RU2658488C2 - Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток - Google Patents

Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток Download PDF

Info

Publication number
RU2658488C2
RU2658488C2 RU2015131835A RU2015131835A RU2658488C2 RU 2658488 C2 RU2658488 C2 RU 2658488C2 RU 2015131835 A RU2015131835 A RU 2015131835A RU 2015131835 A RU2015131835 A RU 2015131835A RU 2658488 C2 RU2658488 C2 RU 2658488C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
inhibitor
medium
tgf
stage
Prior art date
Application number
RU2015131835A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015131835A (ru
Inventor
Алиреза РЕЗАНИА
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51017432&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2658488(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of RU2015131835A publication Critical patent/RU2015131835A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2658488C2 publication Critical patent/RU2658488C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/507—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/395—Thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • User Interface Of Digital Computer (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к способам получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включения экспрессии и индуцирования PDX1, NKX6.1 и HB9. Способы включают дифференцировку плюрипотентных клеток, полученных без разрушения эмбриона, плюрипотентных клеток неэмбрионального происхождения, линии эмбриональных стволовых клеток Н1, линии эмбриональных стволовых клеток Н7, линии эмбриональных стволовых клеток Н9, индуцибельных плюрипотентных клеток или перепрограммированных плюрипотентных клеток, или клеток дефинитивной энтодермы, полученных из них, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки. Полученные клетки дифференцируют в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки по меньшей мере ингибитором ALK5 и/или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или их смеси, и культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Изобретение позволяет повысить выход панкреатических эндокринных клеток. 4 н. и 48 з.п. ф-лы, 13 табл., 69 ил., 14 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка истребует приоритет, предоставляемый в связи с подачей Предварительной заявки на патент США №61/747662, поданной 31 декабря 2012 года, которая в полном объеме содержится в настоящем документе в виде ссылки.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области дифференцировки клеток. Более детально, настоящее изобретение представляет способы, клеточные культуры и среду для получения панкреатических энтодермальных, панкреатических эндокринных клеток-предшественников и одногормонных панкреатических эндокринных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека путем культивирования клеток в воздушно-жидкой зоне взаимодействия.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса с возможностью трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или бета-клеток, подходящих для приживления трансплантата. Один подход представляет собой получение функциональных бета-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму), в ходе процесса, известного как гаструляция. Ткани, такие как ткань щитовидной железы, вилочковой железы, поджелудочной железы, кишечника и печени, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточная стадия данного процесса представляет собой образование дефинитивной энтодермы.
К концу гаструляции энтодерма разделяется на передний и задний отделы, которые могут быть распознаны по экспрессии ряда факторов, однозначно выделяющих переднюю, среднюю и заднюю области энтодермы. Например, HHEX и SOX2 идентифицируют переднюю область, в то время как CDX1, 2 и 4 идентифицируют заднюю половину энтодермы.
Миграция ткани энтодермы приближает энтодерму к различным мезодермальным тканям, которые способствуют регионализации кишечной трубки. Это достигается за счет целого ряда секретируемых факторов, таких как FGFs, Wnts, TGF-Bs, ретиноевой кислоты (RA), лигандов BMP и их антагонистов. Например, FGF4 и BMP способствуют экспрессии CDX2 в предполагаемой энтодерме задней кишки и подавляют экспрессию передних генов Hhex и SOX2 (Development 2000 г., 127: 1563-1567). Было продемонстрировано, что сигнализация WNT также действует параллельно с сигнализацией FGF, способствуя развитию задней кишки и препятствуя зачаткам передней кишки (Development 2007 г., 134: 2207-2217). Наконец, ретиноевая кислота, секретируемая мезенхимой, регулирует границу между передней и задней кишкой (Curr Biol 2002 г., 12: 1215-1220).
Уровень экспрессии специфических факторов транскрипции может использоваться для определения типа ткани. Во время преобразования дефинитивной энтодермы в примитивную кишечную трубку кишечная трубка становится разделенной на широкие домены, которые можно наблюдать на молекулярном уровне с помощью ограниченных паттернов экспрессии генов. Например, регионализованный отдел поджелудочной железы в кишечной трубке демонстрирует очень высокую экспрессию PDX1 и очень низкую экспрессию CDX2 и SOX2. PDX1, NKX6.1, PTF1A и NKX2.2 высоко экспрессируются тканью поджелудочной железы; а экспрессия CDX2 высока в кишечной ткани.
Образование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Дорсальный и вентральный домены поджелудочной железы формируются из эпителия передней кишки. Передняя кишка также дает начало формирования пищевода, трахеи, легких, щитовидной железы, желудка, печени, поджелудочной железы и системы желчных протоков.
Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют панкреодуоденальный, содержащий гомеобокс ген PDX1. В отсутствие PDX1 поджелудочная железа не развивается дальше образования вентрального и дорсального зачатков. Следовательно, экспрессия PDX1 является важным этапом органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит как экзокринную, так и эндокринную ткани, которые образуются при дифференцировании панкреатической энтодермы.
D'Amour et al. описывает производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005 г., 23: 1534-1541; патент США №7704738). Трансплантация этих клеток под капсулу почки у мышей приводила к дифференцированию в более зрелые клетки с характеристиками ткани энтодермы (патент США №7704738). Клетки дефинитивной энтодермы, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, могут быть далее дифференцированы в PDX1-положительные клетки после добавления FGF10 и ретиноевой кислоты (заявка на патент США №2005/0266554). Последующая трансплантация таких клеток-предшественников панкреатических клеток в жировое тело иммунодефицитных мышей привела к образованию функциональных панкреатических эндокринных клеток с последующей 3-4-месячной стадией созревания (патент США №7993920 и патент США №7534608).
Fisk et al. сообщают о системе получения клеток панкреатических островков из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США №7033831). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Эмбриональные стволовые клетки человека сначала были дифференцированы в энтодерму при помощи комбинации бутирата натрия и активина A (патент США №7326572). Затем клетки культивировали с антагонистами BMP, такими как Noggin, в комбинации с EGF или бета-целлюлином для генерирования PDX1-положительных клеток. Конечное дифференцирование индуцировали никотинамидом.
Низкомолекулярные ингибиторы также применяли для индуцирования клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток. Например, низкомолекулярные ингибиторы рецептора TGF-β и рецепторов ВМР (Development 2011, 138: 861-871; Diabetes 2011, 60: 239-247) применялись для значительного увеличения количества эндокринных клеток поджелудочной железы. Кроме того, низкомолекулярные активаторы также применяли для генерирования клеток дефинитивной энтодермы или клеток-предшественников панкреатических клеток (Curr Opin Cell Biol 2009 г., 21: 727-732; Nature Chem Biol 2009, 5: 258-265).
НВ9 (также известный как HIXB9 и MNX1) является транскрипционным активаторным белком BHLH, экпрессируемым на ранней стадии развития поджелудочной железы, начинающейся приблизительно на 8 эмбриональный день. НВ9 также экспрессируется в нотохорде и спинном мозге. Экспрессия HB9 неравномерна и достигает пика примерно в день 10,5 в эпителии поджелудочной железы, будучи экспрессированной в клетках, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1. Примерно в день 12,5 экспрессия HB9 снижается и на поздних стадиях ограничивается только β клетками. В гомозиготах мышей с нулевой мутацией HIXB9, дорсальная доля поджелудочной железы не развивается (Nat Genet 23: 67-70, 1999; Nat Genet 23: 71-75, 1999). HB9-/- бета-клетки экспрессируют низкие уровни глюкозного транспортера, GLUT2 и NKX6.1. Далее, HB9 -/- поджелудочной железы демонстрирует значительное снижение в количестве инсулин-положительных клеток в то же время, не оказывая значительного влияния на экспрессию прочих гормонов поджелудочной железы. Таким образом, временной контроль HB9 чрезвычайно важен для нормального развития и функционирования бета-клетки. В то время как немного известно о факторах, регулирующих экспрессию HB9 в бета-клетках, недавнее исследование на данио предполагает, что ретиноевая кислота может положительно регулировать экспрессию HB9 (Development, 138, 4597-4608, 2011).
Гормоны щитовидной железы, тироксин («T4») и трииодотиронин («Т3»), являются гормонами, основанными на тирозине, которые производятся щитовидной железой и первоначально отвечают за регулирование метаболизма. Основной формой гормонов щитовидной железы в крови является Т4, обладающий более длительным периодом полужизни, чем Т3. Соотношение Т4 и Т3, выделяемых в кровь, составляет точно 20 к 1. Т4 конвертируется в более активный Т3 (в три-четыре раза более мощный, чем Т4) внутри клеток с помощью деиодиназы.
Т3 прикрепляется к рецепторам гормонов щитовидной железы, TRα1 и TRβ1 (TR). TR является ядерным рецептором гормонов, который гетеродимеризуется с ретиноидным Х рецептором. Димеры связываются с отвечающими элементами щитовидной железы (TREs) в отсутствии лиганда и действуют как транскрипционные репрессоры. Прикрепление Т3 к TR понижает репрессию TRE-зависимых генов и стимулирует экспрессию различных целевых генов. В то время как многочисленные исследования предполагали, что роль Т3 состоит в увеличении пролиферации бета-клеток, снижении апоптоза и улучшении секреции инсулина, его роль в дифференцировке клеток не определена.
Трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) относится к большому семейству плеотропных цитокинов, которые задействованы во многих биологических процессах, включая контроль роста, дифференцировку, миграцию, выживание клеток, фиброз и спецификацию процесса развития. Представители суперсемейства TGF-β передают сигнал посредством рецепторного комплекса, содержащего рецепторы типа I и типа II. Лиганды TGF-B (такие как активины и факторы дифференцировки роста(«GDF»)) связывают вместе рецептор типа II с рецептором типа I. Рецептор типа II фосфорилирует и активирует рецептор типа I в комплексе. Существует пять видов рецепторов типа II у млекопитающих: TβR-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II, и AMHR-II и семь рецепторов типа I (ALKs 1-7). Активин и родственные ему лиганды сигнализируют через комбинации ActR-II или ActR-IIB и ALK4 или ALK5, и BMP сигнализируют через комбинации ALK2, ALK3, и ALK6 с ActR-II, ActR-IIB, или BMPR-II. AMH сигнализирует через комплекс AMHR-II с ALK6, и лимфоузел, как выяснилось недавно, сигнализирует через комплекс ActR-IIB и ALK7 (Cell. 2003, 113(6): 685-700). После закрепления лиганда TGF-B на соответствующем рецепторе испускаемые сигналы передаются в ядро, первоначально через активацию комплексов Smad-белков. При активации рецепторы типа I фосфолирируют представителей рецептор-регулируемого подсемейства Smad-белков. Это активирует их и дает возможность формировать комплексы с обычными медиаторами Smad, Smad4. Smad 1, 5, и 8 являются субстратами для ALK 1, 2, 3, и 6, в то время как Smad 2 и 3 являются субстратами для ALK 4, 5, и 7 (FASEB J 13: 2105-2124). Активированные комплексы Smad аккумулируются в ядре, где они напрямую задействованы в транскрипции целевых генов, как правило, в ассоциации с другими специфическими ДНК-связывающими транскрипционными факторами. Составы, которые избирательно ингибируют рецепторы TGF-β, были разработаны для терапевтического применения и для изменения судьбы клетки в контексте репрограммирования и дифференцировки из различных популяций стволовых клеток. В частности, ингибиторы ALK5 ранее применялись для направления дифференцировки эмбриональных стволовых клеток к эндокринной судьбе (Diabetes, 2011, 60(1): 239-47).
В целом, процесс дифференцировки прогениторных клеток в функциональные бета-клетки проходит через различные стадии; и протоколы получения панкреатических клеток из прогениторных клеток, таких как плюрипотентные стволовые клетки человека, были в значительной степени улучшены. Несмотря на эти продвижения в расследованиях, каждый шаг в процессе дифференцировки прогениторных клеток является уникальной задачей. Таким образом, сохраняется необходимость в протоколе, который бы привел к получению функциональных эндокринных клеток и, в частности, функциональных бета-клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1А-Н показаны фазовые контрастные образцы клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способа, описанного в Примере 1 на следующих временных точках: День 1 (Фиг. 1A); день 5 (Фиг. 1B); день 6 (Фиг. 1C); день 7(Фиг. 1D); день 9 (Фиг. 1E); день 13 (Фиг. 1F); день 16 (Фиг. 1G); и день 21 (Фиг. 1H).
На Фиг. 2А-К показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении одной недели в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для следующего: DAPI (Фиг. 2A); инсулин (Фиг. 2B); HB9 (Фиг. 2С), DAPI (Фиг. 2D); глюкагон (Фиг. 2E); инсулин (Фиг. 2F); DAPI (Фиг. 2G); инсулин (Фиг. 2H); соматостатин (Фиг. 2I); NKX6.1 (Фиг. 2J); инсулин (Фиг. 2K). Панели A-C, D-F, G-I и J-K были взяты из того же поля.
На Фиг. 3А-Н показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении двух недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для следующего: инсулин (Фиг. 3А); глюкагон (Фиг. 3В); инсулин (Фиг. 3С); соматостатин (Фиг. 3D); инсулин (Фиг. 3Е); NKX6.1 (Фиг. 3F); НВ9 (Фиг. 3G); и NKX6.1 (Фиг. 2Н). Панели А-В, С-D, E-F и G-H были взяты из того же поля.
На Фиг. 4А-D показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении трех недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для инсулина (Фиг. 4А); глюкагона (Фиг. 4В); инсулина (Фиг. 4С) и соматостатина (Фиг. 4D). Панели А-В и С-D были взяты из того же поля.
На Фиг. 5А-R представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 1: PDX1 (Фиг. 5A); NKX6.1 (Фиг. 5B); PAX4 (Фиг. 5C); PAX6 (Фиг. 5D), NGN3 (Фиг. 5E); NKX2.2 (Фиг. 5F); ABCC8 (Фиг. 5G); хромогранин-А (Фиг. 5H); PCSK1 (Фиг. 5I); IAPP (Фиг. 5J); инсулин (Фиг. 5К); глюкагон (Фиг. 5L); соматостатин (Фиг. 5М); грелин (Фиг. 5N); PTFIA (Фиг. 5О); ZIC1 (Фиг. 5Р); CDX2 (Фиг. 5Q) и SOX9 (Фиг. 5R). Клетки культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия после стадии 5.
На Фиг. 6А-L представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 2: PDX1 (Фиг. 6A); NKX6.1 (Фиг. 6B); PAX4 (Фиг. 6C); PAX6 (Фиг. 6D), NGN3 (Фиг. 6E); NKX2.2 (Фиг. 6F); ABCC8 (Фиг. 6G); хромогранин-А (Фиг. 6Н); PCSK1 (Фиг. 6I); IAPP (Фиг. 6J); инсулин (Фиг. 6) и глюкагон (Фиг. 6L).
На Фиг. 7А-L представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 3: PDX1 (Фиг. 7А); NKX6.1 (Фиг. 7В); PAX4 (Фиг. 7C); PAX6 (Фиг. 7D), NGN3 (Фиг. 7E); NKX2.2 (Фиг. 7F); ABCC8 (Фиг. 7G); хромогранин-А (Фиг. 7Н); PCSK1 (Фиг. 7I); IAPP (Фиг. 7J); инсулин (Фиг. 7K) и глюкагон (Фиг. 7L).
На Фиг. 8А-H представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 4: PDX1 (Фиг. 8A); NKX6.1 (Фиг. 8B); NGN3 (Фиг. 8C); ABCC8 (Фиг. 8D); PCSK1 (Фиг. 8E); грелин (Фиг. 8F); глюкагон (Фиг. 8G); и инсулин (Фиг. 8Н).
На Фиг. 9А-F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 4: PDX1 (Фиг. 9А); NKX6.1 (Фиг. 9B); NGN3 (Фиг. 9C); ABCC8 (Фиг. 9D); глюкагон (Фиг. 9E); и инсулин (Фиг. 9F).
На Фиг. 10А-В описаны результаты иммуноокрашивания клеток стадии 6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в соответствии с примером 4 и обработанных либо 1 микромолярным SD208 ингибитором (Фиг. 10А), либо 1 микромолярным ALK5 ингибитором II (Фиг. 10В) и окрашенным для хромогранина-А (пан-эндокринный маркер) и NKX6.1 (панкреатический прекурсорный маркер и специфический маркер бета-клеток).
На Фиг. 11А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, дифференцированных как описано в примере 6: ABCC8 (Фиг. 11A), глюкагон (Фиг. 11B), амилин (Фиг. 11C), инсулин (Фиг. 11D), NGN3 (Фиг. 11Е), NKX2.2 (Фиг. 11F), NKX6.1 (Фиг. 11G) и PDX1 (Фиг. 11H). Данные представлены как кратное возрастание по сравнению с недифференцированной линией Н1.
На Фиг. 12А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 7 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 12A), глюкагон (Фиг. 12B), амилин (Фиг. 12C), инсулин (Фиг. 12D), NGN3 (Фиг. 12Е), NKX2.2 (Фиг. 12F), NKX6.1 (Фиг. 12G) и PDX1 (Фиг. 12H).
На Фиг. 13А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 8 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 13A), глюкагон (Фиг. 13B), амилин (Фиг. 13C), инсулин (Фиг. 13D), NGN3 (Фиг. 13Е), NKX2.2 (Фиг. 13F), NKX6.1 (Фиг. 13G) и PDX1 (Фиг. 13H).
На Фиг. 14А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 9 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 14A), глюкагон (Фиг. 14B), амилин (Фиг. 14C), инсулин (Фиг. 14D), ISL-1 (Фиг. 14Е), MNX1 (Фиг. 14F), NKX6.1 (Фиг. 14G) и SLC30A8 (Фиг. 14H).
На Фиг. 15А-J показаны профили FACS клеток стадии 5 день 3, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для следующего: Изотипический контроль (Фиг. 15А); NKX6.1 (Фиг. 15В); NKX2.2 (Фиг. 15С); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 15D); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 15Е); PAX6 (Фиг. 15F); ISL-1 (Фиг. 15G); FOXA2 (Фиг. 15Н); NeuroD (Фиг. 15I) и глюкагон (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 15J).
На фиг. 16А-I показаны профили FACS клеток стадии 6 день 5, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для: Изотипический контроль (Фиг. 16А); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 16В); NKX2.2 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 16С); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 16D); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 16Е); PAX6 (Фиг. 16F); ISL-1 (Фиг. 16G); FOXA2 (Фиг. 16Н) и NeuroD (Фиг. 16I).
На Фиг. 17А-I показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 6 день 15, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для: Изотипический контроль (Фиг. 17А); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 17В); NKX2.2 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 17С); глюкагон (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 17D); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 17Е); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 17F); ISL-1 (Фиг. 17G); FOXA2 (Фиг. 17Н) и NeuroD (Фиг. 17I).
На Фиг. 18А-С показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 4 день 4, дифференцированных как описано в примере 1 и окрашенных для: NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 18А); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 18В); и NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 18С).
На Фиг. 19А-С показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 6 день 6, дифференцированных как описано в примере 11 и окрашенных для: NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 19А); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 19В); и NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 19С).
Фиг. 20 показывает кинетику производства человеческого С-пептида в условиях in vivo в NOD-SCID мыши, куда трансплантированы различные популяции клеток, как описано в примере 11.
На Фиг. 21А -F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 12: Амилин (Фиг. 21А); инсулин (Фиг. 21В), MAFA (Фиг. 21C), NKX6.1 (Фиг. 21D), PTF1a (Фиг. 21E) и SOX9 (Фиг. 21F).
На Фиг. 22А-D представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, дифференцированных как описано в примере 13: MAFA (Фиг. 22А); инсулин (Фиг. 22В); Амилин (Фиг. 22С) и NKX6.1 (Фиг. 22D).
