CN109072183B - 细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明将提供制备体细胞的方法,其包括将哺乳动物的已分化的体细胞在用于诱导分化除了上述已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基中,在TGF‑β通路抑制剂的存在下进行培养,从而使上述已分化的体细胞转换为其它体细胞。
Description
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请基于2015年10月21日提出申请的日本专利申请第2015-207529号说明书要求优先权,并将其公开的全体通过参考援引于本说明书中。
本发明主要涉及细胞的制备方法。具体而言,涉及一种基于直接重编程的细胞的制备方法。本发明还涉及用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞的诱导剂。
背景技术
近年来着眼于再生医疗技术,其通过将细胞移植给患者而对功能、形态的异常进行补充以治疗疾病。
例如对成骨细胞而言,如果以修复骨肿瘤、外伤、骨髓炎等导致的骨缺损、以及骨肿瘤等刮治后的骨缺损的修复目的,而向病变部移植成骨细胞,则可以期待促进骨形成,提高功能、形态性的预后。实际上,例如已经进行了将从患者的松质骨(cancellous bone)收集的骨髓细胞进行自体移植的治疗,其有效性已知。在该情况下,认为从自体骨髓细胞中包含的间充质干细胞诱导分化了成骨细胞,促进了骨形成和重建。另一方面,随着老龄化,骨质疏松症的罹患率增加,也存在老人如果骨折则导致长期卧床的情况。认为成骨细胞的移植可以促进治愈骨质疏松症、外伤等导致的骨折、难治性骨折、假骨折(pseudofracture)。成骨细胞的移植也可能对以下方面有效:类风湿性关节炎、突发性股骨头坏死、变形性关节症、腰椎峡部畸形症(lumbar spondylosis deformans)、椎管狭窄症、椎间盘突出症、峡部裂(spondylolysis)、脊椎松解型滑脱症、脊柱侧弯症、脊髄型颈椎病、后纵韧带骨化症、脊髓损伤、变形性髋关节症(coxarthrosis)、变形性膝关节症(gonarthrosis)、股骨头滑脱症、骨软化症、手术后的骨的修复(心脏手术之后的胸骨的修复等)、人工踝关节手术所伴随的缺陷部的修复、骨髓炎、骨坏死(osteonecrosis)等。
另一方面,牙周病也被称为第4生活方式病,罹患率极高,还构成了各种全身性疾病的原因。随着牙周病的进行而发生牙槽骨的骨吸收,所以认为如果将成骨细胞效率良好地供应到局部的骨吸收部,则与牙槽骨的再生治疗相关。
另外,如果将成骨细胞的移植与骨移植、人工骨移植、人工关节、植入进行组合使用,则有提高治疗效果的可能性。
在再生医疗技术中,使用的细胞的供应方式是待解决的问题之一。
例如,作为移植目的的成骨细胞,迄今为止已使用了骨髓间充质干细胞、包含骨髓间充质干细胞的骨髓细胞等。但是,采集骨髓对患者的侵害较大,并存在不能供应足够数量的骨髓细胞的情况等问题。另一方面,如果使用人胚胎干细胞(ES细胞),则不需要从患者采集骨髓,也有能够供应足够数量的成骨细胞的可能性,但有伦理问题,除此以外,存在移植后残存的ES细胞发生肿瘤化的危险性。另外,即使使用了iPS细胞,虽然不再需要从患者收集骨髓,并有能够供应足够数量的成骨细胞的可能性,但存在移植后残存的iPS细胞发生肿瘤化的危险性。
对于其它细胞也存在同样的问题。
在非专利文献1中进行了对人ES细胞的Osterix的慢病毒载体导入+利用成骨性(Osteogenic)培养基的向成骨细胞的诱导分化。在非专利文献2、3中,从小鼠iPS细胞经历MSC而利用成骨性培养基进行诱导分化,得到了成骨细胞。
在非专利文献4中,向小鼠iPS细胞导入Runx2的腺病毒载体,利用成骨性培养基进行诱导分化,得到了成骨细胞。如非专利文献1~4所示那样,成骨细胞是从ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞进行诱导分化而制成的,因此需要长期的培养,也存在癌变的危险性。
对于向体细胞导入组织特异性的转录因子的基因群,可以直接诱导分化(不经历iPS细胞的转化)为该组织细胞(直接转换(直接重编程)),例如有以下报告:
小鼠成纤维细胞→软骨细胞(导入SOX9+Klf4+c-Myc基因)
小鼠成纤维细胞→心肌细胞(导入GATA4+Mef2c+Tbx5基因)
小鼠成纤维细胞→肝细胞(导入Hnf4α+(Foxa1或Foxa2或Foxa3)基因)
小鼠成纤维细胞→神经干细胞(导入Sox2+FoxG1基因等)、
小鼠、人细胞→造血干细胞等。
专利文献1公开了用于向体细胞导入指定的基因群而有效地制备(直接转换)有功能性的成骨细胞的方法。然而,在导入基因的方法中,由于导入的基因、载体的影响,存在细胞发生肿瘤化的可能性。另外也存在需要用于证实安全性的费用和时间等问题。因此,需要不导入基因而诱导为移植用的细胞的技术
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开公报WO2015/012377
非专利文献
非专利文献1:Karner E等人.J Cell Physiol.2009.
非专利文献2:Li F等人.J Cell Biochem.2010.
非专利文献3:Biloussova G等人.Stem cells.2011.
非专利文献4:Tashiro K等人.Stem cells.2009.
发明内容
发明要解决的问题
本发明主要的目的在于提供细胞的制备方法,特别是将已分化的体细胞不进行基因导入而转换为其它体细胞的技术(直接转换(直接重编程))的技术)。
解决问题的方法
本发明人发现:通过将哺乳动物的已分化的体细胞在培养基中,在TGF-β通路抑制剂的存在下在各种组成的培养基中进行培养,可以将原材料的体细胞转换为除了该原材料的体细胞以外的其它体细胞。
尚没有使用TGF-β通路抑制剂的直接转换(直接重编程)的报告。
本发明包括以下的成骨细胞的制备方法、成骨细胞的诱导剂及试剂盒。
项1,制备体细胞的方法,其包括将哺乳动物的已分化的体细胞在用于诱导分化除了上述已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基中,在TGF-β通路抑制剂的存在下进行培养,使上述已分化的体细胞转换为其它体细胞。
项2,根据项1所述的方法,其中,TGF-β通路抑制剂为TGF-β/SMAD通路抑制剂。
项3,根据项1或2所述的方法,其中,TGF-β通路抑制剂为D4476、SB431542、LY2157299、SD208或ALK5抑制剂II。
项4,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,TGF-β通路抑制剂为ALK5抑制剂II。
项5,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为间充质类的细胞。
项6,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞或角质细胞转换为成骨细胞。
项7,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞或外周血单核细胞转换为白色脂肪细胞。
项8,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞或角质细胞转换为棕色脂肪细胞。
项9,根据项7或8所述的方法,其中,用于诱导分化体细胞的培养基包含过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂。
项10,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为软骨细胞。
项11,根据项1~4的任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为成肌细胞。
项12,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为施万细胞。
项13,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使角质细胞转换为尿路上皮细胞。
项14,根据项1~4中任一项所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为间充质干细胞。
项15,用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞的诱导剂,其包含TGF-β通路抑制剂。
项16,用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞的试剂盒,所述试剂盒包括TGF-β通路抑制剂及用于诱导分化上述其它体细胞的培养基。
发明的效果
在本发明中,可以利用低分子化合物的作用,在短时间内从已分化的体细胞提供其它体细胞。由于得到的体细胞(例如:间充质干细胞、成骨细胞)可以容易地从待移植的本人的体细胞诱导,所以即使在将得到的体细胞本身或由其制作成的组织进行移植的情况下,也不会产生免疫性排斥应答等问题。另外,由于可不经历iPS细胞、ES细胞的转化而直接从体细胞诱导为体细胞,因此可以避免癌变等由多功能性干细胞所引起的问题。另一方面,也可以预先制作细胞并制成库,从库将细胞使用在对患者的同种异体移植、异种移植中。
附图说明
[图1]示出茜素红S染色的结果(染色图)。
[图2]示出茜素红S染色的结果(吸光度测定)。
[图3]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图4]示出骨钙素(Osteocalsin)的免疫染色的结果(染色图)。
[图5]示出茜素红S染色的结果(染色图及吸光度测定)。
[图6]示出Runx2的免疫染色的结果(染色图)。
[图7]示出Bodipy染色的结果(染色图)。
[图8]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图9]示出阿辛蓝染色的结果(染色图)。
[图10]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图11]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图12]示出油红O染色的结果(染色图)。
[图13]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图14]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图15A]示出Bodipy染色的结果(染色图)。
[图15B]示出Bodipy染色的结果(荧光强度测定)。
[图16]示意性示出TGF-β/SMAD通路。
[图17]示意性示出TGF-β/SMAD通路和TGF-β/ERK通路。
[图18]示意性示出TGF-β/SMAD通路、TGF-β/JNK通路和TGF-β/p38通路。
[图19]示意性示出TGF-β/SMAD通路和TGF-β/RhoA通路。
[图20]示出茜素红S染色的结果(染色图)。
[图21]示出ALP染色的结果(染色图)。
[图22]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图23]示出油红O染色的结果(染色图)。
[图24]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图25]示出阿辛蓝染色的结果(染色图)。
[图26]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图27]示出茜素红S染色的结果(染色图)。
[图28]示出ALP染色的结果(染色图)。
[图29]示出μCT的断层图像(μCT分析)。箭尖、箭头分别示出了骨缺损(Bonedefect)、再生的骨组织(愈伤组织)(Regenerated bone tissue(Callus))。
[图30]示出μCT的三维重构建图像。为移植之后21天的图像。箭头示出骨缺损(Bone defect)或再生的骨组织(愈伤组织)(Regenerated bone tissue(Callus))。上段为横截面(Cross section),下段为纵剖面(longitudinal section)。
[图31]示出基于苏木素伊红染色(HE染色)及茜素红S染色(Alizarin Red Sstaining)的组织学分析(Histological analysis)的结果。
[图32]示出基于DNA微阵列(DNA microarray)解析的示出了MSC标记基因(MSCmarker genes)的表达量的热图。
[图33]示出茜素红S染色的结果(染色图)。
[图34]示出茜素红S染色的结果(吸光度测定)。
[图35]示出茜素红S染色及ALP染色的结果(染色图)。
[图36]示出茜素红S染色的结果(吸光度测定)。
[图37]示出ALP染色的结果(染色图)。
[图38]示出茜素红S染色的结果(染色图)。
[图39]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图40]示出骨钙素(Osteocalsin)(OC)的免疫染色的结果(染色图和DAPI阳性细胞中的OC阳性细胞的百分比)。
[图41]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图42]示出UCP1的免疫染色的结果(染色图像)。
[图43]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图44]示出UCP1的免疫染色的结果(染色图)。
[图45]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图46]示出UCP1的免疫染色的结果(染色图像(A)和DAPI阳性细胞中的UCP1阳性细胞的百分比(B))。
[图47]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图48]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图49]示出Bodipy染色的结果(染色图)。
[图50]示出Bodipy染色的结果(Bodipy阳性细胞的比率)。
[图51]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图52]示出Bodipy染色的结果(染色图)。
[图53]示出Bodipy染色的结果(定量)。
[图54]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图55]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图56]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
[图57]示出基于实时RT-PCR法的基因表达量的测定结果。
需要说明的是,在图4、图6及图7中一并显示了色反转图像。
具体实施方式
本发明涉及以哺乳动物的已分化的体细胞作为原材料,制备其它体细胞的方法。换言之,本发明涉及将哺乳动物的已分化的体细胞转换为其它体细胞的方法。“转换”是指将体细胞向目标的体细胞转换。本发明的方法的优选实施方式之一为“直接转换”(也称为“直接重编程”)的不经过以iPS细胞的制作为代表的细胞的初始化的工序,而将体细胞转换为其它体细胞的方法。也可以换言之为将体细胞直接转换为其它体细胞的方法。
在本发明的方法的优选实施方式中,体细胞不进行基因的导入而向其它体细胞转换。“不进行基因的导入”是指体细胞的初始的基因群序列(主要指DNA的碱基序列)不发生变化而向其它体细胞转换。或者,“不进行基因的导入”是指以体细胞的初始的内在基因的功能为基础而使其向其它体细胞转换。
已分化的体细胞(原材料)
作为在本发明的方法中用作原材料的哺乳动物的已分化的体细胞,只要源自哺乳动物即可,没有特别限定。所述体细胞是指细胞中除了生殖细胞以外的细胞。
作为体细胞的种类,可列举例如:成纤维细胞、上皮细胞(皮肤表皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、气管粘膜上皮细胞、肠道粘膜上皮细胞等)、表皮细胞、龈细胞(如龈成纤维细胞、龈上皮细胞)、牙髓细胞、白色脂肪细胞、皮下脂肪、内脏脂肪、肌肉、血液细胞(例如:外周血单核细胞)等,可列举优选:成纤维细胞、龈细胞、口腔粘膜上皮细胞、牙髓细胞、脂肪细胞、表皮角化细胞(角质细胞)、血液细胞等。
