); and
Resnick, J. L. et al., Nature, 359, 550-551(1992))。レスニック(Resnick)
らは、マウス始原生殖細胞が継代培養の後にも引き続いて分裂し、ＥＳ細胞と類
似した細胞のコロニーを形成したと報告した(Resnick, J. L. et al., Nature,
359, 550-551(1992))。ラボスキー(Labosky)らは、マウスＥＧ細胞株がインビボ
で生殖系列への伝達のために要求される多能性を有すると報告した(Labosky, P.
A. et al., Development, 120, 3197-3204(1994))。

【０００４】ウシおよびブタＥＧ細胞については、形態、アルカリポスファターゼ活性およ
び胚子体形成などに関する報告がされている(Cherny, R. A. et al., Reprod. F
ertil. Dev., 6, 569-575(1994); Shim, H. et al., Biol. Reprod., 57, 1189-
1095(1997); Piedrahita, J. A. et al., J. Reprod. Fertil., 52, 245-254(19
97))。しかし、生殖系列への伝達はこれらの種においてはまだ立証されていない
。

【０００５】ペイン(Pain)らは、色んな形態学的な可能性を有する鳥類胚性幹細胞がインビ
ボで胚盤葉細胞の長期培養によって得られ、保存できると報告した。しかし、始
原生殖細胞由来の多能性ＥＧ細胞を製造することは哺乳類以外の種においてはま
だ報告されていない。

【０００６】鳥類の始原生殖細胞は、外胚葉から発生し、４細胞期胚（培養後約１８〜１９
時間）に生殖腺内胚葉(生殖三日月環)に移動する(Swift, C. H., Am. J. Anat.,
15, 483-516(1914); Hamburger, V. and Hamilton, H. L., J. Morphol., 88,
49-92(1951);およびEyal-Giladi, H. and Kochav, S., Dev. Biol., 49, 321-33
7(1976))。始原生殖細胞は、１０〜１２細胞期胚に生殖三日月環から血管に移動
し(Ando, Y. and Fujimoto, T., Dev. Growh Differ., 25, 345-32(1983); and
Ukeshima, A. et al., J. Electron. Microsc., 40, 124-128(1991))、１７細胞
期胚(２．５日培養)まで循環器で循環した後、原始生殖腺領域に到達して集結し
、コロニー化する(Nieuwkoop, P. D. and Sutasurya, L. A., In Primordial Ge
rm Cells in the Chrodates, 113-127(1979))。この移動経路およびその発達過
程は哺乳類における過程と非常に異なる。

【０００７】アリオーリ(Allioli)らは、生殖腺から分離したニワトリ始原生殖細胞を体外
培養条件の下で数日間増殖させ得ると報告した(Allioli, N. et al., Dev. Biol
., 165, 30-37(1994))。チャン(Chang)らは、生殖隆起由来の間質細胞(germinal
ridge stroma cells, GRSCs)上で生殖腺からのニワトリ始原生殖細胞(gonadal
PGCs, gPGCs)を５日間培養するのに成功した(Chang, I. et al., Cell Biol. In
t., 19, 569-676(1995))。このように培養したｇＰＧＣｓは、受容体胚子内へ再
注入したとき、生殖隆起へ移動する能力を有する。最近、チャンらは、体外で５
日間培養したｇＰＧＣｓを注入して生殖系列キメラニワトリを生産した(Chang,
I. et al., Cell Biol. Int., 21, 495-499(1997))。

【０００８】また、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０６５３４号には、１３〜１４細胞期胚の血液
から分離した始原生殖細胞を栄養補給層を用いずにＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦお
よびＩＧＦ−Ｉが添加された培地で培養してＥＧ細胞を確立する方法が開示され
ている。しかし、胚子から得られる血液ＰＧＣｓの量は胚子当り１００個であっ
て、ｇＰＧＣｓの胚子当り１０００個以上に比べて非常に少なく、胚子血液から
血液ＰＧＣを分離することは難しい。また、実際に栄養補給層を用いずにＰＧＣ
ｓを培養したにも拘らず、これらはただ３〜４回の継代培養した段階で培養器に
付着して形態学的に変形する。したがって、これらから得られたＥＧ細胞は既に
分化したと推定される。また、多能性検証においては前記ＥＧ細胞がアルカリポ
スファターゼ活性を有するかどうかを確認しただけ、他の特性については確認し
なかったので、実際にＥＧ細胞を確立したとはみなせない。また、確立されたＥ
Ｇ細胞の特性であるインビトロ(in vitro)およびインビボ(in vivo)分化能を有
するかどうかは全く確認できなく、継代培養後にもＥＧ細胞が引き続いて分裂す
るかに対する検証も提示されていない。

