KR20210074303A - 중간엽 줄기 세포의 분화 방법 - Google Patents

중간엽 줄기 세포의 분화 방법 Download PDF

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앤-소피 레브룬
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로레 헤르트조그
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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 약학적 제형, 및 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

중간엽 줄기 세포의 분화 방법
본 발명은 재생 치료 분야, 특히 최소 침습 기술을 통해 투여 가능한 골 세포 치료 제품 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 및 세포 집단, 및 이러한 세포 및 세포 집단을 포함하는 제품, 방법 및 용도에 관한 것이다.
골형성 분화를 겪을 수 있는 줄기 세포, 골형성 분화를 향해 투입되는 세포 또는 골 형성 능력을 갖는 세포의 이식은 골 관련 질환, 특히 새로운 뼈 조직의 생산이 필요한 질환의 치료를 위한 유망한 방안이다.
중간엽 줄기 세포 (MSC)는 뼈 장애를 치료하기 위해 전부터 사용되고 있었다 (Gangji et al., 2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42). 그러나, 이렇게 상대적으로 미분화된 줄기 세포가 이식될 수 있지만, 이들은 골모세포 계통에 투입되지 않기 때문에, 이식된 줄기 세포의 상당 부분이 결국에 원하는 골 조직의 형성에 기여하지 않을 수 있다. 또한, 이러한 줄기 세포의 양은 종종 불만족스럽다.
세포의 유전적 변형없이 생체 외에서 뼈 형성 세포를 생성하기 위한 제조 방법이 당 업계에 기술되어 있다.
WO 2007/093431호는 단리된 MSC의 시험관 내 확장 방법에 관한 것으로, 골모세포 표현형을 나타내는 세포를 생성시킨다. 상기 방법에서는, 인간 MSC가 혈청 또는 혈장 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2)의 존재 하에서 배양되었다.
WO 2009/087213호는 인간 MSC를 인간 혈장 또는 혈청, FGF-2 및 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)와 접촉시키는 것을 포함하는, 시험관 내 또는 생체 외에서 인간 MSC로부터 골전구세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.
그러나 동종 뼈 형성 세포 산물의 개발과 관련하여 생산량, 즉 한 번의 골수 기증에서 발생되는 도즈수, 산물의 가용성 및 비용 효율성과 같은 주요 문제는 여전히 남아 있다. 또한 제조 공정의 생산성에 따라 제조 용량을 보장하기 위해 매년 많은 골수가 검증될 필요가 있다. 따라서, 한 번의 골수 기증으로부터 얻은 생산성을 증가시킬 필요성이 남아 있으며, 보다 일반적으로 특히 재생 요법에 유용한 MSC-유래 세포 및 세포 산물을 얻기 위한 추가 및/또는 개선된 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명의 특정 대표적인 실시양태를 예시하는 실험 섹션에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 3 차 배양 (및 따라서 중간 세포 계대 "P2" 부가)을 포함하고, 2 차 배양의 배양 기간, 3 차 배양의 배양 기간, 3 차 배양 종료시 동결 보존 단계의 추가 또는 플레이팅 밀도의 하나 이상의 설정을 제어하는 단계를 포함하는 제조 방법으로 세포가 제조되는 경우, 연골-골모세포 계통의 중간엽 줄기 세포 (MSC)-유래 세포의 생산량이 상당히 개선될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득, 예컨대 분화 및/또는 확장하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, 섬유아세포 성장 인자-2 (FGF-2), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 중간엽 줄기 세포 (MSC)-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계를 포함하고,
여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일 동안 배양되며, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 20%가 증식하는 마지막 날이다 (예를 들어, 세포 주기의 S 기, G2 기 또는 M 기에서).
추가 측면에서, 본 발명은 MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계를 포함하고,
여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠, 바람직하게는 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅된다.
추가 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계;
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(d) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 재현탁하는 단계; 및
(e) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하는 단계.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 MSC의 시험관 내 또는 생체 외 확장에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 제공하며, 이에 의해 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 90%는 직경이 25 μm 이하 (D90 ≤25 μm)이고 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 직경이 35 μm 초과이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 약학적 제형을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서, 바람직하게는 연골-골모세포 계통의 세포의 이식이 필요한 대상체의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 본원에 정의된 약학적 제형을 제공한다.
본 발명자들은 본 방법이 후술하는 바와 같이 하나 이상의 이점을 제공할 수 있음을 발견했다. 본 방법은 하나의 골수 샘플로부터 얻은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 배양 수율 및 생산성을 실질적으로 증가시킬 수 있다. 결과적으로 한번의 골수 기증으로 만족스러운 생산량을 충당하기에 충분하다. 더욱이, 본 방법은 임상 사용을 위한 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 가용성을 증가시킨다. 또한, 본 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 동결 보존은 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체에게 직접 투여될 수 있는 세포 산물로 이어진다. 본 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 동결 보존은 요청시 세포 산물의 직접 분배 및 전달을 가능하게 하고, 따라서 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체를 즉시 치료할 수 있다. 또한, 본 방법으로 얻은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하면 세포 산물의 모든 방출 테스트를 수행하고 세포 산물 투여 전에 결과를 얻을 수 있다. 또, 본원에 정의된 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 유리하게는 골유도성 및 골형성 잠재력을 모두 갖는다.
본 발명의 상기 및 추가의 측면 및 바람직한 실시양태가 다음 섹션 및 이어지는 청구범위에서 설명된다. 이에 의해, 청구범위의 대상체가 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
도 1은 A: MSC; B: 세포 산물 A; C: 세포 산물 B; D: 세포 산물 C - 신선에서 유세포 분석에 의해 분석된 CD73 (도 1A) 및 CD44 (도 1B) 발현 수준을 보여주는 그래프를 나타낸다 (MSC, 세포 산물 A, B 및 C에 대해 각각 N = 12, 6, 22, 15 (CD73) 및 N = 22, 8, 22, 18 (CD44)).
도 2는 종래 기술에 따른 비교 세포 산물 및 본 발명을 나타내는 세포 산물의 세포 크기를 보여주는 그래프를 나타낸다: A: MSC; B: 세포 산물 A; C: 세포 산물 B; D: 세포 산물 C - 신선; E: 세포 산물 C - cryo CS10; F: 세포 산물 C - HSA 1:1로 희석된 cryo CS10; G: 세포 산물 C - cryo CS10 5% HSA; H: 세포 산물 C - cryo HTS 10% HSA 10% DMSO.
도 3은 배양 기간에 따른 세포 밀도를 나타낸 그래프이다. 세포의 수는 다음과 같이 계수되었다: 도 3A: 수동적 (Buerker 챔버를 사용한 트리판 블루 방법) 또는 도 3B: 세포 측정법 (BD TrucountTM).
도 4는 상이한 배양 기간 동안 2 차 배양에서 세포의 이벤트/기 (G0/G1, S 및 G2/M)로의 세포 주기 분석을 보여주는 그래프를 나타낸다. D24에서는 세포의 42%가 여전히 증식하고 있는데 (11% S 및 31% G2/M) 반해, D25에서는 세포가 대부분 세포 주기에서 벗어났다.
