CN114317401B - 一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代的方法 - Google Patents

一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代和大量制备功能成熟的胰岛细胞及胰岛类器官的方法。该方法采用至少含有BET抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基培养胰岛前体细胞，能够使胰岛前体细胞在多次传代后保持原有特性，且由其获得的胰岛细胞及胰岛类器官也具有正常的功能。因此，本申请的方法能够大量制备质量稳定而均一的胰岛前体细胞，并进一步制备足量的胰岛细胞及胰岛类器官，可用于疾病建模、药物筛选和糖尿病的治疗，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代的方法
技术领域
本申请涉及一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代的方法，属于生物技术领域。
背景技术
糖尿病是一种全球高发慢性病，严重影响着数亿人的身体健康，消耗了大量的医疗资源。在治疗糖尿病方面，胰岛移植的前景非常广阔，但面临很多限制因素，特别是器官供体供应短缺和移植后相关免疫抑制等问题。人多能干细胞(human pluripotent stemcells,hPSCs)，包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)具有分化为人体所有细胞类型的潜能。在过去20多年里，干细胞分化技术取得了重大进展，人多能干细胞可以逐步分化成定型内胚层细胞(definitive endoderm,DE)、胰岛前体细胞(pancreatic progenitor,PP)、内分泌前体细胞(endocrine precursor,EP)和胰岛β细胞(pancreaticβ-like cell,PB)。
然而，由于在定向分化过程中经历多个中间步骤，大量制备可以用于疾病建模、药物筛选和细胞治疗的功能性胰岛细胞，仍然是一个极其耗时耗力的过程。研究人员尝试通过建立可扩增的胰岛前体细胞培养体系来解决每次以人多能干细胞为起点进行分化带来的安全性、不可控性和复杂性等难题。但是，由于人胰岛前体细胞自我更新的分子机制尚不明确，人胰岛前体细胞的体外培养及扩增充满挑战，目前仍难以获得可稳定扩增的胰岛前体细胞培养体系。
发明内容
本申请的目的是在体外获得大量的PDX1和NKX6.1双阳性的胰岛前体细胞，并努力延长和保持这种胰岛前体细胞传代的稳定性，以满足规模化制备质量稳定且均一的胰岛前体细胞，从而快速获得足量有功能的胰岛细胞及胰岛类器官的需求。因此，应用本申请的方案在对胰岛前体细胞进行扩增传代时，力求抑制和避免胰岛前体细胞进入下一步分化阶段，例如分化为内分泌前体细胞等丧失胰岛前体细胞原有特性(例如PDX1和NKX6.1双阳性)的情形发生。
为了实现上述发明目的，本申请提供一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代的方法。
第一方面，本申请提供一种促进或保持胰岛前体细胞呈现PDX1和NKX6.1双阳性的方法，或者一种抑制或避免胰岛前体细胞分化为内分泌前体细胞的方法，或者一种抑制或避免胰岛前体细胞表达NGN3、NKX2.2、和/或NEUROD1标志物的方法，所述方法包括在培养胰岛前体细胞的培养基中加入至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂。
第二方面，本申请提供一种体外制备胰岛细胞的方法，包括在后前肠内胚层细胞阶段，后前肠内胚层细胞向胰岛前体细胞过渡的阶段、和/或胰岛前体细胞阶段采用含有至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂的培养基对所述阶段的细胞进行培养。
在一种实施方式中，在胰岛前体细胞阶段，细胞在所述培养基中扩增至少传代5代，10代，15代，20代，25代，30代，35代，40代，45代，50代，55代，或60代以上。
在一种实施方式中，在胰岛前体细胞阶段之后，例如在胰岛前体细胞向内分泌前体细胞过渡的阶段、或在内分泌前体细胞阶段，不再使用含有BET抑制剂的培养基对所述阶段的细胞进行培养。
第三方面，本申请提供一种体外扩增胰岛前体细胞的方法，包括：采用包含至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂的培养基来培养胰岛前体细胞，并使所述细胞至少传代5代，10代，15代，20代，25代，30代，35代，40代，45代，50代，55代，或60代以上。
第四方面，本申请提供一种胰岛细胞及胰岛类器官或胰岛前体细胞在制备预防、诊断或治疗病症和/或疾病的药物中的用途，其特征在于，所述制备的过程包括经由权利要求2-4之一项所述的方法制备胰岛细胞及胰岛类器官的步骤，或包括实施权利要求5所述的方法；所述病症和/或疾病为糖尿病或糖尿病相关的病症和/或疾病。
第五方面，本申请提供一种筛选预防、诊断或治疗病症和/或疾病的药物的方法，其特征在于，包括：采用包含至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂的培养基大量扩增胰岛前体细胞，再将扩增后的胰岛前体细胞分化为胰岛细胞及胰岛类器官；所述病症和/或疾病为糖尿病或糖尿病相关的病症和/或疾病。
第六方面，本申请提供一种扩增胰岛前体细胞的培养基，其特征在于，所述培养基在基础培养基中添加至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂。
