JP2022501053A - 間葉系幹細胞を分化させるための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法を提供する。本発明はまた、これらの方法により得られるＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、そのＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる医薬処方物、および軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象の治療におけるそれらの使用に関する。

Description

本発明は、再生療法の分野、特に、低侵襲技術によって投与可能な骨細胞療法製品の分野にある。特に、本発明は、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)（ＭＳＣ）からＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞および細胞集団、ならびにこのような細胞および細胞集団を含んでなる製品、方法ならびに使用に関する。

骨分化に運命決定された細胞または骨形成能を有する細胞の、骨分化を遂行し得る幹細胞の移植は、骨関連疾患の治療に、特に、その治療が新たな骨組織の産生を必要とする場合に有望な手段である。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、これまでに骨障害を治療するために使用されてきた(Gangji et al.、2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42)。しかしながら、このような比較的未分化の幹細胞は移植可能であるものの、それらは骨芽細胞系譜に運命決定されていないので、このように移植された幹細胞のうちかなりの割合のものが最終的に所望の骨組織の形成に寄与しない可能性がある。さらに、このような幹細胞の量は、満足できないものである場合が多い。

細胞の遺伝子改変を用いずにｅｘ ｖｉｖｏで骨形成細胞を生成するための製造方法は、当技術分野ですでに記載されている。

ＷＯ２００７／０９３４３１は、単離したＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大培養のための方法に関するものであり、これにより骨芽細胞表現型を示す細胞が得られる。前記の方法では、ヒトＭＳＣを血清または血漿および塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）の存在下で培養した。

ＷＯ２００９／０８７２１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいてヒトＭＳＣから骨前駆細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞を得るための方法であって、前記ＭＳＣをヒト血漿または血清、ＦＧＦ−２およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）と接触させることを含んでなる方法に関するものである。

しかしながら、製品の生産容量、すなわち、１回の骨髄提供から供給される用量数、利用可能性および費用対効果など、同種異系の骨形成細胞製品の開発に関する大きな問題が残っている。さらに、この製造法の生産性では、製造能力を確保するために毎年、多数の骨髄の品質管理を行うことが必要となる。従って、１回の骨髄提供から得られる生産性を高めること、より一般には、中でも再生療法に有用なＭＳＣ由来細胞および細胞製品を得るためのさらなる方法および／または改善された方法がなお必要である。

発明の概要
本発明の特定の代表的実施形態を示す実験の節によって確証されるように、本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の生産容量が、三次培養（従って、中間細胞継代「Ｐ２」の付加）、および二次培養の培養期間、三次培養の培養期間、三次培養の終了時の凍結保存工程の付加、または移植密度に関する１以上の設定の制御を含んでなる製造方法によって前記細胞が得られる場合に著しく改善され得ることを認めた。

よって、１つの側面において、本発明は、ＭＳＣからＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得る、例えば、分化させる、および／または拡大培養するための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）およびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来細胞を得ること；
（ｂ）ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
を含んでなり、
前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）でｘ日の期間培養され、ここで、ｘ日は前記ＭＳＣ由来細胞の少なくとも２０％が増殖している（例えば、細胞周期のＳ期、Ｇ２期またはＭ期にある）最終日である方法が提供される。

さらなる側面において、本発明は、ＭＳＣからＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法を提供し、その方法は、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
を含んでなり、
前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）でさらに培養するために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは、３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種される方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、ＭＳＣからＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること；
（ｄ）前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させること；ならびに
（ｅ）前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存すること
を含んでなる方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、本明細書に定義されるような方法により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団に関する。

さらなる側面において、本発明は、懸濁液中のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の少なくとも９０％が２５μｍ以下の直径を有し（Ｄ_９０≦２５μｍ）、かつ、懸濁液中のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞で３５μｍを超える直径を有するものは多くても１％である、ＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ拡大培養により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を提供する。

さらなる側面において、本発明は、本明細書に定義されるようなＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる医薬処方物を提供する。

別の側面において、本発明は、薬剤として使用するための、好ましくは、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象の治療において使用するための、本明細書に定義されるようなＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、または本明細書に定義されるような医薬処方物を提供する。

本発明者らは、本方法が後述するような１以上の利点を提供し得ることを見出した。本方法は、ある骨髄サンプルから得られたＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の培養収量および生産性の実質的増大を可能とする。結果として、１回の骨髄提供で満足のいく生産容量をまかなうために十分となる。さらに、本方法は、臨床使用のためのＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の利用可能性を高める。さらに、本方法により得られるＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の凍結保存は、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象に直接投与可能な細胞製品をもたらす。本方法により得られるＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の凍結保存は、要求に応じて細胞製品の直接的分配および送達、従って、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象の緊急治療を可能とする。さらに、本方法により得られるＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の凍結保存は、細胞製品の全出荷試験を行い、細胞製品の投与前にそれらの結果を得ることを可能とする。加えて、本明細書に定義されるような方法により得られるＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞は有利には、骨誘導能と骨形成能の両方を有する。

本発明のこれらおよびさらなる側面および好ましい実施形態を以下の節および添付の特許請求の範囲に記載する。添付の特許請求の範囲の主題は、これにより本明細書に具体的に組み込まれる。

図１は、Ａ：ＭＳＣ；Ｂ：細胞製品Ａ；Ｃ：細胞製品Ｂ；Ｄ：細胞製品Ｃ−新鮮（ＭＳＣ、細胞製品Ａ、ＢおよびＣそれぞれについてＮ＝１２、６、２２、１５（ＣＤ７３）およびＮ＝２２、８、２２、１８（ＣＤ４４））においてフローサイトメトリーにより分析されたＣＤ７３（図１Ａ）およびＣＤ４４（図１Ｂ）発現レベルを示すグラフを表す。 図２は、従来技術による比較細胞製品および本発明を示す細胞製品の細胞サイズを示すグラフを表す：Ａ：ＭＳＣ；Ｂ：細胞製品Ａ；Ｃ：細胞製品Ｂ；Ｄ：細胞製品Ｃ−新鮮；Ｅ：細胞製品Ｃ−凍結ＣＳ１０；Ｆ：細胞製品Ｃ−凍結ＣＳ１０ 希釈ＨＳＡ １：１；Ｇ：細胞製品Ｃ−凍結ＣＳ１０ ５％ＨＳＡ；Ｈ：細胞製品Ｃ−凍結ＨＴＳ １０％ＨＳＡ １０％ＤＭＳＯ。 図３は、培養期間による細胞密度を示すグラフを表す。細胞は、図３Ａ：手動で（ビルケルチャンバーを用いたトリパンブルー法）または図３Ｂ：サイトメトリー（ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標））により計数した。 図４は、細胞周期分析を種々の培養期間での二次培養における細胞のイベント／周期（Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ）で示すグラフを表す。Ｄ２４で、４２％の細胞がなお増殖しているが（１１％Ｓおよび３１％Ｇ２／Ｍ）、Ｄ２５からは、細胞は主としてこの細胞周期を脱している。 図５は、種々の培養期間での細胞分化マーカー（ＢＭＰ２、ＲＵＮＸ２、ＺＮＦＳ２１、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰ１３、ＣＨＩ３Ｌ１）の発現レベルを示すグラフを表す（Ｄ３４〜Ｄ３８の時点はＮ＝８およびＤ４２の時点はＮ＝６）。 図６は、種々の培養期間での細胞集団の細胞密度を示すグラフを表す（Ｎ＝８）。 図７は、種々の培養期間での２つの細胞集団の平均細胞直径を示すグラフを表す（Ｎ＝２）。 図８は、Ｘ線分析により評価された骨誘導および骨形成を示す。Ａ：骨誘導（Ａ、左のパネル）は、骨の不透明度、従って、骨の厚さと直接相関があるグレー強度値を測定することにより評価される。 骨形成（Ａ、右のパネル）は、Ｘ線撮像によってより屈折して見える結節の表面を測定することにより評価される。Ｂ：骨の不透明度は、賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）で有意に高い（ｎ＝２０（賦形剤）およびｎ＝３４（５つの異なるバッチからのＢ−Ｆ細胞Ｃ）。Ｃ：骨形成の表面は、石灰化した結節が見られなかった賦形剤に比べて有意に高い（ｎ＝２０（賦形剤）およびｎ＝３４（５つの異なるバッチからのＢ−Ｆ細胞Ｃ）。Ｄ〜Ｅ：骨形成（絶対的骨形成により表される）を伴う骨誘導（図８Ｄ）または伴わない骨誘導（図８Ｅ）は賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）で有意に高い。マン・ホイットニーのＵ検定：^＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｆ：骨誘導活性に加えて、骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）は、４／５の骨髄ドナー（またはバッチ生産）および６５％のマウスにおける少なくとも１つの石灰化した結節の存在により示される、高い骨形成活性を促進する（ｎ＝２０（賦形剤）およびｎ＝３４（５つの異なるバッチからのＢ−Ｆ細胞Ｃ）。 図９は、骨形成細胞Ｃ凍結保存品または賦形剤の単回投与の４週間後の冠状組織切片を示す。骨形成細胞Ｃ凍結保存品は、以下の２つの機序により活性を示す：（ｉ）「骨誘導」：膜内骨化をもたらす、パラ分泌による宿主骨形成の刺激および（ｉｉ）「骨形成」：軟骨内骨化による「直接的」骨形成（ドナー由来／ヒト起源）の促進。 図１０は、骨形成細胞Ｃ凍結保存品の単回注射を受けてから４週間後のマウス頭蓋冠の組織学的分析を示す。骨形成細胞Ｃ凍結保存品は、骨誘導および骨形成特性（「ｆｌｕｏ」）を示した。石灰化した結節においてヒト骨形成（「ヒトＩ型コラーゲン」）が強調された（骨形成）。骨芽細胞活性（３つ目のパネルに黒い矢印で示される「ＡＬＰ」）および破骨細胞活性（４つ目のパネルに黒い矢印で示される「ＴＲＡＰ」）はほとんどが石灰化した結節において検出され、結節における骨リモデリングプロセスが投与４週間後になお進行していることを示す。類骨（「ゴールドナーのマッソントリクローム染色」）は強調されず、骨形成プロセスが完了していることを示す。 図１１は、分節大腿骨未臨界サイズ欠損モデル(segmental femoral sub-critical size defect model)における骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）の効果を示す。Ｘ線画像は、賦形剤単独または骨形成細胞Ｃ凍結保存品の投与の０日目から１０週後までの分節大腿欠損を示す。 図１２は、分節大腿骨未臨界サイズ欠損モデル（ｓｕｂ−ＣＳＤモデル）における骨形成細胞Ｃ凍結保存品の効果を示す。このグラフは、外科手術／品目投与（「Ｗ０」）当日および賦形剤単独、または骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）の投与１０週後（「Ｗ１０」）までの経時的なＸ線像における骨修復のパーセンテージを表す；平均±ＳＥＭ、^＊＊＊ｐ＜０．００１（２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ）。 図１３は、分節大腿骨未臨界サイズ欠損モデル（ｓｕｂ−ＣＳＤモデル）における骨形成細胞Ｃ凍結保存品の効果を示す。このグラフは、外科手術／品目投与の当日（「Ｗ０」）および賦形剤単独、または骨形成細胞Ｃ凍結保存品（Ｂ−Ｆ細胞Ｃ）の投与１０週後（「Ｗ１０」）までの経時的なＸ線像から決定されたＲＵＳスコアを表す；平均±ＳＥＭ、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１（２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ）。

好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が別段のことを明らかに示さない限り、単数の指示対象および複数の指示対象の両方を含む。

用語「を含んでなる(“comprising”, “comprises” and “comprised of”)」は、本明細書で使用する場合、「含む(“including”, “includes”)」または「含有する(“containing”, “contains”)」と同義であり、包含またはオープンエンドを示し、列挙されていない付加的なメンバー、要素または方法工程を排除しない。これらの用語はまた、特許技術用語において十分に確立された意味を有する「からなる」および「から本質的になる」も包含する。

端点による数の範囲の列挙は、各範囲内に包含される総ての数および分数、ならびに列挙される端点を含む。

用語「約」または「およそ」は、パラメーター、量、時間などの測定可能な値に関して本明細書で使用する場合、そのような変動が開示されている発明において機能するために適当である限り、指定の値の、また、指定の値からの変動、例えば、指定の値の、また、指定の値からの±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動を包含することを意味する。修飾語「約」が指す値それ自体も具体的かつ好ましく開示されていることが理解されるべきである。

用語「１以上の」または「少なくとも１つの」、例えば、メンバーの群の１以上のメンバーまたは少なくとも１つのメンバーはそれ自体、さらなる例示により明らかになるが、この用語は、とりわけ、前記メンバーのいずれか１つ、または前記メンバーのいずれか２つ以上、例えば、前記メンバーのいずれか≧３、≧４、≧５、≧６または≧７など、および前記メンバーの最大総ての言及を包含する。別の例において、「１以上の」または「少なくとも１つの」は、１、２、３、４、５、６、７またはそれを超えるものを指し得る。

本明細書において本発明の背景の記述は、本発明の内容を説明するために含まれる。これは、言及される材料のいずれかが特許請求の範囲のいずれの優先日を基点としていずれかの国で公開されていた、公知であった、または共通の一般知識の一部であったことを認めるものではない。

本開示中に、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が特定可能な引用により参照される。本明細書に引用される総ての文献はそれらの全内容が本明細書の一部として援用される。特に、本明細書において具体的に参照されるこのような文献の教示または節は本明細書の一部として援用される。

別段の定義がない限り、本発明の開示に使用される総ての用語は、技術用語および科学用語を含め、本発明が属する技術分野の熟練者により共通に理解されているものと同様の意味を有する。さらなる指針によって、用語の定義は本発明の教示をより良く理解するために含まれる。特定の用語が本発明の特定の側面または本発明の特定の実施形態に関して定義される場合、このような内包は、別段の定義がない限り、本明細書全体、すなわち、本発明の他の側面または実施形態に関しても当てはまるものとする。

後段で、本発明の異なる側面または実施形態をさらに詳しく定義する。このように定義される各側面または実施形態は、別段のことが明らかに示されない限り、他のいずれの側面または実施形態と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれの特徴も、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれの他の１または複数の特徴と組み合わせてもよい。

本明細書において「１つの実施形態」、「ある実施形態」という場合には、実施形態に関して記載される特定の特徴、構造または特性は本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書の様々な場所で「１つの実施形態において」または「ある実施形態において」という句が見られる場合、必ずしも総てが同じ実施形態に関するとは限らないが、その場合もある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１以上の実施形態において、本開示から当業者には自明であるような好適ないずれの様式で組み合わせてもよい。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが他の特徴は含まないが、当業者により理解されるように、異なる実施形態の特徴の組合せは本発明の範囲内にあることが意味され、異なる実施形態を形成する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態はいずれも、いずれの組合せで使用してもよい。

１つの側面において、本発明は、ＭＳＣからＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ることを含んでなる方法を提供する。

用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、本明細書で使用する場合、間葉系譜、一般には２つ以上の間葉系譜、より一般には３つ以上の間葉系譜、例えば、軟骨骨芽細胞系譜（軟骨および骨）、骨芽細胞系譜（骨）、軟骨芽細胞系譜（軟骨）、筋細胞系譜（筋肉）、腱細胞系譜（腱）、線維芽細胞系譜（結合組織）、脂肪細胞系譜（脂肪）および間質生成系譜（骨髄間質）の細胞を生成することができる成体の中胚葉由来幹細胞を指す。ＭＳＣは、生体サンプル、好ましくは、ヒト対象の生体サンプル、例えば、骨髄、骨梁、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、具体的には、胎児および青年皮膚、骨膜、歯髄、腱および脂肪組織から単離され得る。

用語「生体サンプル」または「サンプル」は、本明細書で使用する場合、生物源から、例えば、動物またはヒト対象などの生物、細胞培養、組織サンプルなどから得られるサンプルを指す。動物またはヒト対象の生体サンプルは、動物またはヒト対象から取り出された、それらの細胞を含んでなるサンプルを指す。動物またはヒト対象の生体サンプルは１以上の組織種を含んでなってよく、１以上の組織種の細胞を含んでなってよい。動物またはヒト対象の生体サンプルを得る方法は、例えば、組織生検または採血など、当技術分野で周知である。ヒトＭＳＣ、それらの単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大培養、および分化は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；同第５，８１１，０９４号；同第５，７３６，３９６号；同第５，８３７，５３９号；または同第５，８２７，７４０号に記載されている。当技術分野に記載されるいずれかの方法により単離される、当技術分野に記載されるいずれのＭＳＣも本方法において好適であり得る。特に、ＭＳＣは、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ ３系統間葉分化能を示すと定義され得る(Dominici et al., 2006, vol. 8, 315)。

用語「ＭＳＣ」はまた、ＭＳＣの後代、例えば、動物またはヒト対象の生体サンプルから得られたＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ増殖（増殖／拡大培養）により得られた後代を包含する。

用語「幹細胞」は、一般に、自己再生し得る、すなわち、分化することなく増殖し得る、かつそれまたはその後代が少なくとも１つの比較的さらに専門化した細胞種を生じ得る、専門化していないまたは比較的専門化していない、かつ増殖能のある細胞を指す。この用語は、幹細胞の後代または少なくともその一部が、母幹細胞の専門化していないまたは比較的専門化していない表現型、分化能、および増殖能を実質的に保持する、実質的に無制限の自己再生をし得る幹細胞、ならびに限定された自己再生を示す幹細胞、すなわち、後代またはその一部のさらに増殖および／または分化する能力が、母細胞と比較して著しく低下している幹細胞を包含する。例として、限定されるものではないが、幹細胞は、１以上の系譜に分化してますます比較的さらに専門化した細胞を生産し得る子孫（このような子孫および／もしくはますます比較的さらに専門化した細胞はそれ自体、本明細書において定義されるような幹細胞であり得る）を生じ得るか、または有糸分裂後であり得る最終分化細胞、すなわち完全に専門化した細胞さえも生じ得る。

用語「成体幹細胞」は、本明細書で使用する場合、胎児段階、または好ましくは生後の（例えば、特に、しかし限定されるものではないが、ヒト生物では、生後少なくとも１か月齢、例えば、生後少なくとも２か月齢、少なくとも３か月齢、例えば、少なくとも４か月齢、少なくとも５か月齢、例えば、生後少なくとも６か月齢、例えば、生後１歳もしくはそれ以上、５歳以上、少なくとも１０歳以上、１５歳以上、２０歳以上、または２５歳以上の）、例えば、成人に達した後の生物内に存在するかまたはそれから得られる（例えば、単離される）幹細胞を指す。例として、成体幹細胞は、そうでなければ従来の用語「乳児」、「小児」、「若年」、「青年」、または「成人」で記載されるヒト対象から得ることができる。