На Фиг. 23А-F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 5: PDX1 (Фиг. 23А); NKX6.1 (Фиг. 23B); NGN3 (Фиг. 23C); ABCC8 (Фиг. 23D); глюкагон (Фиг. 23E); и инсулин (Фиг. 23F).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приведенное ниже подробное описание настоящего изобретения, будет более понятно при изучении вместе с приложенными рисунками. Рисунки предоставлены с целью иллюстрации определенных вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается только приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами. Для четкости описания, а не для ограничения настоящего изобретения, подробное описание настоящего изобретения разделено на подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Настоящее изобретение направлено на дифференцировку энтодермальных прогениторных клеток, таких как плюрипотентные стволовые клетки, в клетки, демонстрирующие характеристики панкреатических эндокринных клеток путем культивирования упомянутых прогениторных клеток, по меньшей мере частично, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которая существует в открытом культуральном сосуде или культуральном сосуде, частично заполненном субстратом. Хотя термин «воздух» применяется здесь для удобства, изобретение не ограничено смесью газов и составляющих, находящихся в нормальной окружающей среде. Изобретение детально рассматривает и включает газообразные смеси, обладающие составом, отличным от нормальной окружающей среды, включая, например, смеси, обогащенные определенным компонентом или в которых содержание определенного компонента понижено или исключено.
Дополнительно, настоящее изобретение представляет клеточные культуры для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, демонстрирующие характеристики панкреатических эндокринных клеток, так же как и дифференцировочную среду, которая инициирует и упрощает подобную дифференцировку. Преимуществом является то, что эти клеточные культуры и дифференцировочная среда могут применяться в сочетании с дифференцировкой в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для обеспечения не полученных ранее урожаев клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.
Культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия может производиться на всех стадиях, задействованных в дифференцировке от плюрипотентных стволовых клеток до панкреатических эндокринных клеток, или может включать культивирование планарной культуры, погруженной в субстрат на ранних стадиях дифференцировки, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время поздних стадий дифференцировки. В предпочтительном варианте процесс изобретения включает комбинацию культивирования плюрипотентных стволовых клеток на поддерживающей поверхности, погруженной в среду, на ранних стадиях, и затем культивирование в воздушно-жидкостной среде на поздних стадиях дифференцировки. В таких вариантах осуществления клетки могут быть первоначально посеяны на твердую поверхность для погруженного культивирования, а затем удалены с твердой поверхности и пересеяны на пористую поверхность для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Альтернативно, клетки могут быть изначально посеяны на пористую поддерживающую поверхность, которая затем погружается в субстрат, на ранних стадиях дифференцировки и затем перемещены в воздушно-жидкостную зону взаимодействия на поздних стадиях дифференцировки. Культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на поздних стадиях дифференцировки в значительной степени улучшает экспрессию эндокринных маркеров по сравнению с культивированием клеток в погруженном состоянии на протяжении всего процесса, указывая, что больший процент клеток был дифференцирован в панкреатические эндокринные клетки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение направлено на дифференцировку энтодермальных прогениторных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культурального сосуда, частично заполненного субстратом, в панкреатические энтодермальные клетки, положительные для NKX6.1, PDX1, и НВ9. Это изобретение частично основано на открытии того, что культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия значительно улучшает экспрессию эндокринных маркеров. Более того, было открыто, что панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут быть быстро получены в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, что приводит к получению предоминантных одногормонных инсулин-положительных клеток. Было обнаружено, что одноклеточный посев в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия улучшает консистенцию производства инсулина.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые как обладающие способностью на одноклеточном уровне к самообновлению и дифференциации. Стволовые клетки могут производить клетки-потомки, включая самообновляющиеся прогениторные клетки, необновляющиеся прогениторные клетки и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий дифференцирования из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы). Стволовые клетки также дают начало тканям множества зародышевых листков после трансплантации и вносят значительный вклад в образование большинства, если не всех тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируются по потенциалу развития. Плюрипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток.
Дифференцировка представляет собой процесс, посредством которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной клетки или мышечной клетки. Дифференцированная клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования относится к клетке, дошедшей в ходе процесса дифференцирования до стадии, с которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до конкретного типа клеток или подмножества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться к менее дифференцированному типу. «Дедифференцировка» обозначает процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированной (или коммитированной) позиции в клеточной линии дифференцировки. Применяемый в настоящем документе термин «клеточная линия дифференцировки» означает наследственность клетки, т.е. из каких клеток произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркер, специфичный для линии дифференцирования, относится к характеристике, специфически ассоциированной с фенотипом клеток интересующей линии дифференцирования, и его можно использовать для оценки дифференцирования некоммитированной клетки в клетки интересующей линии дифференцирования.
В настоящем документе термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в исследуемых клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией понимают повышенный уровень положительного маркера и пониженный уровень отрицательного маркера по сравнению с недифференцированной клеткой. Обнаруживаемый уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества способов, известных в данной области.
В настоящем документе клетка «положительна по» заданному маркеру или «положительна», если заданный маркер явно обнаруживается в клетке. Аналогично клетка «отрицательна по» заданному маркеру или «отрицательна», если заданный маркер не обнаруживают в клетке. В частности, положительность по FACS как правило выше, чем 2%, в то время как отрицательный предел по FACS, как правило, менее 1%. Положительность по ПЦР, как правило, менее 34 циклов (Cts): в то время как отрицательность по ПЦР, как правило, более 34,5 циклов.
В попытках воспроизвести дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в функциональные клетки энтодермы поджелудочной железы в статичных клеточных культурах в условиях in vitro, процесс дифференцировки часто рассматривается как прогрессирование через несколько последовательных стадий. В частности, процесс дифференцировки в целом рассматривается как прогрессирование через шесть стадий. В этой постадийной прогрессии «стадия 1» относится к первому шагу в процессе дифференцировки, дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 1»). «Стадия 2» относится ко второму шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 2»). «Стадия 3» относится к третьему шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 3»). «Стадия 4» относится к четвертому шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток-предшественников панкреатической передней кишки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 4»). «Стадия 5» относится к пятому шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток-предшественников панкреатической передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток и/или панкреатических эндокринных клеток-предшественников (здесь и далее упоминаются как «панкреатические энтодермальные клетки/эндокринные клетки-предшественники» или альтернативно как «клетки стадии 5»). «Стадия 6» относится к дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток и/или эндокринных панкреатических клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 6»).
Однако следует отметить, что не все клетки в отдельно взятой популяции прогрессируют через эти стадии с одинаковой скоростью. Вследствие этого, в клеточных культурах в условиях in vitro нередко обнаруживается присутствие клеток, которые прогрессировали менее или более по пути дифференцировки, чем большинство клеток, присутствующих в популяции, в особенности на поздних стадиях дифференцировки. Например, нередко наблюдается появление маркеров, характерных для панкреатических энтодермальных клеток, во время стадии 5 культивирования клеток. Для иллюстративных нужд настоящего изобретения характеристики различных типов клеток ассоциированы с определенными выше стадиями, как описано в настоящем документе.
«Клетки дефинитивной энтодермы», как используется в настоящем документе, относится к клеткам, которые несут в себе характеристики клеток, появившиеся из эпибласта во время гаструляции, и которые формируют желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: FOXA2 (также известный как гепатоцитный ядерный фактор 3-β (HNF3β)), GATA4, SOX17, CXCR4, брахиурия, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, и MIXL1. Маркерные характеристики клеток дефинитивной энтодермы включают CXCR4, FOXA2 и SOX17. Таким образом, клетки дефинитивной энтодермы могут быть охарактеризованы их экспрессией CXCR4, FOXA2 и SOX17. Дополнительно, в зависимости от длительности времени, на протяжении которого клеткам позволяется оставаться на стадии 1, можно наблюдать рост в HNF4α.
«Клетки кишечной трубки», как используется в данном документе, относится к клеткам, произошедшим от дефинитивной энтодермы, которые могут дать начало всем энтодермальным органам, таким как легкие, печень, поджелудочная железа, желудок и кишечник. Клетки кишечной трубки могут быть охарактеризованы их постоянно растущей экспрессией HNF4α, выше, чем экспрессия клеток дефинитивной энтодермы. Например, рост экспрессии HNF4α в мРНК в десять-сорок раз можно наблюдать на стадии 2.
«Энтодерма передней кишки», как используется в данном документе, относится к клеткам энтодермы, которые дают начало пищеводу, легким, желудку, печени, поджелудочной железе, желчному пузырю и части двенадцатиперстной кишки. Клетки энтодермы передней кишки экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2 и HNF4α. Клетки энтодермы передней кишки могут быть охарактеризованы ростом экспресии PDX1 по сравнению с клетками кишечной трубки. Например, более пятидесяти процентов клеток в культурах стадии 3 типично экспрессируют PDX1.
«Клетка-предшественник панкреатической передней кишки», как используется в данном документе, относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF6, NGN3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, гастрин, FOXA2, PTF1a, PROX1 и HNF4α. Клетки-предшественники панкреатической передней кишки поджелудочной железы можно охарактеризовать как положительные по отношению к экспрессии PDX1, NKX6.1 и SOX9.
Используемый в настоящей заявке термин, «панкреатическая энтодермальная клетка» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 β, PTF1 α, HNF6, HNF4 α, SOX9, NGN3; гастрин; HB9, или PROX1. Панкреатические энтодермальные клетки могут характеризоваться отсутствием у них значительной экспрессии CDX2 или SOX2.
«Панкреатическая эндокринная клетка-предшественник», как используется в настоящем документе, относится к клеткам энтодермы поджелудочной железы, обладающим возможностью стать клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NKX2.2, NeuroD1, ISL1, PAX4, PAX6 или ARX. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут быть охарактеризованы их экспрессией NKX2.2 и NeuroD1.
Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая эндокринная клетка» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид. В дополнение к этим гормонам, маркерные характеристики панкреатических эндокринных клеток включают один или несколько из NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, и PAX6. Панкреатические эндокринные клетки, экспрессирующие маркеры бета-клеток, могут характеризоваться их экспрессией инсулина и по меньшей мере одного из следующих транскрипционных факторов: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, MAFA и PAX6.
В настоящем документе используются попеременно «д1», «1д», и «день1», «д2», «2д», и «день 2» и так далее. Эти комбинации цифр и букв относятся к конкретному дню инкубации на различных стадиях в процессе поэтапного протокола дифференцировки настоящей заявки.
В настоящем документе термин «глюкоза» применяют относительно декстрозы, сахару, обычно встречающемуся в природе.
В настоящем документе термин «NeuroD1» применяют для обозначения белка, экспрессируемого в прогениторных клетках панкреатических эндокринных клеток, и гена, кодирующего его.
«LDN-193189» относится к ((6-(4-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенил)-3-(пиридин-4-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин, гидрохлорид; DM-3189)), ингибитору рецептора BMP, доступному по торговой маркой STEMOLECULE™ от Stemgent, Inc., Cambridge, MA, USA.
Характеристики, источник, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
А. Характеристики плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать одно или несколько определенных TRA-1-60 и TRA-1-81 антител (Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии TRA-1-60 и TRA-1-81. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, как правило, имеют щелочнофосфатазную активность, которую можно обнаружить путем обработки клеток 4%-м раствором параформальдегида, а затем выращивая с щелочнофосфатазным набором субстратов, который продается под торговой маркой VECTOR® Red, как описано производителем (Vector Laboratories, штат Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток можно подтвердить, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их последующего гистологического исследования на наличие клеточных типов, происходящих от этих трех зародышевых листков. Плюрипотентность можно альтернативно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа эмбриоидных телец на наличие маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток можно кариотипировать с использованием стандартного способа G-бэндинга и сравнить с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все хромосомы человека присутствуют и не имеют видимых изменений.
В. Источники плюрипотентных стволовых клеток
Примерные типы плюрипотентных стволовых клеток, которые можно применять, включают в себя устойчивые линии плюрипотентных клеток, в том числе преэмбриональной ткани (такой как, например, бластоцист), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент во время беременности, как правило, но не обязательно перед сроком приблизительно от 10 до 12 недель беременности. Не имеющими ограничительного характера примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека, такие как, например, эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, H7 и H9 (WiCell Research Institute, Мэдисон, штат Висконсин, США). Клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток, также пригодны для использования. Индуцибельные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, полученные из взрослых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов, относящихся к плюрипотентным транскрипционным факторам, таким как OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011 г., 12: 165-185, см. также IPS, Cell, 126(4): 663-676) также могут использоваться. Эмбриональные стволовые клетки человека, применяемые в способах настоящего изобретения, также могут быть подготовлены, как описано Thomson и др. (патент США №5,843,780; Science, 1998 г.; 282: 1145-1147; Curr Top Dev Biol, 1998 г.; 38: 133-165; Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92: 7844-7848). Мутантные линии эмбриональных стволовых клеток человека, такие как BG01v (BresaGen, Athens, Ga.), или клетки, полученные из зрелых соматических клеток человека, такие как клетки, описанные в Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007) также могут применяться. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки, пригодные для применения в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью способов, описанных в: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008); Takahashi et al. (Cell 131: 861-872 (2007), и в заявке на патент США №2011/0104805. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные клетки могут иметь не-эмбриональное происхождение. Все эти ссылки, патенты и приложения к патентам включены в настоящий документ способом ссылок во всей их полноте, в частности, поскольку они относятся к выделению, культуре, размножению и дифференцировке плюрипотентных клеток.
С. Размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируются на слое питающих клеток, которые оказывают разностороннюю поддержку плюрипотентным клеткам. Альтернативно, плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но тем не менее поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцировки часто поддерживают путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. Альтернативно, рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживают путем использования среды с определенным химическим составом.
Плюрипотентные клетки можно легко размножить в культуре путем использования различных питательных слоев или с помощью сосудов, покрытых матриксными белками. Альтернативно, химически определенные поверхности в сочетании с определенными средами, такими как среды, которые продаются под торговыми марками mTESR®1 (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), могут использоваться для обычного размножения клеток. Плюрипотентные клетки можно легко удалить из культуральных планшетов посредством ферментативного расщепления, механического разделения или с применением различных кальцийхелатирующих агентов, таких как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Альтернативно, плюрипотентные клетки можно размножить в суспензии в отсутствие каких-либо матриксных белков или питательного слоя.
Множество различных способов размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток могут применяться в описываемом изобретении. Например, способы изобретения могут использовать способы Reubinoff et al., Thompson et al., Richard et al. и заявки на патент США №2002/0072117. Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science 282: 1145-1147 (1998) описывают культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов. Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) оценивает панель из одиннадцати слоев различных человеческих взрослых, эмбриональных и неонатальных питающих клеток по их способности поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека, замечая, что линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных на питательных фибробластах взрослой кожи достигают морфологии эмбриональных стволовых клеток человека и остаются плюрипотентными. заявке на патент США №2002/0072117 описаны линии клеток, продуцирующие среду, которая поддерживает рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток культуре. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимальные и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент США №2002/072117 также описано использование клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.
Прочие пригодные способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, к примеру, в Wang et al., Stojkovic et al., Miyamoto et al. и Amit et al. Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005 г.), описаны способы длительного выращивания плюрипотентных стволовых клеток человека на слоях питающих клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека. Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005 г.), описана система питающих клеток, полученная в результате спонтанного дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека. Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004 г.), описан источник питающих клеток из плаценты человека. Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003 г.) описывает слой питающих клеток, полученных из крайней плоти человека.
Другие подходящие способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, к примеру, в Inzunza et al., патенте США No. 6642048, WO 2005/014799, Xu et al. и заявке на патент США №2007/0010011. Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005 г.), описывает слой питающих клеток, полученных из фибробластов постнатальной крайней плоти человека. В патенте США №6642048 описана среда, поддерживающая рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток среде, а также клеточные линии, которые можно использовать для производства такой среды. Патент США №6642048 сообщает о мезенхимальных и фибробластоподобных клеточных линиях, полученных из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток; так же как и способах получения таких клеточных линий, обработки среди и выращивания стволовых клеток с применением подобной среды. В международной заявке WO 2005/014799 описана кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцирования клеток млекопитающих. В заявке на патент WO 2005/014799 сообщает, что культуральная среда, изготовленная в соответствии с настоящим изобретением, кондиционируется при помощи секреторной активности клеток мыши, в частности, активности дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов, именуемых MMH (Met Murine Hepatocyte). Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004 г.), описана кондиционированная среда, полученная из производных эмбриональных стволовых клеток человека, генетически модифицированных для сверхэкспрессии обратной транскриптазы теломеразы человека. В заявке на патент США №2007/0010011 описана культуральная среда с определенным химическим составом для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культуральной системе используют бессывороточную среду, обогащенную факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Примеры подобных культуральных систем включают, без ограничения, Cheon et al., Levenstein et al. и патентом США №2005/0148070. Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описана не содержащая питающих клеток и сыворотки культуральная система, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток. Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006 г.), описаны способы длительного культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF). В заявке на патент США №2005/0148070, описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде с определенным составом без сыворотки и без питающих клеток-фибробластов, где данный способ включает: культивирование стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заменитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, культуральную среду, в основном, не включающую эмбриональную сыворотку млекопитающих и содержащую по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, при этом фактор роста фибробластов происходит из источника, иного, чем просто слой питающих клеток-фибробластов, среду, поддерживающую пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без слоя питающих клеток или кондиционированной среды.
Другие пригодные способы культивирования и размножения плюрипотентных стволовых клеток описаны в заявке на патент США №2005/0233446, патенте США №6800480, заявке на патент США №2005/0244962 и WO 2005/065354. В заявке на патент США №2005/0233446, описана среда с определенным составом, которую можно использовать при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. Среда в растворе по существу является изотонической по сравнению с культивируемыми стволовыми клетками. В данной культуре конкретная среда содержит основную среду и количество каждого из bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, необходимое для поддержки по существу недифференцированного роста зародышевых стволовых клеток. В патенте США №6800480, отмечено, что культуральная среда для выращивания зародышевых стволовых клеток приматов по существу в недифференцированном состоянии, включающая в себя основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. В описании в патенте 6800480 далее сообщается, что основную среду объединяют с питательной сывороткой, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбранным из группы, состоящей из питающих клеток и компонента внеклеточного матрикса, полученного из питающих клеток. Эта среда дополнительно включает в себя аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбранный из группы, состоящей из нуклеозидов и соли пировиноградной кислоты. В заявке на патент США №2005/0244962 сообщает, что один из аспектов раскрытия представляет способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов и что стволовые клетки в культивируют в культуре, по существу не содержащей эмбриональную сыворотку млекопитающих (предпочтительно также по существу не содержащей сыворотку любого животного) и при наличии фактора роста фибробластов, полученного из источника, отличного от просто питающего слоя фибробластов.
Международная заявка WO 2005/065354 раскрывает определенную, изотоническую культуральную среду, которая по существу не содержит питающих клеток и сыворотки, и содержит: базальную среду; bFGF; инсулин; и аскорбиновую кислоту в количествах, достаточных для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих. Подробнее, в международной заявке № WO 2005/086845, описан способ поддержания недифференцированной стволовой клетки, причем указанный способ включает воздействие на стволовую клетку представителем семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), представителем семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клетки в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения необходимого результата.
Плюрипотентные стволовые клетки можно высевать на соответствующий культуральный субстрат. В одном варианте осуществления соответствующий культуральный субстрат представляет собой компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с адгезивными молекулами. Подходящим культуральным субстратом является восстановленная базальная мембрана, которая продается под торговой маркой MATRIGEL™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). МАТРИГЕЛЬ™ представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы допустимо использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток данные компоненты могут включать в себя по отдельности или в различных комбинациях ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п.