另外,也可列举从间充质干细胞(Mesenchymal stem cell:MSC)、神经干细胞(Neural stem cell)、肝干细胞(hepatic stem cell)、肠干细胞、皮肤干细胞、毛囊干细胞、色素细胞干细胞等体细胞干细胞而诱导分化或使其去分化或重编程而制成的体细胞。另外,也可列举从各种体细胞而诱导分化、或使其去分化或重编程而诱导成的其它体细胞。另外,也可列举从生殖系列的细胞进行诱导分化或使其去分化或重编程而诱导成的体细胞。
另外,也可列举培养细胞,也可列举从培养细胞进行诱导分化、或使其去分化或重编程而诱导成的体细胞。
作为哺乳动物,可列举小鼠、大鼠、仓鼠、人、犬、猫、猴、兔、牛、马、猪等。体细胞特别优选源自人。对体细胞的来源的个体的年龄没有限定,可以为成人、也可以为儿童、也可以为胎儿。需要说明的是,在本说明书中,将源自胎儿的细胞,以及源自胎盘、羊膜、脐带等的细胞也包括于“体细胞”。
在将制备的体细胞移植至活体的情况下,由于减少了感染、排斥反应等危险而优选使用源自待移植的受试者的体细胞(自体细胞)。然而,也可以将从他人、其它动物的体细胞(并非自体细胞)所制备的体细胞用于移植。另外,可以从预先准备好的他人、其它动物的体细胞制备其它体细胞而用于移植。另外,可以将从他人、其它动物的体细胞预先制备体细胞并用作移植。即,可以预先制作体细胞库或体细胞前体细胞的库,以供移植目的。在这种情况下,为了减少排斥反应等危险,可以预先对血液学与MHC进行分型。另外,可以预先确认移植用的体细胞的性质、致瘤性等。
制备的其它体细胞
通过本发明的方法制备的其它体细胞,为除了用作原材料的体细胞以外的体细胞。另外,从用作原材料的体细胞在生理的条件下(特别是活体内)分化的体细胞不包括在“其它体细胞”中。例如,在活体内间充质干细胞向成骨细胞分化,因此在将间充质干细胞用作原材料时,成骨细胞不符合“其它体细胞”。
作为制备的体细胞的种类,可列举例如:间充质干细胞(MSC)、成骨细胞、脂肪细胞(棕色脂肪细胞或白色脂肪细胞)、软骨细胞、成肌细胞、尿路上皮细胞、骨髓间质细胞、肌腱细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、施万细胞等胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞等。
进一步,可列举:表皮细胞、色素细胞、毛囊细胞、指甲基质细胞、结缔组织细胞、肺和气管的细胞(气管上皮细胞、肺泡上皮细胞等)、消化道上皮细胞、腺细胞、造血干细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、血小板、成红细胞、红细胞、淋巴网状细胞、抗原呈递细胞、乳腺上皮细胞、肾脏的细胞(肾小球细胞、尿细管上皮细胞、尿路上皮细胞等尿路类细胞等)、生殖系统细胞、角膜细胞、结膜细胞、视网膜细胞、滑膜细胞、内分泌细胞、胰岛细胞(胰岛素生成细胞(β细胞)等)、外分泌细胞、肝干细胞、胰干细胞、肠道干细胞、唾液腺干细胞等。
对于用作原材料的体细胞和制备的体细胞的组合,没有特别限定。
从制备体细胞的效率较高的观点出发,优选用作原材料的体细胞和制备的其它体细胞均为从间充质干细胞分化的、属于间充质类的体细胞。
作为属于间充质类的细胞,可例示:间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞、骨髓间质细胞、肌腱细胞等。另外,肝细胞、胆管上皮细胞、胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞等已知可能从间充质干细胞分化来的细胞,也包括于“属于间充质类的细胞”中。
在成骨细胞中,包括前成骨细胞、不成熟成骨细胞、成熟成骨细胞、骨细胞等。另外,在脂肪细胞中包括白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞,在白色脂肪细胞中包括脂肪干细胞、前脂肪细胞、成熟脂肪细胞、肥大的脂肪细胞等。在棕色脂肪细胞中包括米色细胞、Brite细胞等。在软骨细胞中包括不成熟软骨细胞、成熟软骨细胞、肥大软骨细胞等。在成肌细胞中包括肌卫星细胞、未成熟成肌细胞、成熟的成肌细胞、肌细胞、肌管细胞、肌纤维等。同理,对本说明书中所记载的细胞而言,均包括以其名称所表示的细胞系列中的、分化的程度不同的细胞。
作为本发明的实施方式的具体例,可例示:使成纤维细胞转换为间充质干细胞(MSC)的方法、使成纤维细胞转换为成骨细胞的方法、使成纤维细胞转换为脂肪细胞的方法(例如,使成纤维细胞转换为白色脂肪细胞的方法、使成纤维细胞转换为棕色脂肪细胞的方法等)、使成纤维细胞转换为软骨细胞的方法、使成纤维细胞转换为软骨细胞的方法、使成纤维细胞转换为成肌细胞的方法、使角质细胞转换为尿路上皮细胞的方法、使血液细胞(例如,外周血单核细胞)转换为白色脂肪细胞的方法等。
另外,可例示将龈细胞、口腔粘膜上皮细胞、牙髓细胞、脂肪细胞、血液细胞等作为原材料,使其转换为间充质干细胞(MSC)、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞的方法等。
在本发明中也包括:从原材料暂时转换为中间细胞(例如,MSC、MSC样的细胞、其它体细胞干细胞等),然后从该中间细胞分化为最终目标的细胞(成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞等)。由于中间细胞等也是体细胞之一,所以在本说明书中,直接转换包括经由这些中间细胞。
培养基
在本发明的方法中,将已分化的体细胞,在用于诱导除了已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基(诱导分化培养基)中培养。作为诱导分化培养基,可以根据制备的目的体细胞而使用公知的诱导分化培养基。
“用于诱导除了已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基”、“诱导分化培养基”是指:包含主要可以使多功能性干细胞(ES细胞、iPS细胞等)向该体细胞分化的成分的培养基。
例如,作为用于诱导成骨细胞的培养基,可例示将以下成分的一种或两种以上添加至普通液体培养基而成的培养基:抗坏血酸(例如,浓度0.1~1000μg/ml左右、优选为1~100μg/ml左右);β-甘油磷酸酯(例如:浓度0.1~1000mM左右、优选为1~100mM左右);糖皮质激素如地塞米松(1nM~10mM左右、优选为10~1000mM左右)及氢化可的松等。作为具体的例子,可列举将50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸酯、100nM地塞米松(均为最终浓度)添加于添加了10%FBS或者5%HS的DMEM等普通培养基而成的培养基。但不限于这些。
作为用于诱导白色脂肪细胞的培养基,可例示将胰岛素(Insulin)(例如浓度0.01~100μg/mL左右、优选为0.1~10μg/mL左右);3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine;IBMX)(例如浓度0.01~100mM左右、更优选为0.1~10mM左右);地塞米松(Dexamethasone)(例如为浓度0.01~100μm左右、更优选为0.1~10μm左右)等成分(一种或两种以上)添加于普通培养基而成的培养基。作为具体例,可列举添加了10%FBS的DMEM+MDI培养基(添加了0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松及1μg/mL胰岛素的10%FBS的DMEM)。但不限于这些。
从转换为白色脂肪细胞的效率较高的观点出发,优选进一步加入过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂(例如浓度0.01~100μm左右、更优选为0.1~10μm左右)。
作为PPAR-γ激动剂,可例示:罗格列酮、环格列酮、GW1929、nTZDpa、吡格列酮盐酸盐、曲格列酮等噻唑烷二酮化合物。
作为用于诱导棕色脂肪细胞的培养基,可例示将胰岛素(Insulin)(例如浓度0.01~100μg/mL左右、更优选为0.1~10μg/mL左右);3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine;IBMX)(例如浓度0.01~100mM左右、更优选为0.1~10mM左右);地塞米松(例如浓度0.01~100μm左右、更优选为0.1~10μm左右)添加于普通培养基而成的培养基。另外,也可以添加吲哚美辛(Indometacin)(例如浓度0.001~10mM左右、更优选为0.01~1mM左右)。
从转换为棕色脂肪细胞的效率较高的观点出发,优选进一步向培养基加入甲状腺激素(例如浓度0.01~100nM左右、更优选为0.1~10nM左右)和/或过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂(例如浓度0.01~100μm左右、更优选为0.1~10μm左右),进一步优选加入两者。
作为甲状腺激素,可例示:碘甲腺氨酸钠(Triiodothyronine,T3)、甲状腺素(Thyroxine,T4)等。
作为PPAR-γ激动剂,可例示:罗格列酮、环格列酮、GW1929、nTZDpa、吡格列酮盐酸盐、曲格列酮等噻唑烷二酮化合物。
作为用于诱导棕色脂肪细胞的培养基的具体例,可例示[1]添加了FBS10%、0.5mMIBMX、125nM吲哚美辛、1uM地塞米松、850nM胰岛素、甲状腺激素如1nM三碘甲状腺氨酸(Triiodothyronine,T3)、1μm罗格列酮的DMEM培养基,[2]添加了10%FBS、850nM胰岛素、1nM T3、1μm罗格列酮的DMEM培养基。可以第1~2天使用[1],第3日以后使用[2]。
另外,作为用于从成纤维细胞诱导棕色脂肪细胞的培养基,可以使用添加了1nMT3,1μm罗格列酮、0.5mM异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM。作为用于从角质细胞诱导棕色脂肪细胞的培养基,可以使用添加了1nMT3、1μm罗格列酮、0.5mM异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素的HuMedia-KG2。
但不限于这些。
作为PPAR-γ激动剂,可例示罗格列酮、环格列酮、GW1929、nTZDpa、吡格列酮盐酸盐、曲格列酮等噻唑烷二酮化合物。
作为用于诱导间充质干细胞的培养基,例如可以使用下述的文献(1-1)~(1-4)中记载的培养基,但不限于这些。
(1-1)M.D.Hoffman and D.S.W.Benoit,J Tissue Eng Regen Med.2013Apr1.doi:10.1002/term.1736
(1-2)C-Y Li,等人,Stem Cell Res Ther.2015Apr 13;6:55.doi:10.1186/s13287-015-0066-5.
(1-3)B.Gharibi and F.J.Hughes,Stem Cells Transl Med.2012Nov;1(11):771-82.doi:10.5966/sctm.2010-0031.Epub 2012Oct 23
(1-4)S.K.Both等人.Tissue Eng.2007Jan;13(1):3-9.
(1-5)F.Ng等人,Blood.2008Jul 15;112(2):295-307.doi:10.1182/blood-2007-07-103697.Epub 2008Mar 10.
(1-6)Hynes K等人,J Dent Res.2013Sep;92(9):833-9。
作为用于诱导软骨细胞的培养基,可以使用公知的那些。可以使用下述的文献(2-1)~(2-4)中记载的培养基,但不限于这些。
(2-1)H.Outani,等人,PLOS One,8(10):e77365.doi:10.1371/journal.pone.0077365
(2-2)G.-I.Im,等人.Tissue Engineering.March 2006,12(3):527-536.doi:10.1089/ten.2006.12.527.
(2-3)H-J.Kim and G.-I.Im,Journal of Orthopaedic Research,Volume 27,Issue 5,pages 612-619,May 2009
(2-4)A.M.Ibrahim等人,Microscopy Research and Technique,Volume 78,Issue 8,pages 667-675,August 2015。
作为用于诱导成肌细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用添加了5%FBS、50ug/ml牛胎球蛋白、10nG/ml hEGF、1nG/ml bFGF、10ug/mL胰岛素、0.4ug地塞米松的Ham's/F10培养基;添加了10%FBS、10uM 5-氮杂胞嘧啶核苷(azacytidine)、10ng/mLVEGF、10ng/mL IGF-1、10ng/mL bFGF的DMEM培养基;添加了5%马血清10ng/mL的αMEM培养基等。另外,例如可以使用文献:Int J Mol Med.2014Jan;33(1):160-70.doi:10.3892/ijmm.2013.1555.Epub 2013Nov 13.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导神经细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用[1]添加了1uM视黄酸(RA)、5uM FSK的DMEM培养基,[2]添加了1uM RA、5uM FSK、10ng/mL bFGF的DMEM培养基,[3]添加了1uM RA、1uM FSK、10ng/mL bFGF、100ng/mL SHH的DMEM培养基,第1~3天使用[1],第4~5天使用[2],第6天以后使用[3]。另外,例如可以使用文献:Yan Y等人,Stem Cells Transl Med.2013Nov;2(11):862-70.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导胶质细胞和神经细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用文献:L.Hook等人,Neurochemistry International.Volume 59,Issue 3,September2011,Pages 432-444、Selvaraj V等人,Front Biosci(Landmark Ed).2012Jan 1;17:65-89.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导胶质细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用文献:Duan L等人,Stem Cells Transl Med.2015May;4(5):437-47.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导施万细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用在添加了10%FBS(胎牛血清)的DMEM培养基(Dulbecco修饰Eagle培养基(Dulbecco's ModiedEagle's Medium))等普通培养基中,包含1~20μm左右(特别是5μm左右)的forskolin;2~50ng/ml左右(特别是10ng/ml左右)的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子,basic fibroblastgrowth factor);2~50ng/ml左右(特别是10ng/ml左右)的PDGF(Platelet-DerivedGrowth Factor);50~1000ng/ml左右(特别是200ng/ml左右)的人类神经调节蛋白-β1(human neuregulin-β1)(别名heregulin,GGF(Glial growth factor))等成分中的一种或两种以上(优选为全部)的培养基(施万细胞诱导培养基)(以上浓度均为终浓度)。作为一例,可以使用下述文献(3-1)~(3-2)中记载的培养基(可从未分化脂肪干细胞诱导施万细胞的培养基)。
(3-1)Kingham PJ,DF Kalbermatten,D Mahay等人:Adipose-derived stemcells differentiate into a Schwann cell phenotype andpromote neuriteoutgrowth in vitro.ExpNeurol,2007;207:267-274.