도 5는 상이한 배양 기간 (시점 D34 내지 D38의 경우 N = 8, D42의 경우 N = 6)에서 세포 분화 마커 (BMP2, RUNX2, ZNFS21, SPARC, MMP13, CHI3L1)의 발현 수준을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 6은 상이한 배양 기간 (N = 8)에서 세포 집단의 세포 밀도를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 7은 상이한 배양 기간 (N = 2)에서 두 세포 집단의 평균 세포 직경 크기를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 8은 X-선 분석에 의해 평가된 골유도 및 골형성을 나타낸다. A: 골유도 (A, 왼쪽 패널)는 골 불투명도 및 따라서 골 두께와 직접 연관된 회색 강도값을 측정하여 평가된다. 골형성 (A, 오른쪽 패널)은 X-선 영상에 의해 더 굴절되는 것으로 보이는 결절의 표면을 측정하여 평가된다. B: 뼈 형성 세포 C ("B-F 세포 C")는 부형제 (n = 20 (부형제) 및 n = 34 (5 개의 상이한 배치에서 B-F 세포 C))에 비해 동결 보존된 뼈 형성 세포 C ("B-F 세포 C")에서 골 불투명도가 상당히 높다. C: 표면 광물화된 결절이 관찰되지 않은 부형제 (n = 20 (부형제) 및 n = 34 (5 개의 상이한 배치의 B-F 세포 C))에 비해 골형성 표면이 현저히 높았다. D-E: 골형성 (절대 골형성으로 표시됨)을 포함하거나 (도 8D), 포함하지 않는 (도 8E) 골유도는 부형제에 비해 동결 보존된 뼈 형성 세포 C ("B-F 세포 C")에서 현저히 높았다. Mann Whitney U-검정: ***p<0.001. F: 골유도 활성 외에, 동결 보존된 뼈 형성 세포 C ("B-F 세포 C")는 4/5 골수 기증자 (또는 배치 생산) 및 마우스의 65% (n = 20 (부형제) 및 n = 34 (5 개의 상이한 배치의 B-F 세포 C))에서 적어도 하나의 광물화 결절의 존재로 제시되는 높은 골형성 활성을 촉진한다.
도 9는 동결 보존된 뼈 형성 세포 C 또는 부형제의 단일 투여 4 주 후의 관상 조직학적 섹션을 보여준다. 동결 보존된 뼈 형성 세포 C는 다음 두 가지 메커니즘을 통해 활성을 나타낸다: (i) "골유도": 막내 골화로 이어지는 파라크린 분비를 통한 숙주 골 형성의 자극 및 (ii) "골형성": 연골 내 골화에 의한 "직접" 골형성 (기증자/인간 기원으로부터)의 촉진.
도 10은 동결 보존된 뼈 형성 세포 C의 단일 주사 4 주 후에 마우스 두개골의 조직학 분석을 보여준다. 동결 보존된 뼈 형성 세포 C는 골유도 및 골형성 특성 ("fluo")을 나타내었다. 인간 뼈 형성 ("인간 I 형 콜라겐")은 광물화된 결절 (골형성)에서 강조되었다. 골모세포 (3 번째 패널에서 검은색 화살표로 표시된 "ALP") 및 파골세포 (4 번째 패널에서 검은색 화살표로 표시된 "TRAP") 활성은 주로 광물화된 결절에서 발견되어 투여 후 4 주째에 결절에서 뼈 재형성 과정이 여전히 진행 중임을 나타낸다. 골형성 과정이 완료되었음을 나타내는 뼈모양은 강조되지 않았다 ("Goldner의 Masson trichrome 염색").
도 11은 분절 대퇴골 아임계 크기 결손 모델에서 동결 보존된 뼈 형성 세포 C ("B-F 세포 C")의 효과를 보여준다. X-선 이미지는 부형제 단독 투여 또는 동결 보존된 뼈 형성 세포 C 투여 후 0 일부터 10 주까지 분절 대퇴 결손을 나타낸다.
도 12는 분절 대퇴골 아임계 크기 결손 모델 (sub-CSD 모델)에서 동결 보존된 뼈 형성 세포 C의 효과를 보여준다. 그래프는 외과적 시술/제품 투여 당일 ("W0") 및 부형제 단독 또는 동결 보존된 뼈 형성 세포 C 투여 후 10 주 ("W10") 까지에 걸쳐 X-선 이미지에서 뼈 복구 비율을 나타낸다. 동결 보존된 세포 C 형성 ("B-F 세포 C"); 평균±SEM, ***p<0.001 (이원 반복 측정 ANOVA).
도 13은 분절 대퇴골 아임계 크기 결손 모델 (sub-CSD 모델)에서 동결 보존된 뼈 형성 세포 C의 효과를 보여준다. 그래프는 수술 시술/제품 투여 당일 ("W0") 및 부형제 단독 또는 동결 보존된 뼈 형성 세포 C (B-F 세포 C) 투여 후 10 주 ("W10") 까지에 걸쳐 X-선 이미지로부터 결정된 RUS 점수를 나타낸다; 평균±SEM, **p<0.01, ***p<0.001 (이원 반복 측정 ANOVA).
바람직한 실시양태의 상세한 설명
본원에서 사용되는 단수형은 문맥에서 명확하게 다르게 표시되지 않는 한 단수형 및 복수형을 모두 포함한다.
본원에서 사용되는 "포함하는", "포함하다" 및 "~로 이루어지는" 이라는 용어는 "포함한", "포함한다" 또는 "함유하는", "함유하다"와 동의어로 사용되고, 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 일원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 이 용어는 또한 특허 용어에서 잘 알려진 의미를 가지는 "~로 구성되는" 및 "기본적으로 ~로 구성되는"도 포괄한다.
종점에 의한 수치 범위 나열은 언급된 종점뿐 아니라 각 범위안에 포함되는 모든 숫자 및 분수를 포함한다.
파라미터, 양, 시간적인 기간 등과 같은 측정값을 언급하는데 있어서 본원에서 사용되는 "약" 이라는 용어는, 지정값 및 그로부터의 변동값, 특히 지정값 및 그로부터의 ±10% 이하, 바람직하게는 ±5% 이하, 더욱 바람직하게는 ±1% 이하, 더욱더 바람직하게는 ±0.1% 이하의 변동값을 개시된 발명에서 수행하기에 적합하다면 포함하고자 한다. 수식어 "약" 으로 언급되는 값 자체가 또한 구체적이면서 바람직하게 고지되는 것으로 이해하여야 할 것이다.
용어 "하나 이상" 또는 "적어도 하나", 예컨대 일군 멤버의 하나 이상의 멤버 또는 적어도 하나의 멤버는 자체로 추가의 예시 수단으로 명확하긴 하지만, 이 용어는 특히 상기 멤버의 어느 하나, 또는 상기 멤버의 임의의 2 이상, 예컨대, 임의의 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상 또는 7 이상 등, 및 최대 모든 상기 멤버를 포함한다. 다른 예에서, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상을 나타낼 수 있다.
본 발명의 배경에 대한 논의는 본 발명의 내용을 설명하기 위해 포함된다. 이것을 언급된 자료 중 어떤 것이 어떤 주장의 우선 순위 날짜로 공개되었거나, 알려졌거나, 또는 어떤 국가에서 일반적인 지식의 일부로서 인정하는 것으로 받아들여서는 안된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서는 식별 인용에 의해 참조된다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특히, 본 명세서에서 구체적으로 언급된 이러한 문서의 교시 또는 섹션은 참조로 포함된다.
다르게 정의되지 않는다면, 기술적 및 과학적 용어를 포함하여 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명에 속하는 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가의 안내 수단으로, 본 발명의 교시를 더 잘 이해하기 위해 용어 정의가 포함될 수 있다. 특정 용어가 본 발명의 특정 측면 또는 본 발명의 특정 실시양태와 관련하여 정의되는 경우, 이러한 의미는 다른 설명이 없는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐, 즉 본 발명의 다른 측면 또는 실시양태와 관련하여 적용되는 의미이다.