在一种实施方案中，扩增胰岛前体细胞的培养基的配方包含有效量的DMEM，B27，青霉素，链霉素，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)，616452(一种TGFβ抑制剂)，和I-BET151(一种BET抑制剂)。
在一种实施方案中，扩增胰岛前体细胞的培养基的配方包含97％DMEM，1X B27，1％青霉素、链霉素混合液，10ng/mL bFGF，50ng/mL EGF，10μM616452，和1μM I-BET151。
在本申请的特定方面，还提供用于治疗患有本文讨论的病症和/或疾病的受试者的方法，包括将足量的胰岛细胞及胰岛类器官植入受试者体内；在移植前，使胰岛前体细胞在含有至少一种BET抑制剂的培养基中长期传代，以扩增胰岛前体细胞群，随后将胰岛前体细胞分化为胰岛细胞及胰岛类器官。
在一种实施方式中，病症和/或疾病可选自(a)I型或II型糖尿病和相关疾病、障碍或病症(包括但不限于糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病和糖尿病性神经病)；(b)胰岛素抵抗和X综合征、肥胖症及相关疾病、障碍或病症(包括但不限于胰岛素抵抗、II型糖尿病、生殖疾病、心血管疾病、肺病、胆石和空腹诱导的胆囊炎、癌症和皮肤病)、库欣(Cushing)综合征、甲状腺机能减退、胰岛瘤、颅咽管瘤和涉及下丘脑的其它疾病；(c)充血性心力衰竭、左心室肥大、心肌梗塞(MI)后生存、冠状动脉病、动脉粥样硬化、心绞痛、血栓形成，(d)高血压，包括早期高血压、家族性脂质异常性高血压和单纯收缩期高血压(ISH)；增加的胶原蛋白形成、纤维症和高血压后重塑(联合的抗增殖效果)；受损的血管顺应性、中风；所有这些与高血压相关或不相关的疾病或病症，(e)肾衰竭，尤其是慢性肾衰竭、肾小球硬化症、肾病；(f)甲状腺机能减退；(g)有或没有高血压的内皮功能障碍，(h)高脂血症、高脂蛋白血症、高甘油三酯血症和高胆固醇血症，(i)黄斑变性、白内障、青光眼，(j)皮肤和结缔组织疾病，和(k)经皮腔内血管成形术后的再狭窄和冠状动脉搭桥手术后的再狭窄；外周血管疾病。
在一种实施方式中，受试者为人或动物。
在一种实施方式中，BET抑制剂靶向BRD2，BRD3，BRD4，和/或BRDT，例如I-BET151，(+)-JQ1，I-BET762，OXT-015，TEN-010，CPI-203，LY29002，RVX8中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述TGFβ抑制剂包含E-616452，A83-01，A77-01，SB431542，GW788388，TGFβRI-IN-2，BIBF0775，ITD1，SJN2511，D4476，LY364947，SB505124，SB525334，SD208中的一种或多种。
在一种实施方式中，胰岛前体细胞来源于胚胎干细胞、围产期干细胞，成体干细胞，诱导多能干细胞，或生物工程干细胞；优选的，来源于人诱导多能干细胞。
在一种实施方式中，基础培养基为EF6(包含EGF，bFGF和一种TGFβ抑制剂，例如616452)培养基,分化过程中的Stage 4培养基,后前肠内胚层细胞向胰岛前体细胞分化的培养基。
在一种实施方式中，BET抑制剂的浓度为10nM-10μM；优选为1μM。
在一种实施方式中，胰岛前体细胞被扩增传代8小时，24小时，48小时，72小时，96小时，120小时以上。
本申请的优点是：
1)本申请首次建立了人胰岛前体细胞长期稳定高效扩增的新型技术体系，优于以人多能干细胞为起点的技术。
2)本申请通过扩增培养获得的人胰岛前体细胞能够进一步快速高效地分化为具有生理功能的人胰岛细胞，实质性解决了大量制备具有生理功能的人胰岛细胞及胰岛类器官的技术问题，因而在细胞疗法、疾病模型、药物筛选和基础研究等方面具有广泛的应用前景。
3)该人胰岛前体细胞培养体系可以显著促进人胰岛前体细胞标志基因的表达，并且实现了在培养中快速纯化人胰岛前体细胞，将人胰岛前体细胞纯度提高至90％以上，具备很高的均一性。
附图说明
图1基础培养基扩增人胰岛前体细胞以及筛选能促进扩增的小分子。
图2 I-BET151能促进人胰岛前体细胞的扩增。
图3(+)-JQ1可以增加PDX1和NKX6.1双阳性人胰岛前体细胞的数量。
图4扩增的人胰岛前体细胞(ePP)与正常人胰岛前体细胞的特性无差别。
图5人胰岛前体细胞的特性在扩增过程中始终保持稳定。
图6不同来源的人胰岛前体细胞均可获得相似的扩增效果。
图7扩增的胰岛前体细胞仍然可以分化成为胰岛β细胞及胰岛类器官。
图8扩增的胰岛前体细胞分化的胰岛β细胞及胰岛类器官具有正常的生理功能。
图9扩增的人胰岛前体细胞分化的胰岛细胞及胰岛类器官可快速改善小鼠糖尿病。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”、“具有”或“含有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
在本申请的描述中，术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本文中提及“一种或多种”或“至少一种”表示存在该要素的至少一个；可以存在多个这样的要素，除非另有明确具体的限定。
如说明书和随附的权利要求书中所使用，除非上下文中明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。