(3-2)Liu Y,Zhang Z,Qin Y,Wu H,Lv Q,Chen X,Deng W:A new method forSchwann-like cell differentiation of adipose derived stem cells.NeurosciLett.2013Sep 13;551:79-83.。
作为用于诱导心肌细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用文献:Y.J.Nam等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2013Apr 2;110(14):5588-93.doi:10.1073/pnas.1301019110.Epub 2013Mar 4.中记载的培养基。但不限于这些。
作为用于诱导血管内皮细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用添加了10%FBS、100ng/mL VEGF的DMEM。另外,可以利用Chatterjee I等人,Methods MolBiol.2015Feb 17.PMID:25687301中记载的方法进行。但不限于这些。
作为用于诱导平滑肌细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以利用Wang Y等人,Biomaterials.2014Oct;35(32):8960-9.中记载的方法进行。但不限于这些。
作为用于诱导肥大细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如:可以使用[1]添加了15%FBS、20ng/mL VEGF的DMEM培养基,[2]添加了10%FBS、10ng/mL IL-3、100ng/mL IL-6、10ng/mL Flt3L、10ng/mL TPO、10ng/mL VEGF的IDMD培养基,[3]添加了10%Stem span、100ng/mL SCF、100ng/mL IL-6、10ng/mL Flt3L、10ng/mL TPO、10ng/mL VEGF的IDMD,第1~8天使用[1],第9~18天使用[2],第19日以后使用[3]。但不限于这些。
作为用于诱导β细胞(胰岛素生成细胞)的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用添加了15%FBS、100ng/mL Activin A、10nM GLP-1、10mM烟酰胺、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF、ITS的DMEM。另外,可以使用Shahjalal HM等人,J Mol Cell Biol.2014Oct;6(5):394-408.、Noguchi H.et a.,Curr Diabetes Rev.2010May;6(3):184-90.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导肝细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Y.Yu等人,Stem Cell Res.2012Nov;9(3):196-207中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导消化道的细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Spence JR等人,Nature.2011Feb 3;470(7332):105-9.、Wells JM and SpenceJR.Development.2014Feb;141(4):752-60.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导肺和气管的细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Ghaedi M等人,J Clin Invest.2013Nov;123(11):4950-62.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导尿路上皮细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Osborn S.L等人,Stem Cells Transl Med.2014;3(5):610-619.、Kang M等人,Int.J.Mol.Sci.2014,15(5),7139-7157中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导肾脏的细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用LamAQ,等人.Semin Nephrol.2014Jul;34(4):445-61.、Lam AQ,and Bonventre JV.Curr OpinOrgan Transplant.2015Apr;20(2):187-92.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导造血干细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用WangY,等人,Proc Natl Acad Sci USA.2005;102:19081-6.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导血液细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用NakayamaN等人,Blood.1998Apr 1;91(7):2283-95.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导淋巴细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Carpenter L等人,Blood.2011Apr 14;117(15):4008-11.、Vodyanik MA,等人,Blood.2005;105:617-26.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导成红细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Lu SJ,等人,Blood.2008;112:4475-84.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导巨核细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用TakayamaN.and Eto K.Methods Mol Biol.2012;788:205-17.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导树突细胞、巨噬细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Senju S等人,Gene Ther.2011Sep;18(9):874-83.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导粒细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用MorishimaT等人,J Cell Physiol.2011May;226(5):1283-91.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导视网膜细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用MaedaT等人,J Biol Chem.2013Nov 29;288(48):34484-93中记载的培养基。但并不限于这些。
作为用于诱导角膜细胞的培养基,可以使用公知的那些。例如,可以使用Yu D等人,Cell Biol Int.2013Jan;37(1):87-94.中记载的培养基。但并不限于这些。
作为普通培养基,例如可以使用:Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、EMEM(Eagle's minimal essential medium)等普通液体培养基。可以根据需要而添加血清成分胎牛血清(Fetal Bovine Serum(FBS)、人血清(Human Serum)(血清))、链霉素、青霉素等抗生素/非必需氨基酸等成分。
TGF-β通路抑制剂
在本发明的方法中,将在用于诱导其它体细胞的培养基中,在TGF-β通路抑制剂的存在下培养。
术语“TGF-β通路抑制剂”,包括TGF-β/SMAD通路抑制剂、TGF-β/Erk通路抑制剂、TGF-β/JNK通路抑制剂、TGF-β/p38通路抑制剂及TGF-β/RhoA通路抑制剂。即,抑制以下中任一项以上的抑制剂为本发明的TGF-β抑制剂:TGF-β受体家族的分子、作为其配体的TGF-β超家族的细胞因子、在TGF-β受体家族的分子的下游构成TGF-β/SMAD通路、TGF-β/Erk通路、TGF-β/JNK通路、TGF-β/p38通路、TGF-β/RhoA通路的分子。
“TGF-β通路抑制剂”不仅包括作为狭义的抑制剂的低分子化合物,也包括:细胞因子的中和抗体;受体的拮抗剂;可溶性受体;具有与通路的蛋白质结合而阻碍其作用的活性的抗体、适体、肽;作为显性负性而运作的突变体蛋白质、肽、其类似体;抑制通路的蛋白质的表达的siRNA、shRNA、microRNA等。
TGF-β/SMAD通路抑制剂
TGF-β/SMAD通路抑制剂是指可抑制属于TGF-β/SMAD通路的蛋白质的活性的化合物。TGF-β/SMAD通路示意地示于图16(引用自Chen g等人,Int J Biol Sci,2012),对本领域技术人员而言为公知的信号路径。
TGF-β/SMAD通路主要由以下构成:由属于TGF-β超家族蛋白质构成的配体(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活素-βA、激活素-βB、激活素-βC、激活素-βE、nodal、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10、BMP15,GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、AMH(MIS)等)、属于构成异源二聚体型的受体的TGF-βI型受体家族的蛋白质及属于TGF-βII型受体家族的蛋白质,以及属于作为细胞内的信号转导分子(效应子)的SMAD家族的蛋白质(特别是SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD1、SMAD5或SMAD8)。
在TGF-β/SMAD通路中,在配体与二聚体型的受体结合时,作为激酶型受体的TGF-βI型受体蛋白质将SMAD蛋白质磷酸化而向下游传递信号。因此,在本说明书中,将抑制TGF-β超家族的细胞因子、TGF-βI型受体家族、TGF-βII型受体家族、SMAD家族蛋白(特别是SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD1、SMAD5或SMAD8)中的任一种的分子称为TGF-β/SMAD通路抑制剂。
作为TGF-β/SMAD通路抑制剂的实施方式之一,可例示属于TGF-βI型受体家族(也称为激活素受体样激酶(ALK)家族)的ALK蛋白质(ACVRL1(ALK1)、ACVR1(ALK2)、BMPR1A(ALK3)、ACVR1B(ALK4)、TGFBR1(ALK5)、BMPR1B(ALK6)、ACVR1C(ALK7))的抑制剂(ALK抑制剂)。另外,可例示属于TGF-βII型受体家族的蛋白质(ACVR2A(ACTRII)、ACVR2B(ACTRIIB)、TGFBRII(AAT3)、BMPR2(PPH1))的抑制剂。
具体而言,可例示:作为ALK5的抑制剂的D4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二噁烷-6-基)-5-(2-吡啶基)1H-咪唑-2-基]-苯酰胺)、ALK5抑制剂II(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶;别名RepSox)、GW788388、SD-208(2-(5-氯-2-氟苯)-4-[(4-吡啶基)氨基]蝶啶);作为ALK5和TGFBRII(AAT3)的抑制剂的LY2109761、LY2157299(Galunisertiv、4-[5,6-二氢-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉甲酰胺)、LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉);作为ALK4及ALK5的抑制剂的SM16(4-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-4-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)双环[2.2.2]辛烷-1-甲酰胺)、EW-7197、SB525334((6-[2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]-喹喔啉);作为ALK4、ALK5及ALK7抑制剂的SB431542(4-[4-(1,3-苯并二噁茂-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、SB505124、A83-01;作为ALK2及ALK3的抑制剂的LDN-193189、PKC-412、芹菜素(Apigenin)、DMH1、ML347;作为ALK1及ALK2的抑制剂的LDN-214117;作为ALK1、ALK2及ALK3的抑制剂的LDN-212854;作为ALK1、ALK2、ALK3及ALK6的抑制剂的K02288。
作为TGF-β/SMAD通路抑制剂,也可以使用Gellibert,F等人.J.Med.Chem.2004,47,4494-4506中记载的以下述式(1)或(2)表示的化合物或其的盐。
[化学式1]
[式中,X为CH或N。
R1为H、甲基或卤素(例如:氟、氯、溴或碘)。
R2为H或甲基。]
作为ALK抑制剂,从效果较高的观点出发,优选至少具有对ALK5的抑制活性的ALK抑制剂(ALK5抑制剂)。从效果特别高的观点出发,优选具有对ALK4及ALK5、或ALK5的特异性抑制活性的那些(在ALK蛋白质中,对该蛋白质的抑制活性明显较高)。
作为优选的ALK抑制剂的具体例,可示例D4476、SB431542、SD208、LY2157299及ALK5抑制剂II,特别优选ALK5抑制剂II。D4476、SB431542、SD208及ALK5抑制剂II的使成纤维细胞转换为成骨细胞的效率较高。LY2157299及ALK5抑制剂II的使成纤维细胞转换为棕色脂肪细胞的效率较高。
作为TGF-β/SMAD通路抑制剂的另外的实施方式,可例示SMAD蛋白质的抑制剂。其中,优选为位于ALK5的下游的SMAD2及SMAD3的抑制剂,进一步优选为SMAD4的抑制剂。
TGF-β/ERK通路抑制剂
TGF-β/ERK通路抑制剂是指可抑制属于TGF-β/ERK通路的蛋白质的活性的化合物。TGF-β/ERK通路示意地示于图17(引用自Y.E.Zhang,“Non-smad pathways in TGF-βsignaling”Cell Research 19:128,2009),对本领域技术人员而言为公知的信号路径。
TGF-β/Erk通路主要由以下构成:由属于TGF-β超家族的蛋白质构成的配体(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活素-βA、激活素-βB、激活素-βC、激活素-βE、nodal、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10、BMP15、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、AMH等);属于构成异源二聚体型的受体的TGF-βI型受体家族的蛋白质及属于TGF-βII型受体家族的蛋白质,以及作为细胞内的信号转导分子的Raf、MEK1/2、Erk1/2蛋白质。
在TGF-β/Erk通路中,在配体与二聚体型的受体结合时,向Raf、MEK1/2、Erk1/2和下游传递信号。因此,在本说明书中,将抑制以下中任一个的分子称为TGF-β/Erk通路抑制剂:TGF-β超家族的细胞因子、TGF-βI型受体家族、TGF-βII型受体家族、Raf、MEK1/2、Erk1/2。
作为TGF-β/Erk通路抑制剂的实施方式之一,可例示上述ALK蛋白质的抑制剂。
作为TGF-β/Erk通路抑制剂的另外的实施方式,可例示Raf的抑制剂、MEK1的抑制剂、MEK2的抑制剂、Erk1的抑制剂及Erk2的抑制剂的抑制剂。其中,优选为Erk1的抑制剂、Erk2的抑制剂。
TGF-β/JNK通路抑制剂
TGF-β/JNK通路抑制剂是指可抑制属于TGF-β/JNK通路的蛋白质的活性的化合物。TGF-β/JNK通路示意地示于图18(引用自Y.E.Zhang,“Non-smad pathways in TGF-βsignaling”Cell Research 19:128,2009),对本领域技术人员而言为公知的信号路径。
TGF-β/JNK通路主要由以下构成:由TGF-β超家族的蛋白质构成的配体(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活素-βA、激活素-βB、激活素-βC、激活素-βE、nodal、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10,BMP15、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、AMH等),属于构成异源二聚体型的受体的TGF-βI型受体家族的蛋白质及属于TGF-βII型受体家族的蛋白质,以及作为细胞内的信号转导分子的TAB1/2、TAK1、TRAF6、MKK4、JNK蛋白质。
在TGF-β/JNK通路中,在配体与二聚体型的受体结合时,向TAB1/2、TAK1、TRAF6、MKK4、JNK和下游传递信号。因此,在本说明书中,将抑制以下中任一个的分子称为TGF-β/JNK通路抑制剂:TGF-β超家族的细胞因子、TGF-βI型受体家族、TGF-βII型受体家族、TAB1/2、TAK1、TRAF6、MKK4、JNK。
作为TGF-β/JNK通路抑制剂的实施方式之一,可例示上述ALK蛋白质的抑制剂。
作为TGF-β/JNK通路抑制剂的另外的实施方式,可例示TAK1的抑制剂、MKK4的抑制剂及JNK的抑制剂。其中,优选为JNK的抑制剂。
TGF-β/p38通路抑制剂
在本发明的方法中,将在用于诱导其它体细胞的培养基中,在TGF-β/p38通路抑制剂的存在下进行培养。
TGF-β/p38通路抑制剂是指可抑制属于TGF-β/p38通路的蛋白质的活性的化合物。TGF-β/p38通路示意地示于图18(引用自Y.E.Zhang,“Non-smad pathways in TGF-βsignaling”Cell Research 19:128,2009),对本领域技术人员而言为公知的信号路径。
TGF-β/p38通路主要由以下构成:由TGF-β超家族的蛋白质构成的配体(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活素-βA、激活素-βB、激活素-βC、激活素-βE、nodal、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10,BMP15、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、AMH等),属于构成异源二聚体型的受体的TGF-βI型受体家族的蛋白质及属于TGF-βII型受体家族的蛋白质,以及作为细胞内的信号转导分子的TAB1/2、TAK1、TRAF6、MKK3、MKK6、属于p38家族的蛋白质。
在TGF-β/p-38通路中,在配体与二聚体型的受体结合时,向TAK、MKK3或MKK6、p-38家族(特别是p-38α、p-38β)传递信号至下游。因此,在本说明书中,将抑制以下中任一个的分子称为TGF-β/SMAD通路抑制剂:TGF-β超家族的细胞因子、TGF-βI型受体家族、TGF-βII型受体家族、TAB1/2、TAK1、TRAF6、MKK3、MKK6、p38家族蛋白(特别是p38α、p38β)。
作为TGF-β/p38通路抑制剂的实施方式之一,可例示上述ALK蛋白质的抑制剂。
作为TGF-β/p38通路抑制剂的另外的实施方式,可列举:TAK1的抑制剂、MKK3的抑制剂、MKK6的抑制剂、p38的抑制剂。其中,优选为p38的抑制剂。
TGF-β/RhoA通路抑制剂
在本发明的方法中,在用于诱导其它体细胞的培养基中,TGF-β/RhoA通路抑制剂的存在下进行培养。
TGF-β/RhoA通路抑制剂是指可抑制属于TGF-β/RhoA通路的蛋白质的活性的化合物。TGF-β/RhoA通路示意地示于图19(引用自Y.E.Zhang,“Non-smad pathways in TGF-βsignaling”Cell Research 19:128,2009),对本领域技术人员而言为公知的信号路径。
