RU2752499C2 - Генерация функциональных бета-клеток, полученных из человеческой плюрипотентной стволовой клетки, демонстрирующих реакцию в виде глюкозозависимого митохондриального дыхания и двухфазной секреции инсулина - Google Patents
Генерация функциональных бета-клеток, полученных из человеческой плюрипотентной стволовой клетки, демонстрирующих реакцию в виде глюкозозависимого митохондриального дыхания и двухфазной секреции инсулина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2752499C2 RU2752499C2 RU2019101200A RU2019101200A RU2752499C2 RU 2752499 C2 RU2752499 C2 RU 2752499C2 RU 2019101200 A RU2019101200 A RU 2019101200A RU 2019101200 A RU2019101200 A RU 2019101200A RU 2752499 C2 RU2752499 C2 RU 2752499C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- medium
- inhibitor
- stage
- cell
- Prior art date
Links
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 title claims abstract description 121
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 93
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims description 138
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title claims description 64
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 title claims description 40
- 230000006540 mitochondrial respiration Effects 0.000 title claims description 32
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 953
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 177
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 101000979205 Homo sapiens Transcription factor MafA Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 claims abstract description 80
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 80
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 101000939387 Homo sapiens Urocortin-3 Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102100029794 Urocortin-3 Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108091006296 SLC2A1 Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 102000058063 Glucose Transporter Type 1 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 claims abstract 5
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 claims abstract 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 227
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 158
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 106
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 100
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 79
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 79
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 79
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 79
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 75
- OGNYUTNQZVRGMN-UHFFFAOYSA-N ZM447439 Chemical compound N1=CN=C2C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=C1NC(C=C1)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC=C1 OGNYUTNQZVRGMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 59
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 58
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims description 57
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 51
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 51
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 51
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 49
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 49
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 46
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 claims description 46
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims description 44
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 44
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 claims description 42
- -1 A366 Chemical compound 0.000 claims description 38
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 37
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 37
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 31
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 claims description 29
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 28
- 210000003577 pancreatic endocrine progenitor Anatomy 0.000 claims description 28
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 26
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 22
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 17
- 229940125373 Gamma-Secretase Inhibitor Drugs 0.000 claims description 13
- 239000003540 gamma secretase inhibitor Substances 0.000 claims description 13
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- SHRCVZJKZJGIHQ-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-[4-[(2-chloroacetyl)amino]phenyl]sulfonylphenyl]acetamide Chemical compound C1=CC(NC(=O)CCl)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(NC(=O)CCl)C=C1 SHRCVZJKZJGIHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- QOECJCJVIMVJGX-UHFFFAOYSA-N 2-cyclohexyl-6-methoxy-N-(1-propan-2-yl-4-piperidinyl)-7-[3-(1-pyrrolidinyl)propoxy]-4-quinazolinamine Chemical compound N1=C(C2CCCCC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 QOECJCJVIMVJGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- TXZPMHLMPKIUGK-UHFFFAOYSA-N 2-methoxy-N-(3-methyl-2-oxo-1,4-dihydroquinazolin-6-yl)benzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(NC(=O)N(C)C2)C2=C1 TXZPMHLMPKIUGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108010065691 Biphasic Insulins Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000189 biphasic insulin Substances 0.000 claims description 11
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 claims description 11
- DZTGIRNXWSZBIM-UHFFFAOYSA-N chembl3086883 Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1N DZTGIRNXWSZBIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NGAGMBNBKCDCDJ-UHFFFAOYSA-N 8-phenyl-2-(1-piperazinyl)-1-benzopyran-4-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C=C(N3CCNCC3)OC2=C1C1=CC=CC=C1 NGAGMBNBKCDCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N (z)-n-(4-benzylpiperazin-1-yl)-1-(3,5-dimethyl-1-phenylpyrazol-4-yl)methanimine Chemical compound CC1=NN(C=2C=CC=CC=2)C(C)=C1\C=N/N(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N 0.000 claims description 7
- OUKWLRHRXOPODD-UHFFFAOYSA-N N-(1-cyclohexyl-4-piperidinyl)-6-methoxy-7-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-(4-propan-2-yl-1,4-diazepan-1-yl)-4-quinazolinamine Chemical compound N1=C(N2CCN(CCC2)C(C)C)N=C2C=C(OCCCN3CCCCC3)C(OC)=CC2=C1NC(CC1)CCN1C1CCCCC1 OUKWLRHRXOPODD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims 3
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims 2
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 177
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 85
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 75
- 102100023237 Transcription factor MafA Human genes 0.000 description 75
- 101000612089 Homo sapiens Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 60
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 57
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 57
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 54
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 54
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 53
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 53
- OMKHWTRUYNAGFG-IEBDPFPHSA-N 3-deazaneplanocin a Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=CC=2N1[C@@H]1C=C(CO)[C@@H](O)[C@H]1O OMKHWTRUYNAGFG-IEBDPFPHSA-N 0.000 description 52
- SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N Tretinoin Chemical compound OC(=O)/C=C(\C)/C=C/C=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N 0.000 description 47
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 45
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 45
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 43
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 40
- 229940098448 fibroblast growth factor 7 Drugs 0.000 description 39
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 38
- LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 1,5-naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1h-pyrazol-4-yl]- Chemical compound CC1=CC=CC(C2=C(C=NN2)C=2N=C3C=CC=NC3=CC=2)=N1 LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 37
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 37
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 37
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 37
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 31
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 31
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 29
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 29
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 29
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 29
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 29
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 29
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- PCCDKTWDGDFRME-UHFFFAOYSA-N 4-[6-(4-piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline;hydrochloride Chemical compound Cl.C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 PCCDKTWDGDFRME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 22
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 22
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 22
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 22
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 21
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 21
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 20
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 20
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 18
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 18
- 102000013380 Smoothened Receptor Human genes 0.000 description 17
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 17
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 17
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 description 17
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 16
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 16
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 16
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 16
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 16
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 16
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 16
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 16
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 229940123379 Methyltransferase inhibitor Drugs 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 15
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 14
- 101000963360 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-79 specific Proteins 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 12
- 102000000717 Lysine methyltransferases Human genes 0.000 description 12
- 108050008120 Lysine methyltransferases Proteins 0.000 description 12
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 12
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 12
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 11
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 11
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 11
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 11
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 11
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 11
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000010792 Chromogranin A Human genes 0.000 description 10
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 10
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 10
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 10
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 10
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 10
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 10
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 10
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 9
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 9
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 9
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 9
- 102100031671 Homeobox protein CDX-2 Human genes 0.000 description 9
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 description 9
- 108700020297 NeuroD Proteins 0.000 description 9
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 9
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 9
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 9
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 9
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 9
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 9
- 102100029895 Bromodomain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 8
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 8
- 101000576323 Homo sapiens Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 102100025170 Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000044880 Wnt3A Human genes 0.000 description 8
- 108700013515 Wnt3A Proteins 0.000 description 8
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 8
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 8
- 229940125763 bromodomain inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 230000008410 smoothened signaling pathway Effects 0.000 description 8
- 108091005625 BRD4 Proteins 0.000 description 7
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 description 7
- 229940126190 DNA methyltransferase inhibitor Drugs 0.000 description 7
- 101100518002 Danio rerio nkx2.2a gene Proteins 0.000 description 7
- 102100025623 Gap junction delta-2 protein Human genes 0.000 description 7
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 description 7
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 description 7
- 101100460496 Homo sapiens NKX2-2 gene Proteins 0.000 description 7
- 108050000588 Neurogenic differentiation factor 1 Proteins 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 239000003968 dna methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- BERLXWPRSBJFHO-UHFFFAOYSA-N 2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-n-pyridin-4-ylpteridin-4-amine Chemical compound FC1=CC=C(Cl)C=C1C1=NC(NC=2C=CN=CC=2)=C(N=CC=N2)C2=N1 BERLXWPRSBJFHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940123877 Aurora kinase inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 102000007345 Chromogranins Human genes 0.000 description 6
- 108010007718 Chromogranins Proteins 0.000 description 6
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 6
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 description 6
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 6
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 6
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 6
- PTJGLFIIZFVFJV-UHFFFAOYSA-N N'-hydroxy-N-(3-pyridinyl)octanediamide Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NC1=CC=CN=C1 PTJGLFIIZFVFJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 6
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 239000003719 aurora kinase inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 102000006533 chordin Human genes 0.000 description 6
- 108010008846 chordin Proteins 0.000 description 6
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 101150068520 wnt3a gene Proteins 0.000 description 6
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 6
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 5
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 5
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 description 5
- 101001054725 Homo sapiens Inhibin beta B chain Proteins 0.000 description 5
- 101001117146 Homo sapiens [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 5
- 102100027003 Inhibin beta B chain Human genes 0.000 description 5
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 5
- 102100024148 [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 description 5
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 description 5
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 5
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 5
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 5
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 5
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N (-)-indolactam V Chemical compound C1[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C2=CC=CC3=C2C1=CN3 LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N 0.000 description 4
- 125000004211 3,5-difluorophenyl group Chemical group [H]C1=C(F)C([H])=C(*)C([H])=C1F 0.000 description 4
- ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M Alexa Fluor 546 Chemical compound [H+].[Na+].CC1CC(C)(C)NC(C(=C2OC3=C(C4=NC(C)(C)CC(C)C4=CC3=3)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=C2C=3C(C(=C(Cl)C=1Cl)C(O)=O)=C(Cl)C=1SCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000003989 Aurora kinases Human genes 0.000 description 4
- 108090000433 Aurora kinases Proteins 0.000 description 4
- 102100033641 Bromodomain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 4
- 102100033642 Bromodomain-containing protein 3 Human genes 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940122680 Demethylase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 102100036255 Glucose-6-phosphatase 2 Human genes 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 description 4
- 108010074870 Histone Demethylases Proteins 0.000 description 4
- 102000008157 Histone Demethylases Human genes 0.000 description 4
- 101000871850 Homo sapiens Bromodomain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000871851 Homo sapiens Bromodomain-containing protein 3 Proteins 0.000 description 4
- 101000930907 Homo sapiens Glucose-6-phosphatase 2 Proteins 0.000 description 4
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 description 4
- 101000757216 Homo sapiens Protein arginine N-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000757232 Homo sapiens Protein arginine N-methyltransferase 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000945096 Homo sapiens Ribosomal protein S6 kinase alpha-5 Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LUZOFMGZMUZSSK-UHFFFAOYSA-N Indolactam-V Natural products C1C(CO)NC(=O)C(C(C)C)N(C)C2=CC=CC3=C2C1=CN3 LUZOFMGZMUZSSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102100031455 NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1 Human genes 0.000 description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100022985 Protein arginine N-methyltransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 4
- 102100033645 Ribosomal protein S6 kinase alpha-5 Human genes 0.000 description 4
- 108010041191 Sirtuin 1 Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000005441 aurora Substances 0.000 description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 4
- ULFUJLFTRWWLPO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2,7,7-trimethyl-5-oxo-4-(4-phenylphenyl)-1,4,6,8-tetrahydroquinoline-3-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=C(C)NC(CC(C)(C)CC2=O)=C2C1C(C=C1)=CC=C1C1=CC=CC=C1 ULFUJLFTRWWLPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XHEFDIBZLJXQHF-UHFFFAOYSA-N fisetin Chemical compound C=1C(O)=CC=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 XHEFDIBZLJXQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 102000046485 human PRMT2 Human genes 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- IMYVCWQAHSYYOO-UHFFFAOYSA-N n-[4-[(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)amino]phenyl]benzamide Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC(C=C1)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC=C1 IMYVCWQAHSYYOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N phorbol 12,13-dibutanoate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(=O)CCC)C1(C)C BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000019195 vitamin supplement Nutrition 0.000 description 4
- LXHCVQFUTOUZEQ-YDALLXLXSA-N (2s)-2-amino-3-[4-(4-hydroxy-3-iodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]propanoic acid;sodium Chemical compound [Na].IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 LXHCVQFUTOUZEQ-YDALLXLXSA-N 0.000 description 3
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 description 3
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 3
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 3
- LXFOLMYKSYSZQS-LURJZOHASA-N CC(C)N(C[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1O)n1cnc2c(N)ncnc12)[C@@H]1C[C@H](CCc2nc3cc(ccc3[nH]2)C(C)(C)C)C1 Chemical compound CC(C)N(C[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1O)n1cnc2c(N)ncnc12)[C@@H]1C[C@H](CCc2nc3cc(ccc3[nH]2)C(C)(C)C)C1 LXFOLMYKSYSZQS-LURJZOHASA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 3
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 3
- 102000012004 Ghrelin Human genes 0.000 description 3
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 description 3
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 3
- 102100038885 Histone acetyltransferase p300 Human genes 0.000 description 3
- 102100039489 Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-79 specific Human genes 0.000 description 3
- 102100027332 Homeobox protein SIX2 Human genes 0.000 description 3
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000882390 Homo sapiens Histone acetyltransferase p300 Proteins 0.000 description 3
- 101000651912 Homo sapiens Homeobox protein SIX2 Proteins 0.000 description 3
- 101001076604 Homo sapiens Inhibin alpha chain Proteins 0.000 description 3
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 3
- 101000613495 Homo sapiens Paired box protein Pax-4 Proteins 0.000 description 3
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 3
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 3
- 102100025885 Inhibin alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102100022913 NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-2 Human genes 0.000 description 3
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 description 3
- 102100040909 Paired box protein Pax-4 Human genes 0.000 description 3
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 3
- 108010041216 Sirtuin 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 3
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 3
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 3
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 3
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 3
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 3
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N inositol Chemical compound OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 3
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N (-)-Epigallocatechin-3-o-gallate Chemical compound O([C@@H]1CC2=C(O)C=C(C=C2O[C@@H]1C=1C=C(O)C(O)=C(O)C=1)O)C(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N 0.000 description 2
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 2
- AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N (S)-2-methyl-1-(4-methylisoquinoline-5-sulfonyl)-1,4-diazepane Chemical compound C[C@H]1CNCCCN1S(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC(C)=C12 AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- IQCKJUKAQJINMK-HUBRGWSESA-N 1-[3-[[(2r,3s,4r,5r)-5-(4-amino-5-bromopyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl-propan-2-ylamino]propyl]-3-(4-tert-butylphenyl)urea Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2C(Br)=C1)O)N(C(C)C)CCCNC(=O)NC1=CC=C(C(C)(C)C)C=C1 IQCKJUKAQJINMK-HUBRGWSESA-N 0.000 description 2
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 2
- ZXSWZQSYZYMZKS-UHFFFAOYSA-N 2-methoxyethyl 4-(3-hydroxyphenyl)-7-(2-methoxyphenyl)-2-methyl-5-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-1h-quinoline-3-carboxylate Chemical compound COCCOC(=O)C1=C(C)NC(CC(CC2=O)C=3C(=CC=CC=3)OC)=C2C1C1=CC=CC(O)=C1 ZXSWZQSYZYMZKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVZCPICCWKMZDT-UHFFFAOYSA-N 3-[[2-(2-pyridinyl)-6-(1,2,4,5-tetrahydro-3-benzazepin-3-yl)-4-pyrimidinyl]amino]propanoic acid Chemical compound N=1C(NCCC(=O)O)=CC(N2CCC3=CC=CC=C3CC2)=NC=1C1=CC=CC=N1 AVZCPICCWKMZDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WBKCKEHGXNWYMO-UHFFFAOYSA-N 3-[[2-(2-pyridinyl)-6-(1,2,4,5-tetrahydro-3-benzazepin-3-yl)-4-pyrimidinyl]amino]propanoic acid ethyl ester Chemical compound N=1C(NCCC(=O)OCC)=CC(N2CCC3=CC=CC=C3CC2)=NC=1C1=CC=CC=N1 WBKCKEHGXNWYMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJPKFNFCWJBCX-UHFFFAOYSA-N 6-[(4-bromothiophen-2-yl)methoxy]-7h-purin-2-amine Chemical compound C=12NC=NC2=NC(N)=NC=1OCC1=CC(Br)=CS1 JUJPKFNFCWJBCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940122485 ATM kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004228 Aurora kinase B Human genes 0.000 description 2
- 108090000749 Aurora kinase B Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021975 CREB-binding protein Human genes 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 2
- 102000010970 Connexin Human genes 0.000 description 2
- 108050001175 Connexin Proteins 0.000 description 2
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 2
- QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N Cyclopamine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC2=C3C)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@@]13O[C@@H]2C[C@H](C)CN[C@H]2[C@H]1C QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 2
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 description 2
- 108010009540 DNA (Cytosine-5-)-Methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100036279 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N GCG Natural products C=1C(O)=C(O)C(O)=CC=1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2CC1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021337 Gap junction alpha-1 protein Human genes 0.000 description 2
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 description 2
- 102000006419 Glucagon-Like Peptide Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010083749 Glucagon-Like Peptide Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241001559542 Hippocampus hippocampus Species 0.000 description 2
- 102100022893 Histone acetyltransferase KAT5 Human genes 0.000 description 2
- 102100021453 Histone deacetylase 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100038715 Histone deacetylase 8 Human genes 0.000 description 2
- 101710177327 Histone deacetylase 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100032742 Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Human genes 0.000 description 2
- 102100031470 Homeobox protein ARX Human genes 0.000 description 2
- 101000896987 Homo sapiens CREB-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101000899255 Homo sapiens Histone deacetylase 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000923090 Homo sapiens Homeobox protein ARX Proteins 0.000 description 2
- 101001025971 Homo sapiens Lysine-specific demethylase 6B Proteins 0.000 description 2
- 101000712674 Homo sapiens TGF-beta receptor type-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108050003304 Huntingtin-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037461 Lysine-specific demethylase 6B Human genes 0.000 description 2
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- 102100025825 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012661 PARP inhibitor Substances 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 2
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940121906 Poly ADP ribose polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000003861 Ribosomal protein S6 Human genes 0.000 description 2
- 108090000221 Ribosomal protein S6 Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 2
- 108091006207 SLC-Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102000037054 SLC-Transporter Human genes 0.000 description 2
- 101001117144 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090739 Smoothened Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100033456 TGF-beta receptor type-1 Human genes 0.000 description 2
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 2
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000032740 autosomal recessive 10 intellectual disability Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- KRPUUUJWTZKSOK-YDALLXLXSA-L calcium (4S)-4-[[4-[(2-amino-4-oxidopteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]-5-hydroxy-5-oxopentanoate Chemical compound [Ca++].Nc1nc([O-])c2nc(CNc3ccc(cc3)C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(O)=O)cnc2n1 KRPUUUJWTZKSOK-YDALLXLXSA-L 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 2
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 2
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 2
- 108010015417 connexin 36 Proteins 0.000 description 2
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N cyclopamine Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C(CC2=C3C)C1C2CCC13OC2CC(C)CNC2C1C QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 2
- ASIYFCYUCMQNGK-JZGIKJSDSA-L disodium L-tyrosinate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C([O-])C=C1 ASIYFCYUCMQNGK-JZGIKJSDSA-L 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000011990 fisetin Nutrition 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- IYRMWMYZSQPJKC-UHFFFAOYSA-N kaempferol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 IYRMWMYZSQPJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 229950003489 lomeguatrib Drugs 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229960005337 lysine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 2
- YOVNFNXUCOWYSG-UHFFFAOYSA-N n-[3-[2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethylimidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]oxyphenyl]-4-(2-morpholin-4-ylethoxy)benzamide Chemical compound C1=C2N(CC)C(C=3C(=NON=3)N)=NC2=CN=C1OC(C=1)=CC=CC=1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1OCCN1CCOCC1 YOVNFNXUCOWYSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSYLKMKIVWJAAK-UHFFFAOYSA-N n-[4-[(2-amino-6-methylpyrimidin-4-yl)amino]phenyl]-4-(quinolin-4-ylamino)benzamide Chemical compound NC1=NC(C)=CC(NC=2C=CC(NC(=O)C=3C=CC(NC=4C5=CC=CC=C5N=CC=4)=CC=3)=CC=2)=N1 QSYLKMKIVWJAAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 2
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 2
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 2
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 2
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AELCINSCMGFISI-DTWKUNHWSA-N (1R,2S)-tranylcypromine Chemical compound N[C@@H]1C[C@H]1C1=CC=CC=C1 AELCINSCMGFISI-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 1
- YKLPAWHQHJTBDV-RXMQYKEDSA-N (2r)-2-amino-3-oxo-2-(sulfanylmethyl)butanoic acid Chemical compound CC(=O)[C@](N)(CS)C(O)=O YKLPAWHQHJTBDV-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- OWGLFIKZKQOYHZ-UHFFFAOYSA-N (3-bromophenyl)-(4-pyrrolidin-1-ylpiperidin-1-yl)methanone Chemical compound BrC1=CC=CC(C(=O)N2CCC(CC2)N2CCCC2)=C1 OWGLFIKZKQOYHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWUBBDSIWDLEOM-XHQRYOPUSA-N (3e)-3-[(2e)-2-[1-(6-hydroxy-6-methylheptan-2-yl)-7a-methyl-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1h-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexan-1-ol Chemical compound C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2\C1=C\C=C1/CC(O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-XHQRYOPUSA-N 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FAYAUAZLLLJJGH-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chlorophenyl)-3-[5-[2-(4-thieno[3,2-d]pyrimidinylamino)ethyl]-2-thiazolyl]urea Chemical compound ClC1=CC=CC(NC(=O)NC=2SC(CCNC=3C=4SC=CC=4N=CN=3)=CN=2)=C1 FAYAUAZLLLJJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKNAKDFZAWQEEO-IBGZPJMESA-N 1-[7-(3,4-dimethoxyphenyl)-9-[[(3s)-1-methylpiperidin-3-yl]methoxy]-3,5-dihydro-2h-1,4-benzoxazepin-4-yl]propan-1-one Chemical compound C1N(C(=O)CC)CCOC2=C1C=C(C=1C=C(OC)C(OC)=CC=1)C=C2OC[C@H]1CCCN(C)C1 YKNAKDFZAWQEEO-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-morpholinyl)-6-(1-thianthrenyl)-4-pyranone Chemical compound O1C(C=2C=3SC4=CC=CC=C4SC=3C=CC=2)=CC(=O)C=C1N1CCOCC1 XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMHZFEWYVFWVLI-UHFFFAOYSA-N 2-(pyridin-3-ylmethylidene)indene-1,3-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=CC1=CC=CN=C1 OMHZFEWYVFWVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAOSCCRYLYQBES-UHFFFAOYSA-N 2-[[[4-hydroxy-2-oxo-1-(phenylmethyl)-3-quinolinyl]-oxomethyl]amino]acetic acid Chemical compound O=C1C(C(=O)NCC(=O)O)=C(O)C2=CC=CC=C2N1CC1=CC=CC=C1 CAOSCCRYLYQBES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004204 2-methoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- WEVWMDXKENHVCZ-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydro-1h-pteridin-2-one Chemical compound C1=CN=C2NC(=O)NCC2=N1 WEVWMDXKENHVCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WONYMNWUJVKVII-UHFFFAOYSA-N 3,5-diiodothyropropionic acid Chemical compound IC1=CC(CCC(=O)O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C=C1 WONYMNWUJVKVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJIFOCRGDDQFJF-UHFFFAOYSA-N 3-[[2-(3-pyridinyl)-6-(1,2,4,5-tetrahydro-3-benzazepin-3-yl)-4-pyrimidinyl]amino]propanoic acid Chemical compound N=1C(NCCC(=O)O)=CC(N2CCC3=CC=CC=C3CC2)=NC=1C1=CC=CN=C1 LJIFOCRGDDQFJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSCPDZHWVNUUFI-UHFFFAOYSA-N 3-aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(N)=C1 GSCPDZHWVNUUFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004208 3-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C([H])C(*)=C1[H] 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYOZTVGMEWJPKR-VOMCLLRMSA-N 4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-yl-1-cyclohexanecarboxamide Chemical compound C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IYOZTVGMEWJPKR-VOMCLLRMSA-N 0.000 description 1
- NRRCQHARLPNLHJ-UHFFFAOYSA-N 4-[1-ethyl-7-[(piperidin-4-ylamino)methyl]imidazo[4,5-c]pyridin-2-yl]-1,2,5-oxadiazol-3-amine;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=12N(CC)C(C=3C(=NON=3)N)=NC2=CN=CC=1CNC1CCNCC1 NRRCQHARLPNLHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBKXEAXTFZPCHS-UHFFFAOYSA-N 4-phenylbutyric acid Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=CC=C1 OBKXEAXTFZPCHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- YHHFKWKMXWRVTJ-XLNRJJMWSA-N 5-chloro-n-[(z)-[phenyl(pyridin-2-yl)methylidene]amino]pyridin-2-amine Chemical compound N1=CC(Cl)=CC=C1N\N=C(C=1N=CC=CC=1)\C1=CC=CC=C1 YHHFKWKMXWRVTJ-XLNRJJMWSA-N 0.000 description 1
- RZWRYPGAUIOOMK-UHFFFAOYSA-N 5-nitroso-8-quinolinol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=C(N=O)C2=C1 RZWRYPGAUIOOMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JTDYUFSDZATMKU-UHFFFAOYSA-N 6-(1,3-dioxo-2-benzo[de]isoquinolinyl)-N-hydroxyhexanamide Chemical compound C1=CC(C(N(CCCCCC(=O)NO)C2=O)=O)=C3C2=CC=CC3=C1 JTDYUFSDZATMKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUVUVNZRUGEAHB-CYBMUJFWSA-N 7-(3,5-dimethyl-4-isoxazolyl)-8-methoxy-1-[(1R)-1-(2-pyridinyl)ethyl]-3H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-one Chemical compound C1([C@@H](C)N2C3=C4C=C(C(=CC4=NC=C3NC2=O)C2=C(ON=C2C)C)OC)=CC=CC=N1 VUVUVNZRUGEAHB-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- XIVUGRBSBIXXJE-UHFFFAOYSA-N 7-[3-(dimethylamino)propoxy]-6-methoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)-n-(1-methylpiperidin-4-yl)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCN(C)CCC2)N=C2C=C(OCCCN(C)C)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C)CC1 XIVUGRBSBIXXJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGRPKOGHYBAVMW-UHFFFAOYSA-N 8-hydroxy-5-quinolinecarboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=CC=C(O)C2=N1 JGRPKOGHYBAVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022958 Adenylate kinase 7 Human genes 0.000 description 1
- 108050000848 Adenylate kinase 7 Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 101100472733 Arabidopsis thaliana RING1A gene Proteins 0.000 description 1
- DTEKTGDVSARYDS-UHFFFAOYSA-N BI-D1870 Chemical compound N1=C2N(CCC(C)C)C(C)C(=O)N(C)C2=CN=C1NC1=CC(F)=C(O)C(F)=C1 DTEKTGDVSARYDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000796998 Bacillus subtilis (strain 168) Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase, inducible Proteins 0.000 description 1
- 229940122798 Bone morphogenetic protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000001805 Bromodomains Human genes 0.000 description 1
- 108050009021 Bromodomains Proteins 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 description 1
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 description 1
- 235000021318 Calcifediol Nutrition 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 description 1
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 239000011626 DL-alpha-tocopherylacetate Substances 0.000 description 1
- 235000001809 DL-alpha-tocopherylacetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940124087 DNA topoisomerase II inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101000923091 Danio rerio Aristaless-related homeobox protein Proteins 0.000 description 1
- 229940122964 Deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- UBSCDKPKWHYZNX-UHFFFAOYSA-N Demethoxycapillarisin Natural products C1=CC(O)=CC=C1OC1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 UBSCDKPKWHYZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100030012 Deoxyribonuclease-1 Human genes 0.000 description 1
- 101100073171 Drosophila melanogaster Kdm2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023266 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710146529 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100037249 Egl nine homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710111663 Egl nine homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108700031316 Goosecoid Proteins 0.000 description 1
- 102000050057 Goosecoid Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108010087745 Hepatocyte Nuclear Factor 3-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000009094 Hepatocyte Nuclear Factor 3-beta Human genes 0.000 description 1
- 102100022123 Hepatocyte nuclear factor 1-beta Human genes 0.000 description 1
- 102100029087 Hepatocyte nuclear factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102000017286 Histone H2A Human genes 0.000 description 1
- 108050005231 Histone H2A Proteins 0.000 description 1
- 101710116149 Histone acetyltransferase KAT5 Proteins 0.000 description 1
- 102100021454 Histone deacetylase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022537 Histone deacetylase 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001045758 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-beta Proteins 0.000 description 1
- 101000988619 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001046996 Homo sapiens Histone acetyltransferase KAT5 Proteins 0.000 description 1
- 101000899259 Homo sapiens Histone deacetylase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000899330 Homo sapiens Histone deacetylase 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 1
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000966275 Homo sapiens Lethal(3)malignant brain tumor-like protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000738523 Homo sapiens Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000702559 Homo sapiens Probable global transcription activator SNF2L2 Proteins 0.000 description 1
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000945090 Homo sapiens Ribosomal protein S6 kinase alpha-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000702545 Homo sapiens Transcription activator BRG1 Proteins 0.000 description 1
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 102100030657 Lethal(3)malignant brain tumor-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710173086 Lethal(3)malignant brain tumor-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100040548 Lethal(3)malignant brain tumor-like protein 3 Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229940123628 Lysine (K)-specific demethylase 1A inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010033293 Lysine Acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000007077 Lysine Acetyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100058550 Mus musculus Bmi1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000978776 Mus musculus Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100302187 Mus musculus Ring1 gene Proteins 0.000 description 1
- WTKBRPXPNAKVEQ-UHFFFAOYSA-N N'-(2-aminophenyl)-N-(4-methylphenyl)heptanediamide Chemical class C1=CC(C)=CC=C1NC(=O)CCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1N WTKBRPXPNAKVEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDQPVOFTURLJPT-UHFFFAOYSA-N N,N'-dihydroxyoctanediamide Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NO IDQPVOFTURLJPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOWJIWFCOPZFGV-UHFFFAOYSA-N N-[(4-acetamidoanilino)-sulfanylidenemethyl]-4-tert-butylbenzamide Chemical compound C1=CC(NC(=O)C)=CC=C1NC(=S)NC(=O)C1=CC=C(C(C)(C)C)C=C1 WOWJIWFCOPZFGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WWGBHDIHIVGYLZ-UHFFFAOYSA-N N-[4-[3-[[[7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl]amino]-oxomethyl]-5-isoxazolyl]phenyl]carbamic acid tert-butyl ester Chemical compound C1=CC(NC(=O)OC(C)(C)C)=CC=C1C1=CC(C(=O)NCCCCCCC(=O)NO)=NO1 WWGBHDIHIVGYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJRGHIGYPXNABY-UHFFFAOYSA-N N-hydroxy-1-[(4-methoxyphenyl)methyl]-6-indolecarboxamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CN1C2=CC(C(=O)NO)=CC=C2C=C1 AJRGHIGYPXNABY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010084438 Oncogene Protein v-maf Proteins 0.000 description 1
- 229940121878 P300 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- INAICWLVUAKEPB-QSTFCLMHSA-N PFI-3 Chemical compound OC1=CC=CC=C1C(=O)\C=C\N1[C@@H](CN2C=3N=CC=CC=3)C[C@@H]2C1 INAICWLVUAKEPB-QSTFCLMHSA-N 0.000 description 1
- 102100037878 Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100031021 Probable global transcription activator SNF2L2 Human genes 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033643 Ribosomal protein S6 kinase alpha-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000011990 Sirtuin Human genes 0.000 description 1
- 108050002485 Sirtuin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000317 Topoisomerase II Inhibitor Substances 0.000 description 1
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 102100031027 Transcription activator BRG1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 101150020913 USP7 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021013 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 7 Human genes 0.000 description 1
- 108700011958 Ubiquitin-Specific Peptidase 7 Proteins 0.000 description 1
- 229940126752 Ubiquitin-specific protease 7 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000008219 Uncoupling Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010021111 Uncoupling Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010059705 Urocortins Proteins 0.000 description 1
- 102000005630 Urocortins Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- PQOOIERVZAXHBP-UHFFFAOYSA-N [3-anilino-4-[oxo-[4-(1-pyrrolidinyl)-1-piperidinyl]methyl]phenyl]-[4-(1-pyrrolidinyl)-1-piperidinyl]methanone Chemical compound C=1C=C(C(=O)N2CCC(CC2)N2CCCC2)C(NC=2C=CC=CC=2)=CC=1C(=O)N(CC1)CCC1N1CCCC1 PQOOIERVZAXHBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 210000000677 aggregate cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000006470 autoimmune attack Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- UXJFDYIHRJGPFS-WPWMEQJKSA-N chembl380797 Chemical compound C=1C=CC=C(\N=C\C=2C3=CC=CC=C3C=CC=2O)C=1C(=O)NC(C)C1=CC=CC=C1 UXJFDYIHRJGPFS-WPWMEQJKSA-N 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000020973 chromatin silencing at telomere Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229960003603 decitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009504 deubiquitination Effects 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000027721 electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060002566 ephrin Proteins 0.000 description 1
- 102000012803 ephrin Human genes 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- LQPGVGSKBNXQDU-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-[[2-pyridin-3-yl-6-(1,2,4,5-tetrahydro-3-benzazepin-3-yl)pyrimidin-4-yl]amino]propanoate Chemical compound N=1C(NCCC(=O)OCC)=CC(N2CCC3=CC=CC=C3CC2)=NC=1C1=CC=CN=C1 LQPGVGSKBNXQDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008246 gaseous mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000004547 gene signature Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013038 irreversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000008777 kaempferol Nutrition 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- XAPDRNSTUYCSQC-SGTLLEGYSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-(3,5-difluorophenyl)acetyl]amino]propanoyl]amino]-2-phenylacetate Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 XAPDRNSTUYCSQC-SGTLLEGYSA-N 0.000 description 1
- 108040008770 methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N n-(1-benzylpiperidin-4-yl)-6,7-dimethoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)quinazolin-4-amine;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC(N2CCN(C)CCC2)=NC=1NC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVQVEZQDNHMQJV-UHFFFAOYSA-N n-[(3-benzamidophenyl)carbamothioyl]-3,4,5-trimethoxybenzamide Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)NC(=S)NC=2C=C(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)C=CC=2)=C1 KVQVEZQDNHMQJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INVVXEKRUDMEBE-UHFFFAOYSA-N n-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1h-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1C=C(NC(=O)C2OC3=CC=CC=C3OC2)C(OCCN(C)C)=CC=1C=1C=NNC=1 INVVXEKRUDMEBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRYZCEONIWEUAV-UHFFFAOYSA-N n-[6-(hydroxyamino)-6-oxohexoxy]-3,5-dimethylbenzamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C(=O)NOCCCCCC(=O)NO)=C1 VRYZCEONIWEUAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229950009215 phenylbutanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 1
- IYPZRUYMFDWKSS-UHFFFAOYSA-N piperazin-1-amine Chemical compound NN1CCNCC1 IYPZRUYMFDWKSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001811 primitive streak Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940043437 protein kinase A inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012656 protein kinase A inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 description 1
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- DQZMLPMCOMRJOR-MOVGKWKRSA-N s-[(6s)-7-(1-adamantylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-7-oxoheptyl] 2-methylpropanethioate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)CCCCCSC(=O)C(C)C)C3 DQZMLPMCOMRJOR-MOVGKWKRSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M sodium valproate Chemical compound [Na+].CCCC(C([O-])=O)CCC AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- ISFPDBUKMJDAJH-UHFFFAOYSA-N splitomicin Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1OC(=O)CC2 ISFPDBUKMJDAJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- FCENQCVTLJEGOT-KIHVXQRMSA-N stresscopin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 FCENQCVTLJEGOT-KIHVXQRMSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960003741 tranylcypromine Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 239000000777 urocortin Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- RPQZTTQVRYEKCR-WCTZXXKLSA-N zebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=CC=C1 RPQZTTQVRYEKCR-WCTZXXKLSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
- C12N5/068—Stem cells; Progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/345—Gastrin; Cholecystokinins [CCK]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/375—Thyroid stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/395—Thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ доведения незрелой панкреатической бета-клетки до зрелой панкреатической бета-клетки, экспрессирующей PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1. Кроме того, рассмотрен способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в зрелые бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета. 2 н. и 41 з.п. ф-лы, 10 ил., 23 табл., 7 пр.
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Данная заявка истребует приоритет, предоставляемый в связи с подачей Предварительной заявки на патент США № 62/352,968 (поданной 21 июня 2016 года), которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к способам продуцирования функциональных панкреатических бета-клеток in vitro и популяциям, получаемым в результате дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток. В частности, изобретение относится к бета-клеткам или популяции бета-клеток, которые демонстрируют реакцию в виде митохондриального дыхания/активности и реакцию в виде двухфазной секреции инсулина.
Предпосылки создания изобретения
[0003] Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1-го типа и нехватка островков Лангерганса, выполненных с возможностью трансплантации, заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или бета (β)-клеток, подходящих для приживления трансплантата. Один подход представляет собой генерацию функциональных бета-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные клетки.
[0004] При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентная клетка дает начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму), в ходе процесса, известного как гаструляция. Ткани, такие как ткань щитовидной железы, вилочковой железы, поджелудочной железы, кишечника и печени, будут развиваться из энтодермы посредством промежуточной стадии.
[0005] D'Amour et al. описали производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, полученной из человеческих эмбриональных стволовых клеток, при наличии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005, 23:1534-1541; патент США № 7,704,738). Трансплантация этих клеток под капсулу почки у мышей приводила к дифференцировке в более зрелые клетки с характеристиками ткани энтодермы (патент США № 7,704,738). Дефинитивные энтодермальные клетки, полученные из человеческих эмбриональных стволовых клеток, можно дополнительно дифференцировать в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 и ретиноевой кислоты (заявка на патент США № 2005/0266554). Последующая трансплантация этих клеток-предшественников панкреатических клеток в жировое тело иммунодефицитных мышей привела к образованию функционализированных панкреатических эндокринных клеток с последующей 3-4-месячной стадией созревания (патенты США № 7,534,608 и № 7,993,920).
[0006] Для индуцирования панкреатических эндокринных клеток-предшественников используют низкомолекулярные ингибиторы. Например, низкомолекулярные ингибиторы рецептора TGF-β и рецепторов BMP (Development 2011, 138:861-871; Diabetes 2011, 60:239-247) применяют для увеличения числа панкреатических эндокринных клеток. Кроме того, для генерации дефинитивных энтодермальных клеток или клеток-предшественников панкреатических энтодермальных клеток также применяют низкомолекулярные активаторы (Curr. Opin. Cell Biol. 2009, 21:727-732; Nature Chem. Biol. 2009, 5:258-265).
[0007] В целом процесс дифференцировки клеток-предшественников в функциональные β-клетки развивается через различные стадии, и были улучшены протоколы генерации панкреатических клеток из клеток-предшественников, таких как человеческие плюрипотентные стволовые клетки. Несмотря на эти продвижения в исследованиях, каждая стадия в процессе дифференцировки клеток-предшественников является уникальной задачей. Таким образом, сохраняется необходимость в дополнительной разработке протокола дифференцировки с целью продуцирования функциональных панкреатических эндокринных клеток и, в частности, функциональных бета-клеток. В частности, желательно обеспечивать способ генерации in vitro реагирующих на глюкозу инсулинпродуцирующих клеток, выполненных с возможностью быстрой и регулируемой стимулируемой глюкозой секреции (GSIS), наблюдаемой в функциональных бета-клетках. А именно, желательно обеспечивать способ получения in vitro функциональных бета-клеток, показывающих увеличение митохондриального дыхания/активности с последующей первой фазой и второй фазой секреции инсулина.
[0008] GSIS начинается с импорта глюкозы в бета-клетку посредством глюкозного транспортера (член 1 семейства 2 носителей растворенных веществ; SLC2A1; часто называемый глюкозным транспортером 1; GLUT1 для человеческих бета-клеток) и метаболизма глюкозы до пирувата посредством процесса, называемого гликолизом. Импорт пирувата в митохондрии, его метаболизм посредством TCA (трикарбоновая кислота) и последующей активации цепи переноса электронов (ETC, называемая в настоящем документе «митохондриальной активностью» или «митохондриальным дыханием») тесно связаны с экзоцитозом инсулина для обеспечения быстрого высвобождения инсулина в нужном количестве.
[0009] Показано, что функциональные бета-клетки внутри островка при внезапном увеличении концентрации глюкозы секретируют инсулин в две последовательные фазы (Henquin et al. Diabetologia (2009) 52(5):739-751). Амплитуду и продолжительность обеих фаз регулируют кинетикой внутриклеточного Ca2+ сигнала или дополнительной секрецией факторов сопряжения. Первая фаза (1-я) секреции инсулина представляет собой экзоцитоз небольшого пула связанных и легко высвобождаемых гранул инсулина. Вторая фаза (2-я) секреции инсулина, меньшей амплитуды, но большей продолжительности, представляет собой перемещение гранул из резервного пула гранул и их фиксацию/подготовку для высвобождения. Двухфазную GSIS, представляющую собой ключевой маркер созревания бета-клеток, не обнаруживают до постнатальной фазы развития человека и отличают от монофазной GSIS, наблюдаемой в незрелых бета-клетках (Otonkoski et al. Diabetes (1988) 37:286-291).
[0010] При диабете 2-го типа 1-я фаза GSIS отсутствует; а 2-я фаза GSIS также снижена. Сообщается, что при диабете 1-го типа, при котором число бета-клеток значительно снижают посредством аутоиммунной атаки, отсутствует устойчивая двухфазная GSIS (Krogvold et al. Diabetes (2015) 64: 2506-2512).