【０００９】したがって、外来遺伝子トランスフェクションおよび遺伝子標的を用いて形質
転換家禽を生産することによって外来遺伝子の世代間伝達が可能なＥＧ細胞株の
開発が要求された。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】

発明の要約したがって、本発明の目的は、鳥類の多能性胚性生殖細胞（ＥＧ）株を確立す
るための方法を提供することである。

【００１１】本発明の他の目的は、鳥類の多能性胚性生殖細胞株を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】

本発明の一実施態様によって、(a)鳥類の胚性生殖腺から分離した始原生殖細
胞(primordial germ cell, gPGC)を、細胞成長因子および分化抑制因子を含む培
地で培養して胚性生殖細胞コロニーを得る段階； (b)得られたＥＧ細胞を栄養補給層(feeder layer)を用いてＥＧ細胞がコロニー
化するまで前記段階（ａ）と同様な培地で培養する段階;および (c)ＥＧ細胞を回収し、前記段階（ａ）と同様な培地で継代培養してＥＧ細胞株
を確立する段階を含む鳥類の胚性生殖細胞株を確立するための製造方法が提供さ
れる。

【００１３】

【発明の実施の形態】

本発明の他の実施態様によって、承認番号KCLRF-BP-00026号として寄託された
ものと実質的に同様な性質を有するニワトリ胚性生殖細胞株が提供される。

【００１４】発明の詳細な説明鳥類の胚性生殖（ＥＧ）細胞株を確立するための本発明の製造方法は、鳥類の
始原生殖細胞（ＰＧＣｓ）の分離から始まる。前記鳥類は、七面鳥、ニワトリ、
ウズラ、キジまたはアヒルであり得る。始原生殖細胞は、１４〜３６細胞期胚（
培養後５０時間〜１０日）、好ましくは２４〜３０細胞期胚（培養後４日〜６．
５日）である鳥類の初期胚の胚性生殖腺から分離し得る。たとえば、２８細胞期
胚のホワイトレグホーン胚性生殖腺を分離した後、生殖腺組織をトリプシン−Ｅ
ＤＴＡによって分解してｇＰＧＣを含む懸濁液を製造する。しかし、胚子の発達
段階は本発明の目的に反しない限り上記に限定されず、どのような鳥類または器
官、組織および膜から始原生殖細胞が分離されるかによって異なり得る。

【００１５】分離した始原生殖細胞を細胞成長因子および分化抑制因子を含む培地で５％Ｃ
Ｏ_２の存在下、３７〜４２℃の温度でＥＧ細胞のコロニーが形成するまでに培養
する。前記培地は、ＤＭＥＭ培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; Gi
bco BRL ＃ 10313-021）または機能的にそれと同様な培地が好ましい。

【００１６】本発明に有用な細胞成長因子としては、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）、塩基性線
維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン11（IL-11）、インスリン類
似成長因子（insulin-like growth factor-I；IGF-I)およびこれらの混合物を含
む。代表的な分化抑制因子としては、血漿白血病抑制因子（ＬＩＦ）がある。ま
た、培養培地は、哺乳類の血清、鳥類の血清またはピルビン酸ナトリウム、グル
タミン、β―メルカプトエタノールおよびこれらの混合物からなる群から選ばれ
た補助成分を含み得る。

【００１７】培養培地は、０．１〜３０％ＦＢＳ(fetal bovine serum)、０．０２〜２０％
ニワトリ血清、０．０１〜１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０２〜２０
０ｍＭグルタミン、０．５５〜５，５００μｍ β―メルカプトエタノール、
ＳＣＦ０．０５〜５００ｎｇ／ｍｌ、ＬＩＦ０．１〜１，０００units/ｍｌ、ｂ
ＦＧＦ０．１〜１，０００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１１０．０００４〜４ｎｇ/ｍ
ｌおよびＩＧＦ−１０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭが好ましい
。

【００１８】培地に形成されたＥＧ細胞コロニーは、たとえば、ピペッティングを繰返して
ＥＧ細胞を個別的に分離し、回収したＥＧ細胞を、培地、たとえば、前述の培地
に懸濁し、次いでＥＧ細胞株の形態学的特徴を示す細胞のコロニーが形成するま
で栄養補給層上で７〜１０日間３７〜４２℃で培養する。栄養補給層としては、
鳥類の繊維芽細胞またはこれらと同等なものが用いられ、分裂抑制されていない
鳥類の胚子繊維芽細胞（ＣＥＦ）または鳥類の繊維芽細胞が最も好ましい。