TGF-β/RhoA通路主要由以下构成:由属于TGF-β超家族的蛋白质构成的配体(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活素-βA、激活素-βB、激活素-βC、激活素-βE、nodal、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10、BMP15、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、AMH等);属于构成异源二聚体型的受体的TGF-βI型受体家族的蛋白质及属于TGF-βII型受体家族的蛋白质,以及作为细胞内的信号转导分子的Par6、PKCζ、Smurf1、RhoA蛋白质。
在TGF-β/RhoA通路中,在配体与二聚体型的受体结合时,向TAK、MKK3或MKK6、p-38家族(特别是p-38α、p-38β)传递信号至下游。因此,在本说明书中,将抑制以下中任一个的分子称为TGF-β/RhoA通路抑制剂:TGF-β超家族的细胞因子、TGF-βI型受体家族、TGF-βII型受体家族、Par6、PKCζ、Smurf1、RhoA。
作为TGF-β/RhoA通路抑制剂的实施方式之一,可例示上述ALK蛋白质的抑制剂。
作为TGF-β/RhoA通路抑制剂的另外的实施方式,可列举RhoA的抑制剂、PAK的抑制剂。其中,优选为RhoA的抑制剂。
作为TGF-β通路抑制剂的优选例,可列举抑制以下中任一项以上的抑制剂:ALK5或作为其配体的TGF-β家族的细胞因子、及在ALK 5的下游中构成TGF-β/SMAD通路、TGF-β/Erk通路、TGF-β/JNK通路、TGF-β/p38通路或TGF-β/RhoA通路的分子。
当然,也可以为抑制2个以上的通路的抑制剂。抑制TGF-β受体家族的分子、或其配体为TGF-β超家族的细胞因子的抑制剂,因抑制TGF-β通路中的多个通路,故优选。
作为TGF-β通路抑制剂,只要是公知的TGF-β通路抑制剂即可,没有限制。今后开发的TGF-β通路抑制剂全部包括于本发明的TGF-β通路抑制剂中。
TGF-β通路抑制剂也包括上述化合物的衍生物。例如,可以使用WO00/61576号中记载的D4476的衍生物。
“在TGF-β通路抑制剂的存在下”是指在培养基中主要包含TGF-β通路抑制剂的实施方式,在不会破坏本发明的效果范围内不限于此。TGF-β通路抑制剂在培养基中的浓度,可以由本领域技术人员适当设定。通常为0.01μm~100μm左右、特别是0.1μm~10μm左右。
TGF-β通路抑制剂可以一种单独或两种以上组合使用。
另外,在不会破坏本发明的效果的范围中,可以与其它化合物组合使用。例如,从制备目标的体细胞的效率较高的观点出发,可以组合使用TGF-β通路抑制剂与他汀化合物。
作为他汀化合物,广泛包括HMG-CoA还原酶抑制剂,没有特别限定,可列举例如:辛伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、西伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀、二氢康帕丁、康帕丁、贝伐他汀、卡伐他汀、克利伐他汀、达伐他汀、格仑伐地汀、Fluindostatin、Velostatin、美伐他汀、利伐他汀、西立伐他汀、CI-981等。今后开发的他汀化合物全部包括于本发明的他汀化合物中。
在本发明的优选实施方式中,除了上述培养基的成分以外所使用的TGF-β通路抑制剂及其它化合物的数量为10种以下、更优选为4种以下、进一步优选为3种以下、特别优选为一种或两种。
培养
在本发明的方法中,将哺乳动物的已分化的体细胞在诱导培养基中,在TGF-β通路抑制剂的存在下培养。
培养可以在用于容纳细胞及培养基的适当的容器中进行。作为优选的进行培养的方法,可例示在约37℃左右及二氧化碳浓度约5%左右的条件下进行培养的方法,但并不限定于此。在上述条件下的培养例如可以使用公知的CO2培养箱进行。
对进行培养的时间而言,在不损伤本发明的效果的范围内即可,没有特别的限定。例如可以为从24小时至60天左右,优选为3~30天、更优选为10~20天左右、特别优选为14天左右。
TGF-β通路抑制剂可以仅于整个培养期间中的一部分时期进行添加。
从效果较高的观点出发,在整个培养期间中,可以在给定时间(例如6~10天左右、特别是8天左右)在诱导培养基中并在上述化合物的存在下进行培养,之后在诱导培养基中并在上述化合物的非存在下进行培养。这种情况下的在上述化合物的存在下的培养,在整个培养期间中,可以从培养开始时进行,也可以在给定时间在上述化合物的非存在下进行培养后进行。
特别是在制备棕色脂肪细胞的情况下,可以通过以下有效地制备棕色脂肪细胞:在整个培养期间中,从培养开始的给定时间(例如6~10天左右、特别是8天左右)在诱导培养基中在上述化合物的存在下进行培养,之后在诱导培养基中在上述化合物的非存在下进行培养。
另外,也可以将哺乳动物的已分化的体细胞,在普通培养基中在TGF-β通路抑制剂的存在下培养后,再于诱导培养基中在TGF-β通路抑制剂的非存在下进行培养。另外,也可以在普通培养基中在TGF-β通路抑制剂的存在下培养后,在普通培养基中在TGF-β通路抑制剂的非存在下进行培养,之后在诱导培养基中在TGF-β通路抑制剂的非存在下进行培养。另外,也可以在普通培养基中在TGF-β通路抑制剂的存在下培养后,在诱导培养基中在TGF-β通路抑制剂的存在下培养,之后在诱导培养基中在TGF-β通路抑制剂的非存在下进行培养。像这样,只要包括在TGF-β通路抑制剂存在下进行培养,和在诱导培养基中进行培养这两个过程,则它们可以不同时进行,也可以各自仅占整个培养期间的一部分。
在培养中,必要时可以进行传代。在进行传代的情况下,在达到融合状态前或在达到后立即回收细胞,将细胞接种至新的培养基。另外,在本发明的培养中可以适当更换培养基。
另外,即使没有完全转换完毕,也可以将回收培养的途中的细胞并用于移植。在该情况下,可以期待通过本发明的方法引起对转换的触发,发生不可逆的表观基因组的变化,从而细胞在移植后转换为目标的细胞。
这样,制备了目的体细胞。
目的体细胞的制备,可以通过检测标记等公知的方法来证实。
在以下描述了其的例子,但均不限于仅用一个标记即可确定,优选将数个标记的检测进行组合来证实。
也可以如下进行目的体细胞的制备的评价:进行制备的体细胞的转录分析等mRNA表达的汇总的分析、蛋白质组分析等蛋白质表达的汇总的分析等,与源自活体的目的体细胞的分析结果进行比较。
例如,成骨细胞的获得可以通过以下进行确认:ALP(碱性磷酸酶)基因、骨钙素(Osteocalcin,OC)基因、骨桥蛋白(Osteopontin)基因、Runx2基因的mRNA的基于实时PCR是测定、基于茜素红S的染色(矿化(矿物化)的骨基质的产生)等。需要说明的是,在本说明书中,前成骨细胞、不成熟成骨细胞、成熟成骨细胞、骨细胞等也合称为“成骨细胞”。
白色脂肪细胞的获得可以通过以下进行确认:利用油红O染色、Bodipy染色进行染色、较大的单层性脂滴所具有的特有形态、FABP4基因、HS基因L、AdipoQ基因的表达。
棕色脂肪细胞的获得可以通过以下进行检测:利用油红O染色、Bodipy染色进行染色,多层性脂滴具有的特有的形态、UCP-1基因、CIDEA基因、KCNK3基因、PCG-1α基因、Cox8b基因、Otop基因、ELOVL3基因等的表达。其中,UCP-1(解偶联蛋白1,Uncoupling protein 1)是在棕色脂肪细胞中特异性表达的基因,认为其编码氧化地磷酸化解偶联的线粒体内膜蛋白质,担任棕色脂肪细胞的功能的基础,因此是作为棕色脂肪细胞的指标的特别优选中之一。
软骨细胞的获得可以通过以下进行检测:例如SOX9基因、COL2A1(II型胶原)基因、aggrecan基因、COL11A1(XI型胶原)基因、MMP13基因的表达、软骨基质的产生、阿辛蓝染色、甲苯胺蓝染色、番红花O染色等。
成肌细胞的获得可以通过以下进行检测:例如MyoD基因、肌细胞生成素基因、Myf5基因、MRF4基因的表达;骨骼肌型α肌动蛋白蛋白质、骨骼肌型肌球蛋白的表达,肌所特有的形态(多核、肌纤维的形成、肌管的形成)、收缩性等。
心肌细胞的获得可以通过以下进行检测:例如肌钙蛋白T(cTnT)蛋白质、原肌球蛋白、心肌型α肌动蛋白蛋白质、心肌型肌球蛋白的表达;ATP2A2基因、GJA1基因、GJA5基因、NPPA基因、NPPB基因的表达,自主收缩性等。
平滑肌细胞的获得可以通过以下进行检测:例如α平滑肌肌动蛋白(αSMA)蛋白质、平滑肌肌球蛋白的表达。
间充质干细胞(MSC)的得到可以通过以下进行检测:被抗Stro-1、抗CD90、抗CD106、抗CD105、抗CD146、抗CD166、抗CD44抗体所染色,不被抗CD19、抗CD45抗体所染色等,使用多个抗体的细胞表面抗原的表达模式。另外,可以检查MASP1基因、FOSB基因的表达、Nestin蛋白质、CXCL12蛋白质、PDGF受体α/Sca-1蛋白质、CD51/PDGF受体α蛋白质等的表达而综合地判定。进一步可以通过向各种间充质类细胞的分化能力进行检测。
神经细胞的获得可以通过以下进行检测:例如Tuj1蛋白质、vGLUT1蛋白质、MAP2蛋白质的表达、形态,神经传递物质的合成、动作电位。
胶质细胞的获得可以通过以下进行检测:例如在少突神经胶质的情况下通过olig2蛋白质,星形胶质细胞的情况下通过GFAP蛋白质,小胶质细胞的情况下通过OX42蛋白质的表达进行检测。
施万细胞的获得可以通过以下进行检测:形态(具有比较小型的核的双极性或多极性的细胞形态,细胞宽度和细胞长度的比。)、S100β、p75NTR、GFAP、Nestin、NG2等施万细胞特异性的标记的表达的检测,对共培养的神经细胞的神经突起伸长的效果、髓鞘形成能力。
肝细胞的得到例如可以通过以下进行检测:白蛋白、细胞色素P450的表达、各种酶活性、药品的代谢、LDL摄取等功能。
胆管上皮细胞的获得可以通过以下进行检测:例如AFP(-)、Dlk(-)、Alb(-)、CK19(+)、zEpCAM(+)、Thy1(-)这样的性质。
血管内皮细胞得到可以通过以下进行检测:例如CD31抗原的表达、内皮因子、VE钙粘蛋白(VE-cadherin)、VWF、TIE2、ANGPT2的表达。
淋巴内皮细胞的获得可以通过以下进行检测:例如D2-40抗原的表达、平足蛋白(Podoplanin)、LYVE-1、PROX-1的表达。
肌腱细胞的获得可以通过以下进行检测:例如Scleraxis(Scx)和腱调蛋白(tenomodulin)(Tnmd)的表达。
成纤维细胞可以利用COL1A1、COL1A2的基因表达等来确认。
骨髓间质细胞可以从细胞表面标记的表达、基因表达等来确认。
淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞、造血干细胞、肥大细胞等的得到,也可以从细胞表面标记的表达、基因表达等来确认。
尿路上皮细胞的获得可以通过以下进行检测:例如尿溶蛋白1b、尿溶蛋白2、CK5、CK17的基因表达,不对称的单位膜(Asymmetric Unit Membrane)的形成等。
治疗或预防剂;移植材料
通过本发明的方法制备的体细胞可以通过移植至活体而用于各种疾病或状态的预防或治疗。在本说明书中,如果没有特别说明,则术语“治疗”意指患者在患有特定的疾病或障碍的期间进行的处理,由此而减轻疾病或障碍的严重程度、或减轻一个或多个其症状、或延迟或减速疾病或障碍的发展。本说明书中,在术语“治疗”中包括“预防”。
移植材料是指将体细胞导入活体内的材料。移植材料包括在体外制备体细胞后,移植至相同或另外的个体的材料。另外,将目的体细胞在体外诱导至分化途中,移植后在体内中诱导向最终目标的体细胞的移植材料,也包括于本发明中。
例如,作为使用成骨细胞治疗的对象的疾病,可列举:骨肿瘤、外伤、骨髓炎等伴随的骨缺损或骨肿瘤等刮治后的骨缺损、骨折、骨质疏松症、牙周病、牙槽骨吸收、唇腭裂、类风湿性关节炎、突发性股骨头坏死、变形性关节症、腰椎峡部畸形症(lumbar spondylosisdeformans)、椎管狭窄症、椎间盘突出症、峡部裂(spondylolysis)、脊椎松解型滑脱症、脊柱侧弯症、脊髄型颈椎病、后纵韧带骨化症、脊髓损伤、变形性髋关节症(coxarthrosis)、变形性膝关节症(gonarthrosis)、股骨头滑脱症、骨软化症、下颌骨重建等因复杂骨折而受到破坏的骨折部位的重建术、手术后的骨的修复(心脏手术后的胸骨的修复等)、人工踝关节手术伴随的缺陷部的修复、骨髓炎、骨坏死(osteonecrosis)等。另外,如果移植成骨细胞,则有与骨移植、人工骨移植、人工关节、植入组合使用而提高治疗效果的可能性。另外,也可以将成骨细胞用三维的支架等进行培养而在体外制作各种形态的骨组织,通过移植该骨组织,进行上述疾病的治疗。除此以外,也将与成骨细胞的缺陷、不足或功能降低相关的各种疾病作为对象。
不限于疾病的治疗,也可以用于美容目的。例如,可以通过在由于事故、手术等而缺陷的部位移植成骨细胞或由其制成的骨组织,从而使骨基质产生而修复缺陷部位,使其丰满而变得不明显。为本说明书中便利起见,将此时对人的处理也称为治疗,可以将“患者”替换为“健康的人”或“人”,将“疾病”替换为“美容”。
可以将成骨细胞作为细胞制剂而移植给患者,也可以与包括羟基磷灰石、活体吸收性陶瓷等人工材料的基体材料(支架(scaffold))一起进行移植,或与支架一起培养后进行移植。在这些情况下,支架可以根据移植目的而做成各种三维的形状。
另外,棕色脂肪细胞可以用于肥胖、代谢综合征、或者与它们相关的疾病或状态的预防或治疗。在目的疾病中包括:I型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病性并发症(视网膜症、周围神经病变、肾病、大血管病变、糖尿病坏疽、骨质疏松、糖尿病昏迷等)、糖耐量受损、胰岛素抵抗、酸中毒、酮症、酮症酸中毒、肥胖、中心型肥胖和其并发症、内脏肥胖综合征、高血压、饭后高脂血症、脑血管疾病、动脉硬化症、粉瘤性动脉硬化症、代谢综合征、脂质异常症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL血症、肾脏疾病(糖尿病肾病、肾病综合征等)、动脉硬化症、血栓性疾病、心肌梗塞、缺血性心脏病、心绞痛、心力衰竭、脑血管障碍(脑梗塞、脑中风等)、外周循环障碍、感觉障碍、高尿酸血症、痛风、感染性疾病(呼吸道感染、尿路感染、消化道感染、皮肤感染、软组织感染等)、恶性肿瘤、白内障、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、骨质疏松。可认为通过基于棕色脂肪细胞的脂质的燃烧和糖、脂质代谢异常的改善,可得到对这些疾病的预防和治疗效果。
另外,棕色脂肪细胞也可以使用于去除腹部、下巴周围、大腿等的脂肪的美容用途。棕色脂肪细胞也可以作为导入乳房等的美容措施的移植材料使用。
在给予棕色脂肪细胞时,脂肪量特别是内脏脂肪、皮下脂肪等白色脂肪细胞减少,另外,即使在摄取了高卡路里食物的情况下也抑制体重增加,因此在肥胖、代谢综合征、或者与它们相关的疾病或状态的预防和治疗这两者中有用。本发明还可以不限于疾病的预防或治疗,也用于促进健康、美容(例如腹部、下巴、手臂、大腿等内脏脂肪、皮下脂肪的除去)等目标。为本说明书中便利起见,将此时对人的处理也称为治疗,可以将“患者”替换为“健康的人”或“人”,将“疾病”替换为“促进健康、美容”等。
棕色脂肪细胞也可以作为导入乳房等的美容措施的移植材料使用。
对于白色脂肪细胞,可以通过在由外伤、烧伤、手术等造成的组织的缺陷部移植白色脂肪细胞而进行组织的形态的改善、感染的预防等。例如,可以通过在乳癌的摘出手术后的缺陷部移植白色脂肪细胞来重建乳房。另外,也可以作为美容措施的移植材料使用。
对于成肌细胞,认为可得到对Duchenne肌营养不良、肌营养不良、先天性/远端型肌病、肌强直性营养不良等肌强直综合征、线粒体病、周期性四肢麻痹等肌原性疾病、Werdnig-Hoffman病、Charcot-Marie-Tooth病、先天性髓鞘发育不全症、肌萎缩性侧索固化症(ALS)等神经源性肌疾病;皮肌炎、多肌炎、结节性多动脉炎、风湿病性多肌痛、混合性结缔组织病等胶原病;炎症性肌病、内分泌性肌病、由类固醇、高脂血症治疗药等引起的药品性肌病、肌肉减少症、进行性骨化性纤维发育不良(FOP)等的预防和治疗效果。
对于软骨细胞,认为可得到对骨关节炎、变形性软骨病、软骨营养不良关节炎、类风湿性关节炎、外伤、椎间盘损伤、半月板损伤、剥离性骨软骨炎、骨坏死、神经源性关节症等软骨疾病中观察到的软骨损伤、软骨缺陷等的预防和治疗效果。
对于间充质干细胞,认为可得到能从间充质干细胞分化而来的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞等有效的对上述众多疾病等的预防和治疗效果。
对于肌腱细胞,认为可得到对外伤、手术所伴随的肌腱的断裂等的预防和治疗效果。
对于神经细胞和胶质细胞,认为可得到对神经变性疾病(帕金森氏病、帕金森氏综合征、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索固化症、进行性核上性麻痹、亨廷顿氏病、Shy-Dragersyndrome综合征、黑质纹状体变性、橄榄桥脑小脑萎缩、脊髓小脑共济失调等)、皮质基底节变性、路易体病、张力障碍、Meige综合征、晚期小脑皮质萎缩、家族性痉挛性截瘫、运动神经元疾病、马查多-约瑟夫病、Pick病、脑中风、脑血管疾病、脱髓鞘疾病(多发性硬化、急性多发性神经炎、急性播散性脑脊髓炎、急性小脑炎、横贯性脊髓炎等)、脑肿瘤、感染所伴随的脑脊髓疾病(脑膜炎、脑脓肿、Creutzfeldt-Jakob病等)、外伤之后的神经功能障碍、由毒物、放射线等造成的神经疾病、精神疾病(精神分裂症、躁狂抑郁症等)、睡眠障碍(发作性睡病、原发性睡眠过度、复发性睡眠过度、特发性睡眠过度、失眠症等)、癫痫等的预防和治疗效果。
作为使用施万细胞治疗的目的疾病,可列举由脑梗塞、脊椎损伤等造成的中枢神经的缺陷或者损伤,外伤、神经炎、肿瘤的切除等所伴随的末梢神经的缺陷或者损伤;多发性硬化视神经脊髓炎(Devic综合征)、同心圆硬化症(Balo病)、急性播散性脑脊髓炎(acutedisseminated encephalomyelitis,ADEM)、炎症性弥漫性硬化症(Schilder病)、感染性亚急性固化症全脑炎(subacute sclerosing panencephalitis,SSPE)、进行性多灶性脑白质病(progressive multifocal leukoencephalopathy,PML)等中枢神经类的疾病;格林-巴利综合征、费雪综合征、慢性炎症性脱髓鞘多神经根炎等外周神经系统的疾病;Charcot-Marie-Tooth disease(CMT)等由施万细胞缺陷、不足或者功能降低造成的疾病等。
对于肝细胞和胆管上皮细胞,可认为可得到对肝功能衰竭、暴发性肝炎、肝硬化、脂肪性肝炎、代谢综合征等的预防和治疗效果。另外,有助于对肝的药物的毒性试验、代谢试验、安全性试验。另外,在对糖尿病、脂质异常症、代谢综合征、高血压等的药品的筛选、效果判定中有用。
认为肺和气管的细胞可得到原发性肺动脉高压、肺纤维化、肺气肿、支气管扩张症、肺结节病、间质性肺炎、囊性纤维化、弥漫性全细支气管炎、阻塞性全细支气管炎、肺嗜酸性肉芽肿病、慢性血栓梗塞症性肺动脉高压、多肺动静脉瘘等的预防和治疗效果。
认为肾脏的细胞可得到对肾衰竭、糖尿病性肾并、慢性肾小球肾炎、先天性肾发育不良、囊性肾、IgA肾症、肾硬化症、妊娠中毒症等的预防和治疗效果。
尿路上皮细胞对于以下有用:膀胱癌症中膀胱全摘的症例中的代用膀胱的形成、膀胱阴道瘘中尿路上皮有缺陷的部位的贴片的构建、对于神经原性膀胱中膀胱发生纤维化而萎缩的症例进行膀胱扩大术时,用于部分补偿的尿路上皮的形成,晚期间质性膀胱炎(尿路上皮的功能异常)的尿路上皮再生等。
认为心肌细胞可得到对心肌梗塞、缺血性心脏疾病、充血性心力衰竭,心肌炎、肥厚性心肌病、扩张型心肌症等的预防和治疗效果。
认为淋巴管内皮可得到对淋巴水肿等的预防和治疗效果。
平滑肌细胞在气管、消化道、血管的再生治疗时有用。
血管内皮细胞在血管的再生治疗时有用。
造血干细胞和骨髓间质细胞对骨髓衰竭、再生障碍性贫血、免疫缺陷有用。
淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突细胞对免疫缺陷症以及抗肿瘤免疫有用。巨核细胞对血小板减少有用。成红细胞对再生障碍性贫血有用。
另外,本发明不仅可用于人,也可以用于包括犬、猫等宠物动物、牛、马、猪、绵羊、鸡等家畜的疾病的治疗。该情况下,将“患者”或者“人”替换为“患畜”或者“动物”。
本发明不仅可以用于再生医疗,也可以用于针对各种疾病的药品(也包括生物学制剂、核酸医药)的开发,药品的副作用的评价、产生、病情明确等基础研究。
诱导剂
本发明也提供用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞的诱导剂,其包含TGF-β通路抑制剂。另外,也提供TGF-β通路抑制剂的用途,其用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞。
即,本发明提供TGF-β通路抑制剂的新型用途。
诱导剂可以为单独的TGF-β通路抑制剂,也可以为包含TGF-β通路抑制剂的组合物。在为组合物的情况下,可以进一步含有用于溶解TGF-β通路抑制剂的适当的溶剂(水、DMSO等)。
实施例
虽然在以下示出了实施例,但本发明不仅限定于该实施例。
以下示出了在实施例中使用的化合物的结构。
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
[化学式5]
以下,在本说明书中及图中,存在将“ALK5抑制剂II”记载为“ALK5抑制剂”、“ALK5IH”、“ALK5IHII”或“ALK5iII”的情况。