Краткое изложение сущности изобретения
[0011] Как указано и полностью описано, в настоящем изобретении предложены способы продуцирования in vitro функциональных бета-клеток (функциональных панкреатических бета-клеток) и популяций клеток, полученных в результате дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток. В частности, изобретение относится к генерации функциональных панкреатических бета-клеток (инсулинпродуцирующих клеток) или популяции функциональных бета-клеток, которые демонстрируют реакцию в виде митохондриального дыхания/активности и реакцию в виде двухфазной секреции инсулина.
[0012] Один аспект настоящего изобретения представляет собой способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в функциональные бета-клетки. Конкретный аспект настоящего изобретения представляет собой способ дифференцировки панкреатических энтодермальных клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1. В вариантах осуществления способ включает культивирование панкреатических эндокринных клеток в культуральной среде в которую добавили одну или более малых молекул из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568.
[0013] Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой полученную in vitro популяцию функциональных панкреатических бета-клеток, экспрессирующих одногормональный инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA и полученных путем дифференцировки панкреатических эндокринных клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления популяция функциональных бета-клеток также совместно экспрессирует UCN3 и SLC2A1. В вариантах осуществления увеличивают экспрессию MAFA по сравнению с незрелыми бета-клетками. В вариантах осуществления популяцию функциональных бета-клеток in vitro получают путем культивирования панкреатических эндокринных клеток в среде, в которую добавили одну или более малых молекул из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568.
[0014] Дополнительный вариант осуществления изобретения представляет собой способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A, включающий стадии дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки; и дифференцировки панкреатических эндокринных клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1. В вариантах осуществления увеличивают экспрессию MAFA по сравнению с незрелыми бета-клетками. В вариантах осуществления способ включает культивирование панкреатических эндокринных клеток в культуральной среде в которую добавили одну или более малых молекул из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568.
[0015] В каждом из вариантов осуществления, описанных выше, в культуральную среду дополнительно добавляют одно или более из ZM447439, гепарина, N-ацетилцистеина и состава I. В указанных выше вариантах осуществления в культуральную среду дополнительно добавляют один или более из T3, T4 и их аналога. В указанных выше вариантах осуществления в культуральную среду добавляют ингибитор ALK5. В некоторых указанных выше вариантах осуществления культуральная среда не содержит ингибитора ALK5. В указанных выше вариантах осуществления изобретения в культуральную среду добавляют AZT или DEZA. В некоторых указанных выше вариантах осуществления в культуральную среду добавляют AZT и DEZA.
[0016] В вариантах осуществления изобретения, описанных выше, в среду дополнительно добавляют ингибитор гамма-секретазы. В некоторых из указанных выше вариантов осуществления в культуральную среду добавляют T3. В некоторых из вариантов осуществления T3 относится к диапазону от 1 нМ до 1 мкМ. В конкретных вариантах осуществления T3 относится к диапазону от 1 нМ до 100 нМ.
[0017] Дополнительно в вариантах осуществления изобретения, описанных выше, функциональные бета-клетки получают посредством поэтапной дифференцировки одной или более из клеток, выбранных из группы: клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы; клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки; клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки; клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток; панкреатические эндокринные клетки-предшественники; и клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для незрелых бета-клеток (панкреатических эндокринных клеток).
[0018] В каждом из вариантов осуществления, описанных выше, способ включает культивирование клеток на поверхности раздела воздух-жидкость. В некоторых вариантах осуществления, описанных выше, способ включает культивирование клеток в суспензии, например скоплений клеток в суспензии.
[0019] В указанных выше вариантах осуществления дифференцированная функциональная бета-клетка экспрессирует MAFA на более высоком уровне, чем незрелая бета-клетка. В вариантах осуществления дифференцированная функциональная бета-клетка экспрессирует UCN3 на более высоком уровне, чем незрелая бета-клетка. В некоторых указанных выше вариантах осуществления повышают экспрессию MAFA и UCN3 по сравнению с экспрессией в незрелой бета-клетке.
[0020] В указанных выше вариантах осуществления изобретения популяция функциональных бета-клеток показывает стимулированную глюкозой секрецию инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание. В описанных выше вариантах осуществления стимулированная глюкозой секреция инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание аналогичны подобным в человеческих островковых клетках. В вариантах осуществления изобретения, описанных выше, функциональные бета-клетки секретируют инсулин во множестве фаз.
[0021] В вариантах осуществления, глюкозозависимое митохондриальное дыхание имеет максимальную реакцию в виде увеличения скорости потребления кислорода после стимуляции глюкозой в диапазоне от около 20% до около 80% сверх исходной скорости потребления кислорода (OCR). В вариантах осуществления реакция в виде увеличения скорости потребления кислорода происходила через по меньшей мере 15 минут после стимуляции глюкозой.
[0022] В указанных выше вариантах осуществления стимулированная глюкозой секреция инсулина представляет собой быструю двухфазную секрецию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой. В вариантах осуществления в первой фазе двухфазной секреции инсулина наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере четырех раз до по меньшей мере восьми раз по сравнению с секрецией на исходном уровне, а во второй фазе двухфазной секреции инсулина наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере двух до по меньшей мере четырех раз по сравнению с секрецией на исходном уровне. В вариантах осуществления секреция инсулина происходит в интервале от по меньшей мере пяти минут до по меньшей мере десяти минут после стимуляции глюкозой.
[0023] В некоторых вариантах осуществления способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток включает стадии: дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы («клетки стадии 1»); дифференцировки клеток стадии 1 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки («клетки стадии 2»); дифференцировки клеток стадии 2 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки («клетки стадии 3»); дифференцировки клеток стадии 3 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток («клетки стадии 4»); дифференцировки клеток стадии 4 в панкреатические энтодермальные/эндокринные клетки-предшественники (клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для одной или более из панкреатических энтодермальных клеток и панкреатических эндокринных клеток-предшественников; «стадия 5»); дифференцировки клеток стадии 5 в незрелые бета-клетки (панкреатические эндокринные клетки; «стадия 6»); и дифференцировки клеток стадии 6 в функциональные бета-клетки (панкреатические эндокринные клетки; «стадия 7»).
[0024] В вариантах осуществления способ дифференцировки включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки стадии 1 путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, в которую добавили соединение MCX и GDF-8.
[0025] В вариантах осуществления способ включает дифференцировку клеток стадии 1 в клетки стадии 2 путем культивирования клеток стадии 1 в среде, в которую добавили FGF7 и аскорбиновую кислоту.
[0026] В вариантах осуществления способ включает дифференцировку клеток стадии 2 в клетки стадии 3 путем культивирования клеток стадии 2 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
[0027] В вариантах осуществления способ включает дифференцировку клеток стадии 3 в клетки стадии 4 путем культивирования клеток стадии 3 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
[0028] В вариантах осуществления способ включает дифференцировку клеток стадии 4 в клетки стадии 5 путем культивирования клеток стадии 4 в среде, в которую добавили SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP, аскорбиновую кислоту. В вариантах осуществления в среду дополнительно добавляют один или более из T3, T4 или их аналога. В некоторых вариантах осуществления в среду дополнительно добавляют ингибитор ALK5.
[0029] В вариантах осуществления способ включает культивирование клеток стадии 5 в панкреатические эндокринные клетки путем культивирования клеток стадии 5 в среде, в которую добавляют ингибитор BMP, аскорбиновую кислоту, один или более из T3, T4 или их аналога. В вариантах осуществления в среду добавляют T3. В некоторых вариантах осуществления T3 относится к диапазону от 1 нМ до 1 мкМ. В определенных вариантах осуществления T3 относится к диапазону от 1нМ до 100нМ. В некоторых вариантах осуществления в среду дополнительно добавляют ингибитор ALK 5. В других вариантах осуществления в культуральную среду не добавляют ингибитор ALK5. В некоторых вариантах осуществления в среду дополнительно добавляют ингибитор гамма-секретазы. В определенных вариантах осуществления в среду добавляют одно или более из ZM447439, гепарина, N-ацетилцистеина и состава I. В вариантах осуществления в культуральную среду добавляют AZT или DEZA. В некоторых вариантах осуществления в культуральную среду добавляют AZT и DEZA. В вариантах осуществления способ включает культивирование клеток на поверхности раздела воздух-жидкость. В некоторых вариантах осуществления способ включает культивирование клеток в суспензии, например скоплений клеток в суспензии.
[0030] В каждом из вариантов осуществления способа дифференцировки, описанных выше, панкреатические энтодермальные клетки («клетки стадии 4») можно подвергать криоконсервации. В некоторых вариантах осуществления способ дифференцировки панкреатических энтодермальных клеток в панкреатические эндокринные клетки-предшественники включает культивирование криоконсервированных клеток.
[0031] В каждом из описанных выше вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки могут представлять собой человеческие плюрипотентные стволовые клетки, такие как человеческие эмбриональные стволовые клетки. В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки могут представлять собой человеческие клетки H1 или H9.
[0032] Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A, включающий: (a) дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы, и полученные путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, в которую добавили активин А и WNT3A; (b) дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы, в незрелые бета-клетки; и (c) дифференцировку незрелых бета-клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1, путем культивирования незрелых бета-клеток в среде, в которую добавили одно или более из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568. Плюрипотентные стволовые клетки, использованные в данном способе, могут представлять собой человеческие плюрипотентные стволовые клетки, такие как человеческие эмбриональные стволовые клетки. В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки представляют собой человеческие клетки CyT49.
[0033] Данные функциональные бета-клетки могут иметь глюкозозависимое митохондриальное дыхание или стимулируемую глюкозой секрецию инсулина этих функциональных бета-клеток как в человеческих островковых клетках. Функциональные бета-клетки могут также секретировать инсулин во множестве фаз.
[0034] В определенных вариантах осуществления этого способа культуральная среда не содержит ингибитора ALK5. В некоторых вариантах осуществления в культуральную среду дополнительно добавляют гепарин, N-ацетилцистеин, состав I и один или более из T3, T4 или их аналога. В других вариантах осуществления в культуральную среду добавляют T3. В альтернативных вариантах осуществления в среду добавляют ZM447439, гепарин, N-ацетилцистеин и один или более из T3, T4 или их аналога, и она не содержит ингибитора ALK5. В среду можно добавлять T3, AZT или DEZA.
[0035] Способ может включать культивирование незрелых бета-клеток на поверхности раздела воздух-жидкость, в скоплениях в суспензии, в роллерных флаконах или на микроносителях. В одном варианте осуществления способ включает в себя культивирование незрелых бета-клеток в роллерных флаконах. В другом варианте осуществления способ включает в себя культивирование незрелых бета-клеток в роллерных флаконах на микроносителях.
[0036] Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в незрелые бета-клетки в способе может включать в себя: (a) дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы («клетка стадии 1»), путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, в которую добавили активин А и WNT3A; (b) дифференцировку клеток стадии 1 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки («клетки стадии 2»); (c) дифференцировку клеток стадии 2 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки («клетки стадии 3»); (d) дифференцировку клеток стадии 3 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток («клетки стадии 4»); (e) дифференцировку клеток стадии 4 в панкреатические эндокринные клетки-предшественники («стадия 5»); и (f) дифференцировку клеток стадии 5 в незрелые бета-клетки. В определенных вариантах осуществления стадии e. и f. включают в себя культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость, в скоплениях в суспензии, в роллерных флаконах или на микроносителях. В других вариантах осуществления стадии e. и f. включают в себя культивирование клеток в роллерных флаконах. В еще одних вариантах осуществления стадии e. и f. включают в себя культивирование незрелых бета-клеток в роллерных флаконах на микроносителях.
[0037] В определенных вариантах осуществления способ включает дифференцировку клеток стадии 1 в клетки стадии 2 путем культивирования клеток стадии 1 в среде, в которую добавили FGF7 и аскорбиновую кислоту. В других вариантах осуществления способ также включает дифференцировку клеток стадии 2 в клетки стадии 3 путем культивирования клеток стадии 2 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC и аскорбиновую кислоту. В определенных вариантах осуществления в среде отсутствует ингибитор BMP. В еще одном варианте осуществления способ включает дифференцировку клеток стадии 3 в клетки стадии 4 путем культивирования клеток стадии 3 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC и аскорбиновую кислоту. Кроме того, в определенных вариантах осуществления в среде отсутствует ингибитор BMP.
[0038] В другом варианте осуществления способ включает дифференцировку клеток стадии 4 в клетки стадии 5 путем культивирования клеток стадии 4 в среде, в которую добавили SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту. В среду можно дополнительно добавлять один или более из T3, T4 или их аналога.
[0039] В альтернативном варианте осуществления способ включает культивирование клеток стадии 5 в незрелые бета-клетки путем культивирования клеток стадии 5 в среде, в которую добавили ингибитор BMP, аскорбиновую кислоту, один или более из T3, T4 или их аналога. В среду можно дополнительно добавлять ингибитор ALK 5 или ингибитор гамма-секретазы. Способ может также включать дифференцировку незрелых бета-клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A, путем культивирования незрелых бета-клеток в среде, не содержащей ингибитор ALK5 и в которую добавили ZM447439, AZT, N-ацетилцистеин, DEZA, состав I и один или более из Т3, Т4 или их аналога.
[0040] В каждом из вариантов осуществления способа дифференцировки, описанных выше, культура может представлять собой суспензионную культуру или суспензионную культуру клеточных агрегатов. В определенных вариантах осуществления можно выполнять культивирование в роллерных флаконах, на микроносителях или на микроносителях в роллерных флаконах.
Краткое описание графических материалов
[0041] На ФИГ. 1A-1H показаны результаты скрининга малых молекул, которые усиливают экспрессию MAFA или UCN3 на стадии 7. На ФИГ. 1A-1D показано, что экспрессия MAFA на стадии 7 была значительно усилена по сравнению с S6D7 или необработанными или обработанными DMSO культурами на стадии 7 после лечения UNC0638 (селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a и GLP), UNC0646 (мощный и селективный ингибитор G9a/GLP), UNC0642 (мощный и селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a и GLP), TC-E5003 (селективный ингибитор метилтрансферазы аргининов PRMT1), A366 (мощный и селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a/GLP), PF03814735 (ингибитор киназы Aurora A и B), ZM447439 (ингибирует киназу Aurora B), дигидрохлорид SB747651A (мощный ингибитор MSK1; кроме того, ингибирует другие киназы группы AGC), PFI1 (ингибитор бромодомена BET), LY303511 (ингибитор BRD2, BRD3 и BRD4), MS436 (мощный и селективный ингибитор бромодомена BRD4) и MC1568 (селективно ингибирует HDAC класса II (IIa)). На ФИГ. 1E-1H показано, что экспрессия UCN3 на стадии 7 увеличена по сравнению с S6D7 или необработанными или обработанными DMSO культурами на стадии 7 после добавления 5-азацитидина (AZT) (ингибитор ДНК-метилтрансферазы), пироксамида (ингибитор гистондеацетилазы) и CI994 (ингибитор гистондеацетилазы). Все условия S7D7; Скопления на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI).
[0042] На ФИГ. 2A и 2B показана надежность выбранных малых молекул в качестве активаторов MAFA или UCN3, так как их эффект сохраняли при различных протоколах подготовки стадии 7. Обнаружено, что 3-деазанепланоцин А (DEZA) является эффективным активатором MAFA, но не UCN3 (ФИГ. 2A). Подтверждено, что AZT является активатором UCN3, но не MAFA во время стадии 7 (ФИГ. 2B). Все условия S7D7; Скопления на ALI.
[0043] На ФИГ. 3A-3M показано увеличение генной экспрессии после семи дней улучшенной подготовки стадии 7 группы маркеров созревания в скоплениях клеток ALI до уровней, наблюдаемых в человеческих островках. Улучшения, использованные во время дифференцировки стадии 7, включают в себя: (i) удаление ингибитора II ALK5; (ii) снижение концентрации T3; (iii) добавление DEZA; (iv) добавление AZT; (v) добавление ZM; (vi) снижение концентрации глюкозы до 5,56 мМ; и (vii) добавление определенного коктейля витаминов, заменимых аминокислот, липидов, пирувата натрия и следовых элементов (состав I - таблица XII). На ФИГ. 3A показано, что INHBB был выше уровня экспрессии, наблюдаемого в человеческих островках, в условиях использования ингибитора II ALK5, и удаление ингибитора ALK5 в отсутствии или в присутствии AZT/DEZA уменьшало INHBB до уровней, наблюдаемых в человеческих островках. На ФИГ. 3B показано увеличение экспрессии INHA до уровней человеческих островков в скоплениях на ALI при удалении ингибитора II ALK5. Хотя экспрессию MAFA и SLC2A1, показанную на ФИГ. 3C и 3D соответственно, уменьшают при удалении ингибитора II ALK5, добавление AZT/DEZA восстанавливает экспрессию MAFA и SLC2A1 до уровней человеческих островков. Экспрессию UCN3 (ФИГ. 3E), G6PC2 (каталитическая субъединица 2 глюкозо-6-фосфатазы; ФИГ. 3F) и PDK1 (киназа 1 пируватдегидрогеназы; ФИГ. 3G) увеличивали до уровней, наблюдаемых в человеческих островках или превышающих их, при добавлении AZT/DEZA и удалении ингибитора II ALK5 в скоплениях на ALI. Экспрессию INS (инсулин; ФИГ. 3H), GJD2 (белок межклеточных щелевых контактов, дельта 2; также CX36/коннексин 36; ФИГ. 3I), SIX2 (гомеобокс SIX 2; ФИГ. 3J) и PDX1 (ФИГ. 3K) постепенно скачкообразно увеличивали сначала после удаления ингибитора II ALK5, а затем после добавления AZT/DEZA. Экспрессия NKX6.1 (ФИГ. 3L) и GLP1R (рецептор глюкагоноподобного пептида 1; ФИГ. 3M) существенно не изменялась при различных условиях, но их экспрессия в скоплениях на ALI постоянно находилась на уровнях, наблюдаемых в человеческих островках или превышающих их. Все условия S7D7; Скопления на ALI.
[0044] На ФИГ. 4A-4E показана генерация клеток C-ПЕПТИДА, в скоплениях клеток ALI, которые на основании присутствия белка совместно экспрессируют маркеры созревания: PDX1 (ФИГ. 4A), NKX6.1 (ФИГ. 4B), MAFA (ФИГ. 4C), SLC2A1 (ФИГ. 4D) и UCN3 (ФИГ. 4E) на S7D7. Типовое окрашивание человеческих островков показано в левой колонке. Условие без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR001 показано в средней колонке. Условие без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR004 показано в правой колонке. Все условия S7D7; Скопления на ALI.
[0045] На ФИГ. 5A-5F показана генерация клеток C-ПЕПТИДА в S7D7, которые показывают схожую с человеческими островками кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания на ALI, в особенности при специфичных для стадии 7 условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT, DEZA, FI, BLAR001». На ФИГ. 5A показано, что человеческие островки быстро реагировали на высокую концентрацию D-глюкозы, как видно на основании OCR, равной 123,3% ± 12,92 по сравнению с исходным уровнем через 15 минут после инъекции («п/и»), и сохраняли высокую OCR во времени (131,5% ± 11,32; 72 мин п/и). С другой стороны, в скоплениях на ALI S6D7, которые обогащали незрелыми С-ПЕПТИДположительными клетками, не было стремительной реакции OCR на высокую концентрацию D-глюкозы (104,4% ± 3,37; 15 мин п/и), и они показывают относительно слабую реакцию OCR во времени (113,3% ± 4,51; 72 мин п/и). На ФИГ. 5D показано, что внутри группы скопления на ALI S7D7 только при условии «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR001» наблюдалась схожая с человеческими островками кинетика глюкозозависимого митохондриального дыхания (112,4% ± 3,25-15 мин п/и; 129,5% ± 3,78-72 мин п/и). Условия скопления на ALI S7D7, при которых кинетика глюкозозависимого митохондриального дыхания выполнена с возможностью неотличимости от незрелых скоплений на ALI S6D7: «ALK5, T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR001» (100,3% ± 4,04-15 мин п/и; 107,8% ± 6,51 -72 мин п/и) (ФИГ. 5B); «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR001» (96,9% ± 3,06-15 мин п/и; 109,0% ± 4,58-72 мин п/и) (ФИГ. 5C); «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR004» (103,4% ± 4,76-15 мин п/и; 113,6% ± 6,72-72 мин п/и) (ФИГ. 5E); и «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR004» (102,1% ± 4,04-15 мин п/и; 112,7% ± 3,38-72 мин п/и) (ФИГ. 5F).
[0046] На ФИГ. 6A-6L показаны скопления клеток Aggrewell™, дифференцированные в суспензионной культуре до незрелых панкреатических бета-клеток. На ФИГ. 6A показана процедура, с помощью которой (i) свежий монослой S4D3 или криоконсервированные клетки S4D3 собирали (ii) посредством способа Aggrewell™ в (iii) скопления клеток. На ФИГ. 6B показано, что в скоплениях S4D5 Aggrewell™ обнаружили высокое содержание белка факторов транскрипции (ТФ) панкреатической энтодермы PDX1 (сверху слева) и NKX6.1 (сверху посередине), но низкое содержание белка ТФ эндокринной ткани NEUROD1 (сверху справа); колебание размещающих линию дифференцировки непанкреатической энтодермы ТФ SOX2 (снизу посередине) и CDX2 (снизу справа). На ФИГ. 6C цитометрия посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) показала, что 99,3±0,1% клеток были PDX1+ (слева), 84,4±0,1% - NKX6.1+ (посередине), но 2,2±0,4% - NKX6.1+ NEUROD1+ (справа) или 1,35±0,55% - NKX6.1+ CHGA+ (посередине) (скопления Aggrewell™ S4DS). На ФИГ. 6D показано сохранение устойчивых характеристик панкреатической энтодермы в скоплениях Aggrewell™ S4D4, полученных из криоконсервированных клеток S4D3, за счет сохранения высокой генной экспрессии PDX1 (сверху слева), NKX6.1 (сверху справа) и низкой экспрессии NEUROD1 (снизу слева) и CHGA (снизу справа) по сравнению с монослоем S4D3. На ФИГ. 6E показана процедура, с помощью которой (i) свежий монослой S4D3 или криоконсервированные клетки S4D3 собирали (ii) посредством способа Aggrewell™ в скопления клеток и (iii) дифференцировали в суспензионной культуре до (iv) незрелых бета-клеток посредством S6D6. Анализ FACS скоплений Aggrewell™ S6D6 показывает устойчивый профиль белка незрелых бета-клеток, так как 78,5±1,87% клеток были NKX6.1+ CHGA+ (слева, ФИГ. 6F), 73,6±4,34% - NKX6.1+ NEUROD1+ (справа, ФИГ. 6F) и 38,4±5,96% - NKX6.1+ ИНСУЛИН+ (слева, ФИГ. 6G). Большая часть ИНСУЛИН-положительной популяции (50,2±6,92% от общего числа клеток были ИНСУЛИН+) была NKX6.1+ (слева, ФИГ. 6G) и не ГЛЮКАГОН-положительной (7,43±1,49% ИНСУЛИН+ ГЛЮКАГОН+; (справа, ФИГ. 6G). На ФИГ. 6H показано посредством IF, что в S6D6 большинство C-ПЕПТИД-положительных клеток в скоплениях Aggrewell™ были как PDX1+ (слева), так и NKX6.1+ (посередине). На ФИГ. 6I показано, что присутствие белка ТФ привратника созревания MAFA (справа) уже легко обнаруживали в S6D6 и его экспрессировали на большем уровне, чем в предыдущих скоплениях на ALI в S6D6-S6D7 (Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133) (см. также ФИГ. 3C для сравнения с ALI S7D7). Экспрессия ИНСУЛИНА (ФИГ. 6J), PDX1 (ФИГ. 6K) и NKX6.1 (ФИГ. 6L) была выше, чем в предыдущих скоплениях на ALI в S6D6-S6D7.
[0047] На ФИГ. 7A-7M показана генерация скоплений S7D7 Aggrewell™ с помощью суспензионной культуры для созревания панкреатических бета-клеток. На ФИГ. 7A показана процедура, с помощью которой (i) свежий монослой S4D3 или криосохраненные клетки собирали в скопления Aggrewell™, подготовленные в суспензионной культуре посредством прохождения через (ii и iii) стадии 5, 6 и 7 для генерации (iv) скоплений Aggrewell™ S7D7. Скопления Aggrewell™ S7D7, культивированные в условиях «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC DEZA AZT FI BLAR001» во время стадии 7, сохраняли профиль белка бета-клеток на исходном уровне (ФИГ. 7B-7C). 89% клеток были NKX6.1+ CHGA+ (слева, ФИГ. 7B), 77,7% - NKX6.1+ NEUROD1+ (справа, ФИГ. 7B) и 40,8% - NKX6.1+ ИНСУЛИН+ (слева, ФИГ. 7C). Большая часть ИНСУЛИН-положительной популяции (46,4% от общего числа клеток были ИНСУЛИН+) была NKX6.1+ (слева, ФИГ. 7C) и не ГЛЮКАГОН-положительной (3,9% ИНСУЛИН+ ГЛЮКАГОН+; (справа, ФИГ. 7C). Генная экспрессия маркеров созревания MAFA (ФИГ. 7D), UCN3 (ФИГ. 7E), SLC2A1 (ФИГ. 7F), G6PC2 (ФИГ. 7G), ИНСУЛИН (ФИГ. 7H) и NKX6.1 (ФИГ. 7I) находилась на уровнях человеческих островков в скоплениях S7D7 Aggrewell™, подготовленных в условиях стадии 7 «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC DEZA AZT FI BLAR001 или BLAR004», или превышала их. Уровни экспрессии S7D7 маркера созревания, такого как MAFA (ФИГ. 3C), G2PC2 (ФИГ. 3F), ИНСУЛИН (ФИГ. 3H) и NKX6.1 (ФИГ. 3L), гораздо выше в Aggrewell™ («БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC DEZA AZT FI BLAR001 или BLAR004», чем в скоплениях на ALI. На ФИГ. 7J-7M показано, что добавление DEZA и AZT к условиям стадии 7 «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC FI BLAR004» приводило к генерации большого числа не продуцирующих ГЛЮКАГОН (ФИГ. 7J; снизу справа) клеток С-ПЕПТИДА, которые на основании присутствия белка совместно экспрессировали PDX1 в S7D7 (ФИГ. 7J; снизу слева), NKX6.1 (ФИГ. 7J; снизу посередине), MAFA (ФИГ. 7K; снизу слева), UCN3 (ФИГ. 7K; снизу посередине) и SLC2A1 (ФИГ. 7K; снизу справа). На ФИГ. 7L-7M показана генерация посредством обработки в условиях «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC FI BLAR004» стадии 7 клеток С-ПЕПТИДА, которые на основании присутствия белка совместно экспрессировали маркеры созревания S7D7: PDX1 (ФИГ. 7L; снизу слева), NKX6.1 (ФИГ. 7L; снизу посередине), MAFA (ФИГ. 7M; снизу слева), SLC2A1 (ФИГ. 7M; снизу справа), но не ГЛЮКАГОН (ФИГ. 7L; снизу справа) или UCN3 (ФИГ. 7M; снизу посередине).
[0048] На ФИГ. 8A-8I показана генерация зрелых панкреатических бета-клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, с помощью суспензионной культуры, со схожей с человеческими островками кинетикой глюкозозависимого митохондриального дыхания и GSIS. На ФИГ. 8A-8B показано, что человеческие островковые клетки и быстро реагировали на высокую концентрацию D-глюкозы, как видно на основании OCR, равной 123,3% ± 12,92 по сравнению с исходным уровнем через 15 минут п/и, и сохраняли высокую OCR во времени (131,5% ± 11,32; 72 мин п/и). В скоплениях на ALI S6D7, которые обогащали незрелыми С-ПЕПТИД-положительными клетками, не было стремительной реакции OCR на высокую концентрацию D-глюкозы (104,4% ± 3,37; 15 мин п/и), и они показывают относительно слабую реакцию OCR во времени (113,3% ± 4,51; 72 мин п/и). Схожую с человеческими островками кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания наблюдали в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR004» в S7D13 в контексте скоплений Aggrewell™ в суспензии (110,7% ± 2,46-15 мин п/и; 125,9% ± 2,27-72 мин п/и) (ФИГ. 8A). Скопления Aggrewell™ в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT, DEZA, FI, BLAR004» в суспензии потребляли больше кислорода в ответ на стимуляцию высокой концентрацией глюкозы, чем человеческие островки (162,0% ± 11,51-15 мин п/и; 177,1% ± 0,99-72 мин п/и) (ФИГ. 8B). На ФИГ. 8C показано, что зрелые бета-клетки внутри человеческих островков показали способность к осуществлению множества циклов быстрой двухфазной секреции инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой. Человеческие островки продемонстрировали способность к осуществлению множества циклов «включения-выключения» секреции инсулина. Все исследованные условия показывали сильную реакцию в виде секреции инсулина на KCl (ФИГ. 8C-8I). Добавление эксендина-4 не увеличивало амплитуду реакции в виде GSIS в показанных человеческих островках, но было включено для сравнения с профилями GSIS ALI или Aggrewell™ (ФИГ. 8D). Скопления на ALI S7D21, обработанные во время стадии 7 в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC FI», либо в BLAR001 (ФИГ. 8E), либо в BLAR004 (ФИГ. 8F), показали первую (~4-10-кратное увеличение в первой фазе первой реакции в виде GSIS), но не вторую, и относительно медленную реакцию в виде двухфазной GSIS. Скопления на ALI не были способны блокировать вторую фазу секреции инсулина при реперфузии 300 млмМ D-глюкозы после стимуляции. Скопления S7D14 Aggrewell™, обработанные во время стадии 7 в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI BLAR004», показали сильную первую двухфазную GSIS (~5-кратное увеличение в первую фазу первой реакции в виде GSIS), с последующими способностью полностью блокировать GSIS и слабой второй монофазной реакцией (ФИГ. 8G). После добавления DEZA и AZT к условиям «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI BLAR004» скопления S7D14 Aggrewell™ показали множество циклов схожей с человеческими островками двухфазной GSIS (~5-7-кратное увеличение в первой фазе первой реакции в виде GSIS) и способность полностью блокировать GSIS между повышениями концентрации глюкозы (ФИГ. 8H-8I).
[0049] На ФИГ. 9A-9Q показана генерация панкреатической энтодермы, полученной из CyT49 hESC, во множестве типов суспензионной культуры. На ФИГ. 9A показан постадийный протокол дифференцировки для генерации панкреатической энтодермы, полученной из CyT49 hESC. Для каждой стадии указаны важные факторы транскрипции (ФТ). На ФИГ. 9B показано число полученных клеток S4D3 по отношению к исходному числу hESC в миллионах клеток на мл. На ФИГ. 9C показаны выходы S4D3 для 0,1 фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) Mini и 0,5 фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) Mini. Например, для суспензионной культуры типа 0,5 PBS получено 4,08±0,854 клеток на одну клетку hESC, что существенно больше, чем PEC-01 д12 (2,23±0,090). На ФИГ. 9C показано приблизительно 6-кратное увеличение общего выхода клеток S4D3 (в миллионах клеток) при увеличении объема среды со 100мл (0,1 PBS) до 500мл (0,5 PBS). На ФИГ. 9D и 9E показаны фазово-контрастные изображения и диаметр (в мкм) агрегатов S4D3 из суспензионных культур следующих типов: 2-литровый роллерный флакон (ФИГ. 9D справа), 0,1 PBS (ФИГ. 9E посередине) и 0,5 PBS (ФИГ. 9E справа); полученные в 2-литровом роллерном флаконе PEC-01 д12 (ФИГ. 9D слева) и PEC-01 д15 (ФИГ. 9E слева) показаны в качестве примеров предшествующего уровня техники. Агрегаты S4D3, полученные в суспензионной культуре 0,1 PBS и 0,5 PBS, единообразно меньше, чем агрегаты, полученные в роллерном флаконе. На ФИГ. 9F-9L показана генная экспрессия для агрегатов S4D3. Генная экспрессия NKX6.1 (ФИГ. 9F), PTF1A (ФИГ. 9G), PDX1 (ФИГ. 9H), SOX2 (ФИГ. 9I), CDX2 (ФИГ. 9J), NEUROD1 (ФИГ. 9K) и CHGA (ФИГ. 9L) по отношению к CyT49 hESC показана для агрегатов S4D3, полученных в 2-литровом роллерном флаконе, 0,1 PBS и 0,5 PBS и PEC-01 д15, полученных в 2-литровом роллерном флаконе. На ФИГ. 9F-9L показана устойчивая индукция генной программы панкреатической энтодермы и одновременное ограничение экспрессии альтернативных линий дифференцировки энтодермы и ранней панкреатической эндокринной дифференцировки по отношению к PEC-01 д15 (предшествующий уровень техники). На ФИГ. 9N-9P показана сильная белковая колокализация маркеров панкреатической энтодермы (например, PDX1, NKX6.1), но не белковых маркеров альтернативных линий дифференцировки энтодермы (например, SOX2, CDX2) и маркеров эндокринной дифференцировки (например, CHGA) для агрегатов S4D3, полученных посредством нового протокола в 2-литровом роллерном флаконе (ФИГ. 9N), 0,1 PBS (ФИГ. 9O) и 0,5 PBS (ФИГ. 9P), по отношению к агрегатам PEC-01 д12 (ФИГ. 9M), полученных в 2-литровом роллерном флаконе, и агрегатам PEC-01 д15 (ФИГ. 9Q).
[0050] На Фиг. 10A-10AB показана генерация инсулинпродуцирующих клеток, полученных из CyT49 hESC, во множестве типов суспензионной культуры. На ФИГ. 10A показан описанный постадийный протокол дифференцировки для генерации нефункциональных инсулинпродуцирующих клеток, полученных из CyT49 hESC. Для каждой стадии указаны важные факторы транскрипции (ФТ), начиная с исходного числа клеток, полученных из S4D3 CyT49 hESC в условиях стадии 5. На ФИГ. 10B показано число полученных клеток S6D7 по отношению к исходному числу hESC в миллионах клеток на мл. Например, для суспензионной культуры типа 0,5 PBS, в которой используют 2,4±0,169 клеток S6D7, полученных по новому протоколу, на одну клетку hESC. На ФИГ. 1°C показан выход S6D7 из культур 0,1 PBS и 0,5 PBS. На ФИГ. 1°C показано приблизительно 7,5-кратное увеличение общего выхода клеток S6D7 (в миллионах клеток) при увеличении объема среды со 100мл (0,1 PBS) до 500мл (0,5 PBS). На ФИГ. 10D показаны фазово-контрастные изображения агрегатов S5D3 из суспензионных культур типа 2-литрового роллерного флакона (ФИГ. 10D слева), 0,1 PBS (ФИГ. 10D посередине) и 0,5 PBS (ФИГ. 10D справа). На ФИГ. 10E показаны фазово-контрастные изображения агрегатов S6D7 из суспензионных культур типа 2-литрового роллерного флакона (ФИГ. 10E слева), 0,1 PBS (ФИГ. 10E посередине) и 0,5 PBS (ФИГ. 10E справа) с указанием диаметра агрегата под каждой фотографией. На ФИГ. 10F показаны фазово-контрастные изображения агрегатов S7D13 из суспензионных культур типа 2-литрового роллерного флакона (ФИГ. 10F слева) и 0,1 PBS (ФИГ. 10F справа). Суспензионная культура 0,1 PBS и 0,5 PBS поддерживает плотную архитектуру агрегатов в течение стадии 7. С другой стороны, агрегаты стадии 6-7 распадаются с образованием клеточных пластов в суспензионной культуре в 2-литровом роллерном флаконе. На ФИГ. 10G-10N показывают генные экспрессии в S4D3, S5D3, S6D7 и S7D7. На ФИГ. 10G-10N показано, что способы получения суспензионных культур с использованием нового протокола индуцировали появление устойчивой генной сигнатуры в панкреатической моногормональной инсулинпродуцирующей клетке; Способы получения суспензионной культуры в 2-литровом роллерном флаконе, 0,1PBS и 0,5 PBS приблизительно одинаково индуцировали экспрессию PDX1 (ФИГ. 10G), NKX6.1 (ФИГ. 10H), CHGA (ФИГ. 10I), NEUROD1 (ФИГ. 10J), NGN3 (ФИГ. 10K), ИНСУЛИНА (ФИГ. 10L), MAFA (ФИГ. 10M) и ГЛЮКАГОНА (ФИГ. 10N). На ФИГ. 10O-10T показано постадийное формирование белковой колокализации маркеров инсулинпродуцирующих клеток, таких как CHGA, NKX6.1, ИНСУЛИН, но не ГЛЮКАГОН, на S5D3 в 0,5 PBS (ФИГ. 10O-10P), на S6D7 в 2-литровом роллерном флаконе (ФИГ. 10Q), на S6D7 в 0,1 PBS (ФИГ. 10R), на S7D13 в 2-литровом роллерном флаконе (ФИГ. 10S) и на S7D14 в 0,1 PBS (ФИГ. 10T). На ФИГ. 10U показана частота встречаемости клеток NKX6.1, совместно экспрессирующих CHGA, ИНСУЛИН или ГЛЮКАГОН, а также частота встречаемости клеток, совместно экспрессирующих ИНСУЛИН и ГЛЮКАГОН, среди полученных из PEC-01 клеток S6D7. На ФИГ. 10U показана большая распространенность полигормональных инсулинпродуцирующих клеток и, следовательно, низкие количества моногормональных инсулин-положительных клеток в полученных из PEC-01 агрегатах S6D7 в 2-литровом роллерном флаконе. На ФИГ. 10V показана колокализация ГЛЮКАГОНА и NKX6.1 для: полученных из PEC-01 клеток S6D7; S7D14 в 0,1PBS и S7D13 в роллерном флаконе (РФ). На ФИГ. 10V показано, что все ИНСУЛИН+ ГЛЮКАГОН+ клетки являются отрицательными в отношении присутствия NKX6.1 во всех исследованных условиях (полученные из PEC-01 клетки S6D7; S7D14 в 0,1PBS и S7D13 в РФ с использованием нового протокола). На ФИГ. 10W-10AB показана белковая колокализация маркеров инсулинпродуцирующих клеток, таких как СИНАПТОФИЗИН (панэндокринный маркер), NKX6.1, ИНСУЛИН и MAFA на S6D7 в 0,1 PBS (ФИГ. 10W-10X), на S7D16 в 0,1 PBS (ФИГ. 10Y-10Z) и на S7D23 в 2-литровом роллерном флаконе (ФИГ. 10AA-10AB). После проведения стадии 7 наблюдали устойчивую белковую колокализацию СИНАПТОФИЗИНА, NKX6.1, ИНСУЛИНА и MAFA, характерную для нефункциональных моногормональных инсулинпродуцирующих клеток.
Подробное описание изобретения
[0051] Следующее подробное описание изобретения будет более понятно при изучении вместе с приложенными фигурами. Фигуры обеспечены для иллюстрации определенных вариантов осуществления изобретения. Однако изобретение не ограничивают приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами. Для ясности описания, а не в целях ограничения, подробное описание изобретения разделено на подразделы, описывающие или иллюстрирующие конкретные элементы, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
A. Определения
[0052] Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, образованные со способностью, на одноклеточном уровне, к самообновлению и дифференцировке. Стволовые клетки могут продуцировать клетки-потомки, включая самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцировки из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы). Стволовые клетки также дают начало тканям множества зародышевых листков после трансплантации и после инъекции в бластоцисты и по существу способствуют образованию большинства, если не всех, тканей. Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития. Плюрипотентные стволовые клетки выполнены с возможностью обеспечения зарождения всех видов эмбриональных клеток.
[0053] Дифференцировка представляет собой процесс, посредством которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает признаки специализированной клетки, например нервной клетки или мышечной клетки. Дифференцированная клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в пределах клеточной линии дифференцировки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки относится к клетке, дошедшей в процессе дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться в конкретный тип клеток или подмножество типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток либо вернуться к менее дифференцированному типу клеток. «Дедифференцировка» обозначает процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в пределах клеточной линии дифференцировки. В контексте настоящего документа выражение «клеточная линия дифференцировки» означает наследственность клетки, т. е. то, из каких клеток произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. Клеточная линия дифференцировки помещает клетку в пределы наследственной схемы развития и дифференцировки. Маркер, специфичный для линии дифференцировки, относится к характеристике, специфически ассоциированной с фенотипом клеток интересующей линии дифференцировки, и его можно применять для оценки дифференцировки некоммитированной клетки в клетки интересующей линии дифференцировки.
[0054] В контексте настоящего документа термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов, которые дифференциально экспрессируются в интересующей клетке. В данном контексте под дифференциальной экспрессией понимают повышенный уровень положительного маркера и пониженный уровень отрицательного маркера по сравнению с недифференцированной клеткой или клеткой на другой стадии дифференцировки. Обнаруживаемый уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками так, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличать ее от других клеток с помощью любого из множества способов, известных в данной области.
[0055] В настоящем документе термины «плотность клеток» и «плотность посева» применяются взаимозаменяемо и относятся к числу клеток, высеваемых на единицу площади поверхности твердого или полутвердого плоского или криволинейного субстрата.
[0056] В настоящем документе термин «суспензионная культура» относится к культуре клеток, отдельным клеткам или кластерам, суспендированным в среде, а не соединенным с какой-либо поверхностью.