含溴结构域和额外终端域家族蛋白(BET)是BRD蛋白家族中的第二类，包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。BET蛋白含有两个在序列上高度保守的分别处于N端和C端的BRD结构域。研究显示，BET蛋白与组蛋白的乙酰化赖氨酸结合，从而控制了C-Myc、PIM1和BCL2等促生长、抗凋亡靶基因的转录。
如本文所用，“抑制剂”是例如抑制表达或结合靶分子或蛋白质的试剂。它们可以部分或全部阻断刺激或具有蛋白酶抑制剂活性。它们可以减少、降低、防止或延迟激活，包括所描述的靶蛋白活性的失活、脱敏或下调。调节剂可以是靶分子或蛋白质的拮抗剂。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指任何动物，例如家养动物、动物园动物或人。“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，示例性非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、羊、猪、马、牛和非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴和猿)。
本文以端点述及的数值范围包括包含于该范围内的所有数值和小数(例如1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还要理解的是，所有的数值及其小数都可被假定为用术语“约”修饰。
术语“约”是指在所提到的数值的0.1-50％左右、5-50％左右或10-40％左右，优选10-20％左右，更优选10％左右或15％左右。
本文中使用的术语“预防”指的是相对于未治疗的对照样本能降低治疗的样本的失调或病症的发生，或者相对于未治疗的对照样本能延迟失调或病症的一种或多种症候的发生、或者能减轻失调或病症的一种或多种症候的严重程度。
在医学背景下，“诊断”是通过评价一个或多个因素来鉴定一种或多种健康情况(包括疾病和/或损伤)以鉴定或确定疾病性质和/或原因的行为或过程，所述因素可以包括患者病史、身体检查、评述症状和评述来自一项或多项实验室检验的数据。在本申请中，如果不另外定义，则它们不仅包括鉴定特定疾病意义上的诊断，而且还包括筛选那些处于疾病风险之中或怀疑有某种疾病的无症状的或高风险的人群，或者监测那些未治疗的或经治疗的患者，以及监测治疗过程并进行早期预测和/或存活率预测。
如本文所用，术语“治疗”指减少或减轻疾病发作和/或症状的进展、严重程度和/或持续时间。
本文使用的术语“糖尿病”是指在形成例如I型和II型糖尿病、早期糖尿病和特征在于轻度减少的胰岛素或轻度升高的血糖水平的前期糖尿病的任何哺乳动物(包括实验动物模型和人)中表现出的任何糖尿病症状。糖尿病过程可来源于多种病因因素，特征在于在空腹状态下或在口服葡萄糖耐受测试中给予葡萄糖后提升的血浆葡萄糖水平或高血糖。增加的和过早的发病率和死亡率与持久的或不受控的高血糖相关。异常葡萄糖稳态可能与脂质、脂蛋白和载脂蛋白代谢的改变以及其它代谢和血液动力学疾病直接和间接相关。因此，II型糖尿病患者可能面临着增加的大血管和小血管并发症风险，包括冠心病、中风、外周血管疾病、高血压、肾病、神经病和视网膜病。
“与糖尿病相关的病症和/或疾病”包括但不限于糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病和糖尿病性神经病、黄斑变性、冠心病、心肌梗塞、糖尿病性心肌病、心肌细胞死亡、冠状动脉病、外周动脉病、中风、肢体缺血、血管再狭窄、足溃疡、内皮功能障碍和/或动脉硬化。
如本文所用，术语“扩增”或“传代”是将细胞从现有的培养物中分开或分出来，并加入新鲜培养液开始新的培养，促进细胞数量快速增加的手段；所述“扩增”或“传代”至少5代，10代，15代，20代，25代，30代，35代，40代，45代，50代，55代，或60代以上，并能保持胰岛前体细胞中PDX1和NKX6.1双阳性的细胞约占30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％以上。
如本文所用，术语“胰岛细胞”包含分泌胰岛素的胰岛β细胞，能分泌胰高血糖素的胰岛α细胞，和/或能分泌生长抑素的胰岛δ细胞，胰高血糖素与胰岛素一起发挥作用来调节血糖的水平。胰岛细胞可由多能干细胞逐步分化而来。例如，人多能干细胞逐步分化为胰岛β细胞的过程依次经历以下主要阶段：人多能干细胞，定型内胚层细胞(DE，Stage 1)，原肠管细胞(PG，Stage 2)，后前肠内胚层细胞(PF，Stage 3)，胰岛前体细胞(PP，Stage 4)，内分泌前体细胞(EP，Stage 5)，胰岛β细胞(PB，Stage 6)。
如本文所用，术语“胰岛类器官”包含基于3D体外细胞培养系统建立的，与体内来源的胰岛高度相似的，具有胰岛的一些关键特性的模型。胰岛类器官可由多能干细胞和/或胰岛前体细胞在3D培养系统中逐步诱导分化而来。例如，人多能干细胞逐步分化为胰岛类器官的过程依次经历以下主要阶段：人多能干细胞，定型内胚层细胞，原肠管细胞，后前肠内胚层细胞，胰岛前体细胞，内分泌前体细胞，胰岛类器官；胰岛前体细胞逐步分化为胰岛类器官的过程依次经历以下主要阶段：胰岛前体细胞，内分泌前体细胞，胰岛类器官。胰岛类器官可以复制出胰岛的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。例如，胰岛类器官包含分泌胰岛素的胰岛β细胞，能分泌胰高血糖素的胰岛α细胞，和/或能分泌生长抑素的胰岛δ细胞等。胰岛类器官具有与体内胰岛相似的生理反应，例如，感应环境中葡萄糖浓度的变化分泌胰岛素。