实施例1(图1)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以5×103细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基或添加了各化合物的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM中添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸酯、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第24天。
第24天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。之后,加入茜素红S染色液,于室温培养15分钟。染色后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤、进行拍摄。
各化合物的浓度如下所述:
D4476:2μm
ALK5抑制剂II:2μm
SB431542:2μm。
将结果示于图1。可知通过在添加了D4476、ALK5抑制剂II或SB431542的诱导培养基中培养,将人成纤维细胞转换为具有矿物化骨基质产生能力的成骨细胞。可知特别是ALK5抑制剂II,以最高的效率使成纤维细胞转换为成骨细胞。
对于TGF-β信号而言,已知其是成骨细胞的增殖、生存、分化和骨形成所必需的,在成骨细胞的分化和骨形成中促进性地运作(例如,文献:Kasagi and Chen,Cell&Bioscience 2013,3:4)。意外的结果是,通过本发明的方法可通过TGF-β通路的抑制而实现向成骨细胞的转换。
实施例2(图2)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDF)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以5×103细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入矿物化诱导培养基或添加了各化合物的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第24天。
第24天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次后,加入茜素红S染色液,于室温培养15分钟。染色之后的染色液回收至96孔板,通过吸光度计测定了吸光度(OD:550nm)。
各化合物的浓度如下所述:
D4476:2μm
SB431542:2μm
ALK5抑制剂II:2μm。
将结果示于图2。可知通过在添加了D4476、ALK5抑制剂II或SB431542的诱导培养基中培养,使人成纤维细胞转换为具有矿物化骨基质产生能力的成骨细胞。可知特别是ALK5抑制剂II,以最高的效率使成纤维细胞转换为成骨细胞。
实施例3(图3)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以5×103细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入矿物化诱导培养基或添加了各化合物的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第24天。
第24天从各孔吸除培养液,利用PBS洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、对骨钙素及碱性磷酸酶或β-actin基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。将骨钙素及碱性磷酸酶基因的mRNA水平相对于β-actin基因mRNA的比的形式进行定量,将仅用矿物化诱导培养基进行培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
各化合物的浓度如下所述:
D4476:2μm
SB431542:2μm
ALK5抑制剂II:2μm。
将结果示于图3。可知通过在添加了D4476、ALK5抑制剂II或SB431542的诱导培养基中培养,人成纤维细胞转换为表达骨钙素和碱性磷酸酶基因的成骨细胞。可知特别是ALK5抑制剂II,以最高的效率使成纤维细胞转换为成骨细胞。
实施例4(图4)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以5×103细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以500μL/孔加入普通培养基或添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第24天。
第24天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)进行洗涤。利用4%多聚甲醛固定之后,利用PBS(-)进行洗涤。利用PBS(-)洗涤3次后,加入Blocking One,于室温培养60分钟。
添加抗骨钙素抗体,于4℃过夜进行反应之后,利用Wash buffer洗涤3次。加入Alexa 488-偶联抗小鼠Ig抗体,于室温反应1小时后,利用Wash buffer洗涤5次。使用荧光显微镜以倍率200倍进行照片拍摄。
将结果示于图4。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的诱导培养基中培养,人成纤维细胞转换为产生骨钙素的成骨细胞。
实施例5(图5)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)或源自人脂肪的间充质干细胞(human adipose derived stem cells;ADSC)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以5×103细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基或添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM中添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第19天。
第19天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。之后,加入茜素红S染色液,于室温培养15分钟。染色之后的染色液回收至96孔板,通过吸光度计测定了550nm的吸光度(OD550)(图5下)。另外,利用灭菌蒸馏水洗涤染色后的孔,以1倍的倍率,及利用倒置显微镜以40倍的倍率进行拍摄(图5上)。
将结果示于图5。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的诱导培养基中培养,人成纤维细胞及源自脂肪的间充质干细胞转换为具有矿物化骨基质产生能力的成骨细胞。
实施例6(图6)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以5×103细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以500μL/孔加入普通培养基或添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM中添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第24天。
第19天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)进行洗涤。利用4%多聚甲醛固定之后,利用PBS(-)进行洗涤。利用PBS(-)洗涤3次后,加入Blocking One,于室温培养60分钟。
添加抗Runx2抗体,于4℃过夜进行反应之后,利用Wash buffer洗涤3次。加入Alexa 488-偶联抗小鼠Ig抗体,于室温反应1小时后,利用Wash buffer洗涤5次。使用荧光显微镜以倍率200倍进行照片拍摄。
需要说明的是,将在普通培养基中培养的细胞HDF、在添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基中诱导培养的细胞作为dOBs而示于图中。
将结果示于图6。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的诱导培养基中培养,人成纤维细胞转换为Runx2表达的成骨细胞。
实施例7(图7)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以10×103细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。于第四天吸除培养上清液,添加添加了50mM ALK5抑制剂II的诱导培养基(a)(下述)进行培养。第6天除去诱导培养基(a),添加添加了50mM ALK5抑制剂II的诱导培养基(b)(下述)继续培养。之后,在第9、12、14、16天,使用添加了50mM ALK5抑制剂II的诱导培养基(b),同样地反复进行培养基更换。
第20天,吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。利用Bodipy染色之后,利用灭菌蒸馏水洗涤孔,利用倒置显微镜以100倍、200倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图7。在相差和荧光图像中,均确认了包含较大的单层性脂滴的白色脂肪细胞,可知将源自人正常皮肤的成纤维细胞转换为白色脂肪细胞。
诱导培养基(a)及(b)的组成如下所述:
[诱导培养基(a)]
DMEM(高糖):500mL
胎牛血清(FBS):50mL
MEM非必需氨基酸溶液:5mL 100mM-丙酮酸钠溶液:5mL
青霉素-链霉素混合溶液:5mL胰岛素:170nM
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸:1nM
罗格列酮:1uM
IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤):0.5mM吲哚美辛:62.5nM
地塞米松:1uM
[诱导培养基(b)]
DMEM(高糖):500mL
胎牛血清(FBS):50mL
MEM非必需氨基酸溶液:5mL 100mM-丙酮酸钠溶液:5mL
青霉素-链霉素混合溶液:5mL胰岛素:170nM
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸:1nM。
实施例8(图8)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以2×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1000μL/孔加入添加了Cyclic Pifithrin-α或ALK5抑制剂II的软骨诱导培养基(StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit:ThermoFisherScientific公司制)。
2天一次,更换为新鲜的培养液,培养至第18天。
第18天从各孔吸除培养液,利用PBS洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、对Sox9及Aggrican或β-actin基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以Sox9及Aggrican基因的mRNA水平相对于β-actin基因mRNA的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
各化合物的浓度如下所述:
Cyclic Pifithrin-α:5μm
ALK5抑制剂II:2μm。
将结果示于图8。可以确认通过在ALK5抑制剂II的存在下,在软骨诱导培养基中进行培养,可以将源自人正常皮肤的成纤维细胞转换为表达Sox9和Aggrican基因的软骨细胞。已知Cyclic Pifithrin-α促进从成纤维细胞向iPS细胞的重编程,可知其不促进从成纤维细胞向软骨细胞的转换。
已知经由激活素的TGF-β受体信号正向控制MSC的增殖,TGF-β受体信号促进从MSC向成骨细胞、软骨细胞的分化(例如,文献:W.g.Li and X.X.Xu,Chin J Traumatol.2005;8(6):349-51.,文献:F.Ng等人,Blood.2008;112(2):295-307.)。意外的结果是,通过本发明的方法,可通过抑制TGF-β通路而实现向软骨细胞的转换。
实施例9(图9)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以2×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1000μL/孔加入软骨诱导培养基或添加了2μm ALK5抑制剂II的软骨诱导培养基。
2天一次,更换为新鲜的培养液,培养至第18天。该细胞利用PBS(-)洗涤2次后,以3%乙酸溶液洗涤1次,之后加入Nacalai tesque公司的PH2.5阿辛蓝染色液,于室温染色1小时。利用PBS(-)洗涤3次后,利用显微镜进行观察。
将结果示于图9。确认了通过在ALK5抑制剂II的存在下,在软骨诱导培养基中进行培养,可以将源自人正常皮肤的成纤维细胞转换向产生被染色为蓝色的软骨基质的软骨。
实施例10(图10)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以2×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1000μL/孔加入添加了2μm ALK5抑制剂II和2μm D4476的骨骼肌细胞增殖培养基(添加了5%FBS、50ug/ml牛胎球蛋白、10nG/ml hEGF、1nG/ml bFGF、10ug/mL胰岛素、0.4ug地塞米松的Ham's/F10培养基)。2天一次,更换为新鲜的培养液,培养至第28天。
第28天从各孔吸除培养液,利用PBS洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、对MyoD1及Myogenin或β-actin基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以MyoD1及Myogenin基因的mRNA水平相对于β-actin基因mRNA的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
结果如图10所示。可以确认通过在ALK5抑制剂II的存在下,在骨骼肌细胞增殖培养基中进行培养,可以使将源自人正常皮肤的成纤维细胞转换向表达Myogenin和MyoD1基因的成肌细胞。
实施例11(图11)
将人正常皮肤成纤维细胞株HDF,以5×103细胞/孔的浓度接种至24孔板(第0天)。次日,弃去各孔的培养液,更换为500μl/孔的新培养基。成骨细胞诱导培养基为向Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松添加了10%胎牛血清(FBS)而成。
如图中所示,向培养基进一步添加了作为他汀化合物的辛伐他汀(SS)或普伐他汀(PrS)(终浓度100nM)。
培养28天后,从各孔除去培养液,利用PBS(-)进行洗涤。利用ISOGEN II从回收细胞总RNA,使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix合成了cDNA。加入Real-time PCRMaster Mix和对人碱性磷酸酶(ALP)基因特异性的Taqman探针和引物,使用AB7300Real-time PCR system进行实时RT-PCR。
将结果示于图14,示出了将正常人成纤维细胞的值作为1的相对值。可知共同添加SS、PrS-D4476时,比D4476单独时进一步强烈地诱导了ALP表达。
实施例12(图12)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中所记载的那样以500μL/孔加入普通培养基、脂肪细胞诱导培养基或添加了化合物等的脂肪细胞诱导培养基。
脂肪细胞诱导培养基为添加了10%FBS的DMEM+MDI培养基(添加了0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松及1μg/mL胰岛素的10%FBS的DMEM)。
添加物的浓度如下所述:
T3:1nM
罗格列酮:1μm
D4476:2μm
Pifithrin alpha[p53抑制剂]:5μm
SB431542:2μm
ALK5抑制剂II:2μm。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第14天。
第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次后加入油红O染色液,于室温培养15分钟。之后利用灭菌蒸馏水进行洗涤,利用相位差显微镜以100倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图12。可知通过在T3及罗格列酮以外,添加D4476、SB431542、ALK5抑制剂II中的任一个进行培养,成纤维细胞转换为棕色脂肪细胞。
实施例13(图13)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中所记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、脂肪细胞诱导培养基、或添加了各化合物等的脂肪细胞诱导培养基。
脂肪细胞诱导培养基为添加了添加了10%FBS的DMEM+MDI培养基(添加了0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松及1μg/mL胰岛素的10%FBS的DMEM)。
添加物的浓度如下所述:
T3:1nM
罗格列酮:1μm
D4476:2μm
Pifithrin alpha[p53抑制剂]:5μm
SB431542:2μm
ALK5抑制剂II:2μm。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第14天。第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCRRT Master Mix从该RNA合成了cDNA。将该cDNA与Real-time PCR Master Mix、对CIDEA基因或β肌动蛋白基因特异性的引物与Taqman探针混合。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以CIDEA基因的mRNA水平相对于β肌动蛋白基因mRNA的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将其结果示于图13。可知通过除了T3及罗格列酮以外,添加D4476、SB431542、或ALK5抑制剂中II的任一个进行培养,将成纤维细胞转换为了表达CIDEA基因的mRNA的棕色脂肪细胞。
实施例14(图14)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中所记载的那样以500μL/孔加入普通培养基、脂肪细胞诱导培养基、或添加了各小分子化合物等的脂肪细胞诱导培养基。
脂肪细胞诱导培养基为添加了添加了10%FBS的DMEM+MDI培养基(添加了0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松及1μg/mL胰岛素的10%FBS的DMEM)。
添加物的浓度如下所述:
T3:1nM
罗格列酮:1μm
D4476:2μm。
Pifithrin alpha[p53抑制剂]:5μm
PD0325901:1μm
SB431542:2μm
ALK5抑制剂II:2μm。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第14天。
第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。将该cDNA与Real-timePCR Master Mix、及对AdipoQ或β肌动蛋白基因特异性的引物和Taqman探针混合。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以AdipoQ基因的mRNA水平相对于β肌动蛋白基因mRNA的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将其结果示于图14。可知通过除了T3及罗格列酮以外,添加D4476、PD0325901、SB431542或ALK5抑制剂II中的任一个进行培养,将成纤维细胞转换为了表达AdipoQ基因的mRNA的棕色脂肪细胞。
实施例15(图15)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中所记载的那样以500μL/孔加入普通培养基、脂肪细胞诱导培养基、或添加了各小分子化合物等的脂肪细胞诱导培养基。
脂肪细胞诱导培养基为添加了添加了10%FBS的DMEM+MDI培养基(添加了0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松及1μg/mL胰岛素的10%FBS的DMEM)。
添加物的浓度如下所述:
T3:1nM
罗格列酮:1μm
D4476:2μm
SB431541:2μm
ALK5抑制剂II:2μm。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第14天。