好ましいＭＳＣは、少なくとも軟骨骨芽細胞系譜の細胞、例えば、骨芽細胞系譜の細胞、例えば、軟骨骨前駆細胞および／もしくは骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞、ならびに／または軟骨芽細胞系譜の細胞、例えば、軟骨骨前駆細胞および／もしくは軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞を生成する能力を有する。

さらに好ましいＭＳＣは、少なくとも骨芽細胞（骨）系譜の細胞、例えば、軟骨骨前駆細胞および／もしくは骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞など；または少なくとも軟骨芽細胞（軟骨）系譜の細胞、例えば、軟骨骨前駆細胞および／もしくは軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞；線維芽細胞（結合組織）系譜の細胞、例えば、線維芽細胞、線維細胞；または少なくとも滑膜細胞（滑液）；または腱細胞などを生成する能力を有する。

記載されている場合を除き、「対象」または「患者」は互換的に使用され、動物、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは、哺乳動物を指し、具体的には、ヒト患者および非ヒト哺乳動物を含む。好ましい患者は、ヒト対象である。動物対象は、例えば胎仔などの動物の出生前形態を含む。ヒト対象は胎児を含み得るが、胚は含まない。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、対象は、ヒト対象であり得る。

用語「細胞製品」は、本明細書で使用する場合、ＭＳＣ由来細胞、本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞、本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、または本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞もしくは本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる医薬処方物、例えば、投与に好適な細胞製品（例えば、凍結保存培地中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞）を指す。

ある実施形態において、ＭＳＣは健康な対象から得てよく、これは前記ＭＳＣから得られたＭＳＣ由来細胞の機能性を保証する助けとなり得る。

別の実施形態において、ＭＳＣは、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とするヒト対象から得られる。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、治療対象と同種異系であり得る。ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞に関して用語「同種異系」または「同種」は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞が、ＭＳＣ由来細胞と接触させる、またはＭＳＣ由来細胞で処置する対象以外の１以上の（プールされた）対象から得られることを表す。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、治療対象に対して自己であり得る。ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞に関して用語「自己」は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞が、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞と接触させる、またはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞で処置するものと同じ対象から得られることを表す。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、自己と同種異系（すなわち、同種）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の混合物を含んでなり得る。好ましくは、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、治療対象に対して同種異系である。

用語「間葉系幹細胞由来細胞」または「ＭＳＣ由来細胞」は、本明細書で使用する場合、ＭＳＣの分化により得られる、特に、ＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏを含む）分化により得られる、間葉系譜（例えば、軟骨骨芽細胞系譜（骨および軟骨）、骨芽細胞系譜（骨）、軟骨芽細胞系譜（軟骨）、筋細胞系譜（筋肉）、腱細胞系譜（腱）、線維芽細胞系譜（結合組織）、脂肪細胞系譜（脂肪）、または間質形成系譜（骨髄間質））の細胞を指す。

ＭＳＣの分化は、ＭＳＣをＭＳＣの所望の細胞種への分化を誘導し得る条件下で培養すること、より一般には、ＭＳＣをＭＳＣの所望の細胞種への分化を誘導し得る１以上の薬剤（例えば、増殖因子）を含んでなる培地で培養することを含み得る。ＭＳＣの分化のためのプロトコールはそれ自体公知である（とりわけ、ＷＯ２００７／０９３４３１；およびさらにREGER, R.L. et al. ‘Differentiation and Characterization of Human MSCs’. In: Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), D.J. Prockop et al.編 Humana Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107; VERMURI, M.C. et al. (編). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, 特に201〜352頁) 参照）

用語「増殖因子」は、本明細書で使用する場合、単独でまたは他の物質により媒介される場合に、様々な細胞種の増殖、成長、分化、生存および／または遊走に影響を及ぼし、生物の発生的、形態的および機能的変化に影響を及ぼし得る生物学的に活性な物質を指す。増殖因子は一般に、細胞内に存在する受容体（例えば、表面または細胞内受容体）に、増殖因子に応答してリガンドとして結合することにより作用する。本明細書において増殖因子は、特に、１以上のポリペプチド鎖を含んでなるタンパク質性の実体であり得る。例として、限定されるものではないが、用語「増殖因子」は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリー、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリー、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）ファミリー、成長分化因子（ＧＤＦ）ファミリー、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）ファミリー、造血増殖因子（ＨｅＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、アンギオポエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、グルココルチコイドなどのメンバーを包含する。当業者には、増殖因子または増殖因子の組合せは、ＭＳＣの所望の細胞種への分化を誘導し得ることが知られるいずれの増殖因子または増殖因子の組合せであってもよいことが理解されるであろう。当業者は、ＭＳＣの所望の細胞種への（例えば、軟骨骨芽細胞系譜細胞への）分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、所望の細胞種の実質的に純粋な（すなわち、主としてそれからなる）細胞集団を生じ得ることを認識するであろう。限定されるものではないが、このようにして誘導された細胞集団は、少なくとも９０％（数で）の所望の細胞種、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％の所望の細胞種を含有し得る。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、軟骨骨芽細胞系譜（軟骨および骨）のものである。

「ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞」という記載は、本明細書で使用する場合、軟骨骨前駆細胞、骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞などの骨芽細胞系譜の細胞へ、または、軟骨骨前駆細胞、軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞などの軟骨芽細胞系譜の細胞へ分化する能力を有する前駆細胞を指し得る。当業者には、前駆細胞は、それらがｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで曝される物理的因子、および／または増殖因子などの化学的もしくは生物学的成分といった条件に応じて、骨芽細胞系譜の細胞（例えば、前骨芽細胞もしくは骨芽細胞）へ、または軟骨芽細胞系譜の細胞（例えば、前軟骨芽細胞もしくは軟骨芽細胞）へ分化することが理解されるであろう。

特定の実施形態において、「骨芽細胞系譜の細胞」または「ＭＳＣ由来骨芽細胞系譜細胞」という記載は、骨芽細胞表現型を有し、軟骨骨前駆細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、または骨細胞、またはそれらの混合物など、骨材料または骨基質の形成に寄与し得る、または寄与し得る細胞へ発達し得る細胞種を指し得る。本明細書で使用する場合、「骨前駆細胞」は、特に初期および後期骨前駆細胞を含んでなり得る。好ましくは、「骨芽細胞系譜の細胞」または「ＭＳＣ由来骨芽細胞系譜細胞」は、軟骨骨前駆細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、もしくは骨芽細胞、またはそれらの混合物を等しく指し得るが、さらにより好ましくは、この句は軟骨骨前駆細胞もしくは前骨芽細胞もしくは骨芽細胞、またはそれらの混合物を指し得、例えば、特定の例では、この句は前骨芽細胞を指し得、または他の特定の例では、この句は骨芽細胞を指し得る。これらの用語は総て、それ自体周知である。

さらなる指針により、限定されるものではないが、骨前駆細胞、前骨芽細胞および骨芽細胞、ならびに骨前駆細胞、前骨芽細胞および／または骨芽細胞を含んでなる細胞集団は、以下の特性を示し得る：
ａ）これらの細胞は、骨芽細胞分化および骨芽細胞分化中の多くの細胞外基質タンパク質遺伝子の発現を調節する多機能性転写因子であるＲｕｎｔ関連転写因子２（Ｒｕｎｘ２）の発現を含む；
ｂ）これらの細胞は、以下：アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には、骨−肝臓−腎臓型のＡＬＰのうち少なくとも１つの発現を含み；より好ましくは、オステオカルシン（ＯＣＮ、ＢＧＬＡＰ）、１型プロコラーゲンアミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、オステオネクチン（ＯＮ、ＳＰＡＲＣ）、オステオポンチン（ＯＰＳＴ、ＳＰＰ１、ＯＰＮ）および／もしくは骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）などの１以上のさらなる骨マーカー、および／またはデコリンおよび／もしくはオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの１以上のさらなる骨基質タンパク質の発現もまた含む；
ｃ）これらの細胞はＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、ＣＤ４５を発現し得る細胞は約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約２％未満）；
ｄ）これらの細胞は、外部環境を石灰化する、またはカルシウム含有細胞外基質を合成する能力の証拠を示す（例えば、骨形成培地に曝された場合；Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312参照）。カルシウムの細胞内蓄積および基質タンパク質への沈着は、例えば、^４５Ｃａ^２＋中で培養し、洗浄し、再培養した後に、細胞内に存在するまたは細胞外基質に沈着した放射能を測定すること（米国特許第５，９７２，７０３号）によるか、またはアリザリンレッドに基づく石灰化アッセイ（例えば、Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84参照）を用いて慣例的に測定することができる；
ｅ）これらの細胞は、脂肪細胞系譜の細胞（例えば、脂肪細胞）にも軟骨芽細胞系譜の細胞（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞）にも実質的に分化しない。このような系譜への分化がないことは、当技術分野で確立されている標準的な分化誘導条件（例えば、Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7参照）、およびアッセイ法（例えば、誘導されると、脂肪細胞は一般にオイルレッドＯで染まって脂質蓄積を示し；軟骨細胞は一般にアルシアンブルーまたはサフラニンオレンジで染まる）を用いて試験され得る。脂肪生成および／または軟骨形成分化傾向が実質的に無いことは一般に、各試験に適用した場合に脂肪生成または軟骨形成分化の徴候を示すものが供試細胞のうち２０％未満、または１０％未満、または５％未満、または１％未満であることを意味する。

特定の実施形態において、「軟骨芽細胞（軟骨）系譜の細胞」または「ＭＳＣ由来軟骨芽細胞（軟骨）系譜細胞」という記載は、軟骨芽細胞表現型を有し、軟骨または軟骨基質の形成に寄与し得る、または寄与し得る細胞へ発達し得る細胞種を指し得る。本明細書で使用する場合、「軟骨前駆細胞」は、特に初期および後期軟骨前駆細胞を含んでなり得る。好ましくは、「軟骨芽細胞（軟骨）系譜の細胞」または「ＭＳＣ由来軟骨芽細胞（軟骨）系譜細胞」は、軟骨骨前駆細胞、軟骨前駆細胞、前軟骨芽細胞、もしくは軟骨芽細胞、またはそれらの混合物を指し得、さらにより好ましくは、この句は前軟骨芽細胞もしくは軟骨芽細胞、またはそれらの混合物を指し得、例えば、特定の例において、この句は前軟骨芽細胞を指し得、または他の特定の例において、この句は軟骨芽細胞を指し得る。これらの用語は総て、それ自体周知である。

さらなる指針により、限定されるものではないが、軟骨骨芽細胞系譜および／または軟骨芽細胞系譜の細胞、例えば、軟骨骨前駆細胞、軟骨前駆細胞、前軟骨芽細胞および軟骨芽細胞、ならびに軟骨骨前駆細胞、軟骨前駆細胞、前軟骨芽細胞および／または軟骨芽細胞を含んでなる細胞集団は、以下の特性を示し得る：
ａ）これらの細胞は、軟骨芽細胞分化および軟骨形成中に中枢的役割を果たす転写因子であるＳＯＸ９の発現を含む；
ｂ）これらの細胞は、以下：アグレカン（ＡＣＡＮ）、ＩＩ型コラーゲン、またはＣＤ９０のうち少なくとも１つの発現を含む；
ｃ）これらの細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、ＣＤ４５を発現し得る細胞は約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約２％未満である）；
ｄ）これらの細胞は、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、高レベルのＩＩ、ＩＸ、およびＸＩ型コラーゲンならびにプロテオグリカンを産生する能力の証拠を示す（これらはヒアリン細胞外基質（ＥＣＭ）の主要な構成成分である）。軟骨形成は、例えば、それぞれプロテオグリカンおよび非コラーゲン性タンパク質を染色するサフラニンオレンジ／ファストグリーンアッセイを用いることにより慣例的に測定することができる（例えば、Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98参照）；
ｅ）ヒト関節軟骨細胞は、Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell Physiol, vol. 202(3), 731-42)に概要が示されているような細胞発現特性を示し得、例えば、これらの細胞はインテグリンおよびその他の接着分子（ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１／６１、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、ＣＤ５８、ＣＤ４４）、テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１５１）、受容体（ＣＤ１０５、ＣＤ１１９、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ２２１、ＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ７１、ＣＤ１４）、外酵素（ＣＤ１０、ＣＤ２６）、およびその他の表面分子（ＣＤ９０、ＣＤ９９）を発現し得る。単層培養中、軟骨細胞は、間葉系幹細胞に特有と見なされる特定のマーカー（ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６）を上方調節し得る。従って、このようなマーカーは、成熟度の低い前軟骨芽細胞または軟骨芽細胞によっても発現される場合がある。
ｆ）これらの細胞は、脂肪細胞系譜の細胞（例えば、脂肪細胞）にも骨芽細胞系譜の細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞）にも実質的に分化しない。このような細胞系譜への分化がないことは、当技術分野で確立されている標準的な分化誘導条件（例えば、Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7参照）およびアッセイ法（例えば、誘導されると、脂肪細胞は一般にオイルレッドＯで染まって脂質蓄積を示し；前骨芽細胞および骨芽細胞は一般にＡＬＰで染まる）を用いて試験され得る。脂肪生成および／または骨芽細胞分化傾向が実質的に無いことは一般に、各試験に適用した場合に脂肪生成または骨芽細胞分化の徴候を示すものが供試細胞のうち２０％未満、または１０％未満、または５％未満、または１％未満であることを意味する。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、骨形成特性を有し得る。

用語「骨形成特性」、「骨形成能」または「骨形成活性」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｖｏ、所望により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける骨基質分泌細胞へ（転換）分化する細胞の能力または骨基質を分泌する細胞の能力（すなわち、（転換）分化ステップの必要がない）を指す。この用語は、膜内骨化または軟骨内骨化により骨組織を形成する細胞の能力を包含する。膜内骨化により骨組織を形成する細胞の能力は一般に、鋳型としての骨化軟骨基質の必要なく骨組織を形成する細胞の能力を表す。軟骨内骨化により骨組織を形成する細胞の能力は一般に、まず石灰化した軟骨基質を形成し、次に前記の石灰化した軟骨基質を骨組織形成の鋳型として使用することにより骨組織を形成する細胞の能力を表す。この用語は細胞の骨誘導能を包含しない。

例えば、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞効力は、このような細胞の骨形成活性を測定することにより決定することができる。ヒトＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の骨形成活性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、頭蓋冠への皮下注射によりマウスに細胞を投与した後に（例えば、ヒト起源またはヒト−マウス混合起源の）少なくとも１つの石灰化した結節の存在を決定することにより測定することができる。ヒトＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の骨形成活性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、頭蓋冠への皮下注射によりマウスに細胞を投与した後に（例えば、ヒト起源またはヒト−マウス混合起源の）新たに石灰化した結節の厚さを評価することによるか、またはマウス大腿分節未臨界サイズ欠損（ｓｕｂ−ＣＳＤ）モデルにおいて骨修復度を評価することによって測定することができる。

例えば、１００μｌの賦形剤中に処方された２．５×１０^６細胞などのヒトＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、頭蓋冠骨への単回皮下投与によりヌードマウスに投与することができる。骨の経時的新形成を標識するために、アリザリンレッド（赤）、カルセイン（緑）、カルセイン（青）およびテトラサイクリン（黄）などのカルシウム結合蛍光色素を、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系細胞の細胞投与のそれぞれ３日前および４日後、８日後、および１２日後にマウス腹腔内注射により順次投与することができる。マウスを細胞投与の２週間後に安楽死させ、組織形態計測（例えば、骨形成の定量）により骨形成特性を評価するために各マウスの頭蓋冠を採取することができる。頭蓋冠の初期厚と最終厚を用いて細胞の投与後の骨新形成のパーセンテージを計算することができる。さらに、骨形成特性はまた、免疫蛍光（例えば、マウス起源またはヒト起源の骨形成）によって評価することもできる。骨芽細胞活性は、頭蓋冠切片においてＡＬＰ酵素活性検出法を用いて評価することができる。破骨細胞活性は、頭蓋冠切片においてＴＲＡＰ酵素活性検出法を用いて評価することができる。新形成骨の石灰化の状態は、例えば、市販のキット（例えば、Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ（登録商標））を用いてＡＬＰで染色した頭蓋冠切片においてマッソントリクロームゴールドナー染色を用いて評価することができる。軟骨形成は、頭蓋冠矢状パラフィン切片におけるサフラニンオレンジ染色を用いて評価することができる。

さらなる例において、大腿分節未臨界サイズ欠損を施した１日後に経皮注射により、５０μｌの賦形剤中に処方した１．２５×１０^６細胞などの、ヒトＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞をマウスの骨欠損部位に局部的に投与することができる。骨修復はＸ線撮像により定量することができる。骨欠損サイズは、骨欠損の二端の間の距離を測定することにより定量することができる。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、骨誘導特性を有し得る。

用語「骨誘導特性」、「骨誘導能」または「骨誘導活性」は、本明細書で使用する場合、他の骨基質分泌細胞を誘引し、かつ／または他の細胞の骨基質分泌細胞への（転換）分化を誘導する細胞の能力を指す。

例えば、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞効力は、このような細胞の骨誘導活性を測定することにより決定することができる。ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の骨形成誘導能は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、頭蓋冠への皮下注射によりマウスに細胞を投与した後に新たに石灰化した骨の厚さを評価することによるか、またはマウス大腿分節未臨界サイズ欠損（ｓｕｂ−ＣＳＤ）モデルにおいて骨修復を評価することによって測定することができる。ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の骨形成誘導能はまた、例えば、ＡＬＰ基質染色によるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性評価によって測定することもできる。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、骨誘導特性と骨形成特性の両方を有し得る。有利には、本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、それを必要とする対象に移植した際に、従来技術の方法により得られたＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の移植と比較した場合にその骨新形成を超える骨新形成を可能とする。