目前，人多能干细胞向胰岛细胞分化的技术在很大程度上模拟体内发育过程。在正常发育过程中，转录因子起着不可或缺的作用，因而在研究中常常使用关键转录因子的表达来监测整个分化过程并鉴定各阶段的细胞特征。在胰腺发育过程中，关键转录因子PDX1和NKX6.1的共表达可以用来定义和鉴定具备进一步发育潜能的胰岛前体细胞。如果能获得一种人胰岛前体细胞长期稳定高效扩增的体系，无疑是优于以人多能干细胞为起点的创新性技术。因此，人多能干细胞分化获得的PDX1和NKX6.1双阳性的胰岛前体细胞能否在体外长期培养扩增，是急需解决的关键问题。
针对PDX1和NKX6.1双阳性的胰岛前体细胞短缺的难题，我们开展了小分子药物筛选，首次发现含溴结构域和额外终端域家族蛋白(BET)特异性抑制剂(例如I-BET151和(+)-JQ1)可以有效促进人胰岛前体细胞的扩增、纯化及培养。通过进一步的优化，建立了包含BET特异性抑制剂的新型培养体系，首次实现了高效制备高纯度的可扩增的人胰岛前体细胞。这些人胰岛前体细胞可以被长期稳定扩增培养，维持胰岛前体细胞特征，并且可以进一步高效地分化为具有生理功能的胰岛细胞。特别重要的是，通过小鼠糖尿病模型实验充分证明，这些胰岛细胞可以治愈糖尿病，因而在细胞治疗中具有巨大的潜力。
在机制方面，BET特异性抑制剂可以激活Notch信号通路，并调控染色质开放和表观遗传修饰，促进胰岛前体细胞关键基因表达；深入的机制研究揭示了表观遗传修饰和基因转录等方面的调控对谱系特异性前体细胞自我更新具有重要作用。
总体而言，本申请首次实现了人胰岛前体细胞的长期稳定高效扩增，实质性解决了功能胰岛细胞来源极其短缺等难题，并具备优越的安全性和经济适用性，在基础研究、疾病模型、药物筛选和再生医学中，都有非常广泛的应用前景。
实施例1将人多能干细胞分化为胰岛前体细胞
首先，我们利用人多能干细胞培养基进行人多能干细胞的培养。该人多能干细胞培养基包含88％DMEM，10％KSR，1％NEAA，1％青霉素、链霉素混合液，0.055mMβ巯基乙醇，10ng/mL bFGF。使用的人多能干细胞细胞系包括MEL1人胚胎干细胞系、H9人胚胎干细胞细胞系和人诱导多能干细胞系(hiPSC)。
之后，使用2D或3D分化方法将人多能干细胞分化为胰岛前体细胞。人多能干细胞分化获得胰岛前体细胞的3D分化方法，步骤具体如下：
1)在10厘米培养皿中培养人多能干细胞四天，使用人多能干细胞培养基，每天换液；
2)使用磷酸盐缓冲液润洗一遍细胞后，利用Accutase消化酶将细胞消化至单细胞状态；
3)将细胞种至低吸附的六孔板中，每孔种5.5×106个细胞，加入5.5毫升D0培养基；
4)将细胞培养板放置于转速为100rpm的旋转摇床上；
5)每天更换一次新的培养基，D1至D11培养基，连续培养11天，获得人胰岛前体细胞。
6)所述D0培养基包含88％DMEM，10％KSR，1％NEAA，1％青霉素、链霉素混合液，0.055mMβ巯基乙醇，10ng/mL bFGF，10ng/mL activin A，10ng/mL heregulin B；所述D1培养基包含99％RPMI，1％P/S，1:5000ITS-X，0.2％FBS，100ng/mL activin A，3μMCHIR99021；所述D2培养基包含99％RPMI，1％P/S，1:2000ITS-X，0.2％FBS，100ng/mLactivin A；所述D3培养基包含99％RPMI，1％青霉素、链霉素混合液，1:1000ITS-X，0.2％FBS，25ng/mL KGF，2.5μM A83-01；所述D4-5培养基包含99％RPMI，1％青霉素、链霉素混合液，1:1000ITS-X，0.4％FBS，25ng/mL KGF；所述D6-7培养基包含97％DMEM，1％青霉素、链霉素混合液，1X B27，3nM TTNPB；所述D8培养基包含97％DMEM，1％青霉素、链霉素混合液，1XB27，3nM TTNPB，50ng/mL EGF；所述D9-11培养基包含97％DMEM，1％青霉素、链霉素混合液，1X B27，50ng/mL KGF，50ng/mL EGF。
人多能干细胞分化获得胰岛前体细胞的2D分化方法，步骤具体如下：
1)将人多能干细胞种至12孔板中，每孔种5×105个细胞；
2)培养48小时后，使用磷酸盐缓冲液润洗一遍细胞，更换D1分化培养基开始分化；
3)每天更换一次新的培养基，D1至D14培养基，连续培养14天，获得人胰岛前体细胞。
6)所述D1培养基包含99％RPMI，1％青霉素、链霉素混合液，100ng/mL activin A，3μM CHIR99021；所述D2培养基包含99％RPMI，1％青霉素、链霉素混合液，0.2％FBS，100ng/mL activin A；所述D3培养基包含99％RPMI，1％青霉素、链霉素混合液，2％FBS，100ng/mLactivin A；所述D4-6培养基包含99％RPMI，1％青霉素、链霉素混合液，0.5X B27，0.5X N2，0.05％BSA，50ng/mL KGF；所述D7-8培养基包含97％DMEM，1％青霉素、链霉素混合液，1XB27，0.05％BSA，0.25mM vitamin C，50ng/mL KGF，0.1μM LDN-193189，0.1μM GDC-0449，2μM retinoic acid；所述D9-14培养基包含97％DMEM，1％青霉素、链霉素混合液，1X B27，0.05％BSA，0.25mM vitamin C，0.1μM LDN-193189，50ng/mL EGF。
实施例2通过基础培养基扩增人胰岛前体细胞