第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)进行洗涤。之后,用4%多聚甲醛进行固定,利用PBS(-)洗涤后,利用BODIPY 493/503(Invitrogen)/PBS溶液于室温反应5分钟,用PBS洗涤3次。使用荧光显微镜以倍率200倍进行照片拍摄,另外测量了荧光强度。
将该结果示于图15A(荧光显微镜图像)和图15B(荧光强度)。可知通过除了T3及罗格列酮以外,添加D4476、SB431541或ALK5抑制剂II中的任一个进行培养,将成纤维细胞转换为了具有被BODIPY染色的脂滴的棕色脂肪细胞。
实施例16(图20)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)或人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells;MSC)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基(普通培养基)、矿物化诱导培养基(OB培养基)或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II(ALK5iII)的矿物化诱导培养基(OB培养基+ALK5iII)。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第18天。
第18天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。茜素红S染色后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤,利用倒置显微镜以40倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图20。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基中培养,源自人皮肤的成纤维细胞转换为大量产生矿物化骨基质的成骨细胞。
实施例17(图21)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基或添加了ALK5抑制剂II和/或TGF-β的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第13天。
第13天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用固定液进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。ALP染色(ALP staining)之后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤,利用倒置显微镜以40倍的倍率进行拍摄。
添加至培养基的化合物和细胞因子的浓度为如下所述。
ALK5抑制剂II:4μm
TGF-β:50ng/ml。
将结果示于图21。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基中培养,源自人皮肤的成纤维细胞转换为了具有高ALP活性的成骨细胞。
实施例18(图22)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)或源自人脂肪的间充质干细胞(human adipose derived stem cells;ADSCs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基,或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第18天。
第18天从各孔吸除培养液,利用PBS洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、及对骨钙素、碱性磷酸酶或β-actin基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。将骨钙素(Oc)及碱性磷酸酶(ALP)基因的mRNA水平相对于β-actin基因mRNA水平的比进行定量,将矿物化诱导培养基中培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图22。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基中培养,源自人皮肤的成纤维细胞转换为了表达骨钙素基因和ALP基因的成骨细胞。图中,*及**表示对比矿物化诱导培养基(OB培养基),分别为p<0.05及p<0.01(*p<0.05和**p<0.01对比OB培养基。值为平均值±S.D.(n=4)。)。
实施例19(图23)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)或源自人脂肪的间充质干细胞(human adipose derived stem cells;ADSCs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以2×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基(普通培养基)、MDI培养基(成纤维细胞用的脂肪细胞诱导培养基),或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的MDI培养基(MDI培养基+ALK5iII)。
MDI培养基为向10%FBS DMEM添加了0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松,及1μg/mL胰岛素而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第14天。
第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。油红O染色后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤,利用倒置显微镜以40倍、100倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图23。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的MDI培养基中培养,源自人皮肤的成纤维细胞转换为了大量蓄积脂滴的白色脂肪细胞。
实施例20(图24)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)或源自人脂肪的间充质干细胞(human adipose derived stem cells;ADSCs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)(普通培养基)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、MDI培养基或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的MDI培养基。
MDI培养基(包含3-异丁基-1-甲基黄嘌呤/地塞米松/胰岛素培养基)为向10%FBSDMEM添加了0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松及1μg/mL胰岛素而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第14天。
第14天从各孔吸除培养液,利用PBS洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、及对AdipoQ、FABP4或β-actin基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以AdipoQ及FABP4基因的mRNA水平相对于β-actin基因mRNA水平的比进行定量,将在MDI培养基中培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图24。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的MDI培养基中培养,源自人皮肤的成纤维细胞转换为了表达AdipoQ基因和FABP4基因的白色脂肪细胞。
实施例21(图25)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)或源自人脂肪的间充质干细胞(human adipose derived stem cells;ADSCs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于纤连蛋白包被的24孔板的中心部(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、软骨诱导培养基(软骨细胞培养基)或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的软骨诱导培养基(软骨细胞培养基+ALK5iII)。
软骨诱导培养基为向1%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸,1%胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium)、10ng/ml BMP-2、10ng/ml TGF-β、10ng/ml GDF5、10ng/nl b-FGF而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第21天。
第21天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。阿辛蓝染色后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤,利用倒置显微镜以100倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图25。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的软骨诱导培养基中培养,源自人皮肤的成纤维细胞转换为了大量产生软骨基质的软骨细胞。
实施例22(图26)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)或源自人脂肪的间充质干细胞(human adipose derived stem cells;ADSCs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于纤连蛋白包被的24孔板的中心部(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、软骨诱导培养基或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的软骨诱导培养基。
软骨诱导培养基为向1%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸,1%胰岛素-转铁蛋白-硒、10ng/ml BMP-2、10ng/ml TGF-β、10ng/ml GDF5、10ng/nl b-FGF而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第21天。
第21天从各孔吸除培养液,利用PBS洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、及对Aggrecan,II型胶原或β-actin基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以Aggrecan(ACAN)及II型胶原基因的mRNA水平相对于β-actin基因mRNA水平的比进行定量,将软骨诱导培养基中培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图26。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的软骨诱导培养基中培养,源自人皮肤的成纤维细胞转换为了表达Aggrecan基因和II型胶原蛋白基因的软骨细胞。
实施例23(图27)
将源自人正常龈的成纤维细胞(human gingival fibroblasts;GFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第18天。
第18天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。茜素红S染色后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤,利用倒置显微镜以40倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图27。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基中培养,源自人龈的成纤维细胞转换为了大量产生矿物化骨基质的成骨细胞。
实施例24(图28)
将源自人正常龈的成纤维细胞(human gingival fibroblasts;GFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为向10%FBS DMEM添加了50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松而成。3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第18天。
第18天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用固定液进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。ALP染色后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤,利用倒置显微镜以40倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图28。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的矿物化诱导培养基中培养,源自人龈的成纤维细胞转换为具有高ALP活性的成骨细胞。
实施例25(图29)
动物实验在得到了所属机构的许可下进行。麻醉了8周龄雄性的NOD/SCID小鼠(Charles River)。在注水下,使用牙科钻头于左大腿骨骨干制作了直径约7mm的部分骨缺损。利用与后述的实施例16同样的方法,将在HDFs-ALK5抑制剂II存在下培养了13天时间的细胞(CdOBs;化学介导的直接转换的成骨细胞)与基质胶(BD Bioscience,San Jose,CA)一起悬浊,以5×105细胞/小鼠的浓度移植在骨缺损部和其周边的骨表面。另外,也准备了同样地制作了骨缺损后,将成纤维细胞悬浊于基质胶进行移植的小鼠。21天后将小鼠安乐死,切除大腿,用中性福尔马林固定后,使用XX射线CT设备(Scan Xmate-L090,Com ScanTechno,Yokohama,Japan)微型计算机进行断层摄影(μCT)。
将μCT的断层图像示于图29。可知CdOB在小鼠的体内在骨缺损部中进行了骨形成。
实施例26(图30)
将实施例25的μCT图像进行3维构建的影像示于图30。示出添加了ALK5抑制剂II培养的细胞,在活体内具有骨形成能力。可知CdOB在小鼠的体内在骨缺损部中进行了骨形成。
实施例27(图31)
动物实验在得到了所属机构的许可下进行。与上述实施例25相同地进行了移植实验。另外,也准备了移植了成纤维细胞的小鼠。21天后将小鼠安乐死,与实施例25同样切除大腿,利用中性福尔马林固定后,将骨组织包埋于SCEM(Leica Microsystem)化合物中,进行急冻。切为6μm的切片后,对连续切片利用苏木精伊红(H&E)染色及茜素红S染色。
将结果(40倍的显微镜图像)示于图31。可知CdOB在小鼠的体内在骨缺损部进行了骨形成。
实施例28(图32)
将人正常皮肤成纤维细胞株HDFs培养在60mm培养皿中,培养在普通培养基中(-)。另外,利用添加了4μm的ALK5抑制剂II的普通培养基培养HDFs3或7天时间。利用ISOGEN II从这些细胞回收总RNA。使用Affymetrix公司的DNA芯片在全基因群分析了各细胞的mRNA表达模式。将表示MSC标记的表达量的热图示于图32。可知通过添加了ALK5抑制剂II的培养基中培养,成纤维细胞转换为了间充质干细胞(MSCs)。
实施例29(图33)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基或添加了各小分子化合物的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为添加了10%FBS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松的DMEM。
添加至培养基的化合物和其浓度为如下所述。
I-BET151:2μm
Pifthrin-α:5μm
PD0325901:2μm
2-Me-5HT:2μm
CX4945:2μm
CHIR99021:2μm
毛喉素:2μm
DZnep:50nM
D4476:2μm
SB431542:2μm
ALK5iII:2μm。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第28天。
第28天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次后,加入茜素红S染色液,于室温培养15分钟。染色之后的染色液回收至96孔板,使用于实施例30的实验。之后利用灭菌蒸馏水洗涤孔,进行拍摄。
将结果示于图33。
实施例30(图34)
在实施例29的实验中,将利用茜素红S染色液染色后的液体回收至96孔板,通过吸光度计测定了吸光度(OD550nm)。
将结果示于图34。
从图33和图34所示出的结果可知,作为TGF-β通路抑制剂的D4476、SB431542和ALK5iII,均通过被添加至矿物化诱导培养基,而诱导从成纤维细胞向成骨细胞的转换。但是,可知对除了已报告促进从成纤维细胞向iPS细胞的诱导的TGF-β通路抑制剂以外的化合物(I-BET、Pifthrin-α、PD0325901、2-Me-5HT、CHIR、毛喉素、DZnep)而言,即使在与TGF-β通路抑制剂相同的条件下被添加并培养,也不诱导从成纤维细胞向成骨细胞的转换。在TGF-β通路抑制剂中,特别是ALK5iII最强烈诱导了从成纤维细胞向成骨细胞的转换。
实施例31(图35)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基(OB培养基)或添加了各小分子化合物或者细胞因子的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为添加了10%FBS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松的DMEM。
添加至培养基的化合物和其浓度为如下所述。
D4476:1或4μm
LY2157299:1或4μm
LY364947:1或4μm
SB431542:1或4μm
SB525334:1或4μm
SD208:1或4μm
ALK5iII:1或4μm
TGF-β:10ng/ml。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第21天。
第21天,从一部分的孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用固定液进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。ALP染色后的孔利用灭菌蒸馏水洗涤、进行拍摄。
另外在第21天,从其余的孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次后,加入茜素红S染色液,于室温培养15分钟。染色之后的染色液回收至96孔板,使用于实施例32的实验。之后利用灭菌蒸馏水洗涤孔,进行拍摄。
将结果示于图35。
实施例32(图36)
在实施例31的实验中,将利用茜素红S染色液染色后的液体回收至96孔板,通过吸光度计测定了吸光度(OD550nm)。
将结果示于图36。
从图35和图36所示出的结果可知,通过在添加了各种TGF-β通路抑制剂的矿物化诱导培养基中培养,可以使人成纤维细胞转换为成骨细胞。可知特别是SD208和ALK5iII可以强烈地使人成纤维细胞转换为成骨细胞。可知其中ALK5iII可以最强烈地使人成纤维细胞转换为成骨细胞。
如果在添加了TGF-β的矿物化诱导培养基中培养,则人成纤维细胞未转换为成骨细胞。
实施例33(图37)
将源自各种各样人的源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDF45(由KURABO购入)、由HDF69(PromoCell购入)、HDF22(由PromoCell购入))悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入普通培养基、矿物化诱导培养基或以4μm添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为添加了10%FBS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松的DMEM。