例として、限定されるものではないが、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞属性を評価するために好適な細胞表面マーカーとしては、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０、およびＣＤ４４を含み得る。これらの細胞表面マーカーは、例えば、フローサイトメトリーによる細胞検出を可能とする蛍光色素標識モノクローナル抗体などの市販のモノクローナル抗体により検出することができる。特に、ＣＤ７３およびＣＤ１０５は間葉マーカーであり；ＣＤ４４は接着マーカーであり；およびＣＤ１０はＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の高い画分により一般に発現される骨軟骨芽細胞マーカーである。ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞表面のＣＤ７３の量は一般に高く；ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞表面のＣＤ１０５の量は一般に低く；ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞表面のＣＤ４４の量は一般に高い。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０陽性である。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ３４陰性である。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ３４陰性である。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３陰性である。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３陰性である。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、ＣＤ７３の蛍光強度の正規化中央値（ｎＭＦＩ）（ｎＭＦＩ_ＣＤ７３）が少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩ（ｎＭＦＩ_ＣＤ４４）が少なくとも１００またはＣＤ１０５のｎＭＦＩ（ｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}）が多くても１５０のうちいずれか１以上を有する。例えば、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０または少なくとも９００のｎＭＦＩ_ＣＤ７３；少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００または少なくとも３５０のｎＭＦＩ_ＣＤ４４；または多くても１８０、多くても１７０、多くても１６０、多くても１５０、多くても１４０、多くても１３０、多くても１２０、多くても１１０または多くても１００のｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}のうちいずれか１以上を有する。好ましくは、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、少なくとも５００のｎＭＦＩ_ＣＤ７３、少なくとも１００のｎＭＦＩ_ＣＤ４４、および多くても１５０のｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}を有する。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４陽性であり（すなわち、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現し）、かつ、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、少なくとも５００のｎＭＦＩ_ＣＤ７３、少なくとも１００のｎＭＦＩ_ＣＤ４４または多くても１５０のｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}のうちいずれか１以上を有する。例えば、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４陽性であり（すなわち、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現し）、かつ、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０または少なくとも９００のｎＭＦＩ_ＣＤ７３；少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００または少なくとも３５０のｎＭＦＩ_ＣＤ４４；および多くても１８０、多くても１７０、多くても１６０、多くても１５０、多くても１４０、多くても１３０、多くても１２０、多くても１１０または多くても１００のｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}のうちいずれか１以上を有する。好ましくは、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４陽性であり（すなわち、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現し）、かつ、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、少なくとも５００のｎＭＦＩ_ＣＤ７３、少なくとも１００のｎＭＦＩ_ＣＤ４４、および多くても１５０のｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}を有する。

「蛍光強度の正規化中央値」または「ｎＭＦＩ」は、本明細書で使用する場合、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）などの蛍光色素がコンジュゲートされた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照などの１以上の蛍光色素コンジュゲートアイソタイプ対照抗体で標識された全分析細胞集団のＭＦＩ（ＭＦＩ_{ｉｓｏｔｙｐｅ＿ｃｈａｎｎｅｌ}）に対する、１以上の蛍光色素コンジュゲート抗体で標識されたその細胞集団のＭＦＩ（ＭＦＩ_{ｍａｒｋｅｒ＿ｃｈａｎｎｅｌ}）の比を指す。ｎＭＦＩ結果は、対象とする集団の細胞表面に存在するマーカーの量に比例する。（ｎ）ＭＦＩは一般に、蛍光シグナルの放出が測定される波長に関連する。

「ＣＤ７３のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩ_ＣＤ７３」という記載は、本明細書で使用する場合、ＡＰＣがコンジュゲートされたＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５７５１）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩに対する、ＡＰＣにコンジュゲートされたＣＤ７３に対する抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６０８４７）で標識されたその細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩ_ＣＤ７３は、ＡＰＣに関して、励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される。

「ＣＤ４４のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩ_ＣＤ４４」という記載は、本明細書で使用する場合、ＰＥがコンジュゲートされたＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５６６５０）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩに対する、ＰＥにコンジュゲートされたＣＤ４４に対する抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５０９８９）で標識されたその細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩ_ＣＤ４４は、ＰＥに関して、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。

「ＣＤ１０５のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}」という記載は、本明細書で使用する場合、ＡＰＣがコンジュゲートされたＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５７５１）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩに対する、ＡＰＣにコンジュゲートされたＣＤ１０５に対する抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６２４０８）で標識された細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩ_{ＣＤ１０５}は、ＡＰＣに関して、励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される。

「ＣＤ１０のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩ_ＣＤ１０」は、本明細書で使用する場合、ＰＥがコンジュゲートされたＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５６６５０）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩに対する、ＰＥにコンジュゲートされたＣＤ１０に対する抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５３７５）で標識されたその細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩ_ＣＤ１０は、ＰＥに関して、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。

前述したように、上記に詳説した方法は、特に、（ｉ）細胞の軟骨骨芽細胞系譜または骨芽細胞系譜への運命決定を表すＡＬＰの高い発現、および（ｉｉ）細胞が例えば同種異系対象への細胞移植により好適であることを示す、ＭＳＣ由来骨軟骨芽細胞系譜または骨芽細胞系譜細胞の限定された免疫原性を表す低いＨＬＡ−ＤＲ発現などのより優れた特性を有するＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞、またはその集団をもたらし得る。

よって、特定の実施形態において、少なくとも７０％（数で）（例えば、少なくとも７５％（数で）、例えば、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）陽性であり；１０％未満（数で）（例えば、５％未満（数で）、例えば、３％未満、２％未満、または１％未満）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＨＬＡ−ＤＲ陽性である。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ３４陰性であり；少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％（数で）、例えば、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）陽性であり；１０％未満（例えば、５％未満（数で）、例えば、３％未満、２％未満、または１％未満）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＨＬＡ−ＤＲ陽性である。

特定の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数で）、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３陰性であり；少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％（数で）、例えば、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）陽性であり；１０％未満（例えば、５％未満（数で）、例えば、３％未満、２％未満、または１％未満）のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞がＨＬＡ−ＤＲ陽性である。

細胞が特定のマーカーに対して陽性である（またはそのマーカーを発現するもしくはその発現を含む）と言われる場合、これは、当業者が適当な測定を行った場合に、適切な対照と比較して、そのマーカーに対する明瞭なシグナルの存在または証拠、例えば、検出可能な抗体または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による検出を結論付けることを意味する。この方法がマーカーの定量的評価を可能とする場合、陽性細胞は、対照とは有意に異なる、例えば、限定されるものではないが、対照細胞により生成されるこのようなシグナルの少なくとも１．５倍、例えば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍またはさらにはそれを超える高さのシグナルを平均して生成し得る。

上記の細胞特異的マーカーの発現は、免疫組織化学またはアフィニティー吸着、ウエスタンブロット解析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で公知の任意の好適な免疫学的技術を用いて、または酵素活性（例えば、ＡＬＰ）の任意の好適な生化学的アッセイにより、またはマーカーｍＲＮＡの量を測定する任意の好適な技術、例えば、ノーザンブロット、半定量的もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲなどにより検出することができる。本開示に列挙されているマーカーの配列データは既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などの公開データベースから得ることができる。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、動物細胞、好ましくは、温血動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞、最も好ましくは、ヒト細胞であり得る。

用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、本明細書で使用する場合、動物またはヒト身体の外側または外部を表す。用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、本明細書で使用する場合、「ｅｘ ｖｉｖｏ」を含むと理解されるべきである。用語「ｅｘ ｖｉｖｏ」は一般に、動物またはヒト身体から取り出され、かつ、体外で、例えば、培養容器内で維持または増殖された組織または細胞を指す。

ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、本明細書で意図する場合、好ましくは、接着性であり、すなわち、増殖に表面を必要とし、一般に、培養培地中で自由に浮遊する細胞（懸濁培養）ではなく、前記表面で接着単層として増殖する（すなわち、接着細胞培養）。組織培養プラスチック容器の表面などの表面への細胞の接着は、倒立顕微鏡下での目視検査により容易に調べることができる。接着培養で増殖される細胞は、周期的継代培養を必要とし、そこでは、細胞が表面から酵素的に（例えば、トリプシンを用いて）取り出され、増殖培地に懸濁され、新しい培養容器に再播種され得る。一般に、細胞の接着を可能とする表面または基質は実質的に親水性のいずれの基質であってもよい。当技術分野で知られているように、組織培養容器、例えば、培養フラスコ、ウェルプレート、ディッシュなどは、通常、親水性基質表面を提供するために成形後に適宜表面処理またはコーティングされた多様なポリマー材料から作製され得る。用語「接触させる」とは、本明細書で使用する場合、１以上の分子、成分または材料を別のものと直接的または間接的に一緒にし、それにより、それらの間の相互作用を促進することを意味する。一般に、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の拡大培養および／または分化を誘導し得る１以上の薬剤を、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が培養される培地にそれらを含めることによって、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞と接触させることができる。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ることを含んでなり得る。工程（ａ）は、本明細書において「一次培養」と呼称する場合がある。

用語「線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）」、「塩基性ＦＧＦ」、「ＦＧＦ−ｂ」、「ＦＧＦＢ」、「ＢＦＧＦ」、「ヘパリン結合増殖因子２（ＨＢＧＦ−２）」、または「プロスタトロピン」は互換的に使用することができ、線維芽細胞増殖因子ファミリーのよく知られているメンバーに関する。本発明者らは、ＦＧＦ−２が本発明の方法において特に有効であることを認めた。

用語「トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）」、「ＴＧＦＢ」または「ＴＧＦβ」は、本明細書で使用する場合、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリーのメンバーを指す。本発明者らは、ＴＧＦβが本発明の方法において特に有効であることを認めた。さらなる実施形態において、ＴＧＦβファミリーの前記メンバーは、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３、ＴＧＦ−β−４、ＧＤＦ１（成長分化因子１）、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５、ＩＮＨＡ（インヒビンα鎖）、ＩＮＨＢＡ（インヒビンβＡ鎖）、ＩＮＨＢＢ（インヒビンβＢ鎖）、ＩＮＨＢＣ（インヒビンβＣ鎖）、ＩＮＨＢＥ（インヒビンβＥ鎖）、ＭＩＳ（ミューラー管阻害因子）、ならびにさらにＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、ＮＲＴＮ（ニュールツリン）、ＰＳＰＮ（パーセフィン）、およびそれらの混合物を含むＧＤＮＦサブファミリーのメンバーからなる群から選択される。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＴＧＦβは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。好ましくは、ＴＧＦβはＴＧＦβ１である。

さらなる実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβに加えて、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ以外の１以上の付加的な、外因的に加えた増殖因子と接触させてもよい。別の実施形態において、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβは、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞と接触させる唯一の外因性増殖因子であり得る。

好ましい実施形態において、本方法において使用される増殖因子は、ヒト増殖因子である。本明細書で使用する場合、用語「ヒト増殖因子」は、天然ヒト増殖因子と実質的に同じ増殖因子を指す。例えば、増殖因子がタンパク質性の実体である場合、その構成ペプチドまたはポリペプチドは、天然ヒト増殖因子と同一の一次アミノ酸配列を有し得る。本方法におけるヒト増殖因子の使用は、そのような増殖因子は細胞機能に望ましい効果を惹起すると思われるので好ましい。

用語「天然」は、ヒトにより人工的に生産されるのとは違って自然界に見られる対象または実体を表すために使用される。例えば、天然源から単離することができ、研究室でヒトにより意図的に改変されていない生物に存在するポリペプチド配列は、天然のものである。特定の実体、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質に関して、この用語はあらゆる形態および例えば個体間の通常の変動のために自然界に見られるそれらの変異体を包含する。例えば、タンパク質性増殖因子という場合には、用語「天然」は、個体間の通常の対立遺伝子変形形態のためにそれらの構成ペプチドまたはポリペプチドの一次配列に違いを有する増殖因子を包含する。

本方法は、増殖因子の生物学的に活性な変異体または断片を使用し得る。本発明の方法において、増殖因子の「生物学的に活性な」変異体または断片は、他の条件が実質的に同じである場合に、各増殖因子と少なくともほぼ同程度の、ＭＳＣからの本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の取得を達成する。

ポリペプチドの「変異体」は、そのポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一の（すなわち、大部分は同一であるが、完全には同一でない）アミノ酸配列を有する。ここで、「実質的に同一」とは、少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％同一、例えば、少なくとも９９％同一を指す。配列の違いは１以上のアミノ酸の挿入（付加）、欠失および／または置換から生じ得る。

別の実施形態において、本方法において使用される増殖因子、すなわち、少なくともＦＧＦ−２およびＴＧＦβは、非ヒト動物増殖因子、特に非ヒト哺乳動物増殖因子、またはそれらの生物学的に活性な変異体もしくは誘導体であり得る。本明細書で使用する場合、用語「非ヒト動物増殖因子」および「非ヒト哺乳動物増殖因子」は、それぞれ天然非ヒト動物増殖因子または非ヒト哺乳動物増殖因子と実質的に同じ増殖因子を指す。例えば、増殖因子がタンパク質性の実体である場合、その構成ペプチドまたはポリペプチドは天然非ヒト動物または非ヒト哺乳動物増殖因子と同一の一次アミノ酸配列を有し得る。当業者は、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物増殖因子は、ヒト動物増殖因子(human animal growth factors)よりも程度は低いものの（それらはＭＳＣ細胞と同じ起源のものであるので）、本方法で適用可能であることを理解するであろう。特に、非ヒト動物増殖因子または非ヒト哺乳動物増殖因子は、それらが所望の効果、例えば、（類似の）ヒト増殖因子と同等の効果を惹起すれば使用可能である。

好ましい実施形態において、増殖因子またはそれらの生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は組換え型であり、すなわち、宿主生物またはその祖先に導入され、前記ポリペプチドをコードする配列を含んでなる組換え核酸分子の発現により宿主生物により生産される。用語「組換え核酸分子」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術を用いて相互連結されたセグメントから構成される核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子）を指す。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、培地がさらに血漿、血清またはその代替物のうち１以上を含んでなる場合などには、それらとのさらなる接触が行われる。

用語「血漿」は、従来の定義の通りであり、新鮮血漿、解凍された凍結血漿、溶媒／界面活性剤処理血漿、加工血漿（例えば、ＰＲＰ）、またはそれらの２つ以上の混合物を含んでなる。血漿は通常、抗凝固剤（例えば、ヘパリン（極めて低濃度、一般に、約１５×１０^−５ＩＵ／ｍｌ、クエン酸塩、シュウ酸塩またはＥＤＴＡ）とともに提供される、または抗凝固剤と接触された全血のサンプルから得られる。次に、血液サンプルの細胞成分が適当な技術、一般に、遠心分離により、液体成分（血漿）から分離される。本発明において使用するために好適な血漿を得るための具体例として、限定されるものではないが、血液サンプルを、抗凝固剤ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するバキュテナーチューブ（例えば、ＢＤバキュテナープラスチックＥＤＴＡチューブ、１０ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍＬ）に抜き取ることができる。このサンプルを穏やかに振盪した後に、室温で１０分、１，０００〜２，０００ｇで遠心分離して赤血球から血漿を分離する。上清（血漿）を回収し、場合によりプールし（複数の血液サンプルを使用する場合）、凍結バイアルに分取し、これらを使用まで−８０℃で保存する。用語「血漿」は、ヒトまたは動物身体の一部を形成しない組成物を指す。用語「血漿」は、特定の実施形態において、具体的には、処理血漿、すなわち、全血からのその分離の後に、その組成、具体的には、その化学的組成、生化学的組成、または細胞組成を変更する１以上の処理工程を受けた血漿を含み得る。よって、用語「血漿」は、本明細書で意図する場合、多血小板血漿（ＰＲＰ）、すなわち、血小板を富化した血漿を含み得る。一般に、ＰＲＰは約１．０×１０^６血小板／μｌを含有し得るが、全血中の血小板濃度は約１．５×１０^５〜３．５×１０^５／μＬであり得る。

血漿は、溶媒／界面活性剤で処理してよい。用語「溶媒／界面活性剤処理血漿」、「Ｓ／Ｄ処理血漿」、または「Ｓ／Ｄ血漿」は一般に、（ａ）血漿を溶媒および界面活性剤で処理する工程および（ｂ）溶媒／界面活性剤処理血漿を濾過する工程を含んでなる方法により得ることができるまたは得られた脱細胞化血漿を指す。このような処理に好適な溶媒は、ジアルキルまたはトリアルキルホスフェートなどの溶媒および米国特許第４，７６４，３６９号に記載の界面活性剤である。Ｓ／Ｄ血漿を調製するために使用される界面活性剤は好ましくは、非毒性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）である。

用語「血清」は、従来の定義の通りであり、新鮮血清、解凍された凍結血清もしくは血漿から調製された血清、またはそれらの２つ以上の混合物を含んでなる。血清は、通常全血サンプルから、まず、サンプル中で凝固させ、次に、このようにして形成された血餅および血液サンプルの細胞成分を液体成分（血清）から適当な技術、一般に、遠心分離により分離することにより得ることができる。凝固は、不活性触媒、例えば、ガラスビーズまたは粉体により促進することができる。あるいは、血清は、血漿から、抗凝固剤およびフィブリンを除去することにより得ることもできる。本発明において使用するために好適な血清を得るための具体例として、限定されるものではないが、血液サンプルを、抗凝固剤不含のバキュテナーチューブ（例えば、ＢＤバキュテナープラスプラスチック血清チューブ、１０ｍｌ）に抜き取り、室温で３０〜４５分インキュベートして凝固させる。次に、このチューブを室温で１５分間、１，０００〜２，０００ｇで遠心分離して、赤血球から血清を分離する。上清（血清）を回収し、場合によりプールし（複数の血液サンプルを使用する場合）、凍結バイアルに分取し、これらを使用まで−８０℃で保存する。ゆえに、用語「血清」は、ヒトまたは動物身体の一部を形成しない無細胞組成物を指す。血清は、本明細書で意図する場合、ヒト血清、すなわち、単一のヒト対象または複数のヒト対象（例えば、血清混合プール）から得られたものである。血清は、未処理血清、すなわち、全血からの分離により得られ、任意選択の熱不活性化、保存（低温または非低温）、滅菌、凍結乾燥および／または濾過以外の、その化学的組成、生化学的組成、または細胞組成を変更する下流処理工程を受けていない血清であり得る。特定の実施形態において、血清は、溶媒／界面活性剤処理血漿から得ることができる。

単離された血漿、血清またはその代替物は、本発明の方法において直接使用することができる。それらはまた、後の使用のために適宜保存することができる（例えば、血漿、血清またはその代替物の各凍結点より高いが周囲温度より低い温度（この温度は通常約４℃〜５℃である）で短期間、例えば、最大約１〜２週間；または通常約−７０℃〜約−８０℃で凍結保存により長期間）。

単離された血漿、血清またはその代替物は、特に補体を除去するために当技術分野で公知のように熱失活させることができる。本方法がその存在下で培養される細胞にとって自己の血漿、血清、またはその代替物を使用する場合、血漿、血清またはその代替物を熱不活性化する必要はない場合がある。血漿、血清またはその代替物が培養細胞に対して少なくとも部分的同種異系である場合、血漿、血清またはその代替物を熱不活性化することが有利であり得る。場合により、血漿、血清またはその代替物はまた、保存または使用前に、好ましくは０．２μｍ以下の孔径を有する、従来の微生物用フィルターを用いて除菌してもよい。