尝试使用成分确定的培养基扩增胰岛前体细胞。我们应用实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和免疫荧光染色来鉴定胰腺分化过程(图1A-C)。分化到胰岛前体阶段，流式细胞荧光分析实验(FACS)的结果显示PDX1和NKX6.1双阳性细胞的百分比约为50-60％(图1D)。然后我们尝试扩增这些人胰岛前体细胞，旨在产生大量适合下游检测和应用的细胞。我们选择了包含97％DMEM，1％青霉素、链霉素混合液，1X B27，50ng/mL EGF，10ng/mLbFGF，10μM 616452的基础培养基。然而，在基础培养基的培养下，PDX1和NKX6.1双阳性细胞的百分比在3-5次传代后，从约60％显著降低到不到20％(图1D和E)。
实施例3筛选促进人胰岛前体细胞扩增的小分子
我们进行了化学小分子的筛选，以鉴定可以帮助维持PDX1和NKX6.1双阳性人胰岛前体细胞高效扩增的小分子(图2A)。首先，我们使用基础培养基(EF6培养基)将定向分化获得的人胰岛前体细胞传代2-3代，以产生足够数量的细胞用于下一步的化学小分子筛选。随后，我们将细胞接种到24孔板中，然后用化学小分子库中的小分子处理，每3天换液一次。化学小分子库主要包含针对表观遗传和信号通路的生物活性小分子抑制剂(图2A、B)。经过7天的处理，我们对细胞进行了免疫荧光染色鉴定PDX1和NKX6.1双阳性的细胞，并使用Operetta CLS高内涵显微镜观察拍照并使用其配套分析系统分析了PDX1和NKX6.1双阳性胰岛前体细胞的百分比(图1F)。通过初筛，我们初步选出了5个小分子，然后经过多次重复测试，最终确定小分子I-BET151可以显著增加PDX1和NKX6.1双阳性的胰岛前体细胞(图2B、图1G和1H)。
实施例4 I-BET151促进人胰岛前体细胞的扩增的充分证据
I-BET151是含溴结构域和额外终端域家族蛋白(BET)的特异性抑制剂(图2C)。通过免疫荧光染色和FACS检测PDX1和NKX6.1双阳性细胞的比例，证实了I-BET151可以促进胰岛前体细胞的扩增(图2D-F)。接下来，我们使用RT-qPCR评估了不同浓度的I-BET151对NKX6.1表达的影响。我们发现I-BET151对NKX6.1表达的促进作用表现出剂量依赖效应，最佳浓度为1μM(图1I)。我们检测了其他胰岛前体细胞标志基因如HNF6、SOX9、PDX1和NKX6.1的表达水平，发现I-BET151可以显著诱导这些标志基因的表达(图2G)。接下来，我们利用转录组测序技术(RNA-seq)评估了I-BET151处理后转录组的变化。我们收集了I-BET151处理后以及未处理的人胰岛前体细胞并进行转录组测序。在I-BET151处理后，总共有620个基因上调，2209个基因下调(|log2变化倍数|>1，FDR<0.05)(图2H)。接下来，通过基因本体(GO)分析，我们发现上调基因主要富集在细胞发育、Notch信号通路、胚胎器官形态发生、细胞命运特化和胰腺发育等(图2I)。下调基因主要富集在细胞迁移、分泌、离子转运、脂质转运和急性炎症反应(图2I)。尤其是在I-BET151处理后许多人胰岛前体细胞的标志基因在转录水平上调，包括NKX6.1、PDX1、SOX9、HNF6、FOXA2、GATA4、GATA6和MNX1(图2J)。有趣的是，Notch信号通路相关基因的表达也显著上调，如NOTCH1、HEY1和HES1(图2J)。此外，细胞增殖相关的基因PCNA的表达水平也上调(图2J)。另一方面，后期的内分泌前体细胞的标志基因(如NEUROG3、NEUROD1)和细胞周期抑制基因(如CDKN1A)的表达显著降低(图2J)。进一步的基因共表达网络分析表明，胰岛前体细胞标记基因和Notch信号通路基因显著正相关表达，而与NEUROG3、NEUROD1和CDKN1A显著负相关表达，表明I-BET151可以显著上调并维持人胰岛前体细胞的基因调控网络(图2K)。综上所述，这些数据表明I-BET151促进了人胰岛前体细胞的扩增。
实施例5人胰岛前体细胞的扩增培养基及传代方法
我们确定了人胰岛前体细胞扩增培养基，其配方包含97％DMEM，1X B27，1％青霉素、链霉素混合液，10ng/mL bFGF，50ng/mL EGF，10μM 616452，1μM I-BET151。
人胰岛前体细胞扩增培养基促进人胰岛前体细胞长期培养扩增的方法，步骤具体如下：
1)使用Accutase等消化酶将分化获得的人胰岛前体细胞消化为单细胞状态；
2)按1:3的比例将人胰岛前体细胞种到细胞培养板上；
3)使用人胰岛前体细胞培养基培养细胞，每2-3天换一次液；
4)每3-5天进行传代或冻存处理；
5)每次传代或复苏细胞时向培养基中加入0.5μM的Thiazovivin。
可扩增的人胰岛前体细胞可以进行稳定冻存和复苏，细胞冻存培养基包含60％人胰岛前体细胞培养基，30％FBS，10％DMSO。
实施例6扩增的人胰岛前体细胞的3D培养
此外，我们也提供了一种人胰岛前体细胞扩增培养基促进人胰岛前体细胞3D培养的方法，步骤具体如下：
1)使用Accutase等消化酶将培养的人胰岛前体细胞消化为单细胞状态；
2)将细胞种至低吸附的六孔板中，每孔种5×106个细胞，加入5毫升前述的人胰岛前体细胞培养基；
3)静置2天后换液，将细胞培养板放置于转速为100rpm的旋转摇床上培养3天；
4)获得的人胰岛前体细胞3D细胞团可进一步分化为人胰岛β细胞。
实施例7其他BET抑制剂同样可以促进人胰岛前体细胞的扩增
为了进一步表明本申请的技术方案中同样适合采用除I-BET151之外的BET抑制剂，我们测试了其他BET抑制剂对人胰岛前体细胞扩增的影响。我们发现(+)-JQ1可以增加PDX1和NKX6.1双阳性人胰岛前体细胞的数量，而无活性的立体异构体(-)-JQ1则没有促进作用(图3A-D)。此外，RT-qPCR结果显示(+)-JQ1可以增加胰岛前体细胞关键基因的表达水平(图3E)。因此，仅仅为了展示方便，本申请的大部分实施例以I-BET151作为BET抑制剂的代表，但本领域技术人员应该能够理解，本申请的技术方案中同样适合采用除I-BET151之外的BET抑制剂。