Плюрипотентные стволовые клетки можно высевать на субстрат с соответствующим распределением и при наличии среды, поддерживающей выживаемость, размножение и сохранение желательных характеристик клеток. Все данные характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению при посеве и могут быть без труда определены специалистом в данной области. Подходящая культуральная среда может быть создана из следующих компонентов: модифицированная среда Дюльбекко по способу Игла (DMEM), которая продается под торговой маркой Gibco™ (часть №11965-092) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; модифицированная среда Дюльбекко по способу Игла нокаут (KO DMEM), которая продается под торговой маркой Gibco™ (часть №10829-018) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; базальная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глютамин, который продается под торговой маркой Gibco™ (часть №15039-027) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; непервостепенный раствор аминокислоты, который продается под торговой маркой Gibco™ (часть №11140-050) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; бета-меркаптоэтанол (часть № М7522), которые продает компания Sigma-Aldrich, Company, LLC, Saint Louis, MO; и фактор роста человеческого рекомбинантного базисного фибробласта (bFGF), которые продается под торговой маркой Gibco™ (часть №13256- 029) компании Life Technologies Corporation, Grand Island, NY.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток
По мере того как плюрипотентные клетки дифференцируются в бета-клетки, они дифференцируются через различные стадии, каждая из которых может быть охарактеризована присутствием или отсутствием определенных маркеров. Дифференцировка клеток на этих стадиях достигается путем создания специфических условий культивирования, в том числе присутствие или отсутствие определенных факторов, добавленных в культуральную среду. В целом, эта дифференцировка может задействовать дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в дефинитивные клетки энтодермы. Эти дефинитивные клетки энтодермы могут быть затем дифференцированы в клетки кишечной трубки, которые в свою очередь могут затем быть дифференцированы в клетки энтодермы передней кишки. Клетки энтодермы передней кишки могут быть дифференцированы в клетки-предшественники передней кишки поджелудочной железы, которые, в свою очередь, дифференцируются в клетки энтодермы поджелудочной железы, панкреатические эндокринные клетки-предшественники или и те, и другие. Эти клетки могут быть затем дифференцированы в клетки, продуцирующие гормоны поджелудочной железы (такие как бета-клетки). Это изобретение представляет разбитую на стадии дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки путем культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, существующей внутри культуральных сосудов, частично заполненных субстратом, особенно культивирование клеток стадий 4-6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринных клеток поджелудочной железы
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или более из следующих маркеров: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81.
Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают линию эмбриональных стволовых клеток человека H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07), а также эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также подходящими для применения являются клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В альтернативном варианте осуществления клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования дефинитивной энтодермы, представляет собой мезэнтодермальную клетку. В альтернативном варианте осуществления клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляют собой клетки панкреатической энтодермы, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1 значительно превышает экспрессию CDX2 и SOX2. В некоторых вариантах осуществления более тридцати процентов клеток экспрессируют PDX1 и NKX6.1 и менее тридцати процентов клеток экспрессируют CDX2 или SOX2, согласно измерениям FACS. Особенно пригодными являются клетки, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1 по меньшей мере в два раза превышает экспрессию CDX2 или SOX2.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической эндокринной железы.. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин, или панкреатический полипептид. В предпочтительном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка являются бета-клеткой, производящей инсулин.
В определенных вариантах осуществления для получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, применяется протокол, согласно которому процесс начинается с плюрипотентных стволовых клеток или индуцибельных плюрипотентных клеток, предпочтительно плюрипотентных стволовых клеток. Данный протокол включает следующие стадии:
Стадия 1: Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, полученные из культуры клеточных линий, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток.
Стадия 2: Клетки, полученные на стадии 1, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки.
Стадия 3: Клетки, полученные на стадии 2, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки.
Стадия 4: Клетки, полученные на стадии 3, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки. Клетки не в обязательном порядке культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в конце стадии 4.
Стадия 5: Клетки, полученные на стадии 4, обрабатываются соответствующими факторами и культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников.
Стадия 6: Клетки, полученные на стадии 5, обрабатываются соответствующими факторами и культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.
В то время как настоящее изобретение, в определенных вариантах осуществления, включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток (например, клеток, предшествующих стадии 1) в клетки стадии 6, изобретение также включает дифференцировку клеток, являющуюся результатом других промежуточных стадий, ведущую к стадии 6. В частности, изобретение включает дифференцировку клеток стадии 4-6. Более того, хотя процесс описан в отдельных стадиях, обработка, так же как и прогресс клеток через процесс дифференцировки, может быть как последовательным, так и непрерывным.
Стадия 1: Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы
Плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или любого способа, предложенного в настоящем изобретении. Способы, пригодные для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, обнародованы в: заявке на патент США №2007/0254359; заявке на патент США №2009/0170198; заявке на патент США №2009/0170198; заявке на патент США №2011/0091971; заявке на патент США №2010/0015711; заявке на патент США №2010/0015711; заявке на патент США №2012/0190111; заявке на патент США №2012/0190112; заявке на патент США №2012/0196365; заявке на патент США №20100015711; заявке на патент США №2012/0190111; заявке на патент США №2012/0190112; заявке на патент США №2012/0196365; заявке на патент США №20100015711; заявке на патент США №2012/0190111; заявке на патент США №2012/0190112; заявке на патент США №2012/0196365; предварительной заявке на патент США №61/076900; предварительной заявке на патент США №61/076908 и предварительной заявке на патент США №61/076915, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки, поскольку они относятся к плюрипотентным стволовым клеткам и дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки обрабатываются средой, обогащенной активином А и WNT3A для получения поколения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Обработка может задействовать контакт плюрипотентных стволовых клеток средой, содержащей от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 150 нг/мл, альтернативно от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл, альтернативно около 100 нг/мл активина А. Обработка также может включать контакт клеток с от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл, альтернативно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 30 нг/мл, альтернативно приблизительно 20 нг/мл WNT3A. Плюрипотентные клетки могут культивировать на протяжении приблизительно двух-пяти дней, предпочтительно около трех дней, для обеспечения удобства их дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. В одном из вариантов осуществления плюрипотентные клетки культивируются в присутствии активина А и WNT3A на протяжении одного дня, после чего культивирование продолжается в присутствии активина А (без присутствия WNT3A).
В другом варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки обрабатывают средой, обогащенной дифференцированным фактором роста 8 («GDF8») и ингибитором гликоген синтазы киназы-3 β («GSK3β») (таким как циклические анилино-пиридинотриазиновые композиции, раскрытые в заявке на патент США №2010/0015711, полностью включенной в данный документ путем ссылки) для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Предпочтительным ингибитором GSK3β является 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он, далее именуемый «Композиция MCX». Обработка может включать контакт плюрипотентных стволовых клеток со средой, обогащенной от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 150 нг/мл, альтернативно от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл, альтернативно приблизительно 100 нг/мл GDF8. Обработка может также включать контакт клеток с от приблизительно 0,1 до 5 мкМ, альтернативно от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5 мкМ, предпочтительно примерно 1 мкМ композиции МСХ. Плюрипотентные клетки могут культивировать на протяжении приблизительно двух-пяти дней, предпочтительно приблизительно два-три дня, для обеспечения удобства их дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные клетки культивируются в присутствии GDF8 и композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и более низкой концентрации композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 на протяжении одного дня в отсутствии композиции МСХ. В частности, клетки могут культивироваться в присутствии GDF8 и приблизительно 1мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и примерно 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 на протяжении одного дня в отсутствии композиции МСХ. В альтернативном варианте осуществления клетки могут культивироваться в присутствии GDF8 и приблизительно 1мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и примерно 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, можно определить путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют данных маркеров. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток может быть обнаружена, когда клетки начинают экспрессировать маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Способы оценки экспрессии белковых маркеров и маркеров нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Эти способы включают в себя количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизацию in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ред. 2001 г., дополнение)), а также иммунологические анализы (такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998 г.)).
Дополнительно, эффективность дифференцирования можно определить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток веществом (таким как антитело), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный интересующими дифференцированными клетками.
Дифференцированные клетки в дальнейшем также могут быть очищены. Например, после обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов настоящего изобретения дифференцированные клетки можно очистить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток веществом (таким как антитело), специфически распознающим белковый маркер, характерно экспрессируемый очищенными дифференцированными клетками.
Стадия 2: Дифференцирование клеток экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной эндодермы, могут далее дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки. В одном из вариантов осуществления формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы со средой, содержащей фактор роста фибробластов («FGF»)7 или FGF10 для дифференцировки этих клеток. Например, культуральная среда может включать от приблизительно 25 нг/мл до приблизительно 75 нг/мл, альтернативно от приблизительно 30нг/мл до приблизительно 60 нг/мл, альтернативно приблизительно 50 нг/мл FGF7 или FGF10, предпочтительно FGF7. Клетки можно культивировать при этих условиях на протяжении двух-трех дней, предпочтительно примерно два дня.
В другом варианте осуществления дифференцировка в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, с FGF7 или FGF10 и аскорбиновой кислотой (витамином С). Культуральная среда может содержать от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 0,4 мМ, альтернативно приблизительно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. Культуральная среда также может включать от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 35 нг/мл, альтернативно от приблизительно 15нг/мл до приблизительно 30 нг/мл, альтернативно приблизительно 25 нг/мл FGF7 или FGF10, предпочтительно FGF7. Например, культуральная среда может содержать приблизительно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и приблизительно 25 нг/мл FGF7. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 1 обрабатываются FGF7 и аскорбиновой кислотой на протяжении 2 дней.
Стадия 3: Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, могут далее дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки. В одном из вариантов осуществления, клетки стадии 2 далее дифференцируются в клетки стадии 3 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, обогащенной сглаженным ингибитором рецепторов («SMO») (таким «MRT10» (N-[[[3-бензойламино)фенил]амино]тиоксометил]-3,4,5-триметоксибензамид)) или Sonic Hedgehog («SHH») антагонистом, сигнализирующим о траектории (таким как сглаженный антагонист 1 («SANT-1») ((Е)-4-бензил-N-((3,5-диметил-l-фенил-lH-пиразол-4-ил)метилен-пиперазин-l-амин)), Hedgehog ингибитор траектории 1 («HPI-l) (2-метоксиэтил 1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-(3-гидроксифенил)-7-(2-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-3-хинолдинкарбоксилат), ретиноевой кислотой и Noggin. Альтернативно, клетки стадии 2 могут быть дифференцированы в клетки стадии 3 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, дополненной SMO ингибитором рецептора, SHH, сигнализирующим о траектории антагонистом, ретиноевой кислотой и Noggin. Клетки можно культивировать на протяжении приблизительно двух-четырех дней, предпочтительно примерно два дня. В одном из вариантов осуществления среда обогащена от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,3 мкМ SANT-1, от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 3 мкМ ретиноевой кислоты и от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл Noggin. В другом варианте осуществления среда обогащена приблизительно 0,25 мкМ SANT-1, приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты и приблизительно 100 нг/мл Noggin.
В альтернативном варианте осуществления, клетки стадии 2 далее дифференцируются в клетки стадии 3 путем обработки клеток стадии 2 средой, обогащенной FGF7 или FGF10, ретиноевой кислотой, ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин), или антагонистом, сигнализирующим о траектории, SHH (таким как SANT-1 или HPI-1), активатором протеинкиназы С («РКС») (таким как ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторометил)фенил)-2,4-пентадиенойламино)бензолактам) («ТРВ»); EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ), форбол-12,13-дибутират («PDBu»), форбол-12-миристат-13-ацетат («PMA») или индолактам V («ILV»), ингибитором морфогенического белка кости («BMP») (таким как LDN-193189, Noggin или Chordin) и аскорбиновой кислотой. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена FGF7 или FGF10, ретиноевой кислотой, ингибитором SMO, SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории (таким как SANT-1), активатором РКС (таким как ТРВ), ингибитором ВМР (таким как LDN-193189), и аскорбиновой кислотой. Клетки могут культивироваться в присутствии этих факторов роста, низкомолекулярных антагонистов и антагонистов на протяжении приблизительно двух-четырех дней, предпочтительно около двух-трех дней.
В одном из вариантов осуществления среда обогащена от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 35 нг/мл FGF7, от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты, от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,4 мкМ SANT-1, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 300 нМ ТРВ, от приблизительно 50 нМ до приблизительно 200 нМ LDN-193189 и от приблизительно 0,15 мкМ до приблизительно 0,35 мкМ аскорбиновой кислоты. В другом варианте осуществления среда обогащена приблизительно 25 нг/мл FGF7, приблизительно 1 мкМ ретиноевой кислоты, приблизительно 0,25 мкМ SANT-1, приблизительно 200 нМ ТРВ, приблизительно 100 нМ LDN-193189 и приблизительно 0,25 мкМ аскорбиновой кислоты.
Получение клеток стадии 4-6 путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Хотя настоящее изобретение рассматривает культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на всех стадиях пути от плюрипотентной клетки до панкреатической эндокринной клетки, изобретение предпочтительно представляет формирование клеток стадии 1-3 в погруженной культуре, и клеток стадии 4-6 путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет пошаговый способ дифференцировки плюрипотентных клеток, включающий культивирование во время стадий 4-6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В определенных вариантах осуществления клетки могут культивироваться в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на всем протяжении стадий 4-6. В других вариантах осуществления, только на поздней стадии 4 по стадию 6, или только стадии 5-6, или только стадии 4-5, или только стадии 4-6 включают культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Когда клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия (воздушно-жидкостной зоне взаимодействия), клетки могут культивироваться на пористом субстрате, так что клетки находятся в контакте с воздухом сверху и с культуральной средой внизу. Например, достаточный объем среды может быть добавлен снизу культурального сосуда, содержащего пористый субстрат (например, вкладыш фильтра), так что среда контактирует с нижней поверхностью клеток, расположенных на субстрате, но не инкапсулирует и не покрывает их. Подходящие пористые субстраты могут быть сформированы из любого материала, который не окажет отрицательного влияния на рост и дифференцировку клеток. Примеры пористых субстратов изготовлены из полимеров, таких как полиэтилен терефталат (РЕТ), полиэфир или поликарбонат. Подходящие пористые субстраты могут обладать или не обладать покрытием. В одном из вариантов осуществления пористый субстрат может быть покрыт MATRIGEL™. В одном из вариантов осуществления изобретения пористым субстратом является пористый вкладыш фильтра, который может быть покрыт MATRIGEL™. Предпочтительно, однако, чтобы пористым субстратом являлся вкладыш фильтра без покрытия. Пористость субстрата должна быть достаточной для поддержания жизнеспособности клетки и стимуляции дифференцировки клеток. Подходящие субстраты включают фильтрующие вкладыши, обладающие размером пор от около 0,3 до около 3,0 мкм, от около 0,3 до около 2,0 мкм, от около 0,3 до около 1,0 мкм, от около 0,3 до около 0,8 мкм, от около 0,3 до около 0,6 мкм, от около 0,3 до около 0,5 мкм, от около 0,5 до около 3,0 мкм, от около 0,6 до около 3,0 мкм, от около 0,8 до около 3,0 мкм, от около 1,0 до около 3,0 мкм, от около 2,0 мкм до 3,0 мкм, предпочтительно около 0,4 мкм, и плотностью пор от около 50 до около 120 миллионов пор/см2, от около 60 до около 110 миллионов пор/см2, от около 70 до около 100 миллионов пор/см2, предпочтительно от 80 до 100 миллионов пор/см2, от около 90 до около 100 миллионов пор/см2, более предпочтительно около 100 миллионов пор/см2
Среду следует заменять или освежать ежедневно или через день. Клетки, выросшие на верхней части пористого субстрата, как правило, не являются одиночными клетками, скорее они формируют лист или существуют в агрегатном кластере клеток. Клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, могут испытывать значительно большее воздействие кислорода по сравнению с клетками, погруженными в среду.
Настоящее изобретение таким образом включает получение клеток стадий 4-6, предпочтительно клеток стадий 5-6, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетки стадии 4 могут быть культивированы полностью в планарных культурах, полностью в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, или клетки могут культивироваться в погруженной планарной культуре во время ранней части стадии 4, а затем культивироваться в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время поздней части стадии 4. Эти клетки могут быть получены путем дифференцировки плюрипотентных столовых клеток или путем дальнейшей дифференцировки клеток стадий 3, 4 или 5, полученный иными путями.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, предпочтительно бета-клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки; и дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных/бета-клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, предпочтительно бета-клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки; и дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Способ может включать обработку средой, обогащенной трииодотиронином (Т3), тироксином (Т4), аналогов Т3 или Т4 или их сочетаний (общее название здесь и далее «Т3/Т4», или ингибитором активина рецептороподобной киназы («ALK») 5, или одновременно Т3/Т4 и ингибитором ALK5. Пригодные для применения аналоги гормонов щитовидной железы могут включать: GC-1 (Собертиром), доступный от R & D Systems, Inc. кат. №4554; DITPA (3,5-дииодотиропропионовоая кислота); КВ-141, обсуждаемый в J. Steroid Biochem. Мол. Biol. 2008, 111; 262-267 и Proc. Natl. Acad. Sci. США 2003, 100: 10067-10072; MB07344, обсужденный в Proc. Natl. Acad. Sci. США 2007, 104: 15490-15495; T0681, обсужденный в PLoS One, 2010, 5e8722 и J. Lipid Res. 2009, 50; 938-944; и GC-24, обсужденный в PLoS One, 2010, e8722 и Endocr. Pract. 2012; 18(6): 954-964, содержание которого полностью включено в настоящий документ. Пригодные ALK5 ингибиторы включают: ALK5 ингибитор II (Enzo, Farmingdale, NY); ALK5i (Axxora, San Diego, CA); SD208 (R & D systems (MN)); TGF-B ингибитор SB431542 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); ITD-1 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2109761 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); A83-01 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2157299 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); TGF-β рецептор ингибитор V (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор I (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор IV (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VII (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VIII (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор II (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VI (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор III (EMD Chemicals, Gibstown, NJ). Способ может включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, и культивированием в планарной культуре. Способ может также включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или обоими, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В одном из вариантов осуществления способ включает обработку средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления способ включает обработку клеток стадии 3 средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5. Способ также может включать обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5.
Одним из вариантов осуществления изобретения является способ формирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для бета-клеток, включая дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии β-клеток, экспрессирует инсулин и по меньшей мере один из следующих факторов транскрипции: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, 1SL1, HNF3β, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном из вариантов осуществления способы изобретения приводят к формированию клеток, которые положительны для NKX6.1, PDX1 и НВ9. Соответственно, изобретение представляет способ индуцирования экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в человеческих клетках путем культивирования панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в условиях, достаточных для индуцирования такой экспрессии. Изобретение также представляет способ индуцирования экспрессии PDX1, NKX6.1 и NGN3 в человеческих клетках путем культивирования панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Способ может включать обработку средой, обогащенной Т3, ALK5, или обоими. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, среда может быть обогащена Т3, в то время как в другом варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена как T3, так и ингибитором ALK5. Клетки стадии 6 могут быть клетками, положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9. В других вариантах осуществления клетки стадии 6 являются положительными для одного гормона. Например, клетки стадии 6 могут быть клетками, которые (а) соэкспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А или (b) соэкспрессируют NKX6.1 и инсулин.
Культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия включает посев клеток на пористый субстрат, такой как пористый вкладыш фильтра. В определенных вариантах осуществления размер пор в субстрате может быть от примерно 0,4 до примерно 3 микрон, или любого другого размера, упомянутого в настоящем документе. Посев может быть выполнен путем выделения отдельных клеток или кластеров клеток из однослойных культур в суспензию и затем аликвотирования клеточной суспензии на пористый субстрат, помещенный в воздушно-жидкостную зону взаимодействия. Клетки могут быть посеяны на пористый субстрат из суспензии, содержащей от около 1000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 90,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 80,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 70,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 60,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 50,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 40,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 30,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 20,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 10,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 5000 клеток/мкл, от около 5000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 10,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 20,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 30,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 40,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 50,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 60,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 20,000 клеток/мкл до около 80,000 клеток/мкл, от около 30,000 клеток/мкл до около 70,000 клеток/мкл, от около 40,000 клеток/мкл до около 60,000 клеток/мкл, предпочтительно около 50,000 клеток/мкл. Клетки могут быть посеяны в виде капель клеточной суспензии, содержащих отдельные клетки или скопления клеток. Полученный клеточный депозит может содержать от около 5×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 6×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 7×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 8×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 9×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 1×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 2×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 2×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 3×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 3×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 4×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 4×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 3×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 2×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 1×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 9×106 клеток/см2, от около 5×106 до около 8×106 клеток/см2, от около 5×106 до около 7×106 клеток/см2, от около 5×106 до около 6×106 клеток/см2, от около 7×106 до около 4×107 клеток/см2, от около 8×106 до около 3×107клеток/см2, от около 9×106 до около 2×107 клеток/см2, предпочтительно порядка около 1×107 клеток/см2.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу повышения экспрессии белка НВ9 путем культивирования и дифференцировки популяции панкреатических энтодермальных клеток-предшественников, со-положительных для PDX1 и NKX6.1, в панкреатические эндокринные клетки, со-положительные для PDX1 и NKX6.1 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на пористом субстрате. Альтернативно, экспрессия белка НВ9 может быть понижена путем культивирования и дифференцировки популяции энтодермальных клеток передней кишки, состоящей первоначально из клеток, положительных для PDX1, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток панкреатической энтодермы получают путем поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток, по меньшей мере частично, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления изобретение представляет способ повышения количества клеток, положительных для одного гормона (например, клеток, которые со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин, или клетки, которые производят NKX6.1 и хромогранин-А), путем культивирования и дифференцировки популяции клеток, со-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, затем дифференцируются в панкреатические эндокринные клетки путем обработки составом, выбранным из следующих: ингибитор ALK5, ингибитором ВМР, ингибитор гамма-секретазы, Эфрин лиганды, ингибитор EphB, ингибитор РКС, ингибитор EGFr, ретиноевая кислота, витамин С Т3/Т4, глюкоза, регуляторы клеточного цикла, регуляторы WNT, ингибитор SHH или сочетание вышеперечисленного.
В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, затем дифференцируются в панкреатические эндокринные клетки-предшественники и клетки, экспрессирующие гормоны поджелудочной железы. В альтернативном варианте осуществления изобретение включает клетки, подготовленные способами настоящего изобретения, которые экспрессируют инсулин, но не NKX6.1. В некоторых вариантах осуществления популяция панкреатической энтодермальной клеточной линии, полученная в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, трансплантируется в животное, больное диабетом, для дальнейшего созревания in vivo до функциональных панкреатических эндокринных клеток.
Стадия 4: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 3 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка. Например, ростовая среда, такая как MCDB131 или BLAR, может быть обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин), или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (например, SANT-1 или HPI-1), ингибитором ВМР (например, LDN-193189, Noggin или Chordin), аскорбиновой кислотой и активатором РКС (таким как TPB, PDBu, PMA или ILV) для обеспечения полезной среды для дифференцировки. Культивирование клеток стадии 3 в такой среде на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, как правило, достаточно для дифференцировки клеток стадии 3 в клетки стадии 4. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1; примерно 100 нМ ретиноевой кислоты; примерно 2 нг/мл FGF7; примерно 100 нМ LDN-193189; и примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и примерно около 100 нМ ТРВ, на протяжении трех дней. В другом варианте осуществления среда далее обогащена Т3, к примеру, от около 5 нМ до около 25 нМ, альтернативно около 10 нМ Т3.
На стадии 4 клетки могу культивироваться в планарной культуре или в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В частности, настоящее изобретение представляет клеточную культуру в условиях in vitro для дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток. Альтернативно, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки путем обработки средой, обогащенной, как описано выше, в планарной культуре.
В последующем варианте воплощения, клетки в конце стадии 4 могут быть обработано ингибитором Rho-ассоциированной киназы («ROCK»), таким как Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-аминоэтил)-N-(пиридин-4-ил)цикоргексанкарбоксамид), GSK269962 (N-[3-[[2-(4-амино-1,2,5-оксадиазол-3?-ил)-1-этил-1H-имидазо[4,5-c]пиридин-6-ил]окси]фенил]-4-[2-(4-морфолинил)этокси]бензамид), H1152 ((S)-(+)-2-метил-1-[(4-метил-5-изохинолинил)сульфонил]гомопиперазин, 2HCl,) и, SR3677 (N-[2-[2-(диметиламино)этокси]-4-(1H-пиразол-4-ил)фенил-2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-2-карбоксамид дигидрохлорид). В определенных вариантах осуществления может быть использовано около 10 мкМ ингибитора ROCK.
В определенных вариантах осуществления в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культивируются только клетки поздней стадии 4. В одном из вариантов осуществления в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культивируются только клетки поздней стадии 4, обработанные ингибитором ROCK. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В альтернативном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5, Noggin и РКС активатором (таким как ТРВ). В некоторых вариантах осуществления среда может быть обогащена около 0,1 мкМ ингибитора ALK5, около 100 нг/мл Noggin и около 500 нМ ТРВ. Клеточная культура может быть в однослойном формате. Обработка может длиться около полных трех дней. В определенных вариантах осуществления клетки могут обрабатываться на протяжении двух дней, а затем в последний день клетки могут быть обработаны протеолитическими ферментами, коллагенолитическими ферментами или и теми и другими, такими как диспаза, и разбиты на клеточные кластеры диаметром менее чем 100 микрон, а затем культивированы в присутствии ингибитора ALK5 и LDN-193189. В определенных вариантах осуществления клеточные кластеры с диаметром меньшем, чем около 100 микрон, могут культивироваться в среде, обогащенной около 200 нМ ингибитора ALK5 и около 100 нМ LDN-193189.
Стадия 5: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В другом варианте осуществления ростовая среда обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин) или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (таким как SANT-1 или HPI-1), ретиноевой кислотой, Т3, аскорбиновой кислотой, ингибитором ВМР рецептора (таким как LDN-193189, Noggin или Chordin) и ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором SMO. SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, Т3, аскорбиновой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно на протяжении трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 50нМ LDN-193189, примерно 10 нМ Т3 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5. В некоторых вариантах осуществления ингибитором ALK5 является SD208 (2-(5-хлоро-2-фторофенил)птеридин-4-ил]пиридин-4-ил-амин). В одном из вариантов осуществления среда обогащена около 1000 нМ SD208.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно на протяжении трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, вместе с ретиноевой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5.
Среда может также быть обогащена ZnSO4. Например, может быть добавлено около 10 мкМ ZnSO4. Таким образом, в одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 могут дифференцироваться в клетки стадии 5 путем обработки клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ZnSO4, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, LDN-193189 и ингибитором ALK5 II. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 50 нМ LDN-193189, примерно 10нМ Т3 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5. Подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, SD208, ингибитор ALK5 II, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания.
В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. В другом варианте осуществления использовано около 1000 нМ ингибитора ALK5. В альтернативно варианте осуществления клетки стадии 4 обрабатываются средой, обогащенной примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 100 нМ LDN-193189 и примерно 10000 нМ ингибитора ALK5 II.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении примерно двух дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 50 нМ LDN-193189 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5 (такого как SD208 или ингибитор ALK5 II). В определенных вариантах осуществления средой может быть MCDB-131 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY).
Количество клеток, посеянных для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, может варьировать. Например, для культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, капли клеточной суспензии, содержащие от около 2×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 3×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 4×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 5×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 2×105 клеток/мкл до около 5×105 клеток/мкл, 2×105 клеток/мкл до около 4×105 клеток/мкл, или около 3×105 клеток/мкл, могут быть посеяны на пористый субстрат, такой как фильтр, расположенный в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления капли клеточной суспензии, содержащие от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл, от около 0,6×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл, или от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,6×105 клеток/мкл высеваются на пористый субстрат для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором рецептора ВМР (например, LDN-193189, Noggin или Chordin) и ингибитором ALK5, на протяжении примерно одного дня для дифференцировки клеток стадии 4 в клетки стадии 5. Например, среда может быть обогащена примерно 100 нМ LDN-193189 и примерно 200 нМ ингибитора ALK5. Предпочтительно этот вариант осуществления также включает предварительную обработку клеток диспазой. Клетки могут быть сформированы в кластеры. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4, полученные согласно вариантам осуществления изобретения используются и дифференцируются в клетки стадии 5, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки 4, полученные в соответствии с другими протоколами.
В соответствии с последующим способом, изобретение также представляет клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
В определенных вариантах осуществления культивирование клеток на стадии 5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия может улучшить экспрессию гормонов поджелудочной железы. Соответственно, изобретение также представляет способы повышения экспрессии гормонов поджелудочной железы путем культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления клетки на стадии 5 могут быть обработаны согласно приведенному описанию и в таблицах VIII-XIII ниже. В определенных вариантах осуществления способ также моет понизить экспрессию PTF1a, SOX9, CDX2 (маркер кишечника), ZIC1 (маркер эктодермы) и SOX2 (фронтальный маркер энтодермы).
В одном из вариантов осуществления способ также включает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или обоими, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Стадия 6: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 5 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток стадии 5 в клетки стадии 6. В одном из вариантов осуществления ростовая среда обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин) или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (таким как SANT-1 или HPI-1), ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, Т3/Т4 и ингибитором ALK5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. Клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 500 мМ ингибитора ALK5 и 0,1 нМ T3, на протяжении трех дней. Альтернативно, клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 500 нМ ингибитора ALK5 и 10 нМ T3, на протяжении трех дней. Клетки могут культивироваться в подобной среде на протяжении дополнительных двух дней, или более, если это желательно.
Альтернативно, клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в стадию 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, SMO ингибитором или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ингибитором ВРМ, Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении шести-четырнадцати дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней, альтернативно около 8 дней, альтернативно около 9 дней, альтернативно около 10 дней, альтернативно около 11 дней, альтернативно около 12 дней, альтернативно около 13 дней и альтернативно около 14 дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. Например, клетки могут культивироваться в среде, обогащенной около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 100 нМ LDN-193189, около 1000 нМ T3 и от около 500 до около 10,000 нМ, от около 1000 до около 10,000 нМ, от около 5000 до около 10,000 нМ, от около 600 до около 5000 нМ, от около 700 до около 5000 нМ, от около 800 до около 5000 нМ, от около 900 до около 5000 нМ, от около 1000 нМ до около 5000 нМ, от около 600 до около 1000 нМ, от около 700 до около 1000 нМ, от около 800 до около 1000 нМ, от около 600 до около 1200 нМ, от около 700 до около 1200 нМ, от около 800 до около 1200 нМ, от около 900 до около 1200 нМ, альтернативно около 500 нМ, альтернативно около 1000 мМ, и альтернативно около 10,000 нМ ингибитора ALK5.
Подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, SD208, ингибитор ALK5 II, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания.
В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. В другом варианте осуществления использовано около 1000 нМ ингибитора ALK5. Соответственно, в одном из вариантов осуществления клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, ингибитора SMO или SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории, ингибитором ВМР, Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении примерно шести дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, SMO ингибитором или SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории, ингибитором ВМР, T3, и ингибитором ALK5 II, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении от около 5 дней до около 15 дней, от около 6 дней до около 14 дней, от около 7 дней до около 13 дней, от около 8 дней до около 12 дней, от около 9 дней до около 11 дней, от около 5 дней до около 10 дней, от около 10 дней до около 15 дней, альтернативно около 5 дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней, альтернативно около 8 дней, альтернативно около 9 дней, альтернативно около 10 дней, альтернативно около 11 дней, альтернативно около 12 дней, альтернативно около 13 дней, альтернативно около 14 дней, альтернативно около 15 дней. В одном из вариантов осуществления клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении 5 дней или более. 6 дней или более, 7 дней или более, 8 дней или более, 9 дней или более, 10 дней или более, 11 дней или более, 12 дней или более, 13 дней или более, 14 дней или более, 15 дней или более. В одном из вариантов осуществления клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении 15 дней или менее, 14 дней или менее, 13 дней или менее, 12 дней или менее, 11 дней или менее, 10 дней или менее, 9 дней или менее, 8 дней или менее, 7 дней или менее, 6 дней или менее, 5 дней или менее. В одном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 10 дней. В другом варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 11 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 12 дней. В еще одном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 15 дней. В этих вариантах осуществления среда может быть обогащена примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 100 нМ LDN-193189, примерно 1000 нМ T3 и примерно 10000 нМ ингибитора ALK5 II. В некоторых вариантах осуществления среда может быть также обогащена сульфатом цинка (ZnSO4). Например, среда может быть обогащена 10 мкМ ZnSO4. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории.
В соответствии с последующим способом, изобретение также представляет клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
В одном из вариантов осуществления клетки стадии 5, полученные согласно вариантам осуществления изобретения используются и дифференцируются в клетки стадии 6, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки 5, полученные в соответствии с другими протоколами.
В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, который являются положительными для одного гормона. Таким образом, способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
В определенных вариантах осуществления изобретения способ использует среду BLAR (см. таблицу II) на стадиях 4-6. Среда предпочтительно должна заменяться каждый день или альтернативно через день. В некоторых вариантах осуществления способы включают обработку клеток стадий 4-6 указанными компонентами в количествах, указанных в таблицах VIII-XIII настоящего документа.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток стадии 6, со-экспрессирующих NKX6.1 и хромогранин-А, включающему культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6, предпочтительно стадиях 5-6. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток, положительных для одного гормона инсулина, экспрессирующих NKX6.1, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6, предпочтительно стадиях 5-6.
Культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время или после стадии 4 может существенно улучшить экспрессию панкреатических энтодермальных маркеров вместе с маркерами, относящимися к эндокринным. Соответственно, изобретение представляет способ увеличения экспрессии панкреатических энтодермальных и относящихся к эндокринным маркеров путем культивирования клеток во время или после стадии 4 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления изобретение также представляет способы увеличения урожая положительных для NKX6.1 клеток, со-экспрессирующих инсулин, хромогранин-А и инсулин, путем культивирования клеток стадии 4 и последующих в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в присутствии ингибитора ALK5. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. Другие подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания. В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к ингибитору ALK5, клетки могут быть обработаны, как описано в таблицах VIII-XIII ниже.
В одном из вариантов осуществления изобретение представляет способы увеличения урожая положительных для NKX6.1 клеток, со-экспрессирующих инсулин, хромогранин-А и инсулин, путем культивирования клеток стадии 5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в присутствии ингибитора ALK5 II. В одном из вариантов осуществления способ также включает культивирование клеток во время стадии 5 в присутствии ингибитора ALK5 II и Т3.
Созревание клеток стадии 6 в условиях in vivo
В некоторых вариантах осуществления клетки стадии 6, подготовленные в соответствии с способами изобретения, могут в дальнейшем созревать в условиях in vivo. В одном из вариантов осуществления эти клетки могут дозревать путем трансплантации in vivo млекопитающему. Например, клетки могут быть трансплантированы под почечную капсулу мыши. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6, которые дозревают в условиях in vivo, являются клетками, со-экспрессирующими NKX6.1 и инсулин. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6, которые дозревают в условиях in vivo, являются клетками, со-экспрессирующими NKX6.1 и хромагранин. В альтернативном варианте осуществления созревание in vivo (а) клеток, со-экспрессирующих NKX6.1 и инсулин, или (b) клеток, со-экспрессирующих NKX6.1 и хромагранин, приводит к раннему получению С-пептида. В определенных вариантах осуществления уровень выработки С-пептида от трансплантации приблизительно 3 миллионов клеток стадии 6 равен количеству С-пептида, полученного от трансплантации приблизительно 3000 человеческих островков.
Культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия согласно способам, описанным в настоящем документе, также хорошо подходит для применения в скрининговых составах из-за их эффекта на секрецию панкреатических гормонов и эндокринных маркеров. В частности, клетки стадий 4-6, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, могут использоваться в различных культурных форматах, включая от 384 до 6- WELL(&) форматы, для оценки эффекта включения различных мелких молекул или биоединиц, в различных дозах и временных интервалах, оказываемого на последующую экспрессию маркеров панкреатических энтодермальных, панкреатических эндокринных и панкреатических бета-клеток. Такая оценка может быть выполнена путем измерения генной экспрессии с помощью ПЦР, белковой экспрессии путем FACS, иммуноокрашивания, или с помощью ELISA секреции факторов клетками, на которые воздействовало добавление низкомолекулярных компонентов или высокомолекулярных биологических препаратов.
Клетки, получаемые с помощью способов изобретения
Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить способами настоящего изобретения. Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, полученную способами настоящего изобретения.
Изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, предпочтительно экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, для которых характерна значительная со-экспрессия NKX6.1 и хромогранин-А. Изобретение также представляет инсулин-положительную клетку или популяцию инсулин-положительных клеток, предпочтительно экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, для которых характерна экспрессия NKX6.1 (не в обязательном порядке >30%). Эти популяции ранее не описаны, как объяснено в Примере 10.
Способы обработки
Изобретение представляет способы обработки. В частности, настоящее изобретение представляет способ лечения пациента, страдающего диабетом или подвергающегося риску развития данного заболевания.
Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить или полученные способом настоящего изобретения для применения в способе лечения. В частности, настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить или полученные способом настоящего изобретения для применения в способе лечения пациента, страдающего диабетом или подвергающегося риску развития данного заболевания.
Диабет может быть диабетом типа I или типа II.
В одном из вариантов осуществления способ лечения включает имплантацию клеток, которые получены или могут быть получены способом настоящего изобретения, пациенту.
В одном из вариантов осуществления способ лечения включает
дифференцировку плюрипотентных клеток in vitro в клетки стадии 1, стадии 2, стадии 3, стадии 4, стадии 5 или стадии 6, например, как описано в настоящем документе,
и имплантации дифференцированных клеток пациенту.
В одном из вариантов осуществления способ также содержит стадию культивирования плюрипотентных стволовых клеток, например как описано в настоящем документе, предшествующую стадии дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.
В одном из вариантов осуществления способ также включает стадию дифференцировки клеток in vivo, после стадии имплантации.
В одном из вариантов осуществления пациент является млекопитающим, предпочтительно человеком.
В одном из вариантов осуществления клетки можно имплантировать в форме дисперсных клеток или клеток, образующих кластеры, которые можно вводить в воротную вену печени способом инфузии. Клетки можно альтернативно вводить в биосовместимые разлагающиеся полимерные опорные материалы, пористые неразлагающиеся устройства или в инкапсулированном виде для защиты от иммунного ответа организма-хозяина. Клетки можно имплантировать в подходящее место в организме реципиента. Места имплантации включают в себя, например, печень, естественную поджелудочную железу, пространство под почечной капсулой, сальник, брюшную полость, субсерозное пространство, кишечник, желудок или подкожный карман.
Для стимуляции дальнейшего дифференцирования, выживаемости или активности имплантированных клеток in vivo, до, одновременно с или после введения клеток можно вводить дополнительные факторы, такие как факторы роста, антиоксиданты или противовоспалительные вещества. Данные факторы могут секретироваться эндогенными клетками и воздействовать на внедренные клетки in situ. Дифференцирование имплантированных клеток можно индуцировать любой комбинацией эндогенных и введенных экзогенно факторов роста, известных в данной области.
Количество клеток, используемых при имплантации, зависит от ряда различных факторов, включая состояние пациента и его реакцию на лечение, и может быть определено специалистом в данной области.