ある実施形態において、本方法は、接触させるヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞にとって自己のヒト血漿、血清またはその代替物を使用し得る。血漿、血清またはその代替物に関して「自己」という用語は、その血漿、血清またはその代替物が前記血漿、血清またはその代替物と接触させるＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞と同じ対象から得られることを表す。自己の血漿、血清またはその代替物の使用は、対象によるその細胞の最適な受容を保証し、かつ／または例えば他の血清からの病原体の偶発的伝達を回避し得る。

別の実施形態において、この方法は、接触させるヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞に対して「同種」または「同種異系」のヒト血漿、血清またはその代替物、すなわち、ＭＳＣが得られる対象以外の１以上の（プールされた）ヒト対象から得られるものを使用し得る。

さらなる実施形態において、この方法は、上記で定義されるような自己のおよび同種異系の（すなわち、同種の）血漿、血清またはその代替物の混合物を使用し得る。「血清または血漿の代替物」という句は、本明細書で使用する場合、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の増殖および／または拡大培養を誘導し得る組成物などの血漿および／または血清の１以上の機能を有する天然または人工非毒性組成物を指す。血清または血漿の代替物の限定されない例としては、血小板溶解液、およびヒト血清アルブミンなどの血漿または血清の１以上の分画成分を含んでなる細胞培養のための組成物が含まれる。当業者は、ヒト血漿、血清およびその代替物が１以上の増殖因子、サイトカインまたはホルモンを含んでなり得る複雑な生物学的組成物であることを認識する。

増殖因子ＦＧＦ−２およびＴＧＦβまたはそれらの個々の生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、血漿、血清またはその代替物のうち１以上に加えて、すなわち、それらに対して外因的に、またはそれらに補足して提供されることが意図される。

用語「ヘパリン」は、本明細書で使用する場合、その抗凝固効果を特徴とする、３〜３０ｋＤａの範囲の分子量を有する、グリコサミノグリカンファミリーの炭水化物のポリマーを指す。ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生物学的アッセイによって決定することができ、ヒツジまたはヤギまたはヒト血漿の凝固を妨げるために必要なヘパリンの濃度が、ミリグラム当たりのヘパリン活性の単位に基づき国際的に認められている標準の濃度と比較される。１ｍｇのヘパリンは一般に、１４０〜１８０国際単位（ＩＵ）に等しい。

用語「ＩＵ」または「国際単位」は、生体物質の生物活性または効果として表される生体物質の量の標準的尺度である。この単位が割り当てられている物質ごとに、国際的に認められている生物学的手順に従って試験した場合に、１ＩＵの用量について期待される、国際的に認められている生物活性または効果が存在する。

特定の実施形態において、ヘパリンまたはヘパリン誘導体もしくは類似体は、非分画ヘパリン（ＵＦＨ）；低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、例えば、エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、アルデパリン、パルナパリン、ベミパリン、またはそれらの混合物；ヘパリノイド、例えば、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、アカラン硫酸、ケラタン硫酸、またはそれらの混合物、例えば、ダナパロイド；ヘパリン塩；ヘパリノイド塩；ヘパリン断片；ヘパリノイド断片；およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。好ましくは、ヘパリンまたはヘパリン誘導体もしくは類似体は、ＵＦＨ、ダルテパリン、ダナパロイドおよびヘパラン硫酸からなる群から選択される。

特定の実施形態において、前記ＦＧＦ−２、前記ＴＧＦβ、前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体、および場合により、血漿、血清またはその代替物のうち１以上は、培地、一般には、液体細胞培養培地中に含まれる。一般に、この培地は、当技術分野で公知のような基本培地配合物を含んでなる。多くの基本培地配合物（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ；またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州から入手可能）が本明細書において細胞を培養するために使用可能であり、これには限定されるものではないが、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＣａｍｂｒｅｘ（ニュージャージー州）から入手可能なイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α改変最小必須培地（α−ＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、Ｆ−１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）、イスコブの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、またはＸ−ＶＩＶＯ（商標）無血清培地（臨床グレード）、およびその改変物および／または組合せが含まれる。上記の基本培地の組成は一般に当技術分野で公知であり、培養される細胞の必要に応じて培地および／または培地添加剤の濃度を改変または調整することは当業者の技術の範囲内にある。このような基本培地配合物は、それ自体既知である哺乳動物細胞の発達のために必要な成分を含有する。実例として、限定されるものではないが、これらの成分は、無機塩（特に、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｃｌ、Ｐおよび可能性としてはＣｕ、Ｆｅ、ＳｅおよびＺｎを含有する塩）、生理学的バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ、重炭酸塩）、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよび／または核酸塩基、リボース、デオキシリボース、アミノ酸、ビタミン、酸化防止剤（例えば、グルタチオン）および炭素源（例えば、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）などを含み得る。

培養において使用するために、基本培地には１以上のさらなる成分を添加することができる。例えば、付加的添加剤は、最適な増殖および拡大培養に必要な微量元素および物質を細胞に供給するために使用することができる。このような添加剤には、インスリン、トランスフェリン、セレン塩、およびそれらの組合せが含まれる。これらの成分は、限定されるものではないが、ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、アールの塩溶液などの塩溶液に含まれ得る。さらなる酸化防止剤添加剤、例えば、β−メルカプトエタノールを加えてもよい。多くの基本培地はアミノ酸をすでに含有しているが、例えば、溶液中では安定性が低いことが分かっているＬ−グルタミンなどのいくつかのアミノ酸は後に添加してよい。培地にはさらに抗生物質および／または抗真菌化合物、例えば、一般に、ペニシリンとストレプトマイシンの混合物、および／または限定されるものではないが、アムホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、チロシン、およびゼオシンにより例示される他の化合物を添加してもよい。また、脂質および脂質担体を、細胞培養培地を補足するために使用することもできる。このような脂質および担体は、限定されるものではないが、とりわけ、シクロデキストリン、コレステロール、アルブミンコンジュゲートリノール酸、リノール酸およびアルブミンコンジュゲートオレイン酸、非コンジュゲートリノール酸、アルブミンコンジュゲートリノール酸−オレイン酸−アラキドン酸、アルブミン非コンジュゲートおよびコンジュゲートオレイン酸を含み得る。アルブミンは、脂肪酸不含配合物にも同様に使用することができる。

特定の実施形態において、ヒト血漿、血清またはその代替物のうち１以上は、前記培地に約０．５％〜約３０％、好ましくは約１％〜約１５％、より好ましくは２％〜１０％の割合（血漿、血清、またはその代替物のうち１以上の容量／培地の容量）で含まれてよい。本方法は、比較的低い量、例えば、約５または１０容量％以下、例えば、約１、約２、約３または約４容量％の血漿、血清またはその代替物のうち１以上で満足のいく性能を示すことができ、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を培養するために取得する必要のある血漿、血清またはその代替物のうち１以上の容量の低減を可能とする。

なおさらなる実施形態において、濃縮血漿製品（例えば、凍結血漿からの濃縮物などの血漿濃縮物）、濃縮血清製品または血漿または血清の濃縮代替物製品のうち１以上が使用され得る。このような濃縮製品は、濃縮係数を相殺する（釣り合わせる、補正する）ためなどに、血漿、血清またはその代替物のうち１以上の所望の濃度よりも低い濃度で組成物に含まれ得る。

特定の実施形態において、ヒト血漿、血清および／またはその代替物のうちいずれか２つ以上の組合せまたは混合物が使用され得る。

特定の実施形態において、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβが所望の細胞種へ分化誘導するために十分な濃度で前記培地に含まれる。

特定の実施形態において、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβが、ＭＳＣをＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞へ分化誘導するために十分な濃度で前記培地に含まれる。一般に、ＦＧＦ−２またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７または６ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ以下、例えば、約４、３、２、１または０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に含むことができる。一般に、ＴＧＦβ、例えば、ＴＧＦβ１、またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７または６ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ以下、例えば、約４、３、２、１または０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に含むことができる。前記値は、培地に外因的に添加される場合に、各増殖因子またはそれらの生物学的に活性な変異体もしくは断片の濃度を指すことを意図する。

特定の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０２ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０３ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０４ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０５ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０６ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０７ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０８ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０９ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．１ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．５ＩＵ／ｍｌ、少なくとも１ＩＵ／ｍｌ、少なくとも５ＩＵ／ｍｌ、少なくとも１０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも２０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも３０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも４０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも５０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも６０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも７０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも８０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも９０ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも１００ＩＵ／ｍｌの濃度で前記培地に含まれる。特定の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、少なくとも０．１０ＩＵ／ｍｌの濃度で前記培地に含まれる。特定の好ましい実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、約０．１ＩＵ／ｍｌの濃度で前記培地に含まれる。特定の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、約０．１０ＩＵ／ｍｌ、０．２０ＩＵ／ｍｌ、０．３０ＩＵ／ｍｌ、０．４０ＩＵ／ｍｌ、０．５０ＩＵ／ｍｌ、０．６０ＩＵ／ｍｌ、０．７０ＩＵ／ｍｌ、０．８０ＩＵ／ｍｌ、０．９０ＩＵ／ｍｌまたは１．０ＩＵ／ｍｌの濃度で前記培地に含み得る。

本明細書に教示されるような方法または使用の特定の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度は、少なくとも０．０５ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約０．１ＩＵ／ｍｌであり得る。

ある実施形態において、上記濃度は、培地中の増殖因子またはそれらの生物学的に活性な変異体もしくは断片の総濃度あるいは前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の総濃度を、すなわち、血漿、血清またはその代替物が寄与する場合およびそれらに加えて提供される場合の、前記増殖因子またはそれらの生物学的に活性な変異体もしくは断片の合計濃度あるいは前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の合計濃度を指し得る。

特定の実施形態において、上記濃度は、血漿または血清がすでに寄与しているものに加えて提供される場合の、前記増殖因子またはそれらの生物学的に活性な変異体もしくは断片の濃度あるいは前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度を指し得る。当然のことながら、添加されるべき増殖因子もしくはヘパリンまたはそれらの誘導体もしくは類似体がその血漿、血清またはその代替物中に通常存在しない（検出不能である）場合、増殖因子もしくはヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の総濃度と添加濃度は（実質的に）同じとなる。

好ましい実施形態において、本明細書の他所に定義されるように対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを培養容器で培養する。培養容器は、細胞接着を可能とするためのプラスチック表面を提供し得る。別の実施形態において、この表面は、ガラス表面であり得る。さらに別の実施形態において、この表面は、細胞の接着および増殖が可能な適当な材料、例えば、マトリゲル（登録商標）、ラミニンまたはコラーゲンでコーティングしてもよい。

特定の実施形態において、ＭＳＣは、骨髄（または他の供給源）から、基質表面、例えば、プラスチック表面に接着可能なこれらの（単核）細胞を選択することにより回収され得る。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（例えば、工程（ａ）の一部として）非接着物を除去し、接着細胞を（ａ）に定義される培地で培養することを含んでなり得る。

特定の実施形態において、細胞は、非接着物を除去する前に約１〜８日間、より一般には約２〜６日、より一般には約４日間接着させ得る。そうでなければ、非接着物の除去は、誘導工程（ａ）の後、多くても８日、多くても６日、多くても４日、好ましくは、多くても４日実施され得る。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（例えば、工程（ａ）の一部として）培養培地の一部または全部を（ａ）に定義される培地で置き換えることを含んでなり得る。有利には、これは増殖因子の補充を可能とする。特定の実施形態において、この置換は、一次培養中に少なくとも１回、例えば、１回、２回または３回行い得る。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において、約１３日〜約１５日の期間培養され得る。好ましくは、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において約１４日の期間培養される。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｂ）ＭＳＣ由来細胞を第１の時間継代培養し（「第１継代」または「Ｐ１」）、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養することを含んでなり得る。工程（ｂ）はまた、本明細書では「二次培養」と呼ばれることもある。

ある実施形態において、工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られたＭＳＣ由来細胞を回収することを含んでなり得る。

ある実施形態において、工程（ｂ）は、前記ＭＳＣ由来細胞を剥離し、再播種し、さらに（ａ）に定義される培地、すなわち、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を、好ましくは少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培地で培養することを含んでなり得る。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）において約８日〜約１２日の期間培養される。特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）において約９日〜約１１日の期間培養される。好ましくは、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）において約１０日間培養される。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてｘ日の期間培養されてよく、ここで、ｘ日はＭＳＣ由来細胞の少なくとも２０％が増殖している最終日である。

よって、ある側面は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ、およびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
を含んでなり、
前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）でｘ日の期間培養され、ここで、ｘ日は前記ＭＳＣ由来細胞の少なくとも２０％が増殖している最終日である方法に関する。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてｘ日の期間培養されてよく、ここで、ｘ日はＭＳＣ由来細胞の少なくとも２５％が増殖している（例えば、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にある）最終日である。例えば、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）でｘ日の期間培養され、ここで、ｘ日はＭＳＣ由来細胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５、少なくとも５０％、少なくとも５５、または少なくとも６０％が増殖している（例えば、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にある）最終日である。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、増殖しているＭＳＣ由来細胞は、細胞周期のＳ期、Ｇ２期またはＭ期にある。イベント／周期（Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期）による細胞周期分析は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーによって行うことができる。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてｘ日の期間培養されてよく、ここで、ｘ日はＭＳＣ由来細胞の数がｘ−１日よりも多い最終日である。例えば、ＭＳＣ由来細胞の数がｘ−１日よりも多い最終日としてのｘ日を決定するために、ＭＳＣ由来細胞を二次培養として２８日間培養してよく（従来技術の方法に従う）、サンプルは毎日採取してよく、細胞数または細胞密度（例えば、細胞数／ｃｍ^２として表される）は、各サンプルに関して、例えば、手での計数（例えば、ビルケルチャンバー）またはフローサイトメトリー（例えば、ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標））により決定され得る。細胞数に基づき、ＭＳＣ由来細胞の数が前日（すなわち、ｘ−１日）よりも多い最終日（すなわち、ｘ日）を決定することができる。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてｘ日の期間培養されてよく、ここで、ｘ日はＭＳＣ由来細胞の少なくとも２０％が増殖しており、ＭＳＣ由来細胞の数がｘ−１日より多い最終日である。

特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で播種され得る。特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてさらなる培養のために５×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で播種され得る。好ましくは、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種され得る。

よって、さらなる側面において、本発明は、ＭＳＣからＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
を含んでなり、
前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種される方法を提供する。

用語「密度」および「細胞密度」は本明細書では互換的に使用可能であり、単位表面当たりの細胞数（例えば、細胞／ｃｍ^２として表される）を指す。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＭＳＣ由来細胞を第２の時間継代培養し（「第２継代」または「Ｐ２」）、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得る工程（ｃ）を含んでなり得る。工程（ｃ）はまた、本明細書では「三次培養」と呼ばれることもある。

工程（ｃ）において得られるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、「第３継代」または「Ｐ３」細胞と見なすことができる。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｃ）において約１０日〜約１４日間培養される。特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｃ）において約１１日〜約１３日間培養される。好ましくは、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｃ）において約１２日間培養される。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｃ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で播種され得る。特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｃ）においてさらなる培養のために５×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で播種され得る。好ましくは、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｃ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種され得る。

よって、さらなる側面において、本発明は、ＭＳＣからＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
を含んでなり、
前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｃ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種される方法を提供する。

当業者には、本明細書に教示されるような方法がさらなる継代培養を含んでなり得ることが理解されるであろう。当業者には、これが第４継代（Ｐ４）、第５継代（Ｐ５）、第６継代（Ｐ６）、第７継代（Ｐ７）、第８継代（Ｐ８）、第９継代（Ｐ９）または第１０継代（Ｐ１０）の細胞培養を生成し得ることが理解されるであろう。初代継代（Ｐ０）は、剥離および／または再播種されていないＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を指し得る。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存することを含んでなり得る。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｄ）ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させることを含んでなり得る。ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させることにより、対象へ直接投与するのに好適な細胞製品を得ることができる。この細胞製品は好都合には凍結保存により保存することができ、凍結保存細胞製品は容易に輸送でき、要時に送達することができる。よって、投与に好適な細胞製品は、要時処置のために即利用可能である。さらに、本方法により得られる細胞製品の凍結保存は、細胞製品の全出荷試験を行い、細胞製品の投与前にそれらの結果を得ることを可能とする。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｄ）ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させること；および（ｅ）ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存することを含んでなり得る。

よって、さらなる側面において、本発明は、ＭＳＣからＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること；
（ｄ）前記ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞（工程（ｃ）のもの）を対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させること；ならびに
（ｅ）前記ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞（工程（ｄ）のもの）を凍結保存すること
を含んでなる方法に関する。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｄ）ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を臨床濃度で対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させること；および（ｅ）前記ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存することを含んでなり得る。このような臨床濃度は有利には、本方法により得られたＭＳＣ由来軟骨骨形成系譜細胞を、さらなる希釈または濃縮工程無く、または投与前のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の付加的な洗浄工程無く、そのまま対象に投与することを可能とする。

特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存し、それにより、投与に好適な細胞製品を得ることを含んでなり得る。投与に好適な細胞製品は、投与前の付加的な洗浄工程無く、そのままそれを必要とする対象に送達され得る。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、工程（ｄ）において凍結保存培地に約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で再懸濁される。例えば、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、工程（ｄ）において凍結保存培地に約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約８×１０^７細胞／ｍｌ、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約６×１０^７細胞／ｍｌ、または約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約５×１０^７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁される。好ましくは、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、工程（ｄ）において凍結保存培地に約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁される。

特定の実施形態において、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を約１×１０^７細胞／ｍｌおよび約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。例えば、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約８×１０^７細胞／ｍｌ、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約６×１０^７細胞／ｍｌ、または約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約５×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。好ましくは、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。

特定の実施形態において、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存培地に約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。例えば、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存培地に約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約８×１０^７細胞／ｍｌ、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約６×１０^７細胞／ｍｌ、または約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約５×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。好ましくは、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存培地に約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、凍結保存培地は、ベンゾピランなどの抗酸化化合物を含んでなり得る。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなり得る。本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、凍結保存培地は、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、（ポリ）ペプチド、抗酸化化合物、またはそれらの組合せを含んでなり得る。このような凍結保存培地は有利には、対象に投与する前のＭＳＣ由来軟骨骨形成系譜細胞の付加的洗浄工程無く、本方法により得られた軟骨骨形成系譜のＭＳＣ由来細胞を投与することを可能とする。

特定の実施形態において、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地に、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。例えば、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地に、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約８×１０^７細胞／ｍｌ、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約６×１０^７細胞／ｍｌ、または約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約５×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。好ましくは、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地に、約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。