实施例8扩增后获得的人胰岛前体细胞的特性
经过反复测试和多次优化，我们开发了一种适用于人胰岛前体细胞扩增的培养条件(EF6I，即EF6培养基加I-BET151)(图4A)。使用EF6I培养基，我们建立了由人多能干细胞分化获得的可扩增的胰岛前体细胞。这些培养的人胰岛前体细胞可以长期扩增至35代以上(图4B)，并且这些人胰岛前体细胞可以方便地冻存和复苏，这是许多下游实验检测的重要优势。这些人胰岛前体细胞的特性在扩增过程中始终是稳定的(图5A)。低代数的人胰岛前体细胞(第12代)和高代数的人胰岛前体细胞(第24代)均可以共表达PDX1和NKX6.1(图5B)。RT-qPCR结果表明HNF6、SOX9、PDX1和NKX6.1在长期传代过程中可以稳定表达(图5C)。使用RNA-seq分析整体基因的表达显示，高代数的人胰岛前体细胞(第21代)的转录组与低代数的人胰岛前体细胞(第9代)的转录组非常相似(r2＝0.96624)(图4C)，证实了人胰岛前体细胞在转录组水平上的稳定性。核型分析表明，这些人胰岛前体细胞在长期扩增中仍保持正常的核型(图4D和图5D)。免疫荧光染色结果表明扩增的人胰岛前体细胞中均高表达FOXA2、SOX9、PDX1和NKX6.1等关键基因(图4E)。值得一提的是FACS的结果显示扩增的人胰岛前体细胞中PDX1和NKX6.1双阳性的细胞比例约90％，几乎达到纯化均一的状态，这一比例甚至高于未扩增的人胰岛前体细胞水平(图4F和图4G)。此外，这些人胰岛前体细胞中高表达增殖相关标志基因Ki67(图4H)，这是表明它们具有强大的扩增能力的另一个证据。我们还将人诱导多能干细胞(hiPSC)和H9人胚胎干细胞分化获得了PDX1和NKX6.1双阳性的人胰岛前体细胞，证明了该培养扩增方法的可重复性(图6A-D和图7A-D)。
为了进一步评估人胰岛前体细胞的转录信息，我们利用转录组测序比较了低代数和高代数的人胰岛前体细胞(第9代和第21代)、人多能干细胞、定型内胚层细胞和胰岛前体细胞的转录组。我们还将我们的RNA-seq数据集与Melton实验室近期的数据(人多能干细胞、定型内胚层细胞、胰腺前体细胞、未扩增的胰岛前体细胞和内分泌前体细胞)进行比较。主成分分析(PCA)表明高代数和低代数的人胰岛前体细胞在转录组水平上与未扩增的胰岛前体细胞非常相似(图4I)。通过GO分析，我们发现在人胰岛前体细胞中特异性表达的基因与DNA复制、上皮细胞增殖、胚胎器官发育和胰腺发育有关，进一步证实了它们的确是胰岛前体细胞(图4J)。尤其是这些扩增的人胰岛前体细胞表达关键的标志基因，包括PDX1、NKX6.1、SOX9、HNF6和MNX1，但不表达内分泌前体基因，如NEUROG3、NKX2.2和NEUROD1(图4K)。这些结果表明，扩增的人胰岛前体细胞稳定地保持着与直接源自人多能干细胞的胰岛前体细胞相似的转录组模式。
实施例9将扩增的人胰岛前体细胞分化到人胰岛β细胞
我们将扩增的人胰岛前体细胞分化到人胰岛β细胞，步骤具体如下：
1)使用R6培养基培养人胰岛前体3D细胞团，培养7天，每2-3天换一次液；
2)随后使用R7培养基培养人胰岛前体3D细胞团，培养7天，每2-3天换一次液。
所述R6培养基包含97％DMEM，1X B27，1％青霉素、链霉素混合液，0.05％BSA，10μM硫酸锌，10μg/mL heparin，10μM 616452，1μM T3，0.2μM LDN-193189，0.2μM Compound E，0.5mM vitamin C，10μM forskolin。所述R7培养基包含97％DMEM，1X B27，1％青霉素、链霉素混合液，0.05％BSA，10μM硫酸锌，10μg/mL heparin，10μM 616452，1μM T3，1mM N-acetylcysteine(NAC)，1μM Trolox，0.5mM vitamin C。
实施例10长期扩增不会影响胰岛前体细胞分化至胰岛β细胞的能力
为了研究这些可扩增的人胰岛前体细胞是否可以进一步分化成具有功能的胰岛β细胞，我们开展了进一步分化实验(图8A)。我们将低代数和高代数的人胰岛前体细胞高效地分化为胰岛素阳性的胰岛β细胞(图5E)。I-BET151抑制了人胰岛前体细胞向胰岛β细胞的分化(图5F)，表明I-BET151具有阶段特异性效应。通过免疫荧光染色，我们发现这些C肽阳性的胰岛β细胞共表达PDX1、NKX6.1和NKX2.2(图8B、图6E和图7E)。另一方面，这些细胞几乎不与其他内分泌激素(包括胰高血糖素(GCG)和生长抑素(SST))共染色(图8B、图6E和图7E)。FACS分析显示分化后的细胞中约有40-60％的C肽阳性、胰高血糖素阴性，或C肽阳性、生长抑素阴性，或C肽和PDX1双阳性，或C肽和NKX6.1双阳性的胰岛β细胞(图8C)。我们观察到来自人胚胎干细胞和诱导人多能干细胞的胰岛前体细胞扩增后，其分化能力无太大差异(图6E和F)。因此，长期扩增不会影响胰岛前体细胞分化至胰岛β细胞的能力。
实施例11扩增的胰岛前体细胞分化出的胰岛β细胞具有正常的生理功能