[0057] В настоящем документе клетка является «положительной по» установленному маркеру, «положительной» или обозначается со знаком «+», если установленный маркер обнаруживают в клетке в достаточном количестве. Аналогично клетка является «отрицательной по» установленному маркеру, «отрицательной» или обозначается со знаком «-», если установленный маркер не обнаруживают в клетке в достаточном количестве. В частности, положительность при цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), как правило, означает уровень более чем около 2%, в то время как отрицательный предел для FACS, как правило, составляет менее около 1%. Положительность при цитометрии с помощью полимерной цепной реакции (ПЦР), как правило, означает около или менее 30 циклов (Cts); при этом отрицательность для ПЦР, как правило, составляет более около 31 цикла.
[0058] При попытках воспроизвести дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в функционализированные панкреатические эндокринные клетки в статичных клеточных культурах in vitro процесс дифференцировки часто рассматривают как прохождение через несколько последовательных стадий. В частности, процесс дифференцировки обычно рассматривают как прохождение через множество стадий. В этой поэтапной дифференцировке «стадия 1» обозначает первую стадию в процессе дифференцировки, то есть дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы («клетки стадии 1»). «Стадия 2» обозначает вторую стадию, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки («клетки стадии 2»). «Стадия 3» обозначает третью стадию, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки («клетки стадии 3»). «Стадия 4» обозначает четвертую стадию, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток («клетки стадии 4»). «Стадия 5» обозначает пятую стадию, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для одного или обоих из панкреатических энтодермальных клеток и панкреатических эндокринных клеток-предшественников (совместно обозначаемых как «клетки стадии 5» или альтернативно «панкреатические энтодермальные/эндокринные клетки-предшественники»). «Стадия 6» обозначает шестую стадию, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для незрелых бета-клеток («клетки стадии 6»). В процессе и с целью продуцирования клеток и популяций клеток изобретения применяют седьмую стадию - «стадию 7», которая относится к дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для незрелых бета-клеток (панкреатические эндокринные клетки), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для функциональных бета-клеток, и которые обладают более зрелым фенотипом по сравнению с клетками стадии 6. Под «функциональными бета-клетками, имеющими более зрелый фенотип» или «клетками стадии 7» подразумевают панкреатическую эндокринную клетку, которая, по сравнению с клеткой стадии 6, не только представляет собой одногормональную инсулин+, MAFA+, NKX6.1+, UCN3+, SLC2A1+ и PDX1+ клетку, но также экспрессирует MAFA на более высоком уровне, чем менее зрелая панкреатическая эндокринная клетка, в частности незрелая бета-клетка.
[0059] Необходимо отметить, что не все клетки в отдельно взятой популяции проходят через эти стадии с одинаковой скоростью. Следовательно, в клеточных культурах in vitro нередко обнаруживают наличие клеток, менее или более дифференцированных по сравнению с большинством клеток, присутствующих в популяции, особенно на более поздних стадиях дифференцировки. Например, нередко наблюдают появление маркеров, характерных для панкреатических эндокринных клеток, во время стадии 5 культивирования клеток. Для иллюстративных нужд настоящего изобретения в настоящем документе описаны характеристики различных типов клеток, связанных с определенными выше стадиями.
[0060] В настоящем документе «дефинитивная энтодерма» обозначает клетки, обладающие характеристиками клеток, происходящих от эпибласта при гаструляции, и формирующие желудочно-кишечный тракт и его производные. Дефинитивные энтодермальные клетки экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: FOXA2 (также известный как ядерный фактор гепатоцитов 3-β (HNF3-β)), GATA4, SOX17, CXCR4, Brachyury, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1. Маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, представляют собой CXCR4, FOXA2 и SOX17. Таким образом, дефинитивные энтодермальные клетки могут характеризоваться экспрессией CXCR4, FOXA2 и SOX17. Кроме того, в зависимости от длительности времени, на протяжении которого клеткам позволяют оставаться на стадии 1, можно наблюдать рост в HNF4α.
[0061] В настоящем документе «клетки первичной кишечной трубки» обозначают клетки, полученные из дефинитивной энтодермы и которые могут стать источником образования всех энтодермальных органов, таких как легкие, печень, поджелудочная железа, желудок и кишечник. Клетки кишечной трубки могут характеризоваться по существу растущей экспрессией HNF4α, выше, чем экспрессия дефинитивных энтодермальных клеток. Например, рост экспрессии HNF4α в мРНК в десять-сорок раз можно наблюдать на стадии 2.
[0062] В настоящем документе «энтодермальные клетки передней кишки» обозначают клетки, которые становятся источником образования пищевода, легких, желудка, печени, поджелудочной железы, желчного пузыря и части двенадцатиперстной кишки. Энтодермальные клетки передней кишки экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2 и HNF4α. Энтодермальные клетки передней кишки могут характеризоваться ростом экспрессии PDX1 по сравнению с клетками кишечной трубки. Например, более пятидесяти процентов клеток в культурах стадии 3 типично экспрессируют PDX1.
[0063] В настоящем документе «панкреатические энтодермальные клетки» обозначают клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1β, PTF1α, HNF6, HNF4α, SOX9, NGN3, гастрин; HB9 или PROX1. Панкреатические энтодермальные клетки могут характеризоваться отсутствием у них существенной экспрессии CDX2 или SOX2.
[0064] В настоящем документе «панкреатические эндокринные клетки-предшественники» обозначают панкреатические энтодермальные клетки, способные стать панкреатической клеткой, экспрессирующей гормоны. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3; NKX2.2; NeuroD1; ISL1; PAX4; PAX6; или ARX. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут характеризоваться экспрессией NKX2.2 и NeuroD1.
[0065] В настоящем документе «панкреатические эндокринные клетки» обозначают клетки, выполненные с возможностью экспрессирования по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина, грелина и панкреатического полипептида. Кроме того, к этим гормонам маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включают в себя один или более из NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, HB9 и PAX6.
[0066] «Бета-клетки («β-клетки») представляют собой панкреатические эндокринные клетки, выполненные с возможностью экспрессирования инсулина, но не глюкагона, соматостатина, грелина и панкреатического полипептида. Панкреатические эндокринные клетки, экспрессирующие маркеры β-клеток, могут характеризоваться экспрессией инсулина и по меньшей мере одного из следующих факторов транскрипции: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, HB9, MAFA и PAX6.
[0067] «Функциональные бета-клетки» представляют собой панкреатические эндокринные клетки, которые отображают хорошо изученные процессы, которые обеспечивают быструю и регулируемую стимулированную глюкозой секрецию инсулина (GSIS), в частности увеличение митохондриального дыхания/активности с последующей первой фазой и второй фазой секреции инсулина («двухфазная GSIS»). Более конкретно, функциональные бета-клетки показывают по меньшей мере одну из следующих характеристик двухфазной GSIS: (i) сопряжение митохондриального дыхания/активности с секрецией инсулина; (ii) быстрая реакция в виде секреции инсулина в случае увеличения потребности (в настоящем документе определяется как высокая концентрация глюкозы); (iii) способность к быстрому прекращению секреции инсулина после уменьшения потребности; (iv) способность к осуществлению множества циклов «включения-выключения» секреции инсулина; (v) способность к секретированию нужного количества инсулина в соответствии с потребностью; и (vi) способность к реагированию на множество стимуляторов секреции инсулина (например, эксендин-4 или аминокислоты L-глутамин и L-аргинин). Функциональные β-клетки могут характеризоваться по экспрессии инсулина и по меньшей мере одного из следующих факторов транскрипции: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, HB9, PAX6, MAFA, SLC2A1, UCN3 и GLP1R.
[0068] «Незрелые бета-клетки» представляют собой панкреатические эндокринные клетки, которые не отображали глюкозозависимое митохондриальное дыхание/активность и двухфазную GSIS. Незрелые бета-клетки, экспрессирующие маркеры β-клеток, могут характеризоваться экспрессией инсулина и по меньшей мере одного из следующих факторов транскрипции: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, HB9, MAFA и PAX6.
[0069] В настоящем документе «поверхность раздела воздух-жидкость» или «ALI» обозначает поверхность раздела воздух-жидкость, которая присутствует в открытом сосуде для культивирования или сосуде для культивирования, частично наполненном средой. Хотя в настоящем документе для удобства применяют термин «воздух», изобретение не ограничивают смесью газов и композиций, находящихся в окружающей среде. Изобретение детально рассматривает и включает в себя газообразные смеси, имеющие композиции, отличные от окружающей среды, включая, например, смеси, обогащенные определенным компонентом или в которых содержание определенного компонента понижено или исключено.
[0070] В настоящем документе взаимозаменяемо применяют выражения «д1», «1д» и «день 1»; «д2», «2д» и «день 2» и так далее. Эти комбинации цифр и букв обозначают конкретный день инкубации на различных стадиях в процессе постадийного протокола дифференцировки настоящей заявки.
[0071] Первая фаза (1-я) секреции инсулина представляет собой быстрый экзоцитоз небольшого пула связанных и легко высвобождаемых гранул инсулина в случае резкого увеличения концентрации глюкозы.
[0072] Вторая фаза (2-я) секреции инсулина меньшей амплитуды, но большей продолжительности, чем 1-я фаза секции инсулина, представляет собой перемещение гранул из резервного пула гранул и их связывание/подготовку для высвобождения.
[0073] OCR определяют как скорость потребления кислорода и является индикатором митохондриального дыхания, в частности, посредством цепи переноса электронов (ETC); прямая мера митохондриальной активности.
[0074] Выражение «эффективное количество» или «терапевтическое количество» или их эквиваленты в настоящем документе означают количество соединения, которое должно присутствовать для обеспечения некоторой степени дифференцировки hESCs или дополнительной дифференцировки частично дифференцированных hESC, например подвергнутых воздействию одной или более предшествующих стадий дифференцировки. В дополнительных примерах соединение может присутствовать в культуральной среде hESC или может быть добавлено к hESC во время любой из стадий выращивания. В некоторых вариантах осуществления соединение, агент, малая молекула или ростовой фактор используют для получения дефинитивной энтодермы, передней кишки, клеточных линий дифференцировки панкреатической передней кишки и панкреатической энтодермы, включая панкреатические гормонсекретирующие клетки. В определенных примерах можно подвергать стволовые клетки воздействию соединения, агента, малой молекулы или фактора роста перед любой дифференцировкой или во время первой стадии дифференцировки, а в других примерах можно дифференцировать стволовую клетку до клетки промежуточного типа, такой как, например, клетка дефинитивной энтодермы, а затем подвергать воздействию соединения, агента, малой молекулы или фактора роста.
[0075] Термины «соединения», «низкомолекулярные соединения» или их эквиваленты изобретения означают соединения, соответствующие общей формуле, описанной в настоящем документе (например, в таблице XI), и включают в себя любые специфические соединения в пределах этой формулы, структура которых описана в настоящем документе, или их аналоги. Можно идентифицировать соединения изобретения по их химической структуре или химическому названию. В случае противоречия между химической структурой и химическим названием идентичность соединения определяет химическая структура. Соединения изобретения могут содержать один или более хиральных центров или двойных связей и, следовательно, могут существовать в виде стереоизомеров, таких как изомеры с двойной связью (т. е. геометрические изомеры), энантиомеры или диастереомеры. Таким образом, химические структуры, показанные в настоящем документе, охватывают все возможные энантиомеры и стереоизомеры указанных соединений, включая стереоизомерически чистую форму (например, геометрически чистую, энантиомерно чистую или диастереомерически чистую) и энантиомерные и стереоизомерные смеси. Энантиомерные и стереоизомерные смеси можно разделять на составляющие их энантиомеры или стереоизомеры с использованием методов разделения или методов хирального синтеза, хорошо известных специалисту в данной области. Соединения изобретения также включают в себя меченные изотопами соединения, в которых один или более атомов имеют атомную массу, отличную от атомной массы соединения, обычно обнаруживаемого в природе. Примеры изотопов, которые можно включать в соединения изобретения, включают в себя, без ограничений, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F и 36Cl. Следует дополнительно понимать, что при изображении частичных структур соединений изобретения скобки указывают на точку прикрепления частичной структуры к оставшейся части молекулы.
B. Характеристики плюрипотентных стволовых клеток
[0076] Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать одно или более из указанных антител: TRA-1-60 и TRA-1-81 (Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии TRA-1-60 и TRA-1-81. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, как правило, имеют щелочнофосфатазную активность, которую можно обнаруживать путем фиксации клеток 4%-м раствором параформальдегида и впоследствии путем выращивания с использованием набора щелочнофосфатазных субстратов, который продается под товарным знаком VECTOR® Red, в соответствии с описанием производителя (Vector Laboratories, Inc., г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определенные с помощью полимерной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
[0077] Другое желательное фенотипическое свойство выращенных плюрипотентных стволовых клеток представляет собой потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток можно подтверждать, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксации образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и впоследствии их гистологического исследования на наличие клеточных типов, происходящих от этих трех зародышевых листков. В альтернативном варианте осуществления можно определять плюрипотентность по созданию эмбриоидных телец и оцениванию эмбриоидных телец на наличие маркеров, связанных с тремя зародышевыми листками.
[0078] Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток можно кариотипировать с помощью стандартного метода G-бэндинга и сравнивать с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получать клетки, имеющие «нормальный кариотип», т. е. эуплоидные клетки, в которых все хромосомы человека присутствуют и не имеют видимых изменений.
C. Источники плюрипотентных стволовых клеток
[0079] Любые плюрипотентные стволовые клетки можно применять в способах изобретения. Примерные типы плюрипотентных стволовых клеток, которые можно применять, включают в себя стабильные линии плюрипотентных клеток, в том числе преэмбриональной ткани (такой как бластоцист), эмбриональной или фетальной ткани, взятой в любой момент во время беременности, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно от 10 до 12 недель беременности. Неограничивающие примеры представляют собой стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, такие как линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (код NIH: WA01), H7 (код NIH: WA07), H9 (код NIH: WA09) (WiCell Research Institute, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и SA002 (Cellartis AB Corporation, г. Гетеборг, Швеция).
[0080] Клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток, также являются приемлемыми. Индуцированные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, полученные из зрелых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов транскрипции, относящихся к плюрипотенции, таких как OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185; см. также IPS, Cell, 126(4): 663-676), также можно применять. Эмбриональные стволовые клетки человека, которые используют в способах изобретения, также можно получать, как описано Thomson et al. (патент США № 5,843,780; Science, 1998, 282:1145-1147; Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848). Мутантные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, такие как BG01v (BresaGen, г. Атенс, штат Джорджия), или клетки, полученные из зрелых человеческих соматических клеток, такие как клетки, описанные в Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007), также можно применять. В определенных вариантах осуществления можно получать плюрипотентные стволовые клетки, приемлемые для применения в настоящем изобретении, в соответствии со способами, описанными в: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008); Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007); и заявке на патент США № 2011/0104805. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки, приемлемые для применения в настоящем изобретении, можно считать «интактными» и получать в соответствии со способами, описанными в: Gafni et al. (Nature, 504:282, 2013) и Ware et al. (PNAS, 111: 4484-4489, 2014). Все эти ссылки, патенты и заявки на патенты полностью включены в настоящий документ путем ссылки, в частности, поскольку они относятся к выделению, культивированию, размножению и дифференцировке плюрипотентных клеток.
[0081] Другие источники плюрипотентных стволовых клеток включают в себя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPS, Cell, 126(4): 663-676). Еще одни источники приемлемых клеток включают в себя клетки, полученные из ткани пуповины человека, клетки, полученные из амниотической жидкости человека, клетки, полученные из плаценты человека, и человеческие партеноты. В одном варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины человека, можно получать способом, описанным в патенте США № 7,510,873. В другом варианте осуществления клетки, полученные из ткани плаценты, можно получать с использованием способов, описанных в публикации заявки на патент США № 2005/0058631. В другом варианте осуществления клетки, полученные из амниотической жидкости, можно получать с помощью способов, описанных в заявке на патент США № 2007/0122903. Описания каждой из этих заявок на патент полностью включены в настоящий документ путем ссылки, поскольку они относятся к выделению и характеризации клеток. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки могут иметь не эмбриональное происхождение.
D. Размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
[0082] В заявленном изобретении можно применять множество различных известных способов размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток. Например, плюрипотентные стволовые клетки можно наносить на приемлемый культуральный субстрат. В одном варианте осуществления приемлемый культуральный субстрат представляет собой компонент внеклеточного матрикса, такой как компоненты, полученные из базальной мембраны, или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с адгезивными молекулами. Приемлемый культуральный субстрат представляет собой восстановленную базальную мембрану, продаваемую под товарным знаком MATRIGEL™ (Corning Incorporated, г. Корнинг, штат Нью-Йорк, США). MATRIGEL™ представляет собой препарат из опухолевой клетки Энгельбрета-Холма-Суорма, выполненный с возможностью растворения, который при комнатной температуре превращается в гель с образованием восстановленной базальной мембраны.
[0083] В качестве альтернативы приемлемыми являются и другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов, известные в данной области. В зависимости от типа пролиферирующих клеток данные компоненты могут включать в себя по отдельности или в различных комбинациях ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т. п.
[0084] Плюрипотентные стволовые клетки можно наносить на субстрат с приемлемым распределением и при наличии среды, которая поддерживает выживаемость, размножение и сохранение желательных характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению при посеве и могут быть без труда определены специалистом в данной области. Приемлемые культуральные среды можно получать из следующих компонентов, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), продаваемая под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 11965-092) компанией Life Technologies Corporation, г. Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, США; нокаутирующая модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), продаваемая под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 10829-018) компанией Life Technologies Corporation; основная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глутамин, продаваемый под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 25030-081) компанией Life Technologies; раствор заменимых аминокислот, продаваемый под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 11140-050) компанией Life Technologies; β-меркаптоэтанол, Sigma-Aldrich Company, LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури, США (№ по каталогу M7522); человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), продаваемый под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 13256-029) компанией Life Technologies. Размножение в больших объемах и управляемые процессы дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток также можно получать с помощью суспендирующих биореакторов.
E. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток
[0085] По мере того как плюрипотентные клетки дифференцируются в функциональные β-клетки, они дифференцируются через различные стадии, каждая из которых может характеризоваться наличием или отсутствием определенных маркеров. Дифференцировки клеток на этих стадиях достигают путем создания специфических условий культивирования, включая наличие или отсутствие определенных факторов, добавленных в культуральную среду. В целом эта дифференцировка может включать в себя дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток по линии дифференцировки дефинитивной энтодермы и в дефинитивные энтодермальные клетки. Эти клетки можно впоследствии дополнительно дифференцировать в клетки первичной кишечной трубки, которые, в свою очередь, можно впоследствии дифференцировать в энтодермальные клетки передней кишки. Энтодермальные клетки передней кишки можно дифференцировать в панкреатические энтодермальные клетки, которые впоследствии можно дополнительно дифференцировать в панкреатические эндокринные клетки-предшественники или панкреатические энтодермальные/панкреатические эндокринные клетки-предшественники. Эти клетки можно дифференцировать в панкреатические клетки, продуцирующие или секретирующие гормоны. В настоящей заявке предложена постадийная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки, предпочтительно путем культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии, которая присутствует в пределах сосуда для культивирования, частично наполненного средой, в особенности путем культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии на одной или более из стадий от 5 до 7.
[0086] Один или более из гормонов щитовидной железы трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) и их аналогов, отдельно или дополнительно в комбинации с ингибитором ALK-5, можно применять для культивирования клеток на одной или более из стадий от 1 до 7 дифференцировки и предпочтительно на каждой из стадий от 5 до 7. В альтернативном варианте осуществления ингибитор ALK-5 можно применять отдельно на одной или более стадиях дифференцировки, но предпочтительно на каждой из стадий от 5 до 7 и более предпочтительно на каждой из стадий от 5 до 6. Более предпочтительно один или более из гормонов щитовидной железы или их аналогов и ингибитор ALK5 применяют на одной или более стадиях дифференцировки, предпочтительно на каждой из стадий от 5 до 7 и более предпочтительно на каждой из стадий от 5 до 6. Приемлемые аналоги гормонов щитовидной железы могут включать в себя, без ограничений: GC-1 (Sobertirome) (продаваемый компанией R&D Systems, Inc., г. Миннеаполис, штат Миннесота, США); 3,5-дийодтриопропионовую кислоту (DIPTA); KB-141, обсуждаемый в J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2008(111): 262-267 и Proc. Natl. Acad. Sci. US 2003, 100: 10067-10072; MB07344, обсуждаемый в Proc. Natl. Acad. Sci. US 2007, 104: 15490-15495; T0681, обсуждаемый в J. Lipid Res., May 2009, 50:938 и Endocr. Pract. 2012, 18(6): 954-964, описания которых полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Используемые ингибиторы ALK5 включают в себя: ингибитор II ALK5 (Enzo Life Sciences, Inc., г. Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США), который также представляет собой предпочтительный ингибитор ALK5; ALK5 I (Axxora, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния, США), SD208 (R&D Systems); ингибитор трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) SB431542 (Xcess Biosciences, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния, США); ITD-1 (Xcess Biosciences); LY2109761 (Xcess Biosciences); A83-01 (Xcess Biosciences); LY2157299 (Xcess Biosciences); ингибитор рецептора TGF-β V (EMD Millipore Chemical, г. Гибстаун, штат Нью-Джерси, США);ингибитор рецептора TGF-β I (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β IV (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β VII (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β VIII (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β II (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β VI (EMD Millipore); и ингибитор рецептора TGF-β VI (EMD Millipore).
[0087] В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления изобретения способы включают в себя обработку клеток на одной или более стадиях, но предпочтительно обработку клеток во время стадии 7 дифференцировочной средой, которая включает в себя один или оба из антиоксиданта, такого как витамин Е, ацетилцистеин, витамин С, антиоксидантная добавка (№ по каталогу A1345, компания Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США), глутатион, супероксиддисмутаза, каталаза и т. п. и их комбинации. В других предпочтительных вариантах осуществления при выполнении стадии 6 применяют ингибитор гамма-секретазы, который может представлять собой ингибитор гамма-секретазы XX (EMD Millipore), ингибитор гамма-секретазы XXI (EMD Millipore), ингибитор гамма-секретазы XVI (EMD Millipore), N-[(3,5-дифторфенил)ацетил]-L-аланил-2-фенил]глицин-1,1-диметиловый эфир (DAPT) (№ по каталогу 2634, Tocris Bioscience, г. Бристоль, Великобритания), и т. п. и их комбинации. Используемые количества ингибитора гамма-секретазы могут составлять от около 50 до 5000 нМ, предпочтительно от около 50 до 500 нМ. Количество антиоксиданта может составлять от около 0,1 до 100 мкМ, альтернативно от около 0,1 до 20 мкМ и предпочтительно от около 1 до 10 мкМ. Альтернативно используемые количества антиоксиданта могут составлять от около 100 нМ до 5 мМ, от около 1000 нМ до 2 мМ и предпочтительно от около 0,1 до 1 мМ.
[0088] В вариантах осуществления изобретения конкретные малые молекулы применяют в среде на одной или более стадиях дифференцировки, предпочтительно на стадии 6 и 7. Интересующие малые молекулы представляют собой молекулы, выполненные с возможностью ингибирования киназы Aurora, киназы p90 рибосомального белка S6 или рецептора метилтрансферазы DOT1L, и их предпочтительно применяют вместе с антиоксидантами, которые уменьшают окислительный стресс культивированных клеток. Особый интерес представляют ингибитор II киназы Aurora и ингибитор II киназы p90 рибосомального белка S6 (RSK). Ингибитор II киназы Aurora представляет собой соединение, выполненное с возможностью проникновения в клетку, известное под названием (4-(4'-бензамидоанилино)-6,7-диметоксихиназолин). Ингибитор II RSK представляет собой рацемическую смесь дигидроптеридинона 2-(3,5-дифтор-4-гидроксианилино)-8-изопентил-5,7-диметил-7H-птеридин-6-она. Другие интересующие ингибиторы киназы Aurora включают в себя ZM447439 и PF03814735. Также интерес представляют ингибиторы рецептора протеин-метилтрансферазы DOT1L, в особенности EPZ-5676. EPZ-5676 представляет собой S-аденозилметиониновый (SAM) ингибитор протеин-метилтрансферазы DOT1L. Данное соединение представляет собой ингибитор метилтрансферазы DOT1L (подобный блокатору теломерного сайленсинга 1), который, как показано, ингибирует пролиферацию клеток. Он известен под такими химическими названиями, как 9H-пурин-6-амин, 9-[5-дезокси-5-[[цис-3-[2-[6-(1,1-диметилэтил)-1H-бензимидазол-2-ил]этил]циклобутил](1-метилэтил)амино]-β-D-рибофуранозил]- и (2R,3R,4S,5R)-2-(6-аминопурин-9-ил)-5-[[[3-[2-(6-трет-бутил-1H-бензимидазол-2-ил)этил]циклобутил]-пропан-2-иламино]метил]оксолан-3,4-диол. Интересующие ингибиторы дополнительно представляют собой ингибитор ДНК-метилтрансферазы, такой как 5-азацитидин (AZT), ингибиторы гистондеацетилазы, такие как пироксамид и CI994. Дополнительные интересующие малые молекулы включают в себя UNC0638, UNC0646, UNC0642 и A366 (ингибиторы метилтрансферазы лизинов гистонов G9a и GLP), TC-E5003 (ингибитор PRMT1 метилтрансферазы аргининов), SB747651A дигидрохлорид (ингибитор MSK1; также ингибирует другие киназы группы AGC), PFI1 (ингибитор бромодомена BET), LY303511 (ингибитор BRD2, BRD3 и BRD4), MS436 (ингибитор бромодомена BRD4) и MC1568 (селективно ингибирует HDAC класса II) и 3-деазанепланоцин А (DEZA).
[0089] В предпочтительном варианте осуществления изобретения малая молекула применяют в среде на одной или более из стадий 6 и 7 и более предпочтительно на стадии 7. Используемое количество малых молекул можно определять путем выбора количества, демонстрирующего наибольшую экспрессию маркеров созревания, но не производящего токсических эффектов. Как правило, используемые количества будут составлять от около 500 нМ до 10 мкМ, альтернативно от около 500 нМ до 5 мкМ и предпочтительно от около 500 нМ до 2 мкМ.
Дифференцировка плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток со зрелым фенотипом (функциональных бета-клеток)
[0090] Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. Маркеры плюрипотентных стволовых клеток включают в себя, например, экспрессию одного или более из следующих компонентов: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81. Они могут быть обнаружены посредством ОТ-ПЦР.
[0091] Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают в себя линию H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (код NIH: WA09), линию H1 человеческих эмбриональных стволовых клеток (код NIH: WA01), линию H7 человеческих эмбриональных стволовых клеток (код NIH: WA07) и линию SA002 человеческих эмбриональных стволовых клеток. Также приемлемыми являются клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81.
[0092] Для применения в настоящем изобретении приемлемой является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии дифференцировки дефинитивной энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцировки дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В альтернативном аспекте клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцировки дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку мезэнтодермы. В альтернативном аспекте клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцировки дефинитивной энтодермы, представляет собой дефинитивную энтодермальную клетку.
[0093] Также для применения в настоящем изобретении приемлемой является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии дифференцировки панкреатической энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцировки панкреатической энтодермы, представляет собой панкреатическую энтодермальную клетку, в которой экспрессия PDX1 и NKX6.1 по существу превышает экспрессию CDX2 и SOX2. В определенных вариантах осуществления более 30% клеток экспрессируют PDX1 и NKX6.1 и менее 30% клеток экспрессируют CDX2 или SOX2 при измерении с помощью FACS. В частности, используемыми являются клетки, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1 по меньшей мере в два раза превышает экспрессию CDX2 или SOX2.
[0094] Также приемлемой для применения в настоящем изобретении является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для панкреатической эндокринной линии дифференцировки. В одном аспекте изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии дифференцировки, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатической эндокринной клеткой может быть панкреатическая клетка, экспрессирующая гормоны, способная к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина, грелина или панкреатического полипептида. В предпочтительном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка представляет собой инсулин-продуцирующую β-клетку.
[0095] В определенных вариантах осуществления изобретения для получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для функциональных бета-клеток (панкреатических эндокринных бета-клеток зрелого фенотипа), используют протокол, начинающийся с плюрипотентных стволовых клеток. В данный протокол включены:
Стадия 1. | Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, полученные из культуры клеточных линий, обрабатывают соответствующими факторами для индуцирования образования дефинитивных энтодермальных клеток. |
Стадия 2. | Клетки, полученные на стадии 1, обрабатывают соответствующими факторами для индуцирования образования клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки. |
Стадия 3. | Клетки, полученные из клеток стадии 2, обрабатывают соответствующими факторами для индуцирования дополнительной дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки. |
Стадия 4. | Клетки, полученные на стадии 3, обрабатывают соответствующими факторами для индуцирования дополнительной дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток. На поздней стадии 4 клетки необязательно дополнительно культивируют на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензионной культуре; на поздней стадии 4 клетки перемещают на поверхность раздела воздух-жидкость или объединяют в виде скоплений, которые культивируют в суспензии. |
Стадия 5. | Клетки, полученные на стадии 4, обрабатывают соответствующими факторами, включая в определенных вариантах осуществления: (i) один или более из Т3, Т4 или их аналога; (ii) ингибитор ALK5; или (iii) совместно культивируют (i) и (ii), необязательно на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии, для индуцирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников. |
Стадия 6. | Клетки, полученные из клеток стадии 5, обрабатывают соответствующими факторами, включая в определенных вариантах осуществления: (i) один или более из Т3, Т4 или их аналога; (ii) ингибитор ALK5; (iii) один или более из ингибитора гамма-секретазы, ингибитора RSK, ингибитора рецептора костного морфогенетического белка (BMG) и ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L; (iv) вместе (i) и (ii); (v) (i), (ii) и (iii); (vi) (i) и (iii); или (vii) (ii) и (iii) и культивируют необязательно на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии для индуцирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, в частности незрелых бета-клеток. |
Стадия 7. | Клетки, полученные из клеток стадии 6, обрабатывают соответствующими факторами, включая в определенных вариантах осуществления: (i) один или более из Т3, Т4 или их; (ii) ингибитор ALK5; (iii) антиоксидант; (iv) один или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L; (v) (i) и (ii); (vi) (i) и (iii); (vii) (i) и (iv); (viii) (ii) и (iii); (ix) (ii) и (iv); (x) (i), (ii) и (iii); (xi) (i), (iii) и (iv); (xii) (ii), (iii) и (iv); (xiii) (i), (ii) и (iv); (xiv) (iii) и (iv); или (xv) (i), (ii), (iii) и (iv) и культивируют на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии для индуцирования образования функциональных бета-клеток, панкреатических эндокринных клеток, которые экспрессируют единственный гормон инсулин, и являются PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA-положительными, и которые имеют более высокий уровень экспрессии MAFA, чем клетки стадии 6, а полученная популяция клеток имеет более высокий процент MAFA-положительных и экспрессирующих единственный гормон инсулин клеток, чем клетки стадии 6. |
[0096] Наряду с тем, что изобретение в определенных вариантах осуществления включает в себя дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток (например, клеток, предшествующих стадии 1) в клетки стадии 7, изобретение также включает в себя дифференцировку клеток других стадий в клетки стадии 7. В частности, изобретение включает в себя дифференцировку клеток стадии от 4 до 7. Хотя способ описан в отдельных стадиях, обработка, так же как и прохождение клеток через процесс дифференцировки, может быть последовательной или непрерывной. Дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки стадии 6 или стадии 7 можно выполнять в суспензионных культурах.
[0097] Эффективность дифференцировки можно определять путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток агентом, таким как антитело, который специфически распознает белковый маркер, экспрессированный интересующими дифференцированными клетками. Способы оценивания экспрессии белковых маркеров и маркеров нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Эти способы включают в себя ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг, гибридизацию in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), а также иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, экспрессированных на интактных клетках - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
[0098] Дифференцированные клетки можно также дополнительно очищать. Например, после обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов настоящего изобретения дифференцированные клетки можно очищать путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток агентом, таким как антитело, который специфически распознает белковый маркер, характерно экспрессируемый очищенными дифференцированными клетками. В определенных вариантах осуществления дифференцированные клетки не очищают.
[0099] Любую приемлемую среду для выращивания, содержащую достаточные количества витаминов, минералов, солей, глюкозы, аминокислот и белков-носителей, выполненных с возможностью соответствия для дифференцировки клеток, можно использовать для различных стадий от 1 до 7. Предпочтительно применяют следующие среды: стадия 1 - MCDB-131 (продаваемая компанией Life Technologies Corporation, г. Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, США) или RPMI (продаваемая компанией Sigma-Aldrich); стадия 2 - MCDB-131 или модифицированная по способу Дульбекко среда Игла F12 (DMEM-F12); стадия от 3 до 5 - MCDB-131, BLAR (таблица I и таблица IV) или DMEM; и стадии 6 и 7 - BLAR или CMRL (Life Technologies). Предпочтительно концентрацию глюкозы в среде поддерживают на уровне равном или более предпочтительно меньшем, чем около 10 мМ, для стадий от 1 до 4 и большем, чем около 10 мМ, для стадий от 5 до 7. Для стадии 7 среда предпочтительно содержит достаточное количество витаминов, заменимых аминокислот, липидов, пирувата натрия и следовых элементов, например состава I.
Стадия 1. | Дифференцировка плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток |
[0100] Плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, способами, известными специалистам в данной области, или способами, предложенными в изобретении. Способы, используемые для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцировки дефинитивной энтодермы, описаны в: D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005); Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004); McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007); и D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006). Дополнительные приемлемые способы дифференцировки описаны в: заявке на патент США № 2007/0254359; заявке на патент США 2009/0170198; заявке на патент США 2011/0091971; заявке на патент США 2010/0015711; заявке на патент США 2012/0190111; заявке на патент США 2012/0190112; и заявке на патент США 2012/0196365. Эти описания полностью включены в настоящий документ путем ссылки, поскольку они относятся к дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в дефинитивные энтодермальные клетки.
[0101] В одном варианте осуществления плюрипотентные клетки обрабатывают приемлемой средой для выращивания, предпочтительно MCDB-131 или RPMI. В среду предпочтительно добавляют ростовой фактор дифференцировки, такой как ростовой фактор дифференцировки 8 (GDF8), и ингибитор киназы гликогенсинтазы-3 β (GSK3β), такой как циклические анилин-пиридинотриазиновые соединения, описанные в заявке на патент США 2010/0015711 (полностью включенной в настоящий документ путем ссылки), для индуцирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток. Предпочтительным ингибитором GSK3β является 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он (соединение MCX). Обработка может включать в себя приведение плюрипотентных стволовых клеток в контакт со средой, в которую добавили от около 50 нг/мл до около 150 нг/мл, альтернативно от около 75 нг/мл до около 125 нг/мл, предпочтительно около 100 нг/мл GDF8. Обработка может также включать в себя приведение клеток в контакт с от около 0,1 до около 5 мкМ, альтернативно от около 0,5 до около 2,5 мкМ, предпочтительно около 1 мкМ соединения МСХ. Плюрипотентные клетки можно культивировать на протяжении от около двух до пяти дней, предпочтительно от около двух до трех дней для облегчения дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток.
[0102] В предпочтительном варианте осуществления клетки культивируют в присутствии GDF8 и соединения МСХ на протяжении одного дня с последующим культивированием в присутствии GDF8 и более низкой концентрации соединения МСХ на протяжении одного дня с последующим культивированием в присутствии GDF8 на протяжении одного дня без добавления соединения МСХ. В частности, клетки культивируют в присутствии GDF8 и около 1мкМ соединения МСХ на протяжении одного дня с последующим культивированием в присутствии GDF8 и около 0,1мкМ соединения МСХ на протяжении одного дня с последующим культивированием в присутствии GDF8 на протяжении одного дня без добавления соединения МСХ. В альтернативном варианте осуществления клетки можно культивировать в присутствии GDF8 и около 1мкМ соединения МСХ на протяжении одного дня, с последующим культивированием в присутствии GDF8 и около 0,1мкМ соединения МСХ на протяжении одного дня.
[0103] В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в среде, содержащей активин А, но не содержащей сыворотку, впоследствии культивировать клетки с активином А и сывороткой с последующим культивированием клеток с активином А и сывороткой в другой концентрации, как описано в D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005). В качестве альтернативы плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А, но не содержащей сыворотку, с последующим культивированием клеток с активином A и сывороткой, как описано в D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2005. Плюрипотентные стволовые клетки можно также дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцировки дефинитивной энтодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и WNT-лиганд, но не содержащей сыворотку, с последующим удалением WNT-лиганда и культивированием клеток с активином A и сывороткой, как описано в D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
[0104] В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки обрабатывают активином А и WNT3A для получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток. Обработка может включать в себя контакт плюрипотентных стволовых клеток с активином А в концентрации от около 50 нг/мл до около 150 нг/мл, альтернативно от около 75 нг/мл до около 125 нг/мл, альтернативно около 100 нг/мл. Обработка также может включать в себя приведение клеток в контакт с WNT3A в концентрации от около 10 нг/мл до около 50 нг/мл, альтернативно от около 15 нг/мл до около 30 нг/мл, альтернативно около 20 нг/мл. Плюрипотентные клетки можно культивировать в течение приблизительно трех дней для получения дефинитивных энтодермальных клеток. В одном варианте осуществления плюрипотентные клетки культивируют в присутствии активина А и WNT3A на протяжении одного дня с последующим культивированием в присутствии активина А (без присутствия WNT3A).
[0105] Чтобы определить образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, клетки можно исследовать на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют таких маркеров. Таким образом, можно обнаруживать дифференцировку плюрипотентных клеток, когда клетки начинают экспрессировать маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы.
Стадия 2. | Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки |
[0106] Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, можно дополнительно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки в среде для выращивания, такой как MCDB-131 или DMEM-F12. В одном варианте осуществления формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает в себя культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток, со средой, содержащей фактор роста фибробластов (FGF), предпочтительно FGF7 или FGF10, для дифференцировки клеток. Например, клеточная культура может включать в себя от около 10 нг/мл до около 75 нг/мл, альтернативно от около 25 нг/мл до около 75 нг/мл, еще альтернативно от около 30 нг/мл до около 60 нг/мл, альтернативно около 50 нг/мл фактора роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7 и наиболее предпочтительно около 25 нг/мл FGF7. Клетки можно культивировать в этих условиях на протяжении от двух до трех дней, предпочтительно около двух дней.
[0107] В другом варианте осуществления формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает в себя культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дифференцировки дефинитивной энтодермы, с фактором роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, и аскорбиновой кислотой (витамином С). Культуральная среда может включать в себя от около 0,1 мМ до около 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. Клеточная культура может также включать в себя от около 10 нг/мл до около 35 нг/мл, альтернативно от около 15 нг/мл до около 30 нг/мл, альтернативно около 25 нг/мл фактора роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7. Например, клеточная культура может включать в себя около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и около 25 нг/мл FGF7. В одном варианте осуществления клетки стадии 1 обрабатывают FGF7 и аскорбиновой кислотой на протяжении 2 дней.
Стадия 3. | Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки |
[0108] Клетки первичной кишечной трубки, полученные на стадии 2, можно дополнительно дифференцировать в клетки стадии 3 или клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, путем культивирования этих клеток в среде для выращивания, такой как MCDB-131, DMEM или специализированной среде, такой как BLAR (таблица I). В среду можно добавлять: (i) фактор роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7; (ii) ретиноевую кислоту (RA); (iii) антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH) (такой как антагонист Smoothened 1 (SANT-1), который представляет собой 1-пиперазинамин, N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)- или ((E)-4-бензил-N-((3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил),этилен-пиперазин-1-амин), HPI-1, который представляет собой 2-метоксиэтил 1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-(3гидроксифенил)-7-(2-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-3-хинолинкарбоксилат и предпочтительно SANT-1; (iv) активатор протеинкиназы С (PKC), такой как ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам) (TPB), форбол-12,13-дибутират(PDBu), форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) или индолактам V (ILV) и предпочтительно TPB; (v) ингибитор костного морфогенетического белка (BMP), такой как LDN-193189, ноггин или хордин и предпочтительно LDN-193189; и (vi) аскорбиновую кислоту. В альтернативном варианте осуществления можно также применять ингибитор рецептора Smoothened (SMO) (такой как MRT10 (N[[[3-бензоиламино)фенил]амино]тиоксометил]-3,4,5-триметоксибензамид)) или циклопамин. Например, клеточная культура может включать в себя от около 100 нМ до около 500 нМ, альтернативно от около 100 нМ до около 400 нМ, альтернативно около 200 нМ активатора PKC. Клетки можно культивировать в присутствии этих факторов роста, низкомолекулярных агонистов и антагонистов на протяжении от около двух до четырех дней, предпочтительно от около двух до трех дней, более предпочтительно около двух дней.
[0109] В альтернативном варианте осуществления клетки стадии 3 можно получать из клеток стадии 2 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, в которую добавили ингибитор рецептора SMO, SANT-1, ретиноевую кислоту и ноггин. Клетки можно культивировать на протяжении от приблизительно двух до четырех дней, предпочтительно около двух дней.