特定の実施形態において、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、（ポリ）ペプチド、抗酸化化合物、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地中、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。例えば、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、（ポリ）ペプチド、抗酸化化合物、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地に、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約８×１０^７細胞／ｍｌ、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約６×１０^７細胞／ｍｌ、または約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約５×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。好ましくは、投与に好適な細胞製品は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、（ポリ）ペプチド、抗酸化化合物、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地を、約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、凍結保存培地は、ヌクレオシド（例えば、アデノシン）、糖（例えば、デキストラン−４０、デキストロース、スクロース、マンニトール、ラクトビオン酸）、トリペプチド（例えば、Ｌ−グルタチオン）、バッファー（例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’ −（２−エタンスルホン酸））、塩（例えば、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム）およびＤＭＳＯを含んでなる組成物であり得る。市販の凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０細胞凍結保存培地（Ｃ２８７４、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）である。他の例は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、ＣＳ２またはＣＳＢ細胞凍結保存培地（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）である。

特定の実施形態において、凍結保存培地は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも１０％のＤＭＳＯを含んでなり得る。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、凍結保存培地は、ヌクレオシド（例えば、アデノシン）、糖（例えば、デキストラン−４０、デキストロース、スクロース、マンニトール、ラクトビオン酸）、トリペプチド（例えば、Ｌ−グルタチオン）、バッファー（例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’ −（２−エタンスルホン酸））、塩（例えば、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム）およびベンゾピラン（例えば、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）を含んでなる組成物であり得る。市販の凍結保存培地は、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ溶液（Ｈ４４１６、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）である。

用語「Ｔｒｏｌｏｘ」または「６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸」は、互換的に使用され得る。

特定の実施形態において、凍結保存培地は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも１０％のベンゾピランを含んでなり得る。特定の実施形態において、凍結保存培地は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも１０％の６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸を含んでなり得る。

本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において約１３日〜約１５日間、および工程（ｂ）において約８日〜約１２日間培養され得る。本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において約１３日〜約１５日間、および工程（ｃ）において約１０日〜約１４日間培養され得る。本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）において約８日〜約１２日間、および工程（ｃ）において約１０日〜約１４日間培養され得る。本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において約１３日〜約１５日間、工程（ｂ）において約８日〜約１２日間、および工程（ｃ）において約１０日〜約１４日間培養され得る。

本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において約１４日間、および工程（ｂ）において約１０日間培養され得る。本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において約１４日間、および工程（ｃ）において約１２日間培養され得る。本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）において約１０日間、および工程（ｃ）において約１２日間培養され得る。本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ａ）において約１４日間、工程（ｂ）において約１０日間、および工程（ｃ）において約１２日間培養され得る。

本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で播種され、さらに工程（ｃ）において３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で培養され得る。

本明細書に教示されるような方法の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、工程（ｂ）においてさらなる培養のために３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種され、さらに工程（ｃ）において３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で培養され得る。

さらなる側面において、本発明は、本明細書に定義されるような方法により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を提供する。

「ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団」または「ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞」という記載は、本明細書では互換的に使用され得る。

用語「集団」は、本明細書で使用する場合、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞などの所望の細胞種の細胞の実質的に純粋（すなわち、主としてそれからなる）かつ均質な群に関する。

さらなる側面は、ＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ拡大培養により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団に関し、それにより、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の少なくとも９０％が２５μｍ（Ｄ_９０≦２５μｍ）以下の直径を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の多くても１％が３５μｍを超える直径を有する。ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞集団の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、本明細書に定義されるような方法により得ることができるまたは得られる。

実施例の節において示されるように、本明細書に教示されるような方法は、先に記載されていたＭＳＣ由来細胞よりも特に、小さい、およびより均質な大きさなどの、より優れた特性を有する、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞、またはそのようなものを含んでなる集団をもたらす。本明細書に記載されるような方法により得ることができるより小さく、より均質な大きさのＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、向上した移植特性を有する細胞を形成する。より詳しくは、本明細書に記載されるような方法により得ることができるより小さく、より均質な大きさのＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、これらの細胞を、とりわけ、良好なｉｎ ｖｉｖｏ安全性プロフィールおよび／または注射針通過性を与えることによって肺塞栓および梗塞のリスクを軽減または排除することにより、あらゆる投与経路および特に、血管内投与に好適とする。さらに、本明細書に記載されるような方法により得ることができるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、調整可能かつ高い細胞濃度を限定された投与容量で部位に送達することを可能とする。

特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の平均直径は、２５μｍ未満、２４μｍ未満、２３μｍ未満、２２μｍ未満、２１μｍ未満、または２０μｍ未満である。好ましくは、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の平均直径は２０μｍ未満である。

用語「懸濁液」および「細胞懸濁液」は一般に、液相に分散されたＭＳＣ由来細胞、特に、ＭＳＣ由来の生細胞を指す。

特定の実施形態において、懸濁液中の、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の平均直径は、１０μｍを超えるか、１１μｍを超えるか、１２μｍを超えるか、１３μｍを超えるか、１４μｍを超えるか、または１５μｍを超える。

特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の平均直径は、１０μｍ〜２５μｍ、好ましくは１５μｍ〜２０μｍである。

特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の少なくとも９０％は、２５μｍ以下（Ｄ_９０≦２５μｍ）、２４μｍ以下（Ｄ_９０≦２４μｍ）、２３μｍ以下（Ｄ_９０≦２３μｍ）、２２μｍ以下（Ｄ_９０≦２２μｍ）、２１μｍ以下（Ｄ_９０≦２１μｍ）、または２０μｍ以下（Ｄ_９０≦２０μｍ）、好ましくは２５μｍ以下（Ｄ_９０≦２５μｍ）の直径を有する。

特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、２５μｍ以下（Ｄ_９０≦２５μｍ）のＤ_９０を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の多くても１％が３５μｍを超える直径を有する。特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、２４μｍ以下（Ｄ_９０≦２４μｍ）、２３μｍ以下（Ｄ_９０≦２３μｍ）、２２μｍ以下（Ｄ_９０≦２２μｍ）、２１μｍ以下（Ｄ_９０≦２１μｍ）、または２０μｍ以下（Ｄ_９０≦２０μｍ）のＤ_９０を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の多くても１％が３５μｍを超える直径を有する。

特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、２５μｍ以下（Ｄ_９０≦２５μｍ）のＤ_９０を有し、懸濁液中の多くても１％のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞が３０μｍを超える直径を有する。特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、２４μｍ以下（Ｄ_９０≦２４μｍ）、２３μｍ以下（Ｄ_９０≦２３μｍ）、２２μｍ以下（Ｄ_９０≦２２μｍ）、２１μｍ以下（Ｄ_９０≦２１μｍ）、または２０μｍ以下（Ｄ_９０≦２０μｍ）のＤ_９０を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の多くても１％が３０μｍを超える直径を有する。

特定の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、約２５μｍ〜約１０μｍ（１０μｍ≦Ｄ_９０≦２５μｍ）、約２４μｍ〜約１０μｍ（１０μｍ≦Ｄ_９０≦２４μｍ）、約２３μｍ〜約１０μｍ（１０μｍ≦Ｄ_９０≦２３μｍ）、約２２μｍ〜約１０μｍ（１０μｍ≦Ｄ_９０≦２２μｍ）、約２１μｍ〜約１０μｍ（１０μｍ≦Ｄ_９０≦２１μｍ）または約２０μｍ〜約１０μｍ（１０μｍ≦Ｄ_９０≦２０μｍ）、好ましくは約２５μｍ〜約１０μｍ（１０μｍ≦Ｄ_９０≦２５μｍ）のＤ_９０を有する。

細胞の直径は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、デジタル顕微鏡により、画像解析用ソフトウエア（例えば、Ｍｏｔｉｃ Ｉｍａｇｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）２．０２）を伴って決定することができる。平均細胞直径は、本明細書で言及する場合、自由に浮遊している非付着状態の細胞、従って、懸濁液中の細胞の直径に基づいて決定されるべきでえある。細胞は好ましくは、透明な、非毒性、等張バッファー、例えば、ＰＢＳ、および場合により、生細胞と死細胞を識別するための色素、例えば、トリパンブルーを含んでなる溶液に懸濁させる。好ましくは、統計的に有意な分析を考慮するためには、少なくとも１００個の細胞が測定されるべきである。

さらなる側面は、本明細書に定義されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞またはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる組成物に関する。特定の実施形態において、これらの組成物は、１以上の他の成分をさらに含んでなり得る。例えば、細胞の生存力を維持または増進し得る成分を含み得る。例として、限定されるものではないが、このような成分は、実質的等張条件を確保するための塩、ｐＨ安定剤、例えば、バッファー系（例えば、実質的中性ｐＨを確保するためには、例えば、リン酸バッファー系または炭酸バッファー系）、担体タンパク質、例えば、アルブミン、基本培地および／もしくは培地添加剤、血清もしくは血漿、栄養素、炭水化物源、保存剤、安定剤、酸化防止剤または当業者に周知の他の材料を含む培地を含み得る。また、各ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を上記のような１以上の付加的成分と混合することにより前記組成物を生産する方法も開示される。これらの組成物は例えば液体であってよく、または半固体もしくは固体であってもよい（例えば、凍結組成物であってもよく、またはゲルとして存在してもよく、または固相支持体もしくは足場上に存在してもよい）。

用語「組成物」、「処方物」、または「調製物」は、本明細書では互換的に使用され得る。

特定の実施形態において、組成物は、本明細書に定義されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞、および場合により１以上の薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる医薬処方物であり得る。

よって、さらなる側面において、本発明は、本明細書に定義されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる医薬処方物を提供する。

用語「薬学上許容可能な」とは、本明細書で使用する場合、当技術分野と矛盾なく、医薬処方物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないことを意味する。

本明細書で使用する場合、「担体」または「賦形剤」としては、あらゆる溶媒、希釈剤、バッファー（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、増量剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アミノ酸（例えば、グリシン）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、芳香剤、増粘剤、デポ効果を達成するための薬剤、コーティング剤、抗真菌剤、保存剤、安定剤、酸化防止剤、張度調節剤、吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質に関するこのような培地および薬剤の使用は当技術分野で周知である。このような材料は非毒性であるべきで、細胞の活性に干渉すべきでない。

担体もしくは賦形剤または他の材料の正確な性質は、投与経路によって異なる。例えば、組成物は、発熱物質不含で、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態であり得る。医学処方物の一般原則については、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan編, Cambridge University Press, 1996；およびHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。

液体医薬処方物は一般に、水または薬学上許容可能な水溶液などの液体担体を含む。例えば、生理食塩水、組織または細胞培養培地、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含み得る。

組成物は、１以上の細胞保護分子、細胞再生分子、増殖因子、抗アポトーシス因子または細胞において遺伝子発現を調節する因子を含み得る。このような物質は、細胞をその環境に非依存性とし得る。

このような医薬処方物は、その中の細胞の生存力を確保するさらなる成分を含有し得る。例えば、組成物は、所望のｐＨ、より通常には、ほぼ中性のｐＨを達成するために好適なバッファー系（例えば、リン酸バッファー系または炭酸バッファー系）を含んでなり得、また、浸透圧ストレスを防ぐために細胞に対して等張条件を確保するために十分な塩を含んでなり得る。例えば、これらの目的に好適な溶液は、当技術分野で知られているようなリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル注射液または乳酸加リンゲル注射液であり得る。さらに、組成物は、細胞の生存力を高め得る担体タンパク質、例えば、アルブミン（例えば、ウシまたはヒトアルブミン）を含んでなり得る。

さらに好適には、薬学上許容可能な担体または添加剤は当業者に周知であり、例えば、コラーゲンまたはゼラチンなどのタンパク質、デンプン、多糖、糖（デキストロース、グルコースおよびスクロース）などの炭水化物、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはカルシウムのようなセルロース誘導体、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルファ化デンプン、ペクチン寒天、カラギーナン、粘土、親水性ガム（アカシアガム、グアーガム、アラビアガムおよびキサンタンガム）、アルギン酸、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、デキストラン、ペクチン、水溶性アクリルポリマーまたはポリビニルピロリドンなどの合成ポリマー、プロテオグリカン、リン酸カルシウムなどから選択され得る。

所望により、細胞調製物は、組織再生の改善をもたらす支持体、足場、基質または材料上に投与され得る。例えば、この材料は、粒状セラミック、またはゼラチン、コラーゲン、もしくはフィブリノゲンなどの生体高分子であり得る。多孔性基質は、標準的な技術に従って合成することができる（例えば、Mikos et al., Biomaterials 14: 323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997）。このような支持体、足場、基質または材料は、生分解性であっても非生分解性であってもよい。よって、細胞は、移植用に提供するため多孔性または非多孔性基質などの好適な基質に移行され、および／または好適な基質上で培養され得る。例えば、要すれば、培養ディッシュ内で増殖または分化された細胞を、それらに分化過程を増大および／または継続させるために、固相支持体を本発明の液体栄養培地中でインキュベートすることにより、三次元固相支持体へ移行させることができる。細胞は、例えば、細胞を含有する液体懸濁液を支持体に含浸させることにより、三次元固相支持体へ移行させることができる。この方法で得られた含浸済みの支持体を対象に移植することができる。このような含浸済みの支持体はまた、最終的に移植する前に液体培養培地中に浸漬することによって再培養することもできる。三次元固相支持体は、それをヒトに移植可能とするために生体適合性である必要がある。三次元固相支持体は生分解性であっても非生分解性であってもよい。

細胞または細胞集団は、それらが生存、成長、増殖および／または骨芽細胞などの所望の細胞種へ分化可能な様式で投与することができる。細胞または細胞集団は、骨欠損などの意図した器官内に移植してもよいし、または移動させてもよいし、植え付けてもよい。細胞または細胞集団の他の場所への植え付けも想定され得る。

ある実施形態において、上記で定義されるような医薬細胞調製物は、液体組成物の形態で投与してもよい。複数の実施形態において、細胞またはそれらを含んでなる医薬処方物は、全身的に、局所的に、器官内に、器官機能不全もしくは病変部位にまたは組織病変部位に投与することができる。

好ましくは、医薬処方物は、治療上有効な量の所望の細胞を含んでなり得る。用語「治療上有効な量」は、研究者、獣医、医師またはその他の臨床家により求められる、組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的または医学的応答を惹起し得る、および特に、治療される疾患または病態の局部的または全身的症状または特徴の１以上を予防または緩和し得る量を指す。適当な治療上有効な量は、所望の細胞の性質、病態および重症度、ならびに対象の年齢、大きさ、および状態を考慮して資格のある医師によって決定され得る。

また、本発明の細胞を上記のような１以上の付加的成分ならびに上記のような１以上の医薬賦形剤と混合することにより、前記医薬処方物を生産する方法も提供される。

ある実施形態において、上記の定義のような医薬処方物は、液体または粘稠な組成物の形態で投与してもよい。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、医薬処方物は、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子の組合せ、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸もしくはその誘導体、キトサン、ポリＬ−リシン、ゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノゲン、オステオカルシン、またはそれらの組合せなどの骨誘導特性を有する成分をさらに含んでなり得る。

用語「骨誘導性」は、本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞などの細胞が付着し、移動し、成長し、新しい骨を産生する足場として機能する成分の能力を指す。

前述のように、本明細書に教示されるような医薬処方物は、骨創傷および骨欠損の修復に有用な成分を含んでなり得る。医薬処方物は、骨誘導特性を有する足場または基質を含んでなり得る。医薬処方物は、組成物を骨形成性ならびに骨誘導性(osteo-conductive)および骨誘導性(osteo-inductive)とするために脱石灰化した骨基質（ＤＢＭ）または他の基質と組み合わせることができる。自己骨髄細胞を同種異系ＤＢＭとともに使用する類似の方法が良好な結果をもたらしている(Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313:8-18)。

本明細書に教示されるような医薬処方物は、補足的生活性因子または骨誘導性（osteo-inductive)タンパク質、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７またはＢＭＰ−４などの骨形成因子、または他の任意の増殖因子をさらに含んでよく、またはそれらと併用投与してよい。他の可能性のある併用成分としては、骨再生を補助するために好適なカルシウムまたはリン酸塩の無機供給源が含まれる（ＷＯ００／０７６３９）。所望により、細胞調製物は、組織再生の改善を提供するために担体基質または材料に投与することができる。例えば、この材料は、ヒドロゲル、またはゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸もしくはその誘導体、オステオネクチン、フィブリノゲン、またはオステオカルシンなどの生体高分子であり得る。生体材料は、標準的な技術に従って合成され得る（例えば、Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997）。

また、本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞または本明細書に教示されるような医薬処方物を例えば、全身的に、例えば、注射により対象に投与するための手術用具または装置を含んでなり、さらに本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞または本明細書に教示されるような医薬処方物も含んでなる構成またはパーツキットも開示される。

別の側面において、本発明は、薬剤として使用するための、本明細書に定義されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、または本明細書に定義されるような医薬処方物を提供する。

別の側面において、本発明は、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象の治療において使用するための、本明細書に定義されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、または本明細書に定義されるような医薬処方物を提供する。

関連の側面において、本発明は、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の本明細書で定義されるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞もしくＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、またはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞もしくはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる医薬処方物を投与することを含んでなる方法を提供する。関連の側面において、本発明は、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象の治療のための薬剤の製造のための、上記に定義されるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞もしくはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、またはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞もしくはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる医薬処方物の使用を提供する。

本明細書で使用する場合、用語「治療する」または「治療」は、治療的処置と、目的が望まない生理学的変化または障害を予防することまたは緩徐化する（減弱する）ことである予防または回避的手段の両方を指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の安定（すなわち、非増悪）状態、疾患の進行および合併症の発生の遅延または緩徐化、病状の改善または軽減が含まれる。「治療」は、治療を受けなかった場合に期待される生存と比較した生存の延長も意味し得る。

用語「軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象」は、本明細書で使用する場合、所与の病態、好ましくは、本明細書に定義されるような病態または疾患の治療から利益を得ると思われる哺乳動物またはヒト対象などの対象を含む。このような対象には一般に、限定されるものではないが、前記病態が診断された対象、前記病態の罹患もしくは発症傾向がある対象および／または前記病態が予防される対象が含まれる。

用語「移植」または「細胞移植」は、その通常の意味を持ち、特に、対象への細胞の投与を指す。用語「細胞移植」は、「細胞療法」と互換的に使用することができる。細胞移植は、当技術分野で公知のいずれの技術によって行ってもよい。例として、限定されるものではないが、細胞は、対象への注入により移植され得る。一般に、細胞注入は、非経口的、例えば、血管内、皮下、皮内、または筋肉内、好ましくは、血管内に実施され得る。細胞は、例えば、限定されるものではないが、全身的に、局所的にまたは病変部位に投与され得る。特定の適用、標的組織、治療目的または細胞種によって、投与経路、ならびに処方、濃度などに関して相応に調整を行うことができることは明らかであり得る。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団または医薬処方物は、経皮、骨内、関節内、椎間または血管内投与に好適であり得る。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団または医薬処方物は、骨欠損部位に投与するために好適であり得る。