다음에서, 본 발명의 상이한 측면 또는 실시양태가 보다 상세하게 정의된다. 이와 같이 정의된 각각의 측면 또는 실시양태는 명확하게 반대되는 경우를 제외하고 임의의 다른 측면(들) 또는 실시양태(들)과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "하나의 실시양태", "일 실시양태"는 실시양태와 관련하여 설명된 특정의 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 "일 실시양태에서" 또는 "하나의 실시양태에서"라는 표현의 출현은 모두 반드시 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니지만, 동일한 실시양태를 지칭할 수도 있다. 또한, 특정의 특징들, 구조들 또는 특성들은 하나 이상의 실시양태들에서 본 개시 내용으로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다. 또한, 본 명세서에 설명된 일부 실시양태는 다른 실시양태에 포함된 일부 특징을 포함하나 다른 특징을 포함하지 않더라도, 다른 실시양태의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있고, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 다른 실시양태를 형성하도록 의도된다. 예를 들어, 이어지는 청구 범위에서, 청구된 실시양태들 중 어느 것이든 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고, MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계.
본원에 사용된 용어 "중간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"는 중간엽 계통, 전형적으로 2 이상의 중간엽 계통, 보다 전형적으로는 3 이상의 중간엽 계통, 예를 들어, 연골-골모세포 (연골 및 뼈), 골모세포 (뼈), 연골모세포 (연골), 근세포 (근육), 건세포 (힘줄), 섬유모세포 (결합 조직), 지방 세포 (지방) 및 간질 (골수 기질) 계통의 세포를 생성할 수 있는 성체, 중간엽 유래 줄기 세포를 지칭한다. MSC는 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간 대상체의 생물학적 샘플, 예를 들어 골수, 골량, 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황낭, 피부 (진피), 특히 태아 및 청소년기 피부, 골막, 치수, 힘줄 및 지방 조직으로부터 단리될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 생물학적 공급원, 예를 들어, 동물 또는 인간 대상체과 같은 유기체, 세포 배양물, 조직 샘플 등으로부터 수득되는 샘플을 지칭한다. 동물 또는 인간 대상체의 생물학적 샘플은 동물 또는 인간 대상체로부터 제거되고 이의 세포를 포함하는 샘플을 지칭한다. 동물 또는 인간 대상체의 생물학적 샘플은 1 종 이상의 조직 유형 및 1 종 이상의 조직 유형의 세포를 포함할 수 있다. 동물 또는 인간 대상체의 생물학적 샘플의 수득 방법은 예를 들어, 조직 생검 또는 채혈과 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 인간 MSC, 이의 단리, 시험관 내 확장 및 분화는 예를 들어 미국 특허 제5,486,359호; 미국 특허 제5,811,094호; 미국 특허 제5,736,396호; 미국 특허 제5,837,539호; 또는 미국 특허 제5,827,740호에 기술되어 있다. 당 업계에 알려지고 당 업계에 기술된 임의의 방법에 의해 분리된 임의의 MSC가 본 방법에 적합할 수 있다. 특히, MSC는 골모세포, 지방 세포 및 연골 세포로의 시험관 내 삼중 계통 중간엽 분화 능력을 나타내는 것으로 정의될 수 있다 (Dominici et al., 2006, vol. 8, 315).
용어 "MSC"는 또한 MSC의 자손, 예를 들어, 동물 또는 인간 대상체의 생물학적 샘플로부터 수득된 MSC의 시험관 내 또는 생체 외 증식 (전파/확장)에 의해 수득된 자손을 포함한다.
용어 "줄기 세포"는 일반적으로, 자가-부활이 가능한, 즉 분화 없이 증식가능한 미특수화되거나 상대적으로 덜 특수화된 증식-잠재능 세포를 말하고, 이것 또는 이의 자손은 적어도 하나의 상대적으로 더 특수화된 세포 유형을 낳을 수 있다. 상기 용어는 상당히 비제한된 자가-부활이 가능한, 즉, 줄기 세포의 자손 또는 적어도 그의 일부가, 모 줄기 세포의 미특수화되거나 상대적으로 덜 특수화된 표현형, 분화 잠재성, 및 증식 능력을 상당히 보유하는 줄기 세포 뿐 아니라, 제한된 자가-부활을 나타내는, 즉, 추가의 증식 및/또는 분화에 대한 자손 또는 이의 일부의 능력이 모 세포와 비교하여 현저하게 감소된 줄기 세포를 포함한다. 예를 들어, 제한없이 줄기 세포는 하나 이상의 계통에 따라 분화할 수 있는 후손을 낳아서, 점차 상대적으로 더 특수화된 세포를 생성할 수 있으며, 상기 후손 및/또는 점차 상대적으로 더 특수화된 세포는 그들 자체가 본원에서 정의되는 바와 같은 줄기 세포일 수 있거나, 또는 심지어 유사분열 후일 수 있는 최종 분화된 세포, 즉, 완전히 특수화된 세포를 생성할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "성체 줄기 세포"는 태아 기 또는 바람직하게는 출생 후 (예를 들어, 특히 인간 유기체에 대해 제한없이, 적어도 생후 1 개월, 예를 들어, 생후 적어도 2 개월, 적어도 3 개월, 예를 들어, 적어도 4 개월, 적어도 5 개월, 예를 들어, 생후 적어도 6 개월, 예컨대, 생후 1 년 이상, 5 년 이상, 적어도 10 년 이상, 15 년 이상, 20 년 이상, 또는 25 년 이상), 예를 들어 성년기에 이른 후 유기체에 존재하거나 이로부터 분리된 (예컨대 단리된) 줄기 세포를 의미한다. 예를 들어, 성체 줄기 세포는 "유아", "어린이", "소년", "청소년" 또는 "성인"과 같은 통상적인 용어로 설명될 수 있는 인간 대상체에서 얻을 수 있다.
바람직한 MSC는 적어도 연골-골모세포 계통, 예컨대 골모세포 계통의 세포, 예를 들면, 연골-골전구세포 및/또는 골전구세포 및/또는 전조골세포 및/또는 골모세포 및/또는 골세포, 및/또는 연골모세포 계통의 세포, 예컨대, 연골-골전구세포 및/또는 연골전구세포 및/또는 전연골모세포 및/또는 연골모세포 및/또는 연골세포를 생성할 가능성을 갖는다.
더욱 바람직한 MSC는 적어도 골모세포 (뼈) 계통의 세포, 예컨대, 연골-골전구세포 및/또는 골전구세포 및/또는 전조골세포 및/또는 골모세포 및/또는 골세포, 등; 또는 적어도 연골모세포 (연골) 계통의 세포, 예컨대, 연골-골전구세포 및/또는 연골전구세포 및/또는 전연골모세포 및/또는 연골모세포 및/또는 연골세포; 섬유모세포 (결합 조직) 계통의 세포, 예컨대, 섬유모세포, 섬유세포; 또는 적어도 윤활막세포 (윤활액); 또는 건세포 등을 생성할 가능성을 갖는다.
언급된 경우를 제외하고, "대상체" 또는 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며, 동물, 바람직하게는 척추 동물, 보다 바람직하게는 포유동물을 지칭하고, 구체적으로 인간 환자 및 비인간 포유동물을 포함한다. 바람직한 환자는 인간 대상체가다. 동물 대상체는 태아와 같은 태아기 형태의 동물을 포함한다. 인간 대상체는 배아가 아닌 태아를 포함할 수 있다.
본원에서 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 산물"은 본원에 교시된 바와 같은 MSC-유래 세포, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포, 본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 본원에 교시된 바와 같은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 예를 들어 투여에 적합한 세포 산물 (예: 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포)을 포함하는 약학적 제형을 지칭한다.
일 실시양태에서, MSC는 건강한 대상체로부터 수득될 수 있으며, 이는 상기 MSC로부터 수득된 MSC-유래 세포의 기능성을 보장하는 데 도움이 될 수 있다.