[0110] В одном варианте осуществления в среду добавляют: от около 10 нг/мл до около 35 нг/мл, альтернативно от около 15 нг/мл до около 30 нг/мл, альтернативно около 25 нг/мл фактора роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7; от около 0,1 мМ до около 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ, альтернативно около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; от около 0,1 мкМ до около 0,4 мкМ SANT-1; от около 100 до около 300 нМ TPB; и от около 50 нМ до около 200 нМ, и около 100 нМ LDN-193189. В другом варианте осуществления в среду добавляют около 25 нг/мл FGF-7, около 1 мкМ ретиноевой кислоты, около 0,25 мкМ SANT-1, около 200 нМ ТРВ, около 100 нМ LDN-193189 и около 0,25 мкМ аскорбиновой кислоты.
[0111] В одном варианте осуществления в среду добавляют от около 0,1 мкМ до около 0,3 мкМ SANT-1, от около 0,5 мкМ до около 3 мкМ ретиноевой кислоты и от около 75 нг/мл до около 125 нг/мл ноггина.
Стадия 4. | Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток |
[0112] В одном варианте осуществления способы изобретения включают в себя получение клеток стадии 4 путем обработки клеток стадии 3 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую среду для выращивания и предпочтительно представляет собой MCDB-131, DMEM или специализированную среду, такую как BLAR (таблица I). В среду можно добавлять один или более из следующих компонентов: (а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора V рецептора TGF-β, ингибитора I рецептора TGF-β, ингибитора IV рецептора TGF-β, ингибитора VII рецептора TGF-β, ингибитора VIII рецептора TGF-β, ингибитора II рецептора TGF-β, ингибитора VI рецептора TGF-β, ингибитора рецептора TGF-β III, ингибитора рецептора TGF-β SB431542, SD-208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5 I и ингибитора II ALK5; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из Т3, Т4, аналогов Т3, аналогов Т4 и их смесей; (с) антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), выбранный из SANT-1 или HIP-1; (d) ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, ноггина или хордина; (e) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA и ILV; (f) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF-7 или FGF-10; (g) ретиноевая кислота; и (h) аскорбиновая кислота;. Например, в среду для выращивания, такую как MCDB131 или и предпочтительно BLAR, можно добавлять антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH) (такой как SANT-1 или HPI-1), ингибитор ВМР (такой как LDN-193189, ноггин или хордин), аскорбиновую кислоту и активатор PKC (такой как TPB, PDBu, PMA или ILV) для обеспечения приемлемой дифференцировочной среды.
[0113] Культивирование клеток стадии 3 в такой среде на протяжении от около двух до четырех дней, предпочтительно от около двух до трех дней, более предпочтительно около трех дней, как правило, является достаточным для дифференцировки клеток стадии 3 в клетки стадии 4. В другом варианте осуществления в среду можно добавлять ингибитор SMO и антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 3 можно обрабатывать средой, в которую добавили около 0,25 мкМ SANT-1; около 100 нМ RA; около 2 нг/мл FGF7; около 100 нM LDN-193189; около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и около 200 нM TPB в течение трех дней.
[0114] На стадии 4 клетки можно культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость либо в течение всей стадии, либо через от 2 до 3 дней после плоскостного культивирования. В частности, в настоящем изобретении обеспечивают клеточную культуру in vitro для дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток на поверхности раздела воздух-жидкость, содержащую: (а) сосуд для культивирования; (b) объем среды для выращивания в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема сосуда; (с) воздух в пределах сосуда, который заполняет часть сосуда, свободную от среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между средой и воздухом; и (е) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности субстрата таким образом, что среда контактирует только с частью поверхности клеток. В альтернативном варианте осуществления можно выполнять стадию 4 полностью в плоской культуре.
[0115] В альтернативном варианте осуществления на стадии 4 через от около 2 до 3 дней развития плоской культуры можно объединять клетки в скопления клеток. В частности, в настоящем изобретении обеспечивают клеточную культуру in vitro для дифференцировки клеток, полученных в виде агрегированных клеток, таких как скопления клеток, содержащие: (a) сосуд для культивирования, который облегчает агрегацию клеток или формирование скоплений клеток; (b) объем среды для выращивания (культуральной среды) внутри указанного сосуда; и (с) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные внутри сосуда так, чтобы индуцировать их агрегацию и образование скоплений. В вариантах осуществления сосуд представляет собой планшет с лунками или микролунками, такой как планшеты Aggrewell™ (планшеты с микролунками; STEMCELL Technologies Inc., г. Ванкувер, Канада). В частности, скопления клеток получали в планшетах с микролунками для образования агрегатов клеток одинаковых размера и формы, например с помощью планшетов Aggrewell™. В вариантах осуществления засевают от около 500 до 2000 клеток на одну лунку или микролунку для получения агрегированных клеток или скоплений клеток. В частности, засевают от около 50 до около 3000 клеток на одну лунку или микролунку, предпочтительно от около 50 до около 2000 клеток, от около 50 до 1000 клеток, от около 50 до около 900 клеток, от около 50 до около 800 клеток, от около 100 до около 800 клеток, от около 250 до около 800 клеток или от около 500 до около 800 клеток. Более предпочтительно засевают от около 700 до около 800 клеток на одну лунку или микролунку.
[0116] В дополнительном варианте осуществления скопления клеток, образованные способом агрегирования клеток, можно дополнительно культивировать в суспензии (суспензионная культура), включая удаление агрегированных клеток или скоплений клеток из лунок или микролунок и посев агрегированных клеток/скоплений клеток в сосуд для суспензионной культуры. В вариантах осуществления агрегированные клетки/скопления клеток засевают в суспензионную культуру с плотностью клеток от около 0,75×106 клеток/мл до около 2,0×106 клеток/мл, предпочтительно от около 1×106 клеток/мл до около 2,0×106 клеток/мл, более предпочтительно от около 1,5×106 клеток/мл до около 2,0×106 клеток/мл. Можно использовать любую систему суспензионной культуры, известную специалистам в данной области, для культивирования в суспензионной культуре агрегированных клеток. В частности, система суспензионной культуры может включать в себя посев агрегированных клеток или скоплений клеток во флакон, такой как центрифужная пробирка или вращающаяся колба.
[0117] В дополнительном варианте осуществления клетки по завершении стадии 4 (после 2 или 3 суток в культуре) можно обрабатывать ингибитором Rho-ассоциированной киназы (ROCK), таким как Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-аминоэтил)-N-(пиридин-4-ил)циклогексанкарбоксамид), GSK269962 (N-[3-[[2-(4-амино-1,2,5-оксадиазол-3-ил)-1-этил-1H-имидазо[4,5-c]пиридин-6-ил]окси]фенил]-4-[2-(4-морфолинил)этокси]бензамид), H1152 ((S)-(+)-2-метил-1-[(4-метил-5-изохинолинил)сульфонил]гомопиперазин, 2 HCl,) и SR3677 (N-[2-[2-(диметиламино)этокси]-4-(1H-пиразол-4-ил)фенил-2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-2-карбоксамиддигидрохлорид). В определенных вариантах осуществления можно применять от около 1 до 20 мкМ, от около 1 до 15 мкМ, от около 1 до 10 мкМ или около 10 мкМ ингибитора ROCK.
[0118] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения только клетки поздней стадии 4, например клетки, которые были культивированы в течение от 1 до 2 дней или от 1 до 3 дней в адгезивных плоских культурах, можно затем культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость или культивировать до получения агрегированных клеток, например скоплений клеток, для завершения стадии 4. В одном варианте осуществления изобретения клетки поздней стадии 4, которые обработали ингибитором ROCK, культивируют на поверхности раздела воздух-жидкость. В вариантах осуществления высевают от 0,5 до около 0,75×105 клеток/микролитров для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость; альтернативно высевают приблизительно от 2 до 6×106 клеток для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость. В другом варианте осуществления клетки поздней стадии 4, которые обработали ингибитором ROCK, культивируют до агрегирования клеток с образованием агрегированных клеток, таких как скопления клеток. В вариантах осуществления клетки засевают в сосуд, который облегчает агрегирование клеток или скоплений клеток (трехмерные агрегаты клеток). В некоторых вариантах осуществления сосуд представляет собой планшет с лунками или микролунками. В частности, скопления клеток получают в планшетах с микролунками с образованием агрегатов клеток одинаковых размера и формы, например с помощью планшетов Aggrewell™ (STEMCELL Technologies Inc., г. Ванкувер, Канада). В вариантах осуществления засевают от около 50 до 3000 клеток на одну лунку или микролунку для получения агрегированных клеток или скоплений клеток. В частности, засевают от около 50 до около 3000 клеток на одну лунку или микролунку, предпочтительно засевают от около 50 до около 2000 клеток, от около 50 до 1000 клеток, от 50 до 900 клеток, от 50 до 800 клеток, от 100 до 800 клеток, от 250 до 800 клеток или от около 500 до около 800 клеток. Более предпочтительно засевают от около 700 до 800 клеток на одну лунку или микролунку. В другом варианте осуществления агрегированные клетки или скопления клеток дополнительно культивируют в суспензии. В определенных вариантах осуществления адгезивные клетки в плоской культуре можно обрабатывать раствором для разъединения клеток, таким как раствор, содержащий протеолитические и коллагенолитические ферменты, такой как TrypLE™, Accutase™ или Dispase™, перед культивированием на поверхности раздела воздух-жидкость или культивированием для агрегирования клеток, например образования скоплений клеток.
[0119] В альтернативном варианте осуществления можно получать клетки стадии 4 из клеток стадии 3 путем обработки клеток стадии 3 дифференцировочной средой, содержащей среду для выращивания, в которую добавили ингибитор ALK5, ноггин и активатор РКС, такой как ТРВ. В определенных вариантах осуществления в среду можно добавлять около 0,1 мкМ ингибитора ALK5, около 100 нг/мл ноггина и около 500 нМ ТРВ. Клеточная культура может быть в однослойном формате. Обработка может длиться в целом около трех дней. В определенных вариантах осуществления можно обрабатывать клетки в течение двух дней, а затем в последний день можно обрабатывать клетки протеолитическими ферментами, коллагенолитическими ферментами или обоими ферментами для получения суспензии отдельных клеток. Полученные клетки можно засевать на поверхность раздела воздух-жидкость или засевать для генерации агрегированных клеток или скоплений клеток. Можно агрегировать одиночные клетки в скопления клеток, имеющие диаметр менее около 100 мкм с последующим культивированием в присутствии ингибитора ALK5 и LDN-193189. В определенных вариантах осуществления можно культивировать клеточные кластеры, имеющие диаметр менее около 100 мкм в среде, в которую добавили около 200 нМ ингибитора ALK5 и около 100 нМ LDN-193189. В альтернативном варианте осуществления культивирование клеток стадии 4 на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии может значительно увеличивать экспрессию маркеров панкреатической энтодермы и маркеров, относящихся к эндокринным клеткам.
Стадия 5. | Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток-предшественников |
[0120] В одном варианте осуществления способы изобретения включают генерацию клеток стадии 5 путем обработки клеток стадии 4 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую среду для выращивания и предпочтительно представляет собой MCDB-131, DMEM или специализированную среду, такую как BLAR (таблица I). В среду можно добавлять один или более из следующих компонентов: (а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора V рецептора TGF-β, ингибитора I рецептора TGF-β, ингибитора IV рецептора TGF-β, ингибитора VII рецептора TGF-β, ингибитора VIII рецептора TGF-β, ингибитора II рецептора TGF-β, ингибитора VI рецептора TGF-β, ингибитора III рецептора TGF-β, ингибитора рецептора TGF-β SB431542, SD-208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5 I и ингибитора II ALK5; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из Т3, Т4, аналогов Т3, аналогов Т4 и их смесей; (с) антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), выбранный из SANT-1 или HIP-1; (d) ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, ноггина или хордина; (e) ретиноевая кислота; (f) аскорбиновая кислота; (g) гепарин; и (h) сульфат цинка, и культивирование клеток предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость в течение от около двух до четырех дней, предпочтительно около трех дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В другом варианте осуществления в среду для выращивания также добавляют один или оба из ингибитора SMO (такого как MRT10 или циклопамин) и фактора роста фибробластов, выбранного из FGF-7 или FGF-10. Обработку клеток стадии 4 выполняют в течение от около двух до четырех дней предпочтительно около трех дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5.
[0121] В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 4 дифференцируют в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, в которую добавили от около 0,1 мкМ до около 0,4 мкМ SANT-1 и предпочтительно около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, от около 0,1 мМ до около 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ и предпочтительно около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, от около 50 нМ до около 200 нМ и предпочтительно около 100 нМ LDN-193189, около 1 мкМ Т3 и около 10 000 нМ ингибитора ALK5, более предпочтительно ингибитора II ALK5. В еще одном варианте осуществления клетки необязательно также обрабатывают от около 1 до 15 мкМ, альтернативно от около 1 до 10 мкМ, альтернативно от около 5 до 10 мкМ, предпочтительно около 10 мкМ сульфата цинка (ZnSO4) и от около 1 до 100 мкг/мл, предпочтительно около 10 мкг/мл гепарина. Обработку клеток стадии 4 выполняют в течение от около двух до четырех дней, предпочтительно около 3 дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5.
[0122] В еще одном варианте осуществления способы изобретения включают получение клеток стадии 5 путем обработки клеток стадии 4 средой, в которую добавили гепарин, ингибитор SMO или антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), RA, ингибитор рецептора BMP и ингибитор ALK5, и культивирование клеток на поверхности раздела воздух-жидкость на протяжении около 3 дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления в среду можно добавлять как ингибитор SMO, так и антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), а также RA, ингибитор рецептора ВМР и ингибитор ALK5. Таким образом, в одном варианте осуществления клетки стадии 4 можно дифференцировать в клетки стадии 5 путем обработки клеток стадии 4 средой, в которую добавили гепарин, ZnSO4, ингибитор SMO или антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), RA, LDN-193189 и ингибитор II ALK5. В альтернативном варианте осуществления в среду можно добавлять как ингибитор SMO, так и антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). В одном варианте осуществления клетки стадии 4 дифференцируют в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, в которую добавили около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 50 нМ LDN-193189, около 10 нМ Т3 и около 1000 нМ ингибитора ALK5. Приемлемые ингибиторы ALK5 включают в себя, без ограничений, SD-208, ингибитор II ALK5, ингибитор V рецептора TGF-β, ингибитор I рецептора TGF-β, ингибитор IV рецептора TGF-β, ингибитор VII рецептора TGF-β, ингибитор VIII рецептора TGF-β, ингибитор II рецептора TGF-β, ингибитор VI рецептора TGF-β, ингибитор III рецептора TGF-β и их комбинации. Обработку клеток стадии 4 выполняют в течение от около двух до четырех дней, предпочтительно около 3 дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5.
[0123] В предпочтительном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор II ALK5. В другом предпочтительном варианте осуществления применяют около 10 000 нМ ингибитора II ALK5. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 4 обрабатывают средой, в которую добавили около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 100 нМ LDN-193189 и около 10 000 нМ (10 мМ) ингибитора II ALK5. В еще одном альтернативном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, в которую добавили ингибитор SMO или антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), RA и ингибитор ALK5, и культивирование клеток предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии на протяжении от около двух до четырех дней, предпочтительно около 3 дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления в среду можно добавлять как ингибитор SMO, так и антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). В одном варианте осуществления клетки стадии 4 дифференцируют в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, в которую добавили около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 50 нМ LDN-193189, около 1 мкМ T3 и около 1000 нМ ингибитора ALK5.
[0124] Количество клеток, посеянных для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость, может варьироваться. Например, для культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость капли суспензии одиночных клеток, содержащей от около 0,5 до 6×105 клеток/мкл, можно высеивать на пористый субстрат (например, фильтр). Суспензия может содержать от около 2×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 4×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 5×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 5×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 2×105 клеток/мкл до около 5×105 клеток/мкл; от около 2×105 клеток/мкл до около 4×105 клеток/мкл; или около 3×105 клеток/мкл, которые можно высеивать на пористый субстрат, такой как фильтр, размещенный на поверхности раздела воздух-жидкость. В некоторых вариантах осуществления капли суспензии одиночных клеток, содержащие от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл; от около 0,6×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл; или от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,6×105 клеток/мкл, высеивают на пористую подложку для культивирования на ALI.
[0125] В случае суспензионной культуры скопления клеток получают в планшетах с микролунками, которые впоследствии засевают в систему суспензионной культуры. В вариантах осуществления планшеты Aggrewell™ используют для индуцирования агрегации, в котором засевают от около 50 до 3000 клеток на одну лунку или микролунку для получения агрегированных клеток или скоплений клеток. В частности, засевают от около 50 до около 3000 клеток на одну лунку или микролунку, предпочтительно от около 50 до около 2000 клеток, от около 50 до 1000 клеток, от около 50 до около 900 клеток, от около 50 до около 800 клеток, от около 100 до около 800 клеток, от около 250 до около 800 клеток или от около 500 до около 800 клеток. Более предпочтительно засевают от около 700 до около 800 клеток на одну лунку или микролунку. Агрегированные клетки/скопления клеток засевают в суспензионную культуру с плотностью клеток от около 0,75×106 клеток/мл до около 2,0×106 клеток/мл, предпочтительно от около 1×106 клеток/мл до около 2,0×106 клеток/мл, от около 1,25×106 клеток/мл до около 2,0×106 клеток/мл и более предпочтительно от около 1,5×106 клеток/мл до около 2,0×106 клеток/мл.
[0126] В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, в которую добавили ингибитор рецептора ВМР (например, LDN-193189, ноггин или хордин) и ингибитор ALK5, на протяжении около 1 дня для дифференцировки клеток стадии 4 в клетки стадии 5. Например, в среду можно добавлять около 100 нМ LDN-193189, и около 100 нМ ингибитора ALK5, и около 1 мкМ Т3. Клетки могут находиться в адгезивной плоской культуре или в форме скоплений. В определенных вариантах осуществления клетки можно обрабатывать раствором для разъединения клеток, таким как раствор, содержащий протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием на поверхности раздела воздух-жидкость или культивированием с образованием агрегированных клеток или скоплений клеток.
[0127] В соответствии с вышеупомянутым способом в изобретении дополнительно обеспечивают клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатической энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников (панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников), содержащую: (а) сосуд для культивирования; (b) объем среды для выращивания в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух в пределах указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, свободную от указанной среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенных на поверхности указанного субстрата так, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
[0128] В соответствии с вышеупомянутым способом в альтернативном варианте осуществления изобретения дополнительно обеспечивают клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатической энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников (панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников), содержащую: (a) сосуд для культивирования, который облегчает агрегацию клеток или формирование скоплений клеток; (b) объем среды для выращивания (культуральной среды) внутри указанного сосуда; (с) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные внутри сосуда так, чтобы индуцировать их агрегирование и образование скоплений; и (d) полученные скопления клеток, расположенные в суспензии (суспензионная культура). В вариантах осуществления сосуд для агрегирования клеток представляет собой планшет с лунками или микролунками, такой как планшеты Aggrewell™ (планшеты с микролунками; STEMCELL Technologies Inc., г. Ванкувер, Канада). В вариантах осуществления система суспензионной культуры может включать в себя посев агрегированных клеток или скоплений клеток в сосуд для суспензионной культуры, такой как флакон, например центрифужная пробирка или вращающаяся колба.
Стадия 6. | Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для незрелых бета-клеток |
[0129] В одном варианте осуществления способы изобретения включают получение клеток стадии 6 путем обработки клеток стадии 5 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую среду для выращивания, предпочтительно такую как MCDB-131 или CMRL и более предпочтительно специализированную среду, такую как BLAR (таблица I). В среду можно добавлять один или более из следующих компонентов:
(а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора V рецептора TGF-β, ингибитора I рецептора TGF-β, ингибитора IV рецептора TGF-β, ингибитора VII рецептора TGF-β, ингибитора VIII рецептора TGF-β, ингибитора II рецептора TGF-β, ингибитора VI рецептора TGF-β, ингибитора III рецептора TGF-β, ингибитора рецептора TGF-β SB431542, SD-208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5 I и ингибитора II ALK5; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из Т3, Т4, их аналогов и их смесей; (c) ингибитор рецептора ВМР, предпочтительно выбранный из LDN-193189, ноггина или хордина; (d) ингибитор гамма-секретазы, такой как ингибитор XX гамма-секретазы, ингибитор XXI гамма-секретазы, ингибитор XVI гамма-секретазы или DAPT; (e) аскорбиновая кислота; (f) гепарин; и (g) сульфат цинка. Клетки можно культивировать, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензионной культуре, в течение от около двух до четырех, предпочтительно около трех дней для дифференцировки клеток стадии 5 в клетки стадии 6. В среду можно необязательно дополнительно добавлять один или более из антагониста сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитора рецептора Smoothened, фактора роста фибробластов и ретиноевой кислоты.
[0130] В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, в которую добавили около 50 нМ RA, около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, около 100 нМ LDN-193189, около 10 000 нМ ингибитора ALK5 и предпочтительно ингибитора II ALK5, 1 мкМ Т3, около 100 нМ ингибитора гамма-секретазы в течение около семи дней. Альтернативно клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки клеток средой, в которую добавили около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, около 1000 нМ ингибитора ALK5 и 1 мкМ T3 в течение около трех дней. Клетки можно культивировать в такой среде на протяжении дополнительных двух дней или более, если это желательно.
[0131] Альтернативно клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, в которую добавили гепарин, ингибитор SMO или антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитор ВМР, Т3, Т4, их аналоги и их смеси и ингибитор ALK5, и культивирования предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензионной культуре в течение от около одного до семи дней, альтернативно около шести дней, альтернативно около семи дней. В альтернативном варианте осуществления в среду можно добавлять как ингибитор SMO, так и антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). Например, клетки можно культивировать в среде, в которую добавили около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 100 нМ LDN-193189, около 1000 нМ Т3 и от около 500 до около 10 000 нМ, альтернативно около 500 нМ, альтернативно около 1000 мМ и альтернативно около 10 000 нМ ингибитора ALK5. Приемлемые ингибиторы ALK5 включают в себя, без ограничений, SD-208, ингибитор II ALK5, ингибитор V рецептора TGF-β, ингибитор I рецептора TGF-β, ингибитор IV рецептора TGF-β, ингибитор VII рецептора TGF-β, ингибитор VIII рецептора TGF-β, ингибитор II рецептора TGF-β, ингибитор VI рецептора TGF-β, ингибитор III рецептора TGF-β и их комбинации.
[0132] В предпочтительном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор II ALK5. В более предпочтительном варианте осуществления применяют около 10 000 нМ (10 мМ) ингибитора II ALK5. Соответственно, в одном варианте осуществления клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, в которую добавили гепарин, ингибитор SMO или антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитор ВМР, Т3, Т4, их аналоги и их смеси и ингибитор ALK5, и культивирования предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии предпочтительно в течение около семи дней. В альтернативном варианте осуществления в среду можно добавлять как ингибитор SMO, так и антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). В определенных вариантах осуществления клетки можно обрабатывать раствором для разъединения клеток, таким как раствор, содержащий протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии.
[0133] В другом варианте осуществления клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, в которую добавили гепарин, ингибитор SMO или антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитор ВРМ, Т3 и ингибитор II ALK5, и культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость на протяжении от около 5 дней до около 7 дней, альтернативно около 5 дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней В этих вариантах осуществления в среду можно добавлять около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 100 нМ LDN-193189, около 1000 нМ Т3 и около 10 000 нМ ингибитора II ALK5. В определенных вариантах осуществления в среду можно дополнительно добавлять сульфат цинка (ZnSO4). Например, в среду можно дополнительно добавлять около 10 мМ ZnSO4. В альтернативном варианте осуществления в среду можно добавлять как ингибитор SMO, так и антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH).
[0134] В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения в среду добавляют один или более из ингибитора киназы Aurora, предпочтительно ингибитора II киназы Aurora, ингибитора RSK, предпочтительно ингибитора II RSK и ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L, предпочтительно EPZ-5676. Добавленное количество может составлять от около 100 до 5000 нМ, альтернативно от около 1000 до 5000 нМ, альтернативно от около 2000 до 5000 нМ, альтернативно от около 3000 до 5000 нМ и предпочтительно от около 1000 до 2000 нМ для киназы Aurora и ингибиторов RSK и от около 100 до 1000 нМ для ингибитора DOT1L и более предпочтительно от около 1 мкМ до около 10 нМ.
[0135] В соответствии с вышеупомянутым способом в изобретении дополнительно обеспечивают клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для незрелых бета-клеток, содержащую: (а) сосуд для культивирования; (b) объем среды для выращивания в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух в пределах указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, свободную от указанной среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между указанной средой и указанным воздухом; и (e) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенных на поверхности указанного субстрата так, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
[0136] В соответствии с вышеуказанным способом в альтернативном варианте осуществления изобретения дополнительно обеспечивают клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников (или панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для незрелых бета-клеток, содержащую: (a) сосуд для культивирования, который облегчает агрегацию клеток или формирование скоплений клеток; (b) объем среды для выращивания (культуральной среды) внутри указанного сосуда; (с) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные внутри сосуда так, чтобы индуцировать их агрегирование и образование скоплений; и (d) полученные скопления клеток, расположенные в суспензии (суспензионная культура). В вариантах осуществления сосуд для агрегирования клеток представляет собой планшет с лунками или микролунками, такой как планшеты Aggrewell™. В вариантах осуществления система суспензионной культуры может включать в себя посев агрегированных клеток или скоплений клеток в сосуд для суспензионной культуры, такой как флакон, например центрифужная пробирка или вращающаяся колба.
[0137] В одном варианте осуществления клетки стадии 5, полученные в соответствии с вариантами осуществления изобретения, используют и дифференцируют в клетки стадии 6, при этом в других вариантах осуществления в данном способе для получения клеток стадии 6 и 7 можно использовать клетки стадии 5, полученные в соответствии с другими протоколами.
[0138] В варианте осуществления способы изобретения приводят к образованию клеток стадии 6, которые являются положительными в отношении единственного гормона. Таким образом, в одном варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые совместно экспрессируют NKX6.1, инсулин, хромогранин и PDX1. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые совместно экспрессируют NKX6.1 и инсулин. В определенных вариантах осуществления изобретения способ включает применение специализированной среды (см. таблицу I) на стадиях от 4 до 6, или начиная от поздней стадии 4 до стадии 6, или на стадиях 5 и 6. Среду можно заменять каждый день или альтернативно через день.
[0139] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу образования клеток стадии 6, совместно экспрессирующих NKX6.1 и хромогранин, включающему культивирование клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 6 на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу образования клеток стадии 6, положительных в отношении единственного гормона инсулина и экспрессирующих NKX6.1, путем культивирования клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 6 на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии.
Стадия 7. | Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для незрелых бета-клеток, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для функциональных бета-клеток, выполненных с возможностью обеспечения ответа в виде двухфазной GSIS и активации митохондриального дыхания |
[0140] В одном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 6 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую среду для выращивания, предпочтительно такую как MCDB-131 или CMRL или и более предпочтительно специализированную среду, такую как BLAR001 (таблица I) или BLAR004 (таблица IV) в течение семи дней.
[0141] В среду добавляют один или более из следующих компонентов: 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия с добавлением ITS-X в разведении 1: 200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 нМ T3 (низкий Т3); 1 мМ N-ацетилцистеина (NAC); 0,5 мкМ ZM447439 (ZM); и следующие компоненты, которые входят в состав I (FI) (таблица XII) - среда RPMI с витаминной добавкой в разведении 1: 200; среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1: 200; концентрат липидов с определенным химическим составом в разведении 1: 2000; пируват натрия в разведении 1: 200; следовые элементы А (г. Корнинг, № по каталогу 25-021) в разведении 1: 2000; следовые элементы B (г. Корнинг, № по каталогу 25-022) в разведении 1: 2000. Дополнительные соединения, которые можно добавлять для выполнения стадии 7, включают около 10 нМ T3 (низкий Т3); 5 мкМ 5-азацитидина (AZT) (Sigma Aldrich, № по каталогу A2385); или около 1 мкМ 3-деазанепланоцина А (DEZA) (Biovision, Inc., № по каталогу 2060). В вариантах осуществления для получения клеток стадии 7 среда не содержит ингибитора ALK5.
[0142] В одном варианте осуществления клетки стадии 6 можно дифференцировать в клетки стадии 7 путем обработки средой, в которую добавили около 10 нМ Т3, около 0,5 мкМ одного или более из ингибитора II киназы Aurora и около 1 мМ N-ацетилцистеина. В альтернативном варианте осуществления клетки стадии 6 можно дифференцировать в клетки стадии 7 путем обработки средой, в которую добавили гепарин, Т3, Т4, их аналоги или их смеси, антиоксиданты и ингибитор киназы Aurora или их смеси, и культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензионных культурах в течение от около семи до двадцати одного дня, альтернативно от около семи до десяти дней, предпочтительно около семи дней.
[0143] В соответствии с вышеупомянутым способом в изобретении дополнительно обеспечивают клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для функциональных бета-клеток, содержащую: (а) сосуд для культивирования; (b) объем среды для выращивания в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух в пределах указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, свободную от указанной среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между указанной средой и указанным воздухом; и (e) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенных на поверхности указанного субстрата так, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
[0144] В одном варианте осуществления клетки стадии 6, культивированные в соответствии с вариантами осуществления изобретения, используют и дифференцируют в клетки стадии 7, при этом в других вариантах осуществления в данном способе для получения клеток стадии 7 можно использовать клетки стадии 6, культивированные в соответствии с другими протоколами. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к образованию клеток стадии 7, которые являются положительными в отношении единственного гормона. Таким образом, в одном варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 7, которые совместно экспрессируют NKX6.1, хромогранин, PDX1, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 7, которые совместно экспрессируют NKX6.1, PDX1, инсулин, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В еще одном варианте осуществления образуется популяция клеток, в которой каждая клетка из по меньшей мере около 10%, альтернативно по меньшей мере около 20%, альтернативно по меньшей мере около 30%, альтернативно по меньшей мере около 40%, альтернативно по меньшей мере около 50%, альтернативно по меньшей мере около 60%, альтернативно по меньшей мере около 70%, альтернативно по меньшей мере около 80% или альтернативно по меньшей мере около 90% популяции клеток экспрессирует инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA.
[0145] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10% клеток итоговой клеточной популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В других вариантах осуществления по меньшей мере 20% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В других вариантах осуществления по меньшей мере 30% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В еще других вариантах осуществления по меньшей мере 40% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В еще одних вариантах осуществления по меньшей мере 50% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В еще одних вариантах осуществления по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% клеток экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA. В альтернативных вариантах осуществления по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA.
[0146] В определенных и предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ использует специализированную среду BLAR (таблица I) на стадиях от 4 до 7, или начиная от поздней стадии 4 до стадии 7, или на стадиях 5, 6 и 7. Среду можно предпочтительно заменять каждый день или альтернативно через день.
[0147] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу образования клеток стадии 7, совместно экспрессирующих NKX6.1, PDX1, MAFA, UCN3, SLC2A1 и хромогранин, включающему культивирование клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 7 на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу образования клеток стадии 7, положительных в отношении единственного гормона инсулина (функциональные бета-клетки) и экспрессирующих NKX6.1, PDX1, UCN3, SLC2A1 и MAFA, путем культивирования клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 7 на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии.
[0148] Хотя настоящее изобретение предусматривает культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость на всех стадиях пути от плюрипотентной клетки до панкреатической эндокринной клетки, в изобретении обеспечено образование клеток стадии от 1 до 4 в плоской или погруженной культуре и клеток стадии 5, 6 и 7 путем культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензионной культуре. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток, включающему культивирование клеток на стадиях 4, 5 и 6 на поверхности раздела воздух-жидкость. В определенных вариантах осуществления клетки, культивированные в течение стадий от 4 до 7, можно культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость. В других вариантах осуществления на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии культивируют только клетки от поздней стадии 4 до стадии 6 или клетки стадии 5 и стадии 6. В еще одном альтернативном варианте осуществления стадии от 1 до 4 выполняют путем культивирования клеток в плоских культурах, а стадии от 5 до 7 или стадии от 6 до 7 или только стадию 7 выполняют путем культивирования в суспензионной культуре.
[0149] Культивирование в течение одной или всех из стадий 5, 6 и 7 дополнительно выполняют в присутствии одного или более из Т3, Т4, их аналогов и ингибитора ALK5 или одного или более из Т3, Т4 и их аналогов; или ингибитора ALK5. В предпочтительных вариантах осуществления культивирование в течение одной или более и всех из стадий 5, 6 и 7 предпочтительно выполняют в присутствии Т3 и ингибитора ALK5 и более предпочтительно в присутствии Т3 и ингибитора II ALK5. В более предпочтительных вариантах осуществления культивирование во время стадии 7 выполняют в присутствии T3 в низкой концентрации. В предпочтительных вариантах осуществления культивирование во время стадии 7 выполняют без добавления ингибитора ALK5.
[0150] При культивировании клеток на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) клетки можно культивировать на пористом субстрате так, что клетки находятся в контакте с воздухом на верхней стороне и с клеточной культуральной средой на нижней стороне. Например, можно добавлять достаточный объем среды на дно сосуда для культивирования, содержащего пористый субстрат (например, фильтрующую вставку), так, что среда будет контактировать с нижней поверхностью клеток, расположенных на субстрате, но не будет герметизировать или погружать их. Приемлемые пористые субстраты можно формировать из любого материала, который не окажет отрицательного влияния на рост и дифференцировку клеток. Примеры пористых субстратов изготавливают из полимеров, таких как полиэтилентерефталат (РЕТ), полиэфир или поликарбонат. Приемлемые пористые субстраты могут быть с покрытием или без покрытия. В одном варианте осуществления покрытие может представлять собой MATRIGEL™. В другом варианте осуществления изобретения пористый субстрат представляет собой пористую фильтрующую вставку, которую можно покрывать MATRIGEL™. В другом варианте осуществления изобретения пористый субстрат представляет собой фильтрующую вставку без покрытия. Пористость субстрата должна быть достаточной для поддержания жизнеспособности клетки и стимуляции дифференцировки клеток.
[0151] Культивирование клеток на поверхности раздела воздух-жидкость включает в себя посев клеток на пористый субстрат, такой как пористая фильтрующая вставка. В определенных вариантах осуществления размер пор в субстрате может находиться в диапазоне от около 0,3 до около 3 мкм. Можно выполнять посев путем высвобождения одиночных клеток из однослойных культур или скоплений клеток из однослойных культур в суспензию и последующего аликвотирования суспензии из одиночных клеток или взвешенной клеточной культуры на пористый субстрат на поверхности раздела воздух-жидкость. Клетки можно засевать на пористый субстрат из суспензии, имеющей от около 1000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл. Клетки можно высеивать в виде капель клеточной суспензии, содержащей отдельные клетки или агрегаты или скопления клеток. В определенном варианте осуществления клетки можно культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость с использованием способов, изложенных в публикации заявки на патент США № 2014/0186305, описание которой включено в настоящий документ, так как она относится к культивированию и дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток на поверхности раздела воздух-жидкость.
[0152] Среду можно менять или обновлять через день или предпочтительно каждый день. Клетки, выросшие на верхней стороне пористого субстрата, по существу не являются одиночными клетками, но чаще они находятся в форме пласта или существуют в виде агрегированного скопления клеток. Клетки, культивированные на ALI, могут испытывать большее давление кислорода по сравнению с клетками, погруженными в среду.
[0153] В определенных вариантах осуществления способы изобретения можно выполнять путем культивирования и дифференцировки клеток в виде скоплений в суспензионной культуре. Примерные приемлемые способы для получения суспензионной культуры и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток описаны в заявках на патент США № 2014/0242693 и 2014/0295552, описания которых включены в настоящий документ, так как они относятся к культивированию и дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток с использованием скоплений в суспензии. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения обеспечивают клеточную культуру in vitro, включающую дифференцировку клеток, полученных в виде агрегированных клеток, таких как скопления клеток, включающую посев клеток в сосуд для культивирования, который облегчает агрегирование клеток или образование скоплений клеток, содержащий среду для выращивания (культуральную среду) так, что клетки индуцируют агрегирование и образование скоплений. В вариантах осуществления сосуд, используемый для индуцирования агрегирования клеток, представляет собой планшет с лунками или микролунками, такой как планшеты Aggrewell™. Полученные агрегированные клетки или скопления клеток дополнительно культивируют в суспензии (суспензионная культура), включая удаление агрегированных клеток/скоплений клеток из микролунок и их посев в сосуд для суспензионной культуры так, чтобы дифференцировать агрегированные клетки в суспензии.
[0154] Варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя образование клеток, начиная от поздней стадии 4 до стадии 7, предпочтительно клеток стадий от 5 до 7, на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии. Клетки можно получать путем дифференцировки плюрипотентных столовых клеток или путем дополнительного дифференцировки клеток стадий 3, 4, 5 или 6. Клетки стадии 4 можно культивировать полностью на поверхности раздела воздух-жидкость или клетки можно культивировать в погруженной плоской культуре во время раннего периода стадии 4 (от около одного до двух дней) и впоследствии культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии во время позднего периода стадии 4 (от около второго до третьего дня). Стадию 4 предпочтительно выполняют не на ALI или в суспензии, а в погруженной культуре.
[0155] В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для функциональных бета-клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий: культивирование плюрипотентных стволовых клеток; дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической энтодермы; и дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатической энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии. Способ может включать обработку средой, в которую добавили: (i) T3, T4 или их аналоги; (ii) ингибитор ALK5; или как (i), так и (ii). Способ может включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки (клетки стадии 3), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток (клетки стадии 4), путем обработки средой, в которую добавили: (i) один или оба из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитор ALK5; или как (i), так и (ii); и культивирование в плоской культуре. Способ может также включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток (клетки стадии 4), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для незрелых бета-клеток (клетки стадии 6), путем обработки средой, в которую добавили: (i) один или оба из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитор ALK5; или как (i), так и (ii); и культивирование в плоской культуре или культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии. Способ дополнительно включает дифференцировку клеток стадии 6 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для функциональных бета-клеток, и которые имеют более зрелый фенотип по сравнению с клетками стадии 6 (клетки стадии 7), путем обработки средой, в которую добавили: (i) один или оба из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитор ALK5; или как (i), так и (ii); а также один или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L и необязательно антиоксиданта, такого как витамин Е или ацетилцистеин. Предпочтительное количество ацетилцистеина составляет от около 0,1 до около 2 мМ. Предпочтительное количество витамина Е составляет от около 0,1 до около 10 мкМ. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает выполнение стадии 6 путем обработки клеток стадии 5 средой, в которую добавили: (i) один или оба из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитор ALK5 или; как (i), так и (ii); а также один или более из ингибитора гамма-секретазы, ингибитора RSK и ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L. В еще одном варианте осуществления стадию 6 выполняют путем обработки клеток стадии 5 средой, в которую добавили: (i) один или оба из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитор ALK5; или как (i), так и (ii); а также один или более из ингибитора гамма-секретазы, ингибитора RSK и ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L с последующим выполнением стадии 7 путем обработки средой, в которую добавили: (i) один или оба из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитор ALK5; или как (i), так и (ii); а также один или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK, ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L и необязательно антиоксиданта, такого как витамин Е или ацетилцистеин.
[0156] Один вариант осуществления изобретения представляет собой способ образования функциональных бета-клеток (панкреатических эндокринных клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для зрелого фенотипа) (клетки стадии 7), включающий дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток (клетки стадии 4), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток стадии 7, путем культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для функциональных бета-клеток более зрелого фенотипа, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих факторов транскрипции: NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, MAFA, UCN3, SLC2A1, PAX4, HB9 и PAX6. В одном из вариантов осуществления методы изобретения приводят к образованию клеток стадии 6, которые являются положительными для NKX6.1, PDX1, HB9 и MAFA. Предпочтительно по меньшей мере во время стадий от 5 до 7 способ включает обработку средой, в которую добавили T3, T4 или их аналоги, ингибитор ALK5 или и то и другое. Клетки стадии 6 могут быть клетками, которые являются положительными для NKX6.1, PDX1, HB9 и MAFA. В других вариантах осуществления клетки стадии 6 или 7 являются положительными для одного гормона. Например, клетки стадии 6 и 7 могут представлять собой клетки, которые: (a) совместно экспрессируют NKX6.1 и хромогранин; (b) совместно экспрессируют NKX6.1 и инсулин; и (c) совместно экспрессируют NKX6.1, PDX1, MAFA и единственный гормон инсулин. Клетки стадии 7 экспрессируют единственный гормон инсулин и MAFA на повышенных уровнях и содержат большее число клеток внутри популяции клеток по сравнению с клетками стадии 6.
[0157] В другом варианте осуществления изобретения предложен способ увеличения числа клеток, положительных в отношении единственного гормона (например, клетки, которые совместно экспрессируют NKX6.1 и инсулин, или клетки, которые совместно экспрессируют NKX6.1 и хромогранин, путем культивирования и дифференцировки популяции клеток, совместно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии. В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивированные на поверхности раздела воздух-жидкость или в суспензии, дополнительно дифференцируют до функциональных бета-клеток путем обработки соединением, выбранным из следующего: ингибитор ALK5, ингибитор ВМР, ингибитор гамма-секретазы, Эфрин лиганды, ингибитор EphB, ингибитор РКС, ингибитор EGFr, ретиноевая кислота, витамин С, Т3/Т4, глюкоза, регуляторы клеточного цикла, регуляторы WNT, ингибитор SHH, ингибитор Aurora, антиоксиданты, витамин Е, ацетилцистеин или их комбинации.