В одном из вариантов осуществления способ лечения также включает встраивание клеток перед имплантацией в трехмерный опорный материал. Клетки можно поддерживать in vitro на данном опорном материале перед имплантацией пациенту. Опорный материал, содержащий клетки, альтернативно можно имплантировать непосредственно в организм пациента без дополнительного культивирования in vitro. В опорный материал может быть необязательно включено по меньшей мере одно фармацевтическое вещество, обеспечивающее выживаемость и функционирование трансплантированных клеток.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Культивирование панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример изучает и демонстрирует, что панкреатические эндокринные клетки-предшественники (клетки стадии 5) могут далее дозревать с помощью культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для культивирования панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы в панкреатические эндокринные клетки-предшественники на основе протокола, описанного ниже.
Эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 рассеивали как одиночные клетки при концентрации 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1:30; BD Biosciences, штат Нью-Джерси), в среде MTESR®1 (StemCell Technologies, г. Ванкувер, Канада) с добавлением 10 мкM Y27632 (Rock inhibitor, Catalog No. Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1: (3 дня): 60-70% конфлюэнтных прикрепленных к субстрату культур недифференцированных клеток Н1, размещенных на поверхностях, покрытых MATRIGEL, разведенным в соотношении 1:30, были помещены в среду GIBCO® RPMI 1640 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY), обогащенную 0,2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Hyclone, Utah), 100 нг/мл активина-A (AA; Pepro-tech; Rocky Hill, NJ), и 20 нг/мл Wnt3A (R&D Systems), только на один день. В течение последующих двух дней клетки культивировались в среде GIBCO® RPMI с 0,5% FBS и 100 нг/мл АА.
b) Стадия 2: (3 дня): Клетки стадии 1 были затем помещены в среду Дюльбекко, модифицированную по способу Игла (DMEM-F12) (Life Technologies Corporation, NY), обогащенную 2% FBS и 50 нг/мл FGF7 (Pepro-tech) на три дня.
с) Стадия 3: (4 дня): Клетки стадии 2 затем культивировались на протяжении четырех дней в среде DMEM-HG (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY), обогащенной 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO), 2 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich), 100 нг/мл Noggin (R&D Systems), и 1% (об/об) добавки, которая продается под торговой маркой B27® (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY (кат. №: 17504044).
d) Стадия 4: (3 дня): Клетки стадии 3 культивировались на протяжении трех дней в среде DMEM-HG, обогащенной 0,1 мкМ ингибитора ALK5 (ALK5i; Axxora, San Diego, CA), 100 нг/мл Noggin, 500 нМ ТРВ ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторометил)фенил)-2,4-пентадиенойламино)бензолактам; EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ) и 1% В27 в однослойном формате. Для последнего дня культивирования клетки были обработаны 5 мг/мл диспазы (Becton Dickinson, Bedford, MA, #354235) на протяжении 5 минут, после чего осторожно пипетированы для смешивания и разбивки на клеточные кластеры (<100 микрон). Клеточные кластеры были перенесены в одноразовые полистироловые центрифужные пробирки емкостью 125 мл (Corning) и вращались со скоростью 80-100 об/мин на протяжении ночи в суспензии со средой DMEM-HG, обогащенной 200 нМ ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 (Stemgent, CA) и 1% В27.
е) Стадия 5: (1 день): Клетки стадии 4 были обработаны 5 мг/мл диспазы на протяжении 5 минут, после чего осторожно пипетированы для смешивания и разбивки на клеточные кластеры (<100 микрон). Клеточные кластеры были перенесены в одноразовые полистироловые центрифужные пробирки емкостью 125 мл (Corning, NY) и вращались со скоростью 80-100 об/мин на протяжении ночи в суспензии со средой DMEM-HG, обогащенной 200 нМ ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 (Stemgent, CA), и 1% В27.
Кластеры стадии 5 день 1 были посеяны в пористые культуральные фильтровые вкладыши с диаметром пор 0,4 микрон (BD Biosciences, PET membranes, #353493) на 6-лунковые пластины (в 10 микролитров аликвот содержится ~1 миллион клеток) и культивировались на протяжении 3 недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия путем добавления 1,5 мл DMEM-HG + 1% B27 на дно вкладыша и без среды над ним. На Фиг. 1А-Н представлены фазовые контрастные образы кластеров на разных временных точках после посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. На Фиг. 2 А-К показаны результаты иммуноокрашивания для следующих белков через 1 неделю после посева клеточных кластеров на фильтры: DAPI (Фиг. 2A); инсулин (Фиг. 2B); HB9 (Фиг. 2С), DAPI (Фиг. 2D); глюкагон (Фиг. 2E); инсулин (Фиг. 2F); DAPI (Фиг. 2G); инсулин (Фиг. 2H); соматостатин (Фиг. 2I); NKX6.1 (Фиг. 2J); и инсулин (Фиг. 2K). В то время как на Фиг. 3А-Н показаны результаты иммуноокрашивания для следующих белков через 2 недели после посева на фильтры: инсулин (Фиг. 3А); глюкагон (Фиг. 3В); инсулин (Фиг. 3С); соматостатин (Фиг. 3D); инсулин (Фиг. 3Е), NKX6.1 (Фиг. 3F); HB9 (Фиг. 3G) и NKX6.1 (Фиг. 3Н). На Фиг. 2 панели A-C, D-F, G-I и J-K были взяты из того же поля. На Фиг. 3 панели А-В, С-D, E-F и G-H, соответственно, были взяты из того же поля. На Фиг. 4А-D показаны результаты иммуноокрашивания следующих протеинов через 3 недели после посева на фильтры: инсулин (Фиг. 4А; глюкагон (Фиг. 4В),; инсулин (Фиг. 4С) и соматостатин (Фиг. 4D). На Фиг. 4 панели А-В и С-D, соответственно, были взяты из того же поля.
На стадии 4 и в последующих культурах мРНК была собрана для ПЦР анализа на релевантные панкреатические энтодермальные/ эндокринные гены. Общая РНК был экстрагирована с помощью RNeasy® Mini Kit (Qiagen; Valencia, CA) и обратнотранскрибирована с помощью High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК была усилена с помощью Taqman Universal Master Mix и Taqman Gene Expression Assays, которые были предварительно загружены в Taqman Arrays (Applied Biosystems). Данные были проанализированы с применением ПО Sequence Detection Software (Applied Biosystems) и нормализованы относительно недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hES) с помощью способа ΔΔCt (т.е. результаты ПЦР были откорректированы относительно внутренних контролей (ΔΔCt=ΔCtобразец-ΔCtсправочное)). Все праймеры приобретали в Applied Biosystems. Цитометрия и иммунофлуоресцентный анализ были осуществлены в соответствии с предшествующим описанием (Diabetes, 61, 20126, 2012).
На Фиг. 5А-R представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 1: PDX1 (Фиг. 5A); NKX6.1 (Фиг. 5B); Pax4 (Фиг. 5C); Pax6 (Фиг. 5D), NGN3 (Фиг. 5E); NKX2.2 (Фиг. 5F); ABCC8 (Фиг. 5G); хромогранин-А (Фиг. 5H); PCSK1 (Фиг. 5I); IAPP (Фиг. 5J); инсулин (Фиг. 5К); глюкагон (Фиг. 5L); соматостатин (Фиг. 5М); грелин (Фиг. 5N); Ptf1a (Фиг. 5О); Zic1 (Фиг. 5Р); CDX2 (Фиг. 5Q) и SOX9 (Фиг. 5R). По истечении 3-недельного культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия было отмечено значительное зависимое от времени увеличение экспрессии маркеров, ассоциированных с созреванием эндокринных клеток, таких как ABCC8, IAPP (амилин) и PCSK1. Наблюдался значительный спад в экспрессии PTF1а и SOX9 и очень низкая экспрессия CDX2 (кишечный маркер), ZIC1 (эктодермический маркер) и SOX2 (фронтальный эндодермический маркер), в то время как экспрессия NKX6.1 и PDX1 поддерживались на очень высоком уровне. Экспрессия все гормонов поджелудочной железы была значительно улучшена на протяжении 3-недельного культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Пример 2. Культивирование панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением различных фильтровых вкладышей
Этот пример изучает тип и пористость фильтровых вкладышей в дифференцировке панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для изучения воздействия типа и пористости фильтровых вкладышей эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением описанного ниже протокола.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48) , в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100) (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d. Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е. Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нМ Т3, 50 нМ LDN-193189, 1000 нМ ингибитора ALK5 SD208 в течение трех дней. SD208 (2-(5-хлоро-2-фторофенил)птеридин-4-ил]пиридин-4-ил-амин) является 2,4-двузамещенным птеридином, АТР-конкурентным ингибитором TGF-βR I киназы, раскрытом в Molecular Pharmacology 2007, 72: 152-161, и обладающим структурой, показанной в формуле 1.
Формула 1
Figure 00000001
f. Стадия 6 (5 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,025 мМ аскорбиновой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5, 0,1 нМ T3 в течение трех дней.
В некоторых культурах клетки на стадиях 3-6, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была посеяна с плотностью около 2-6×106 клеток на фильтровые вкладыши для клеточных культур с диаметром пор 0,4 микрон, обладающие поверхностной областью приблизительно 4,2 см2 на 6-лунковой платформе. Различные фильтровые вкладыши, использованные в этом процессе, идентифицированы в таблице I. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. В некоторых культурах фильтры покрывались MATRIGEL™ (раствор 1:30) на 1 час при комнатной температуре, и клетки были посеяны на верхнюю часть покрытых вкладышей в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия или же с культуральной средой на верхушке вкладыша. На протяжении исследования среда заменялась через день.
Фиг. 6 демонстрирует данные анализа ПЦР в реальном времени об экспрессии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 2: PDX1 (Фиг. 6A); NKX6.1 (Фиг. 6B); PAX4 (Фиг. 6C); PAX6 (Фиг. 6D), NGN3 (Фиг. 6E); NKX2.2 (Фиг. 6F); ABCC8 (Фиг. 6G); хромогранин-А (Фиг. 6Н); PCSK1 (Фиг. 6I); IAPP (Фиг. 6J); инсулин (Фиг. 6К) и глюкагон (Фиг. 5L). Культивирование клеток стадии 4 на фильтровых вкладышах ((Corning, 3412, BD 353493, и Millipore PIHT 30R 48) существенно увеличивает панкреатические энтодермальные маркеры, так же как и маркеры, относящиеся к эндокринным. Покрытие фильтров MATRIGEL™ существенно снижает преимущества культивирования на фильтре в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Более того, клетки, культивируемые на фильтровых вкладышах с низкой плотностью пор (BD 353090, Corning 3452) продемонстрировали более низкую выживаемость и дифференцировку.
Таблица I
Список фильтровых вкладышей, оцененных в примере 2.
Фильтровый вкладыш Полимерная композиция Размер пор (микрон) Плотность пор (#/см2) Покрытие
BD, #353493 PET 0,4 100+/- 10×106 Нет
BD, #353090 PET 0,4 2+/- 0,2×106 Нет
Corning, #3452 Полистирол 0,4 4×106 +/- покрытие MATRIGEL™ (раствор 1:30)
Corning, #3412 Поликарбонат 0,4 100×106 Нет
Millipore, #PIHT 30R 48 PET 0,4 100×106 +/- покрытие MATRIGEL™ (раствор 1:30)
Пример 3 Панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, показали увеличение экспрессии эндокринных маркеров по сравнению с планарными культурами или культурами, поддержанными на фильтрах в жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример направлен на различия в склонности к дифференцировке панкреатических энтодермальных клеток, культивированных на планарных субстратах по сравнению с культивированными в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В дополнение, эффект воздушно-жидкостной зоны взаимодействия был дополнительно подчеркнут дифференцировкой интересующих клеток на вкладышах, но со средой, добавленной как на верхнюю, так и на нижнюю части вкладышей.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100) (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Для клеток, культивированных на фильтровых вкладышах, в начале стадии 1 в некоторых культурах среда была добавлена только на дно вкладыша, а верхняя часть вкладыша находилась в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, в то время как в других культурах среда также была добавлена как на верхнюю, так и на нижнюю часть фильтрового вкладыша. Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и композиции 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (производится компанией Invitrogen, см. таблицу II с компонентами среды BLAR), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нМ Т3, 50 нМ LDN-193189, 1000 нМ ингибитора ALK5 (SD208) в течение трех дней.
f) Стадия 6 (5 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,025 мМ аскорбиновой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5, 0,1 нМ T3 в течение трех дней.
В некоторых культурах клетки в конце стадии 3, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 2-6×106 клеток (в 50-100 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась через день.
Фиг. 7 демонстрирует данные анализа ПЦР в реальном времени об экспрессии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 3: PDX1 (Фиг. 7A); NKX6.1 (Фиг. 7B); PAX4 (Фиг. 7C); PAX6 (Фиг. 7D), NGN3 (Фиг. 7E); NKX2.2 (Фиг. 7F); ABCC8 (Фиг. 7G); хромогранин-А (Фиг. 7Н); PCSK1 (Фиг. 7I); IAPP (Фиг. 7J); инсулин (Фиг. 7К) и глюкагон (Фиг. 7L).
Культивирование клеток на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6 значительно повысило панкреатические маркеры, относящиеся к эндокринным. Далее, клетки, которые культивировались и дифференцировались на покрытых MATRIGEL™ фильтровых вкладышах с начала стадии 1 со средой на верхней и нижней частях фильтровых вкладышей, продемонстрировали более низкие уровни панкреатической энтодермальной и эндокринной экспрессией по сравнению с клетками, культивированными в планарных культурах и в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Более того, панкреатические энтодермальные клетки, культивированные на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, продемонстрировали самую высокую экспрессию панкреатических эндокринных клетках по сравнению со всеми протестированными конфигурациями.
Таблица II
Список компонентов среды BLAR
Компонент Концентрация (мМ)
Аминокислоты
Глицин 3.0E-02
Аланин 3.0E-02
Аргинин 3.0E-01
Аспарагин 1.0E-01
Аспарагиновая кислота 1.0E-01
Цистеин 2.0E-01
Глутаминовая кислота 3.0E-02
Гистидин 1.1E-01
Изолейцин 1.0E-02
Лейцин 9.0E-02
Лизина гидрохлорид 1.5E-01
Метиан 3.0E-02
Фенилаланин 3.0E-02
Пролин 1.0E-01
Серин 1.0E-01
Теронин 3.0E-02
Триптофан 2.0E-03
Тирозиндинатрий 1.0E-02
Воздушно-жидкостной зоны взаимодействия 3.0E-02
Витамины
Биотин 3.0E-05
Холина хлорид 5.0E-03
D-кальций пантотенат 1.5E-03
Соль кальция фолиевой кислоты 2.3E-03
Ниацинамид 4.9E-03
Пиридоксина гидрохлорид 9.7E-04
Рибофлавин 1.0E-05
Тинамина гидрохлорид 3.0E-03
Витамин В12 3.7E-06
I-инозитол 2.8E-03
Минералы/прочие
Кальция хлорид (CaCl2-2H2O) 3.0E-01
Меди сульфат (CuSO4-5H2O) 4.8E-06
Железа сульфат (FeSO4-7H2O) 1.0E-03
Магния сульфат (MgSO4-7H2O) 4.1E-01
Калия хлорид (KCl) 3.8E+00
Селеновая кислота H2SeO3
Натрия бикарбонат (NaHCO3) 1.4E+01
Натрия хлорид (NaCl) 1.1E+02
Натрия фосфат двухосновный (Na2HPO4-7H2O) 5.0E-01
Цинка сульфат (ZnSO4-H2O) 1.0E-04
Aденин 1.0E-03
D-глюкоза (декстроза) 5.0E+00
Липоевая кислота 1.2E+05
Фенол красный 1.0E-02
Натрия пируват 1.0E+00
Тимидин 9.8E-05
Пример 4. Панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и обработанные ингибитором ALK5 II, продемонстрировали существенно большее количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих хромогранин-А и инсулин.
Этот пример был осуществлен для демонстрации того, что ингибитор ALK5 II был уникален в получении значительной популяции клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которые экспрессировали NKX6.1 и инсулин или хромогранин-А. Более того, это наблюдение было уникально для культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Погруженные культуры в однослойных планарных культурах не смогли продемонстрировать значительное количество клеток NKX6.1, экспрессирующих инсулин или хромогранин-А.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% не содержащего жирных кислот BSA(Lampire, PA) и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го BSA без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты, 50 нМ LDN; 500-1000 нМ различных ингибиторов ALK5 (см. таблицу III со списком использованных ингибиторов) в течение трех дней.
f) Стадия 6 (7 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты; 500-1000 нМ ингибиторов ALK5 (см. таблицу III со списком протестированных ингибиторов).
В некоторых культурах клетки в конце дня 1 стадии 4, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 2-4×106 клеток (в 25-50 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась через день.
На Фиг. 8 представлены данные ПЦР в реальном времени при анализе экспрессии следующих генов в эмбриональных стволовых клетках человека линии Н1, дифференцированных и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия как описано в примере 4 после дня 1 стадии 4, дня 3 стадии 5 и дня 6 стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: PDX1 (Фиг. 8A); NKX6.1 (Фиг. 8B); NGN3 (Фиг. 8C); ABCC8 (Фиг. 8D); PCSK1 (Фиг. 8E); грелин (Фиг. 8F); глюкагон (Фиг. 8G); и инсулин (Фиг. 8Н).
На Фиг. 9 представлены данные ПЦР анализа в реальном времени об экспресии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 4 и культивированных в планарных однослойных культурах на день 3 стадии 5 и день 4 стадии 6 для PDX1 (Фиг. 9A), NKX6.1 (Фиг. 9B), NGN3 (Фиг. 9C), ABCC8 (Фиг. 9D), PCSK1 (Фиг. 9E), грелин (Фиг. 9F), глюкагон (Фиг. 9G), и инсулин (Фиг. 9H). Сравнение Фиг. 8 и 9 обнаруживает, что обработка планарных культур на стадии 5 и стадии 6 ингибитором ALK5 II привела к падению экспрессии инсулина на стадии 6 по сравнению со стадией 5. Однако обработка культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия ингибитором ALK5 привела к росту экспрессии инсулина на стадии 6 по сравнению со стадией 5. Та же схема применима к экспрессии NGN3 и NKX6.1 в культурах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в сравнении с однослойными культурами.
На Фиг. 10 описаны результаты иммуноокрашивания клеток стадии 6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде, обработанной либо 1 микромолярным SD208 ингибитором (панель 9А), либо 1 микромолярным ALK5 ингибитором II (панель 10В) и окрашенным для хромогранина-А (пан-эндокринный маркер) и NKX6.1 (панкреатический прекурсорный маркер и специфический маркер бета-клеток). Культуры, обработанные ингибитором ALK5 II, привели в результате к со-экспрессии NKX6.1 и хромогранина-А. Однако культуры, обработанные SD208, продемонстрировали очень низкую со-экспрессию NKX6.1 и хромогранина-А.
Культивирование панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в сочетании с ингибитором ALK5 II существенно повысили количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин и хромогранин-А. Более того, тот же протокол, примененный к клеткам, культивированным в однослойным культурам, не показал значительного количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин или хромогранин-А. Последнее, обработка клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия ингибиторами ALK5, отличных от ингибитора ALK5 II, не показала значительного количества клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин или хромогранин-А. Эти результаты показывают, что уникальная комбинация культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия со средой, обогащенной ингибитором ALK5 II, приводит к со-экспрессии инсулина/хромогранина-А и NKX6.1.