다른 실시양태에서, MSC는 MSC-유래 세포의 이식이 필요한 인간 대상체로부터 얻어진다.
본원에 교시된 바와 같은 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포는 치료될 대상체에 동종이계일 수 있다. 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포와 관련하여 용어 "동종이계" 또는 "상동성"은 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포가 MSC-유래 세포와 접촉되거나 이로 처리된 대상체 이외의 하나 이상 (풀화)의 대상체로부터 수득됨을 의미한다
본원에 교시된 바와 같은 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포는 치료될 대상체에 대해 자가적일 수 있다. 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포와 관련하여 용어 "자가"는 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포가 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포와 접촉되거나 이로 처리되는 동일한 대상체로부터 수득됨을 의미한다.
본원에 교시된 바와 같은 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포는 연골-골모세포 계통의 자가 및 동종이계 (즉, 상동성) MSC 또는 MSC-유래 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 연골-골모세포 계통의 MSC 또는 MSC-유래 세포는 치료될 대상체에 동종이계이다.
본원에 사용된 용어 "중간엽 줄기 세포-유래 세포" 또는 "MSC-유래 세포"는 MSC의 분화, 특히 MSC의 시험관 내 (생체 외 포함) 분화에 의해 수득된 중간엽 계통 (예를 들어, 연골-골모세포 (뼈 및 연골), 골모세포 (뼈), 연골모세포 (연골), 근세포 (근육), 건세포 (힘줄), 섬유모세포 (결합 조직), 지방 세포 (지방) 또는 간질 (골수 기질) 계통)의 세포를 지칭한다.
MSC의 분화는 목적하는 세포 유형으로의 MSC의 분화를 유도할 수 있는 조건하에서 MSC의 배양, 보다 전형적으로는 목적하는 세포 유형 방향으로 MSC의 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 인자 (예를 들어, 성장 인자)를 포함하는 배지에서 MSC의 배양을 포함할 수 있다. MSC의 분화를 위한 프로토콜은 그 자체로 공지되어 있다 (특히, WO 2007/093431호 및 추가로 REGER, R.L. et al. 'Differentiation and Characterization of Human MSCs'. In: Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Edited by D.J. Prockop et al. Humana Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107; VERMURI, M.C. et al. (Eds.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, 특히 pages 201 to 352 참조).
본원에 사용된 용어 "성장 인자"는 다양한 세포 유형의 증식, 성장, 분화, 생존 및/또는 이동에 영향을 미치고, 단독으로 또는 기타 물질에 의해 조절되어 유기체의 발달적, 형태학적 및 기능적 변화에 영향을 줄 수 있는 생물학적 활성 성분을 지칭한다. 성장 인자는 전형적으로는 성장 인자에 반응하는 세포에 존재하는 수용체 (예를 들어, 표면 또는 세포내 수용체)에 리간드로서 결합함으로써 작용할 수 있다. 본원에서의 성장 인자는 특히 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 단백질성 실체일 수 있다. 제한이 아닌 예로서, 용어 "성장 인자"는 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리, 골 형태형성 단백질 (BMP) 패밀리, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 패밀리, 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 패밀리, 신경 성장 인자 (NGF) 패밀리, 표피 성장 인자 (EGF) 패밀리, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 패밀리, 성장 분화 인자 (GDF) 패밀리, 간세포 성장 인자 (HGF) 패밀리, 조혈 성장 인자 (HeGF), 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 안지오포이에틴, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리, 글루코코르티코이드 등의 멤버를 포함한다. 당업자는 성장 인자 또는 성장 인자의 조합이 원하는 세포 유형으로 MSC의 분화를 유도할 수 있는 것으로 알려진 임의의 성장 인자 또는 성장 인자의 조합일 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 원하는 세포 유형 (예를 들어, 연골-골모세포 계통의 세포)으로 MSC의 분화를 유도하기 위한 시험관 내 방법이 실질적으로 순수한 (즉, 주로 구성되는) 원하는 세포 유형의 세포 집단으로 이어질 수 있음을 이해할 것이다. 제한없이, 이렇게 유래된 세포 집단은 원하는 세포 유형을 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100% 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 연골-골모세포 계통 (연골 및 뼈)이다.
본원에서 사용된 "연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포"의 언급은 골모세포 계통의 세포, 예컨대 연골-골전구세포, 골전구세포 및/또는 전조골세포 및/또는 골모세포 및/또는 골세포 등, 또는 연골모세포 계통의 세포, 예컨대 연골-골전구세포, 연골전구세포 및/또는 전연골모세포 및/또는 연골모세포 및/또는 연골세포로 분화할 수 있는 전구 세포를 지칭할 수 있다. 당업자는 전구 세포가 이들이 시험관 내 또는 생체 내에서 노출되는 조건, 예컨대 물리적 인자, 및/또는 화학적 또는 성장 인자와 같은 생물학적 성분에 따라 골모세포 계통의 세포 (예를 들어, 전조골세포 또는 골모세포), 또는 연골모세포 계통의 세포 (예를 들어, 전연골모세포 또는 연골모세포)로 분화될 것임을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, "골모세포 계통의 세포" 또는 "골모세포 계통의 MSC-유래 세포"의 언급은 골모세포 표현형을 가지며, 연골-골전구세포, 골전구세포, 전조골세포, 골모세포, 또는 골세포, 또는 이들의 혼합물과 같은 골 물질 또는 골 기질의 형성에 기여할 수 있는 세포로 발달할 수 있거나 이에 기여할 수 있는 세포 유형을 동일하게 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "골전구세포"는 특히 초기 및 후기 골전구세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, "골모세포 계통의 세포" 또는 "골모세포 계통의 MSC-유래 세포"는 연골-골전구세포, 골전구세포, 전조골세포, 또는 골모세포, 또는 이들의 혼합물, 더욱 바람직하게는 연골-골전구세포 또는 전조골세포 또는 골모세포, 또는 이들의 혼합물을 동일하게 지칭할 수 있으며, 예컨대 특정 실시양태에서 이 문구는 전조골세포, 또는 특정의 다른 실시양태에서 골모세포를 지칭할 수 있다. 이 모든 용어는 자체로 잘 알려져 있다.