[0158] В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу поэтапного дифференцировки плюрипотентных клеток, который включает культивирование клеток стадии от 4 до 6 в среде, содержащей достаточные количества: (i) одного или более из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитор ALK5; или как (i), так и (ii); и дополнительное культивирование клеток стадии 6 в среде, которая необязательно содержит один или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK, и ингибитора протеин-метилтрансферазы DOT1L, и антиоксиданта для генерации функциональных бета-клеток (панкреатические эндокринные клетки зрелого фенотипа) и популяций функциональных бета-клеток, которые экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1, UCN3, SLC2A1 и MAFA.
[0159] Клетки стадии 6 и 7, полученные в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, также хорошо подходят для применения в соединениях, используемых для скрининга, из-за их влияния на секрецию панкреатических гормонов и эндокринных маркеров. В частности, клетки стадии от 4 до 7, культивированные на ALI или в суспензионной культуре, выполнены с возможностью тестирования в различных формах для культивирования, содержащих от 384 до 6 лунок. Такие формы позволяют оценивать множество малых молекул или биологических препаратов в различных дозах и временных интервалах в отношении последующей экспрессии маркеров панкреатических энтодермальных клеток, панкреатических эндокринных клеток-предшественников, панкреатических эндокринных клеток и панкреатических бета-клеток. Такое оценивание можно выполнять путем измерения экспрессии генов с помощью ПЦР, экспрессии белков с помощью FACS, или иммуноокрашивания, или с помощью ИФА в отношении секреции факторов клетками, подвергнутыми воздействию малых молекул/биологических препаратов.
F. Клетки, выполненные с возможностью получения способами изобретения
[0160] В изобретении обеспечивают клетки стадии 7 или популяцию клеток стадии 7, которую можно получать способом изобретения. В определенных вариантах осуществления клетки или популяции клеток не очищают после дифференцировки. В определенных вариантах осуществления эти клетки стадии 7 экспрессируют единственный гормон инсулин и являются PDX1-, NKX6.1-, UCN3-, SLC2A1- и MAFA-положительными; кроме того, эти клетки имеют более высокий уровень экспрессии MAFA, чем клетки стадии 6. Клетки экспрессируют UCN3 на более высоком уровне, чем клетки стадии 6 (незрелые бета-клетки). Полученная популяция клеток имеет более высокий процент MAFA-положительных и экспрессирующих единственный гормон инсулин клеток, чем клетки стадии 6. В изобретении также обеспечивают инсулин-положительную клетку или популяцию инсулин-положительных клеток, экспрессирующую маркеры, характерные для функциональных бета-клеток (панкреатические эндокринные клетки зрелого фенотипа), которая характеризуется экспрессией NKX6.1 (предпочтительно более около 30%), экспрессией PDX1 (предпочтительно более около 30%), экспрессией UCN3 (предпочтительно более около 10%), экспрессией SLC2A1 (предпочтительно более около 10%) и экспрессией MAFA (предпочтительно более около 10%).
[0161] В вариантах осуществления изобретения клетки или популяции клеток стадии 7 представляют собой инсулинпродуцирующие клетки или популяцию инсулинпродуцирующих клеток. Инсулинпродуцирующие клетки представляют собой функционально зрелые бета-клетки, которые показывают реакцию в виде митохондриального дыхания/активности и GSIS на глюкозу, аналогичную подобной в человеческих островковых клетках. В вариантах осуществления изобретения функционально зрелые бета-клетки получают в суспензионной культуре.
[0162] В вариантах осуществления функциональные бета-клетки показывают стимулированную глюкозой секрецию инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание. В вариантах осуществления стимулированная глюкозой секреция инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание аналогичны подобным в человеческих островковых клетках. В вариантах осуществления изобретения функциональная бета-клетка секретирует инсулин во множестве фаз.
[0163] В вариантах осуществления глюкозозависимое митохондриальное дыхание имеет максимальную реакцию в виде увеличения скорости потребления кислорода после стимуляции глюкозой в диапазоне от около 20% до около 80% сверх исходной скорости потребления кислорода, предпочтительно от около 20% до около 70%, от около 20% до около 60%, более предпочтительно около 20%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70%, около 75% или около 80%. В вариантах осуществления реакция в виде увеличения скорости потребления кислорода происходит по меньшей мере по истечении от 10 минут до около 15 минут после стимуляции глюкозой, предпочтительно по истечении около 10 минут, около 11 минут, около 12 минут, около 13 минут, около 14 минут, около 15 минут. В вариантах осуществления более высокую скорость потребления кислорода по сравнению с исходной OCR сохраняют в течение от по меньшей мере 60 минут до по меньшей мере 80 минут, предпочтительно от по меньшей мере 70 минут до по меньшей мере 80 минут, более предпочтительно по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 минут.
[0164] В указанных выше вариантах осуществления стимулированная глюкозой секреция инсулина представляет собой быструю двухфазную секрецию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой. В вариантах осуществления в первой фазе двухфазной секреции инсулина наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере четырех до по меньшей мере восьми раз по сравнению с секрецией на исходном уровне, предпочтительно по меньшей мере увеличение в четыре раза, увеличение в пять раз, увеличение в шесть раз, увеличение в семь раз или увеличение в восемь раз по сравнению с секрецией на исходном уровне. В вариантах осуществления во второй фазе двухфазной секреции инсулина наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере двух раз до по меньшей мере четырех раз по сравнению с секрецией на исходном уровне, предпочтительно по меньшей мере увеличение в два раза, увеличение в три раза или увеличение в четыре раза по сравнению с секрецией на исходном уровне. В вариантах осуществления секреция инсулина происходит в интервале от по меньшей мере пяти минут до по меньшей мере десяти минут после стимуляции глюкозой, предпочтительно через по меньшей мере 5 минут, через по меньшей мере 6 минут, через по меньшей мере 7 минут, через по меньшей мере 8 минут, через по меньшей мере 9 минут или через по меньшей мере 10 минут после стимуляции глюкозой.
[0165] В таблице А и В показаны примерные условия культивирования, приемлемые для применения в вариантах осуществления изобретения. В таблицах A и B, представленных ниже, «MCX» является «соединением МСХ», «АА» представляет собой активин, «ALK5 инг.» является ингибитором ALK5, «RA» представляет собой ретиноевую кислоту, «Вит. С» является аскорбиновой кислотой, «инг.» представляет собой ингибитор, «акт.» - активатор. В некоторых вариантах осуществления можно комбинировать любую одну обработку на одной стадии (т. е. на любой из стадий 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) с любым одним видом обработки на других стадиях (т. е. на любой одной из стадий 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7). В других вариантах осуществления клетки стадии 4, полученные способами, отличными от приведенных в таблице А, можно дифференцировать в клетки стадии от 5 до 7 с использованием условий культивирования, показанных в таблице В. В других вариантах осуществления клетки стадии 5, полученные способами, отличными от приведенных в таблицах А и В, можно дифференцировать в клетки стадии 6 или стадии 7 с использованием условий культивирования, показанных в таблице В. В еще одних вариантах осуществления клетки стадии 6, полученные способами, отличными от приведенных в таблицах А и В, можно дифференцировать в клетки стадии 7 с использованием условий культивирования, показанных в таблице В.
Таблица A. Примеры условий культивирования для получения клеток стадии от 1 до 4 в соответствии с вариантами осуществления изобретения | |||||||
Стадия 1 | Стадия 2 | Стадия 3 | Стадия 4 | ||||
Обработка | Плюрипотентные стволовые клетки | Клетки стадии 1 | Клетки стадии 2 | Клетки стадии 3 | |||
С по меньшей мере |
AA и Wnt3A | ||||||
GDF8 и MCX | |||||||
FGF7 | |||||||
FGF7 и Вит. C | |||||||
SANT-1, RA и ноггин | |||||||
FGF7, ретиноевая кислота, SANT-1, акт. PKC(например, TPB), инг. BMP (например, LDN-193189) и вит. C | |||||||
FGF7, ретиноевая кислота, SANT-1, акт. PKC (например, TPB) и вит. C | |||||||
FGF7, ретиноевая кислота, SANT-1, акт. PKC(например, TPB), инг. BMP (например, LDN-193189) и вит. C | |||||||
Другие необязательные компоненты | 0,5% FAF-BSA | 0,5% FAF-BSA | Среда BLAR 2% FAF-BSA |
||||
Продолжительность обработки | Приблизительно 2-5 суток; предпочтительно около 3-4 дней | Приблизительно 2-3 суток; предпочтительно около 2 дней; предпочтительно около 3 дней при наличии AA и Wnt3A на стадии 1 | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | |||
Условия культивирования | Плоская культура или скопления клеток (суспензионная культура) (роллерные флаконы) | Плоская культура или скопления клеток (роллерные флаконы) | Плоская культура или скопления клеток (роллерные флаконы) | Клетки плоской культуры в конце стадии 4 необязательно засевают на ALI с использованием соединения Y в альтернативном варианте осуществления клетки перемещают в скопления; скопления клеток или роллерные флаконы |
|||
Таблица B. Примеры условий культивирования для получения клеток стадии от 5 до 7 в соответствии с вариантами осуществления изобретения | |||||||
Стадия 5 | Стадия 6 | Стадия 7 | |||||
Обработка | Клетки стадии 4 | Клетки стадии 5 | Клетки стадии 6 | ||||
С по меньшей мере | SANT-1, акт. PKC (например, TPB), инг. BMP (например, LDN-193189), вит. C, инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II), T3 | ||||||
SANT-1, акт. PKC (например, TPB), инг. BMP (например, LDN-193189), инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II), T3 | |||||||
инг. BMP (например, LDN-193189), инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II), T3, инг. гамма-секретазы, гепарин | |||||||
инг. BMP (например, LDN-193189), вит. C, инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II), T3, инг. гамма-секретазы, гепарин | |||||||
T3, N-ацетилцистеин, ZM447439, гепарин, ± ALK5 | |||||||
T3, N-ацетилцистеин, ZM447439, гепарин, ALK5+один из: UNC0638, UNC0642, TC-E5003, A366, PF03814735 SB747651, PFI1, LY303511, MS436 или MC1568 | |||||||
T3, N-ацетилцистеин, ZM447439, гепарин, без ALK5+один из: UNC0638, UNC0642, TC-E5003, A366, PF03814735 SB747651, PFI1, LY303511, MS436 или MC1568 | |||||||
без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC | |||||||
без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT и DEZA | |||||||
Другие необязательные компоненты | Замена гормона T3 гормоном T4 или аналогом гормона щитовидной железы ZnSO4 |
ZnSO4 | ZnSO4 инг ALK5 Замена гормона T3 гормоном T4 или аналогом гормона щитовидной железы AZT DEZA |
||||
Продолжительность обработки | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 6-8 дней, предпочтительно около 7 дней | Приблизительно 6-7 суток; в альтернативном варианте осуществления около 7-14 дней; в альтернативном варианте осуществления около 7-23 дней | ||||
Условия культивирования | ALI или скопления клеток (суспензионная культура) (роллерные флаконы) | ALI или скопления клеток (роллерные флаконы) | ALI или скопления клеток (роллерные флаконы) |
[0166] Публикации, цитируемые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируют, без ограничений, следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
[0167] Поставщики материалов и соединений, использованных в следующих примерах, приведены в таблице Х.
Пример 1.
Скрининг и идентификация малых молекул, которые усиливают экспрессию MAFA или UCN3
[0168] Следующий пример относится к идентификации малых молекул, которые могут улучшать статус созревания панкреатической бета-клетки посредством увеличения генной экспрессии маркеров зрелой бета-клетки, включая MAFA (гомолог А онкогена мышечно-апоневротической фибросаркомы v-maf) или UCN3 (урокортин 3). Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (H1-hESC) со средой EZ8 при пассаже 28 засевали в виде отдельных клеток с плотностью 0,094×106 клеток/см2 на MATRIGEL™ в разведении 1: 30 на чашки Петри с покрытием в модифицированную по способу Дульбекко среду Игла со смесью питательных веществ F-12 (DMEM-F12), содержащую GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1X), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл фактора 2 роста фибробластов (FGF2), 1 нг/мл трансформирующего фактора роста бета (TGFβ), инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITS-X) в разведении 1: 100, не содержащий жирных кислот 2%-й бычий сывороточный альбумин (FAF-BSA) и 20 нг/мл инсулиноподобного фактора-1 роста (IGF-1), в которую добавили 10 мкМ ингибитора Rock Y-27632 (соединение Y). Соединение Y добавляли только в течение первых 24 часов после посева. Спустя сорок восемь часов после посева культуры промывали в неполном фосфатно-солевом буферном растворе без магния или кальция (PBS).
[0169] Для ФИГ. 1A-1H культуры дифференцировали, используя следующий протокол. На протяжении стадий с 1 по 4 протокола культуры поддерживали в виде плоских адгезивных культур.
а. Стадия 1 (3 дня). Клетки культивировали в течение одного дня в следующей среде стадии 1: среда MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия (Sigma-Aldrich Co. LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури, США, № по каталогу 5761) и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1Х), 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл ростового фактора 8 дифференцировки (GDF8) и 1,5 мкМ 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она (соединение MCX). Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ соединения MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, 1X GlutaMAX™, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл фактора 7 роста фибробластов (FGF7).
c. Стадия 3 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней специализированной средой BLAR001 (см. таблицу I), которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мкМ SANT-1 (N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)-1-пиперазинамин); 1 мкM ретиноевой кислоты (RA); 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нМ активатора PKC ((2S, 5S-(E,E)-8-(5-(4-трифторметил)фенил-2,4,-пентадиеноиламино)бензолактам (TPB); и ингибитор рецептора костного морфогенетического белка (BMP) LDN-193189-HCl (LDN-HCl) в течение двух дней. Концентрация LDN-HCl, используемая в первый день стадии 3, составляла 100 нМ, а во второй день стадии 3-10 нМ.
d. Стадия 4 (3 дня). Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 50 нМ LDN-HCl; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение трех дней. В конце стадии 4 (3 дня) клетки, культивированные на плоских чашках Петри, высевали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI). В частности, клетки обрабатывали в течение 4 часов 10 мкМ Y-27632, полоскали PBS и обрабатывали в течение приблизительно 2 минут ферментом TrypLE™ Express Enzyme в концентрации 1X с последующим удалением фермента и удалением клеток с поверхности MATRIGEL™ путем аккуратного постукивания по флакону. Полученную клеточную суспензию высевали с плотностью 0,5-1,0×106 клеток (аликвотами объемом 5 мкл) на пористые фильтры-вкладыши для клеточной культуры с размером пор 0,4 мкм или 3,0 мкм, расположенные на планшетах размером 10 см. 8,0 мл среды добавляли на дно каждой вставки, а на верхушку или верхнюю часть фильтра дополнительную среду не добавляли. Среду меняли ежедневно в течение стадий 5, 6 и 7.
e. Стадия 5 (3 дня). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 0,25 мкM SANT-1; 50 нM RA; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3 в форме 3,3´, 5-трийод-L-тиронина натриевой соли; 10 мкМ 2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридина (ингибитор II ALK5 или ALK5) в течение трех дней.
f. Стадия 6 (7 дней). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина; 10 мкМ ZnSO4; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; 10 мкM ингибитора II ALK5; и 100 нМ (S,S)-2-[2-(3,5-дифторфенил)ацетиламино]-N-(5-метил-6-оксо-6,7-дигидро-5H-дибензо[b,d]азепин-7-ил)пропионамида («ингибитор гамма-секретазы XX») в течение семи дней.
g. Стадия 7 (7 дней). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 1 мкМ T3; 10 мкM ингибитора II ALK5; 1 мМ N-ацетилцистеина (NAC).
Кроме того, в течение стадии 7 (S7) для ФИГ. 1A-1H клетки обрабатывали 20 мМ D-глюкозы с витаминной добавкой BME (разведение 1: 100 концентрации 100X) и подвергали воздействию всех 79 малых молекул, перечисленных и описанных в таблице XI. Из 79 малых молекул следующие соединения индуцировали экспрессию MAFA или UCN3: (i) зебуларин; (ii) ломегуатриб; (iii) 5-азацитидин; (iv) митоксантрона дигидрохлорид; (v) EGCG; (vi) физетин; (vii) SGI 1027; (viii) темозоломид; (ix) L002; (x) C646; и (xi) SGC0946.
[0170] Культуры дифференцировали для ФИГ. 2A-2B с использованием следующего протокола: во время стадии от 1 до 4 протокола культуры поддерживали на плоских адгезивных культурах.
а. Стадия 1 (3 дня). Клетки культивировали в течение одного дня в следующей среде стадии 1: среда MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1Х), 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации D-глюкозы 10 мМ, 100 нг/мл ростового фактора 8 дифференцировки (GDF8) и 1,5 мкМ 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она (соединение MCX). Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ соединения MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, 1X GlutaMAX™, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл фактора 7 роста фибробластов (FGF7).
c. Стадия 3 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 1% FAF-BSA; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мкМ SANT-1 (N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)-1-пиперазинамин); 1 мкM ретиноевой кислоты (RA); 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нМ активатора PKC ((2S, 5S-(E,E)-8-(5-(4-трифторметил)фенил-2,4,-пентадиеноиламино)бензолактам (TPB); и ингибитор рецептора костного морфогенетического белка (BMP) LDN-193189-HCl (LDN-HCl) в течение двух дней. Концентрация LDN-HCl, используемая в первый день стадии 3, составляла 100 нМ, а во второй день стадии 3-50 нМ.
d. Стадия 4 (3 дня). Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 1% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 70 нМ LDN-HCl; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение трех дней. В конце стадии 4 (3 дня) клетки, культивированные на плоских чашках Петри, высевали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI). В частности, клетки обрабатывали в течение 4 часов 10 мкМ Y27632, полоскали PBS и обрабатывали в течение приблизительно 2 минут ферментом TrypLE™ Express Enzyme в концентрации 1X с последующим удалением фермента и удалением клеток с поверхности MATRIGEL™ путем аккуратного постукивания по флакону. Полученную клеточную суспензию высевали с плотностью 0,5-1,0×106 клеток (аликвотами объемом 5 мкл) на пористые фильтры-вкладыши для клеточной культуры с размером пор 0,4 мкм или 3,0 мкм, расположенные в планшетах размером 10 см. 8,0 мл среды добавляли на дно каждой вставки, а на верхушку или верхнюю часть фильтра дополнительную среду не добавляли. Среду меняли ежедневно в течение стадий 5, 6 и 7.
e. Стадия 5 (3 дня). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 0,25 мкM SANT-1; 50 нM RA; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3 в форме 3,3´, 5-трийод-L-тиронина натриевой соли; 10 мкМ 2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридина (ингибитор II ALK5 или ALK5) в течение трех дней.
f. Стадия 6 (7 дней). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; 10 мкM ингибитора II ALK5; и 100 нМ (S,S)-2-[2-(3,5-дифторфенил)ацетиламино]-N-(5-метил-6-оксо-6,7-дигидро-5H-дибензо[b,d]азепин-7-ил)пропионамида («ингибитор гамма-секретазы XX») в течение семи дней.
g. Стадия 7 (7 дней). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 нМ T3 (низкий Т3); 1 мМ N-ацетилцистеина (NAC).
Для ФИГ. 2A и 2B в течение семи дней дополнительно добавляли 0,5 мкМ ZM447439 (ZM); и следующие компоненты, которые входят в состав I (FI) (таблица XII) - среда RPMI с витаминной добавкой в разведении 1: 200; среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1: 200; концентрат липидов с определенным химическим составом в разведении 1: 2000; пируват натрия в разведении 1: 200; следовые элементы А в разведении 1: 2000; и следовые элементы В в разведении 1: 2000. Дополнительные соединения, добавленные во время стадии 7, включали в себя или 5 мкМ 5-азацитидина (AZT); или 1 мкМ или 10 мкМ 3-деазанепланоцина А (DEZA).
[0171] В вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, используют среду BLAR собственного изготовления, а именно среду BLAR001 или BLAR004. Среда BLAR была впервые описана в PCT/US13/75939 и заявке на патент США № 13/998,884, поданных 18 декабря 2013 г., которые испрашивают преимущество в соответствии с заявкой 61/747,662, поданной 31 декабря 2012 г.; а впоследствии снова в публикации Rezania et al. (2014) Nature Biotech, 32 (11) 1124-1134, дополнительная таблица 3 (опубликовано онлайн 11 сентября 2014 г.), ссылки на которую полностью включены в настоящий документ. BLAR001 и BLAR004 отличаются по концентрациям или уровням перечисленных агентов или эксципиентов.
Таблица I. Список компонентов среды BLAR001 | |
Аминокислоты | Концентрация (мМ) |
Глицин | 3.0E-02 |
Аланин | 3.0E-02 |
Аргинин | 3.0E-01 |
Аспарагин | 1.0E-01 |
Аспарагиновая кислота | 1.0E-01 |
Цистеин | 2.0E-01 |
Глутаминовая кислота | 3.0E-02 |
Гистидин | 1.1E-01 |
Изолейцин | 1.0E-02 |
Лейцин | 9.0E-02 |
Гидрохлорид лизина | 1.5E-01 |
Метиан | 3.0E-02 |
Фенилаланин | 3.0E-02 |
Пролин | 1.0E-01 |
Серин | 1.0E-01 |
Теронин | 3.0E-02 |
Триптофан | 2.0E-03 |
Тирозин динатрия | 1.0E-02 |
Валин | 3.0E-02 |
Витамины | |
Биотин | 3.0E-05 |
Хлорид холина | 5.0E-03 |
Пантотенат D-кальция | 1.5E-03 |
Соль кальция фолиевой кислоты | 2.3E-03 |
Ниацинамид | 4.9E-03 |
Гидрохлорид пиридоксина | 9.7E-04 |
Рибофлавин | 1.0E-05 |
Гидрохлорид тиамина | 3.0E-03 |
Витамин В12 | 3.7E-06 |
I-инозитол | 2.8E-03 |
Соли/Минеральные вещества | |
Хлорид кальция (CaCl2-2H2O) | 3.0E-01 |
Сульфат меди (CuSO4-5H2O) | 4.8E-06 |
Сульфат железа (FeSO4-7H2O) | 1.0E-03 |
Сульфат магния (MgSO4-7H2O) | 4.1E-01 |
Хлорид калия (KCl) | 3.8E+00 |
Бикарбонат натрия (NaHCO3) | 1.4E+01 |
Хлорид натрия (NaCl) | 1.1E+02 |
Двухосновный фосфат натрия (Na2HPO4-7H2O) | 5.0E-01 |
Цинка сульфат (ZnSO4-H2O) | 1.0E-04 |
Прочее | |
Aденин | 1.0E-03 |
D-глюкоза (декстроза) | 5.0E+00 |
Липоевая кислота | 1.2E-05 |
Фенол красный | 1.0E-02 |
Пируват натрия | 1.0E+00 |
Тимидин | 9.8E-05 |
[0172] Как правило, в вариантах осуществления настоящего изобретения дифференцировку человеческих плюрипотентных клеток выполняют, как по существу описано выше в стадиях 1-7. На стадии 7 добавляли различные малые молекулы и оценивали их влияние с помощью количественной ПЦР в реальном времени. В таблице II перечислены малые молекулы и их мишени. Эти малые молекулы оценивали и добавляли 2 мкМ каждой молекулы на стадии7. Химические названия и структуры соединений, исследованных в данном примере, показаны в таблице XI.
Таблица II. Оцененные малые молекулы | ||
Название молекулы | Мишень | № по каталогу Tocris Biosciences |
Зебуларин | Ингибитор ДНК-метилтрансферазы и цитидиндеаминазы | 2293 |
Децитабин | Ингибитор ДНК-метилтрансферазы | 2624 |
RG 108 | Ненуклеозидный ингибитор ДНК-метилтрансферазы | 3295 |
Ломегуатриб | Ингибитор О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) | 4359 |
5-Азацитидин | Ингибитор ДНК-метилтрансферазы | 3842 |
Митоксантрона дигидрохлорид | Ингибитор II топоизомеразы; иммуносупрессорный и противоопухолевый агент | 4250 |
EGCG | ингибитор DNMT1 | 4524 |
Физетин | ингибитор DNMT1 | 5016 |
SGI 1027 | Ингибитор ДНК-метилтрансферазы | 5155 |
Темозоломид | ДНК-метилирующий противоопухолевый агент | 2706 |
L002 | ингибитор p300 | 5045 |
C 646 | Селективный ингибитор p300/CBP HAT | 4200 |
SGC 0946 | Очень мощный и селективный ингибитор DOT1L; выполнен с возможностью проникновения в клетку | 4541 |
UNC 0224 | Мощный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a | 3861 |
UNC 0638 | Селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a и GLP | 4343 |
BIX 01294 | Ингибитор G9a-подобного белка и метилтрансферазы лизинов гистонов G9a | 3364 |
UNC 0646 | Мощный и селективный ингибитор G9a/GLP | 4342 |
UNC 0642 | Мощный и селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a и GLP | 5132 |
TC-E 5003 | Селективный ингибитор метилтрансферазы аргининов PRMT1 | 5099 |
A 366 | Мощный и селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a/GLP | 5163 |
KU 55933 | Мощный и селективный ингибитор киназы ATM | 3544 |
KU 60019 | Мощный ингибитор киназы ATM | 4176 |
PF 03814735 | Ингибитор киназы Aurora А и В | 4821 |
ZM 447439 | Ингибирует киназу Aurora В | 2458 |
U0126 | Мощный селективный ингибитор MEK1 и 2 | 1144 |
SL 327 | Селективный ингибитор MEK1 и MEK2; выполнен с возможностью проникновения в головной мозг | 1969 |
Дигидрохлорид H 89 | Ингибитор протеинкиназы A | 2910 |
Дигидрохлорид SB 747651A | Мощный ингибитор MSK1; также ингибирует другие киназы группы AGC | 4630 |
Мезилат SNS 314 | Мощный универсальный ингибитор киназы Aurora | 4584 |
Кемпферол | Ингибитор RSK2; блокирует фосфорилирование гистона H3Ser10 | 3603 |
PRT 4165 | Ингибитор Bmi1/Ring1A; блокирует убиквитинирование гистона H2A | 5047 |
P 22077 | Ингибитор USP7; блокирует деубиквитинирование ацетилтрансферазы лизинов гистона Tip60 (KAT5) | 4485 |
PFI 1 | Ингибитор бромодомена BET | 4445 |
Гидрохлорид I-BET 151 | Ингибитор бромодомена BET | 4650 |
LY 303511 | Ингибитор BRD2, BRD3 и BRD4 | 2418 |
MS 436 | Мощный и селективный ингибитор бромодомена BRD4 | 5173 |
SGC-CBP 30 | Мощный ингибитор бромодомена CREBBP/EP300 | 4889 |
I-CBP 112 | Селективный ингибитор бромодомена CREBBP/EP300 | 4891 |
Бромспорин | Ингибитор бромодомена широкого спектра | 4758 |
PFI 3 | Мощный и селективный ингибитор SMARCA4 и полибром-1; также ингибирует SMARCA2 | 5072 |
Гидрохлорид UNC 926 | Ингибитор домена L3MBTL1 | 4516 |
UNC 1215 | Мощный ингибитор считывающего домена Kme L3MBTL3; выполнен с возможностью проникновения в клетку | 4666 |
TC-H 106 | Ингибитор гистондеацетилазы класса I | 4270 |
MС 1568 | Селективно ингибирует HDAC класса II (IIa) | 4077 |
Пироксамид | Ингибитор гистондеацетилазы | 4403 |
CI 994 | Ингибитор гистондеацетилазы | 2952 |
SBHA | Ингибитор гистондеацетилазы | 3810 |
KD 5170 | Ингибитор гистондеацетилазы | 4001 |
LMK 235 | Селективный ингибитор HDAC4/HDAC5 | 4830 |
TCS HDAC6 20b | Селективный ингибитор HDAC6 | 4805 |
PCI 34051 | Мощный и селективный ингибитор гистондеацетилазы 8 (HDAC8); индуцирует апоптоз в клеточных линиях, полученных из Т-клеток | 4643 |
Скриптаид | Ингибитор гистондеацетилазы | 2421 |
NSC 3852 | Ингибитор гистондеацетилазы | 2521 |
4-фенилбутират натрия | Ингибитор гистондеацетилазы | 2682 |
M 344 | Ингибитор гистондеацетилазы | 2771 |
Вальпроевая кислота, натриевая соль | Ингибитор гистондеацетилазы | 2815 |
SAHA | Ингибитор HDAC класса I и II | 4652 |
GSK J2 | Неактивный изомер GSK-J1 (№ по каталогу 4593) | 4688 |
GSK J5 | Неактивный изомер GSK J4 (№. по каталогу 4594); выполнен с возможностью проникновения в клетку | 4689 |
GSK J1 | Мощный ингибитор гистондеметилазы JMJD3/UTX | 4593 |
GSK J4 | Ингибитор гистондеметилазы JMJD3/UTX; выполнен с возможностью проникновения в клетку | 4594 |
Даминозид | Селективный ингибитор гистондеметилазы подсемейства KDM2/7 | 4684 |
Гидрохлорид транилципромина | Необратимый ингибитор лизин-специфической деметилазы 1 (LSD1); также ингибирует MAO | 3852 |
Дигидрохлорид RN 1 | ингибитор LSD1 | 4977 |
IOX 1 | Ингибитор гистондеметилазы; выполнен с возможностью проникновения в клетку | 4464 |
JIB 04 | Универсальный ингибитор гистондеметилазы Jumonji; активен in vivo | 4972 |
Сиртинол | Селективный ингибитор деацетилазы семейства сиртуина | 3521 |
Сплитомицин | ингибитор Sir2p | 1542 |
Ресвератрол | Активатор SIRT1 | 1418 |
EX 527 | Селективный ингибитор SIRT1 | 2780 |
Теновин-1 | ингибитор SIRT1 и SIRT2; активирует P53 | 3365 |
Салермид | Ингибитор SIRT1 и SIRT2 | 4127 |
AK 7 | Селективный ингибитор SIRT2; выполнен с возможностью проникновения в головной мозг | 4754 |
3-Аминобензамид | ингибитор PARP; деметилирует ДНК | 0788 |
Гидрохлорид PJ 34 | Мощный ингибитор PARP; изменяет эпигенетические метки в клетках рака щитовидной железы | 3255 |
IOX 2 | Мощный, селективный ингибитор HIF-1α-пролилгидроксилазы-2 (PHD2) | 4451 |
Форсколин | Активатор PKA; блокирует ядерный экспорт HDAC5 | 1099 |
Ретиноевая кислота | Эндогенный ретиноид; изменяет HDAC-опосредованную репрессию гена | 0695 |
[0173] Количественный анализ и определение характеристик дифференцированных клеток. Для количественного анализа экспрессии генов на различных стадиях клетки человеческих островков, H1-hESC, 7-го дня 6-й стадии (S6D7) и от 7-го дня 7-й стадии до 14-го дня 7-й стадии (S7D7-S7D14) собирали в виде скоплений на ALI, как по существу описано в публикации Rezania et al (2014), выше. Экспрессию генов оценивали с использованием специально изготовленных матриц Taqman Arrays (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния, США). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Sequence Detection (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния, США) и нормализовали, используя GAPDH в качестве конститутивного гена недифференцированных клеток H1-hESC, применяя метод ΔΔCt. Информация о праймерах представлена в таблице III.
Таблица III. Перечень праймеров для количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)
Ген | ИД анализа | |
1 | MAFA | Hs04419861_sH |
2 | UCN3 | Hs00846499_s1 |
3 | GAPDH | Hs99999905_m1 |
[0174] ФИГ. 1A-1D представляют собой графики, показывающие данные количественного анализа ПЦР в реальном времени экспрессии MAFA после обработки малыми молекулами, в котором различные малые молекулы увеличивают экспрессию MAFA по сравнению с S6D7 или необработанными или обработанными DMSO культурами на стадии 7 (S7D7). Добавление UNC0638 (ФИГ. 1A; селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a и GLP), UNC0646 (ФИГ. 1A; мощный и селективный ингибитор G9a/GLP), UNC0642 (ФИГ. 1A; мощный и селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a и GLP), TC-E5003 (ФИГ. 1B; селективный ингибитор метилтрансферазы аргининов PRMT1), A366 (ФИГ. 1B; мощный и селективный ингибитор метилтрансферазы лизинов гистонов G9a/GLP), PF03814735 (ФИГ. 1B; ингибитор киназы Aurora А и В), ZM447439 (ФИГ. 1B; ингибирует киназу Aurora В), дигидрохлорид SB747651A (ФИГ. 1B; мощный ингибитор MSK1; также ингибирует другие киназы группы AGC), PFI1 (ФИГ. 1B; ингибитор бромодомена BET), LY303511 (ФИГ. 1B; ингибитор BRD2, BRD3 и BRD4), MS436 (ФИГ. 1B; мощный и селективный ингибитор бромодомена BRD4) и MC1568 (ФИГ. 1C; селективно ингибирует HDAC класса II (IIa)) значительно усиливает экспрессию MAFA по сравнению с S6D7 или необработанными или обработанными DMSO культурами на стадии 7. ФИГ. 1E-1H представляют собой графики, на которых показаны данные количественного анализа ПЦР в реальном времени экспрессии UCN3 после обработки малыми молекулами, добавления 5-азацитидина (AZT) (ФИГ. 1E; ингибитор ДНК-метилтрансферазы), пироксамида (ФИГ. 1G; ингибитор гистондеацетилазы), и CI994 (ФИГ. 1G; ингибитор гистондеацетилазы) значительно усиливает экспрессию UCN3 по сравнению с S6D7 или необработанными или обработанными DMSO культурами на стадии 7.
[0175] На ФИГ. 2A и 2B показана надежность выбранных малых молекул в качестве активаторов MAFA или UCN3, так как их эффект сохраняют при различных протоколах подготовки стадии 7.
[0176] Условия культивирования, показанные на ФИГ. 2A и 2B, отличаются от подобных на ФИГ. 1 следующими изменениями в стадии 7 (S7): (i) удаление ингибитора II ALK5 (ALK5); (ii) снижение концентрации T3 (низкий T3); (iii) добавление ZM447439 (ZM); и (iv) добавление коктейля витаминов, следовых элементов, липидов и аминокислот (состав I - таблица XII). А именно, исследовали следующее исходное условие: (1) без ингибитора II ALK5 (ALK5); (2) с низким T3; (3) с низким ZM; (4) с низким H; (5) с низким NAC; (6) FI; и BLAR 001. Подтверждено, что AZT является активатором UCN3 (ФИГ. 2B), но не MAFA (ФИГ. 2A) во время стадии 7. В дополнение к исследованию малых молекул обнаружено, что 3-деазанепланоцин А (DEZA; ФИГ. 2A) является эффективным активатором экспрессии MAFA, но не UCN3 (ФИГ. 2B), даже в присутствии ZM447439.
[0177] Таким образом, данный пример демонстрирует идентификацию малых молекул, которые усиливают экспрессию одного из маркеров созревания MAFA или UCN3 во время стадии 7.
Пример 2.
Генерация эндокринных клеток с увеличенной экспрессией маркеров созревания и со схожей с человеческими островками кинетикой глюкозозависимого митохондриального дыхания на поверхности раздела воздух-жидкость
[0178] В следующем примере показана генерация клеток С-ПЕПТИДА (короткий полипептид из 31 аминокислоты, соединяющий А и В цепи инсулина в молекуле проинсулина), которые совместно экспрессируют следующие маркеры созревания, PDX1 (панкреатический и дуоденальный гомеобокс 1); NKX6.1 (гомеобокс 1 NK6); MAFA UCN3; SLC2A1 (член 1 семейства 2 переносчиков растворенных веществ; также называют GLUT1/глюкозным транспортером 1); и он показывает кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания, аналогичную подобным в человеческих островковых клетках. Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (H1-hESC) (со средой EZ8 при пассаже 28 засевали в виде отдельных клеток с плотностью 0,094×106 клеток/см2 на MATRIGEL™ на чашки Петри с покрытием в разведении 1: 30 в модифицированную по способу Дульбекко среду Игла со смесью питательных веществ F-12 (DMEM-F12), которая содержит GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1X), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл фактора 2 роста фибробластов (FGF2), 1 нг/мл трансформирующего фактора роста бета (TGFβ), инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITS-X) в разведении 1: 100, не содержащий жирных кислот 2%-й бычий сывороточный альбумин (FAF-BSA) и 20 нг/мл инсулиноподобного фактора-1 роста (IGF-1), в которую добавили 10 мкМ ингибитора Rock Y-27632 (соединение Y). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промывали в неполном фосфатно-солевом буферном растворе без магния или кальция (PBS).
[0179] Для ФИГ. 3A-3M, 4A-4E и 5A-5F культуры дифференцировали, используя следующий протокол. На протяжении стадий с 1 по 4 протокола культуры поддерживали в виде плоских адгезивных культур.
а. Стадия 1 (3 дня). Клетки культивировали в течение одного дня в следующей среде стадии 1: среда MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1Х), 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл ростового фактора дифференцировки 8 (GDF8) и 1,5 мкМ 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она (соединение MCX). Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ соединения MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, 1Х GlutaMAX™, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл фактора 7 роста фибробластов (FGF7).
c. Стадия 3 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 1% FAF-BSA; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мкМ SANT-1 (N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)-1-пиперазинамин); 1 мкM ретиноевой кислоты (RA); 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нМ активатора PKC ((2S, 5S-(E,E)-8-(5-(4-трифторметил)фенил-2,4,-пентадиеноиламино)бензолактам (TPB); и ингибитор рецептора костного морфогенетического белка (BMP) LDN-193189-HCl (LDN-HCl) в течение двух дней. Концентрация LDN-HCl, используемая в первый день стадии 3, составляла 100 нМ, а во второй день стадии 3-50 нМ.
d. Стадия 4 (3 дня) и перемещение ALI в S4D3. Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 1% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 70 нМ LDN-HCl; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение трех дней. В конце стадии 4 (3 дня) клетки, культивированные на плоских чашках Петри, высевали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI). Для перемещения ALI клетки обрабатывали в течение 4 часов 10 мкМ соединения Y, полоскали PBS и обрабатывали в течение приблизительно 2 минут ферментом TrypLE™ Express Enzyme в концентрации 1X с последующим удалением фермента и удалением клеток с поверхности MATRIGEL™ путем аккуратного постукивания по флакону. Полученную клеточную суспензию высевали с плотностью 0,5-1,0×106 клеток (аликвотами объемом 5 мкл) на пористые фильтры-вкладыши для клеточной культуры с размером пор 0,4 мкм или 3,0 мкм, расположенные в планшетах размером 10 см. 8,0 мл среды добавляли на дно каждой вставки, а на верхушку или верхнюю часть фильтра дополнительную среду не добавляли. Среду меняли ежедневно в течение стадий 5, 6 и 7.
e. Стадия 5 (3 дня). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 0,25 мкM SANT-1; 50 нM RA; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3 в форме 3,3´, 5-трийод-L-тиронина натриевой соли (Sigma Aldrich, № по каталогу T6397); 10 мкМ 2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридина (ингибитор II ALK5 или ALK5) в течение трех дней.
f. Стадия 6 (7 дней). Клетки обрабатывали на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; 10 мкM ингибитора II ALK5; и 100 нМ (S,S)-2-[2-(3,5-дифторфенил)ацетиламино]-N-(5-метил-6-оксо-6,7-дигидро-5H-дибензо[b,d]азепин-7-ил)пропионамида («ингибитор XX гамма-секретазы») (в течение семи дней.
g. Стадия 7 (7 дней). Клетки на ALI обрабатывали двумя видами специализированной среды BLAR: BLAR001 и BLAR004. Первая среда представляет собой среду BLAR001 (список компонентов приведен в таблице I), которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 нМ T3 (низкий Т3); 1 мМ N-ацетилцистеина (NAC); 0,5 мкМ ZM447439 (ZM); и следующие компоненты, которые входят в состав I (FI) - среда RPMI с витаминной добавкой в разведении 1: 200; среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1: 200; концентрат липидов с определенным химическим составом в разведении 1: 2000; пируват натрия в разведении 1: 200; следовые элементы А в разведении 1: 2000; следовые элементы В в разведении 1: 2000 в течение семи дней. Дополнительные соединения, добавленные во время стадии 7, включали в себя одно из 1 мкМ T3 или 10 нМ T3 (низкий T3); 10 мкM ингибитора II ALK5; 5 мкМ 5-азацитидина (AZT); или 1 мкМ или 10 мкМ 3-деазанепланоцина А (DEZA).
Вторая среда представляла собой среду BLAR004 (список компонентов приведен в таблице IV), которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 1 мМ N-ацетилцистеина (NAC); 0,5 мкМ ZM447439 (ZM); и следующие компоненты, которые входят в состав I (FI) - среда RPMI с витаминной добавкой в разведении 1: 200; среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1: 200; концентрат липидов с определенным химическим составом в разведении 1: 2000; пируват натрия в разведении 1: 200; следовые элементы А в разведении 1: 2000; следовые элементы В в разведении 1: 2000 в течение семи дней. Дополнительные соединения, добавленные во время стадии 7, включали в себя одно из 1 мкМ T3 или 10 нМ T3 (низкий T3); 10 мкM ингибитора II ALK5; 5 мкМ 5-азацитидина (AZT); или 1 мкМ или 10 мкМ 3-деазанепланоцина А (DEZA).