【００１９】得られたＥＧ細胞を前記と同様な培地で７〜１０日間隔で継代培養して胚性生
殖細胞株を確立する。このように確立された胚性生殖細胞株は継代培養によって
４ヶ月以上保持することができる。

【００２０】また、本発明は、前記方法を用いて製造されたニワトリＥＧ細胞株を提供する
。

【００２１】ニワトリＥＧ細胞株コロニーの形態は多層からなっており、コロニーの境界が
明確である。各ニワトリＥＧ細胞は大きな核と相対的に小量の細胞質とからなり
、マウスおよびブタＥＳ細胞およびＥＧ細胞の分離された形態と類似する(Wobus
, A. M. et al., Exp. Cell. Res., 152, 212-2199(1984); Matsui, Y. et al.,
Cell, 70, 841-847(1992); Resnick, J. L. et al., Nature, 359, 550-551(19
92); Shim, H. et al., Biol Reprod, 57, 1089-1095(1997); and, Piedrahita,
J. A. et al., Biol. Reprod., 58, 1321-1329(1998))。しかし、ニワトリＥＧ
細胞の形態は、コロニーの大部分が均一な円形状であり、他の種で観察される顕
著な暗い核仁が明らかでないという点でマウスＥＳまたはＥＧ細胞とはやや異な
る。鳥類は、哺乳類と生殖細胞の生理、発達および分化において異なるため、ニ
ワトリＥＧ細胞はマウスＥＧ細胞と形態、細胞接着性およびその他の特徴におい
て異なる。

【００２２】ニワトリＥＧ細胞は、ｇＰＧＣｓおよび未分化された幹細胞の特徴を保持する
。ニワトリＥＧ細胞は、ＳＳＥＡ−１抗原を発現し、インビトロ浮遊培養で種々
の細胞の形態に分化する胚子体に成功的に発達する。また、ニワトリを用いた実
験において、ニワトリＥＧ細胞は胚発達期間の間生殖腺を含む種々の組織に増殖
し、分化すると確認されるので、これらはインビボで多能性を有する。

【００２３】本発明で確立されたニワトリ胚性生殖細胞株の一つを、特許手続上の微生物寄
託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、１９９９年９月２２日付
で韓国細胞株研究財団(KCLRF)（住所：大韓民国110-744ソウル鐘路区蓮建洞２８
番地、ソウル大学医科大学癌研究協会）に寄託番号第KCLRF-BP-00026号として寄
託した。

【００２４】体細胞または生殖系列キメラは、卵子、好ましくは受精卵の胚孔(germinal ca
vity)または血管にＥＧ細胞を微細注入することによって製造できる。さらに好
ましくは、ＥＧ細胞をＸ細胞期胚の卵子の胚孔または１３〜１７細胞期胚の卵子
の血管に注入する。

【００２５】本発明のニワトリＥＧ細胞にエレクトロポレーション(electroporation)また
はリポソームを用いて所望する外来遺伝子を形質感染させるか、形質導入させる
ことができ、これを抗生剤を含む培地で継代培養することによって安定的に形質
感染されたニワトリＥＧ細胞を選別することができる。

【００２６】したがって、本発明のニワトリＥＧ細胞は形質転換ニワトリの製造および生殖
細胞分化および遺伝子刻印の研究に有用である。

【００２７】下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲
を制限しない。

【００２８】また、下記固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に対して
下記に与えられた百分率は、別に言及しない限り各々重量／重量、体積／体積お
よび重量／体積を示す。

【００２９】

【実施例】

実施例１：始原生殖細胞の分離およびニワトリＥＧ細胞株を製造するための培
養条件の確立（段階１）始原生殖細胞の分離ソウル大学農業生命科学大学付属実験牧場から得られたホワイトレグホーン(Whi
te Leghorn)の受精卵を３７．５℃および相対湿度６０〜７０％で５．５日間(２
８まで細胞期胚)培養した。２８細胞期胚の受精卵から胚子を抽出した後、マグ
ネシウムを取除いたリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)が入っている１００ｍｍペト
リ皿で洗浄して卵黄および血液を取除いた。胚子を黒いワックスでコーティング
したペトリ皿に移し、ピンセットを用いて胚性生殖腺を分離した。生殖腺組織を
トリプシン(0.25%(v/v))-EDTA(0.05%(v/v))で処理して個々のｇＰＧＣｓを分離
した。これに、１０％ＦＢＳ(fetal bovine serum, Gibco, USA)を含むＤＭＥＭ
（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco, U.S.A.）に加えてトリプシ
ンＥＤＴＡを不活性させ、遠心分離してｇＰＧＣｓを収穫した。