为了评估这些分化获得的胰岛β细胞的转录谱，我们通过RNA-seq比较了胰岛β细胞、扩增的低代数和高代数的胰岛前体细胞(第9代和第21代)、人多能干细胞、定型内胚层细胞和未扩增的人胰岛前体细胞的转录组，以及来自Melton实验室最近发表的RNA-seq数据集(人多能干细胞、定型内胚层细胞、未扩增的人胰岛前体细胞、分化得到的胰岛β细胞和人原代胰岛β细胞)。PCA结果表明胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞在转录水平上与干细胞分化得到的胰岛β细胞相似(图8D)。与胰岛前体细胞相比，许多β细胞标志基因在胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞中显著上调，包括INS、IAPP、SLC30A8、PCSK1、GCK和ABCC8(图8E)。进一步分析表明，胰岛前体细胞分化到胰岛β细胞后，有2713个基因上调，1400个基因下调(图8F)。对上调基因进行KEGG分析显示上调基因大多与蛋白质消化和吸收、cAMP信号通路、胰岛素分泌、年轻人的成年糖尿病、II型糖尿病以及生长激素合成、分泌和作用等相关(图8G)。下调基因的KEGG分析中则富集到DNA复制、细胞周期、同源重组、RNA转运、ECM-受体相互作用和p53信号通路(图8G)。这些结果表明胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞在转录上与干细胞直接分化获得的胰岛β细胞相似。
为了进一步评估这些胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞的功能，我们使用透射电子显微镜(TEM)观察了细胞内线粒体和胰岛素分泌囊泡的超微结构分析。我们在胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞中观察到成熟的线粒体，并且检测到与人多能干细胞、扩增的胰岛前体细胞以及人原代胰岛相比，胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞中线粒体DNA(mtDNA)含量上调(图8H和I)。免疫荧光染色数据显示胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞高表达成熟的标志蛋白MAFA(图8J)。此外，TEM结果显示这些胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞含有许多典型而致密的胰岛素囊泡(图8K)。此外，我们使用ELISA测定检查了胰岛素和C肽的含量，发现每1000个胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞含有1.248±0.025纳克的C肽和8.93±0.2纳克的胰岛素，这与干细胞分化的胰岛β细胞和人原代胰岛内含量相符(图8L和图6G)。此外，具有功能的胰岛β细胞的一个关键特征是其在葡萄糖刺激下具有释放胰岛素的能力。为了测试胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞的这一功能，我们进行了葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)的实验。通过测定高浓度葡萄糖(16.8mM)刺激与低浓度葡萄糖(2mM)刺激胰岛素分泌量的比率，我们发现对于人胚胎干细胞衍生的胰岛前体细胞分化的胰岛β细胞的分泌量比率约为2，诱导人多能干细胞衍生的胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞的比率约为1.5-1.6(图8M、图6H和图7F)。这些值与干细胞直接分化的胰岛β细胞和人原代胰岛β细胞相近。因此，胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞能够感应低糖和高糖的刺激，表明胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞在体外具有生理功能。
实施例12扩增的人胰岛前体细胞分化获得的胰岛细胞可快速改善小鼠糖尿病
胰岛细胞的一个重要生理功能是能够调节动物体内的血糖水平。为了评估可扩增的胰岛前体细胞分化获得的胰岛细胞的体内功能，我们将得到的具有功能的胰岛细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内(图9A)。免疫缺陷的SCID beige小鼠购自北京维通利华实验动物科技有限公司，小鼠性别为雄性，8-10周龄。实验中使用异氟醚麻醉小鼠后，将约500万分化获得的胰岛β细胞移植到小鼠肾包膜下。移植3天后，就可以在小鼠体内检测到显著的葡萄糖刺激的人胰岛素分泌(图9B)，并且细胞感应血糖变化分泌胰岛素的能力可以维持至少12周(图9C)。该实验中，小鼠禁食16小时后，进行尾部取血收集空腹血液样品，随后按3克每千克浓度腹腔注射葡萄糖溶液，一小时后收集血液样品，之后以6000转离心20分钟收集血清样品并进行ELISA实验分析。ELISA实验中使用商业购买的人胰岛素或人C肽检测试剂盒。接着，我们将胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞移植到糖尿病模型小鼠体内观察血糖变化。糖尿病模型小鼠的构建中，连续五天按45毫克每千克浓度对小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)。一周后小鼠血糖表现出高血糖状态，并出现糖尿病症状(多饮多尿)。随后对糖尿病小鼠进行细胞移植手术。移植30天后，对野生型(正常小鼠，未移植细胞)、实验组(糖尿病小鼠，移植了细胞)和对照组(糖尿病小鼠，未移植细胞)进行了葡萄糖耐受试验。在腹腔葡萄糖耐受试验(IPGTT)中，将三组小鼠禁食16小时，记录空腹血糖水平。然后，按2克每千克浓度给小鼠腹腔注射葡萄糖溶液。腹腔注射后，在选择的时间点记录小鼠的血糖水平。