Таблица III
Ингибиторы FLK5, протестированные в примере 4
Соединение Производитель Номер по каталогу
Ингибитор TGF-B SB431542 Xcess Biosciences (San Diego, Ca) M60015-25s
SD208 R & D systems (MN) 3269
ITD-1 Xcess Biosciences (San Diego, Ca) M600060-2S
LY2109761 Xcess Biosciences (San Diego, Ca) M60035-2S
A83-01 Xcess Biosciences (San Diego, Ca) M60021-2S
LY2157299 Xcess Biosciences (San Diego, Ca) M60064-2S
ALK5-ингибитор II Enzo (Farmingdale, NY) ALX-270-445
Пример 5. Сравнение различных ингибиторов ALK5 на стадиях 5 и 6 для клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример демонстрирует, что ингибитор ALK5 II был уникален в получении значительной популяции клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которые экспрессировали NKX6.1 и инсулин или хромогранин-А. Дополнительные ингибиторы TGF-β, протестированные в данном примере, перечислены в таблице IV.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали в течение еще одного дня в среде MSDB-131, обогащенной следующими компонентами: 2% BSA без жирных кислот; 0,0012 г/мл натрия бикарбоната; 1X GlutaMax™; 4,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8; и 0,1 мкМ композиции МСХ. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d. Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 100 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×105 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах или на фильтровые вкладыши размером 10 см (Corning, #3419) в 10-сантиметровые чашки. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша на 6-лунковых пластинах, и 7,5 мл среды было добавлено на дно каждого 10-сантиметрового вкладыша. На верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е. Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 затем культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189; 1000 нМ различных ингибиторов ALK5 (см. таблицу IV со списком использованных ингибиторов) в течение трех дней.
f. Стадия 6 (6 дней): Клетки стадии 5 затем культивировались в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3; 1000 нМ ингибитора ALK5 (см. таблицу IV со списком использованных ингибиторов) в течение шести дней.
На Фиг. 23 представлены данные ПЦР в реальном времени при анализе экспрессии следующих генов в эмбриональных стволовых клетках человека линии Н1, дифференцированных и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия как описано в примере 5 после дня 4 стадии 5 и дня 6 стадии 6: PDX1 (Фиг. 23А); NKX6.1 (Фиг. 23B); NGN3 (Фиг. 23C); ABCC8 (Фиг. 23D); глюкагон (Фиг. 23E); и инсулин (Фиг. 23F). Аналогично результатам примера 4, культивирование панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и обработка ингибитором ALK5 II значительно повысило экспрессию инсулина и глюкагона. Обработка панкреатических клеток-предшественников передней кишки с другими ингибиторами ALK5 не привела к существенной экспрессии инсулина или глюкагона.
Таблица IV
Ингибиторы ALK5 (также называемые рецепторами TGF-β), протестированные в примере 5
Соединение Производитель Номер по каталогу
Ингибитор TGF-β рецептор V EMD 616456
Ингибитор TGF-β рецептор I EMD 616451
Ингибитор TGF-β рецептор IV EMD 616454
Ингибитор TGF-β рецептор VII EMD 616458
Ингибитор TGF-β рецептор VIII EMD 616459
Ингибитор TGF-β рецептор II EMD 616452
Ингибитор TGF-β рецептор VI EMD 616464
Ингибитор TGF-β рецептор III EMD 616453
Пример 6 Воздействие плотности клеточного посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на последующую дифференцировку в эндокринные клетки
Этот пример идентифицирует диапазон плотности посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и результирующую экспрессию эндокринных маркеров. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4,5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней. Затем, в конце стадии 3, клетки, культивированные на планарных чашках, были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты PBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), затем последовало удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,1, 0,5, 1 и 5×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение двух дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (14 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 10000 нM ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 и 1000 нМ T3 в течение четырнадцати дней.
Образцы РНК отбирались на стадиях 4, 5 и 6, и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 11 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 6 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 11A), глюкагон (Фиг. 11B), амилин (Фиг. 11C), инсулин (Фиг. 11D), NGN3 (Фиг. 11Е), NKX2.2 (Фиг. 11F), NKX6.1 (Фиг. 11G) и PDX1 (Фиг. 11H). Плотность посева в диапазоне 0,1-1×106 клеток/10 мкл привела к одинаковой экспрессии панкреатических энтодермальных и эндокринных маркеров на стадиях 5 и 6. При самой высокой протестированной плотности посева (5×106 клеток/10 мкл) в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия наблюдался спад экспрессии эндокринных маркеров.
Пример 7. Сравнение фильтровых вкладышей с размером пор 0,4, 1 и 3 микрон
Этот пример сравнивает воздействие размера пор фильтра на последующую дифференцировку в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение трех дней. Затем, в конце стадии 4, клетки, культивированные на планарных чашках, были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты PBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), затем последовало удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4, 1 или 3 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (15 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение пятнадцати дней.
Образцы РНК отбирались на стадии 6 и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 12 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в этом примере и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 12A), глюкагон (Фиг. 12B), амилин (Фиг. 12C), инсулин (Фиг. 12D), NGN3 (Фиг. 12Е), NKX2.2 (Фиг. 12F), NKX6.1 (Фиг. 12G) и PDX1 (Фиг. 12H). Фильтровые вкладыши с размером пор от 0,4 до 3 микрон не оказали значительного влияния на экспрессию панкреатических энтодермальных или эндокринных маркеров в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Пример 8. Сравнение дифференцировки панкреатических клеток-предшественников передней кишки в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с жидкостно-жидкостной (L/L) зоной взаимодействия на фильтровых вкладышах
Этот пример сравнивает воздействие культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с культивированием в жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия на дифференцировку панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 100 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. Для условий L/L среда также добавлялась на верхнюю часть фильтровых вкладышей, что приводит к получению жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (10 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение десяти дней.
Образцы РНК отбирались на стадиях 5 и 6, и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 13 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 8 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 13A), глюкагон (Фиг. 13B), амилин (Фиг. 13C), инсулин (Фиг. 13D), NGN3 (Фиг. 13Е), NKX2.2 (Фиг. 13F), NKX6.1 (Фиг. 13G) и PDX1 (Фиг. 13H). Наиболее значительная разница была отмечена в значительном повышении регуляции (7Х) глюкагона в условиях L/L в сравнении с воздушно-жидкостной зоной взаимодействия.
Пример 9. Панкреатические энтодермальные/эндокринные клетки-предшественники, культивированные в воздушно-жидкостной среде, могут применяться для скрининга библиотеки композиций
Этот пример изучает применение культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для скрининга библиотек композиций. Для осуществления этого эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (12 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение двенадцати дней. На этой стадии композиции, перечисленные в таблице V, были скринированы для идентификации потенциальных композиций которые воздействуют на энтодермальные и эндокринные маркеры.
Таблица V
Список композиций, протестированных на стадии 6
Кат. №/ Производитель Ингибитор Целевая киназа Тестовая концентрация
328007-EMD ERK-ингибитор II ERK1, ERK2 2 мкM
420119-EMD JNK-ингибитор II JNK 2 мкM
420136-EMD JNK-ингибитор IX JNK2, JNK3 2 мкM
444939-EMD Ингибитор MEK1/2 MEK1/2 2 мкM
454861-EMD Ингибитор MNK1 MNK1 2 мкM
475863-EMD Ингибитор MK2a MK2a 2 мкM
506156-EMD Ингибитор V MAP-киназы p38 p38, CK1 2 мкM
513000-EMD PD 98059 MEK 2 мкM
553014-EMD Ингибитор IV Raf-киназы B-Raf 2 мкM
559389-EMD SB 203580 p38 MAPK 2 мкM
616373-EMD Ингибитор Tpl2-киназы Tpl2-киназа 2 мкM
692000-EMD ZM 336372 c-Raf 1 2 мкM
M60043-25/XcessBio IDH1 Изоцитрата дегидрогеназа 2 мкM
M60668-25/XcessBio AGI5198 Изоцитрата дегидрогеназа 2 мкM
Образцы РНК отбирались на стадии 6 и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 14 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 9 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 14A), глюкагон (Фиг. 14B), амилин (Фиг. 14C), инсулин (Фиг. 14D), ISL-1 (Фиг. 14Е), MNX1 (Фиг. 14F), NKX6.1 (Фиг. 14G) и SLC30A8 (Фиг. 14H). Этот пример демонстрирует потенциал клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в качестве инструмента скрининга.
Пример 10. FACS-профиль клеток стадии 5-6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример изучает композицию культур стадии 5 и стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы на стадии 5 и стадии 6 с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (15 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 5-15 дней.
Урожай клеток был собран на стадии 5 и различных временных точках стадии 6, и проанализирован способом FACS. FACS окрашивание было осуществлено, как ранее описывалось (Diabetes, 61, 2016, 2012), с применением антител, перечисленных в таблице VI. На Фиг. 15 представлены FACS профили клеток, собранных на стадии 5. На Фиг. 16 представлены FACS профили клеток стадии 6 день 5, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. И наконец, на Фиг. 17 представлены профили клеток стадии 6 день 15, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Как показано на Фиг. 15, на стадии 5 было мало клеток, со-экспрессирующих инсулин и NKX6.1 (~1%) и значительное количество PDX1-положительных клеток находились в активном клеточном цикле, как измерено со-экспрессией PDX1 и KI-67 (~23%; KI-67 является индикатором клеток, находящихся в клеточном цикле.) Однако на стадии 6 день 5 (Фиг. 16) произошел значительный спад в пролиферации PDX1 + клеток (8%), в то время как наблюдался значительный рост количества NKX6.1 + клеток, со-экспрессирующих хромогранин-А (51%; хромогранин-А является пан эндокринным маркером) или инсулин (14%). Более того, отмечен значительный рост клеток, экспрессирующих эндокринные прекурсорные маркеры ISL-1, NeuroD и NKX2.2. Это означает, что уникальные культуры стадии 6 позволяют быстрое созревание клеток вне судьбы пролиферирующего прогенитора к раннему созреванию эндокринных клеток. Дополнительно, рост процентной доли клеток, со-экспрессирующих инсулин и NKX6.1 (33%) наблюдался при продлении стадии 6 до 15 дней (Фигура 17), Более того, наблюдался дальнейший спад процентной доли клеток, положительных для PDX1, которые находились в клеточном цикле (1%) и дальнейший рост процентной доли ISL-1 и NeuroD. И наконец, большинство гормон-положительных клеток являлись одногормонными инсулин-положительными клетками (34% одногормонных инсулин-положительных клеток, 7% одногормонных глюкагон-положительных клеток и 8% полигормонных клеток). Значительная со-экспрессия NKX6.1 и хромогранина-А и одногормонный инсулин-положительные клетки, экспрессирующие NKX6.1 (>30%) отличают ранее неописанную популяцию клеток.
Таблица VI
Список антител, использованных в FACS анализах клеток, полученных в примере 10
Антиген Вид Источник/кат. № Разведение
Глюкагон Мышь Sigma-Aldrich, G2654 1:250
Инсулин Кролик Cell Signaling, 3014B 1:10
NKX6.1 Мышь Developmental Studies Hybridoma Bank; F55A12 1:50
NKX2.2 Мышь Developmental Studies Hybridoma Bank; 1:100
PDX1 Мышь BD BioSciences, 562161 1:50
Ki67 Мышь BD Biosciences, 558595 1:20
Pax6 Мышь BD Biosciences, 561552 1:20
Хромогранин-А Кролик Dako, A0430 1:40
ISL-1 Мышь BD Biosciences, 562547 1:20
NEUROD Мышь BD Biosciences, 563001 1:40
FOXA2 Мышь BD Biosciences, 561589 1:80
Пример 11. Созревание в условиях in vivo NKX6.1+ Хромогранин-А+ инсулин+ клеток NKX6.1 + Хромогранин-А-инсулин- и панкреатических прогениторных клеток, со-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1 в сравнении с человеческими островками в SCID мыши
Этот пример описывает in vitro композицию дифференцированных клеток и влияние на поведение клеток в условиях in vivo. В частности, 5 миллионов панкреатических клеток-предшественников передней кишки (PDX1+ NKX6.1+), взятых на стадии 4 в день 4 и подготовленных в соответствии с примером 1 в планарных культурах, 5 миллионов NKX6.1+ хромогранин-А-отрицательных клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, и 3 миллиона NKX6.1+ хромогранин-А-положительных клеток, подготовленных в соответствии с примером 10 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия были трансплантированы в почечную капсулу не больных диабетом SCID мышей, как описано в (Diabetes 2012, 61(8):2016-29). У мышей отслеживали циркуляцию человеческого С-пептида как способа измерения состояния зрелости клеток во времени. Дополнительно, в отдельную партию мышей был трансплантирован эквивалент1500-4000 трупных человеческих островков (PRODO labs, Irvine, CA) в качестве положительного контроля.
NKX6.1+ хромогранин-А отрицательная популяция была подготовлена следующим образом:
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней. Затем клетки стадии 3 были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью ~2×106 клеток/10 мкл на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
d. Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 затем культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 100 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение двух дней.
e. Стадия 5 (2 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 50 нМ LDN-193189 и 500 нМ ингибитора ALK5 (SD208) в течение двух дней.
f. Стадия 6 (6 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5 в течение шести дней.
Таблица VII ниже описывает уровень экспрессии различных панкреатических энтодермальных и эндокринных маркеров для трех популяций, полученных из человеческих эмбриональный стволовых клеток. Более детально, таблица VII сравнивает следующие результаты: (1) популяция стадии 4 день 4, полученная в соответствии с примером 1 (стадия 4 день 4); (2) популяция панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, полученная в соответствии с примером 11 (панкреатические энтодермальные/эндокринные); и (3) NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+ популяция, полученная в соответствии с примером 10 (NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+). Информация по каждому FACS профилю представлена на Фиг. 17-19. В частности, Фиг.17 демонстрирует FACS профиль NKX6.1+ хромогранин-А+ популяции; Фиг.18 демонстрирует FACS профиль клеток стадии 4 день 4; и Фиг. 19 демонстрирует FACS профиль панкреатических эндокринных клеток стадии 6 день 6, полученных в соответствии с примером 11.
Таблица VII
Сравнение профиля экспрессии трех трансплантированных популяций, измеренной способом FACS
Популяция
Маркер Стадия 4 день 4a Панкреатическая энтодермальная/ эндокриннаяb NKX6.1+ хромогранин-A+ инсулин+c
% PDX1+ Ki-67+ 25 17 1
% NKX6.1+ хромогранин-A+ 10 10 57
% NKX6.1-хромогранин-А+ 19 53 31
% Инсулин+ NKX6.1+ 1 1 33
a Популяция стадии 4 день 4 была получена в соответствии с примером 1 (см. Фиг. 18)
b Панкреатическая энтодермальная/эндокринная популяция была получена в соответствии с примером 11. (см. Фиг. 19)
c Популяция NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+ была получена в соответствии с примером 10 (см. Фиг. 17)
После внедрения мышей периодически тестировали на концентрацию циркулирующего человеческого С-пептида. Циркуляция человеческого С-пептида тестировалась путем взятия крови из подкожной вены ноги. Плазма хранилась при -20°C и позднее анализировалась с применением человеческого С-пептида с помощью набора для анализа ELISA (Alpco Diagnostics, Salem, NH). Результаты представлены графически на Фиг. 20.
Фигура 20 показывает кинетику производства С-пептида в трех популяциях, полученных из эмбриональных стволовых клеток, в сравнении с различными дозами человеческих островков. Популяция клеток, экспрессирующая значимую со-экспрессию NKX6.1 и хромогранина-А, и NKX6.1 и инсулина привела к существенно раннему производству С-пептида. Уровень производства С-пептида был аналогичен трансплантации приблизительно 4000 человеческих островков на 12 недель. Однако через 16 недель после трансплантации, уровни человеческого С-пептида почти вдвое превзошла магнитуду С-пептида, которая наблюдалась при трансплантации 4000 человеческих островков.
Однако трансплантация прогениторных клеток, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, или смешанной популяции панкреатических клеток-предшественников и полигормонных клеток (хромогранин-А+ NKX6.1-) потребовала существенно более длительных периодов времени для выделения уровней С-пептида, эквивалентных 4000 человеческих островков.
Пример 12. Добавление ингибитора гамма секретазы ХХ ускоряет созревание маркеров клеток стадии 6, культивируемых в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример демонстрирует, что ингибиторы NOTCH, такие как ингибиторы гамма секретазы, дополнительно увеличивают количество маркеров зрелости бета-клеток, одновременно поддерживая уровень экспрессии NKX6.1. Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 42) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
a) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
e) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2 % BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (14 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2 % BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 14 дней.
На стадии 6 были протестированы различные дозы (от 100 нМ до 5000 нМ) ингибитора гамма секретазы ХХ (EMD, #565789). мРНК была собрана на стадии 6 день 4 и стадии 6 день 8. Фиг. 21 описывает данные анализа ПЦР для ключевых маркеров зрелости бета-клеток и панкреатических прогениторных маркеров. Как показано на Фиг. 21, маркеры зрелости, такие как амилин (панель 21А), инсулин (панель 21В) и MAFA (панель 21С) были значительно повышены, в то время как экспрессия NKX6.1 (панель 21D) не испытала значительного влияния. Однако панкреатические прекурсорные маркеры, такие как PTFF1 (панель 21Е) и SOX9 (панель 21F), были значительно понижены.
Пример 13. Присутствие ингибитора ALK5 важно для повышения MAFA и добавление Т3 также повышает экспрессию MAFA
Этот пример описывает способность добавки ингибитора ALK5 II к повышению экспрессии MAFA и что добавка Т3 с ингибитором ALK5 и LDN-193189 еще больше увеличивает экспрессию MAFA.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 42) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
a) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
e) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (8 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 8 дней.
На стадии 6 ингибитор ALK5, T3 или LDN были удалены в различных сочетаниях для проверки влияния каждого фактора на экспрессию NKX6.1, инсулина и MAFA. РНК была собрана на стадии 6 день 5 и стадии 6 день 8. Фиг. 22 описывает данные анализа ПЦР для ключевых маркеров зрелости бета-клеток и панкреатических прогениторных маркеров. Как показано на Фиг. 22, удаление ингибитора ALK5 на стадии 6 привело к резкому спаду экспрессии MAFA. В то же время сочетание ингибитора ALK5, LDN-183189 (ингибитор рецептора ВМР) и Т3 существенно улучшило экспрессию MAFA (Фиг. 22А), инсулина (Фиг. 22В), амилина (Фиг. 22С) и умеренно улучшило экспрессию NKX6.1 (Фиг. 22D).
Пример 14. Дополнительный протокол культивирования клеток стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример раскрывает дополнительные материалы и способы культивирования клеток стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Применялись следующие материалы: 10-сантиметровые фильтры от компании Corning (кат. №3419, 0,4 микрон поликарбонатная мембрана), среда MCDB-131 (Invitrogen, кат. №10372-019) или среда BLAR (производства компании Invitrogen); ITS-X (Invitrogen, Ca); гормон щитовидной железы (Т3); Sigma ингибитор ALK5 II- ENZO (кат. №ALX-27-445); LDN-193189- StemGent (#04-0074); гепарин (Sigma, H3149); и BSA без жирных кислот (Proliant/Lampire, 7500804).
Подготовка базальной среды стадии 6: Добавить 1,5 г/л натрия бикарбоната в среду MCDB 131, плюс 2% BSA, плюс 1:200 ITS-X, плюс дополнительные 15 мМ глюкозы.
Подготовка дифференцировочной среды стадии 6: К базальной среде стадии 6 добавить 10 мМ ингибитора ALK5 II, 100 нМ LDN-193189 и 1 мМ Т3.
Способы
Добавить 7,5 мл дифференцировочной среды стадии 6 на дно фильтрового вкладыша размером 10 см. Добавить кластеры клеток в небольших объемах (20-30 мкл) на верхнюю часть фильтровых вкладышей. Как правило, примерно 50 клеточных кластеров размещаются на 10 см вкладыша. При посеве каждый клеточный кластер содержит приблизительно 0,5 М клеток.
Предпочтительно заменять среду ежедневно. Клетки могут быть удалены с фильтрового вкладыша путем удаления клеточных агрегаций индивидуально, например, при помощи пипетки с широким просветом, или же все агрегации могут быть удалены одновременно путем промывания верхних частей фильтра базальной средой. Клеточные агрегации слабо закреплены на вкладышах.