3~4天一次,更换为新鲜的培养液,培养至第10、15天。
第10天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用固定液进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。ALP染色之后,利用灭菌蒸馏水洗涤孔,利用倒置显微镜以40倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图37。
实施例34(图38)
使用源自各种各样人的源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDF45、HDF69、HDF22),以与实施例33相同的方式进行培养。
第15天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,利用10%福尔马林进行固定。用灭菌蒸馏水洗涤3次。茜素红S染色之后,利用灭菌蒸馏水洗涤孔,利用倒置显微镜以40倍的倍率进行拍摄。
将结果示于图38。
从图37和图38的结果可知,源自不同人的源自人正常皮肤的成纤维细胞也均通过在添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基中培养而转换为成骨细胞。
实施例35(图39)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图中记载的那样,以500μL/孔加入矿物化诱导培养基(OB培养基)或添加了各小分子化合物和/或细胞因子的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为添加了10%FBS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松的DMEM。
添加的小分子化合物或者细胞因子的浓度为如下所述。
ALK5iII:4μm
1α,25-二羟维生素D3(VD3):5nM
人类胰岛素样生长因子-1(IGF-1):100ng/ml。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第18天。
第18天从各孔吸除培养液,利用PBS洗涤之后,利用ISOGEN II从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、及对碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液蛋白(Bonesialoprotein)或β-actin基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以碱性磷酸酶、骨钙素(OC)、骨唾液蛋白基因的mRNA水平相对于β-actin基因mRNA水平的比进行定量,将添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基中培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图39。在添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基中培养的细胞中,ALP的mRNA表达显著升高。对OC的mRNA表达而言,与在矿物化诱导培养基中培养的细胞相比,在添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基中培养的细胞中上升,与添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基中培养的细胞相比,在添加了ALK5iII和VD3的矿物化诱导培养基中培养的细胞中进一步显著升高。对BSP的mRNA表达而言,与在矿物化诱导培养基中培养的细胞相比,在添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基中培养的细胞中上升,与添加了ALK5iII的矿物化诱导培养基中培养的细胞相比,在添加了ALK5iII和IGF-1的矿物化诱导培养基中培养的细胞中进一步显著升高。数值为平均值±S.D.(值为平均值±S.D.(n=4).)。
实施例36(图40)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以1×104细胞/孔的浓度接种于24孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以500μL/孔加入普通培养基、或分别以4μm、5nM、100ng/ml的浓度添加了ALK5iII、VD3、IGF-1的矿物化诱导培养基。
矿物化诱导培养基为添加了10%FBS、50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸、100nM地塞米松的DMEM。
3~4天一次,将培养液更换为新鲜的培养液,培养至第18天。
第18天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)进行洗涤。利用4%多聚甲醛固定之后,利用PBS(-)进行洗涤。利用PBS(-)洗涤3次后,加入Blocking One,于室温培养60分钟。
添加抗骨钙素抗体,于4℃过夜进行反应之后,利用Wash buffer洗涤3次。加入Alexa 488-偶联抗小鼠Ig抗体,于室温反应1小时后,利用Wash buffer洗涤3次。之后使用DAPI进行核染色,使用荧光显微镜以倍率200倍进行照片拍摄。另外,使用BZ-H3C、BZ-H3CM(KEYENCE)计算了OC阳性细胞数量/DAPI数量。
将结果示于图40。在HDF中观察到许多被DAPI染色的细胞核,几乎不存在被抗OC抗体明显染色的细胞。另一方面,CdOB中,众多细胞被抗OC抗体强烈染色。以核被DAPI染色的细胞数作为分母,将被抗OC抗体染色的细胞数作为分子计算比值时,可知人成纤维细胞的约87%转换为表达骨钙素蛋白的成骨细胞。图中,**表示对比HDF,p<0.01(**p<0.01对比HDF。)。
实施例37(图41)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM)。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,图如所示,在组1中以1mL/孔加入普通培养基。在组2中以1mL/孔加入不含有罗格列酮的脂肪细胞诱导培养基(脂肪细胞诱导培养基(R-))。在组3中以1mL/孔加入脂肪细胞诱导培养基。在组4中以1mL/孔加入以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基(R-)。在组5~9中以1mL/孔加入以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基。
脂肪细胞诱导培养基为添加了(1nM T3,1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM)。
脂肪细胞诱导培养基(R-)为(添加了1nM T3,0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM)。
2天一次,更换为新鲜的培养液。组5~9如图所记载那样,分别仅在0-2天、0-4天、0-6天、0-8天、0-10天的时间在添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养,之后在不添加ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养。第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,使用Qiagen公司制RNA easy Mini Kit从细胞提取了总RNA。使用Rever TraAce qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。将该cDNA与Real-time PCR Master Mix、对UCP-1基因或β肌动蛋白基因特异性的引物与Taqman探针混合。使用AB7300Real-time PCRsystem进行了qRT-PCR。以UCP1基因的mRNA水平相对于β-肌动蛋白基因mRNA水平的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图41。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养,成纤维细胞转换为强表达UCP1基因的棕色脂肪细胞。可知特别是通过在0-8天时间加入ALK5抑制剂II之后,在不含有ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养4天时间,可以最强烈诱导成纤维细胞向棕色脂肪细胞的转换。
实施例38(图42)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,在组1中以1mL/孔加入普通培养基(对照)。在组2中以1mL/孔加入脂肪细胞诱导培养基。在组3~8中以1mL/孔加入以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基。
脂肪细胞诱导培养基为(添加了1nM T3,1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM)。2天一次,更换为新鲜的培养液。在组3~7中如图所记载那样,分别仅在0-2天、0-4天、0-6天、0-8天、0-10天的时间在添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养,之后在不添加ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养。在第14天从各孔吸除培养液,用PBS(-)洗涤。用4%多聚甲醛进行固定后,利用PBS(-)洗涤,加入Perm Buffer(添加了0.2%Triton-X的PBS)培养15分钟。利用PBS(-)洗涤3次后,加入Blocking One于室温培养60分钟。添加抗UCP-1抗体(RD MAB6158),于室温反应2小时后,用Wash buffer洗涤3次。加入CF488-偶联抗小鼠Ig抗体(Biotum20014)于室温反应2小时后,利用PBS(-)洗涤3次。用Lifetechnology公司制SlowFade Gold antifade reagent与DAPI进行核染色后,使用荧光显微镜以倍率100倍进行照片拍摄。
将荧光显微镜图像示于图42。组1和组2的细胞几乎未被抗UCP1抗体染色。在组3~8中,确认了许多被抗UCP1抗体染色的细胞。特别是在组6中,被抗UCP1抗体染色的细胞的密度最高。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养,成纤维细胞转换为高表达UCP1蛋白的棕色脂肪细胞。可知特别是通过在0-8天时间加入ALK5抑制剂II之后,在不含有ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养4天时间,可以最强烈诱导成纤维细胞向棕色脂肪细胞的转换。
实施例39(图43)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1mL/孔加入普通培养基、脂肪细胞诱导培养基(BA培养基)或化合物添加了ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431542、D4476的脂肪细胞诱导培养基,。化合物的添加浓度为4μm、8μm、12μm或16μm。脂肪细胞诱导培养基为添加了(1nM T3,1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM)。2天一次,更换为新鲜的培养液,培养第1天-第8天。之后,第9天-第14天为止,在不含ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431542、D4476中的任一个的培养基中培养。第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,使用Qiagen公司制RNA easy Mini Kit从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。将该cDNA与Real-time PCR Master Mix、对UCP-1基因或β肌动蛋白基因特异性的引物与Taqman探针混合。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以UCP1基因的mRNA水平相对于β-肌动蛋白基因mRNA水平的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图43。可知通过在添加了ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431541、D4476中的任一个的脂肪细胞诱导培养基中培养,成纤维细胞转换为强表达UCP1基因的棕色脂肪细胞。可知特别是ALK5抑制剂II最强烈诱导成纤维细胞向棕色脂肪细胞的转换,LY2157299紧随其后。
实施例40(图44)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,如图那样以1mL/孔分别加入:在组1中为普通培养基、组2中为脂肪细胞诱导培养基,组3~6中为分别添加了化合物ALK5抑制剂II(4μm)、LY2157299(8μm)、SB431542(4μm)、D4476(4μm)的脂肪细胞诱导培养基。脂肪细胞诱导培养基为添加了(1nM T3,1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM)。2天一次,更换为新鲜的培养液,培养第1天-第8天。之后,从第9天到第14天,在不含ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431542、D4476中任一个的脂肪细胞诱导培养基中培养。在第14天从各孔吸除培养液,用PBS(-)洗涤。用4%多聚甲醛进行固定后,利用PBS(-)洗涤,加入Perm Buffer(添加了0.2%Triton-X的PBS)培养15分钟。利用PBS(-)洗涤3次后,加入Blocking One于室温培养60分钟。添加抗UCP-1抗体(RDMAB6158),于室温反应2小时后,用Wash buffer洗涤3次。加入CF488-偶联抗小鼠Ig抗体(Biotum 20014)于室温反应2小时后,利用PBS(-)洗涤3次。用Lifetechnology公司制SlowFade Gold antifade reagent与DAPI进行核染色后,使用荧光显微镜以倍率100倍进行照片拍摄。
将结果示于图44(荧光显微镜图像)。在全部组中,确认了许多被DAPI染色的细胞核。在组1和组2中,几乎观察不到被抗UCP1抗体染色的细胞。另一方面,在组3~6中,确认了许多被抗UCP1抗体染色的细胞。特别是在组3中,确认了最高密度的被抗UCP1抗体染色的细胞,组4紧随其后。因此,可知通过在添加了ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431541、D4476中的任一个的脂肪细胞诱导培养基中培养,成纤维细胞转换为表达UCP1蛋白的棕色脂肪细胞。可知特别是,AKL5抑制剂II最强烈诱导成纤维细胞向棕色脂肪细胞的转换,LY2157299紧随其后。
实施例41(图45)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1mL/孔加入普通培养基、脂肪细胞诱导培养基或者添加了化合物ALK5抑制剂II(4μm)或LY2157299(8μm)的脂肪细胞诱导培养基。脂肪细胞诱导培养基为(添加了1nM T3,1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM)。2天一次,更换为新鲜的培养液,培养第1天-第8天。之后,第9天-第14天为止,在不含有ALK5抑制剂II也不含有LY2157299的培养基中培养。第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,使用Qiagen公司制RNA easy MiniKit从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。将该cDNA与Real-time PCR Master Mix、对UCP-1基因、CIDEA基因、KCNK3基因或β肌动蛋白基因的特异性的引物及Taqman探针混合。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以UCP1基因的mRNA水平相对于β肌动蛋白基因mRNA的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图45。可知通过在添加了ALK5抑制剂II或LY2157299中的任一个的脂肪细胞诱导培养基中培养,成纤维细胞转换为表达UCP1基因、CIDEA基因、KCNK3基因的棕色脂肪细胞。可知特别是AKL5抑制剂II更强烈诱导成纤维细胞向棕色脂肪细胞的转换。
实施例42(图46)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(HDFs)悬浮于普通培养基(添加了10%FBS的DMEM)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1mL/孔加入普通培养基、脂肪细胞诱导培养基或以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基。脂肪细胞诱导培养基为添加了(1nM T3,1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素及10%FBS的DMEM)。2天一次,更换为新鲜的培养液,培养第1天-第8天。之后,第9天-第14天为止,在不含有ALK5抑制剂II的培养基中培养。在第14天从各孔吸除培养液,用PBS(-)洗涤。用4%多聚甲醛进行固定后,利用PBS(-)洗涤,加入Perm Buffer(添加了0.2%Triton-X的PBS)培养15分钟。利用PBS(-)洗涤3次后,加入Blocking One于室温培养60分钟。添加抗UCP-1抗体(RD MAB6158),于室温反应2小时后,用Wash buffer洗涤3次。加入CF488-偶联抗小鼠Ig抗体(Biotum 20014)于室温反应2小时后,利用PBS(-)洗涤3次。用Lifetechnology公司制SlowFade Gold antifade reagent与DAPI进行核染色后,使用荧光显微镜以倍率100倍进行照片拍摄。使用Keyence BZ-H3A software计算了拍摄的图像的DAPI阳性细胞中的UCP1阳性细胞的百分比。
将结果示于图46。在普通培养基中培养的HDFs、在不添加ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养的细胞中,观察到许多被DAPI染色的细胞核,几乎不存在被抗UCP1抗体染色的细胞。另一方面,对在添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养的细胞而言,众多细胞被抗UCP1抗体强烈染色。以核被DAPI染色的细胞数作为分母,将被抗UCP1抗体染色的细胞数作为分子计算比值,结果可知通过在添加了ALK5抑制剂II的脂肪细胞诱导培养基中培养,超过90%的成纤维细胞转换为高表达UCP1蛋白质的棕色脂肪细胞。
实施例43(图47)
将正常人表皮角化细胞(Human Epidermal Keratinocyte;NHEK(AD))悬浊于正常人表皮角化细胞增殖用无血清液体培养基(HuMedia-KG2;Kurabo公司制)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1mL/孔加入HuMedia-KG2培养基(对照培养基)、K-脂肪细胞诱导培养基(角质细胞用脂肪细胞诱导培养基)或添加了ALK5抑制剂II(4μm)或者LY2157299(8μm)的K-脂肪细胞诱导培养基。
K-脂肪细胞诱导培养基为(添加了1nM T3,1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松、1μg/mL胰岛素的HuMedia-KG2)。
2天一次,更换为新鲜的培养液,培养第1天-第8天。之后,第9天-第14天为止,在不含有ALK5抑制剂II也不含有LY2157299的培养基中培养。第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,使用Qiagen公司制RNA easy Mini Kit从细胞提取了总RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCRMaster Mix、对UCP-1基因、CIDEA基因或β肌动蛋白基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以UCP1基因和CIDEA基因的mRNA水平相对于β肌动蛋白基因mRNA水平的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图47。可知通过在添加了ALK5抑制剂II、LY2157299中的任一个的K-脂肪细胞诱导培养基中培养,正常人表皮角化细胞转换为表达UCP1基因、CIDEA基因的棕色脂肪细胞。