与没有移植胰岛前体细胞分化获得的胰岛β细胞的小鼠相比，移植了细胞的小鼠具有明显更高的葡萄糖耐受性，并且吸收葡萄糖的速度也更快(图9D)。此外，移植细胞的小鼠的血糖水平在移植2周内显著降低，并且这些小鼠在3周血糖下降至正常水平并可稳定维持(图9E)。大约12周后，采用肾切除术移除移植物，小鼠血糖回升并迅速表现出糖尿病症状，证明胰岛β细胞确实改善了STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖水平(图9E)。对取出的体内移植物进行冰冻切片和免疫荧光染色分析，结果显示细胞可以共表达C肽和关键的胰岛β细胞转录因子PDX1和NKX6.1，且没有表现出与其他内分泌激素(胰高血糖素和生长抑素)的共表达(图9F)。总的来说，这些结果表明可扩增的胰岛前体细胞分化获得的胰岛细胞在体内移植后，仍维持着其分化后的表型，并可以产生葡萄糖应激反应，可以迅速改善糖尿病，体现了这些细胞潜在的治疗价值。
综上所述，本申请成功实现了人胰岛前体细胞长期稳定扩增的目标，取得了关键技术的突破。由于建立高效的人胰岛前体细胞体外长期培养扩增方法，对快速获得大量有功能的人胰岛β细胞及胰岛类器官至关重要，因此，本申请的技术方案可以促进疾病模型、药物筛选和细胞移植治疗等临床相关应用的快速发展。
以上对本申请具体实施方式的描述详细地公开了本申请的技术细节，并举例说明了本申请的技术思路，旨在满足专利法的授权规定，但不应反而被认为是对本申请保护范围的限制。该领域的科研人员可以根据本申请，结合彼时的知识与技术作出各种改变或变形，只要未脱离本申请的核心思路与精神，均应属于本申请所附的权利要求的保护范围。

Claims (12)

1.一种促进或保持胰岛前体细胞呈现PDX1和NKX6.1双阳性的方法，或者一种抑制或避免胰岛前体细胞分化为内分泌前体细胞的方法，或者一种抑制或避免胰岛前体细胞表达NGN3，NKX2.2，和/或NEUROD1标志物的方法，其特征在于，包括在培养胰岛前体细胞的培养基中加入至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂。
2.一种体外制备胰岛细胞及胰岛类器官的方法，包括在胰岛前体细胞阶段采用含有至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂的培养胰岛前体细胞的培养基对所述阶段的细胞进行培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在胰岛前体细胞阶段，细胞在所述培养基中至少扩增或传代5代，10代，15代，20代，25代，30代，35代，40代，45代，50代，55代，或60代。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在胰岛前体细胞阶段之后，不再使用含有BET抑制剂的培养基对所述阶段的细胞进行培养。
5.一种体外扩增胰岛前体细胞的方法，其特征在于，包括：采用包含至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂的培养胰岛前体细胞的培养基来培养胰岛前体细胞，并使所述细胞至少传代5代，10代，15代，20代，25代，30代，35代，40代，45代，50代，55代，或60代。
6.胰岛细胞及胰岛类器官或胰岛前体细胞在制备预防或治疗病症和/或疾病的药物中的用途，其特征在于，所述制备的过程包括经由权利要求2-4之一项所述的方法制备胰岛细胞及胰岛类器官的步骤，或包括实施权利要求5所述的方法；所述病症和/或疾病为糖尿病或糖尿病相关的病症和/或疾病。
7.一种筛选预防或治疗病症和/或疾病的药物的方法，其特征在于，包括：采用包含至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂的培养胰岛前体细胞的培养基大量扩增胰岛前体细胞，再将扩增后的胰岛前体细胞分化为胰岛细胞及胰岛类器官；所述病症和/或疾病为糖尿病或糖尿病相关的病症和/或疾病。
8.一种制备治疗糖尿病或糖尿病相关的病症和/或疾病的药物的方法，包括在将足量的胰岛细胞及胰岛类器官植入受试者体内前，使胰岛前体细胞在含有至少一种BET抑制剂和一种TGFβ抑制剂的培养胰岛前体细胞的培养基中长期传代，以扩增胰岛前体细胞群，随后将胰岛前体细胞分化为胰岛细胞及胰岛类器官。
9.一种扩增胰岛前体细胞的培养基，其特征在于，所述培养基在基础培养基中添加至少一种BET抑制剂，所述基础培养基为EF6，所述EF6包含EGF，bFGF和一种TGFβ抑制剂。
10.如权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述培养基的配方包含有效量的DMEM，B27，青霉素，链霉素，碱性成纤维细胞生长因子bFGF，表皮生长因子EGF，TGFβ抑制剂616452，和BET抑制剂I-BET151。
11.如前述任一权利要求，其特征在于，所述BET抑制剂靶向BRD2，BRD3，BRD4，和/或BRDT；或者所述TGFβ抑制剂包含E-616452，A83-01，A77-01，SB431542，GW788388，TGFβRI-IN-2，BIBF0775，ITD1，SJN2511，D4476，LY364947，SB505124，SB525334，SD208中的一种或多种；或者所述胰岛前体细胞来源于胚胎干细胞、围产期干细胞，成体干细胞，诱导多能干细胞，或生物工程干细胞。
12.如权利要求10中所述的诱导多能干细胞，其特征在于，其为人诱导多能干细胞。
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