【００３０】（段階２）培養条件の確立ＥＧ細胞培養培地（すなわち、ＤＭＥＭ）を幹成長因子（ＳＣＦ）、血漿白血病
抑制因子（ＬＩＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）から選ばれた
一つ以上の成長因子で補充した。ＳＣＦ、ＬＩＦおよびｂＦＧＦは、マウスにお
いてｇＰＧＣｓの生存および分裂に重要な成長因子と報告されている(Resnick,
J. L. et al., Nature, 359, 550-551(1992); and Donovan, P. J., Curr. Top.
Dev. Biol., 29, 189-225(1994))。これらの三つの成長因子の他に、インター
ロイキン11（IL-11）およびインスリン類似成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）のような成
長関連因子を培地に加えた。前記段階１で得られたｇＰＧＣｓを、前記因子を多
様に組合せて補充した培養培地に懸濁した後、ＥＧ細胞のコロニーが形成するま
で５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で培養した。

【００３１】その結果、ＩＬ−１１およびＩＧＦ−Ｉを添加しなかった実験においては、Ｅ
Ｇ細胞のコロニー化が観察されなかった。したがって、IL-11およびIGF-Iがニワ
トリＥＧ細胞の生存および分裂に必須的であることが分かる。

【００３２】実施例２：ニワトリＥＧ細胞の培養実施例１で得られたＥＧ細胞を１０％ＦＢＳ、２％ニワトリ血清(Gibco, U.S.
A.)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、５．５ｘ１０^−５
Ｍ β―メルカプトエタノール、ストレプトマイシン１００μｇ/ｍｌ、ペニシ
リン１００units/ｍｌ、ヒト幹細胞成長因子(hSCF,Sigma, U.S.A.)５ｎｇ/ｍｌ
、マウス血漿白血病抑制因子（mLIF, Sigma, U.S.A.）１０units/ｍｌ、ウシの
塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF, Sigma, U.S.A.）１０ｎｇ/ｍｌ、ヒトインタ
ーロイキン11（h-IL-11, Sigma, U.S.A.）０．０４ｎｇ/ｍｌおよびヒトインス
リン類似成長因子−Ｉ（h-IGF-I, Sigma, U.S.A.）１０ｎｇ/ｍｌを含むＤＭＥ
Ｍ培地からなるＥＧ細胞培養培地を含む２４ウェル培養プレートに接種し、５％
ＣＯ_２の存在下、３７℃の培養器で７〜１０日間培養して生殖隆起由来の間質細
胞（GRSC）層上にＥＧ細胞コロニーを形成させた。ニワトリＥＧ細胞コロニーを
軽くピペッテリングしてＧＲＳＣ層から分離した後、２００ｘｇで５分間遠心分
離して得た。得られたＥＧ細胞をＤＭＥＭに懸濁し、分裂抑制処理しなかったニ
ワトリ胚子繊維芽細胞(chicken embryonic fibroblast, CEFs)とともに新たな２
４−ウェルプレートに分株した。ＥＧ細胞コロニーを前記と同様な条件で７〜１
０日間隔で継代培養した。これらのコロニーは１０回以上継代培養が可能であり
、繰返し培養を通じて４ヶ月以上分裂させた。

【００３３】図１ａおよび１ｂは、ニワトリ胚子繊維芽細胞（CEF）上で３回継代培養した
後のニワトリＥＧ細胞コロニーを示す(１ａ：スケール、５０μmおよび１ｂ：ス
ケール、２５μm)。ニワトリＥＧ細胞の形態は、マウスＥＳまたはＥＧ細胞とは
やや異なる。ニワトリＥＧ細胞のほとんどは均一な円形状であり、ＣＥＦ栄養補
給層と強く結合していない。マウスＥＳまたはＥＧ細胞と異なり、ニワトリＥＧ
細胞は細胞間に強い結合がなく、各々の細胞を区分することは難しくない。しか
し、コロニーの形態は多層からなっており、コロニーの境界が明らかである。ニ
ワトリＥＧ細胞は、核仁を明らかに観察できない反面、大きな核と相対的に少な
い量の細胞質から構成されている。

【００３４】実施例３：ＥＧ細胞の特性確認本発明のＥＧ細胞の多能性が多能性細胞の特徴的様相を有するかどうかを確認
するために、グリコーゲンおよびＳＳＥＡ−１エピト―プの存在だけでなく、ア
ルカリホスファターゼ活性およびインビトロ分裂および分化能力などを次のよう
に調査した。

