JP2011509656A - 成長因子の組合せを使用する骨髄幹細胞及び間葉系幹細胞の骨形成分化 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)BMSC又はMSCを含むヒト被験体の生体試料から細胞を回収する工程、
(b)必要に応じて、(a)において回収した細胞から単核細胞を単離する工程、
(c)ヒト血漿又は血清、FGF、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体、及びTGFB、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体を含む培地に(a)又は(b)の細胞を添加すると共に、細胞を基板表面に接着させるような細胞培地混合物を培養する工程、
(d)非接着物を除去すると共に、骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞様細胞、又は骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞様細胞を含む細胞集団が得られるような、(c)に規定される培地中の接着細胞をさらに培養する工程、
を含み得る。
cell)」は、1つのというより1つ又は複数の細胞を表す。
発明の概要の節において詳述したように、一態様では、本発明は、in vitro又はex vivoで、ヒト骨髄幹細胞から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨芽細胞表現型細胞を得る方法と、骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団を得る方法とに関する。
3213-8)において説明されている「迅速に自己再生する細胞」RS−1又はRS−2;Goodellet al. 1997 (Nat Med 3(12):
1337-45)により説明されている「サイドポピュレーション」(SP)細胞;その密度が低いこと(例えば密度勾配遠心分離による)、非接着性、及び骨形成マーカーの発現のレベルが低いことにより当初同定されている骨形成前駆体(OP)細胞(Longet
al. 1995. J Clin Invest. 95(2): 881-7;米国特許第5,972,703号明細書により説明されている);Krauseet
al. 2001 (Cell 105: 369-377)及びDominici et al. 2004. (PNAS 101 (32): 11761-6)により説明されている造血系列及び非造血系列の両方の細胞を生成することができる原始的前駆体細胞;その他を包含することを意図する。
disease)並びにマクキューン・オールブライト症候群を含み得る。
al. 1986 (Science 233: 541-545)及びHarper et al. 1986 (Biochemistry 25:4097-4103)によっても説明されている。
al. 1986 (EMBO J 5: 2523-8)及びKurokawa et al. 1987 (FEBS Lett 213: 189-94)によっても説明されている。
et al. 1989 (Oncogene 4: 429-436)によっても説明されている。
et al. 1985 (Nature 316: 701-5)によっても説明されている。
et al. 1988 (DNA 7: 493-497)によっても説明されている。
Dijke et al. 1988 (PNAS 85: 4715-4719)及びDerynck et al. 1988 (EMBOJ. 7:
3737-3743)によっても説明されている。
of more)アミノ酸の挿入(付加)、欠失及び/又は置換により生じ得る。
and Wunsch 1970 (J Mol Biol 48: 443-453)のアルゴリズムを使用する「Gap」、又はSmithand Waterman
1981 (J Mol Biol 147: 195-197)のアルゴリズムを使用する「Bestfit」(例えばAccelrysからのGCG(商標)v.11.1.2パッケージにおいて利用可能である)の、コンピュータによる実行により行うことができる)、及び一方でポリペプチドが同じアミノ酸残基を含有する、アライメント中における位置の数と、他方で2つのポリペプチドの配列が異なる、アライメント中における位置の数とをスコア化することにより、確定することができる。2つのポリペプチドは、それらのポリペプチドが所与の位置で異なるアミノ酸残基を含有する場合(アミノ酸置換)、又は一方のポリペプチドが所与の位置でアミノ酸残基を含有するが他方のポリペプチドは含有しない場合若しくはその逆の場合(アミノ酸挿入又はアミノ酸欠失)、アライメントにおいてその位置でその配列が異なる。配列同一性は、アライメント中の位置の総数に対する、ポリペプチドが同じアミノ酸残基を含有するアライメント中の位置の割合(百分率)として算出される。配列アライメントと配列同一性の確定とを実施するためのさらに好適なアルゴリズムは、Altschulet
al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)により最初に説明されたBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)、例えばTatusovaand
Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)により説明された「Blast 2 sequences」アルゴリズムに基づくものを含む。
tymphimurium)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis);酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)及びピキア・パストリス(Pichia