В дополнение к специфическим условиям культивирования, описанным в вышеизложенных примерах, другие подходящие условия для дифференцировки плюрипотентных клеток или их прогениторов в панкреатические эндокринные клетки перечислены далее в таблицах VIII-XIII. В этих таблицах «инг. ALK5» значит «ингибитор ALK5», «RA» - ретиноевая кислота, «Вит. С» - аскорбиновая кислота, «инг.» - ингибитор, «акт.» - активатор, ZnSO4 - цинка сульфат, «МСХ» - композиция МСХ, и «АА» - активин А. В определенных вариантах осуществления любая из обработок на одной стадии (например, стадии 4) может быть скомбинирована с любой обработкой на другой стадии (например, стадии 5).
Таблица VIII
Протокол дифференцировки клеток, включающий культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 Фильтр стадии 5 Фильтр стадии 6
Базовая среда MCDB131 Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л) MCDB131 Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л) BLAR Высокий Бикарбонат (Общее количество: 2,93 г/л) BLAR Высокий Бикарбонат (Общее количество: 2,93 г/л) BLAR Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л) BLAR Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л)
Обогащение 0,5% FAF-BSA, 10 мМ глюкозы 0,5% FAF-BSA, 10 мМ глюкозы 2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X,
10 мМ глюкозы		 2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 10 мМ глюкозы 2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 20 мМ глюкозы 2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 20 мМ глюкозы
Факторы роста 100 нг/мл GDF8 25 нг/мл FGF7 25 нг/мл FGF7 2 нг/мл FGF7 10 мкг/мл гепарина 10 мкг/мл гепарина
Низкомолекулярный антагонист/ антагонист 1.0 мкM MCX День 1
100 нM MCX на День 2		 0,25 мM Вит. C 1 мкM ретиноевой кислоты 0,25 мкM SANT
200 нM TPB
100 нM LDN-193189
0,25 мM Вит. C		 100 нM LDN
0,25 мкM SANT
100 нM TPB 100 нM
ретиноевой кислоты
0,25 мM Вит. C		 0,25 мкM SANT
50 нM ретиноевой кислоты
10000 нM инг.
ALK5
100 нM LDN-193189
10 мM ZnSO4 		10000 нM инг. ALK5
1 мкМ T3
100 нM LDN-193189
10 мM ZnSO4
Продолжительность (дней) Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней Приблизительно 3-15 дней
Тип культуры Планарная Планарная Планарная Планарная Воздушно-жидкостная зона взаимодействия Воздушно-жидкостная зона взаимодействия
Таблица IX
Реагенты, использованные в протоколе дифференцирования, описанном в таблице VII
Реактив Концентрация Производитель № по каталогу
MCDB131
BLAR (изготовленная на заказ среда)		 (Добавить 1:100 X Glutamax)
Промежуточный бикарбонат: Добавить 1,5 г натрия бикарбоната/1000 мл среды.
Высокий бикарбонат: Добавить 2,5 г бикарбоната/1000 мл среды		 Invitrogen 10372019
FAF-BSA 0,5% на стадиях 1-2
2% на стадиях 3-6		 Proliant 68700
ITS-X раствор 1:200 Invitrogen 51500056
Глюкоза 10 мM на стадиях 1-4
20 мM на стадиях 5-6		 Sigma G8769
GDF8 100 нг/мл Peprotech 120-00
MCX 1,0 мкМ в день 1 и 100 нМ на день 2
FGF7 25 нг/мл на стадии 2, 25 нг/мл на стадии 3, 2 нг/мл на стадии 4 R & D Systems 251-KG
RA 1 мкМ на стадии 3
100 нM на стадии 4
50 нM на стадии 5		 Sigma R2625
SANT-1 (SHH ингибитор) 0,25 мкM Sigma S4572
LDN-193189
(антагонист ВМР r)		 100 нM на стадиях 3-6 Stemgent 04-0019
ТРВ (активатор РКС) 200 нМ на стадии 3, 100 нМ на стадии 4 ChemPartner Дополнительно
Аскорбиновая кислота (Вит. С) 0,25 мM на стадиях 2-4 Sigma A4544
Ингибитор ALK5 II 10000 нM на стадиях 5-6 ENZO ALX-270-445
T3 1 мкМ на стадии 6 Sigma T6397
Гепарин 10 мкг/мл на стадиях 5-6 Sigma H3149
Цинка сульфат 10 мкМ на стадиях 5-6 Sigma Z0251
Фильтровые вкладыши на 6-лунковых пластинах 0,4 микрон фильтры от BD или Millipore BD
Millipore		 353493
PIHT15R48
Таблица X
Примеры культуральных условий, пригодных для применения в способах Изобретения
Стадия 4 Стадия 5 Стадия 6
Обработка клетки стадии 3 клетки стадии 4 Стадия 5
с по меньшей мере Инг. ALK5; Noggin
RA; FGF7; Вит. С.
T3
Инг. ALK5
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II)
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II); RA; LDN-193189
инг ALK5 (например, инг. ALK5 II); RA; LDN-193189
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II)
Т3; инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II) & LDN-193189
Т3; инг. ALK5
(например, инг. ALK5 II); LDN-193189 и гепарин
Другие необязательные компонентыа
(по меньшей мере один из перечисленных)		 PKC aкт. (например, TPB); SANT-1; ROCK инг. (например, Y27632)
 RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN-193189); гепарин RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN-193189); гепарин
Культивирование: Планарное (воздушно-жидкостная зона взаимодействия не в обязательном порядке в конце стадии 4) Воздушно-жидкостная зона взаимодействия Воздушно-жидкостная зона взаимодействия
Продолжительность обработки Приблизительно 2-4 дня; предпочтительно 2-3 дня Приблизительно 2-4 дня; предпочтительно 2-3 дня Приблизительно 3-15 дней
а исключены из списка, если упомянуты в категории «с по меньшей мере»
Примерные диапазоны компонентов, упомянутых в таблице Х, примененные в способах настоящего изобретения, показаны ниже:
Таблица XI
Примеры объемов культуральных компонентов, пригодных для применения в способах настоящего изобретения
Компонент Примерный пригодный объем Альтернативно
T3 около 0-1500 нМ около 10 нМ
около 1000 нМ
Ингибитор ALK5 от около 75 нМ до около 15000 нМ около 100 нМ
около 200 нМ
около 1000 нМ
около 2000 нМ
около 10000 нМ
SANT-1 приблизительно от 0,1 мкМ до 0,3 мкМ около 0,25 мкМ
Ретиноевая кислота приблизительно от 25 нМ до 150 нМ около 50 нМ
около 100 нМ
Аскорбиновая кислота от около 0,1 до около 0,4 мМ около 0,25 мМ
FGF7 от около 2 до около 35 нг/мл около 2 нг/мл
около 25 нг/мл
ингибитор рецептора ВМР (например, LDN-193189) от около 50 до около 150 мМ около 100 мМ
PKC активатор (например, TPB) от около 50 до около 150 мМ около 200 мМ
Noggin от около 50 нг/мл до около 150 нг/мл около 100 нг/мл
Гепарин от около 5 мкг/мл до около 15 мкг/мл около 10 мкг/мл
ROCK ингибитор (например, Y27632) приблизительно от 5 мкМ до 15 мкМ около 10 мкМ
Цинка сульфат приблизительно от 5 мкМ до 15 мкМ около 10 мкМ
Таблица XI ниже иллюстрирует альтернативные примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Таблица XII
Примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения
Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 Стадия 5 Стадия 6
Обработка Плюрипотентные стволовые клетки клетки стадии 1 клетки стадии 2 клетки стадии 3 клетки стадии 4 Стадия 5
С по меньшей мере GDF8 и MCX
AA и Wnt3A
FGF7 и Вит. С
FGF7; RA; SANT; TPB; LDN и Вит. C
Инг. ALK5, Noggin
RA; FGF7; Вит. С.
T3
FGF7; LDN-193189; SANT; TPB; RA и Вит. C
Инг. ALK5
Т3 и инг.
ALK5
Т3 и инг. ALK5, RA
Инг. ALK5, RA, LDN
гепарин; SANT; RA; инг. ALK5; LDN; ZnSO4
Т3 и инг. ALK5
Т3; инг. ALK5 и LDN
T3, инг. ALK5, LDN и гепарин
гепарин; инг. ALK5; T3; LDN; ZnSO4
Прочие необязательные компоненты а (по меньшей мере один из перечисленных) PKC aкт. (например, TPB); SANT-1;
ROCK инг. (например Y27632)		 RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN); гепарин RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN); гепарин
Продолжительность (дней) Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней Приблизительно 3-15 дней; предпочтительно около 7-15 дней
Тип культуры Планарная Планарная Планарная Планарная (воздушно-жидкостная зона взаимодействия не в обязательном порядке в конце стадии 4) Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр) Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр)
а исключены из списка, если упомянуты в категории «с по меньшей мере»
Таблица XII ниже иллюстрирует альтернативные примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Таблица XIII
Примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 Стадия 5 Стадия 6
Обработка Плюрипотентные стволовые клетки клетки стадии 1 клетки стадии 2 клетки стадии 3 клетки стадии 4 Стадия 5
С по меньшей мере GDF8 и
MCX
 FGF7 и
Вит. С
 FGF7; RA; SANT; TPB; LDN и Вит. C FGF7; LDN; SANT; TPB; RA и Вит. C гепарин; SANT; RA; инг. ALK5; LDN; ZnSO4 гепарин; инг. ALK5; T3; LDN; ZnSO4
Примерные объемы ~100 нг/мл GDF8 и
~1.0 мкM MCX день 1
~100 нM MCX на день 2		 ~25 нг/мл FGF7; ~0,25 мМ Вит. C ~25 нг/мл FGF7; ~1 мкM RA
~0,25 мкM SANT
~200 нM TPB
~100 нM LDN
~0,25 мM Вит. C		 ~2 нг/мл FGF7; ~100 нM LDN
~0,25 мкM SANT
~100 нM TPB
~100 нM RA
~0,25 мM Вит. C		 ~0,25 мкM SANT
~50 нM RA
~10000 нM инг. ALK5
~100 нM LDN
~10 мM ZnSO4 		~10 мкг/мл гепарина; ~10000 нM инг. ALK5
~1 мкM T3
~100 нM LDN
~10 мM ZnSO4
Продолжительность (дней) Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней Приблизительно 3-15 дней; предпочтительно около 7-15 дней
Тип культуры Планарная Планарная Планарная Планарная Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр) Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр)
Как детально описано выше, настоящее изобретение представляет, inter alia, способ формирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для бета-клеток, включая дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем обработки средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или и Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В одном из вариантов осуществления только клетки стадии 4-6 путем культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетки стадии 6 могут быть положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9. Соответственно, изобретение также представляет способ включения экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, включающий: (а) культивирование плюрипотентных стволовых клеток; (b) дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки; и (с) дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1 и НВ9, путем обработки средой, обогащенной Т3/Т4, ингибитором ALK5 или и Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Далее, полученные клетки стадии 6 могут быть клетками, положительными для одного гормона. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6 со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А. В другом варианте осуществления клетки стадии 6 со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
В определенных вариантах осуществления способ включает обработку клеток стадии 5 средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5, например ингибитором ALK5 II. В этих вариантах осуществления среда может быть обогащена одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевая кислота, аскорбиновая кислота, SANT-1 или LDN-139189.
Хотя изобретение было описано и проиллюстрировано ссылками на различные конкретные материалы, процедуры и примеры, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретными комбинациями материалов и процедур, выбранными для этой цели. Многочисленные изменения, касающиеся таких деталей изобретения, будут очевидными для специалистов в данной области техники. Подразумевается, что все описания и примеры представлены только в качестве иллюстрации и находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения, что отражено в нижеприведенной формуле изобретения. Все ссылки, патенты и заявки на патенты, приведенные в этой заявке, полностью включены в этот документ путем отсылки.

Claims (56)

1. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, состоящий из следующих стадий:
а) дифференцировка клеток дефинитивной эндодермы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток панкреатических клеток-предшественников передней кишки, и
b) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки по меньшей мере ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, выделяют из плюрипотентных клеток, полученных без разрушения эмбриона, плюрипотентных клеток неэмбрионального происхождения, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н7, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н9, индуцибельных плюрипотентных клеток или перепрограммированных плюрипотентных клеток.
2. Способ по п. 1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, являются положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9.
3. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
4. Способ по п. 3, в котором по меньшей мере тридцать процентов полученных клеток со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
5. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
6. Способ по п. 5, в котором по меньшей мере тридцать процентов полученных клеток со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
7. Способ по п. 1, где способ также включает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, путем обработки ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы, в планарной культуре.
8. Способ по п. 7, где способ также включает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, путем обработки ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
9. Способ по п. 1, где способ включает обработку трииодотиронином и ингибитором ALK5.
10. Способ по п. 1, где способ также включает культивирование клеток на пористом субстрате.
11. Способ по п. 10, где пористый субстрат не обладает покрытием.
12. Способ по п. 1, где указанный ингибитор ALK5 выбран из группы, состоящей из: ингибитора ALK5 II, ALK5i, SD208, TGF-B ингибитора SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III.
13. Способ по п. 12, в котором указанный ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
14. Способ по п. 1, где способ также включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы.
15. Способ по п. 14, в котором гормон щитовидной железы является трииодотиронином, а ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
16. Способ по п. 15, где способ также включает обработку одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, SANT-1 или LDN-193189.
17. Способ по п. 1, где способ повышает экспрессию гормонов поджелудочной железы.
18. Способ по п. 16, где указанный способ снижает экспрессию PTF1a, SOX9, CDX2, ZIC1 и SOX2.
19. Способ по п. 1, где способ увеличивает количество клеток, положительных для NKX6.1, которые со-экспрессируют инсулин, хромогранин-А или как хромогранин-А, так и инсулин.
20. Способ по п. 1, где аналоги трииодотиронина и аналоги тироксина выбирают из группы, состоящей из GC-1, 3,5-дииодотиропропионовой кислоты, КВ-141, МВ07344, Т0681 и GC-24.
21. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, экспрессируют маркеры, характерные для бета-клеток.
22. Способ по п.1, дополнительно включающий трансплантацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, млекопитающему.
23. Способ по п. 1, где способ дополнительно включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной эндодермы.
24. Способ по п. 22, где способ дополнительно включает культивирование плюрипотентных стволовых клеток в среде до дифференцировки в клетки дефинитивной эндодермы, где среду выбирают из группы, состоящей из среды MCDB-131, среды BLAR, среды RPMI, среды DMEM, среды KO DMEM, среды Ham’s F12/50% DMEM и среды DMEM с высоким содержанием глюкозы.
25. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включающий дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки по меньшей мере ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы, во время культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, выделяют из плюрипотентных клеток, полученных без разрушения эмбриона, плюрипотентных стволовых клеток неэмбрионального происхождения, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н7, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н9, индуцибельных плюрипотентных клеток или перепрограммированных плюрипотентных клеток.
26. Способ по п. 25, где только клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, панкреатические энтодермальные клетки и панкреатические эндокринные клетки-предшественники культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
27. Способ по п. 25, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, являются положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9.
28. Способ по п. 25, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, являются клетками, положительными для одного гормона.
29. Способ по п. 28, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
30. Способ по п. 28, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
31. Способ по п. 25, где способ также включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, на пористом субстрате.
32. Способ по п. 31, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, формируют листовые или агрегатные кластеры на верхней части пористого субстрата.
33. Способ по п. 25, где способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы.
34. Способ по п. 33, в котором гормон щитовидной железы является трииодотиронином, а ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
35. Способ по п. 34, где среда также обогащена одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, SANT-1 или LDN-193189.
36. Способ по п. 25, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, экспрессируют маркеры, характерные для бета-клеток.
37. Способ по п. 25, дополнительно включающий трансплантацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, млекопитающему.
38. Способ по п. 37, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
39. Способ по п. 37, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
40. Способы по п. 25 или 33, где указанный ингибитор ALK5 выбран из группы, состоящей из: ингибитора ALK5 II, ALK5i, SD208, TGF-B ингибитора SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III.
41. Способ по п. 25 или 33, где аналоги трииодотиронина и аналоги тироксина выбирают из группы, состоящей из GC-1, 3,5-дииодотиропропионовой кислоты, КВ-141, МВ07344, Т0681 и GC-24.
42. Способ по п. 25, где культивирование включает культивирование клеток на среде BLAR или MCDB-131.
43. Способ включения экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в клетках, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, включающий:
а) дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток панкреатических клеток-предшественников передней кишки, и
b) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1 и НВ9, путем обработки ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, где плюрипотентные клетки выбраны из группы, состоящей из плюрипотентных стволовых клеток неэмбрионального происхождения, клеток из линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, клеток из линии эмбриональных стволовых клеток человека Н7, клеток из линии эмбриональных стволовых клеток человека Н9, индуцибельных плюрипотентных клеток или перепрограммированных плюрипотентных клеток.
44. Способ по п. 43, где способ также включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток или панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в среде, обогащенной трииодотиронином и ингибитором ALK5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, где среду выбирают из группы, состоящей из среды MCDB-131, среды BLAR, среды RPMI, среды DMEM, среды KO DMEM, среды Ham’s F12/50% DMEM и среды DMEM с высоким содержанием глюкозы.
45. Способ по п. 44, в котором ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
46. Способ по п. 40, где способ дополнительно включает обработку одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, SANT-1 или LDN-193189.
47. Способы по п. 43, где указанный ингибитор ALK5 выбран из группы, состоящей из: ингибитора ALK5 II, ALK5i, SD208, TGF-B ингибитора SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III.
48. Способ по п. 43, где аналоги трииодотиронина и аналоги тироксина выбирают из группы, состоящей из GC-1, 3,5-дииодотиропропионовой кислоты, КВ-141, МВ07344, Т0681 и GC-24.
49. Способ индуцирования PDX1, NKX6.1 и HB9, включающий дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1 и HB9, обработкой ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или как ингибитором ALK5, так и гормоном щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, выделяют из плюрипотентных клеток, полученных без разрушения эмбриона, плюрипотентных стволовых клеток неэмбрионального происхождения, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н7, линии эмбриональных стволовых клеток человека Н9, индуцибельных плюрипотентных клеток или перепрограммированных плюрипотентных клеток.
50. Способ по п. 49, где способ дополнительно включает культивирование клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток или панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в среде, обогащенной трииодотиронином и ингибитором ALK5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, где среду выбирают из группы, состоящей из среды MCDB-131, среды BLAR, среды RPMI, среды DMEM, среды KO DMEM, среды Ham’s F12/50% DMEM и среды DMEM с высоким содержанием глюкозы.
51. Способ по п. 49, где указанный ингибитор ALK5 выбран из группы, состоящей из: ингибитора ALK5 II, ALK5i, SD208, TGF-B ингибитора SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III.
52. Способ по п. 49, где аналоги трииодотиронина и аналоги тироксина выбраны из группы, состоящей из GC-1, 3,5-дииодотиропропионовоой кислоты, KB-141, MB07344, T0681 и GC-24.