제한이 아닌 추가적 안내의 수단으로 골전구세포, 전조골세포 및 골모세포뿐 아니라 골전구세포, 전조골세포 및/또는 골모세포를 포함하는 세포 집단은 하기 특징을 나타낼 수 있다:
a) 세포는 골모세포 분화를 조절하는 다기능성 전사 인자인 Runt-관련 전사 인자 2 (Runx2)의 발현 및 골모세포 분화동안 많은 세포외 기질 단백질 유전자의 발현을 포함한다;
b) 세포는 적어도 하나의 다음 발현을 포함하고: 알칼리 포스파타제 (ALP), 더욱 특히 뼈-간-신장 형태의 ALP; 더욱 바람직하게는 또한 오스테오칼신 (OCN, BGLAP), 프로콜라겐 타입 1 아미노-종결 프로펩타이드 (P1NP), 오스테오넥틴 (ON, SPARC), 오스테오폰틴 (OPST, SPP1, OPN) 및/또는 골 시알로단백질 (BSP)과 같은 하나 이상의 추가적인 골 마커, 및/또는 데코린 및/또는 오스테오프로테게린 (OPG)과 같은 하나 이상의 추가적인 골 기질 단백질의 발현을 포함한다;
c) 세포는 실질적으로 CD45를 발현하지 않는다 (예를 들면, 세포의 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만, 더욱 바람직하게는 약 2% 미만이 CD45를 발현할 수 있다);
d) 세포는 외부 환경을 광물화하거나, 칼슘-함유 세포외 기질을 합성할 수 있는 증거를 나타낸다 (예를 들어, 골형성 배지에 노출된 경우; Jaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64: 295-312 참조). 세포 내 칼슘 축적 및 기질 단백질 내로의 침착은 통상, 예를 들어 45Ca2+에서 배양하고, 세척하고 재-배양한 후, 세포 내부에 존재하거나 세포외 기질에 침착된 임의의 방사능을 측정하거나 (미국 특허 제5,972,703호), 또는 알리자린 레드-기반 광물화 분석 (예를 들어, Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, 329, vol. 77-84 참조)을 사용하여 측정될 수 있다;
e) 세포는 실질적으로 지방세포 계통 (예를 들어, 지방세포) 또는 연골세포 계통 (예를 들어, 연골모세포, 연골세포)의 세포의 어느 것으로도 분화되지 않는다. 이러한 세포 계통으로의 분화의 부재는 당업계에서 정립된 표준 분화 유도 조건 (예를 들어, Pittenger et al. Science, 1999, 284, vol. 143-7 참조), 및 검정 방법 (예를 들어, 유도되는 경우, 지방세포는 전형적으로 지질 축적을 보여주는 오일 레드 O로 염색되고; 연골세포는 전형적으로 알시안 블루 또는 사프라닌-오렌지로 염색됨)을 사용하여 시험될 수 있다. 지방발생 및/또는 연골형성 분화에 대한 경향의 실질적 결여는 전형적으로 시험되는 세포의 20% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 1% 미만이 각각의 시험에 적용되는 경우 지방발생 또는 연골형성 분화의 징조를 보일 것임을 의미할 수 있다.
특정 실시양태에서, "연골모세포 (연골) 계통의 세포" 또는 "연골모세포 (연골) 계통의 MSC-유래 세포"라는 언급은 연골모세포 표현형을 갖고, 연골 또는 연골 기질의 형성에 기여할 수 있는 세포로 발생 가능하거나 이에 기여할 수 있는 세포 유형을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "연골전구세포"는 특히 초기 및 후기 연골전구세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, ""연골모세포 (연골) 계통의 세포" 또는 "연골모세포 (연골) 계통의 MSC-유래 세포"는 연골-골전구세포, 연골전구세포, 전-연골모세포, 또는 연골모세포, 또는 이들의 혼합물을 지칭할 수 있고, 더욱 바람직하게는 문구는 전연골모세포 또는 연골모세포, 또는 이들의 혼합물를 지칭할 수 있거나, 예컨대 특정 예에서 이 문구는 전-연골모세포를 지칭할 수 있거나, 특정 다른 예에서 문구는 연골모세포를 지칭할 수 있다. 이 모든 용어는 자체로 잘 알려져 있다.
제한이 아닌 추가적 안내의 수단으로 연골-골모세포 및/또는 연골모세포 계통, 예컨대 연골-골전구세포, 연골전구세포, 전연골모세포 및 연골모세포뿐 아니라, 연골-골전구세포, 연골전구세포, 전연골모세포 및/또는 연골모세포를 포함하는 세포 집단은 하기 특징을 나타낼 수 있다:
a) 세포는 연골모세포 분화 및 연골 형성에 중추적인 역할을 하는 전사 인자인 SOX9의 발현을 포함한다;
b) 세포는 다음 중 적어도 하나의 발현을 포함한다: 아그레칸 (AGG), II 형 콜라겐 또는 CD90;
c) 세포는 실질적으로 CD45를 발현하지 않는다 (예를 들어, 세포의 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 바람직하게는 약 2% 미만이 CD45를 발현할 수 있음);
d) 세포는 원위치의 히알린 세포외 기질 (ECM)의 주성분인 II 형, IX 형 및 XI 형 콜라겐 및 프로테오글리칸을 높은 수준으로 생산할 수 있는 능력이 있음을 보여준다. 연골 형성은 통상적으로 프로테오글리칸 및 비-콜라겐성 단백질을 각각 염색하기 위해 사프라닌-오렌지/고속 그린 분석을 사용하여 측정될 수 있다 (Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98 참조);
e) 인간 관절 연골세포는 문헌 [Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell Physiol, vol. 202(3), 731-42)]에 요약된 세포 발현 특성을 나타낼 수 있으며, 예를 들면, 이들은 인테그린 및 다른 부착 분자 (CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD51/61, CD54, CD106, CD166, CD58, CD44), 테트라스패닌 (CD9, CD63, CD81, CD82, CD151), 수용체 (CD105, CD119, CD130, CD140a, CD221, CD95, CD120a, CD71, CD14), 체외효소 (CD10, CD26), 및 기타 표면 분자 (CD90, CD99)를 발현할 수 있다. 단층 배양중에, 연골세포는 중간엽 줄기 세포에 특징적인 것으로 간주되는 특정 마커 (CD10, CD90, CD105, CD166)를 상향 조절할 수 있다. 따라서 이러한 마커는 또한 덜 성숙한 조연골모세포 또는 연골모세포에 의해 발현될 수도 있다.
f) 세포는 실질적으로 지방세포 계통의 세포 (예를 들어, 지방세포) 또는 골모세포 계통 (예를 들어, 골모세포, 골세포)으로 분화되지 않는다. 그러한 세포 계통에 대한 분화의 부재는 당 업계에 확립된 표준 분화 유도 조건 (예를 들어, Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7 참조) 및 검정 방법 (예를 들어, 유도된 경우 지방세포는 전형적으로 지질 축적을 나타내는 오일 레드 O로 염색되며, 전조골세포 및 골모세포는 전형적으로 ALP로 염색된다)을 사용하여 시험할 수 있다. 지방발생 및/또는 골모세포 분화에 대한 경향이 실질적으로 결여된 것은 전형적으로 시험된 세포의 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만이 각각의 시험에 적용시 지방발생 또는 골모세포 분화의 징후를 나타낼 것이라는 것을 의미할 수 있다.
특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 골형성 특성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "골형성 특성", "골형성 잠재성" 또는 "골형성 활성"은 생체 내 및 임의로 시험관 내에서 세포가 골-기질-분비 세포로 (전환) 분화하는 능력 또는 골 기질을 분비하는 세포의 능력 (즉, (전환) 분화 단계가 필요없음)을 지칭한다. 이 용어는 막내 골화 또는 연골내 골화에 의해 세포가 골 조직을 형성하는 능력을 포함한다. 막내 골화에 의해 세포가 골 조직을 형성하는 능력은 전형적으로 주형으로서 석회화된 연골 기질의 필요없이 세포가 골 조직을 형성하는 능력을 나타낸다. 연골내 골화에 의해 세포가 골 조직을 형성하는 능력은 전형적으로 석회화된 연골 기질을 먼저 형성하고 이어서 상기 석회화된 연골 기질을 골 조직 형성을 위한 주형으로서 사용함으로써 세포가 골 조직을 형성하는 능력을 나타낸다. 이 용어는 세포의 골유도 잠재성을 포함하지 않는다.
예를 들어, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 세포 효능은 이러한 세포의 골형성 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 연골-골모세포 계통의 인간 MSC-유래 세포의 골형성 활성은 예를 들어 세포를 두개골을 통한 피하 주사에 의해 마우스에 투여한 후 적어도 하나의 광물화 결절 (예: 인간 또는 혼합 인간-뮤린 유래)의 존재를 결정함으로써 생체 내에서 측정할 수 있다. 연골-골모세포 계통의 인간 MSC-유래 세포의 골형성 활성은 예를 들어 세포를 두개관을 통해 피하 주사로 마우스에 투여한 후 새로 광물화된 결절 (예: 인간 또는 혼합 인간-뮤린 유래)의 두께를 평가하거나, 대퇴 분절 아임계 크기 결손 (sub-CSD)의 마우스 모델에서 뼈 복구 정도를 평가함으로써 생체 내에서 측정할 수 있다.