【００３５】 (1) ＰＡＳ(Periodic Acid-Shiff's)染色実施例２で得られた４回連続継代培養されたＥＧ細胞コロニーを１％グルタルア
ルデヒド溶液を含むプレートに５分間固定した後、同量のＰＢＳで２回洗浄した
。ＥＧ細胞コロニーを室温で過ヨウ素酸溶液(Sigma, U.S.A.)に５分間浸漬した
後、同量のＰＢＳで洗浄した。次いで、ＥＧ細胞コロニーを室温でShiff's溶液(
Sigma, U.S.A.)に１５分間浸漬した後、同量のＰＢＳで２回洗浄した。得られた
ＥＧ細胞コロニーを光学顕微鏡で観察した。ニワトリＰＧＣは、細胞質中のグリ
コーゲンを染色するＰＡＳ反応(Meyer, D. B., Dev. Biol., 10, 154-190(1964)
)によって容易に確認できる。図２から分かるように、相対的に弱いが、４回継
代培養後ＥＧ細胞はＰＡＳによって染色された。

【００３６】（２）抗ＳＳＥＡ−１抗体スクリーニングＳＳＥＡ−１エピトープは、未分化されたマウスＥＳ細胞に特徴的に現れるため
、多能性幹細胞を区別する基準として用いられてきた(Solter, D., et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci., 75, 5565-5569(1978))。本発明のＥＧ細胞の多能性が多
能性細胞の特徴的様相を有するかどうかを確認するために、次の通りＳＳＥＡ−
１エピトープの存在を調査した。

【００３７】実施例２で得られた４回継代培養後のＥＧ細胞コロニーを１％グルタルアルデ
ヒド溶液を含むプレートに５分間固定した後、同量のＰＢＳで２回洗浄した。抗
ＳＳＥＡ−１単一抗体を含む腹水液(MC-480; Solter, D. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 75, 5565-5596(1978)を米国アイオア大学のDevelopment Studies H
ybridoma Bankから購入してＰＢＳで１０００倍稀釈した後、ＥＧ細胞コロニー
に加えた。得られたＥＧ細胞コロニーをアビジン／バイオチンで結合されたアル
カリホスファターゼ(Vector Lab., U.S.A.)と反応させた後、BCIP/NBTアルカリ
ホスファターゼ基質(BCIP/NBT alkaline phosphatase substrate kit IV, Vecto
r Lab., U.S.A.)と反応させた。これに１０ｍＭＥＤＴＡ(pH 8.0)を加えて反
応を終結した。

【００３８】図３から分かるように、４回連続継代培養されたすべてのＥＧ細胞はＳＳＥＡ
−１染色に対して陽性反応を示した。これは、ＳＳＥＡ−１エピトープがニワト
リＥＧ細胞によって発現されることを意味する。

【００３９】（３）分裂分析実施例２で得られた８回連続継代培養後のＥＧ細胞コロニーをブロモデオキシ
ウリジンを含む溶液(BrdU, a thymidine analog)で３７℃で１時間放置した後、
同量のＰＢＳ溶液で２回洗浄した。得られたＥＧ細胞コロニーを細胞分裂分析キ
ット(Amersham, UK)で染色した後、前記（１）の手順を繰返してＰＡＳで染色し
た。ＢｒｄＵを含むＥＧ細胞コロニーを任意の抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体
およびペルオキシダーゼ／ＤＡＢシステム(Amersham, UK)を用いて検索した。

【００４０】図４は、８回連続継代培養後染色されたＥＧ細胞コロニーの分裂分析結果を示
す。この結果から分かるように、８回継代培養されたＥＧ細胞は持続的に分裂す
る。

【００４１】（４）アルカリホスファターゼ活性分析実施例２で得られた４回連続継代培養されたＥＧ細胞コロニーのアルカリホス
ファターゼ活性をホスファターゼ基質キットＩＶ(Vector Lab., U.S.A.)を用い
て測定した。

【００４２】この結果は、ＥＧ細胞がアルカリホスファターゼ活性をほとんど示さず、継代
培養中に該活性を回復しないことを示す。

【００４３】文献(Swartz, W. J., Anat. Rec., 202, 379-385(1982))によれば、鳥類の始
原生殖細胞のアルカリホスファターゼ活性は培養初期２日まで観察されるが、始
原生殖細胞が生殖隆起に進入した後には観察されなかったが、これは、ｇＰＧＣ
ｓおよびこれから継代培養されたＥＧ細胞のアルカリホスファターゼ活性が実際
ほとんどないことを意味する。