pastoris)等;培養植物細胞、例えばとりわけシロイヌナズナ(Arabidopsisthaliana)及びタバコ(Nicotiana tobaccum)細胞;動物細胞、例えば哺乳動物細胞及び昆虫細胞;又は多細胞生物、例えば植物若しくは動物)又はそれらの祖先に導入されており、且つ上記ポリペプチドをコードする配列を含む、組換え核酸分子の発現を通じて宿主生物により産生される組換体であってもよい。組換え技術により発現させた成長因子、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体の使用は、病原因子の伝染のリスクを低減する。TGFB−1の組換え産生は、とりわけBourdrelet
al. 1993 (Protein Expr Purif 4: 130-40)により説明されている。組換え成長因子はまた、(例えばSigma、BiologicalIndustries、R&D
Systems、Peprotech等から)一般的に市販されている。
(a)BMSC又はMSCを含むヒト被験体の生体試料から細胞を回収する工程、
(b)必要に応じて、(a)において回収した細胞から単核細胞を単離する工程、
(c)ヒト血漿又は血清、FGF、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体、及びTGFB、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体を含む培地に(a)又は(b)の細胞を添加すると共に、細胞を基板表面に接着させるような細胞培地混合物を培養する工程、
(d)非接着物を除去すると共に、骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞様細胞、又は骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞様細胞を含む細胞集団が得られるような(c)に規定される培地中の接着細胞をさらに培養する工程、
を概して含み得る。
California)から、入手可能)を、本明細書の細胞を培養するために使用することができ、該培地製剤は、イーグル最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、α改変最小必須培地(α−MEM)、基本必須培地(BME)、BGJb、F−12栄養混合液(Ham)、イスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM)、又はX−Vivo−10無血清培地(臨床グレード)(Invitrogen又はCambrex(NewJersey)から入手可能)と、それらの修正物及び/又は組合せとを含むがこれらに限定されない。上述の基本培地の組成は概して、当該技術分野で既知であり、培養する細胞に関する必要に応じて培地の濃度、及び/又は培地添加物を修正又は調整することは、当業者の技能の範囲内である。
本方法から得られる骨芽細胞のさらなる研究により、骨療法における使用により観察される有利な特性の基礎となり得る新規な骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨芽細胞表現型細胞型を規定することが可能となった。
et al. 1997. J Cell Biochem 64: 295-312)。カルシウムの細胞内での蓄積、及びマトリクスタンパク質中への沈着は、例えば45Ca2+中で培養すること、洗浄及び再培養すること、並びにその後細胞内に存在する若しくは細胞外マトリクス中に沈着した放射活性を確定すること(米国特許第5,972,703号明細書)により、又はCa2+アッセイキット(Sigmaキット#587)を使用して石灰化に関して培養基質をアッセイすることにより、又は実施例において説明するように、従来測定することができる。
et al. 1999. Science 284: 143-7を参照されたい)と、アッセイ方法(例えば誘導された場合、脂肪細胞は典型的には脂質蓄積を示すオイルレッドOで染色され、軟骨細胞は典型的にはアルシアンブルー又はサフラニンOで染色される)とを使用して試験することができる。脂肪生成分化又は軟骨形成分化への傾向を実質的に欠くとは、典型的には、65%未満、又は50%未満、又は35%未満、又は20%未満、又は10%未満の試験した細胞が、それぞれの試験に適用したときに、脂肪生成分化又は軟骨形成分化の徴候を示すことを意味し得る。
以下の記載は、上の1節で説明した方法により得られる又は得ることができる、骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞、及び骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞を含む集団、又は上の2節で特徴づけを行った骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞、及び該骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団を含む、上述したさらなる態様に関する。
that)1つ又は複数のヒト被験体のBMSC又はMSCから得ることができる(すなわち同種細胞)。さらに別の実施形態では、骨芽細胞を、非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物のBMSC又はMSCから得て、ヒト被験体に導入することができる(すなわち異種細胞)。
Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and CellularImmunotherapy, by
G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge UniversityPress, 1996、及びHematopoietic
Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P.Law, Churchill Livingstone,
2000を参照されたい。
et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18)。