예를 들어, 100 ㎕ 부형제에서 제형화된 연골-골모세포 계통의 인간 MSC-유래 세포가 예컨대 2.5 x 106 세포로 두개관 뼈에 단일 피하 투여에 의해 누드 마우스에 투여될 수 있다. 경시적으로 골 신형성을 표지하기 위해, 알리자린 레드 (적색), 칼세인 (녹색), 칼세인 (청색) 및 테트라사이클린 (황색)과 같은 칼슘 결합 플루오로크롬을 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 세포 투여 3 일 전과 4, 8 및 12 일 후에 마우스에 복강 내 주사로 순차적으로 각각 투여할 수 있다. 세포 투여 2 주 후 마우스를 안락사시킬 수 있고, 각 마우스의 두개관를 수거하여 조직 형성 측정법 (histomorphometry) (예를 들어, 골 형성의 정량화)에 의해 골 형성 특성을 평가할 수 있다. 두개관의 초기 및 최종 두께는 세포 투여 후 신 골 형성의 백분율을 계산하는데 사용될 수 있다. 또한, 골 형성 특성은 면역형광법 (예를 들어, 뮤린 또는 인간 기원의 골 형성)에 의해 평가될 수도 있다. 골모세포 활성은 ALP 효소 활성 검출 방법을 사용하여 두개관 절편에서 평가될 수 있다. TRAP 효소 활성 검출 방법을 사용하여 두개관 절편에서 파골세포 활성을 평가할 수 있다. 신생 골의 광물화 상태는 예를 들어 시판 키트 (예를 들어, Bio-Optica®)를 사용하여 ALP로 염색된 두개관 절편에서 Masson Trichrome Goldner 염색을 사용하여 평가할 수 있다. 연골 형성은 두개관 시상 파라핀 절편에서 사프라닌-오렌지 염색을 사용하여 평가할 수 있다.
추가의 예에서, 50 ㎕ 부형제에 제형화된 1.25 x 106 세포와 같은 연골-골모세포 계통의 인간 MSC-유래 세포를 대퇴 분절 아임계 크기 결손시키고 1 일 후 경피 주사에 의해 뼈 결손 부위에 국소적으로 마우스에게 투여할 수 있다. 뼈 복구는 X-선 영상으로 정량화할 수 있다. 뼈 결손 크기는 뼈 결손의 두 가장자리 사이의 거리를 측정하여 정량화할 수 있다.
특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 골유도 특성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "골유도 특성", "골유도 잠재성" 또는 "골유도 활성"은 세포가 다른 골-기질-분비 세포를 유인하고/거나 다른 세포의 골-기질-분비 세포로의 (전환) 분화를 유도하는 능력을 지칭한다.
예를 들어, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 세포 효능은 이러한 세포의 골유도 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 뼈 형성을 유도하는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 능력은 예를 들어 세포를 두개관을 통해 피하 주사로 마우스에 투여한 후 새로 광물화된 뼈 두께를 평가하거나, 대퇴 분절 아임계 크기 결손 (sub-CSD)의 마우스 모델에서 뼈 복구 정도를 평가함으로써 생체 내에서 측정할 수 있다. 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 골 형성을 유도하기 위한 능력은 또한 예를 들어 알칼리성 포스파타제 (ALP) 기질 염색에 의한 ALP 활성 평가를 통해 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 골유도성 및 골형성 특성을 모두 가질 수 있다. 유리하게는, 본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 이식시, 선행 방법에 의해 수득된 MSC 또는 MSC-유래 세포에 의한 이식시의 골 신형성과 비교하여 이를 초과하는 신 골형성을 허용한다.
제한이 아닌 예로서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 세포 정체를 평가하기 위한 적합한 세포 표면 마커는 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 포함할 수 있다. 이들 세포 표면 마커는 예를 들어 유세포 측정법에 의한 세포 검출을 허용하는 플루오로크롬-표지된 모노클로날 항체와 같은 시판 모노클로날 항체에 의해 검출될 수 있다. 특히, CD73 및 CD105는 중간엽 마커이고; CD44는 부착 마커이며; CD10은 연골-골모세포 계통의 고 분율의 MSC-유래 세포에 의해 전형적으로 발현되는 연골 골모세포 마커이다. 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 세포 표면상에서 CD73의 양은 전형적으로 높으며; 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 세포 표면상에서 CD105의 양은 전형적으로 낮으며; 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 세포 표면상에서 CD44의 양은 전형적으로 높다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD44 및 CD10에 대해 양성이다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD34에 대해 음성이다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD44 및 CD10에 대해 양성이고; 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD34에 대해 음성이다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD45, CD34 및 CD3에 대해 음성이다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD44 및 CD10에 대해 양성이고; 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD45, CD34 및 CD3에 대해 음성이다.
특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 적어도 500의 CD73에 대한 nMFI (nMFICD73), 적어도 100의 CD44에 대한 nMFI (nMFICD44) 또는 최대 150의 CD105에 대한 nMFI (nMFICD105)의 정규화된 형광 강도의 중앙값 (nMFI) 중 어느 하나 이상을 갖는다. 예를 들어, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850 또는 적어도 900의 MFICD73; 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300 또는 적어도 350의 nMFICD44; 또는 최대 180, 최대 170, 최대 160, 최대 150, 최대 140, 최대 130, 최대 120, 최대 110 또는 최대 100의 nMFICD105 중 어느 하나 이상을 갖는다. 바람직하게는, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 적어도 500의 nMFICD73, 적어도 100의 nMFICD44, 및 최대 150의 nMFICD105을 갖는다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모두 (예를 들어 적어도 90% (수치상), 예컨대 ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥ 98%, ≥99% 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD10 및 CD44에 대해 양성이며 (즉, 세포 표면에서 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현함), MSC- 연골-골모세포 계통의 유래 세포는 적어도 500의 nMFICD73, 적어도 100의 nMFICD44 또는 최대 150의 nMFICD105 중 어느 하나 이상을 갖는다. 예를 들어, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대 ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99% 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD10 및 CD44에 대해 양성이고 (즉, 세포 표면에서 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현함), 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850 또는 적어도 900의 nMFICD73; 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300 또는 적어도 350의 nMFICD44; 및 최대 180, 최대 170, 최대 160, 최대 150, 최대 140, 최대 130, 최대 120, 최대 110 또는 최대 100의 nMFICD105 중 어느 하나 이상을 갖는다. 바람직하게는, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD10 및 CD44에 대해 양성이고 (즉, 세포 표면에서 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현함), 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 적어도 500의 nMFICD73, 적어도 100의 nMFICD44, 및 최대 150의 nMFICD105을 갖는다.
본원에 사용된 "정규화된 형광 강도의 중앙값" 또는 "nMFI"는 하나 이상의 플루오로크롬-접합 항체로 표지된 전체 분석된 세포 집단의 MFI (MFI마커-채널) 대 하나 이상의 플루오로크롬-접합된 동형 대조 항체 (MFI동형-채널), 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 알로피코시아닌 (APC) 또는 피코에리트린 (PE)과 같은 플루오로크롬과 접합된 면역글로불린 G (IgG) 대조군으로 표지된 세포 집단의 MFI의 비를 지칭한다. nMFI 결과는 관심 집단의 세포 표면에 존재하는 마커의 양에 비례한다. (n)MFI는 전형적으로 형광 신호의 방출이 측정되는 파장과 관련된다.