【００４４】（５）インビトロ分化および免疫組織化的分析ニワトリＥＧ細胞から胚子体(embryoid body)が形成されるかどうかを確認す
るために、実施例２で得られた４回継代培養されたＥＧ細胞コロニーを徐々に攪
拌した後、遠心分離して個々の分離されたＥＧ細胞を得た。ＥＧ細胞を、ｍＬＩ
Ｆを取除いたＥＧ細胞培養培地に懸濁した後、非接着性の細菌用ペトリ皿に載せ
た。培地を８日間二日ごとに入れ換え、細胞の形態を毎日調査した。

【００４５】図５ａは、８日後懸濁液中のニワトリＥＧ細胞から形成された胚子体を示す。

【００４６】このように形成された胚子体を収集した後、９６ウェルプレートに分株して胚
子体がプレートに付着および分化するようにした。このように得られた細胞は、
筋肉−特異的アクチン(Dako, U.S.A.)、内胚葉−特異的α−１−フェクトプロテ
イン(Dako, U.S.A.)および外胚葉−特異的Ｓ１００(Dako, U.S.A.)に対する抗体
とともにＤＡＫＯＬＳＡＢキットおよびアビジン／バイオチンで結合されたペ
ルオキシダーゼシステム(Dako, U.S.A.)を用いて免疫組織化学的分析を行った。

【００４７】図５ｂ〜５ｄはアクチン、α−１−フェクトプロテインおよびＳ１００に対す
る抗体を用いた胚子体の免疫組織化学的分析結果を示す。図５ｂ〜図５ｄから分
かるように、ＥＧ細胞はインビトロで種々の細胞形態、たとえば、内胚葉、中胚
葉および外胚葉系統に分化し得る。

【００４８】実施例４：キメラニワトリの製造Ｘ細胞期胚および１３〜１７細胞期胚の韓国烏骨鶏の胚子(Eyal-Giladi, H. e
t at., Dev. Biol., 49, 321-337(1976))を受容体として用いた。各々の韓国烏
骨鶏受精卵の側面部または先端部に穴をあけて小さい窓を作った後、皮膜を取除
いた。

【００４９】実施例２で得られた３回または４回継代培養されたＥＧ細胞をＥＧ細胞培養培
地に１０^３細胞／μlの濃度で懸濁した後、懸濁液２μlをマイクロピペットを用
いて受精卵の胚孔または血管に微細注入した。対照群としては、ＣＥＦを注入し
た受精卵を用いた。各受精卵の窓をパラフィンフィルムで２回密封した後、受精
卵が孵化するまで先端部を下方に向うように載せた。孵化したヒナは３ヶ月間成
長させて体細胞キメラニワトリを得た。

【００５０】上記のように処理した４５個の卵のうち８個の卵が孵化し、このうち３匹のヒ
ナ（３７．５％）が外形上キメラであった。キメラヒナのうち、白色ムラを有す
る２匹のヒナは３回連続継代培養されたＥＧ細胞を注入した胚子から孵化したも
のであり、一匹は４回連続継代培養されたＥＧ細胞を注入した胚子から孵化した
ものである。３匹のヒナから白色ムラの範囲は非常に多様であった。対照群ヒナ
においては白色羽毛が観察されなかった。

【００５１】図６ａは、黒色羽毛を有する典型的な韓国烏骨鶏一組を示し、図６ｂは首の周
りおよび胸に白色ムラを有する体細胞キメラニワトリを示す。ホワイトレグホー
ンの羽毛の色は優性の染色抑制遺伝子（Ｉ／Ｉ）によって白色を示し、韓国烏骨
鶏は劣性の染色遺伝子（ｉ／ｉ）によって黒色を示す。したがって、前記結果は
、ホワイトレグホーンのＥＧ細胞が韓国烏骨鶏の胚子受容体においてインビボ分
化能を有し、したがって、ＥＧ細胞はインビボで多能性であることを意味する。
ニワトリの体細胞キメラ化を確認するために、孵化途中死んだ５匹のヒナの筋肉
、心臓、肝および生殖腺からフェノール抽出を通じてゲノムＤＮＡサンプルを得
た後、配列番号１（正方向）および配列番号２（逆方向）を有するホワイトレグ
ホーンに特異的なＳＣＡＲ(sequence characterized amplified region)プライ
マーを用いてＰＣＲ分析を行った。