et al., Biomaterials 14:323, 1993;Mikos et al., Polymer35:1068, 1994;Cook et
al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997)。
細胞培養及び血漿調製物
20ml〜60mlのヘパリン処置した骨髄(BM)を、骨疾患を患っている患者の腸骨稜から、又は健康なボランティアから得た。BMを、リン酸緩衝食塩水(PBS、2v:v)と混合し、密度勾配フィコール溶液上に重層した。遠心分離後、単核細胞を界面から回収し、PBS中で2回洗浄した。並行して、患者又は健康なドナー由来の血清を、乾燥した管中に流した160mlの血液の遠心分離後に得た。細胞を、同種血漿(自家性血漿を使用することもでき、実質的に同じ結果が得られる)を15%で、FGF2を10ng/mlで、TGFb−1を10ng/mlで添加したDMEM培地中に再懸濁した。細胞を、1×108細胞/175cm2でフラスコに播種し、5%CO2を含有する37℃加湿雰囲気中で維持した。細胞を、1日間付着させた後、初期培地を交換した。7日目及び11日目に、さらに2回部分的な培地交換を行った(半量を交換した)。14日目に、37℃で1分間〜5分間トリプシン/EDTA溶液を使用して、細胞を分離した。細胞を計数し、1×105細胞/175cm2で播種し、さらに1週間培養した。
細胞内マーカー及び細胞表面マーカーを、異なる時点(14日目及び21日目)で、フローサイトメトリーにより分析した。細胞表面マーカーに関しては、細胞を、以下の結合型モノクローナル抗体:抗CD45、CD90、CD105、CD73、CD166、CD63、CD14、CD19、HLA−ABC、HLA−DR、CD28、CD80、CD86及びCTLA−4と共に15分間インキュベートし、その後PBSで洗浄した後、遠心分離し、0.3mlのPBS中に再懸濁した。細胞内マーカー(OCN及びALP)に関しては、透過処理キットを使用し、特異的抗ALP結合型モノクローナル抗体を、製造業者(Analis)のプロトコルに従って使用した。その後細胞をPBSで洗浄した後、0.3mlのPBS中に再懸濁した。
アルカリホスファターゼ酵素活性を、pNPP(p−ニトロフェニルホスフェート)の加水分解に基づく生化学的アッセイにより測定した。pNPPがALPにより脱リン酸化されると、黄色に変色し、分光光度計により410nmで検出することができる。細胞のALP酵素活性は、精製子ウシ腸アルカリホスファターゼ活性に基づく標準曲線と比べて、21日目に確定する。ALP活性は、タンパク質1mg当たりのALPの単位で報告する。1単位のALPは、37℃、1分で1μmolのpNPPを加水分解する。
細胞の石灰化の誘導の可能性を、培養液中に骨形成培地を添加することにより評価した。14日目に、1cm2当たり5700個の骨形成性(bone-forming)細胞を、0.1μMのデキサメタゾン、0.05mMのアスコルビン酸、及び3mMのグリセロールホスフェートを添加した血漿の存在下で6ウェルプレート中に播種した。2週間の培養後、細胞を、3.7%ホルムアルデヒド/PBS中で固定し、アリザリンレッドにより染色した。石灰化スコアを、各培養に対して以下のように示した:0=石灰化せず、1=石灰化が進行中、2=完全に石灰化した。
10ng/mlのTGFb−1を添加した又は添加していない、個体A由来の1ml当たり2000個〜20000個の前骨芽細胞(PREOBa)を、個体B由来の1ml当たり200000個のT細胞(PBMCb)と共に同時培養した。10μg/mlの濃度のフィトヘマグルチニン(phytohemaglutinine)(PHA)を、T細胞増殖の陽性対照として使用した。細胞を、24ウェルマイクロタイタープレート中で7日間培養し、培養期間の最後の18時間、3H−チミジンでパルスラベルして(pulsed)、T細胞増殖を測定した。細胞を、氷冷PBSで2回、氷冷5%トリクロロ酢酸(TCA)で2回、洗浄した。最後に、0.1NのNaOH及び0.1%のTriton−X100を含有する溶液により、細胞を溶解した。上清を回収し、シンチレーション液と混合して、βカウンターで分析した。
血漿及びTGF、対血漿及びTGF/FGF2
本発明者らは、15%同種血漿含有培地に添加した唯一の成長因子としてのTGFb−1の効果を最初に試験した。図1に示したように、TGFB−1のみを添加した初代培養は、増殖に適切な細胞の量を示すことができなかった:実際に、FGF2及びTGFb−1の両方を含有する培地のフラスコから、TGFb−1を単独で含有するフラスコ中のものよりも、ほぼ20倍多い細胞が回収されている(p=0.0317、両側マン・ホイットニー検定)。
同種血漿及びFGF2を含有し、10ng/mlのTGFb−1を添加した培地又は添加していない培地中における、15人の患者由来の骨芽細胞の増殖速度を評価した(図2)。以下の実験により、初代培養(1.07×)、二次培養(2.5×)、及び全体(global)培養(3.08×)のいずれにおいても、TGFb−1を添加した血漿において培養した細胞の増殖の平均収率は、TGFb−1を添加せずに培養した細胞の収率より大幅に優れていることが示された(表1)。
フローサイトメトリーにより、FGF2及びTGFb−1の両方を添加した培地中で得られた細胞の表現型が、ほとんどのマーカーに関して、TGFb−1を添加せずに培養した細胞の表現型と類似することが明らかとなった。両方の細胞型が、CD90、CD105、CD73、CD63、CD166及びALPを発現していたが、CD45、CD14又はCD19の発現は観察されなかった(表3)。FGF2/TGFb−1培養条件におけるALPの発現は、FGF2単独条件と比較して低減した(それぞれ、42.2%対73.6%)。
細胞のALP酵素活性を比色アッセイにより評価し、該アッセイにより、TGFb−1と共に培養した細胞は、この成長因子を添加せずに培養した細胞と比べて、より低いALP活性を有することが示されている(表4)。これらの結果は、FACSにより測定したALPの発現と強く相関している。