均質かつ小さな細胞サイズの本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、前記細胞を対象に静脈内投与する際に急性毒性の軽減または排除をもたらす。よって、本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、血管内または経皮投与に特に好適である。

よって、特定の実施形態において、上記に定義されるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞またはＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団または医薬処方物は、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする前記対象に経皮または血管内投与され得る。

さらに、本発明者らは、本明細書に教示されるような方法により得られるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は骨形成特性を有すること見出した。

よって、特定の実施形態において、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象は、筋骨格疾患を有する対象であり得る。

用語「筋骨格疾患」は、本明細書で使用する場合、その治療が疾患を有する対象への本医薬処方物の投与から利益が得られるいずれのタイプの骨疾患、筋肉疾患、関節疾患、または軟骨異栄養症も指す。特に、このような疾患は、例えば、骨および／もしくは軟骨形成の減少または過剰な骨および／もしくは軟骨吸収、骨に存在する骨芽細胞または骨細胞および／もしくは軟骨に存在する軟骨芽細胞は軟骨細胞の数、生存力または機能の低下、対象における骨量および／または軟骨量の減少、骨の脆化、骨強度または弾力性の低下などを特徴とし得る。

筋骨格疾患の限定されない例としては、例えば原発性、閉経後、老年性、コルチコイド誘発性、ビスホスホネート誘発性、および放射線療法誘発性などの任意のタイプの骨粗鬆症またはオステオペニア；任意の続発性、一部位または多部位骨壊死；例えば、癒合不能、変形癒合、癒合遅延骨折または圧迫、顎顔面骨折などの任意のタイプの骨折；骨固定（例えば、脊椎固定および再建）を必要とする病態；先天性骨欠損；例えば外傷性損傷または癌手術後の骨再建、および頭蓋顔面骨再建；外傷性関節炎、限局性軟骨および／または関節欠陥、限局性変形性関節炎；変形性関節症、変形性関節炎、変形性膝関節症、および変形性股関節症；骨形成不全症；溶骨性骨癌；パジェット病；内分泌障害；低リン酸血症；低カルシウム血症；腎性骨異栄養症；骨軟化症；無形成骨症、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症；歯周病；ゴーハム病(Gorham-Stout disease)およびマッキューン・オルブライト症候群；関節リウマチ；強直性脊椎炎を含む脊椎関節症、乾癬性関節炎、腸疾患性関節症、および未分化脊椎関節炎および反応性関節炎；全身性紅斑性狼瘡および関連症候群；硬皮症および関連障害；シェーグレン症候群；巨細胞性動脈炎（ホートン病）、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、ＡＮＣＡ関連血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫、顕微鏡的多発性血管炎、およびチャーグ−ストラウス症候群）、ベーチェット症候群、およびその他の多発性動脈炎および関連障害（例えば、結節性多発性動脈炎、コーガン症候群、およびバージャー病）を含む全身性血管炎；アミロイドーシスおよびサルコイドーシスを含む他の全身性炎症性疾患を伴う関節炎；通風、ピロリン酸カルシウム二水和物病、リン酸カルシウムまたはシュウ酸カルシウム結晶の関節沈着に関連する障害または症候群を含む結晶性関節症；軟骨石灰沈着症および神経因性関節症；フェルティー症候群およびライター症候群；ライム病およびリウマチ熱といった局部性または全身性障害を含み得る。

特定の実施形態において、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象は、骨関連障害を有する対象であり得る。

よって、用語「骨関連障害」は、本明細書で使用する場合、その治療が障害を有する対象への軟骨骨芽細胞系譜細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の移植から利益を受け得るいずれのタイプの骨疾患にも関する。特に、このような障害は、骨形成の減少または過度の骨吸収、骨に存在する骨芽細胞または骨細胞の数、生存力または機能の低下、対象における骨量の減少、骨の脆化、骨強度または弾力性の低下などを特徴とし得る。

例として、限定されるものではないが、本発明の方法により得られるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞（例えば、骨芽細胞系譜細胞）の移植から利益を受け得る骨関連障害としては、例えば原発性、閉経後、老年性、コルチコイド誘発性などの任意のタイプの骨粗鬆症またはオステオペニア；任意の続発性、一部位または多部位骨壊死；任意のタイプの骨折、例えば、癒合不能、変形癒合、癒合遅延骨折または圧迫などの任意のタイプの骨折；骨固定（例えば、脊椎固定および再建）を必要とする病態；例えば外傷性損傷または癌手術後の骨再建、および頭蓋顔面骨再建、骨形成不全症、溶骨性骨癌、パジェット病、内分泌障害、低リン酸血症、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、関節リウマチ、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、ゴーハム病およびマッキューン・オルブライト症候群といった局部性または全身性障害を含み得る。

本明細書に記載のＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団および医薬処方物は、単独で使用しても、または各障害に関して知られている療法もしくは活性化合物のいずれかと併用してもよい。他所に記載されているように、投与は同時であっても、または任意の順序で逐次であってもよい。

細胞が異種（すなわち、非自己、非同種または非同種異系）源に由来する場合、併用免疫抑制療法、例えば、シクロスポリンまたはタクロリムス（ＦＫ５０６）などの免疫抑制薬が一般に投与され得る。

細胞の投与量は、治療される対象によって異なる。好ましい実施形態において、細胞の投与量は１０^２〜１０^１０または１０^２〜１０^９、または１０^３〜１０^１０または１０^３〜１０^９、または１０^４〜１０^１０または１０^４〜１０^９、例えば、１０^４〜１０^８、または１０^５〜１０^７であり、例えば、約１×１０^５、約５×１０^５、約１×１０^６、約５×１０^６、約１×１０^７、約５×１０^７、約１×１０^８、約５×１０^８、約１×１０^９、約２×１０^９、約３×１０^９、約４×１０^９、約５×１０^９、約６×１０^９、約７×１０^９、約８×１０^９、約９×１０^９または約１×１０^１０細胞がヒト対象に投与可能である。さらなる実施形態において、１０^６〜１０^８細胞／ｋｇ体重または１×１０^７〜９×１０^７細胞／ｋｇ体重、例えば、約１×１０^７、約２×１０^７、約３×１０^７、約４×１０^７、約５×１０^７、約６×１０^７、約７×１０^７、約８×１０^７、約９×１０^７または約１×１０^８細胞／ｋｇ体重がヒト対象に投与可能である。例えば、このような細胞数またはこのような細胞数／ｋｇ体重は、特に、対象に投与される細胞総数を指し、この投与は好適には、１日以上にわたって（例えば、１、２、３、４もしくは５日またはそれを超える日数にわたって）投与される１用量以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０用量またはそれを超える用量）に分割され得る。しかしながら、治療上有効な用量の正確な決定は、それらの大きさ、年齢、組織損傷の大きさ、および損傷が発生してからの時間を含む、各患者の個々の因子に基づくものであり得、当業者ならば本開示および当技術分野の知識から容易に確認することができる。

好適には、投与される医薬処方物において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、約１０^４細胞／ｍｌ〜約１０^９細胞／ｍｌ、好ましくは約１０^５細胞／ｍｌ〜約１０^８細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは約１×１０^６細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で存在し得る。

特定の実施形態において、投与される医薬処方物は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。特定の実施形態において、投与される医薬処方物は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。

特定の実施形態において、投与される医薬処方物は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存培地中に約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。特定の実施形態において、投与される医薬処方物は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存培地中に約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。

特定の実施形態において、投与される医薬処方物は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地中に約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。特定の実施形態において、投与される医薬処方物は、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を、ＤＭＳＯ、ＨＳＡ、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなる凍結保存培地中に約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で含んでなる。

本明細書に教示されるような方法、使用、または細胞製品の特定の実施形態において、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞は、例えば、投与される医薬処方物中に、約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌ、好ましくは約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で存在してよい。

本明細書に教示されるようなＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞サイズの縮小は、調整可能かつ／または高い細胞濃度を可能とする。よって、組成物が液体組成物である場合、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象に投与される、本明細書に教示されるような方法により得られるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を含んでなる組成物の容量は、他の方法により得られるＭＳＣ由来細胞を含んでなる組成物の容量よりも少ない。

本願はまた、以下の記載に示されるような側面および実施形態を提供する。
記載１ 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）およびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
を含んでなり、
前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）でｘ日の期間培養され、ここで、ｘ日は前記ＭＳＣ由来細胞の少なくとも２０％が増殖している最終日である、方法。

記載２ 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ｂ）において約８日〜約１２日間、好ましくは、約１０日間培養される、記載１に記載の方法。

記載３ 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ａ）において約１３日〜約１５日間、好ましくは、約１４日間培養される、記載１または２に記載の方法。

記載４ 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ｃ）において約１０日〜約１４日間、好ましくは、約１２日間培養される、記載１〜３のいずれか１つに記載の方法。

記載５ 前記増殖しているＭＳＣ由来細胞が細胞周期のＳ期、Ｇ２期またはＭ期にある、記載１〜４のいずれか１つに記載の方法。

記載６ ＭＳＣからＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
を含んでなり、
前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）でさらに培養するために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは、３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種される、方法。

記載７ 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ｃ）でさらに培養するために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは、３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種される、記載６に記載の方法。

記載８ ＭＳＣからＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
（ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
（ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；
（ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること；
（ｄ）前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させること；ならびに
（ｅ）前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存すること
を含んでなる、方法。

記載９ 前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞が工程（ｄ）において凍結保存培地に約１×１０^７／ｍｌ〜約１×１０^８／ｍｌの濃度、好ましくは、約２×１０^７／ｍｌ〜約４×１０^７／ｍｌの濃度で再懸濁される、記載８に記載の方法。

記載１０ 前記凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなる、記載８または９に記載の方法。

記載１１ ＴＧＦβがＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびそれらの混合物からなる群から選択される；好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、記載１〜１０のいずれか一１つに記載の方法。

記載１２ ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度が約０．１ＩＵ／ｍｌであり；かつ／または
ヘパリンまたはヘパリン誘導体もしくはその類似体が非分画ヘパリン（ＵＦＨ）；エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、アルデパリン、パルナパリン、ベミパリン、またはそれらの混合物などの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）；ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、アカラン硫酸、ケラタン硫酸、またはそれらの混合物、例えばダナパロイドなどのヘパリノイド；ヘパリン塩；ヘパリノイド塩；ヘパリン断片；ヘパリノイド断片；およびそれらの混合物からなる群から選択される、
記載１〜１１のいずれか１つに記載の方法。

記載１３ 前記培地が血漿、血清またはその代替物のうち１以上をさらに含んでなる場合など、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞がさらなる接触を受ける、記載１〜１２のいずれか１つに記載の方法。

記載１４ 前記対象がヒト対象である、記載１〜１３のいずれか１つに記載の方法。

記載１５ 記載１〜１４のいずれか１つに記載の方法により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団。

記載１６ 懸濁液中のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の少なくとも９０％が２５μｍ以下の直径を有し（Ｄ_９０≦２５μｍ）、かつ、懸濁液中のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞で３５μｍを超える直径を有するものは多くても１％である、ＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ拡大培養により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団。

記載１７ ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞が記載１〜１４のいずれか１つに記載の方法により得ることができるまたは得られる、記載１６に記載のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団。

記載１８ 記載１５〜１７のいずれか１つに記載のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる、医薬処方物。

記載１９ リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子の組合せ、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸もしくはその誘導体、キトサン、ポリＬ−リシン、ゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノゲン、オステオカルシン、またはそれらの組合せなどの骨誘導特性を有する成分をさらに含んでなる、記載１８に記載の医薬処方物。

記載２０ 薬剤として使用するための、好ましくは、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象の治療において使用するための、記載１５〜１７のいずれか一項に記載のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、または記載１８もしくは１９に記載の医薬処方物。

記載２１ 前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞が約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌ、好ましくは、約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で存在し；および／または
前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団もしくは医薬処方物が経皮投与、骨内投与、関節内投与、椎間投与もしくは血管内投与に好適であり；
前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団または医薬処方物が骨欠損部位における投与に好適である、
記載２０に記載の使用のための集団または医薬処方物。

本発明をその特定の実施形態に関して説明してきたが、以上の説明に照らせば当業者には多くの代替、改変、および変形が明らかであることは明白である。よって、以下のようなこのような代替、改変、および変形は総て、添付の特許請求の範囲の趣旨および広義の範囲に包含することが意図される。

本明細書に開示される本発明の側面および実施形態は、以下の限定されない例によりさらに裏づけられる。

実施例１：本発明の実施形態によるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法
５％ＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．１ＵＩ／ｍｌヘパリン（ＬＥＯ Ｐｈａｒｍａ）、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）およびＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を添加した従来の培養培地を培養培地として使用した。

健康なボランティアドナーの腸骨稜から２０〜６０ｍｌのヒト骨髄（ＢＭ）穿刺液を得た。採取後、骨髄白血球を計数し、培養培地に５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。細胞播種の４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新した。播種の７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、増殖因子を更新するために新鮮な培地に置き換えた。細胞を一次培養として１４日間培養した。１４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第１継代：Ｐ１）。中間細胞を凍結保存し（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０中）、液体窒素中で保存した。各細胞保存株は１名のドナーから供給し、ドナー間でプールは行わなかった。

次に、中間細胞を解凍し、二次培養として５７２細胞／ｃｍ^２の密度で再播種した。細胞を二次培養として１０日間培養した。２４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第２継代：Ｐ２）。中間細胞を凍結保存し（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０中）、液体窒素中で保存した。

次に、中間細胞を解凍し、三次培養として５７２細胞／ｃｍ^２の密度で再播種した。細胞を三次培養として１０日間培養した。３４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第３継代：Ｐ３）。最終細胞製品を得るために、細胞をＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｃ−新鮮」と呼称する。

三次培養の終了時に、細胞をまた長期保存用に凍結保存した。そのために、細胞を所望の濃度（２５×１０^６細胞／ｍｌ）となるように凍結保存培地に再懸濁させた。次に、この細胞懸濁液をクライオチューブに移し、液体窒素中で保存した。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｃ−凍結」または「骨形成細胞Ｃ凍結（保存）」と呼称し、「Ｂ−Ｆ細胞 Ｃ」とも略す。凍結保存培地は、次の通りであった。
ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、または
５０％（ｖ／ｖ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）および５０％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、または
９５％（ｖ／ｖ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）および５％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、または
８０％（ｖ／ｖ）Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、および１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）。

比較例１：間葉系幹細胞およびＭＳＣ由来細胞を得るための従来技術の方法
従来技術による比較細胞製品およびそれらの製造方法を以下に記載する。

間葉系幹細胞
未分化ＭＳＣは、健康なボランティアドナーの腸骨稜からヒト骨髄（ＢＭ）穿刺液を得ることにより調製した。採取後、骨髄白血球を計数し、従来の培養培地に５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。２４時間後、培養培地を除去し、細胞新鮮培養培地を加えた。培養培地は２〜３日毎に置き換えた。半分を超えるコロニーが集密度８０％に達した際または数コロニーが集密度１００％に達した際に、細胞を採取した（第１継代１：Ｐ１）。この第１継代時に、細胞をそのままＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）中で凍結保存した。培養プロセスを終了させるために、ＭＳＣを解凍し、二次培養として５７２細胞／ｃｍ^２で播種し、培養した。半分を超えるコロニーが集密度８０％に達した際または数コロニーが集密度１００％に達した際に、第２継代（Ｐ２）のＭＳＣを得るために細胞を採取した。この細胞製品を本明細書では「ＭＳＣ」と呼称する。

細胞製品Ａ
５％Ｏｃｔａｓｅｒｕｍ（５０：５０自己血清およびＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ））、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）およびＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を添加した従来の培養培地を培養培地として使用した。

凍結培地：８０％従来培養培地、１０％Ｏｃｔａｓｅｒｕｍ（５０：５０自己血清およびＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ））、１０％ＤＭＳＯ。

健康なボランティアドナーの腸骨稜からヒトＢＭ穿刺液を得ることにより、本明細書において「細胞製品Ａ」と呼称されるｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＭＳＣ由来細胞を作製した。採取後、骨髄白血球を計数し、５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で培養培地に播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。細胞播種の４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新した。播種の７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、新鮮培地に置き換えた。細胞は一次培養として１４日間培養した。１４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第１継代：Ｐ１）。中間細胞を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）または凍結培地中で凍結保存し、液体窒素中で保存した。

二次培養のために、細胞を解凍し、１１４４細胞／ｃｍ^２の密度で再播種した。細胞を二次培養として１４日間培養した。２８日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第２継代：Ｐ２）。最終細胞製品を得るために、細胞をＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ａ」と呼称する。

細胞製品Ｂ
５％ＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．１ＵＩ／ｍｌヘパリン（ＬＥＯ Ｐｈａｒｍａ）、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）およびＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を添加した従来の培養培地を培養培地として使用した。

健康なボランティアドナーの腸骨稜からヒトＢＭ穿刺液を得ることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＭＳＣ由来細胞を作製した。採取後、骨髄白血球を計数し、培養培地中に５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。細胞播種４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新した。播種７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、増殖因子を更新するために新鮮培地と置き換えた。細胞を一次培養として１４日間培養した。１４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第１継代：Ｐ１）。中間細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）中で凍結保存し、液体窒素中で保存した。

次に、中間細胞を解凍し、二次培養として２８６細胞／ｃｍ^２の密度で再播種した。細胞を二次培養として１４日間培養した。２８日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第２継代：Ｐ２）。最終細胞製品を得るために、細胞をＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｂ」と呼称する。

実施例２：本発明の実施形態による方法により得られるＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞、ならびに従来技術方法により得られるＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞特性評価
材料および方法
細胞
本発明を示す細胞製品（すなわち、細胞製品Ｃ新鮮および細胞製品Ｃ凍結）は、実施例１に記載されているように得た。比較細胞製品（すなわち、ＭＳＣ、細胞製品Ａおよび細胞製品Ｂ）は、比較例１に記載されているように得た。

細胞計数および生存率
細胞密度および生存率は、トリパンブルー排除アッセイを用いて決定した。採取後、細胞をトリパンブルー（０．４％、Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標））で１：２希釈し、細胞生存率を、ビルケルチャンバー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））および倒立顕微鏡（ＡＥ３１、Ｍｏｔｉｃ（登録商標））を用いて分析した。細胞生存率はまた、アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（商標）およびＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（登録商標））を用いたフローサイトメトリーによっても分析した。採取後、５０，０００細胞を室温、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標））中、暗所で、２．５μｌの７−ＡＡＤとともにインキュベートした。