Таблица IV. Список компонентов среды BLAR004 | |
Аминокислоты | Концентрация (мМ) |
Глицин | 2.0E-01 |
Аланин | 2.0E-01 |
Аргинин | 5.0E-02 |
Аспарагин | 2.0E-02 |
Аспарагиновая кислота | 2.0E-02 |
Цистеин | 3.0E-02 |
Глутаминовая кислота | 5.0E-02 |
Гистидин | 8.0E-02 |
Изолейцин | 7.0E-02 |
Лейцин | 1.5E-01 |
Гидрохлорид лизина | 2.0E-01 |
Метионин | 2.0E-02 |
Фенилаланин | 6.0E-02 |
Пролин | 1.0E-01 |
Серин | 1.0E-01 |
Теронин | 1.4E-01 |
Триптофан | 5.0E-02 |
Тирозиндинатрий | 6.0E-02 |
Валин | 2.0E-01 |
Витамины | |
Биотин | 3.0E-05 |
Хлорид холина | 5.0E-03 |
Пантотенат D-кальция | 1.5E-03 |
Соль кальция фолиевой кислоты | 2.3E-03 |
Ниацинамид | 4.9E-03 |
Гидрохлорид пиридоксина | 9.7E-04 |
Рибофлавин | 1.0E-05 |
Гидрохлорид тиамина | 3.0E-03 |
Витамин В12 | 3.7E-06 |
I-инозитол | 2.8E-03 |
DL-альфа-токоферола ацетат | 1.0E-03 |
Аскорбиновая кислота | 5.0E-02 |
Ретинол, полностью транс- (вит. А) | 1.0E-04 |
25-гидроксивитамин D | 3.0E-05 |
Витамин K1- (филлохинон) | 1.0E-09 |
Пара-аминобензойная кислота | 3.0E-04 |
Холестерин | 1.0E-04 |
Соли | |
Хлорид кальция (CaCl2-2H2O) | 3.0E-01 |
Сульфат меди (CuSO4-5H2O) | 4.8E-06 |
Сульфат железа (FeSO4-7H2O) | 1.0E-03 |
Сульфат магния (MgSO4-7H2O) | 4.1E-01 |
Хлорид калия (KCl) | 3.8E+00 |
Бикарбонат натрия (NaHCO3) | 1.4E+01 |
Хлорид натрия (NaCl) | 1.1E+02 |
Двухосновный фосфат натрия (Na2HPO4-7H2O) | 5.0E-01 |
Цинка сульфат (ZnSO4-H2O) | 1.0E-04 |
Прочее | |
Aденин | 1.0E-03 |
D-глюкоза (декстроза) | 5.0E+00 |
Липоевая кислота | 1.2E-05 |
Фенол красный | 1.0E-02 |
Пируват натрия | 1.0E-01 |
Тимидин | 9.8E-05 |
Путресцин | 1.0E-02 |
Глутатион | 1.0E-03 |
[0180] Определение характеристик и количественный анализ дифференцированных клеток. Для количественного анализа экспрессии генов на различных стадиях клетки человеческих островков, H1-hESC, 7-го дня 6-й стадии (S6D7) и от 7-го дня 7-й стадии до 14-го дня 7-й стадии (S7D7-S7D14) собирали в виде скоплений на ALI, как описано в публикации Rezania et al., Nature Biotechnology, 2014; 32(11): 1121-1133. Экспрессию генов оценивали с использованием специально изготовленных матриц Taqman Arrays (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния, США). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Sequence Detection (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния, США) и нормализовали, используя GAPDH в качестве конститутивного гена недифференцированных клеток H1-hESC, применяя метод ΔΔCt. Информация о праймерах представлена в таблице V.
Таблица V. Перечень праймеров кПЦР-РВ | ||
Ген | ИД анализа | |
1 | GJD2 | Hs00950432_m1 |
2 | GLP1R | Hs00157705_m1 |
3 | INHA | Hs00171410_m1 |
4 | INHBB | Hs00173582_m1 |
5 | PDK1 | Hs00176853_m1 |
6 | SIX2 | Hs00195590_m1 |
7 | UCP2 | Hs01075227_m1 |
8 | SLC2A1 | Hs00892681_m1 |
9 | G6PC2 | Hs01549773_m1 |
10 | INS | Hs00355773_m1 |
11 | NKX6.1 | Hs00232355_m1 |
12 | PDX1 | Hs00236830_m1 |
13 | NEUROD1 | Hs00159598_m1 |
14 | CHGA | Hs00154441_m1 |
15 | MAFA | Hs04419861_sH |
16 | UCN3 | Hs00846499_s1 |
17 | GAPDH | Hs99999905_m1 |
[0181] Для количественного анализа колокализации белков на различных стадиях клетки человеческих островков и клетки S7D7 собирали в виде скоплений клеток на ALI и анализировали посредством иммунофлуоресценции (IF). Клетки, полученные из H1-hESC, подготавливали и окрашивали, как по существу описано в публикации Rezania et al. (2014) выше, и с использованием антител, перечисленных в таблице VI настоящего документа. Для получения срезов из замороженного материала клетки промывали PBS с последующей фиксацией в течение ночи в 4% PFA при 4 °C. После фиксации 4% PFA удаляли, клетки дважды промывали PBS и инкубировали в течение ночи при 4°C в 30% растворе сахарозы. Пробы криоконсервировали в растворе OCT и срезы толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла Superfrost plus (VWR International, LLC, г. Рэднор, штат Пенсильвания, США, № по каталогу 48311-703).
[0182] Для выполнения иммунофлуоресцентного окрашивания первичные антитела добавляли в соответствующих разведениях в течение ночи при 4 °C, при этом вторичные антитела добавляли в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим промыванием PBS и добавлением прикрепляющегося реагента Vectastain с DAPI (Vector Laboratories Inc., г. Берлингейм, штат Калифорния, США, № по каталогу H-1200). Срезы визуализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Ti (Nikon Instruments, Inc., г. Мелвилл, штат Нью-Йорк, США).
Таблица VI. Список антител, используемых для анализа IF | |||
Антиген | Вид | Источник | Разведение |
C-ПЕПТИД | Мышь | Abcam (№ по каталогу ab8297). |
1: 100 |
ГЛЮКАГОН | Кролик | Abcam (№ по каталогу ab92517). |
1: 100 |
PDX1 | Коза | R&D systems (№ по каталогу AF2419). |
1: 33 |
MAFA | Кролик | Life Span Biosciences (№ по каталогу LP9872). |
1: 100 (Извлечение антигена) |
GLUT1 | Кролик | Abcam (№ по каталогу ab115730). |
1: 300 |
NKX6.1 | Кролик | Novus Biologicals (№ по каталогу NBP1-49672). |
1: 100 |
UCN3 | Кролик | Novus Biologicals (№ по каталогу NBP1-80732). |
1: 100 (Извлечение антигена) |
NEUROD1 | Кролик | Abcam (№ по каталогу 16508) |
1: 100 |
KI67 | Кролик | Abcam (№ по каталогу ab16667). |
1: 100 (Извлечение антигена) |
SOX2 | Коза | Sigma (№ по каталогу sc-17320) |
1: 50 |
CDX2 | Мышь | BioGenex (№ по каталогу MU392A-UC). |
1: 50 |
Антитело осла к мышиному IgG (H+L), вторичное антитело, Alexa Fluor 488 | Мышь | Life Technologies (№ по каталогу A21202). |
1: 50 |
Антитело осла к кроличьему IgG (H+L), вторичное антитело, Alexa Fluor 546 | Кролик | Life Technologies (№ по каталогу A10040). |
1: 100-1: 200 |
Антитело осла к козьему IgG (H+L), вторичное антитело, Alexa Fluor 546 | Коза | Life Technologies (№ по каталогу A11056). |
1: 50 |
[0183] Для количественного анализа глюкозозависимой митохондриальной активности на различных стадиях собирали зрелые человеческие островки, скопления на ALI S6D7 и скопления на ALI S7D7 и измеряли их скорость потребления кислорода (OCR) на внеклеточном поточном анализаторе XFe24 (Seahorse Bioscience, № по каталогу 102238-100) до и после инъекции 20 мМ D-глюкозы. Скопления на ALI удаляли из условий стадии 7 и инкубировали в течение 2 часов при 37°C и в не содержащей CO2 среде, и в среде, выполненной с возможностью достижения исходного уровня OCR. Среда для предварительной инкубации содержит 1 мМ D-глюкозы, 1 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия в основной среде XF. После предварительной инкубации скопления на ALI помещали на аппарат Seahorse, в котором выполняли следующие измерения: (i) OCR на исходном уровне 3 раза (перед введением D-глюкозы); и (ii) 5 раз после введения D-глюкозы (время инкубации после введения: 72 минуты). Все измерения OCR нормализовали в соответствии с содержанием ДНК в отдельных пробах скоплений на ALI или Aggrewell в центрифужных пробирках. ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA MicroKit (Qiagen, № по каталогу 56304), а содержание ДНК измеряли с помощью спектрофотометра для УФ и видимой областей спектра NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, № по каталогу ND8000).
[0184] На ФИГ. 3A-3M показано увеличение генной экспрессии (после семи дней обработки в условиях стадии 7) группы маркеров созревания в скоплениях клеток ALI до уровней, наблюдаемых в человеческих островках. Маркер созревания определяют в настоящем документе как ген, участвующий в положительной стимуляции быстрой стимулированной глюкозой секреции инсулина (GSIS). В следующем списке подробно описаны изменения в протоколе дифференцировки стадии 7, которые выполняли для улучшения генной экспрессии маркеров созревания к S7D7 в скоплениях на ALI: (i) удаление ингибитора II ALK5; (ii) снижение концентрации T3; (iii) добавление DEZA; (iv) добавление AZT; (v) добавление ZM; (vi) снижение концентрации глюкозы до 5,56 мМ; и (vii) добавление определенного коктейля витаминов, заменимых аминокислот, липидов, пирувата натрия и следовых элементов (состав I-FI). Аналогичные наблюдения и результаты получили в отношении профиля генной экспрессии генов созревания для условий как с BLAR001, так и BLAR004 во время стадии 7. На ФИГ. 3A показано, что INHBB экспрессировали на уровне, превышающем наблюдаемый в человеческих островках в условиях, в которых используют ингибитор II ALK5. Результаты показывают, что в клетках S7 ингибирование TGFB1 (трансформирующий фактор 1 роста бета) с помощью ингибитора II ALK5 приводит к отрицательному профилю сигнализации TGF-бета, который ингибирует процессы GSIS. Обнаружено, что удаление ингибитора ALK5 в отсутствии или в присутствии AZT/DEZA приводило к уменьшению экспрессии INHBB до уровней, наблюдаемых в человеческих островках, таким образом указывая на нивелирование влияния отрицательной сигнализации TGF-бета на GSIS во время стадии 7. Кроме того, на ФИГ. 3B показано увеличение экспрессии INHA до уровней человеческих островков в скоплениях на ALI при удалении ингибитора II ALK5.
[0185] Хотя экспрессию MAFA и SLC2A1, показанную на ФИГ. 3C и 3D соответственно, согласно полученным данным уменьшили при удалении ингибитора II ALK5, добавление AZT/DEZA восстанавливает экспрессию MAFA и SLC2A1 до уровней человеческих островков. Экспрессию UCN3 (ФИГ. 3E), G6PC2 (каталитическая субъединица 2 глюкозо-6-фосфатазы; ФИГ. 3F) и PDK1 (киназа 1 пируватдегидрогеназы; ФИГ. 3G) увеличивали до уровней, наблюдаемых в человеческих островках или превышающих их, при добавлении AZT/DEZA и удалении ингибитора II ALK5 в скоплениях на ALI. Экспрессию INS (инсулин; ФИГ. 3H), GJD2 (белок межклеточных щелевых контактов, дельта 2; также CX36/коннексин 36; ФИГ. 3I), SIX2 (гомеобокс SIX 2; ФИГ. 3J) и PDX1 (ФИГ. 3K) согласно полученным данным постепенно скачкообразно увеличивали сначала после удаления ингибитора II ALK5, а затем после добавления AZT/DEZA. Изменений экспрессии NKX6.1 (ФИГ. 3L) и GLP1R (рецептор глюкагоноподобного пептида 1; ФИГ. 3M) не наблюдали при различных условиях, но их экспрессия в скоплениях на ALI постоянно находилась на уровнях, наблюдаемых в человеческих островках или превышающих их.
[0186] На ФИГ. 4A-4E показана генерация клеток C-ПЕПТИДА в скоплениях клеток ALI, которые на основании присутствия белка совместно экспрессируют следующие маркеры созревания: PDX1 (ФИГ. 4A), NKX6.1 (ФИГ. 4B), MAFA (ФИГ. 4C), SLC2A1 (ФИГ. 4D) и UCN3 (ФИГ. 4E) на S7D7. Для каждого из ФИГ 4A-4E иммунофлуоресцентное окрашивание показано в виде отдельных каналов с С-ПЕПТИДОМ в верхнем ряду и интересующим белком созревания в нижнем ряду. Типовое окрашивание человеческих островков показано в левой колонке, условие «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR001» - в средней колонке, а условие «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR004» - в правой колонке. Большая часть (если не все) С-ПЕПТИД-положительных клеток также были положительными в отношении PDX1 (ФИГ. 4A) и NKX6.1 (ФИГ. 4B), как и человеческие островковые клетки. Значительная часть С-ПЕПТИД-положительных клеток также были положительными в отношении MAFA (ФИГ. 4C), SLC2A1 (ФИГ. 4D) и UCN3 (ФИГ. 4E) как в условиях с BLAR001, так и с BLAR004. Однако экспрессию MAFA, SLC2A1 и UCN3 не ограничивали C-ПЕПТИД-положительными клетками.
[0187] На ФИГ. 5A-5E показана генерация клеток C-ПЕПТИДА в S7D7, которые показывают схожую с человеческими островками кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI), в особенности при специфичных для стадии 7 условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT, DEZA, FI, BLAR001». Митохондриальное дыхание или активность, представленные с использованием скорости потребления кислорода (OCR), измеряли на исходном уровне и после введения 20 мМ D-глюкозы. Пять измерений OCR в течение 72-минутного периода были сделаны после введения 20 мМ D-глюкозы, а измерения показаны в виде процентной доли OCR по сравнению с исходным уровнем, нормализованной по содержанию ДНК в каждой отдельной пробе. На ФИГ. 5A показано, что человеческие островки (черная линия с кружками) быстро реагировали на высокую концентрацию D-глюкозы, как видно на основании OCR, равной 123,3% ± 12,92 по сравнению с исходным уровнем через 15 минут (мин) после инъекции («п/и»), и сохраняли высокую OCR во времени (131,5% ± 11,32; 72 мин п/и). С другой стороны, в скоплениях на ALI S6D7 (серая линия с треугольниками), которые обогащали незрелыми С-ПЕПТИД-положительными клетками, согласно полученным данным не было стремительной реакции OCR на высокую концентрацию D-глюкозы (104,4% ± 3,37; 15 мин п/и), и они показывают относительно слабую реакцию OCR во времени (113,3% ± 4,51; 72 мин п/и). На ФИГ. 5D показано, что внутри группы скопления на ALI S7D7 только при условии «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR001» (серая линия с квадратами) согласно полученным данным наблюдалась схожая с человеческими островками кинетика глюкозозависимого митохондриального дыхания (112,4% ± 3,25-15 мин п/и; 129,5% ± 3,78-72 мин п/и). Обнаружено, что следующие условия в скоплениях S7D7 на ALI обеспечивают глюкозозависимую митохондриальную кинетику, аналогичную подобной в незрелых скоплениях на ALI S6D7: ALK5, T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR001 (100,3% ± 4,04-15 мин п/и; 107,8% ± 6,51 -72 мин п/и) (ФИГ. 5B); без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR001 (96,9% ± 3,06-15 мин п/и; 109,0% ± 4,58-72 мин п/и) (ФИГ. 5C); без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR004 (103,4% ± 4,76-15 мин п/и; 113,6% ± 6,72-72 мин п/и) (ФИГ. 5E); и без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT/DEZA, FI, BLAR004 (102,1% ± 4,04-15 мин п/и; 112,7% ± 3,38-72 мин п/и) (ФИГ. 5F).
[0188] Таким образом, этот пример демонстрирует, что выполнение усовершенствований в условиях стадии 7 улучшает статус созревания полученных из hESC созревающих бета-клеток на ALI. В частности, в этом примере показана генерация на ALI клеток C-ПЕПТИДА, которые совместно экспрессируют множество маркеров созревания бета-клеток и обладают специфическими для бета-клеток функциональными возможностями, схожими с человеческими островками, такими как глюкозозависимое митохондриальное дыхание.
Пример 3.
Генерация полноценных панкреатических энтодермальных и незрелых бета-клеток в форме скоплений клеток, выполненных с возможностью подчинения суспензионной культуре, выполненной с возможностью изменения
[0189] В следующем примере показана генерация полноценных панкреатических энтодермальных или незрелых бета-клеток в форме скоплений клеток Aggrewell™, выполненных с возможностью подчинения суспензионной культуре, выполненной с возможностью изменения. Суспензионная культура, используемая в данном примере, представляла собой скопления клеток Aggrewell™, культивированные в центрифужных пробирках («скопления Aggrewell™ в центрифужных пробирках»). Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (H1-hESC) со средой EZ8 при пассаже 28 засевали в виде отдельных клеток с плотностью 0,094×106 клеток/см2 на MATRIGEL™ на чашки Петри с покрытием в разведении 1: 30 в модифицированную по способу Дульбекко среду Игла со смесью питательных веществ F-12 (DMEM-F12), которая содержит GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1X), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл фактора 2 роста фибробластов (FGF2), 1 нг/мл трансформирующего фактора роста бета (TGFβ), инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITS-X) в разведении 1: 100, не содержащий жирных кислот 2%-й бычий сывороточный альбумин (FAF-BSA) и 20 нг/мл инсулиноподобного фактора-1 роста (IGF-1), и в которую добавили 10 мкМ ингибитора Rock Y-27632 (соединение Y). Соединение Y добавляли только в течение первых 24 часов после посева. Через сорок восемь часов после посева культуры промывали в неполном PBS (обозначается как «-/-», что значит фосфатно-солевой буферный раствор без магния или кальция).
[0190] Для ФИГ. 6A-6L культуры дифференцировали, используя следующий протокол. Скопления клеток ALI S6D6, показанные на ФИГ. 6I-6L культивировали, как описано выше, за исключением того, что в день 3 стадии 4 скопления клеток Aggrewell™ получали либо из свежего монослоя S4D3, либо из криоконсервированных клеток S4D3 (как более подробно описано ниже) путем культивирования в течение дополнительных 48 часов (день 5 стадии 4 или S4D5). В ходе выполнения протокола дифференцировки среду меняли ежедневно.
а. Стадия 1 (3 дня). Клетки культивировали в течение одного дня в следующей среде стадии 1: среда MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1Х), 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл ростового фактора 8 дифференцировки (GDF8) и 1,5 мкМ 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она (соединение MCX) (ингибитор GSK-3β). Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ соединения MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, 1X GlutaMAX™, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл фактора 7 роста фибробластов (FGF7).
c. Стадия 3 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней специализированной средой BLAR001 (см. таблицу I), которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 1% FAF-BSA; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мкМ SANT-1 (N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)-1-пиперазинамин); 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) (Sigma Aldrich, № по каталогу R2625); 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нМ активатора PKC (2S,5S-(E,E)-8-(5-(4-трифторметил)фенил-2,4,-пентадиеноиламино)бензолактам (TPB); и ингибитор рецептора костного морфогенетического белка (BMP) LDN-193189-HCl (LDN-HCl) в течение двух дней. Концентрации LDN-HCl, используемые в первый день стадии 3, составляли 100 нМ, а во второй день стадии 3-10 нМ.
d. Стадия 4 (3 дня). Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 1% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 70 нМ LDN-HCl; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение трех дней.
e. Криоконсервация монослоя в день 3 стадии 4. Криоконсервированные клеточные банки из монослоя S4D3 получали с использованием следующей процедуры. Если говорить кратко, монослой S4D3 обрабатывали в течение 4 часов 10 мкМ соединения Y. Впоследствии клетки высвобождали с помощью фермента TrypLE™ Express Enzyme в виде суспензии отдельных клеток с последующей нейтрализацией фермента с помощью среды для «высвобождения» (полная среда стадии 4, подробно описанная в «разделе k», в которую добавили 4 кЕд/мл ДНКазы I и 10 мкМ соединения Y). Отдельные клетки осаждали, ресуспендировали в холодной среде для «высвобождения» и подсчитывали с помощью прибора Nucleocounter® NC-100. Холодную среду для «криоконсервации» (60% KSR; 15% BLAR001; 5% HEPES (концентрация 1M); 20% DMSO) добавляли в соотношении от 1 к 1 к суспензии отдельных клеток в холодной среде для «высвобождения». 5,0×106 клеток в 4,5 мл среды для «криоконсервации/высвобождения» в соотношении 1 к 1 добавляли в одиночный флакон для криоконсервации объемом 5 мл. Флакон (-ы) переносили в программируемый криозамораживатель (CRF) (Planar PLC, № по каталогу Kryo 360), в котором клетки замораживали с использованием следующей схемы замораживания и длительно хранили в жидком азоте. Процедура замораживания в CRF показана в таблице VII.
f. Размораживание криоконсервированных клеток монослоя S4D3: Замороженные флаконы объемом 5 мл, содержащие 5,0×106 клеток монослоя, размораживали в водяной бане с температурой 37°C в течение 2 минут. Клетки собирали в среду после S4D3 (подробно описанную в разделе «g») и добавляли с плотностью приблизительно 787 клеток на одну лунку Aggrewell™ планшета Aggrewell™ 400EX.
g. Стадия 4 (2 дня) для перемещения скопления Aggrewell™. Для генерации скопления Aggrewell™ клетки монослоя дня 3 стадии 4 или размороженные криоконсервированные клетки дня 3 стадии 4 обрабатывали соединением Y в течение 4 часов, промывали PBS и обрабатывали в течение 3 минут раствором аккутазы для разъединения клеток с последующим удалением фермента и удалением клеток с поверхности MATRIGEL™ путем аккуратного постукивания по флакону. Полученную суспензию клеток добавляли с плотностью приблизительно 787 клеток на одну лунку Aggrewell™ планшета Aggrewell™ 400EX, а планшет осторожно центрифугировали при 100 x г для генерации скоплений Aggrewell™. Количество клеток в одном скоплении может варьироваться от 50 до 3000 клеток. Для перемещения клеток монослоя дня 3 стадии 4 в скопления Aggrewell™ и культивирования через 48 часов после агрегации использовали следующую среду («среда после S4D3»): Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 1% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 70 нМ LDN-HCl; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение двух дней. Десять (10) мкМ соединения Y и 2 мкг/мл человеческого рекомбинантного ламинина добавляли в среду только в течение первых 24 часов. Через два дня (S4D5) скопления Aggrewell™ удаляли из лунок планшетов Aggrewell™ и переносили в центрифужные пробирки PBS0.1MAG («Скопления Aggrewell в суспензии»).
h. Стадия 5 (3 дня). Скопления Aggrewell™ S4D5 извлекали из планшетов Aggrewell™ 400EX и переносили в центрифужные пробирки PBS0.1MAG с плотностью клеток 1,5-2,0 миллиона клеток/мл при скорости вращения 27 об./мин (оборотов в минуту) в среду стадии 5 на три дня. Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 0,25 мкM SANT-1; 50 нM RA; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3 в форме 3,3´, 5-трийод-L-тиронина натриевой соли; и 10 мкМ 2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридина («ингибитор II ALK5» или «ALK5»). 4 кЕд/мл ДНКазыI и 5 мкМ соединения Y добавляли только в день 1 стадии 5.
i. Стадия 6 (от 6 до 8 дней). Скопления Aggrewell™ обрабатывали в специализированной среде BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; 10 мкМ ингибитора II ALK5) и 100 нМ (S,S)-2-[2-(3,5-дифторфенил)ацетиламино]-N-(5-метил-6-оксо-6,7-дигидро-5H-дибензо[b,d]азепин-7-ил)пропионамида («ингибитор XX гамма-секретазы»).
Таблица VII. Процедура замораживания CRF | |||
Схема замораживания монослоя S4D3 | |||
Стадия | Скорость охлаждения (°C/мин) | Целевая температура (°C) | Охладить до |
1 | ОЖИДАНИЕ | 4 | Н/П |
2 | Дождитесь достижения нужной температуры | 4 | Камера |
6 | Проба | ||
3 | 1 | -7 | Проба |
4 | 25 | -45 | Камера |
5 | 10 | -25 | Камера |
6 | 0,2 | -45 | Проба |
7 | 25 | -160 | Камера |
8 | Удержание (20 мин) | -160 | Н/П |
[0191] Количественный анализ и определение характеристик дифференцированных клеток. Для количественного анализа колокализации белка на различных стадиях скопления Aggrewell™ S4D5 и скопления Aggrewell™ S6D6 собирали и анализировали посредством иммунофлуоресценции (IF). Использовали процедуру определения характеристик и реагенты, описанные в таблице VI примера 2.
[0192] Для количественного анализа экспрессии генов на различных стадиях скопления Aggrewell™ дня 5 стадии 4 и скопления Aggrewell™ дня 6 стадии 6 собирали и анализировали посредством количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (кПЦР-РВ), как описано в публикации Nature Biotechnology, (32) 11, 1121-1133. Использовали процедуру определения характеристик и реагенты, описанные в таблице V примера 2.
[0193] Для количественного анализа колокализации белка скопления Aggrewell™ дня 5 стадии 4 и скопления Aggrewell™ дня 6 стадии 6 собирали и анализировали посредством проточной цитометрии с активацией флуоресценции (FACS). Окрашивание в анализе FACS проводили, как описано в Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133, и использовали антитела, перечисленные в таблице VII. Дифференцированные клетки инкубировали в TrypLE™ Express в течение 5-10 минут при 37 °C, высвобождали в суспензию отдельных клеток, после чего их дважды промывали буферным раствором для окрашивания, представляющим собой PBS, содержащий 0,2% BSA. Внутриклеточное окрашивание антителами проводили с использованием фиолетового флуоресцентного реактивного красителя LIVE/DEAD при 4°C в течение 30 минут с последующей однократной промывкой холодным PBS. Фиксацию клеток выполняли в 300 мкл буферного раствора Cytofix/Cytoperm с последующей двукратной промывкой в буферном растворе Perm/Wash. Впоследствии клетки инкубировали с соответствующими антителами при 4°C в течение 30 минут (для неконъюгированных антител) или 1 часа (для конъюгированных антител), а затем дважды отмывали и анализировали на приборе BD FACS Canto II с применением программного обеспечения BD FACS Diva, регистрируя по меньшей мере 30 000 событий. Нежизнеспособные клетки при анализе FACS исключали и проводили дискриминирование, используя изотипические антитела («IgG»).
Таблица VIII. Список антител, используемых для анализа FACS | |||
Антиген | Вид | Источник/№ по каталогу | Разведение |
Alexa Fluor 647 анти-KI67 |
Мышь | BD, № по каталогу 561126 | Без примеси |
Меченное PE анти-PDX1 | Мышь | BD, № по каталогу 562161 | Без примеси |
Меченное Alexa Fluor 647 антитело к ИНСУЛИНУ | Кролик | Cell Signaling, № по каталогу 9008S | 1: 80 |
ИНСУЛИН | Кролик | Cell Signaling, № по каталогу 3014S | 1: 10 |
Меченное PE анти-NKX6.1 | Мышь | BD, № по каталогу 563023 | 1: 40 |
CHGA | Кролик | DAKO, № по каталогу IS502 | 1: 10 |
Меченное PE анти-NEUROD1 | Мышь | BD, № по каталогу 563001 | 1: 40 |
ГЛЮКАГОН | Мышь | Sigma-Aldrich, № по каталогу G2654 | 1: 250 |
Антитело к мышиному IgG(H+L) вторичное, конъюгат с Alexa Fluor 647 | Коза | Life technology, № по каталогу A21235 | 1: 4000 |
F(ab')2 к кроличьему IgG(H+L) вторичное антитело, конъюгат с RPE | Коза | Life technology, № по каталогу A10542 | Без примеси |
[0194] На ФИГ. 6A показана процедура, с помощью которой (i) свежий монослой S4D3 или криоконсервированные клетки S4D3 собирали (ii) посредством способа Aggrewell™ в (iii) скопления клеток. На ФИГ. 6B показано, что в скоплениях Aggrewell™ S4D5 обнаруживали наличие большого количества белков ТФ панкреатической энтодермы PDX1 (сверху слева) и NKX6.1 (сверху посередине), но низкого количества эндокринного ТФ NEUROD1 (сверху справа), колебание размещающих линию дифференцировки непанкреатической энтодермы ТФ SOX2 (снизу посередине) и CDX2 (снизу справа). Анализ FACS (ФИГ. 6C) показывает, что 99,3±0,1% клеток были PDX1+ (слева), 84,4±0,1% NKX6.1+ (посередине), но 2,2±0,4% NKX6.1+ NEUROD1+ (справа) или 1,35±0,55% NKX6.1+ CHGA+ (посередине). На ФИГ. 6D показано сохранение устойчивых характеристик панкреатической энтодермы в скоплениях Aggrewell™ S4D4, полученных из криоконсервированных клеток S4D3, за счет сохранения высокой генной экспрессии PDX1 (сверху слева), NKX6.1 (сверху справа) и низкой экспрессии NEUROD1 (снизу слева) и CHGA (снизу справа) по сравнению с монослоем S4D3. В целом скопления Aggrewell™ S4D5 показывали более выраженные характеристики неэндокринной панкреатической энтодермы, чем предшествующие клетки стадии 4, описанные в Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133. Результаты являются значимыми, так как скопления Aggrewell™ обеспечивают исходную точку, выполненную с возможностью изменения, от которой можно начинать основанную на суспензионной культуре дифференцировку до бета-клеток.
[0195] На ФИГ. 6E показана процедура, с помощью которой (i) свежий монослой S4D3 или криоконсервированные клетки S4D3 собирали (ii) посредством способа Aggrewell™ в скопления клеток, и (iii) дифференцировали в суспензионной культуре до (iv) незрелых бета-клеток посредством S6D6. Анализ FACS скоплений Aggrewell™ S6D6 показал профиль белка незрелых бета-клеток, так как 78,5±1,87% клеток были NKX6.1+ CHGA+ (слева, ФИГ. 6F), 73,6±4,34% NKX6.1+ NEUROD1+ (справа, ФИГ. 6F) и 38,4±5,96% NKX6.1+ ИНСУЛИН+ (слева, ФИГ. 6G). Большая часть ИНСУЛИН-положительной популяции (50,2±6,92% от общего числа клеток были ИНСУЛИН+) была NKX6.1+ (слева, ФИГ. 6G) и не ГЛЮКАГОН-положительной (7,43±1,49% ИНСУЛИН+ ГЛЮКАГОН+; (справа, ФИГ. 6G). На ФИГ. 6H показано посредством IF, что в S6D6 большинство C-ПЕПТИД-положительных клеток в скоплениях Aggrewell™ были как PDX1+ (слева), так и NKX6.1+ (посередине). Неожиданно было обнаружено, что присутствие белка ТФ привратника созревания MAFA (справа) уже легко обнаруживали в S6D6, и его экспрессировали на большем уровне, чем в предыдущих скоплениях на ALI в S6D6-S6D7 (Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133) (ФИГ. 6I; см. также ФИГ. 3C для сравнения с ALI S7D7). Аналогично экспрессия ИНСУЛИНА (ФИГ. 6J), PDX1 (ФИГ. 6K) и NKX6.1 (ФИГ. 6L) была выше, чем в предыдущих скоплениях на ALI в S6D6-S6D7. Результаты подтверждают, что скопления Aggrewell™ S4D5 можно культивировать в суспензионной культуре до состояния незрелых бета-клеток, создавая подготовленную исходную точку, выполненную с возможностью изменения, для основанной на суспензионной культуре дифференцировки до функциональных зрелых бета-клеток.
[0196] Таким образом, данный пример показывает, что клетки стадии 4 можно подвергать агрегированию в скопления клеток, сохраняя их фенотип панкреатической энтодермы. Более того, эти скопления клеток стадии 4 можно дополнительно дифференцировать до фенотипа полноценных незрелых бета-клеток (стадия 6) с помощью суспензионной культуры, выполненной с возможностью изменения.
Пример 4.
Генерация суспензионной культуры эндокринных клеток с увеличенной экспрессией маркера созревания бета-клеток и белковым профилем, аналогичным подомному в зрелых человеческих островковых клетках
[0197] В следующем примере показана генерация суспензионной культуры клеток С-ПЕПТИДА, которые показывают совместную экспрессию и наличие белков следующих маркеров созревания, PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1. Клетки клеточной линии H1-hESC, культивированные со средой EZ8, при пассаже 28 засевали в виде отдельных клеток с плотностью 0,094×106 клеток/см2 на MATRIGEL™ на чашки Петри с покрытием в разведении 1:30 в среду DMEM-F12, содержащую GlutaMAX™ в разведении 1:100 (концентрация 1X), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл FGF2, 1 нг/мл TGFβ, ITS-X в разведении 1:100, 2% FAF-BSA и 20 нг/мл IGF-1, в которую добавили 10 мкМ соединения Y. Соединение Y добавляли только в течение первых 24 часов после посева. Через сорок восемь часов после посева культуры промывали в PBS (-/-).
[0198] Для ФИГ. 7A-7M культуры дифференцировали, используя следующий протокол. На протяжении стадий с 1 по 4 протокола культуры поддерживали в виде плоских адгезивных культур. Начиная с монослоя S4D3 или криоконсервированных клеток S4D3, скопления клеток Aggrewell™ получали и культивировали в течение дополнительных 48 часов (день 5 стадии 4 или S4D5). В ходе выполнения протокола дифференцировки среду меняли ежедневно. Во время стадий 5, 6 и 7 скопления Aggrewell™ культивировали в суспензионной культуре, как описано в примере 3, за исключением того, что стадия 6 протекала более 7 дней, а не 6 дней.
а. Стадия 1 (3 дня). Клетки культивировали в течение одного дня в следующей среде стадии 1: среда MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в разведении 1:100 (концентрация 1X), 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкМ соединения MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ ингибитора GSK-3β. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, 1X GlutaMAX™, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл FGF7.
c. Стадия 3 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 1% FAF-BSA; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мкМ SANT-1; 1 мкM RA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нM TPB); и LDN-HCl в течение двух дней. Концентрация LDN-HCl, используемая в первый день стадии 3, составляла 100 нМ, а во второй день стадии 3-10 нМ.
d. Стадия 4 (3 дня). Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 1% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 70 нМ LDN-HCl; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение трех дней.
Криоконсервация монослоя в день 3 стадии 4. Криосохраненные клеточные банки из монослоя S4D3 получали с использованием процедуры, описанной в примере 3 и таблице VII.
e. Размораживание криоконсервированных клеток монослоя S4D3. Замороженные флаконы объемом 5 мл, содержащие 5,0 X106 клеток монослоя S4D3, размораживали, как описано в примере 3.
f. Стадия 4 (2 дня) для перемещения скопления Aggrewell™. Скопления Aggrewell™ получали из клеток монослоя дня 3 стадии 4 или размораживали криоконсервированные клетки дня 3 стадии 4, как описано в примере 3.
g. Стадия 5 (3 дня). Скопления Aggrewell™ S4D5 извлекали из планшетов Aggrewell™ 400EX и переносили в центрифужные пробирки PBS0.1MAG с плотностью клеток 1,5-2,0 миллиона клеток/мл при скорости вращения 27 об./мин (оборотов в минуту) в среду стадии 5 на три дня. Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1:200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 0,25 мкM SANT-1; 50 нM RA; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; и 10 мкМ ингибитора II ALK5. 4 кЕд/мл ДНКазыI и 5 мкМ соединения Y добавляли только в день 1 стадии 5.
h. Стадия 6 (7 дней). Скопления Aggrewell™ обрабатывали в специализированной среде BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; 10 мкМ ингибитора II ALK5 и 100 нМ ингибитора XX гамма-секретазы.
i. Стадия 7 (от 6 до 7 дней). Скопления Aggrewell™ обрабатывали в специализированной среде BLAR001 или BLAR004, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H), 10 нМ T3 (низкий T3); 1 мМ NAC; 0,5 мкМ ZM); и следующие компоненты, которые входят в состав I (FI) - среда RPMI с витаминной добавкой в разведении 1: 200; среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1:200; концентрат липидов с определенным химическим составом в разведении 1:2000; пируват натрия в разведении 1:200; следовые элементы А в разведении 1:2000; следовые элементы В в разведении 1:2000 в течение семи дней. Дополнительные соединения, добавленные во время стадии 7, включали в себя 4 мкМ AZT; или 1 мкМ DEZA. Для большей ясности скопления Aggrewell™ в суспензии культивировали во время стадии 7 в двух условиях, используя концентрации, описанные выше (в среде, основанной на BLAR001 или BLAR004): (i) без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC; (ii) без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT, DEZA.
[0199] На стадиях 5, 6 и 7 клеточные культуры обрабатывали, начиная или со скоплений Aggrewell™ S4D5, или со скоплений на ALI, перемещенных в S4D3. Скопления Aggrewell™ S4D5 извлекали из планшетов Aggrewell™ 400EX и переносили в центрифужные пробирки PBS0.1MAG с плотностью клеток 1,5-2,0 миллиона клеток/мл при скорости вращения 27 об./мин (оборотов в минуту).
[0200] Количественный анализ и определение характеристик дифференцированных клеток. Скопления Aggrewell™ стадии 7 и человеческие островки оценивали посредством IF, FACS и кПЦР-РВ, как описано в примерах 2 и 3.
[0201] На ФИГ. 7A показана процедура, с помощью которой (i) свежий монослой S4D3 или криосохраненные клетки собирали в скопления Aggrewell™, подготовленные в суспензионной культуре посредством прохождения через (ii и iii) стадии 5, 6 и 7 для генерации (iv) скоплений Aggrewell™ S7D7. Так же, как скопления Aggrewell™ S6D6 (ФИГ. 6F-6G), скопления Aggrewell™ S7D7, культивированные в условиях «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC DEZA AZT FI BLAR001» во время стадии 7, сохраняли профиль белка бета-клеток на исходном уровне (ФИГ. 7B-7C). 89% клеток были NKX6.1+ CHGA+ (слева, ФИГ. 7B), 77,7% - NKX6.1+ NEUROD1+ (справа, ФИГ. 7B) и 40,8% - NKX6.1+ ИНСУЛИН+ (слева, ФИГ. 7C). Большая часть ИНСУЛИН-положительной популяции (46,4% от общего числа клеток были ИНСУЛИН+) была NKX6.1+ (слева, ФИГ. 7C) и не ГЛЮКАГОН-положительной (3,9% ИНСУЛИН+ ГЛЮКАГОН+; (справа, ФИГ. 7C).
[0202] В дополнение к профилю бета-клеток на исходном уровне генная экспрессия маркеров созревания MAFA (ФИГ. 7D), UCN3 (ФИГ. 7E), SLC2A1 (ФИГ. 7F), G6PC2 (ФИГ. 7G), ИНСУЛИН (ФИГ. 7H) и NKX6.1 (ФИГ. 7I) находилась на уровнях человеческих островков в скоплениях S7D7 Aggrewell™, подготовленных в условиях стадии 7 «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC DEZA AZT FI BLAR001 или BLAR004», или превышала их. Уровни экспрессии в S7D7 маркеров созревания, таких как: MAFA (ФИГ. 3C); G2PC2 (ФИГ. 3F); ИНСУЛИН (ФИГ. 3H); и NKX6.1 (ФИГ. 3L) были значительно выше в скоплениях Aggrewell™ («БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC DEZA AZT FI BLAR001 или BLAR004»), чем в скоплениях на ALI.
[0203] В действительности, ФИГ. 7J-7M показывают, что добавление DEZA и AZT к условиям стадии 7 «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC FI BLAR004» приводило к генерации большого числа не продуцирующих ГЛЮКАГОН (ФИГ. 7J; снизу справа) клеток С-ПЕПТИДА, которые на основании присутствия белка совместно экспрессировали PDX1 в S7D7 (ФИГ. 7J; снизу слева), NKX6.1 (ФИГ. 7J; снизу посередине), MAFA (ФИГ. 7K; снизу слева), UCN3 (ФИГ. 7K; снизу посередине) и SLC2A1 (ФИГ. 7K; снизу справа). Для каждой фигуры иммунофлуоресцентное окрашивание показано в виде отдельных каналов с С-ПЕПТИДОМ в верхнем ряду. Так как экспрессию MAFA, SLC2A1 и UCN3 не ограничивают С-ПЕПТИДположительными клетками, ожидают, что по меньшей мере около 10% популяции клеток будут показывать совместную экспрессию С-ПЕПТИДА, PDX1, NKX6.1, MAFA, SLC2A1 и UCN3. В противоположность этому на ФИГ. 7L-7M показана генерация посредством обработки в условиях «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC FI BLAR004» стадии 7 клеток С-ПЕПТИДА, которые на основании присутствия белка совместно экспрессировали частичный набор маркеров созревания к S7D7: PDX1 (ФИГ. 7L; снизу слева), NKX6.1 (ФИГ. 7L; снизу посередине), MAFA (ФИГ. 7M; снизу слева), SLC2A1 (ФИГ. 7M; снизу справа), но не ГЛЮКАГОН (ФИГ. 7L; нижний правый) и UCN3 (ФИГ. 7M; снизу посередине). Обработка скоплений Aggrewell™ в условиях «БЕЗ ALK5 С НИЗКИМ T3 ZM H NAC DEZA AZT FI BLAR004» стадии 7 приводило к генерации большого числа зрелых бета-клеток, схожих со зрелыми островками взрослого человека, согласно оцениванию по экспрессии генов и наличию белка.