본원에 사용된 "CD73에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD73"은 CD73에 대한 APC-접합 항체 (예를 들어, BD Biosciences®, Cat No: 560847)로 표지된 전체 분석된 세포 집단의 MFI 대 APC (예를 들어, BD Biosciences® Cat No: 555751)와 접합된 IgG 대조군으로 표지된 세포 집단의 MFI의 비를 지칭한다. 바람직하게는, nMFICD73은 APC에 대한 여기 파장 633 nm 및 방출 파장 660 nm로 측정된다.
본원에 사용된 "CD44에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD44"는 CD44에 대한 PE-접합 항체 (예를 들어, BD Biosciences®, Cat No: 550989)로 표지된 전체 분석된 세포 집단의 MFI 대 PE (예를 들어, BD Biosciences® Cat No: 556650)와 접합된 IgG 대조군으로 표지된 세포 집단의 MFI의 비를 지칭한다. 바람직하게는, nMFICD44는 PE에 대한 여기 파장 488 nm 및 방출 파장 580 nm로 측정된다.
본원에 사용된 "CD105에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD105"는 CD105에 대한 APC-접합 항체 (예를 들어, BD Biosciences®, Cat No: 562408)로 표지된 전체 분석된 세포 집단의 MFI 대 APC (예를 들어, BD Biosciences® Cat No: 555751)와 접합된 IgG 대조군으로 표지된 세포 집단의 MFI의 비를 지칭한다. 바람직하게는, nMFICD105는 APC에 대한 여기 파장 633 nm 및 방출 파장 660 nm로 측정된다.
본원에 사용된 "CD10에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD10"은 CD10에 대한 PE-접합 항체 (예를 들어, BD Biosciences®, Cat No: 555375)로 표지된 전체 분석된 세포 집단의 MFI 대 PE (예를 들어, BD Biosciences® Cat No: 556650)와 접합된 IgG 대조군으로 표지된 세포 집단의 MFI의 비를 지칭한다. 바람직하게는, nMFICD10은 PE에 대한 여기 파장 488 nm 및 방출 파장 580 nm로 측정된다.
전술한 바와 같이, 상기 상세히 기술된 방법은 우수한 특성, 예컨대 특히 (i) ALP의 고발현 - 연골-골모세포 또는 골모세포 계통으로 향하게 세포 투입을 나타냄, (ii) 저 HLA-DR 발현 - 연골-골모세포 또는 골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 제한된 면역원성을 나타내어 세포가 예를 들어 동종이계 대상체에 세포 이식하기에 더 적합함을 가지는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 이러한 MSC-유래 세포의 집단을 산출할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 70% (수치상) (예를 들면 적어도 75% (수치상), 예컨대, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%)는 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 대해 양성이고; 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 10% 미만 (수치상) (예를 들면 5% 미만 (수치상), 예컨대, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만)는 HLA-DR에 대해 양성이다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD10 및 CD44에 대해 양성이고; 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD34에 대해 음성이다; 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 70% (예를 들면 적어도 75% (수치상), 예컨대, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%)는 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 대해 양성이고; 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 10% 미만 (예를 들면 5% 미만 (수치상), 예컨대, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만)은 HLA-DR에 대해 양성이다.
특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD73, CD105, CD10 및 CD44에 대해 양성이고; 실질적으로 모든 (예를 들어, 적어도 90% (수치상), 예컨대, ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 CD45, CD34 및 CD3에 대해 음성이다; 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 70% (예를 들면 적어도 75% (수치상), 예컨대, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100%)는 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 대해 양성이고; 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 10% 미만 (예를 들면 5% 미만 (수치상), 예컨대, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만)은 HLA-DR에 대해 양성이다.
세포가 특정 마커에 대해 양성 (또는 그를 발현하거나, 그의 발현을 포함한다)이라고 말해지는 경우, 이는 당업자가 적절한 측정을 수행하였을 때, 적합한 대조군과 비교하여 그 마커에 대해 예를 들어 항체-검출가능 또는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 검출과 같이 특징적인 신호의 존재 또는 증거가 있는 것으로 결론되어질 것임을 의미한다. 그 방법이 마커의 정량적 평가를 가능하게 하는 경우, 양성 세포는 평균적으로 대조군과 상당히 다른, 예를 들어 그러나 제한없이, 대조군 세포에 의해 발생되는 신호보다 적어도 1.5 배 높은, 예를 들어, 적어도 2 배, 적어도 4 배, 적어도 10 배, 적어도 20 배, 적어도 30 배, 적어도 40 배, 적어도 50 배 높거나, 또는 심지어 더 높은 신호를 발생할 수 있다.
상기 세포-특이적 마커의 발현은 당 업계에 알려진 임의의 적합한 면역학적 기술, 예컨대 면역조직화학법 또는 친화성 흡착법, 웨스턴 블롯 분석, 유세포 분석, ELISA 등을 사용하여, 또는 (예컨대 ALP에 대한) 효소 활성의 임의의 적합한 생화학적 검정법에 의해, 또는 마커 mRNA의 양을 측정하기 위한 임의의 적합한 기술, 예를 들어 노던 블롯, 반-정량적 또는 정량적 RT-PCR 등에 의해 검출될 수 있다. 본원 명세서에 열거된 마커에 대한 서열 데이터는 공지되어 있고, 공개 데이터베이스 예컨대, 유전자은행 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)으로부터 입수할 수 있다.
특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 동물 세포, 바람직하게는 온혈 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포일 수 있다.
본원에 사용된 "시험관 내 (in vitro)"라는 용어는 일반적으로 동물체 또는 인체의 외부 또는 밖을 나타내기 위한 것이다. 본원에 사용된 용어 "시험관 내"는 생체 외 (ex vivo)를 포함하도록 이해되어야 한다. 본원에 사용된 "생체 외"라는 용어는 전형적으로 동물체 또는 인체로부터 제거되고, 신체 외부, 예를 들어 배양 용기 내에서 유지되거나 증식되는 조직 또는 세포를 지칭한다.
본원에서 의도된 바와 같은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 바람직하게는 부착성이고, 즉 성장을 위한 표면을 필요로 하며, 전형적으로 배양 배지 (현탁 배양)에서 자유-부동 세포로서 보다는 상기 표면상의 부착성 단층 (즉, 부착성 세포 배양물)으로서 성장한다. 조직 배양 플라스틱 용기의 표면과 같은 표면에 대한 세포의 부착은 도립 현미경 하에서 육안 검사에 의해 용이하게 검사될 수 있다. 부착성 배양에서 성장한 세포는 주기적인 계대를 요구하며, 여기서 세포는 효소적으로 (예를 들어, 트립신을 사용하여) 표면으로부터 제거되고, 성장 배지에 현탁되고, 새로운 배양 용기(들)에 재플레이팅될 수 있다. 일반적으로, 세포의 부착을 허용하는 표면 또는 기질은 임의의 실질적인 친수성 기질일 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 조직 배양 용기, 예를 들어, 배양 플라스크, 웰 플레이트, 접시 등은 친수성 기질 표면을 제공하기 위해 일반적으로 다양한 중합체 물질로 제조되고, 적절하게 표면 처리되거나 몰딩 후 코팅될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "접촉"은 하나 이상의 분자, 성분 또는 물질을 또 다른 것과 직접 또는 간접적으로 합쳐 이들 사이의 상호 작용을 용이하게 하는 것을 의미한다. 전형적으로, MSC 또는 MSC-유래 세포의 확장 및/또는 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제가 MSC 또는 MSC-유래 세포가 배양되는 배지에 포함됨으로써 MSC 또는 MSC-유래 세포와 접촉될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 (a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (a)는 또한 본원에서 "1 차 배양"으로 지칭될 수 있다.