フローサイトメトリー
上記の比較例１および実施例１に記載されているように得られた比較細胞製品（すなわち、ＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞：細胞製品ＡおよびＢ）ならびに本発明を示す細胞製品（すなわち、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞：細胞製品Ｃ）を採取し、細胞表面マーカーをフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩおよびＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウエア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞を以下のコンジュゲートモノクローナル抗体：抗ＣＤ７３、抗ＣＤ９０および抗ＣＤ１６６（間葉マーカーであり、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞により発現が高いはずである）、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３４および抗ＣＤ４５（造血マーカーであり、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞には実質的に存在しないはずである）、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ４９ａ−ｅ、抗ＣＤ２９（接着マーカーである）、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８６および抗ＨＬＡ−ＤＲ（免疫原性マーカーである）、および抗アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）とともに室温で１５分間インキュベートし、次に、ＰＢＳで洗浄した後に遠心分離し、０．３ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。

細胞表面マーカーＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１０およびＣＤ４４の特性決定のため、５×１０^４細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡ中、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で、５μｌの抗体とともに暗所で１０分間インキュベートした。このインキュベーション時間の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞外染色に使用した種々の抗体は以下である：ＣＤ１０５に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６２４０８）、ＣＤ７３に対するＡＰＣコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６０８４７）、ＣＤ１０に対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５３７５）、ＣＤ４４に対するＰＥコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５０９８９）。非特異的染色は、細胞を、ＦＩＴＣ、ＡＰＣおよびＰＥとコンジュゲートされた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：それぞれ５５６６４９；５５５７５１；５５６６５０）とともにインキュベートすることにより決定した。分析前に、対象とするシングレットおよび集団のゲーティングを行った。フローサイトメトリー分析は、１×１０^４イベントのゲーティング集団に対してＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））およびＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）８．０ソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を用いて行った。分析に使用した設定パラメーターを、ビーズ（ＢＤ ＣｏｍｐＢｅａｄｓ Ｐｌｕｓ（登録商標）、カタログ番号５６０４９７）を用いて自動実行した。各コンジュゲートに関して、陽性カットオフを対照アイソタイプ抗体陽性１％に固定し、各マーカーの陽性を決定した。全分析集団の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）も求め、対応するアイソタイプ対照抗体のＭＦＩにより割って正規化ＭＦＩ（ｎＭＦＩ）を得た。

ＡＬＰ酵素活性の測定
ＡＬＰ酵素活性は、リン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）の加水分解に基づく生化学的アッセイにより測定した。ＡＬＰにより脱リン酸化された後、ｐＮＰＰは黄色になり、分光光度計により４１０ｎｍで検出することができる。細胞のＡＬＰ酵素活性は、精製仔牛腸管ＡＬＰ活性に基づく標準曲線に関して決定される。ＡＬＰ活性はＡＬＰ／ｍｇタンパク質の単位で報告する。１単位のＡＬＰは、３７℃で１分間に１μｍｏｌのｐＮＰＰを加水分解する。

逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
採取後、細胞はＲＮＡ抽出まで乾燥ペレット（５００，０００細胞）として−８０℃で保存した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を製造者の説明書に従って用い、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は、ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ（登録商標）１６（Ｔｒｉｎｅａｎ（登録商標））を用いて測定した。ＲＮＡ逆転写（ＲＴ）は、１μｇの全ＲＮＡ抽出物から、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ（登録商標））を製造者の説明書に従って用いて行った。ｑＰＣＲは、プレミックスＥｘ Ｔａｑ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ（登録商標））を用い、２μｌのｃＤＮＡから、製造者の説明書に従って行った。対象とする以下の遺伝子の発現レベルを定量した：ＲＵＮＸ２（フォワード：ＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＣＴＧＡＧ（配列番号１）、リバース：ＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣ（配列番号２））、ＳＯＸ９（Ｆ：ＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＣＣＣＡＡ（配列番号３）、Ｒ：ＡＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧ（配列番号４）、ＢＭＰ２（Ｆ：ＧＧＡＡＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＴＴ（配列番号５）、Ｒ：ＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＡ（配列番号６））、ＡＬＰＬ（Ｆ：ＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧ（配列番号７）、Ｒ：ＡＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣ（配列番号８））、ＭＭＰ１３（Ｆ：ＴＧＧＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡ（配列番号９）、Ｒ：ＡＡＣＴＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧ（配列番号１０））、ＣＨＩ３Ｌ１（Ｆ：ＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＡＧＡ（配列番号１１）、Ｒ：ＧＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＣＣＧＴＣＣＡ（配列番号１２））、ＤＣＮ（Ｆ：ＡＡＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＧ（配列番号１３）、Ｒ：ＧＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧ（配列番号１４））、ＯＣＮ（Ｆ：ＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＴ（配列番号１５）、Ｒ：ＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＡＴＡＣＡＧ（配列番号１６））、ＳＰＯＮ１（Ｆ：ＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡ（配列番号１７）、Ｒ：ＣＡＣＧＧＧＴＧＡＧＣＣＣＡＡＴＴＣＴ（配列番号１８））、ＰＯＳＴＮ（Ｆ：ＴＴＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴ（配列番号１９）、Ｒ：ＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号２０））。ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を用いて２反復で行った。３つのハウスキーピング遺伝子：ＲＰＬ１３Ａ（Ｆ：ＣＡＴＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号２１）、Ｒ：ＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧ（配列番号２２））、ＴＢＰ（Ｆ：ＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＡ（配列番号２３）、Ｒ：ＧＣＣＡＴＡＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＣ（配列番号２４））、ＨＰＲＴ（Ｆ：ＣＣＣＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴ（配列番号２５）、Ｒ：ＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴ（配列番号２６））から得られた幾何平均を用いて正規化を行った。同じドナー由来の異なるＭＳＣ由来細胞製品間の比較は、対象とする各遺伝子に関して２−ΔΔＣｔ法を用いて遺伝子発現（変化倍率）を計算することにより行った(Schmittgen and Livak, 2008, 3(6), 1101-8; Nature Protocols, 3(6), 1101-1108)。

統計分析はＪＭＰ（登録商標）（１３．１．０）ソフトウエアを用いて行った。変化倍率で表すＲＴ−ｑＰＣＲデータを対数変換し、スチューデントの検定（α＝０．０５）を行って細胞種間に見られる差異の統計的有意性を評価した。統計的有意性は得られたｐ値（ｐ）に応じてグラフで表した：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１、および^＊＊＊はｐ＜０．００１。

多重アッセイ
採取後、細胞を５０，０００細胞／ｃｍ²の密度で播種した。５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で４８時間のインキュベーション後、細胞培養上清を採取し、遠心分離し（室温にて１５００ｒｐｍで５分）、−８０℃で保存した。上清を、Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））を用い、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイにより分析した。プレミックスＭｕｌｔｉｐｌｅｘは特注生産されたものであった（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））。以下の分泌因子を調べた：ＢＭＰ−２、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＭＰ１３、ＯＰＮ、ＯＰＧ、ＳＰＡＲＣ、ＲＡＮＫＬ、ＣＨＩ３Ｌ１。このアッセイは製造者の説明書に従って行い、分析はＭＡＧＰＩＸ（登録商標）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））およびＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ５．０ＴＭソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標））を用いて行った。

細胞サイズの測定
比較例１および実施例１に記載されているように得た比較細胞製品（すなわち、ＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞：細胞製品ＡおよびＢ）および本発明を示す細胞製品（すなわち、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞：細胞製品Ｃ）を採取し、０．４％トリパンブルーを含むＰＢＳに１２．５×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁させた。１０μｌの細胞懸濁液を目盛り付きのスライドガラス（Ｍｏｔｉｃ（登録商標））に載せ、次いで、カバーガラスで保護し、倍率４０倍の倒立顕微鏡（ＡＥ３１；Ｍｏｔｉｃ）下に置いた。顕微鏡に取り付けたカメラ（Ｍｏｔｉｃａｍ、Ｍｏｔｉｃ（登録商標））で撮影した画像をＭｏｔｉｃ Ｉｍａｇｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）２．０２ソフトウエアにより分析して細胞直径を測定した。分析を統計的に有意と見なすために少なくとも１００細胞を測定した。

ｅｘ ｖｉｖｏ培養の種々の時点で得られた細胞のサイズはまた、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩおよびＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウエア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によっても分析した。簡単に述べれば、実施例１または比較例１に記載されるように、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養の開始後２１、２３、２６および２８日目に細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に細胞密度１×１０^６細胞／ｍｌで懸濁させ、前方散乱（ＦＳＣ）測定に関してフローサイトメーターで分析した（相対的蛍光単位で表す）。前方散乱は、レーザー光路方向の散乱光を測定するため、フローチャンバーを通過する細胞の相対的サイズが得られる。

結果
培養収量
本発明を示す方法は、全体的な培養収量を劇的に増大させたことから（表２、細胞製品Ｃ新鮮と細胞製品ＡおよびＢ）、臨床使用のための同種異系細胞の入手可能性（すなわち、１回の骨髄提供から得られる細胞の数）を有意に増大させた。

平均±ＳＤは、ドナー効果による変動（骨髄出発材料間の変動）を含むバッチ間の変動を考慮；ＰＤＬ：集団倍加レベルは、細胞数が倍加した時間；^＊総収率は、総ての連続培養（０日目に細胞を播種してから製造工程の終了およびＭＳＣ由来細胞の生成まで）の培養収率の累積を考慮；ＮＡ：取得できず

細胞マーカー発現プロフィール
フローサイトメトリー分析は、細胞製品Ａ、細胞製品Ｂ（従来技術に従う比較方法で作製）、および最終の凍結保存有りまたは無しの細胞製品Ｃ（本発明を示す方法で作製）の細胞表面マーカー発現プロフィールに基づく一般的な細胞識別は匹敵していたことを明らかにした。

それらは総て、間葉マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し、造血マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３を発現していなかった（細胞集団の５％未満はこれらのマーカーを発現していた）（表３）。細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）は、（ｉ）低レベルのＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体、例えば、ＨＬＡ−ＤＲを発現し、（ｉｉ）ＡＬＰの発現が高かった（表３および４）。ＨＬＡ−ＤＲの弱い発現により呈される弱い免疫原性は有利には、例えば同種異系対象への細胞移植を可能とする（表３）。加えて、細胞製品Ａ、細胞製品Ｂ、および細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）は、未分化ＭＳＣに比べてそれらの表面に接着マーカーＣＤ４９ｅおよび酵素ＡＬＰの発現が高かった（表３および４）。高いＡＬＰ発現は、細胞製品Ａ、細胞製品Ｂ、および細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）の骨芽細胞系譜への運命決定を強調する。

略語：ＡＬＰ：アルカリ性ホスファターゼ；ＡＰＣ：アロフィコシアニン；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート；ＨＬＡ−ＤＲ：ヒト白血球抗原−ＤＲアイソタイプ；ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ：ヒト白血球抗原−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱアイソタイプ；ＭＳＣ：間葉幹細胞；ＮＤ：決定されず；ＰＥ：フィコエリトリン；ＳＤ：標準偏差

略語：ＡＬＰ：アルカリ性ホスファターゼ；ＮＤ：決定されず；ＰＥ：フィコエリトリン

細胞表面マーカー発現プロフィールは、細胞表面のマーカーの存在（集団陽性パーセンテージ）によるだけでなく、種々のマーカーの細胞表面に発現されるマーカーの量（集団正規化蛍光中央値）を分析することによっても特徴付けた。これらの分析により、異なるＭＳＣ由来細胞間のいくつかの差異が強調された。

ヘパリンの存在下で培養された細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）は、ヘパリンの不在下で培養されたＭＳＣおよび細胞製品Ａよりも高いレベルのＡＬＰを発現し（ＡＬＰ−ＰＥ ｎＭＦＩ結果）、それらの骨形成細胞の骨芽細胞系譜への運命決定を強めた。

細胞表面での間葉マーカーＣＤ７３およびＣＤ１０５の発現は、細胞種にも依存していた。ヘパリンの存在下で作製された細胞製品（最終の凍結保存有りまたは無しの細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃ）は、細胞製品Ａよりも高いレベルのＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現した。加えて、細胞製品Ｃは、特に、細胞製品Ｃが最終の凍結保存を受けなかった場合に、それらの表面に細胞製品Ｂよりも多いＣＤ７３およびＣＤ１０５を有していると思われた（表５）。分化細胞製品Ａ、ＢおよびＣは、未分化ＭＳＣよりも高い量の細胞マーカーＣＤ１０を発現する。加えて、細胞製品Ｃは、それらの表面に細胞製品ＡおよびＢよりも多いＣＤ１０を有する（表５）。

ｎＭＦＩフローサイトメトリー分析は、ＣＤ７３およびＣＤ４４タンパク質発現が他の細胞種よりも細胞製品Ｃで上昇していたことを明らかにした（図１）。

略語：ＡＬＰ：アルカリ性ホスファターゼ；ＡＰＣ：アロフィコシアニン；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート；ＨＬＡ−ＡＢＣ：ヒト白血球抗原ＡＢＣ；ＨＬＡ−ＤＲ：ヒト白血球抗原−ＤＲアイソタイプ；ＭＳＣ：間葉幹細胞；ＮＡ：適用不可；ＮＤ：決定されず；ＰＥ：フィコエリトリン；ＳＤ：標準偏差

ＲＴ−ｑＰＣＲおよび多重アッセイ
分析により、ＭＳＣに比べて細胞製品Ｃ新鮮における遺伝子ＲＵＮＸ２は有意に（^＊）過剰発現したが、細胞製品Ｂに比べて有意に（^＊）下方調節されていたことが明らかになった（表６ａ）。ＭＳＣおよび細胞製品Ａに比べて細胞製品Ｃ新鮮におけるＭＭＰ１３遺伝子は有意に（^＊）上方調節されていたが、その発現は細胞製品Ｂではなお有意に（^＊）高かった（表６ａ）。

他方、遺伝子ＳＰＡＲＣおよびＫＩ６７は、細胞製品Ｃ新鮮では他の総ての細胞種に比べて有意に（^＊＊）下方調節されていた（表６ａ）。遺伝子ＰＰＡＲＧは、細胞製品Ｃ新鮮およびＭＳＣでは同等に発現されたが、細胞製品ＡおよびＢに比べて有意に（^＊＊＊）下方調節されていた（表６ａ）。

さらに、細胞製品Ｃ凍結保存における遺伝子ＢＭＰ２、ＳＯＸ９、ＭＭＰ１３およびＡＬＰＬは、ＭＳＣに比べて有意に過剰発現されており（表６ｂ）、軟骨骨形成系譜へのそれらの関与を示す。

SD: 標準偏差

SD:標準偏差

細胞サイズ
（ｉ）Ｍｏｔｉｃ Ｉｍａｇｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）２．０ソフトウエアおよび（ｉｉ）フローサイトメトリーＦＳＣ分析を用いた細胞サイズの測定から、細胞製品Ｂ、細胞製品Ｃ新鮮および細胞製品Ｃ凍結は、細胞製品Ａよりも小さく、均質であることが確認された（表７、図２）。

極めて興味深いことに、大部分の細胞製品Ｃ（少なくとも９０％）は直径２５μｍを超えず、それらの１％未満が直径３５μｍを超えていた。これに対し、細胞製品Ａは、直径２５μｍを超えないわずか３５．４％の細胞および３５μｍより大きい直径を有する２６．９％の細胞を含んでいた（表８、図２）。細胞製品Ｂは、直径２５μｍを超えない７３．７％の細胞および３５μｍより大きい直径を有する３．３％の細胞を含んでいた（表８、図２）。

実施例３：実施例１の方法により得られたＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞のｉｎ ｖｉｖｏ骨形成
材料および方法
細胞
本発明を示す細胞製品（すなわち、細胞製品Ｃ凍結）は、実施例１に記載されているように得た。

マウス
１０〜１１週の雌ＮＭＲＩ−Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）マウスはＪａｎｖｉｅｒ Ｓ．Ａ．Ｓ．（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）から購入し、食物および水を自由に摂らせる標準的条件で飼育した。

頭蓋冠骨形成マウスモデル
１２週齢の雌ＮＭＲＩ−Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）マウスをイソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標））で麻酔し、細胞製品Ｃ凍結（マウス１個体当たり１００μｌ中２．５×１０^６細胞）または賦形剤（１００μｌ）を頭蓋冠骨に単回の皮下投与を施した。経時的に骨新形成を標識するために、カルシウム結合蛍光色素をマウスに順次投与した。アリザリンレッド（赤）、カルセイン（緑および青）およびテトラサイクリン（黄）（総てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から）をそれぞれ細胞投与の２日または３日前および５日、１２日、および１９日後に腹腔内投与した。試験動物の、投与後４週間の体重、全身の臨床徴候、および投与部位の臨床徴候を経過観察した。細胞投与の４週間後に頚椎脱臼によりマウスを安楽死させ、各マウスの頭蓋冠を採取して、骨形成細胞の骨形成特性をＸ線撮像、組織形態計測（骨形成の定量）および免疫蛍光により評価した。

Ｘ線分析による骨形成の定量
安楽死時に、横に並べた各マウスの頭蓋冠のｅｘ ｖｉｖｏＸ線撮像をＦａｘｉｔｒｏｎ（登録商標）ＭＸ−２０装置を用いて行った。デジタル画像は、手動モードにて、３５ｋＶに設定した電圧、曝露時間４．８秒、明度／対比 ８３００／６０００として、倍率１．５倍で撮影した。作成されたＸ線像は、０（ブラック領域）〜２５５（ホワイト領域）の範囲のグレー強度値を用いたグレーレベル画像であり、放射線不透性および従って骨不透明度または骨厚に正比例する。頭頂骨の骨形成の骨誘導部分（選択から除外された石灰化結節）（手による選択）のグレーレベル強度値を、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウエアのヒストグラムツールを用いて解析した。

Ｘ線撮像およびＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウエアは、石灰化結節（手による選択）の表面積を定量するためにも使用した。

サンプル包理および組織切片化
組織形態計測、ＡＬＰ、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）、マッソントリクロームゴールドナー染色および免疫蛍光のために、頭蓋冠を固定し、４℃で穏やかに振盪しながら、各１２時間の７０％、８０％および９０％エタノール浴での連続インキュベーションで脱水し、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）プラスチック樹脂（ＨｉｓｔｏＲｅｓｉｎ、Ｌｅｉｃａ（登録商標））に包埋した。４μｍ厚および８μｍ厚の冠状切片を、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ（登録商標）、ＲＭ２２５５）を用いて切片化した。