【００５２】ＰＣＲ反応は、ゲノムＤＮＡ５０〜１００ｎｇ、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、１
０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、正方向プライマー０．４pmol、逆方
向プライマー０．４pmolおよびＴａｑプリメラーゼ１unitsを用いる２５μl反応
液で行った。９４℃で１分間の変性(denaturation)段階、６０℃で１分間のアニ
ーリング段階および７２℃で２分間の展開段階からなるPCRプログラムをDNA熱循
環機(Perkin Elmer Cetus)で４５回行った。得られたホワイトレグホーン特異的
なDNA断片は約３ｋｂであった。図７は、体細胞キメラ化に対するPCR分析結果を
示し、第１列、５列、９列、１３例および１７列は肝ＤＮＡを用いたＰＣＲ生成
物であり、第２列、６列、１０列、１４列および１８列は筋肉ＤＮＡを用いたＰ
ＣＲ生成物であり、第３列、７列、１１列、１５列および１９列は心臓ＤＮＡを
用いたＰＣＲ生成物であり、第４列、８列、１２列、１６列および２０列は生殖
腺ＤＮＡを用いたＰＣＲ生成物であり、第２１列は韓国烏骨鶏ゲノムＤＮＡであ
り、第２２列はホワイトレグホーンのゲノムＤＮＡであり、第２３列はＤＮＡが
ない対照群である。図７から分かるように、体細胞キメラ化は固別的に異なる。
５匹のヒナのうち一匹はすべての組織サンプル（肝、心臓、筋肉および生殖腺）
において体細胞キメラ化を示した。注入されたＥＧ細胞は２匹の孵化したヒナの
生殖腺およびすべてのヒナの心臓に影響を及ぼし、２つのヒナはただ心臓におい
てのみ体細胞キメラ化を示した。これらの結果は、ニワトリＥＧ細胞が生殖腺を
含む種々の組織においてインビボで分化および影響を及ぼすことができることを
意味する。

【００５３】実施例５：始原生殖細胞またはＥＧ細胞内への外来遺伝子形質感染および選別レポーター遺伝子（ＧＦＰまたはＬａｃｚ）を各々エレクトロポレーションお
よびリポソームを用いてＰＧＣｓまたはＥＧ細胞に形質形質させた。遺伝子の形
質感染効率は、エレクトロポレーションを用いた場合約８０％程度、リポソーム
を用いた場合約３０％程度であった。また、形質感染されたＰＧＣｓまたはＥＧ
細胞を、抗生剤であるネオマイシン３５０μg/ｍｌを含むＤＭＥＭ培地で連続継
代培養して安定的に形質感染されたＰＧＣｓまたはＥＧ細胞を選別した。

【００５４】本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲
によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形
および変化させ得ると理解されなければならない。

【００５５】

【表１】

【００５６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な
説明によって明白になる。

【図１ａ】ニワトリ胚子繊維芽細胞上で３回継代培養した後のニワトリＥＳ細胞コロニー
の形態的特徴を示す(１ａ：スケール、５０μm)図。

【図１ｂ】ニワトリ胚子繊維芽細胞上で３回継代培養した後のニワトリＥＳ細胞コロニー
の形態的特徴を示す(１ｂ：スケール、２５μm)図。

【図２】４回継代培養後形成されたＥＧ細胞コロニーにおいてＰＡＳ反応を示す図。

【図３】４回継代培養後形成されたＥＧ細胞コロニーにおいて抗-ＳＳＥＡ−１抗体ス
クリーニング結果を示す図。

【図４】８回継代培養後着色されたＥＧ細胞コロニーの分裂分析結果を示す図。

【図５ａ】８日間浮遊培養した後ニワトリＥＧ細胞から形成された胚子体を示し、図５ｂ
〜５ｄはアクチン、α−１−フェクトプロテインおよびＳ１００に対する抗体を
用いた胚子体の免疫組織化学的分析結果を示す図。

【図５ｂ】８日間浮遊培養した後ニワトリＥＧ細胞から形成された胚子体を示し、図５
ｂ〜５ｄはアクチン、α−１−フェクトプロテインおよびＳ１００に対する抗体
を用いた胚子体の免疫組織化学的分析結果を示す図。

【図５ｃ】８日間浮遊培養した後ニワトリＥＧ細胞から形成された胚子体を示し、図５ｂ
〜５ｄはアクチン、α−１−フェクトプロテインおよびＳ１００に対する抗体を
用いた胚子体の免疫組織化学的分析結果を示す図。

【図５ｄ】８日間浮遊培養した後ニワトリＥＧ細胞から形成された胚子体を示し、図５ｂ
〜５ｄはアクチン、α−１−フェクトプロテインおよびＳ１００に対する抗体を
用いた胚子体の免疫組織化学的分析結果を示す図。