[0204] Таким образом, данный пример демонстрирует, что скопления клеток стадии 4 можно дополнительно дифференцировать в суспензионной культуре до функциональных бета-клеток посредством изменений условий обработки стадии 7. В частности, в примере 4 показана генерация С-ПЕПТИД-положительных клеток внутри скоплений клеток в суспензионной культуре, которые совместно экспрессируют маркеры созревания бета-клеток, необходимые для обеспечения соответствующих функциональных возможностей бета-клеток.
Пример 5.
Генерация суспензионной культуры эндокринных клеток, имеющих кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания и стимулированной глюкозой секреции инсулина, аналогичную подобной в зрелых человеческих островках
[0205] В следующем примере показана генерация функционально зрелых бета-клеток с использованием суспензионной культуры со схожей с человеческими островками кинетикой глюкозозависимого митохондриального дыхания и стимулированной глюкозой секреции инсулина (GSIS). Условия культивирования такие же, как в примере 4. Клетки клеточной линии H1-hESC, культивированные со средой EZ8, при пассаже 28 засевали в виде отдельных клеток с плотностью 0,094×106 клеток/см2 на MATRIGEL™ на чашки Петри с покрытием в разведении 1:30 в среду DMEM-F12, которая содержит GlutaMAX™ в разведении 1:100 (концентрация 1X), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл FGF2, 1 нг/мл TGFβ, ITS-X в разведении 1:100, 2% FAF-BSA, 20 нг/мл IGF-1, в которую добавили 10 мкМ соединения Y. Соединение Y добавляли только в течение первых 24 часов после посева. Через сорок восемь часов после посева культуры промывали в PBS (-/-).
[0206] Для ФИГ. 8A-8I культуры дифференцировали, используя следующий протокол. На протяжении стадий с 1 по 4 протокола культуры поддерживали в виде плоских адгезивных культур. Начиная с монослоя S4D3 или криоконсервированных клеток S4D3, скопления клеток Aggrewell™ получали и культивировали в течение дополнительных 48 часов (день 5 стадии 4 или S4D5). В ходе выполнения протокола дифференцировки среду меняли ежедневно. На стадиях 5, 6 и 7 скопления Aggrewell™ культивировали в суспензионной культуре, как описано в примере 3. Скопления на ALI, показанные на ФИГ. 8E-8F, культивировали, как описано в примере 2. Вкратце:
а. Стадия 1 (3 дня). Клетки культивировали в течение одного дня в следующей среде стадии 1: среда MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в разведении 1:100 (концентрация 1X), 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкМ соединения MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ ингибитора GSK-3β. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, 1X GlutaMAX™, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл FGF7.
c. Стадия 3 (2 дня). Клетки обрабатывали в течение двух дней специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1:200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 1% FAF-BSA; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мкМ SANT-1; 1 мкM RA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нM TPB); и LDN-HCl в течение двух дней. Концентрация LDN-HCl, используемая в первый день стадии 3, составляла 100 нМ, а во второй день стадии 3-10 нМ.
d. Стадия 4 (3 дня). Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1:200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 1% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 70 нМ LDN-HCl; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение трех дней.
e. Криоконсервация монослоя в день 3 стадии 4. Криосохраненные клеточные банки из монослоя S4D3 получали с использованием процедуры, описанной в примере 3 и таблице VII.
f. Размораживание криоконсервированных клеток монослоя S4D3: Замороженные флаконы объемом 5 мл, содержащие 5,0 X106 клеток монослоя S4D3, размораживали, как описано в примере 3. Можно применять аналогичную процедуру для перемещения скоплений на ALI или Aggrewell™.
g. Стадия 4 (2 дня) для перемещения скопления Aggrewell™ или перемещения скопления на ALI. Скопления Aggrewell™ получали из клеток монослоя дня 3 стадии 4 или размораживали криоконсервированные клетки дня 3 стадии 4, как описано в примере 3. Скопления на ALI получали из клеток дня 3 стадии 4, как описано в примере 2.
Так же как в примере 4, на стадиях 5, 6 и 7 клеточные культуры обрабатывали, начиная или со скоплений Aggrewell™ S4D5, или со скоплений на ALI, перемещенных в S4D3. Скопления Aggrewell™ S4D5 извлекали из планшетов Aggrewell™ 400EX и переносили в центрифужные пробирки PBS0.1MAG с плотностью клеток 1,5-2,0 миллиона клеток/мл при скорости вращения 27 об./мин (оборотов в минуту).
h. Стадия 5 (3 дня). Скопления Aggrewell™ или ALI обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия, и в которую добавили ITS-X в разведении 1:200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 0,25 мкM SANT-1; 50 нM RA; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; и 10 мкМ ингибитора II ALK5 в течение трех дней. 4 кЕд/мл ДНКазыI и 5 мкМ соединения Y добавляли только в день 1 стадии 5 в скопления Aggrewell™.
i. Стадия 6 (7 дней). Скопления Aggrewell™ или ALI обрабатывали в специализированной среде BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия, в которую добавили ITS-X в разведении 1:200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; 10 мкМ ингибитора II ALK5 и 100 нМ гамма-секретазы XX.
j. Стадия 7 (от 7 до 14 дней). Скопления Aggrewell™ или ALI обрабатывали в специализированной среде BLAR001 или BLAR004, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1:200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H), 10 нМ T3 (низкий T3); 1 мМ NAC; 0,5 мкМ ZM); и следующие компоненты, которые входят в состав I (FI) - среда RPMI с витаминной добавкой в разведении 1:200; среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1:200; концентрат липидов с определенным химическим составом в разведении 1:2000; пируват натрия в разведении 1:200; следовые элементы А в разведении 1:2000; следовые элементы В в разведении 1:2000 в течение семи дней. Дополнительные соединения, добавленные во время стадии 7, включали в себя 4 мкМ AZT; или 1 мкМ DEZA. Для большей ясности скопления Aggrewell™ или ALI в суспензии культивировали во время стадии 7 в двух условиях, используя концентрации, описанные выше (в среде, основанной на BLAR001 или BLAR004): (i) без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC; (ii) без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT, DEZA. ФИГ. 8A, 8B, 8H, 8I: Во время стадии 7 скопления Aggrewell в суспензии культивировали до S7D13 или S7D14 в двух условиях: (i) без ALK5, с низким T3, 0,5 мкМ ZM, 10 мкг/мл H, 1 мМ NAC; (ii) от S7D1 до S7D5 - без ALK5, с низким T3, 0,5 мкМ ZM, 10 мкг/мл H, 1 мМ NAC; 5 мкМ AZT; 1 мкМ DEZA; от S7D6 до S7D13 или S7D14 - без ALK5, с низким T3, 0,5 мкМ ZM, 10 мкг/мл H, 1 мМ NAC.
[0207] Количественный анализ и определение характеристик дифференцированных клеток. Для количественного анализа глюкозозависимой митохондриальной активности скоплений на ALI S6D7 характеризовали скопления Aggrewell™ стадии 7 и зрелые человеческие островки с помощью устройства Seahorse XFe24, как описано в примере 2. Скопления на ALI/Aggrewell™ или человеческие островки собирали и измеряли их скорость потребления кислорода (OCR) на внеклеточном поточном анализаторе XFe24 до и после введения 20 мМ D-глюкозы. Скопления на ALI/Aggrewell™ или человеческие островки удаляли из условий стадии 7 и инкубировали в течение 2 часов при 37°C и в не содержащей CO2 среде, и в среде, выполненной с возможностью достижения исходного уровня OCR. Среда для предварительной инкубации содержит 1 мМ D-глюкозы, 1 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия в основной среде XF. После предварительной инкубации скопления на ALI/Aggrewell™ или человеческие островки помещали на аппарат Seahorse, в котором выполняли следующие измерения: (i) OCR на исходном уровне 3 раза (перед введением D-глюкозы); (ii) 5 раз после введения D-глюкозы (время инкубации после введения: 72 минуты). Все измерения OCR нормализовали в соответствии с содержанием ДНК в отдельных пробах. ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA MicroKit, а содержание ДНК измеряли с помощью спектрофотометра для УФ и видимой областей спектра NanoDrop 8000.
[0208] Для количественного анализа глюкозозависимой секреции инсулина скопления на ALI стадии 7, скопления Aggrewell™ и зрелые человеческие островки характеризовали с помощью клеточной перфузионной системы (BioRep Technologies, г. Майами, штат Флорида, США, № по каталогу PERI4-02). Если говорить кратко, для нормализации секреции инсулина по исходному уровню скопления на ALI/Aggrewell™ или человеческие островки переносили в теплый (37 °C) буферный раствор Кребса (таблица IX). Клетки помещали в перфузионные камеры (BioRep Technologies, № по каталогу PERI-CHAMBER) и непрерывно перфузировали (скорость потока 100 мкл/мин) четырьмя последовательными буферными растворами Кребса, в которые добавили одно из: (i) 3 мМ D-глюкозы; (ii) 16,7 мМ D-глюкозы ± 100 нг/мл эксендина-4 (Ex4); и (iii) 25 мМ KCl с 3 мМ D-глюкозы. На каждой фигуре указаны конкретные протоколы перфузии. Пробы перфузата собирали каждую минуту и определяли концентрации белка С-ПЕПТИДА (в единицах нг/мл) с помощью твердофазного ИФА для С-ПЕПТИДА (Mercodia, г. Уппсала, Швеция, № по каталогу 10-1136-01).
Таблица IX. Компоненты буферного раствора Кребса (pH 7,4) | ||
№ по каталогу | Концентрация | |
NaCl | Sigma-Aldrich, S7653 | 7,5 г/1000мл |
KCl | Sigma-Aldrich, B9333 | 0,357 г/1000мл |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, C1016 | 0,277 г/1000мл |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, M7506 | 0,144 г/1000мл |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich 71643 | 0,144 г/1000мл |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, P5655 | 0,16г/1000мл |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, S5761 | 0,42 г/1000мл |
HEPES | Thermo Fisher Scientific15630080 |
[0209] На ФИГ. 8A и 8B показана митохондриальная реакция скоплений Aggrewell™ S7D13 в суспензии на введение 20 мМ D-глюкозы. На ФИГ. 8A и 8B показано, что человеческие островки (черная линия с кружками) и быстро реагировали на высокую концентрацию D-глюкозы, как видно на основании OCR, равной 123,3% ± 12,92 по сравнению с исходным уровнем через 15 минут (мин) после инъекции («п/и»), и сохраняли высокую OCR во времени (131,5% ± 11,32; 72 мин п/и). С другой стороны, в скоплениях на ALI S6D7 (серая линия с треугольниками), которые обогащали незрелыми С-ПЕПТИДположительными клетками, не было стремительной реакции OCR на высокую концентрацию D-глюкозы (104,4% ± 3,37; 15 мин п/и), и они показывают относительно слабую реакцию OCR во времени (113,3% ± 4,51; 72 мин п/и). Схожую с человеческими островками кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания наблюдали в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI, BLAR004» в S7D13 в контексте скоплений Aggrewell™ в суспензии (110,7% ± 2,46-15 мин п/и; 125,9% ± 2,27-72 мин п/и) (серая линия с квадратами) (ФИГ. 8A); В противоположность этому, скопления на ALI S7D7 в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI BLAR001 или BLAR004» не отображали кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания на уровне человеческих островков (ФИГ. 5C и 5E). Кроме того, скопления Aggrewell™ в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, AZT, DEZA, FI, BLAR004» в суспензии потребляли значительно больше кислорода в ответ на стимуляцию высокой концентрацией глюкозы, чем человеческие островки (162,0% ± 11,51-15 мин п/и; 177,1% ± 0,99-72 мин п/и) (серая линия с квадратами) (ФИГ. 8B); DEZA и AZT вводили только во время первых четырех дней обработки стадии 7, предполагая, что функциональная митохондриальная способность к реагированию, полученная за счет AZT и DEZA, оставалась стабильной в скоплениях Aggrewell™ стадии 7 в течение по меньшей мере 10 дней.
[0210] На ФИГ. 8C показано, что зрелые бета-клетки внутри человеческих островков демонстрировали способность к осуществлению множества циклов быстрой двухфазной секреции инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой. Вторая реакция в виде двухфазной GSIS была менее выраженной по сравнению с первой (первая фаза первой реакции в виде GSIS была приблизительно в 7-8 раз сильнее). Кроме того, человеческие островки демонстрировали способность к осуществлению множества циклов «включения-выключения» секреции инсулина и способность к массивному высвобождению гранул инсулина при KCl-опосредованной деполяризации мембраны. Все исследованные условия показывали сильную реакцию в виде секреции инсулина на KCl (ФИГ. 8C-8I). Добавление эксендина-4 (Ex4) не увеличивало амплитуду реакции в виде GSIS в показанных человеческих островках, но было включено для сравнения с профилями GSIS ALI или Aggrewell™ (ФИГ. 8D). Скопления на ALI S7D8-S7D10, обработанные во время стадии 7 в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC FI», либо в BLAR001 (ФИГ. 8E), либо в BLAR004 (ФИГ. 8F), показали одну (~4-10-кратное увеличение в первой фазе первой реакции в виде GSIS), но не вторую, и относительно медленную реакцию в виде двухфазной GSIS. Кроме того, скопления на ALI не были способны блокировать вторую фазу секреции инсулина при реперфузии 3 мМ D-глюкозы после стимуляции. В противоположность этому, скопления S7D14 Aggrewell™, обработанные во время стадии 7 в условиях «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI BLAR004», показали сильную первую двухфазную GSIS (~5-кратное увеличение в первую фазу первой реакции в виде GSIS), а затем продемонстрировали способность полностью блокировать GSIS и показали слабую вторую монофазную реакцию (ФИГ. 8G). После добавления DEZA и AZT к условиям «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, FI BLAR004» скопления S7D14 Aggrewell™ показали множество циклов схожей с человеческими островками двухфазной GSIS (~5-7-кратное увеличение в первой фазе первой реакции в виде GSIS) и способность полностью блокировать GSIS между повышениями концентрации глюкозы (ФИГ. 8H-8I). На ФИГ. 8H и 8I представлено два биологических повторения условия «без ALK5, с низким T3, ZM, H, NAC, DEZA, AZT BLAR004» для скопления Aggrewell™ S7D14. На ФИГ. 8H-8I DEZA и AZT вводили только во время первых четырех дней обработки стадии 7, предполагая, что устойчивые реакции в виде двухфазной GSIS, полученные за счет AZT и DEZA, оставались стабильными в скоплениях Aggrewell™ стадии 7 в течение по меньшей мере 10 дней.
[0211] Таким образом, в примере 5 показана генерация полученных из hESC функциональных бета-клеток (стадия 7) с использованием клеточной агрегации и суспензионной культуры, имеющих схожую с человеческими островками кинетику глюкозозависимого митохондриального дыхания и GSIS.
Таблица X. Поставщики материалов и соединения, используемые в примерах 1-5 | |
Материал/соединение | Поставщик |
(S,S)-2-[2-(3,5-дифторфенил)ацетиламино]-N-(5-метил-6-оксо-6,7-дигидро-5H-дибензо[b,d]азепин-7-ил)пропионамид («ингибитор XX гамма-секретазы») | EMD Millipore, № по каталогу 565789 |
0,2% BSA | BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США, № по каталогу 554657 |
2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин («ингибитор II ALK5» или «ALK5») | Enzo Life Sciences, Inc., г. Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу ALX-270-445 |
3,3´, 5-трийод-L-тиронин натрия | Sigma Aldrich, № по каталогу T6397 |
30% раствор сахарозы | Amresco, г. Солон, штат Огайо, США, № по каталогу 0335 |
4% PFA | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США, № по каталогу 158127 |
флакон для криоконсервирования объемом 5 мл | Thermo Fisher Scientific, № по каталогу 5000-0050 |
5-Азацитидин (AZT) | Sigma Aldrich, № по каталогу A2385 |
раствор аккутазы для разъединения клеток | Stem Cell Technologies, № по каталогу 07920 |
планшет Aggrewell™ 400EX | STEMCELL Technologies Inc.; г. Ванкувер, Канада; № по каталогу 27840 |
аскорбиновая кислота | Sigma Aldrich Co. LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури, США, № по каталогу A4544 |
среда BME с витаминной добавкой | Sigma Aldrich, № по каталогу B6891 |
концентрат липидов с известным химическим составом | Gibco by Life Technologies, № по каталогу 11905 |
буферный раствор Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США, № по каталогу 554723 |
Деазанепланоцин A (DEZA) | Biovision, Inc., № по каталогу 2060 |
D-глюкоза | Sigma-Aldrich Co. LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури, США, № по каталогу G8769 |
DMEM-F12 | Life Technologies Corporation, г. Карлсбад, штат Калифорния, США, № по каталогу 11330-032 |
DMSO | Sigma-Aldrich, № по каталогу D2650 |
ДНКазаI | Sigma-Aldrich, № по каталогу 9003-98-9 |
Эксендин-4 (Ex4) | Sigma-Aldrich, № по каталогу E7144 |
среда EZ8 | Gibco by Thermo Fisher Scientific, № по каталогу A151690 |
не содержащий жирных кислот бычий сывороточный альбумин | Proliant, Inc., г. Бун, штат Айдахо, США, № по каталогу 68700 |
фактор 2 роста фибробластов | R & D Systems Inc., г. Миннеаполис, штат Миннесота, США, № по каталогу 233-FB-025 |
фактор 7 роста фибробластов (FGF7) | R&D Systems, Inc., г. Миннеаполис, штат Миннесота, США, № по каталогу 251-KG |
GlutaMAX™ | Life Technologies Corporation, г. Карлсбад, штат Калифорния, США, № по каталогу 35050-079) |
ростовой фактор 8 дифференцировки (GDF8) | Peprotech, г. Роки Хилл, штат Нью-Джерси, США, № по каталогу 120-00 |
H1-hESC | клетки WA01, WiCell Research Institute, г. Мэдисон, штат Висконсин, США |
гепарин (H) | Sigma Aldrich, № по каталогу H3149 |
HEPES | Thermo Fisher Scientific, № по каталогу 15630080 |
человеческий рекомбинантный ламинин 521 | BioLamina, № по каталогу LN-521-03 - человеческий рекомбинантный ламинин 521 |
неполный PBS (фосфатно-солевой буферный раствор без магния и кальция) | Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США, № по каталогу 14190 |
инсулиноподобный фактор-1 роста (IGF-1) | R & D Systems Inc., г. Миннеаполис, штат Миннесота, США, № по каталогу 291-G1-200 |
инсулин-трансферрин-селен-этаноламин | Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США, № по каталогу 51500056 |
KSR | Thermo Fisher Scientific, № по каталогу 10828028 |
LDN-193189-HCl (LDN-HCl) (6-(4-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенил)-3-(пиридин-4-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин, гидрохлорид, рецептор BMP) |
Shanghai ChemPartners Co Ltd., г. Шанхай, Китай, № по каталогу CG468-141007, серия/партия 20141212 |
L-глутамин | Gibco by Life Technologies, № по каталогу 25030-081 |
фиолетовый флуоресцентный реактивный краситель LIVE/DEAD | Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США, № по каталогу L34955 |
MATRIGEL™ | Corning Incorporated, г. Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу 356231 |
среда MCDB-131 | Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США, № по каталогу ME120219L2 |
среда MEM с добавлением заменимых аминокислот | Gibco by Life Technologies, № по каталогу 111400 |
N-ацетилцистеин (NAC) | Sigma Aldrich, № по каталогу A9165 |
Nucleocounter® NC-100 | Chemometec, Аллерод, Дания, № по каталогу 900-004 |
раствор OCT | Sakura Finetek USA Inc., г. Торранс, штат Калифорния, США, № по каталогу 4583 |
центрифужные пробирки PBS0.1MAG | PBS Biotech Inc., г. Камарильо, штат Калифорния, США, № по каталогу 1A-0.1-D-001 |
буферный раствор Perm/Wash | BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США, № по каталогу 554722 |
пористые фильтры-вкладыши для клеточной культуры, 0,4 мкм | Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу 3419 |
пористые фильтры-вкладыши для клеточной культуры, 3,0 мкм | Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу 3420 |
ретиноевая кислота (RA) | Sigma Aldrich, № по каталогу R2625 |
среда RPMI с витаминной добавкой | Sigma Aldrich, № по каталогу R7256 |
SANT-1 (N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)-1-пиперазинамин) | Sigma Aldrich, № по каталогу S4572 |
бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich Co. LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури, США, № по каталогу 5761 |
пируват натрия | Gibco by Life Technologies, № по каталогу 11360 |
TPB | Shanghai ChemPartners Co Ltd., г. Шанхай, Китай, № по каталогу Custom, серия/партия CP-0007242-101 |
следовые элементы А | Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу 25-021 |
следовые элементы B | Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу 25-022 |
трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) | R & D Systems Inc., г. Миннеаполис, штат Миннесота, США, № по каталогу 240-B-002 |
TrypLE™ Express Enzyme | Life Technologies Corporation, № по каталогу 12604-013 |
основная среда XF | Seahorse Bioscience, № по каталогу 102340-100 |
Y-27632 (соединение Y) | Sigma Aldrich Co. LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури, США, № по каталогу Y-0503 |
ZM447439 (ZM) | Selleckchem.com, № по каталогу S1103 |
ZnSO4 | Sigma Aldrich, № по каталогу Z0251 |
Таблица XII. Компонент состава I | ||
Компонент | Концентрация | Поставщик |
Среда RPMI с витаминной добавкой | Разведение 1:200 |
Sigma Aldrich, № по каталогу R7256 |
Среда MEM с добавлением заменимых аминокислот | Разведение 1:200 |
Life Technologies, № по каталогу 111400 |
Концентрат липидов с известным химическим составом | Разведение 1:2000 |
Gibco by Life Technologies, № по каталогу 11905 |
пируват натрия | Разведение 1:200 |
Life Technologies, № по каталогу 111360 |
Следовые элементы А | Разведение 1:2000 |
Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу 25-021 |
Следовые элементы B | Разведение 1:2000 |
Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу 25-022 |
[0212] В приведенных выше примерах описаны различные малые молекулы, которые, как правило, выполняют функцию ингибиторов клеточного цикла, но неожиданно в настоящем изобретении было обнаружено, что они индуцируют экспрессию ключевых маркеров зрелых бета-клеток, включая PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1.
Пример 6.
Генерация панкреатической энтодермы, полученной из hESC CyT49, во множестве типов суспензионной культуры
[0213] В следующем примере показана усовершенствованная генерация панкреатических энтодермальных клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток, в частности линии человеческих эмбриональных стволовых клеток CyT49 (hESC), с использованием протокола дифференцировки во множестве типов суспензионной культуры (роллерный флакон и вертикальный вращающийся биореактор PBS Biotech MagLift™). В таблице XIII перечислены конкретные улучшения, примененные к полученной из hESC CyT49 панкреатической энтодерме. В частности, панкреатическая энтодерма, полученная из hESC CyT49, показывает меньшую распространенность как альтернативных энтодермальных, так и эндокринных линий дифференцировки, что является важным требованием для дополнительной эффективной генерации инсулинпродуцирующих клеток и более характерно для полученной из hESC H1 панкреатической энтодермы (пример 3). Более того, время, необходимое для генерации панкреатической энтодермы, полученной из hESC CyT49, уменьшают на 5 дней. Новый протокол получения панкреатической энтодермы, полученной из hESC CyT49, можно использовать в таких типах, как роллерный флакон и биореактор, что позволяет осуществлять как горизонтальное, так и вертикальное масштабирование производства.
Таблица XШ. Улучшения в генерации панкреатической энтодермы | |||
PEC-01, полученные из hESC CyT49 |
Клетки, полученные из hESC H1
(Пример 3) |
Новые клетки, полученные из hESC CyT49
(Пример 6) |
|
Продолжительность протокола | 15 суток | 10 суток | 10 суток |
Распространенность других линий дифференцировки энтодермы | Средняя | Низкая | Низкая |
Распространенность эндокринной дифференцировки | Средняя | Низкая | Низкая |
Тип | Роллерный флакон, биореакторы (8,895,300; 8,445,273) | Вертикальное масштабирование; биореактор (настоящее описание) | Роллерный флакон, биореактор (настоящее описание) |
В таблице XIV описаны основные изменения, примененные к протоколу дифференцировки для генерации улучшенной панкреатической энтодермы, полученной из hESC CyT49. Основные различия включают в себя отсутствие ингибирования BMP во время стадий 3-4 и применение MCDB131 (стадии 1-2) и BLAR001 (стадии 3-4) в качестве основных сред.
Таблица XIV. Протокол дифференцировки до полученной из hESC панкреатической энтодермы | ||||
Стадия | Стадия 1 | Стадия 2 | Стадия 3 | Стадия 4 |
PEC-01, полученные из hESC CyT49 | Wnt3A, AA, ITS; RPMI1640 | FGF7, инг. IV TGF-бета, ITS; RPMI1640 | TTNPB, KAAD-циклопамин, Ноггин, B27, ITS; DMEM/высокая конц. глюкозы | EGF, FGF7, Ноггин, B27; DMEM/высокая конц. глюкозы |
Клетки, полученные из H1 (пример 3) | MCX, GDF8; MCDB131 | FGF7; MCDB131 | FGF7, SANT, TPPB, LDN, RA, ITSX; BLAR001 | FGF7, SANT, TPPB, LDN, RA, ITSX; BLAR001 |
Новые клетки, полученные из hESC CyT49 (пример 6) | Wnt3A, AA, ITSX; MCDB131 | FGF7; MCDB131 | FGF7, SANT, TPPB, RA, ITSX; BLAR001 | FGF7, SANT, TPPB, RA, ITSX; BLAR001 |
[0214] Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток CyT49 (CyT49-hESC; регистрация NIH 0041) при пассаже 27 рабочего клеточного банка 4A (WCB4A) засевали в виде отдельных клеток с плотностью 0,033×106 клеток/см2 на обработанные тканевой культурой чашки Петри в модифицированную по способу Дульбекко среду для выращивания Игла со смесью питательных веществ F-12, содержащую GlutaMAX™ в разведении 1: 100Х (DMEM-F12; Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США, № по каталогу 10565), добавку XenoFree (XF) Knockout Serum Replacement (KSR; Life Technologies, № по каталогу 12618) в разведении 1: 10 («концентрация 10%»), среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1: 100 («концентрация 1X») пенициллин-стрептомицин в разведении 1: 100 («концентрация 1X»), 10 нг/мл человеческого активина A (R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота, США, № по каталогу 338-AC) и 10 нг/мл человеческого херегулина-бета (PeproTech, г. Роки-Хилл, штат Нью-Джерси, США № по каталогу 100-03). Человеческий сывороточный альбумин в разведении 1: 10 («концентрация 10%»; Valley Biomedical, г. Винчестер, штат Вирджиния, № по каталогу HP-1022) использовали только в течение первых 24 часов после посева. Через девяносто шесть часов после посева сливающиеся культуры hESC CyT49 пересевали в упомянутую выше среду для выращивания. В альтернативном варианте осуществления сливающиеся hESC CyT49 высвобождали в виде суспензии отдельных клеток путем обработки Accumax (Innovative Cell Technologies, г. Сан-Диего, штат Калифорния, № по каталогу AM105) (3 минуты при 37 °C) и агрегировали со скоростью 31 об./мин и при концентрации один миллион клеток на мл в роллерных флаконах (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк, США, № по каталогу CLS431644) в среде DMEM-F12, содержащей GlutaMAX в разведении 1: 100X (Life Technologies, № по каталогу 10565), пенициллин-стрептомицин в концентрации 1Х, добавку StemPro® в разведении 1: 50 (Life Technologies, № по каталогу ME130070L1), 10 нг/мл человеческого активина А, 10 нг/мл человеческого херегулина-бета 1 и 200 нг/мл LR3-IGF1 (Cell Sciences, г. Ньюберипорт, штат Массачусетс, США, № по каталогу LRM001).
[0215] Для ФИГ. 9A-9Q культуры дифференцировали с использованием следующего протокола (показан на Фиг. 9A) в форме суспензионной культуры. На стадиях от 1 до 4 протокола суспензионные культуры находились в 2-литровых роллерных флаконах (RB) при 31 об./мин, вертикальных вращающихся биореакторах 0,1 PBS Mini или 0,5 PBS Mini MagLift™ (PBSBiotech, г. Камарильо, штат Калифорния, США) при 45 об./мин. «0,1PBS» относится к вертикальному вращающемуся биореактору Mini MagLift™ объемом 100 мл, а «0,5PBS» относится к вертикальному вращающемуся биореактору Mini MagLift™ объемом 500 мл. Агрегаты hESC CyT49 помещали в концентрации приблизительно 0,18-0,36 миллиона клеток на мл в среду объемом 500 мл в 2-литровом роллерном флаконе, среду объемом 100 мл биореактора 0,1 PBS Mini или среду объемом 500 мл биореактора 0,5 PBS Mini.Среду для культивирования клеток меняли ежедневно.
а. Стадия 1 (2 дня). Недифференцированные агрегаты ES культивировали в течение одного дня в следующей среде стадии 1: среда MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1X), 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл человеческого активина А, 50 нг/мл мышиного Wnt3A (R and D Systems, № по каталогу 1324-WN) и ITS-X (инсулин-трансферрин-селен-этаноламин; ThermoFisher Scientific, г. Уолтем, штат Массачусетс, США, № по каталогу 51500056) в разведении 1: 10 000. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл человеческого активина А и ITS-X в разведении 1: 10 000.
b. Стадия 2 (3 дня). Агрегаты обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили 0,5% FAF-BSA, GlutaMAX™ в концентрации 1Х, 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл фактора 7 роста фибробластов (FGF7; PeproTech, № по каталогу AF-100-19).
c. Стадия 3 (2 дня). Агрегаты обрабатывали в течение двух дней специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 0,25% FAF-BSA; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мкМ SANT-1 (N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)-1-пиперазинамин); 1 мкM ретиноевой кислоты (RA); 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 300 нМ активатора PKC ((2S, 5S-(E,E)-8-(5-(4-трифторметил)фенил-2,4,-пентадиеноиламино)бензолактам (TPB); в течение двух дней.
d. Стадия 4 (3 дня). Агрегаты обрабатывали специализированной средой BLAR001, которая содержит 3,6 г/1000 мл бикарбоната натрия и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ D-глюкозы для получения концентрации 10 мМ D-глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 0,25% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 300 нM TPB в течение трех дней.
В патентах США № 8,445,273; 8,895,300, полностью включенных в настоящий документ путем ссылки, описаны PEC-01 («панкреатическая энтодермальная клетка - 01») д15, полученные с использованием по меньшей мере протокола, описанного ниже. Агрегаты CyT49 hESC вносили в объеме гранул агрегата (APV) от 1,0 мкл до 2,0 мкл на мл. Стадии от 1 до 4 приведенного ниже протокола поддерживали в виде суспензионных культур в 2-литровых роллерных флаконах в объеме 500 мл при вращении со скоростью 31 об./мин.
а. Стадия 1 (2 дня; д1-д2). Недифференцированные агрегаты ES обрабатывали в течение одного дня средой RPMI1640 (Life Technologies, № по каталогу 21870-076), в которую добавили GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 0,2%-ю эмбриональную бычью сыворотку (FBS; HyClone, г. Логан, штат Юта, США, № по каталогу SH30070.03); пенициллин-стрептомицин в концентрации 1X; в разведении 1: 5000 ITS (Invitrogen, г. Уолтем, штат Массачусетс, США, № по каталогу 41400); 100 нг/мл активина A; и 50 нг/мл Wnt3A. Впоследствии клетки культивировали в течение дополнительного дня в среде RPMI1640, в которую добавили GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 0,2%-ю эмбриональную бычью сыворотку; пенициллин-стрептомицин в концентрации 1X; ITS в разведении 1: 5000; 100 нг/мл активина A; и 50 нг/мл Wnt3A.
b. Стадия 2 (3 дня; д3-д5). Агрегаты обрабатывали в течение одного дня средой RPMI1640, в которую добавили GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 0,2%-ю эмбриональную бычью сыворотку; пенициллин-стрептомицин в концентрации 1X; ITS в разведении 1: 1000; 25 нг/мл человеческого FGF7; и 2,5 мкМ ингибитора IV трансформирующего фактора роста бета (TGF-β; EMD Bioscience, г. Биллерика, штат Массачусетс, № по каталогу 616454). Впоследствии клетки культивировали в течение двух дополнительных дней в среде RPMI1640, в которую добавили GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 0,2%-ю эмбриональную бычью сыворотку; пенициллин-стрептомицин в концентрации 1X; ITS в разведении 1: 1000; и 25 нг/мл человеческого FGF7.
c. Стадия 3 (3 дня; д6-д8). Агрегаты обрабатывали в течение трех дней средой DMEM с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen, № по каталогу 11960-051), в которую добавили добавку B-27 в разведении 1: 50 (Invitrogen, № по каталогу 17504-044); пенициллин-стрептомицин в концентрации 1X; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; ITS в разведении 1: 1000; 3 нМ TTNPB («4-[(E)-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил]бензоевая кислота»; «Sigma-Aldrich», Сент-Луис, штат Миссури, США, № по каталогу T3757); 0,25 мкМ KAAD-циклопамина («3-кето-N-аминоэтил-N'-аминокапроилдигидроциннамоил циклопамин»; Toronto Research Chemicals, г. Норт-Йорк, Канада, № по каталогу K171000); и 50 нг/мл человеческого Ноггина (R and D Systems, № по каталогу 3344-NG).
d. Стадия 4 (3 дня; д9-д12; д12 называется «PEC-01 д12»). Агрегаты обрабатывали в течение трех дней средой DMEM с высоким содержанием глюкозы, в которую добавили добавку B-27 в разведении 1: 50; пенициллин-стрептомицин в концентрации 1X; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 50 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста (EGF; PeproTech, № по каталогу AF-100-15); 50 нг/мл FGF7; и 50 нг/мл человеческого Ноггина.
e. Криоконсервация в д12. Агрегаты ресуспендировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, в которую добавили GlutaMAX™ в концентрации 1Х; концентрация 15% DMSO («диметилсульфоксид»; Origen Biomedical, г. Остин, штат Техас, США, № по каталогу CP-10); концентрация 60% KSR, не содержащей XF; и 25 мМ буферного раствора HEPES («N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота»; (ThermoFisher Scientific, № по каталогу 15630080). Агрегаты д12 криоконсервировали в программируемом криозамораживателе (CRF; Planer PLC, Шеппертон Санбери-на-Темзе, Великобритания, № по каталогу Kryo 560-16) с использованием следующего протокола: (1) начальная температура -2,0 °C; (2) от -2,0 °C/мин до -9,0 °C; (3) при -9,0°C в течение 10 минут и инициирование замораживания вручную; (4) от -0,2 °C/мин до 40 °C; (5) от -25 °C/мин до -150 °C; (6) перенос в жидкий азот для хранения.
f. После криоконсервации до PEC-01 (3 дня; д13-д15). Агрегаты обрабатывали в течение трех дней средой DMEM с высоким содержанием глюкозы, в которую добавили добавку B-27 в разведении 1: 50; пенициллин-стрептомицин в концентрации 1X; GlutaMAX™ в концентрации 1Х; 50 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста (EGF; PeproTech, № по каталогу AF-100-15); 50 нг/мл FGF7; и 50 нг/мл человеческого Ноггина. В первый день в среду добавляли только 10Ед/мл ДНКазы I (Roche, г. Базель, Швейцария, № по каталогу 04536282001).
[0216] Определение характеристик дифференцированных клеток. Для количественного анализа генной экспрессии с помощью способов с применением суспензионной культуры в 2-литровом роллерном флаконе, 0,1 PBS или 0,5 PBS, CyT49-hESC, агрегаты дня 3 стадии 4 (S4D3) и PEC-01 д15 собирали, как описано в Nature Biotechnology, 2014, (32) 11, 1121-1133. Экспрессию генов оценивали с использованием специально изготовленных матриц Taqman Arrays (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния, США). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Sequence Detection (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния, США) и нормализовали, используя GAPDH в качестве конститутивного гена недифференцированных клеток CyT49-hESC, применяя метод ΔΔCt. Информация о праймерах представлена в таблице XV.
Таблица XV. Перечень праймеров кПЦР-РВ | ||
Ген | ИД анализа | |
1 | PTF1A | Hs00603586_g1 |
2 | CDX2 | Hs00230919_m1 |
3 | SOX2 | Hs01053049_s1 |
4 | NKX6.1 | Hs00232355_m1 |
5 | PDX1 | Hs00236830_m1 |
6 | NEUROD1 | Hs00159598_m1 |
7 | CHGA | Hs00154441_m1 |
8 | GAPDH | Hs99999905_m1 |
[0217] Для количественного анализа колокализации белков с помощью способов с применением суспензионной культуры в 2-литровом роллерном флаконе, 0,1 PBS или 0,5 PBS, CyT49-hESC, агрегаты дня 3 стадии 4 (S4D3) и PEC-01 д15 собирали и анализировали посредством проточной цитометрии с активацией флуоресценции (FACS). Окрашивание в анализе FACS проводили, как описано в Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133, и использовали антитела, перечисленные в таблице XVI. Дифференцированные клетки инкубировали в Accumax (Innovative Cell Technologies, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США, № по каталогу AM105) в течение 20 минут при комнатной температуре, высвобождали в суспензию отдельных клеток, после чего их дважды промывали буферным раствором autoMACS Running Buffer (г. Бергиш, Германия, Miltenyl Biotec, № по каталогу 120-091-221), фиксированным в 4% параформальдегиде (4% PFA; Sigma Aldrich, № по каталогу 158127) в течение 30 минут при комнатной температуре с последующими двумя промывками в буферном растворе autoMACS Running Buffer. Впоследствии клетки инкубировали с соответствующими антителами (таблица XVI) перед анализом на приборе BD FACS Canto II с применением программного обеспечения BD FACS Diva, регистрируя по меньшей мере 30 000 событий. Нежизнеспособные клетки при анализе FACS исключали и проводили дискриминирование, используя изотипические антитела («IgG»).
Таблица XVI. Список антител, используемых для анализа FACS | |||
Антиген | Вид | Источник/№ по каталогу | Разведение |
Alexa Fluor 647 анти-NKX6.1 |
Мышь | BD, № по каталогу 563338 | 1:3 |
Меченное PE анти-PDX1 | Мышь | BD, № по каталогу 562161 | 1:2 |
Меченное Alexa Fluor 405 антитело к CHGA | Мышь | Novus Biologicals, № по каталогу NBP2-33198AF405 | 1:100 |
PerCP-Cy™5,5 к SOX2 | Мышь | BD, № по каталогу 561506 | 1:2 |
Меченное PE анти-CDX2 | Мышь | BD, № по каталогу 563428 | 1:4 |
[0218] Для количественного анализа выходов клеток с помощью способов с применением суспензионной культуры в 2-литровом роллерном флаконе, 0,1 PBS или 0,5 PBS CyT49-hESC и агрегаты дня 3 стадии 4 (S4D3) собирали и подсчитывали на приборе Nucleocounter® NC-100 (Chemometec, Аллерод, Дания, № по каталогу NC-100).