免疫蛍光染色
頭蓋冠の４μｍ厚冠状プラスチック組織切片に対してヒトおよびマウスコラーゲンＩの免疫蛍光による評価を行った。簡単に述べれば、室温で３０分間、ＰＢＳ １Ｘ／Ｔｒｉｔｏｎ０．３％の溶液を用いた透過化工程の後、組織切片を、室温で１時間、ブロッキング溶液（すなわち、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ウマ血清／Ｔｒｉｔｏｎ（商標））中でインキュベートして非特異的結合部位を飽和させた。次に、これらの組織スライドをマウス抗ヒトおよびウサギ抗マウスコラーゲンＩ一次抗体（Ａｂｃａｍ；それぞれ＃ａｂ１３８４９２およびＡｂｃａｍ；＃ａｂ２１２８６）とともに４℃で一晩インキュベートした。ＲＴで５分のＰＢＳ中での３回の洗浄の後、室温で１時間、ブロッキング溶液でブロッキングを行った。次に、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を室温で２時間加え、遮光した。二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１２０６）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｃｙ３（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ；＃ａｂ９７０３５）を、それぞれマウスコラーゲンＩを緑でおよびヒトコラーゲンＩを赤で可視化するために使用した。次に、これらのスライドをＰＢＳ １×中、室温で５分、３回すすぎ、室温で１分、ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）溶液とともにインキュベートすることによって核を染色した。最後に、これらのスライドをＰＢＳ中で１回、軽くすすいだ後、ＧｌｙｃｅｒＧｅｌ（登録商標）試薬にマウントした。免疫蛍光の陰性対照として、隣接する組織スライドでは一次抗体を除いた。

組織染色
骨芽細胞および破骨細胞活性をそれぞれ頭蓋冠切片で、それぞれＡＬＰおよびＴＲＡＰ酵素活性検出法を用いて評価した。ＡＬＰ染色では、４μｍ厚の頭蓋冠冠状プラスチック切片を、Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ＲＲ Ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））およびＮａｐｈｔｏｌ ＡＳ−ＭＸアルカリ性リン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の溶液とともに１時間インキュベートした。８μｍ厚の頭蓋冠冠状プラスチック切片に対し、Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ）キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を製造者の説明書に従って用い、ＴＲＡＰ染色を行った。新たに形成された骨の石灰化の状態を評価するために、ＡＬＰで染色した頭蓋冠切片に対し、キット（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ（登録商標））を製造者の説明書に従って用い、マッソントリクロームゴールドナー染色を行った。デジタル画像を、光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ（登録商標））およびＬｅｉｃａ（登録商標）ＬＡＳ ＥＺソフトウエアを用いて取得した。

頭蓋冠の組織形態計測的解析
骨形成（すなわち、絶対的骨形成）の定量をプラスチック包埋組織で行った。石灰化結節有りおよび無しの絶対的新形成骨の厚さ（アリザリンレッドにより蛍光標識された基底石灰化前線からカルセインおよびテトラサイクリンにより蛍光標識された骨新形成まで）を、４μｍ厚の冠状切片でＺＥＮ（登録商標）画像解析ソフトウエア（Ｚｅｉｓｓ）により測定した（μｍ）。各動物について、５つの独立したレベルで、各レベル間の距離を２００μｍとして絶対的厚さの４回の測定を行った、第一段階として、各動物について、厚さの平均（結節有りまたは無し）±ＳＤ（すなわち、５つのレベルの各レベル当たり４回の測定の平均）を計算した。

統計分析
結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。統計分析は、ＪＭＰ（登録商標）（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）またはＧａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウエアを用いて行った。群間の差異は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意と見なした。

結果
細胞製品Ｃ凍結を投与したマウスは、投与４週間後に対象よりも高い骨形成を示した（図８Ａ〜Ｃ）。骨の不透明度は、賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結で有意に高かった（図８Ｂ）。骨形成の表面は、石灰化結節が見られなかった賦形剤に比べて有意に高かった（図８Ｃ）。骨形成を伴うまたは伴わない骨誘導（絶対的骨形成により表される）の組織形態計測的尺度は、賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結で有意に高かった（図８Ｄ〜Ｅ）。また、骨誘導活性に加え、骨形成細胞Ｃ凍結は、石灰化結節の存在により強調される高い骨形成活性を促進した。この骨形成活性は４／５の骨髄ドナー（またはバッチ生成物）および６５％のマウスに見られた（図８Ｆ）。１ドナー／バッチは、各群１個体のマウスで少なくとも１つの石灰化結節が見られた場合に骨形成性（陽性）であると見なした。賦形剤の投与後には結節は見られなかった。

より詳しくは、細胞製品Ｃ凍結は、骨誘導特性（頭蓋冠でのマウス起源の均質な骨形成）および骨形成特性（ヒトおよびマウス起源の石灰化結節）の両方を示した（図９）。

頭蓋冠表面に膜内宿主骨化が誘導された（図９および１０）。より詳しくは、骨形成細胞Ｃ凍結は、骨誘導特性および骨形成特性を示した（図１０「ｆｌｕｏ」）。マウス／ヒトＩ型コラーゲン二重免疫標識（図１０「ヒトＩ型コラーゲン」）は、宿主およびドナー起源の骨の存在（骨形成）を明らかにした。骨芽細胞活性（図１０「ＡＬＰ＋」）および破骨細胞（図１０「ＴＲＡＰ」）活性はほとんど石灰化結節に検出され、結節内の骨リモデリングプロセスが投与後４週間目になお進行していたことを示した。この所見は結節の大きさに依存し、結節が大きいほど高いＡＬＰ活性およびＴＲＡＰ活性が投与後４週間目になお存在していた。弱い類骨（図１０「ゴールドナーのマッソントリクローム染色」）が強調され、骨形成が完了していることを示す。

よって、骨形成細胞Ｃ凍結保存は骨新形成を高めた。

このことは、扁平骨ならびに長骨における骨欠損の治療のための、本明細書および実施形態に記載されるような細胞製品および細胞組成物の有用性を実証する。

実施例４：実施例１の方法により得られた細胞製品Ｃ凍結により修復されたｉｎ ｖｉｖｏマウス分節大腿骨未臨界サイズ欠損（ｓｕｂ−ＣＳＤ）
試験手順
細胞
本発明を示す細胞製品（すなわち、細胞製品Ｃ凍結）は、実施例１に記載されているように得られる。

分節大腿（ｓｕｂ−）未臨界サイズ欠損（ＳＦＣＳＤ）モデル
文献(Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80; Manassero et al., 2016, Journal of Visualized Experiments; (116): 52940)に従い、無菌条件下で外科手術を行った。簡単に述べれば、１３週齢の雌ＮＭＲＩ−Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）マウスをイソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標））で、またはデクスメデトミジン塩酸塩（Ｄｅｘｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）、Ｏｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ、１ｍｇ／体重ｋｇ）とケタミン（Ｎｉｍａｔｅｋ（登録商標）、Ｅｕｒｏｎｅｔ、１５０ｍｇ／体重ｋｇ）の混合物の腹腔内注射で麻酔し、加温プレート上に腹臥位に置いた。左大腿の前側に６穴ＰＥＥＫマイクロロッキングプレート（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ（登録商標））を適用した後、グリのこぎりおよびジグ（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ（登録商標））を用い、２ｍｍ長の大腿骨幹中部骨切り術を行った。予防的投薬として、抗生物質（Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標）、１０ｍｇ／体重ｋｇ）を手術前日に投与し（飲用水中）および鎮痛剤（ブプレノルフィン塩酸塩、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、０．１ｍｇ／体重ｋｇ）を手術前日と手術後少なくとも３日間１２時間毎に投与した。ＭＳＣ由来細胞Ｃ凍結保存（マウス当たり５０μｌ容量中１．２５×１０^６細胞）または賦形剤（対照群）を術後当日に、骨欠損部位に局所的に、１００μｌハミルトン（登録商標）シリンジを用いた経皮注射により投与した。細胞または賦形剤投与の１０週間後に頚椎脱臼によりマウスを安楽死させた。各マウスの左大腿を切開し、採取し、Ｘ線撮像まで０．９％ＮａＣｌ中、室温で維持した。

Ｘ線分析による骨修復の定量
各マウスの左大腿のｉｎ ｖｉｖｏＸ線撮像は、手術直後に、プレートの固定、分節大腿骨欠損サイズを制御するために、また、ベースラインを得るために、Ｆａｘｉｔｒｏｎ（登録商標）ＭＸ−２０装置を用いて、ＭＳＣ由来細胞または賦形剤の投与後１０週間まで２週毎に行った。デジタル画像は、手動モードにて、３５ｋＶに設定した電圧、曝露時間４．８秒、明度４，３００および対比７，１００として、倍率５倍で内外像および前後像を撮影した。

有効性は、３つの異なる方法、すなわち、骨修復パーセンテージ、適合されたラジオグラフィックユニオンスコア（ＲＵＳ）、および癒合スコアにより、２週間毎の経過観察で測定した。
・骨修復パーセンテージは、修復欠損サイズを初期欠損サイズで割ることにより計算した。欠損サイズは、各マウスについて、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエアを用い、内外および前後Ｘ線像で、骨欠損の両端間の距離（μｍ）を２か所（両皮質）で測定すること（合計４回の測定）により経時的に定量した。各マウスの各時点で、４回の測定値の平均を計算した。
・ＳＦＣＳＤモデルに関して適合されたＲＵＳ（ラジオグラフィックユニオンスコア）は、骨新形成、接合および骨折線（前後画像および内外ラジオグラフィック画像から）の有無に基づく半定量的測定値である。スコアリングは、両像で２つの皮質欠損部位において決定した４スコアの合計（各１〜４の範囲の４スコアの合計）に相当する。従って、スコアリングは、４（治癒の徴候無し）〜１６（完全な癒合）の範囲である。
・癒合スコアは、大腿欠損の両端間の癒合率を評価するバイナリスコアである。癒合を定義するために使用される放射線学的基準は、少なくとも３つの皮質における欠損の接合の可視化である(Cekich E et al., Acta Orthop Traumatol Turc. 2014, 48(5), 533-40)。スコアは０（癒合無し）または１（癒合）である。このパラメーターについては、最後の時点のみ分析した（ここでは、Ｗ１０）。

統計分析
結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。２元配置ＡＮＯＶＡ反復測定とその後にボンフェローニ事後検定を含んでなる統計分析を、ＪＭＰ（登録商標）（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウエアを用いて行う。群間の差異はｐ＜０．０５の場合に統計的に有意と見なした。

結果
分節大腿骨ｓｕｂ−ＣＳＤモデルにおいて、骨形成細胞Ｃ凍結保存は、投与２〜１０週間後に賦形剤に比べて骨折修復のパーセンテージを有意に向上させ、加速化した（図１１および１２）（ｐ＜０．００１）。さらに、ＲＵＳスコアは、賦形剤群に比べて骨形成細胞Ｃ凍結保存群で有意に増加していた（図１３）。最後に、癒合率も、賦形剤投与後の癒合に比べて骨形成細胞Ｃ凍結保存の投与１０週後に、９／１９（４７％）のマウスで向上していた。

このことは、長骨ならびに扁平骨における骨欠損の治療のための、本明細書および実施形態に記載されるような細胞製品および細胞組成物の有用性を実証する。

実施例５：動態研究およびマーカー発現分析による二次培養および三次培養の期間
上記の実施例１に記載されているように二次培養後に得られた本発明の実施形態によるＭＳＣ由来細胞を種々の時点（Ｄ２１、Ｄ２２、Ｄ２３、Ｄ２４、Ｄ２５、およびＤ２８）で採取し、細胞周期をフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（商標）およびＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウエア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。

ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ（商標）ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗキットを用いて全細胞ＤＮＡを７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色した。簡単に述べれば、１０^５細胞を１００μｌのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファー中で固定した後、周囲温度で２０分間インキュベートし、１ｍｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、その後、３００ｇで５分遠心分離した。上清を廃棄し、１００μｌのＢＤ Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐｌｕｓ中で細胞に透過処理を施した後、４℃で１０分間インキュベートし、ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファで洗浄し、その後、３００ｇで５分遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を再び１００μｌのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファー中で固定し（周囲温度で５分）、ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、３００ｇで５分遠心分離した。全細胞ＤＮＡを２０μｌの７−ＡＡＤ溶液中で染色した後、暗所、周囲温度で１０分間インキュベートした。１ｍｌの染色バッファーをこれらのサンプルに加えた後、フローサイトメトリー適合チューブに移した。

サンプルをＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析し、７−ＡＡＤ発光を、６５０ｎｍのロングパスフィルターを通した後に収集した。

図３および４は、Ｄ２４における細胞が増殖曲線の終わり付近に位置していたことを示す。細胞は細胞周期をまだ脱していなかったが、Ｄ２５から細胞は主として細胞周期から脱し、すなわち、それらはもはや増殖しなかった。

図４は、種々の培養期間での二次培養における細胞のイベント／周期（Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ）による細胞周期分析を示す。Ｄ２４では、４２％の細胞がなお増殖していたが（１１％Ｓおよび３１％Ｇ２／Ｍ）、Ｄ２５から細胞は主として細胞周期から脱していた。従って、二次培養の最適期間は２４日であった。

実施例１に記載されているように三次培養後に得られたＭＳＣ由来細胞を種々の時点で、すなわち、３４日目（Ｄ３４）から４２日目（Ｄ４２）までの各日に採取し、細胞表面マーカー発現を、実施例２のフローサイトメトリーに記載されているようなフローサイトメトリーにより分析した。

ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞の細胞集団に対して行ったフローサイトメトリーマーカー発現分析は、分化マーカー（ＢＭＰ２、ＲＵＮＸ２、ＺＮＦＳ２１、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰ１３、ＣＨＩ３Ｌ１）の発現はＤ３４からＤ４２まで増加し（図５）、増殖マーカーＫＩ６７の発現はこの培養期間（Ｄ３４〜Ｄ４２）中、低下した。

図６は、８つのバッチに関する種々の培養期間での細胞密度を示す。細胞密度は一般に、Ｄ３６でより高い。細胞はサイトメトリー（ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標））により計数した。図７は、２バッチについての種々の培養期間での平均細胞直径サイズを示す。細胞直径はＤ３５〜Ｄ３６で最小であった。従って、細胞の計数および細胞サイズの測定は、細胞がＤ３５〜Ｄ３８に増殖のプラトーに達し、細胞サイズはＤ３５およびＤ３６で最小であったことを示す（図６および７）。

これらを考慮し、Ｄ３６で最高である細胞密度を考えれば、三次培養の最適期間はＤ３６であった。

Claims (21)

1. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
   （ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）およびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来細胞を得ること；
   （ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
   （ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
   を含んでなり、
   前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）でｘ日の期間培養され、ここで、ｘ日は前記ＭＳＣ由来細胞の少なくとも２０％が増殖している最終日である、方法。
2. 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ｂ）において約８日〜約１２日間、好ましくは、約１０日間培養される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ａ）において約１３日〜約１５日間、好ましくは、約１４日間培養される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ｃ）において約１０日〜約１４日間、好ましくは、約１２日間培養される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記増殖しているＭＳＣ由来細胞が細胞周期のＳ期、Ｇ２期またはＭ期にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ＭＳＣからＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
   （ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
   （ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；ならびに
   （ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること
   を含んでなり、
   前記ＭＳＣ由来細胞は工程（ｂ）でさらに培養するために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは、３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種される、方法。
7. 前記ＭＳＣ由来細胞が工程（ｃ）でさらに培養するために３×１０^２〜１×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは、３×１０^２〜８×１０^２細胞／ｃｍ^２の密度で播種される、請求項６に記載の方法。
8. ＭＳＣからＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得るための方法であって、
   （ａ）対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度で含んでなる培養培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得ること；
   （ｂ）前記ＭＳＣ由来細胞を第１の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養すること；
   （ｃ）前記ＭＳＣ由来細胞を第２の時間、継代培養し、さらに前記ＭＳＣ由来細胞を（ａ）に定義される培地で培養し、それにより、ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を得ること；
   （ｄ）前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を対象に投与するのに好適な凍結保存培地に再懸濁させること；ならびに
   （ｅ）前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞を凍結保存すること
   を含んでなる、方法。
9. 前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞が工程（ｄ）において凍結保存培地に約１×１０^７／ｍｌ〜約１×１０^８／ｍｌの濃度、好ましくは、約２×１０^７／ｍｌ〜約４×１０^７／ｍｌの濃度で再懸濁される、請求項８に記載の方法。
10. 前記凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アデノシン、ポリペプチド、ベンゾピラン、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
11. ＴＧＦβがＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびそれらの混合物からなる群から選択される；好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度が約０．１ＩＵ／ｍｌであり；かつ／または
    ヘパリンまたはヘパリン誘導体もしくはその類似体が非分画ヘパリン（ＵＦＨ）；エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、アルデパリン、パルナパリン、ベミパリン、またはそれらの混合物などの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）；ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、アカラン硫酸、ケラタン硫酸、またはそれらの混合物、例えばダナパロイドなどのヘパリノイド；ヘパリン塩；ヘパリノイド塩；ヘパリン断片；ヘパリノイド断片；およびそれらの混合物からなる群から選択される、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記培地が血漿、血清またはその代替物のうち１以上をさらに含んでなる場合など、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞がさらなる接触を受ける、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記対象がヒト対象である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団。
16. 懸濁液中のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の少なくとも９０％が２５μｍ以下の直径を有し（Ｄ_９０≦２５μｍ）、かつ、懸濁液中のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞で３５μｍを超える直径を有するものは多くても１％である、ＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ拡大培養により得ることができるまたは得られたＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団。
17. ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞が請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得ることができるまたは得られる、請求項１６に記載のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団。
18. 請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団を含んでなる、医薬処方物。
19. リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子の組合せ、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸もしくはその誘導体、キトサン、ポリＬ−リシン、ゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノゲン、オステオカルシン、またはそれらの組合せなどの骨誘導特性を有する成分をさらに含んでなる、請求項１８に記載の医薬処方物。
20. 薬剤として使用するための、好ましくは、軟骨骨芽細胞系譜細胞の移植を必要とする対象の治療において使用するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団、または請求項１８もしくは１９に記載の医薬処方物。
21. 前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞が約１×１０^７細胞／ｍｌ〜約１×１０^８細胞／ｍｌ、好ましくは、約２×１０^７細胞／ｍｌ〜約４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で存在し；および／または
    前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団もしくは医薬処方物が経皮投与、骨内投与、関節内投与、椎間投与もしくは血管内投与に好適であり；
    前記ＭＳＣ由来の軟骨骨芽細胞系譜細胞の集団または医薬処方物が骨欠損部位における投与に好適である、
    請求項２０に記載の使用のための集団または医薬処方物。

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