【図６ａ】図６ａは、黒色羽毛を有する典型的な韓国の烏骨鶏を示し、図６ｂは、首の周
りおよび胸に部分的な白色羽毛を有する体細胞キメラニワトリを示す図。

【図６ｂ】図６ａは、黒色羽毛を有する典型的な韓国の烏骨鶏を示し、図６ｂは、首の周
りおよび胸に部分的な白色羽毛を有する体細胞キメラニワトリを示す図。

【図７】図７は、体細胞および生殖系列キメラ化に対するＰＣＲ分析結果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者パーク、タエ・スブ大韓民国、431−058 キョンギ−ドー、アンヤン−シ、ドンガン−グ、ダラン−ドン、サトビエオル・アパートメント 606 −1106 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 CA02 DA02 GA13 GA14 4B063 QA06 QQ08 QR68 QR69 QR77 QS38 QX01 4B065 AA90X BB08 BB11 BB12 BB19 BB25 BB34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (a)鳥類の胚性生殖腺から分離した始原生殖細胞(primordial
germ cell, gPGC)を、細胞成長因子および分化抑制因子を含む培地で培養して
胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）コロニーを得る段階； (b)得られたＥＧ細胞を栄養補給層(feeder layer)を用いてＥＧ細胞がコロニー
化するまで前記段階（ａ）と同様な培地で培養する段階;および (c)ＥＧ細胞を回収し、前記段階（ａ）と同様な培地で継代培養してＥＧ細胞株
を確立する段階を含む鳥類の胚性生殖（ＥＧ）細胞株を確立するための製造方法
。
【請求項２】前記鳥類の胚性生殖腺が１４〜３６細胞期胚にあることを特
徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】前記鳥類の胚性生殖腺が２４〜３０細胞期胚にあることを特
徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】前記鳥類が、七面鳥、ニワトリ、ウズラ、キジまたはアヒル
であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】前記（ａ）段階において、始原生殖細胞を培養するとき、栄
養補給層として生殖隆起由来の間質細胞(germinal ridge stroma cells; GRSCs)
層を用いる方法。
【請求項６】前記成長因子が、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）、塩基性線維芽
細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン11（IL-11）、インスリン類似成
長因子（ＩＧＦ−Ｉ）およびこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴
とする請求項１記載の方法。
【請求項７】前記培地が、ＳＣＦ０．０５〜５００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧ
Ｆ０．１〜１，０００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１１０．０００４〜４ｎｇ/ｍｌ
およびＩＧＦ−１０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌおよびこれらの混合物からな
る群から選ばれる成長因子を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】前記分化抑制因子が血漿白血病抑制因子(ＬＩＦ)であること
を特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】前記ＬＩＦの量が０．１〜１，０００units/ｍｌであること
を特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】前記培地が哺乳類血清または鳥類血清をさらに含むことを
特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】前記培地が、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、β―メ
ルカプトエタノールおよびこれらの混合物からなる群から選ばれた補助成分をさ
らに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】前記栄養補給層が分裂抑制処理されていないことを特徴と
する請求項１記載の方法。
【請求項１３】前記栄養補給層が、繊維芽細胞または類似細胞株であるこ
とを特徴とする請求項１または１２記載の方法。
【請求項１４】前記繊維芽細胞が鳥類の繊維芽細胞または鳥類の胚子繊維
芽細胞であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】前記鳥類がニワトリであることを特徴とする請求項１４記
載の方法。
【請求項１６】請求項１の方法によって製造された鳥類の胚性生殖細胞株
。
【請求項１７】連続的な継代培養によって維持することができる請求項１
６記載の胚性生殖細胞株。
【請求項１８】ＳＳＥＡ−１抗原を発現し、胚子体の形成能を有し、種々
の組織に分化できる請求項１６記載の胚性生殖細胞株。
【請求項１９】寄託番号KCLRF-BP-00026号として寄託されたものと同様な
特徴を有するニワトリ胚性生殖細胞株である請求項１６の鳥類の胚性生殖細胞株
。
【請求項２０】請求項１６の鳥類の胚性生殖細胞を受精卵に注入すること
を特徴とする体細胞キメラおよび生殖腺キメラの製造方法。
【請求項２１】胚性生殖細胞を前記受精卵の胚盤葉細胞層または血管に微
細注入することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】胚性生殖細胞をＸ細胞期胚の受精卵の胚孔へ注入すること
を特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】胚性生殖細胞を１３〜１７細胞期胚の受精卵の血管に注入
することを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】エレクトロポレーションまたはリポソームを用いて確立さ
れたＥＧ細胞または始原生殖細胞内へ外来遺伝子を形質感染させる方法。
【請求項２５】抗生剤を含む培地で外来遺伝子によって形質感染されたＥ
Ｇ細胞を継代培養する段階を含む、安定的に形質感染されたＥＧまたはＰＧＣｓ
を選別する方法。