[0219] На ФИГ. 9A показано, как дифференцировали CyT49 hESC до панкреатической энтодермы (например, S4D3) с использованием нового протокола. PEC-01 д12 и PEC-01 д15 приводят в настоящем документе в качестве примеров предшествующего уровня техники. Способы с применением суспензионной культуры использовали на основании их совместимости с промышленной генерацией инсулинпродуцирующих клеток посредством применения панкреатической энтодермы в качестве промежуточного материала, а именно использовали 2-литровый роллерный флакон, вертикальные вращающиеся биореакторы 0,1 PBS или 0,5 PBS. Хотя способ с 2-литровым роллерным флаконом можно использовать для горизонтального масштабирования получения панкреатических энтодермальных клеток, он не является идеальным для возможного промышленного производства инсулинпродуцирующих клеток. Система вертикального вращающегося биореактора PBS Biotech MagLift™ представляет собой альтернативную систему вертикального масштабирования, которая может обеспечивать возможность постепенного улучшения продукции инсулинпродуцирующих клеток с одновременным увеличением объема и сохранением малого/компактного размера агрегатов с течением времени. На ФИГ. 9B показано, что, как ожидалось, выходы клеток в S4D3 показывали значительное увеличение числа клеток по отношению к внесенным hESC. Отношение клеток S4D3 к внесенным hESC было схожим при всех способах с применением суспензионной культуры при использовании нового протокола; 4,30±0,782 для 2-литрового роллерного флакона, 3,27±0,585 для 0,1PBS 4,08±0,854 для 0,5PBS и значительно увеличено по сравнению с предшествующим уровнем техники (2,23±0,090 PEC-01 д12 клеток на одну внесенную клетку hESC). Кроме того, на ФИГ. 9C мы продемонстрировали, что описанный протокол дифференцировки может быть выполнен с возможностью эффективного вертикального масштабирования с использованием системы вертикального вращающегося биореактора PBS MagLift™. При увеличении объема среды со 100 мл (0,1PBS) до 500 мл (0,5PBS) наблюдали приблизительно 6-кратное увеличение выхода S4D3 (ФИГ. 9C). Кроме того, применение формы суспензии 0,1PBS (~150±33,2 мкм) или 0,5PBS (~153±37,6 мкм) приводило к образованию одинаково меньших агрегатов S4D3 по сравнению с агрегатами в роллерном флаконе S4D3 (~274±92,5 мкм) и PEC-01 д12 (~259±55,3 мкм). Криоконсервация, размораживание и дополнительное трехдневное культивирование PEC-01 д12 были необходимы для уменьшения размера агрегатов PEC-01 до уровня, наблюдаемого для 0,1PBS и 0,5PBS (PEC-01 д15; ~191±45,4 мкм) (ФИГ. 9D-9E). Продемонстрировано, что устойчивого фенотипа панкреатической энтодермы достигали с использованием нового протокола дифференцировки клеток, полученных из CyT49 hESC, при всех способах с применением суспензионной культуры. Каждый из NKX6.1 (ФИГ. 9F), PTF1A (ФИГ. 9G), PDX1 (ФИГ. 9H) значительно индуцировали при использовании способов с 2-литровым роллерным флаконом, 0,1PBS, 0,5PBS, так же, как с PEC-01 д15. В отличие от протокола дифференцировки PEC-01 д15, который приводил к повышению экспрессии SOX2 (альтернативная линия дифференцировки энтодермы; ФИГ. 9I), NEUROD1 (ранняя эндокринная дифференцировка; ФИГ. 9K) и CHGA (ранняя эндокринная дифференцировка; ФИГ. 9L), новый протокол дифференцировки снижал экспрессию этих маркеров непанкреатической энтодермы при всех исследованных способах с применением суспензионной культуры в CyT49. В действительности такое увеличение непанкреатической энтодермы снижает эффективность продукции панкреатической энтодермы, как было оценено по уровню белка. По отношению к PEC-01 д12 (~38,0%; ФИГ. 9M), колокализацию белков между PDX1 и NKX6.1 увеличивали при всех новых способах с применением суспензионной культуры S4D3, в которых используют новый протокол дифференцировки полученных из CyT49 hESC клеток; 2-литровый роллерный флакон ~64,6% (ФИГ. 9N), 0,1PBS ~48,9% (ФИГ. 9O) и 0,5PBS ~65,3% (ФИГ. 9P). Более того, ~49% PDX1+ NKX6.1+ панкреатической энтодермы, наблюдаемой в PEC-01 д12, также экспрессировали SOX2+ (ФИГ. 9M), в отличие от всех новых способов с применением суспензионной культуры S4D3, в которых используют новый протокол дифференцировки полученных из CyT49 hESC клеток; 2-литровый роллерный флакон ~2,0% (ФИГ. 9N), 0,1PBS ~10,0% (ФИГ. 9O) и 0,5PBS ~6,2% (ФИГ. 9P). Относительно низкую процентную долю панкреатической энтодермы, наблюдаемую в PEC-01 д12, также подтверждали увеличением распространенности ранней эндокринной дифференцировки (~49,6%; ФИГ. 9M) по сравнению с новыми способами с применением суспензионной культуры S4D3; 2-литровый роллерный флакон ~26,9% (ФИГ. 9N), 0,1PBS ~26,6% (ФИГ. 9O) и 0,5PBS ~30,2% (ФИГ. 9P). Криоконсервация, размораживание и 3-дневное дополнительное культивирование клеток PEC-01 д12 были необходимы для небольшого увеличения колокализации PDX1 и NKX6.1 (PEC-01 д15; ~47,5%; ФИГ. 9Q) путем уменьшения SOX2 (~22,5%; ФИГ. 9Q) и CHGA (~42,5%; ФИГ. 9Q). Колокализация белков между NKX6.1 и CDX2 была низкой при всех исследованных условиях (ФИГ. 9M-9Q), что было отражено низкой экспрессией гена CDX2 в S4D3 во всех типах суспензионной культуры (ФИГ. 9J).
Пример 7.
Генерация инсулинпродуцирующих клеток, полученных из hESC CyT49, во множестве типов суспензионной культуры
[0220] В следующем примере показана усовершенствованная генерация панкреатических инсулинпродуцирующих клеток, полученных из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) CyT49 с использованием нового протокола дифференцировки во множестве типов суспензионной культуры (роллерный флакон, вертикальные вращающиеся биореакторы 0,1 PBS и 0,5 PBS Biotech MagLift™). В таблице XVII перечислены конкретные улучшения, примененные к полученным из hESC CyT49 инсулинпродуцирующим клеткам. Хотя новый протокол дифференцировки аналогичен по длительности с получением инсулинпродуцирующих клеток (предшествующий уровень техники - Stem Cells Transl Med, 2015 (10) 4, 1214-1222) из клеток PEC-01 или клеток, схожих с PEC-01, при этом новый протокол, использованный для продуцирования инсулин-положительных клеток из hESC CyT49, показывает увеличенную продукцию клеток, продуцирующих единственный гормон инсулин (только INS+), посредством значительного снижения полигормональных инсулинпродуцирующих клеток (и INS+, GCG+) и наличия белка PDX1, NKX6.1, CHGA, MAFA в клетках, продуцирующих единственный гормон инсулин. Отсутствие экспрессии GCG и индукция экспрессии NKX6.1, MAFA в клетках, положительных в отношении единственного гормона инсулина, является обязательным требованием для возможного приобретения функциональных возможностей, характерных для человеческих островков (примеры 2-5). Более того, новый протокол получения инсулинпродуцирующих клеток, полученных из hESC CyT49, впервые показывает способность к вертикальному масштабированию в биореакторе, что является обеспечением лучшей возможности осуществления, чем горизонтальное масштабирование с использованием роллерного флакона, возможного промышленного производства инсулинпродуцирующих клеток (пример 7).
Таблица XVII. Улучшения в генерации инсулинпродуцирующих клеток | |||
Инсулинпродуцирующие клетки, полученные из клеток, схожих с PEC-01 (CyT49) |
Клетки, полученные из hESC H1
(Пример 2-4) |
Новые клетки, полученные из hESC CyT49
(Пример 7) |
|
Продолжительность протокола | 12-21 день (стадия 7) | 17 дней (стадия 7) | 17-25 дней (стадия 7) |
Распространенность INS + клеток всех типов | ~45% | ~50% | ~50% |
Распространенность INS + GCG + клеток | Средняя; ~15% | Низкая; ~4% | Низкая; ~6,6% |
Наличие MAFA в INS + NKX6.1 + клетках? | Не оценено, но очень низкая экспрессия гена | Да | Да |
Тип | Вращающиеся 6-луночные планшеты | биореактор (настоящее описание) | Роллерный флакон, биореактор (настоящее описание) |
[0221] В таблице XVIII описаны основные изменения, примененные к протоколу дифференцировки для генерации улучшенной панкреатической энтодермы, полученной из hESC CyT49. Основные различия включают в себя малые молекулы и используемые основные среды. Аббревиатуры включают в себя: Nic - никотинамид; MG - Matrigel; GSI - ингибитор гамма-секретазы; ROCKi - Rho-ассоциированный ингибитор протеинкиназы.
Таблица VIII. Протокол дифференцировки клеток hESC в инсулинпродуцирующие клетки | |||
Стадия | Стадия 5 | Стадия 6 | Стадия 7 |
Полученные из PEC-01 инсулинпродуцирующие клетки (CyT49) (Stem Cell Trans Med, 2015) | Ноггин, KGF, EGF, GSI, ROCKi, B-27; DMEM/высокая конц. глюкозы | Nic, ROCKi, B-27; CMRL1066 | Nic, MG, ROCKi, T3, Nic, B-27; CMRL1066 |
Клетки, полученные из hESC H1
(Пример 2-4) |
SANT, RA, LDN, инг. ALK5, T3, гепарин; BLAR001 | LDN, инг. ALK5, T3, XX, гепарин; BLAR001 | T3, гепарин, NAC, состав I; BLAR001 |
Новые клетки, полученные из hESC CyT49
(Пример 7) |
SANT, RA, LDN, инг. ALK5, T3, гепарин; BLAR001 | LDN, инг. ALK5, T3, XX, гепарин; BLAR001 | T3, гепарин, NAC, состав I; BLAR001 |
[0222] Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток CyT49 (CyT49-hESC; регистрация NIH 0041) при пассаже 27 рабочего клеточного банка клеток 4A (WCB4A) засевали и сохраняли, как описано в примере 6. Кроме того, агрегацию и дифференцировку hESC CyT49 на стадиях 1-4 выполняли, как описано в примере 6.
[0223] Для ФИГ. 10A-10AB культуры дополнительно дифференцировали в течение стадий 5-7 с использованием следующего протокола (показан на Фиг. 10A) в форме суспензионной культуры. На стадиях от 5 до 7 протокола суспензионные культуры поддерживали роллерных флаконах (RB) при 31 об./мин, вертикальных вращающихся биореакторах 0,1 PBS Mini или 0,5 PBS Mini MagLift™ при 45 об./мин. «0,1PBS» относится к вертикальному вращающемуся биореактору Mini MagLift™ объемом 100 мл, а «0,5PBS» относится к вертикальному вращающемуся биореактору Mini MagLift™ объемом 500 мл. Следует отметить, что протокол дифференцировки стадии 7 называется основной обработкой, так как коктейль для индуцирования функциональных возможностей, характерных для инсулинпродуцирующих клеток, не включен в настоящий документ и является предметом другого изобретения. В течение стадий 5-6 среду меняли ежедневно, а на стадии 7 среду меняли через день.
а. Стадия 5 (3 дня). Полученные из CyT49 S4D3 (пример 6 - новый протокол получения из клеток hESC CyT49) или PEC-01 д15 агрегаты обрабатывали средой BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия, в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 0,25 мкM SANT-1; 50 нM RA; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; и 10 мкМ ингибитора II ALK5.
b. Стадия 6 (7 дней). Агрегаты обрабатывали в специализированной среде BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия, в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 14,5 мМ D-глюкозы для достижения конечной концентрации 20 мМ D-глюкозы; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H); 10 мкМ ZnSO4; 100 нМ LDN-HCl; 1 мкМ T3; 10 мкМ ингибитора II ALK5 и 100 нМ ингибитора XX гамма-секретазы. Агрегаты S5D3 в суспензионной культуре 0,5 PBS переносили в суспензионную культуру 0,1 PBS для выполнения стадий 6-7.
c. Стадия 7 (от 7 до 23 дней). Агрегаты обрабатывали в специализированной среде BLAR001, которая содержит 2,7 г/1000 мл бикарбоната натрия, и в которую добавили ITS-X в разведении 1: 200; 1X GlutaMAX™; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина (H), 10 нМ T3 (низкий T3); 1 мМ NAC); и следующие компоненты, которые входят в состав I (FI) - среда RPMI с витаминной добавкой в разведении 1: 200; среда MEM с добавлением заменимых аминокислот в разведении 1: 200; концентрат липидов с определенным химическим составом в разведении 1: 2000; пируват натрия в разведении 1: 200; следовые элементы А в разведении 1: 2000; следовые элементы В в разведении 1: 2000.
[0224] Определение характеристик дифференцированных клеток. Для количественного анализа генной экспрессии с помощью способов с применением суспензионной культуры в роллерном флаконе, 0,1 PBS или 0,5 PBS, CyT49-hESC, агрегаты дня 3 стадии 4 (S4D3), дня 3 стадии 5 (S5D3), дня 7 стадии 6 (S6D7) и дня 7 стадии 7 (S7D7) собирали, как описано в Nature Biotechnology, 2014, (32) 11, 1121-1133 и примере 1. Информация о праймерах представлена в таблице XIX.
Таблица XIX. Перечень праймеров кПЦР-РВ | ||
Ген | ИД анализа | |
1 | NGN3 | Hs00360700_g1 |
2 | ИНСУЛИН | Hs00355773_m1 |
3 | MAFA | Hs01651425_s1 |
4 | NKX6.1 | Hs00232355_m1 |
5 | PDX1 | Hs00236830_m1 |
6 | NEUROD1 | Hs00159598_m1 |
7 | CHGA | Hs00154441_m1 |
8 | GAPDH | Hs99999905_m1 |
[0225] Для количественного анализа колокализации белков с помощью способов с применением суспензионной культуры в роллерном флаконе, 0,1 PBS или 0,5 PBS, CyT49-hESC, агрегаты дня 3 стадии 5 (S5D3), дня 7 стадии 5 (S6D7), дня 13 стадии 7 (S7D13) и дня 7 стадии 14 (S7D14) собирали и анализировали посредством проточной цитометрии с активацией флуоресценции (FACS), как описано в примере 1. Список антител, используемых в анализе FACS, приведен в таблице XX.
Таблица XX. Список антител, используемых для анализа FACS | |||
Антиген | Вид | Источник/№ по каталогу | Разведение |
Alexa Fluor 647 анти-NKX6.1 |
Мышь | BD, № по каталогу 563338 | 1: 3 |
Антитела к PAX4 (неконъюгированные) | Коза | R and D Systems, № по каталогу AF2614 | 1: 40 |
Меченное Alexa Fluor 405 антитело к CHGA | Мышь | Novus Biologicals, № по каталогу NBP2-33198AF405 | 1: 100 |
Меченное Alexa Fluor 488 антитело к ИНСУЛИНУ | Мышь | Novus Biologicals, № по каталогу NBP2-34738AF488 | 1: 10 |
Антитела BV421 к ГЛЮКАГОНУ | Мышь | BD, № по каталогу 565891 | 1: 10 |
Меченное Alexa Fluor 488 антитело к козьим IgG | Коза | Jackson Laboratories, № по каталогу 705-546-147 | 1: 400 |
[0226] Для количественного анализа выходов клеток с помощью способов с применением суспензионной культуры в роллерном флаконе, 0,1 PBS или 0,5 PBS CyT49-hESC и агрегаты дня 7 стадии 6 (S6D7) собирали и подсчитывали на приборе Nucleocounter® NC-100 (Chemometec, Аллерод, Дания, № по каталогу NC-100).
[0227] Для количественного анализа колокализации белков с помощью способов с применением суспензионной культуры в роллерном флаконе, 0,1 PBS или 0,5 PBS, агрегаты дня 7 стадии 6 (S6D7), дня 16 стадии 7 (S7D16) и дня 23 стадии 7 (S7D23) собирали и анализировали посредством иммунофлуоресценции (IF). Полученные из CyT49-hESC агрегаты получали, как описано в публикации Nature Biotechnology, 2014, (32) 11, 1121-1133 и в предыдущих примерах, и с использованием антител, перечисленных в таблице XXI настоящего документа.
Таблица XXI. Список антител, используемых для анализа IF | |||
Антиген | Вид | Источник | Разведение |
ИНСУЛИН | Мышь | Cell Signaling (№ по каталогу 8138BF). |
1: 250 |
MAFA | Кролик | Life Span Biosciences (№ по каталогу LP9872). |
1: 100 (Извлечение антигена) |
СИНАПТОФИЗИН | Кролик | Novus Biologicals (№ по каталогу NB120-16659). |
1: 50 |
NKX6.1 | Кролик | Life Span Biosciences (№ по каталогу LP9878). |
1: 1000 |
[0228] На ФИГ. 10A показан новый протокол, используемый для дифференцировки полученных из S4D3 CyT49 hESC на стадиях 5-7 до инсулинпродуцирующих клеток. В частности, инсулинпродуцирующие клетки, полученные способами настоящего изобретения, показывали совместную экспрессию и наличие белков PDX1, NKX6.1, CHGA, ИНСУЛИНА и MAFA, но не ГЛЮКАГОНА. На ФИГ. 10B показано, что выходы клеток в S6D7 были приблизительно равными изначально внесенным количествам hESC для способов с применением суспензионной культуры в 2-литровом роллерном флаконе (RB) (отношение S6D7 к внесенным hESC 0,95±0,31) и 0,1 PBS (отношение S6D7 к внесенным hESC 0,92±0,23). Удивительно, что культивирование в суспензионной культуре с использованием 0,5 PBS показывало наибольшие клеточные выходы в S6D7; из одной внесенной клетки hESC получали 2,4±0,169 клеток S6D7. Более того, было продемонстрировано (см. ФИГ. 10C), что протокол дифференцировки на стадиях 5-7 может быть выполнен с возможностью эффективного вертикального масштабирования с использованием системы вертикального вращающегося биореактора MagLift™. При увеличении объема среды со 100 мл (0,1 PBS) до 500 мл (0,5 PBS) наблюдали приблизительно 7,5-кратное увеличение выхода S6D7 (ФИГ. 10C). Кроме того, использование суспензии типа 0,1 PBS или 0,5 PBS приводило к получению одинаково меньших агрегатов S5D3 (ФИГ. 10D), S6D7 (ФИГ. 10E) и S7D13-S7D14 (ФИГ. 10F) по сравнению с агрегатами, основанными на 2-литровых роллерных флаконах. Если говорить кратко, агрегаты S6D7 культивировали в суспензионной культуре согласно описанному протоколу с использованием роллерных флаконов, имевших следующие диаметры; RB ~265±79,0 мкм (ФИГ. 10E слева), 0,1PBS ~190±59,9 мкм (ФИГ. 10E посередине) и 0,5PBS ~227±59,0 мкм (ФИГ. 10E справа). Кроме того, использование вертикальных вращающихся биореакторов PBS Mini MagLift™ позволяло поддерживать малый размер агрегатов и архитектуру в течение S7D14 (ФИГ. 10F), требуемые для обеспечения функциональных возможностей, характерных для человеческих островков (пример 7). С другой стороны, агрегаты S7D13 в суспензии в 2-литровом роллерном флаконе в конечном счете теряли свою агрегированную архитектуру и образовывали разъединенные клеточные листы (ФИГ. 10F). Показано, что способы получения суспензионных культур с использованием нового протокола индуцировали появление устойчивой генной сигнатуры в панкреатической инсулинпродуцирующей клетке; RB, 0,1 PBS и 0,5 PBS индуцируют сохранение/увеличение экспрессии факторов транскрипции бета-клеток PDX1 (ФИГ. 10G), NKX6.1 (ФИГ. 10H); эндокринных маркеров/факторов транскрипции CHGA (ФИГ. 10I), NEUROD1 (ФИГ. 10J), NGN3 (ФИГ. 10K); бета-клеточного гормона ИНСУЛИНА (ФИГ. 10L); и фактора транскрипции раннего созревания бета-клеток MAFA (ФИГ. 10M). С другой стороны, при дифференцировке агрегатов PEC-01 д15 в инсулинпродуцирующие клетки с использованием нового протокола дифференцировки в 2-литровых роллерных флаконах («полученные из PEC-01») наблюдали значительную индукцию совместной экспрессии ГЛЮКАГОНА и ИНСУЛИНА (ФИГ. 10L, 10N). В действительности анализ наличия белка показал, что, как описано ранее в Nature Biotechnology, 2014, (32) 11, 1121-1133, новый протокол дифференцировки индуцировал образование устойчивых панкреатических эндокринных клеток-предшественников (стадия 5), приводящих к получению клеток, продуцирующих единственный гормон инсулин (стадии 6-7) в линии hESC CyT49. На ФИГ. 10O показано, что к S5D3 приблизительно 54,1% агрегатов, культивированных в 0,5PBS, были CHGA+ NKX6.1+ (увеличение с ~1% CHGA+ NKX6.1+ в S4D3 для всех типов суспензии; ФИГ. 9N-9P) в результате эндокринной дифференцировки с высокой скоростью, подтверждаемой увеличением PAX4+ CHGA+ клеток в S5D3. PAX4 представляет собой ген, являющийся прямой мишенью для NGN3 (индуктор эндокринной дифференцировки в поджелудочной железе). К S7D13-S7D14 общее число NKX6.1+ ИНСУЛИН+ клеток значительно увеличилось во всех типах суспензии; с приблизительно 15,4% в S5D3 (ФИГ. 10P) до ~40,3% в RB в S6D7 (ФИГ. 10Q); ~44,7% в 0,1PBS в S6D7 (ФИГ. 10R); ~51,8% в RB в S7D13 (ФИГ. 10S); и ~48,9% в 0,1PBS в S7D14 (ФИГ. 10T). Аналогичным образом к S7D13-S7D13 увеличили процентную долю NKX6.1+ CHGA+ клеток с ~1% в S4D3 (ФИГ. 9N-9P) до ~81,0% в RB в S6D7 (ФИГ. 10Q); ~88,7% в 0,1PBS в S6D7 (ФИГ. 10R); ~79,6% в RB в S7D13 (ФИГ. 10S); и ~80,9% в 0,1PBS в S7D14 (ФИГ. 10T). Показано, что большинство NKX6.1+ ИНСУЛИН+ клеток, полученных с помощью нового протокола на стадии 7, были моногормональными и не продуцировали альфа-клеточный гормон ГЛЮКАГОН; ~18,8% ИНСУЛИН+ ГЛЮКАГОН+ в RB в S6D7 (ФИГ. 10Q); ~14,4% в 0,1PBS в S6D7 (ФИГ. 10R); ~7,7% в RB в S7D13 (ФИГ. 10S); и ~6,5% в 0,1PBS в S7D14 (ФИГ. 10T). Более того, продемонстрировано, что полигормональные клетки составляли только малую долю от общего числа клеток стадии 7 (ФИГ. 10S-10T), и, вероятно, происходили из популяции CHGA+ NKX6.1-, в которой число полученных из CyT49 клеток S4D3 по существу больше, чем число полученных из H1 клеток S4D3 (пример 3). Удивительно, что полученные из PEC-01 агрегаты в 2-литровых роллерных флаконах в S6D7 показывали колокализацию между ИНСУЛИНОМ и ГЛЮКАГОНОМ, равную ~41,9%. Во всех исследованных условиях клетки ГЛЮКАГОН+ ИНСУЛИН+ не были NKX6.1+, как показано для полученных из PEC-01 агрегатов в 2-литровом роллерном флаконе в S6D7 и полученных из S4D3 по новому протоколу 0,1PBS в S7D14, 2-литровом роллерном флаконе в S7D13 (ФИГ. 10V). Устойчивая индукция инсулинпродуцирующих эндокринных клеток была подтверждена иммунофлуоресцентным анализом (IF-анализом). Агрегаты, культивированные в RB или 0,1 PBS, показали значительное увеличение числа СИНАПТОФИЗИН+ NKX6.1+ ИНСУЛИН+ клеток в S6D7 (0,1 PBS - ФИГ. 10W) и S7D16-D23 (RB - ФИГ. 10AA; 0,1 PBS - ФИГ. 10Y). Более того, фактор транскрипции раннего созревания MAFA уже индуцировали в 0,1 PBS в S6D7 (ФИГ. 10X), и он начал совместно экспрессироваться в ИНСУЛИН-положительных клетках на стадии 7 в RB в S7D23 (ФИГ. 10AB) и 0,1 PBS в S7D16 (ФИГ. 10Z).
[0229] Хотя изобретение было описано и проиллюстрировано ссылками на различные конкретные материалы, процедуры и примеры, следует понимать, что изобретение не ограничивают конкретными комбинациями материалов и процедур, выбранными для этой цели. Многочисленные изменения, касающиеся таких деталей изобретения, будут очевидными для специалистов в данной области. Подразумевается, что все описания и примеры представлены только в качестве иллюстрации и находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения, что отражено в нижеприведенной формуле изобретения. Все ссылки, патенты и заявки на патенты, приведенные в этой заявке, полностью включены в этот документ путем ссылки.
Claims (64)
1. Способ доведения незрелой панкреатической бета-клетки до зрелой панкреатической бета-клетки, экспрессирующей PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1, включающий:
культивирование незрелой панкреатической бета-клетки в среде, в которую добавили одно или более из UNC0638, UNC0642, UNC0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI994 или MC1568, в результате которого незрелая панкреатическая бета-клетка переходит в зрелую панкреатическую бета-клетку.
2. Способ по п. 1, где в среду дополнительно добавляют i) гепарин, ii) N-ацетилцистеин и iii) один или более из T3, T4 и их аналога.
3. Способ по п. 1, где среда не содержит ингибитор ALK5.
4. Способ по п. 1, где в среду дополнительно добавляют ингибитор ALK5.
5. Способ по п. 1, где в среду добавляют
i) ZM447439;
ii) гепарин;
iii) N-ацетилцистеин; и
iv) одно или более из T3, T4 и их аналога;
и где среда не содержит ингибитор ALK5.
6. Способ по п. 5, где в среду добавляют T3.
7. Способ по п. 6, где в среду добавляют AZT.
8. Способ по п. 7, где в среду добавляют DEZA.
9. Способ по п. 1, где незрелую бета-клетку получают посредством поэтапной дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы, клеток первичной кишечной трубки, клеток энтодермы передней кишки, панкреатических энтодермальных клеток или панкреатических эндокринных клеток-предшественников.
10. Способ по п. 1, где способ включает культивирование незрелой панкреатической бета-клетки на поверхности раздела воздух-жидкость.
11. Способ по п. 1, где способ включает культивирование незрелой панкреатической бета-клетки в скоплениях в суспензии.
12. Способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в зрелые бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A, включающий:
a) дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы;
b) дифференцировку клеток дефинитивной энтодермы со стадии a) в клетки первичной кишечной трубки;
c) дифференцировку клеток первичной кишечной трубки со стадии b) в клетки энтодермы передней кишки;
d) дифференцировку клеток энтодермы передней кишки со стадии c) в панкреатические энтодермальные клетки;
e) дифференцировку панкреатических энтодермальных клеток со стадии d) в панкреатические эндокринные клетки-предшественники;
f) дифференцировку панкреатических эндокринных клеток-предшественников со стадии e) в незрелые бета-клетки; и
g) культивирование незрелых бета-клеток со стадии f) в среде, в которую добавили одно или более из UNC0638, UNC0642, UNC0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI994 или MC1568 для доведения незрелых бета-клеток до зрелых бета-клеток, экспрессирующих PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1.
13. Способ по п. 12, где зрелые бета-клетки показывают глюкозозависимое митохондриальное дыхание.
14. Способ по п. 12, где зрелые бета-клетки показывают стимулированную глюкозой секрецию инсулина.
15. Способ по п. 12, где зрелые бета-клетки секретируют инсулин во множестве фаз.
16. Способ по п. 12, где в среду дополнительно добавляют:
i) гепарин;
ii) N-ацетилцистеин; и
iii) одно или более из T3, T4 и их аналога.
17. Способ по п. 12, где среда не содержит ингибитор ALK5.
18. Способ по п. 12, где в среду дополнительно добавляют T3.
19. Способ по п. 12, где в среду добавляют
i) ZM447439;
ii) гепарин;
iii) N-ацетилцистеин; и
iv) одно или более из T3, T4 и их аналога, и
где среда не содержит ингибитор ALK5.
20. Способ по п. 19, где в среду добавляют T3.
21. Способ по п. 20, где в среду дополнительно добавляют AZT.
22. Способ по п. 21, где в среду дополнительно добавляют DEZA.
23. Способ по п. 12, где способ включает культивирование незрелых бета-клеток на поверхности раздела воздух-жидкость.
24. Способ по п. 12, где способ включает культивирование незрелых бета-клеток в скоплениях в суспензии.
25. Способ по п. 12, где стадия a) включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, в которую добавили соединение MCX и GDF-8.
26. Способ по п. 12, где стадия b) включает дифференцировку клеток дефинитивной энтодермы в клетки первичной кишечной трубки путем культивирования клеток дефинитивной энтодермы в среде, в которую добавили FGF7 и аскорбиновую кислоту.
27. Способ по п. 12, где стадия c) включает дифференцировку клеток первичной кишечной трубки в клетки энтодермы передней кишки путем культивирования клеток первичной кишечной трубки в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
28. Способ по п. 12, где стадия d) включает дифференцировку клеток энтодермы передней кишки в панкреатические энтодермальные клетки путем культивирования клеток энтодермы передней кишки в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
29. Способ по п. 12, где стадия e) включает дифференцировку панкреатических энтодермальных клеток в панкреатические эндокринные клетки-предшественники путем культивирования панкреатических энтодермальных клеток в среде, в которую добавили SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
30. Способ по п. 29, где в среду дополнительно добавляют одно или более из T3, T4 или их аналога.
31. Способ по п. 12, где стадия f) включает культивирование панкреатических эндокринных клеток-предшественников до незрелых бета-клеток путем культивирования панкреатических эндокринных клеток-предшественников в среде, в которою добавляют i) ингибитор BMP, ii) аскорбиновую кислоту и iii) одно или более из T3, T4 и их аналога.
32. Способ по п. 31, где в среду дополнительно добавляют ингибитор ALK 5 или ингибитор гамма-секретазы.
33. Способ по п. 12, где стадия g) включает культивирование незрелых бета-клеток в среде, которая не содержит ингибитор ALK5 и в которую добавляют ZM447439, AZT, N-ацетилцистеин, DEZA, Состав I и одно или более из T3, T4 и их аналога.
34. Способ по п. 33, где зрелые бета-клетки показывают глюкозозависимое митохондриальное дыхание.
35. Способ по п. 33, где зрелые бета-клетки показывают стимулированную глюкозой секрецию инсулина.
36. Способ по п. 34, где глюкозозависимое митохондриальное дыхание имеет реакцию в виде увеличения скорости потребления кислорода после стимуляции глюкозой в диапазоне от около 20% до около 80% сверх исходной скорости потребления кислорода.
37. Способ по п. 36, где реакция в виде увеличения скорости потребления кислорода происходила через по меньшей мере 15 минут после стимуляции глюкозой.
38. Способ по п. 35, где стимулированная глюкозой секреция инсулина включает двухфазную секрецию инсулина в ответ на стимуляцию.
39. Способ по п. 38, где в первой фазе двухфазной секреции инсулина наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере четырех до по меньшей мере восьми раз по сравнению с секрецией на исходном уровне, а во второй фазе наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере двух раз до по меньшей мере четырех раз по сравнению с секрецией на исходном уровне.
40. Способ по п. 38, где секреция инсулина происходит в интервале от по меньшей мере пяти минут до по меньшей мере десяти минут после стимуляции глюкозой.
41. Способ по п. 6, где в среду добавляют T3 в количестве 1 нМ-100 нМ.
42. Способ по п. 30, где в среду добавляют T3 в количестве 1 нМ-1 мкM.
43. Способ по п. 12, где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой человеческие клетки H1 или H9.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662352968P | 2016-06-21 | 2016-06-21 | |
US62/352,968 | 2016-06-21 | ||
PCT/US2017/037373 WO2017222879A1 (en) | 2016-06-21 | 2017-06-14 | Generation of human pluripotent stem cell derived functional beta cells showing a glucose-dependent mitochondrial respiration and two-phase insulin secretion response |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019101200A RU2019101200A (ru) | 2020-07-21 |
RU2019101200A3 RU2019101200A3 (ru) | 2021-01-18 |
RU2752499C2 true RU2752499C2 (ru) | 2021-07-28 |
Family
ID=60659269
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019101200A RU2752499C2 (ru) | 2016-06-21 | 2017-06-14 | Генерация функциональных бета-клеток, полученных из человеческой плюрипотентной стволовой клетки, демонстрирующих реакцию в виде глюкозозависимого митохондриального дыхания и двухфазной секреции инсулина |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10633635B2 (ru) |
EP (2) | EP3472303B1 (ru) |
JP (3) | JP7044726B2 (ru) |
KR (4) | KR20230169395A (ru) |
CN (2) | CN116286663A (ru) |
AR (1) | AR108847A1 (ru) |
AU (2) | AU2017282638C1 (ru) |
CA (1) | CA3027879A1 (ru) |
DK (1) | DK3472303T3 (ru) |
ES (1) | ES2939233T3 (ru) |
MA (1) | MA45502A (ru) |
RU (1) | RU2752499C2 (ru) |
SG (1) | SG11201810550WA (ru) |
TW (1) | TW201809266A (ru) |
WO (1) | WO2017222879A1 (ru) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL308120A (en) | 2017-06-14 | 2023-12-01 | Vertex Pharma | Devices and methods for drug administration |
KR20200087201A (ko) * | 2017-11-15 | 2020-07-20 | 셈마 테라퓨틱스, 인크. | 섬세포 제조 조성물 및 사용 방법 |
IL308644A (en) * | 2018-03-02 | 2024-01-01 | Vertex Pharma | Methods for improving the differentiation of stem cells into beta cells |
JP7311116B2 (ja) * | 2018-04-27 | 2023-07-19 | 株式会社カネカ | 膵臓β細胞の製造方法 |
CA3099770A1 (en) * | 2018-05-07 | 2019-11-14 | President And Fellows Of Harvard College | Cell populations and gene expression associated with in vitro beta cell differentiation |
EP3790956A4 (en) * | 2018-05-11 | 2022-03-16 | Cornell University | PROCEDURE FOR DIFFERENTIATION OF HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS INTO MONOCLONAL CELLS |
EP3833365A4 (en) | 2018-08-10 | 2022-05-11 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | ISLE DIFFERENTIATION DERIVED FROM STEM CELLS |
CN114401752B (zh) | 2019-05-31 | 2023-04-04 | W.L.戈尔及同仁股份有限公司 | 具有受控氧扩散距离的细胞封装装置 |
EP3975926A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
WO2020243665A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
WO2020243663A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
AU2020306049A1 (en) * | 2019-06-25 | 2022-02-10 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Enhanced differentiation of beta cells |
EP3989967A4 (en) * | 2019-06-27 | 2023-05-24 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND METHODS OF PROTEIN DEGRADATION |
WO2021102305A1 (en) * | 2019-11-20 | 2021-05-27 | Washington University | Methods and compositions for generating functionally mature beta cells and uses thereof |
WO2021233116A1 (zh) * | 2020-05-21 | 2021-11-25 | 北京大学 | 多能干细胞的成分明确、无异源的培养系统 |
WO2022026932A2 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-03 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Differentiation of pancreatic endocrine cells |
US11578309B2 (en) | 2020-12-31 | 2023-02-14 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
US20240182864A1 (en) * | 2021-03-24 | 2024-06-06 | Salk Institute For Biological Studies | Novel chemical combinations and methods of use thereof, towards differentiation of human progenitor cells into functional beta cells |
WO2022236173A1 (en) * | 2021-05-07 | 2022-11-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Treating liver disease |
US20220403340A1 (en) * | 2021-06-11 | 2022-12-22 | Washington University | Media for cryopreserved cells and methods of making and using same |
IL311636A (en) | 2021-11-01 | 2024-05-01 | Vertex Pharma | Differentiation of stem cell-derived pancreatic islets |
CN114317401B (zh) * | 2021-12-07 | 2022-10-04 | 浙江大学 | 一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008011518A2 (en) * | 2006-07-19 | 2008-01-24 | Diakine Therapeutics, Inc. | Encapsulation system |
WO2013095953A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
RU2522001C2 (ru) * | 2008-10-31 | 2014-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
US20140329704A1 (en) * | 2013-03-28 | 2014-11-06 | President And Fellows Of Harvard College | Markers for mature beta-cells and methods of using the same |
WO2015002724A2 (en) * | 2013-06-11 | 2015-01-08 | President And Fellows Of Harvard College | SC-β CELLS AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING THE SAME |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
PL1649013T3 (pl) | 2003-06-27 | 2016-07-29 | Depuy Synthes Products Inc | Regeneracja i naprawa chrząstki i kości z wykorzystaniem komórek poporodowych |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
US8586357B2 (en) * | 2003-12-23 | 2013-11-19 | Viacyte, Inc. | Markers of definitive endoderm |
CA2549605C (en) | 2003-12-23 | 2013-05-07 | Cythera, Inc. | Definitive endoderm |
CN103356707B (zh) | 2005-03-31 | 2016-07-06 | 斯丹姆涅恩有限公司 | 制备用以治疗伤口或糖尿病性神经病引发的溃疡,或预防手术后疝形成的药物的方法 |
AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
US7807459B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-10-05 | Reneuron, Inc. | EphA4-positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
WO2008013664A2 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
CA2954431C (en) | 2007-11-27 | 2021-08-24 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
BRPI0913925A2 (pt) | 2008-06-30 | 2015-08-04 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciação de células-tronco pluripotentes |
ES2552240T3 (es) | 2008-06-30 | 2015-11-26 | Janssen Biotech, Inc. | Diferenciación de las células madre pluripotentes |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
US8895300B2 (en) | 2008-11-04 | 2014-11-25 | Viacyte, Inc. | Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof |
ES2665006T3 (es) | 2009-10-29 | 2018-04-24 | Janssen Biotech, Inc. | Células madre pluripotentes |
BR112012017761A2 (pt) | 2009-12-23 | 2015-09-15 | Centocor Ortho Biotech Inc | diferenciação das células-tronco embrionárias humanas |
NZ607608A (en) | 2010-08-09 | 2014-03-28 | Takeda Pharmaceuticals Co | Method of producing pancreatic hormone-producing cells |
MX358590B (es) * | 2012-06-08 | 2018-08-24 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas. |
CN104903440B (zh) | 2012-09-03 | 2018-04-06 | 诺和诺德股份有限公司 | 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层 |
WO2014104403A1 (en) * | 2012-12-26 | 2014-07-03 | Kyoto University | Method for Inducing Exocrine Pancreatic Cells |
CA2896750A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells |
RU2658488C2 (ru) * | 2012-12-31 | 2018-06-21 | Янссен Байотек, Инк. | Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток |
KR101942769B1 (ko) | 2012-12-31 | 2019-01-28 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
MX2016015004A (es) | 2014-05-16 | 2017-06-27 | Janssen Biotech Inc | Uso de moleculas pequeñas para mejorar la expresion de mafa en celulas endocrinas pancreaticas. |
EP3420073B1 (en) * | 2016-02-24 | 2023-11-08 | Novo Nordisk A/S | Generation of functional beta cells from human pluripotent stem cell-derived endocrine progenitors |
-
0
- MA MA045502A patent/MA45502A/fr unknown
-
2017
- 2017-06-14 CN CN202310204715.8A patent/CN116286663A/zh active Pending
- 2017-06-14 US US15/622,931 patent/US10633635B2/en active Active
- 2017-06-14 SG SG11201810550WA patent/SG11201810550WA/en unknown
- 2017-06-14 JP JP2018566957A patent/JP7044726B2/ja active Active
- 2017-06-14 CA CA3027879A patent/CA3027879A1/en active Pending
- 2017-06-14 KR KR1020237040656A patent/KR20230169395A/ko not_active Application Discontinuation
- 2017-06-14 DK DK17815945.5T patent/DK3472303T3/da active
- 2017-06-14 AU AU2017282638A patent/AU2017282638C1/en active Active
- 2017-06-14 KR KR1020227008775A patent/KR102489946B1/ko active IP Right Grant
- 2017-06-14 ES ES17815945T patent/ES2939233T3/es active Active
- 2017-06-14 RU RU2019101200A patent/RU2752499C2/ru active
- 2017-06-14 EP EP17815945.5A patent/EP3472303B1/en active Active
- 2017-06-14 KR KR1020237001597A patent/KR102607813B1/ko active IP Right Grant
- 2017-06-14 KR KR1020187037170A patent/KR102376911B1/ko active IP Right Grant
- 2017-06-14 CN CN201780038877.1A patent/CN109415693B/zh active Active
- 2017-06-14 EP EP22213072.6A patent/EP4194548A1/en active Pending
- 2017-06-14 WO PCT/US2017/037373 patent/WO2017222879A1/en unknown
- 2017-06-19 TW TW106120303A patent/TW201809266A/zh unknown
- 2017-06-21 AR ARP170101710A patent/AR108847A1/es unknown
-
2020
- 2020-03-12 US US16/817,413 patent/US11952591B2/en active Active
-
2021
- 2021-12-03 JP JP2021196949A patent/JP7429680B2/ja active Active
-
2022
- 2022-12-23 AU AU2022291632A patent/AU2022291632A1/en active Pending
-
2023
- 2023-10-05 JP JP2023173813A patent/JP2024012312A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008011518A2 (en) * | 2006-07-19 | 2008-01-24 | Diakine Therapeutics, Inc. | Encapsulation system |
RU2522001C2 (ru) * | 2008-10-31 | 2014-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
WO2013095953A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
US20140329704A1 (en) * | 2013-03-28 | 2014-11-06 | President And Fellows Of Harvard College | Markers for mature beta-cells and methods of using the same |
WO2015002724A2 (en) * | 2013-06-11 | 2015-01-08 | President And Fellows Of Harvard College | SC-β CELLS AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING THE SAME |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
PAGLIUCA FW, MELTON DA. "How to make a functional β-cell", Development, 2013, Vol. 140, pp. 2472-2483. PAGLIUCA FW et al. "Generation of functional human pancreatic β cells in vitro", Cell, 2014, Vol. 159(2), pp. 428-439. * |
PAGLIUCA FW, MELTON DA. "How to make a functional β-cell", Development, 2013, Vol. 140, pp. 2472-2483. PAGLIUCA FW et al. "Generation of functional human pancreatic β cells in vitro", Cell, 2014, Vol. 159(2), pp. 428-439. REZANIA A et al. "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells", Nat. Biotechnol., 2014, Vol. 32(11), pp. 1121-1133. * |
REZANIA A et al. "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells", Nat. Biotechnol., 2014, Vol. 32(11), pp. 1121-1133. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2752499C2 (ru) | Генерация функциональных бета-клеток, полученных из человеческой плюрипотентной стволовой клетки, демонстрирующих реакцию в виде глюкозозависимого митохондриального дыхания и двухфазной секреции инсулина | |
RU2768963C2 (ru) | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки | |
CN105073979B (zh) | 使用hb9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法 | |
KR20170002630A (ko) | 췌장 내분비 세포에서 mafa 발현을 향상시키기 위한 소분자의 용도 |