实施例44(图48)
将正常人表皮角化细胞(Human Epidermal Keratinocyte;NHEK(AD))悬浊于正常人表皮角化细胞增殖用无血清液体培养基(HuMedia-KG2;Kurabo公司制)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,以1mL/孔加入HuMedia-KG2培养基(对照培养基)、K-成骨细胞诱导培养基(角质细胞用成骨细胞诱导培养基)或添加了化合物ALK5抑制剂II(4μm)的K-成骨细胞诱导培养基。K-成骨细胞诱导培养基为添加了50μg/mL抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸酯和100nM地塞米松的HuMedia-KG2。2天一次,更换为新鲜的培养液,培养至第14天。之后,第14天-第28天为止为,任一种细胞均在不含有ALK5抑制剂II的培养基中培养。第28天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,使用Qiagen公司制RNA easy Mini Kit从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCRMaster Mix、对Runx2基因或β肌动蛋白基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以Runx2基因的mRNA水平相对于β肌动蛋白基因mRNA水平的比进行定量,将用普通培养基培养的成纤维细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图48。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的K-成骨细胞诱导培养基中培养,正常人表皮角化细胞转换为表达Runx2基因的成骨细胞。
实施例45(图49)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于对照培养基中。将其以104细胞/mm2的浓度接种于48孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。第4天吸除培养上清液,将孔分为5组,添加图中记载的培养基。即,
组1:对照培养基
组2:WA培养基
组3:添加了1μm罗格列酮的WA培养基
组4:添加了16μm的ALK5抑制剂II的WA培养基
组5:添加了16μm的ALK5抑制剂II和1μm罗格列酮的WA培养基。
培养基的组成如下所述。
对照培养基为添加了10%FBS、100mM非必需氨基酸(NEAA)、100U/ml青霉素及100μg/mL链霉素的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM。
WA培养基为添加了10%FBS、100mM非必需氨基酸(NEAA)、100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素、0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、62.5nM吲哚美辛、1μm地塞米松及170nM胰岛素的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM。
于5%CO2/95%加湿的空气、37℃继续培养。在第6、8、10天分别更换为相同组成的新鲜培养基。
第12天,如下进行BODIPY染色。
(1)除去孔内的培养液之后,用PBS洗涤各孔1次。
(2)向各孔加入4%甲醛液50μL,于室温固定一夜。
(3)用PBS洗涤2次。
(4)向各孔每孔加入BODIPY染色液50μL,于室温静置30分钟。
(5)从孔内除去染色液后,于室温静置30分钟。
将用荧光显微镜拍摄的相差图像和绿色荧光图像示于图49。用对照培养基培养的细胞几乎未被Bodipy染色,在添加了罗格列酮的WA培养基中培养的组中,染色极弱的细胞以较低频率存在。在添加了ALK5抑制剂II的WA培养基中培养的组中,确认了更多染色更强烈的细胞。在添加了ALK5抑制剂II和罗格列酮这两者的WA培养基中培养的组中,最多的细胞被BODIPY强烈染色。因此,可知通过在添加了ALK5抑制剂II的WA培养基中培养,人成纤维细胞转换为白色脂肪细胞。可知特别是在罗格列酮的共存下,AKL5抑制剂II更强烈地诱导成纤维细胞向白色脂肪细胞的转换。
实施例46(图50)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于对照培养基中。将其以104细胞/mm2的浓度接种于48孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。第4天吸除培养上清液,将孔分为7组,添加图中记载的培养基。即,
组1:对照培养基
组2:WA培养基
组3:添加了1μm罗格列酮的WA培养基
组4:添加了8μm的ALK5抑制剂II的WA培养基
组5:添加了16μm的ALK5抑制剂II的WA培养基
组6:添加了8μm的ALK5抑制剂II和1μm罗格列酮的WA培养基。
组7:添加了16μm的ALK5抑制剂II和1μm罗格列酮的WA培养基。
培养基的组成与实施例45相同。
于5%CO2/95%加湿的空气、37℃继续培养。在第6、8、10天分别更换为相同组成的新鲜培养基。
第12天,与实施例45同样利用BODIPY染色,将脂滴进行荧光染色。使用荧光显微镜BZ-9000(Keyence),以100倍进行拍摄。用BZ-II Analyzer software(Keyence,Osaka,Japan)计算BODIPY阳性细胞数,进行各组间的比较。
将结果(平均±标准偏差)示于图50。用对照培养基培养的细胞几乎未被BODIPY染色,在添加了1μm的罗格列酮或者16μm的ALK5抑制剂II的任一个的WA培养基中培养的组中,染色的细胞以较低频率存在。在与8μm或16μm的ALK5抑制剂II共添加了1μm的罗格列酮的WA培养基中培养的组中,确认了染色的细胞更多。因此,可知通过在添加了ALK5抑制剂II的WA培养基中培养,人成纤维细胞转换为白色脂肪细胞。可知特别是在罗格列酮的共存下,AKL5抑制剂II更强烈地诱导成纤维细胞向白色脂肪细胞的转换。
实施例47(图51)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于对照培养基中。将其以104细胞/mm2的浓度接种于6孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。第4天吸除培养上清液,将孔分为5组,与实施例45同样添加图中记载的培养基。培养基的组成与实施例45相同。
于5%CO2/95%加湿的空气、37℃继续培养。在第6、8、10天分别更换为相同组成的新鲜培养基。
第12天,从细胞回收RNA。使用对AdipoQ、FABP4(成熟脂肪细胞标记)及PPAR-γ(脂肪前体细胞标记)基因分别特异性的TaqMan探针和引物,进行实时PCR而定量了mRNA。
将结果(平均)(相对值)示于图51。对AdipoQ和FABP4而言,在单独添加ALK5iII培养中轻度诱导表达,在与ALK5iII和罗格列酮的共添加中强烈诱导表达。PPAR-γ在在WA培养基中的培养也诱导轻度表达,在添加ALK5iII或者罗格列酮任一种中中等诱导表达,在ALK5iII和罗格列酮的共添加中强烈诱导表达。
因此,可知通过在添加了ALK5抑制剂II的WA培养基中培养,人成纤维细胞转换为白色脂肪细胞。可知特别是在罗格列酮的共存下,AKL5抑制剂II更强烈地诱导成纤维细胞向白色脂肪细胞的转换。
实施例48(图52)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于对照培养基中。将其以104细胞/mm2的浓度接种于48孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。第4天吸除培养上清液,将孔分为10组,添加图中记载的培养基。即,
组1:WA培养基
组2:添加了16μm的ALK5抑制剂II(ALK5iII)的WA培养基
组3:添加了16μm的LY2157299的WA培养基
组4:添加了16μm的SB431542的WA培养基
组5:添加了16μm的D4476的WA培养基
组6:添加了1μm罗格列酮的WA培养基。
组7:添加了16μm的ALK5抑制剂II(ALK5iII)和1μm罗格列酮的WA培养基。
组8:添加了16μm的LY2157299和1μm罗格列酮的WA培养基。
组9:添加了16μm的SB431542和1μm罗格列酮的WA培养基。
组10:添加了16μm的D4476和1μm罗格列酮的WA培养基。
培养基的组成与实施例45相同。
于5%CO2/95%加湿的空气、37℃继续培养。在第6、8、10天分别更换为相同组成的新鲜培养基。
第12天,与实施例45同样利用BODIPY染色,将脂滴进行荧光染色。使用荧光显微镜BZ-9000(Keyence),以100倍进行拍摄。用BZ-II Analyzer software(Keyence,Osaka,Japan)计算脂肪细胞数,进行各组间的比较。将结果示于图52。
用分别单独添加了ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431542或者D4476的WA培养基中培养的细胞,仅有少数的细胞具有被Bodipy染色的脂滴,在添加了ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431542、D4476的任一个和罗格列酮这两者的WA培养基中培养的组中,确认了许多染色的细胞。因此,可知如果在添加了TGF-β通路抑制剂的WA培养基中培养,则人成纤维细胞转换为白色脂肪细胞。另外,可知如果在TGF-β通路抑制剂和罗格列酮的两者添加了的WA培养基中培养,则与TGF-β通路抑制剂单独比,人成纤维细胞更有效地转换为白色脂肪细胞。可知特别是在TGF-β通路抑制剂中,AKL5抑制剂II最强烈地诱导成纤维细胞向白色脂肪细胞的转换。
实施例49(图53)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于对照培养基中。将其以104细胞/mm2的浓度接种于6孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。第4天吸除培养上清液,将孔分为10组,与实施例48同样添加图中记载的培养基。培养基的组成与实施例45相同。
于5%CO2/95%加湿的空气、37℃继续培养。在第6、8、10天分别更换为相同组成的新鲜培养基。
第12天,与实施例48同样利用BODIPY染色,将脂滴进行荧光染色。使用荧光显微镜BZ-9000(Keyence),以100倍进行拍摄。用BZ-II Analyzer software(Keyence,Osaka,Japan)计算BODIPY阳性细胞数、被BODIPY染色的面积及被BODIPY染色的强度,进行各组间的比较。
将结果(平均±标准偏差)示于图53。用对照培养基培养的细胞几乎未被BODIPY染色,在添加了1μm的罗格列酮或者16μm的ALK5抑制剂II中的任一个的WA培养基中培养的细胞蓄积了少量的脂肪。16μm的ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431542和D4476均通过与罗格列酮共添加,而比罗格列酮单独更强烈地诱导脂肪蓄积。在共添加ALK5抑制剂II和1μm的罗格列酮的WA培养基中培养的组中,确认了最大量的脂肪蓄积的细胞。因此,可知通过在添加了TGF-β通路抑制剂的包含罗格列酮的WA培养基中培养,人成纤维细胞有效地转换为了白色脂肪细胞。可知特别是在TGF-β通路抑制剂中,AKL5抑制剂II最强烈地诱导成纤维细胞向白色脂肪细胞的转换。
实施例50(图54)
将源自人正常皮肤的成纤维细胞(human dermal fibroblasts;HDFs)悬浮于对照培养基中。将其以104细胞/mm2的浓度接种于6孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。第4天吸除培养上清液,将孔分为5组,添加图中记载的培养基。即,
组1:添加了1μm罗格列酮的WA培养基
组2:添加了1μm罗格列酮和16μm的ALK5抑制剂II(ALK5iII)的WA培养基
组3:添加了1μm罗格列酮和16μm的LY2157299(LY)的WA培养基
组4:添加了1μm罗格列酮和16μm的SB431542(SB)的WA培养基
组5:添加了1μm罗格列酮和16μm的D4476(D4)的WA培养基。
培养基的组成与实施例45相同。于5%CO2/95%加湿的空气、37℃继续培养。在第6、8、10天分别更换为相同组成的新鲜培养基。
第12天,从细胞回收RNA,与实施例47相同,定量了AdipoQ、FABP4(成熟脂肪细胞标记)及PPAR-γ(脂肪前体细胞标记)基因的mRNA。
将结果(平均)示于图54。组2~5的细胞中度~高度表达了AdipoQ、FABP4或者PPAR-γ中的任一个以上的基因的mRNA。添加了ALK5抑制剂II的细胞,最强烈表达了全部这3个基因。
因此,可知ALK5抑制剂II、LY2157299、SB431542和D4476均使人成纤维细胞转换为白色脂肪细胞。可知特别是在TGF-β通路抑制剂中,AKL5抑制剂II最强烈地诱导成纤维细胞向白色脂肪细胞的转换。
实施例51(图55)
将人成纤维细胞aHDF45以每孔1.0×104细胞/500μL/孔接种于24孔板。次日,将孔分为2组,1组将培养基更换为下述对照培养基,另外的1组更换为添加了4μm的Alk5iII的下述SC培养基。于37℃,5%CO2/95%大气下培养14天时间。一周进行2次培养基更换。
对照培养基:添加了10%FBS、100mM非必需氨基酸(NEAA)、1mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素及100μg/mL链霉素的Dulbecco's modified minimum essential medium;DMEM。
SC(施万细胞)培养基:添加了10%FBS、10ng/mL rhbFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、5.7μg/mL毛喉素、200ng/mL rhHeregulin beta-1、5ng/mL rhPDGF-AA、100mM非必需氨基酸(NEAA)、1mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素及100μg/mL链霉素的Dulbecco's modifiedminimum essential medium;DMEM。
在第8天及第14天,使用RNeasy Mini QIAcube Kit(QIAGEN)从各细胞提取RNA,使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO)进行反转录反应,合成了cDNA。使用得到的cDNA,进行了基于StepOnePLUS(Applied Biosystems)的EGR2及S100β基因的mRNA表达的实时RT-PCR分析。
将结果示于图55。可知通过在添加了4μm的Alk5iII的SC培养基中培养,从而人成纤维细胞转变为共表达S100β和EGR2的施万细胞。
实施例52(图56)
将正常人表皮角化细胞(Human Epidermal Keratinocyte;NHEK(AD))悬浊于正常人表皮角化细胞增殖用无血清液体培养基(HuMedia-KG2;Kurabo公司制)中。将其以3×104细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,分别以1mL/孔加入HuMedia-KG2培养基、人表皮基底细胞增殖用培养基(CnT-PR;CELLnTEC公司制)或以1μm或10μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的人表皮基底细胞增殖样培养基。2天一次,更换为新鲜的培养液,培养至第21天。第21天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,使用Qiagen公司制RNA easy Mini Kit从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCRMaster Mix、对Uroplakin 1b基因、Uroplakin 3b基因或β肌动蛋白基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以Uroplakin 1b基因和Uroplakin 3b基因的mRNA水平相对于β肌动蛋白基因mRNA水平的比进行定量,将用HuMedia-KG2培养基培养的人表皮角化细胞的值设为1进行计算。将其结果示于图56。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的CnT-PR培养基中培养,人表皮角化细胞转换为了表达Uroplakin1b基因和Uroplakin 3b基因的尿路上皮细胞。
实施例53
将人正常外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclear cells;PBMCs)悬浊于对照培养基(添加了10%FBS的RPMI1640培养基)中。将其以2.5×105细胞/孔的浓度接种于12孔板(第0天),于5%CO2/95%加湿的空气、37℃开始培养。次日,吸除培养上清液,在组1中以1mL/孔加入对照培养基。在组2中以1mL/孔加入P-脂肪细胞诱导培养基(外周血单核细胞用脂肪细胞诱导培养基)。在组3中以1mL/孔加入以4μm的浓度添加了ALK5抑制剂II的P-脂肪细胞诱导培养基。P-脂肪细胞诱导培养基为添加了10%FBS、30U/mlrecombinant hIL-2、1nM T3、1μm罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5μm地塞米松及1μg/mL胰岛素的RPMI1640培养基。2天一次,将培养液的50%更换为新鲜的培养液。
第14天从各孔吸除培养液,利用PBS(-)洗涤之后,使用Qiagen公司制RNA easyMini Kit从细胞提取了总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix从该RNA合成了cDNA。向该cDNA混合了Real-time PCR Master Mix、对FABP4基因或β肌动蛋白基因特异性的引物和Taqman探针。使用AB7300Real-time PCR system进行了qRT-PCR。以FABP4基因的mRNA水平相对于β肌动蛋白基因mRNA水平的比进行定量,将用普通培养基培养的人正常外周血单核细胞的值设为1进行计算。
将结果示于图57。可知通过在添加了ALK5抑制剂II的P-脂肪细胞诱导培养基中培养,人正常外周血单核细胞转换为了表达FABP4基因的白色脂肪细胞。
Claims (13)
1.制备体细胞的方法,其包括将哺乳动物的已分化的体细胞在用于诱导分化除了所述已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基中,在TGF-β通路抑制剂的存在下进行培养,使所述已分化的体细胞转换为其它体细胞,并且进一步包括在TGF-β通路抑制剂的非存在下进行培养;
其中所述其它体细胞不包括在生理的条件下分化的体细胞,并且选自成骨细胞、白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞、施万细胞和尿路上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,TGF-β通路抑制剂为D4476、SB431542、LY2157299、SD208或ALK5抑制剂II。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,TGF-β通路抑制剂为ALK5抑制剂II。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为间充质类的细胞。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞或角质细胞转换为成骨细胞。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞或外周血单核细胞转换为白色脂肪细胞。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞或角质细胞转换为棕色脂肪细胞。
8.根据权利要求6所述的方法,其中,用于诱导分化体细胞的培养基包含过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为软骨细胞。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为成肌细胞。
11.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为施万细胞。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使角质细胞转换为尿路上皮细胞。
13.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使成纤维细胞转换为间充质干细胞。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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