RU2015131835A 2012-12-31 2013-12-18 Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток RU2658488C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261747662P 2012-12-31 2012-12-31
US61/747,662 2012-12-31
PCT/US2013/075939 WO2014105543A1 (en) 2012-12-31 2013-12-18 Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018116648A Division RU2768963C2 (ru) 2012-12-31 2013-12-18 Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
RU2018116647A Division RU2018116647A (ru) 2012-12-31 2013-12-18 Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015131835A RU2015131835A (ru) 2017-02-06
RU2658488C2 true RU2658488C2 (ru) 2018-06-21

Family

ID=51017432

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015131835A RU2658488C2 (ru) 2012-12-31 2013-12-18 Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
RU2018116647A RU2018116647A (ru) 2012-12-31 2013-12-18 Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
RU2018116648A RU2768963C2 (ru) 2012-12-31 2013-12-18 Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018116647A RU2018116647A (ru) 2012-12-31 2013-12-18 Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
RU2018116648A RU2768963C2 (ru) 2012-12-31 2013-12-18 Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки

Country Status (17)

Country Link
US (1) US10344264B2 (ru)
EP (1) EP2938724B1 (ru)
JP (1) JP6557146B2 (ru)
KR (1) KR102084561B1 (ru)
CN (1) CN105008518B (ru)
AR (1) AR094347A1 (ru)
AU (4) AU2013368221B2 (ru)
BR (1) BR112015015770A2 (ru)
CA (1) CA2896655C (ru)
DK (1) DK2938724T3 (ru)
ES (1) ES2837763T3 (ru)
HK (1) HK1217110A1 (ru)
MX (1) MX2015008577A (ru)
PH (1) PH12015501465A1 (ru)
RU (3) RU2658488C2 (ru)
SG (2) SG10201709338RA (ru)
WO (1) WO2014105543A1 (ru)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101617243B1 (ko) 2007-07-31 2016-05-02 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
MX2010005805A (es) 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
CN102482643B (zh) 2009-07-20 2016-06-29 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
SG10201608914WA (en) 2011-12-22 2016-12-29 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
US8859286B2 (en) * 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
KR102205234B1 (ko) * 2013-06-11 2021-01-20 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
CN117821369A (zh) 2014-05-16 2024-04-05 詹森生物科技公司 小分子增强胰腺内分泌细胞中的mafa表达的用途
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
DK3234110T3 (da) 2014-12-18 2024-05-13 Harvard College FREMGANGSMÅDER TIL GENERERING AF STAMCELLE-AFLEDTE ß-CELLER OG ANVENDELSER DERAF
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
WO2016100921A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF
MA45329A (fr) 2016-04-08 2019-02-13 Univ California Production de cellules bêta matures pleinement fonctionnelles à partir de progénitrices pancréatiques humaines
KR101870240B1 (ko) * 2016-04-12 2018-06-22 서울대학교산학협력단 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법
MA45502A (fr) 2016-06-21 2019-04-24 Janssen Biotech Inc Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases
AU2017313847A1 (en) * 2016-08-19 2019-02-28 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of differentiating stem cells into endoderm
JP6869554B2 (ja) * 2016-08-24 2021-05-12 学校法人慶應義塾 ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２ｄオルガノイド及びその使用
FR3061206B1 (fr) * 2016-12-23 2020-06-26 Laboratoires Clarins Modele de peau incluant epiderme, derme et hypoderme, son procede de preparation et son utilisation
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
IL274436B2 (en) 2017-11-15 2024-01-01 Semma Therapeutics Inc Preparations for the production of islet cells and methods of use
EP3833365A4 (en) 2018-08-10 2022-05-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated ISLE DIFFERENTIATION DERIVED FROM STEM CELLS
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
EP3856205A4 (en) * 2018-09-25 2022-06-15 The Regents of the University of California PRODUCTION AND ACCUMULATION OF PANCREATIC ENDOCRIN PROGENIOR CELLS
WO2020236985A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-26 President And Fellows Of Harvard College Endocrine differentiation-inducing molecule
AU2020282355B2 (en) 2019-05-31 2023-11-02 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
AU2020284245B2 (en) 2019-05-31 2023-10-05 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
CA3139292A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Timothy M. BRUHN Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
AU2020283056B2 (en) 2019-05-31 2023-06-08 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
WO2021044379A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US11116797B2 (en) 2019-09-05 2021-09-14 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
JP2024503291A (ja) 2020-12-31 2024-01-25 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ユニバーサルドナー細胞
CN113046299A (zh) * 2021-03-19 2021-06-29 上海爱萨尔生物科技有限公司 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的添加剂
CN112961823B (zh) * 2021-03-19 2024-01-23 上海爱萨尔生物科技有限公司 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养液
CN112980774B (zh) * 2021-03-19 2022-04-01 上海爱萨尔生物科技有限公司 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养方法
AU2022366819A1 (en) * 2021-10-15 2024-05-02 Thymmune Therapeutics, Inc. Thymic cells and methods of making
WO2023201361A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells
CN115011544B (zh) * 2022-05-30 2023-11-17 广州国家实验室 体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040172A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
WO2006088867A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Medistem Laboratories, Incorporated Method for expansion of stem cells
US20110281355A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells
US20120052576A1 (en) * 2010-08-31 2012-03-01 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of Pluripotent Stem Cells

Family Cites Families (266)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5759830A (en) 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
RU2139351C1 (ru) 1991-04-25 1999-10-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Н- и l-цепи моноклонального антитела рм1 (монат) к рецептору il-6r человека и их v-области, модифицированная монат, его н- и l-цепи и их v-области, cdr- последовательности, днк-последовательности
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
AU687386B2 (en) 1993-04-08 1998-02-26 Human Cell Cultures, Inc. Cell culturing method and medium
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
JP4079461B2 (ja) 1994-12-29 2008-04-23 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
AU7138298A (en) 1997-04-24 1998-11-13 Ortho-Mcneil Corporation, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
ATE358493T1 (de) 1997-07-03 2007-04-15 Osiris Therapeutics Inc Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
WO1999014318A1 (en) 1997-09-16 1999-03-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
AU729377B2 (en) 1997-10-23 2001-02-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
ZA9811898B (en) 1997-12-29 2000-06-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Anti-Inflammatory Compounds.
US6328960B1 (en) 1998-03-18 2001-12-11 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
NZ513598A (en) 1999-01-21 2001-09-28 Vitro Diagnostics Inc Immortalized cell lines and methods of making the same
DE60037107T2 (de) 1999-02-11 2008-09-25 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Pluripotente embryonale keimzellinie aus vögeln
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
CA2385628A1 (en) 1999-09-27 2001-04-05 Ammon B. Peck Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
AU778155B2 (en) 1999-12-13 2004-11-18 Scripps Research Institute, The Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
EP1302534A4 (en) 2000-06-26 2004-06-16 Renomedix Inst Inc CELL FRACTIONS CONTAINING CELLS CAPABLE OF DIFFERENCING INTO NEURAL CELLS
IL155367A0 (en) 2000-10-23 2003-12-23 Smithkline Beecham Corp NOVEL 2,4,8-TRISUBSTITUTED-8h-PYRIDO[2,3,-d]PYRIMIDIN-7-ONE COMPOUNDS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, PROCESSES FOR THE PREPARATION THEREOF, AND USE THEREOF IN THE PREPARATION OF MEDICAMENTS FOR TREATING CSBP/p38 KINASE MEDIATED DISEASES
ATE301661T1 (de) 2000-12-08 2005-08-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Makroheterocyclische verbindungen als kinase inhibitoren
CA2431166A1 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
US20040121460A1 (en) 2001-01-24 2004-06-24 Lumelsky Nadya L Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
EP3078667B1 (en) 2001-01-25 2018-11-21 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
DE10290025T1 (de) 2001-04-19 2003-10-09 Develogen Ag Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Insulin-produzierende Zellen
DE60231035D1 (de) 2001-04-24 2009-03-19 Ajinomoto Kk Stammzellen und verfahren zu deren trennung
JP2004531262A (ja) 2001-05-15 2004-10-14 ラッパポート ファミリー インスチチュート フォア リサーチ イン ザ メディカル サイエンシズ ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
CA2456981C (en) 2001-08-06 2012-02-28 Bresagen, Inc. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
JP2005506074A (ja) 2001-10-18 2005-03-03 イクシオン・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換
CA2468171C (en) 2001-11-15 2015-10-06 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
EP1463798A4 (en) 2001-12-07 2005-01-19 Geron Corp ISLAND CELLS FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
EP2305276A3 (en) 2001-12-07 2011-09-21 Cytori Therapeutics, Inc. Processed lipoaspirate cells for use in therapy
WO2003054169A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
EP1461421A2 (en) 2001-12-28 2004-09-29 Cellartis AB A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
US20050208029A1 (en) 2002-04-17 2005-09-22 Akihiro Umezawa Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
AU2003225295A1 (en) 2002-05-08 2003-11-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) * 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
WO2003102171A1 (en) 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Expansion and transdifferentiation of human acinar cells
AU2003238874A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 Janssen Pharmaceutica N.V. Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
CA2494040A1 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
AU2003268534A1 (en) 2002-09-06 2004-03-29 Amcyte Inc. Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004050827A2 (en) 2002-12-05 2004-06-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
CN100549163C (zh) 2002-12-16 2009-10-14 技术研究及发展基金有限公司 制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物
US20050118148A1 (en) 2002-12-20 2005-06-02 Roland Stein Compositions and methods related to mammalian Maf-A
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
CA2514539C (en) 2003-01-29 2012-03-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Process for producing coated preparation
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
US20070154981A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070020242A1 (en) 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
ES2564044T3 (es) 2003-06-27 2016-03-17 DePuy Synthes Products, Inc. Células posparto derivadas de tejido del cordón umbilical y métodos de preparación y uso de las mismas
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
WO2005021728A2 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
US6939633B2 (en) 2003-09-17 2005-09-06 General Motors Corporation Fuel cell shutdown and startup using a cathode recycle loop
CA2550010A1 (en) 2003-12-17 2005-06-30 Allergan, Inc. Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
GB0329498D0 (en) 2003-12-19 2004-01-28 Novartis Ag Organic compounds
CA2549605C (en) 2003-12-23 2013-05-07 Cythera, Inc. Definitive endoderm
CN109628371B (zh) 2003-12-23 2021-02-19 维亚希特公司 定形内胚层
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20050233446A1 (en) 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
WO2005071066A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
JP4901471B2 (ja) 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
WO2005086860A2 (en) 2004-03-09 2005-09-22 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
CN1950498A (zh) 2004-03-10 2007-04-18 加利福尼亚大学董事会 培养胚胎干细胞的组合物和方法
JP4688793B2 (ja) 2004-03-23 2011-05-25 敏宏 赤池 多能性幹細胞の増殖方法
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
EP1730268A2 (en) 2004-04-01 2006-12-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
KR101278421B1 (ko) 2004-04-27 2013-07-15 비아싸이트, 인크. Ｐｄｘ１ 발현 내배엽
WO2005121011A1 (en) 2004-06-08 2005-12-22 Il Shik Yoon Prefabricated light reflecting system mounted to ceiling of elevator cage
CA2573283C (en) 2004-07-09 2023-03-14 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
CA2576872C (en) 2004-08-13 2013-11-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
JP2006075022A (ja) * 2004-09-07 2006-03-23 Foundation For Biomedical Research & Innovation 膵臓ホルモン産生細胞取得方法
NZ553235A (en) 2004-09-08 2009-11-27 Wisconsin Alumni Res Found Culturing human pluripotent stem cells
WO2006029197A1 (en) 2004-09-08 2006-03-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Medium and culture of embryonic stem cells
CA2596231A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Novathera Ltd Methods for embryonic stem cell culture
EP1859026A2 (en) 2005-01-31 2007-11-28 ES Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
CN101188942B (zh) 2005-03-04 2011-11-30 生命扫描有限公司 成年胰衍生的基质细胞
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
ATE553198T1 (de) 2005-04-15 2012-04-15 Geron Corp Behandlung von krebs durch die kombinierte hemmung der proteasom- und telomeraseaktivitäten
US20080208351A1 (en) 2005-04-26 2008-08-28 Aarhus Universitet Biocompatible Material for Surgical Implants and Cell Guiding Tissue Culture Surfaces
JP4557797B2 (ja) 2005-05-20 2010-10-06 株式会社日立製作所 光ディスク装置
JP5092124B2 (ja) 2005-05-24 2012-12-05 国立大学法人 熊本大学 Ｅｓ細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
EP1899344A1 (en) 2005-06-10 2008-03-19 Irm, Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
KR20160116024A (ko) 2005-06-22 2016-10-06 아스테리아스 바이오세라퓨틱스, 인크. 인간 배아 줄기 세포의 현탁 배양
JP5345388B2 (ja) 2005-06-30 2013-11-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 環式アニリノ−ピリジノトリアジン
US20090087907A1 (en) 2005-07-29 2009-04-02 Alice Pebay Compositions and Methods for Growth of Pluripotent Cells
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
AU2006286149B2 (en) 2005-08-29 2012-09-13 Technion Research And Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
KR20080056182A (ko) 2005-09-02 2008-06-20 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 간엽 줄기 세포의 유도 방법
SG151259A1 (en) 2005-09-12 2009-04-30 Es Cell Int Pte Ltd Cardiomyocyte production
WO2007039986A1 (ja) 2005-10-05 2007-04-12 Osaka University 脂肪組織由来細胞から膵内分泌細胞を得る方法
SG169324A1 (en) 2005-10-14 2011-03-30 Univ Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
CA2627645C (en) 2005-10-27 2015-07-07 Cythera, Inc. Pdx1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm
CN103113463B (zh) 2005-12-13 2015-02-18 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
CA2643478C (en) 2006-02-23 2019-06-18 Novocell, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
CA3147112A1 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) * 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
EP2021462B1 (en) 2006-04-28 2019-01-09 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8685730B2 (en) * 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
AU2007248609B2 (en) * 2006-05-02 2012-11-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
CA2654196A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
AU2007297575A1 (en) 2006-06-26 2008-03-27 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell culture
US8968994B2 (en) 2006-07-06 2015-03-03 Jeremy Micah Crook Method for stem cell culture and cells derived therefrom
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US9040297B2 (en) 2006-08-02 2015-05-26 Technion Research & Development Foundation Limited Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
CN101611016B (zh) 2006-10-17 2012-01-25 斯蒂菲尔实验室公司 他拉罗唑代谢物
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
US8835163B2 (en) 2006-10-18 2014-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2008056779A1 (fr) 2006-11-09 2008-05-15 Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire
US8217027B2 (en) 2006-12-21 2012-07-10 Abbott Laboratories Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
CN101641436A (zh) 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US20090053182A1 (en) 2007-05-25 2009-02-26 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
DK2173863T3 (en) 2007-06-29 2019-01-21 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
DK3192865T3 (da) 2007-07-01 2021-06-28 Janssen Biotech Inc Enkelt pluripotent stamcelle-kultur
CN101861386A (zh) 2007-07-18 2010-10-13 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
KR101617243B1 (ko) 2007-07-31 2016-05-02 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
EP2584034B8 (en) 2007-07-31 2017-12-06 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells
MX2010002179A (es) 2007-08-24 2010-04-27 Stichting Het Nl Kanker I Composicion para el tratamiento de enfermedades neoplasicas.
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
MX2010005805A (es) * 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
JP5733986B2 (ja) 2008-02-21 2015-06-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 細胞の付着、培養、及び剥離のための方法、表面改質されたプレート、並びに組成物
JPWO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2011-07-14 独立行政法人科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
WO2009116951A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
AU2008355123B2 (en) 2008-04-21 2014-12-04 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
EP2297319B1 (en) 2008-06-03 2015-10-07 Viacyte, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
WO2010002785A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
KR101651661B1 (ko) 2008-06-30 2016-08-26 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포의 분화
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
US9683215B2 (en) 2008-08-22 2017-06-20 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
PL2346988T3 (pl) 2008-10-31 2017-10-31 Janssen Biotech Inc Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych do linii endokrynnej trzustki
US9012218B2 (en) 2008-10-31 2015-04-21 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2010053472A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Novocell, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
EP4176888A1 (en) 2008-11-14 2023-05-10 ViaCyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
KR101774546B1 (ko) 2008-11-20 2017-09-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양
WO2010063848A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
EP2456858B1 (en) 2009-07-20 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2456859A4 (en) 2009-07-20 2015-03-18 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
CN102482643B (zh) 2009-07-20 2016-06-29 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
KR101755214B1 (ko) 2009-08-12 2017-07-07 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 만능줄기세포의 신경전구세포로의 분화 유도 방법
AU2010319921A1 (en) 2009-10-29 2012-05-17 Janssen Biotech Inc. Pluripotent stem cells
ES2932664T3 (es) 2009-11-12 2023-01-23 Technion Res & Dev Foundation Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
EP2516626B1 (en) 2009-12-23 2017-05-10 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CN102741395B (zh) 2009-12-23 2016-03-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
EP2505639B1 (en) 2009-12-29 2018-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
CN102858958A (zh) 2010-02-03 2013-01-02 日本国立癌症研究中心 诱导肝干细胞及其制造方法、以及该细胞的用途
SG183400A1 (en) 2010-03-02 2012-09-27 Univ Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
CN102959076B (zh) 2010-03-31 2015-09-16 斯克里普斯研究所 重编程细胞
EP2563908B1 (en) 2010-04-25 2019-01-09 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
WO2011158960A1 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Kyoto University Method for selecting human induced pluripotent stem cells
WO2011160066A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Regents Of The University Of Minnesota Production of insulin producing cells
US9279103B2 (en) 2010-08-05 2016-03-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
WO2012117333A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2013055834A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 The New York Stem Cell Foundation Er stress relievers in beta cell protection
WO2013056072A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
WO2013055397A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
SG10201608914WA (en) 2011-12-22 2016-12-29 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
US10066210B2 (en) 2012-06-08 2018-09-04 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
CN104903440B (zh) 2012-09-03 2018-04-06 诺和诺德股份有限公司 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层
KR101942769B1 (ko) 2012-12-31 2019-01-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
WO2014127164A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Allergan, Inc. Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
TW201522637A (zh) * 2013-03-15 2015-06-16 Jackson Lab 非胚胎幹細胞之單離及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040172A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
WO2006088867A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Medistem Laboratories, Incorporated Method for expansion of stem cells
US20110281355A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells
US20120052576A1 (en) * 2010-08-31 2012-03-01 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of Pluripotent Stem Cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OBREGON MJ "Thyroid hormone and adipocyte differentiation", Thyroid. 2008; 18(2): 185-195. *
ВЕЧКАНОВ Е.М. и др. "Основы клеточной инженерии", Учебное пособие. - Ростов-на-Дону, 2012. - 136 с. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018279009A1 (en) 2019-01-17
AU2021245259A1 (en) 2021-11-04
US20140186305A1 (en) 2014-07-03
HK1217110A1 (zh) 2016-12-23
RU2018116648A3 (ru) 2021-08-26
RU2768963C2 (ru) 2022-03-25
SG10201709338RA (en) 2017-12-28
US10344264B2 (en) 2019-07-09
RU2018116647A (ru) 2018-10-24
CA2896655C (en) 2021-06-22
EP2938724A1 (en) 2015-11-04
KR102084561B1 (ko) 2020-03-04
JP6557146B2 (ja) 2019-08-07
DK2938724T3 (da) 2020-12-14
ES2837763T3 (es) 2021-07-01
EP2938724B1 (en) 2020-10-28
BR112015015770A2 (pt) 2017-07-11
JP2016506246A (ja) 2016-03-03
KR20150103182A (ko) 2015-09-09
SG11201505128SA (en) 2015-07-30
AR094347A1 (es) 2015-07-29
RU2018116648A (ru) 2018-10-24
CA2896655A1 (en) 2014-07-03
PH12015501465A1 (en) 2015-09-21
AU2013368221B2 (en) 2018-11-01
CN105008518A (zh) 2015-10-28
CN105008518B (zh) 2020-08-07
WO2014105543A1 (en) 2014-07-03
EP2938724A4 (en) 2016-07-27
AU2023285724A1 (en) 2024-01-18
AU2018279009B2 (en) 2021-07-29
MX2015008577A (es) 2015-09-07
AU2021245259B2 (en) 2023-10-05
RU2015131835A (ru) 2017-02-06
RU2018116647A3 (ru) 2021-09-15
AU2013368221A1 (en) 2015-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2658488C2 (ru) Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
JP7278990B2 (ja) Ｈｂ９調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化
RU2752499C2 (ru) Генерация функциональных бета-клеток, полученных из человеческой плюрипотентной стволовой клетки, демонстрирующих реакцию в виде глюкозозависимого митохондриального дыхания и двухфазной секреции инсулина
JP6588969B2 (ja) 膵内分泌細胞内のｍａｆａ発現を強化するための小分子の使用