比較的低いALP発現であっても、FGF2/TGFb−1と共に培養した細胞は、FGF2のみと共に培養した細胞と同様の生物活性(石灰化)を示すことが示された。このことは、石灰化により確定した。
TGFb−1の存在下で培養した骨形成性細胞が同種T細胞による増殖応答を誘導するどうかを確定するために、末梢血単核(mononucleated)細胞(PBMC)を、漸増数の骨形成性細胞(2000/ml〜20000/ml)と共に培養した。表5及び図4に示したように、FGF2/TGFb−1で産生した骨芽細胞は、PBMCの同種応答を誘導せず(左側)、PHAで刺激したPBMCの増殖の最大90%の阻害を誘導することもできた。
免疫特権BMSC又はMSC由来の骨形成性細胞を迅速且つ顕著に増殖させる方法を開発するために、これらの細胞成長及び特徴に対するTGFBの効力を評価した。
Claims (15)
- in vitro又はex vivoで成体ヒト骨髄幹細胞(BMSC)又は成体ヒト間葉系幹細胞(MSC)から骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞、又は骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団を得る方法であって、前記BMSC又はMSCと、ヒト血漿又は血清、線維芽細胞成長因子(FGF)、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体、及び形質転換成長因子β(TGFB)、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体とを接触させることを含む、方法。
- (a)BMSC又はMSCを含むヒト被験体の生体試料から細胞を回収する工程、
(b)必要に応じて、(a)において回収した細胞から単核細胞を単離する工程、
(c)ヒト血漿又は血清、FGF、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体、及びTGFB、又は生物学的に活性なその変異体若しくは誘導体を含む培地に(a)又は(b)の細胞を添加すると共に、細胞を基板表面に接着させるような細胞培地混合物を培養する工程、
(d)非接着物を除去すると共に、骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞様細胞、又は骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞様細胞を含む細胞集団が得られるような、(c)に規定される培地中の接着細胞をさらに培養する工程、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 該細胞を、工程(c)及び工程(d)合わせて約7日〜約18日の期間培養する、請求項2に記載の方法。
- 工程(d)において得られる細胞又は細胞集団を収集することをさらに含む、請求項2又は3に記載の方法。
- (c)に規定される培地中で工程(d)からの細胞又は細胞集団を継代すると共に、さらに培養する工程(e)をさらに含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 該細胞を、工程(e)において約3日〜約12日の期間培養する、請求項5に記載の方法。
- 該FGFが、FGF−1、FGF−2又はFGF−3である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 該TGFBが、TGFB−1、TGFB−2又はTGFB−3である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項の方法により得ることができる、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞、又はヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞を含む単離した細胞集団。
- ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞、又はヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団であって、前記骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨芽細胞表現型細胞が、(1)CD90、CD105、CD73、CD63、CD166、アルカリホスファターゼ(ALP)、より具体的には骨−肝臓−腎臓型のALPの発現を有し、(2)CD45、CD14、CD19を発現せず、且つ(3)15%未満の該細胞がHLA−DRを発現することを特徴とする、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞、又はヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団。
- 前記骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨芽細胞表現型細胞が、オステオカルシン(OCN)の発現をさらに有する、請求項10に記載のヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞表現型細胞、又はヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞若しくは骨芽細胞を含む細胞集団。
- 骨関連障害を治療するための、請求項9〜11のいずれか一項に規定される細胞又は細胞集団。
- 該細胞又は細胞集団が同種被験体に投与される、請求項12に記載の細胞又は細胞集団。
- 請求項9〜11のいずれか一項に規定される細胞又は細胞集団を含み、且つ骨病変の部位での前記細胞又は細胞集団の投与に好適な、医薬品組成物。
- 骨病変の部位での組成物の投与のための外科用器具を含み、且つ請求項14に規定される医薬品組成物をさらに含む装置であって、該骨病変の部位での該医薬品組成物の投与に適している装置。
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