용어 "섬유모세포 성장 인자 2 (FGF-2)", "염기성 FGF", "FGF-b", "FGFB", "BFGF", "헤파린-결합 성장 인자 2 (HBGF-2)" 또는 "프로스타트로핀"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 섬유모세포 성장 인자 패밀리의 이미 공지된 멤버를 지칭한다. 본 발명자들은 FGF-2가 본 발명의 방법에서 특히 효과적임을 알아냈다.
본원에 사용된 용어 "형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ)", "TGFB" 또는 "TGF베타"는 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 패밀리의 멤버를 지칭한다. 본 발명자들은 TGFβ가 본 발명의 방법에서 특히 효과적임을 알아냈다. 추가의 실시양태에서, 상기 TGFβ 패밀리의 멤버는 TGF-베타-1, TGF-베타-2, TGF-베타-3, TGF-베타-4, GDF1 (성장 분화 인자 1), GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-11, GDF-15, INHA (인히빈 알파 사슬), INHBA (인히빈 베타 A 사슬), INHBB (인히빈 베타 B 사슬), INHBC (인히빈 베타 C 사슬), INHBE (인히빈 베타 E 사슬), MIS (뮐러-억제 인자 (Muellerian-inhibiting factor)) 및 GDNF (신경교 세포주 유래 신경 영양 인자)를 포함한 GDNF 하위 패밀리 멤버, NRTN (네우투린), PSPN (퍼세핀) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, TGFβ는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 TGFβ는 TGFβ1이다.
추가의 실시양태에서, MSC 또는 MSC-유래 세포는 FGF-2 및 TGFβ 이외에 FGF-2 및 TGFβ 이외의 하나 이상의 추가의 외인성 첨가 성장 인자와 접촉될 수 있다. 다른 실시양태에서, FGF-2 및 TGFβ는 MSC 또는 MSC-유래 세포와 접촉하는 단독 외인성 성장 인자일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법에 사용된 성장 인자는 인간 성장 인자이다. 본원에 사용된 용어 "인간 성장 인자"는 자연 발생적 인간 성장 인자와 실질적으로 동일한 성장 인자를 지칭한다. 예를 들어, 성장 인자가 단백질성 실체인 경우, 그 구성 펩타이드(들) 또는 폴리펩타이드(들)은 자연 발생 인간 성장 인자와 동일한 일차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 세포 기능에 대해 바람직한 효과를 유도할 것으로 예상되기 때문에, 본 발명의 방법에서는 인간 성장 인자의 사용이 바람직하다.
"자연적으로 발생하는"이라는 용어는 사람에 의해 인공적으로 생성되는 것이 아닌, 자연상에서 발견될 수 있는 물체 또는 실체를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 본질적으로 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않는 유기체에 존재하는 폴리펩타이드 서열이 자연적으로 발생한 것이다. 특정 실체, 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 단백질을 언급할 때, 이 용어는 예를 들어 개체 간의 정상적인 변이로 인해 자연에서 발생하는 모든 형태 및 변이체를 포함한다. 예를 들어, 단백질성 성장 인자를 언급할 때, 용어 "자연적으로 발생하는"은 개체 간 정상적인 대립 유전자 변이로 인해 구성 펩타이드(들) 또는 폴리펩타이드(들)의 일차 서열과 차이가 있는 성장 인자를 포함한다.
본 방법은 성장 인자의 생물학적 활성 변이체 또는 단편을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 성장 인자의 "생물학적 활성" 변이체 또는 단편은 다른 조건이 실질적으로 동일한 경우, 각각의 성장 인자로서 MSC로부터 본원에 교시된 바와 같이 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 얻는 것과 거의 동일한 정도를 적어도 달성한다.
폴리펩타이드의 "변이체"는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 (즉, 상당히 동일하지만 완전히 동일하지는 않은) 아미노산 서열을 갖는다. 본원에서, "실질적으로 동일한"은 적어도 85% 동일, 예를 들어 적어도 90% 동일, 바람직하게는 적어도 95% 동일, 예를 들어 적어도 99% 동일함을 의미한다. 서열 차이는 하나 이상의 아미노산의 삽입 (추가), 결실 및/또는 치환에 기인할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 방법에 사용된 성장 인자, 즉 적어도 FGF-2 및 TGFβ는 비인간 동물 성장 인자, 특히 비인간 포유동물 성장 인자, 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비인간 동물 성장 인자" 및 "비인간 포유동물 성장 인자"는 각각 자연 발생 비인간 동물 또는 비인간 포유동물 성장 인자와 실질적으로 동일한 성장 인자를 지칭한다. 예를 들어, 성장 인자가 단백질성 실체인 경우, 그 구성 펩타이드(들) 또는 폴리펩타이드(들)는 자연 발생 비인간 동물 또는 비인간 포유동물 성장 인자와 동일한 일차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 당업자는 비인간 동물 또는 비인간 포유동물 성장 인자가 본 방법에 적용 가능할 수 있지만, MSC 세포와 동일한 기원이기 때문에 인간 동물 성장 인자보다 덜 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비인간 동물 또는 비인간 포유동물 성장 인자는 이들이 원하는 효과, 예를 들어 (유사한) 인간 성장 인자와 비슷한 효과를 이끌어 낸다면 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 재조합체로서, 즉 숙주 유기체 또는 이의 선조체에 도입되고 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자의 발현을 통해 숙주 유기체에 의해 생성된다. 본원에 사용된 용어 "재조합 핵산 분자"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 함께 연결된 세그먼트로 구성된 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 cDNA 분자)를 지칭한다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, MSC 또는 MSC-유래 세포는 추가로 접촉되며, 예를 들어 배지는 혈장, 혈청 또는 그의 대체물 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
용어 "혈장"은 통상적으로 정의되는 바와 같고, 신선한 혈장, 해동된 냉동 혈장, 용매/세제-처리된 혈장, 가공된 혈장 (예를 들어, PRP) 또는 이들 중 임의의 2 이상의 혼합물을 포함한다. 혈장은 일반적으로 항응고제 (예를 들어, 헤파린 (매우 낮은 농도, 일반적으로 약 15x10-5 IU/ml, 시트레이트, 옥살레이트 또는 EDTA)와 함께 제공되거나 접촉된 전혈의 샘플로부터 얻어진다. 이어서, 혈액 샘플의 세포 성분이 적절한 기술, 전형적으로 원심분리에 의해 액체 성분 (혈장)으로부터 분리된다. 제한적이지 않은 특정 예로서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 혈장을 수득하기 위해 혈액을 혈액응고방지제 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)를 함유하는 배큐테이너 튜브 (예를 들어, BD Vacutainer 플라스틱 EDTA 튜브, 10 ml, 1.8 mg/mL)로 추출할 수 있다. 샘플을 천천히 진탕하고 나서 실온에서 1,000-2,000 g으로 10 분동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리한다. 상등액 (혈장)을 수거하고 임의로 풀화하고 (복수의 혈액 샘플을 사용하는 경우), 저온 바이알에 분주하여 사용하기 전까지 -80 ℃에서 저장한다. 그러므로 "혈장"이라는 용어는 인체 또는 동물체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 의미한다. "혈장"이라는 용어는 특정 실시양태에서 특히 가공된 혈장, 즉 전혈로부터 분리된 후 이의 조성, 구체적으로 이의 화학적, 생화학적 또는 세포 조성을 변경시키는 하나 이상의 처리 단계를 거친 혈장을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 의도된 용어 "혈장"은 혈소판 풍부 혈장 (PRP), 즉 혈소판이 풍부해진 혈장을 포함할 수 있다. 전형적으로, PRP는 약 1.0 x 106 혈소판/㎕를 함유할 수 있는 반면, 전혈 중 혈소판 농도는 약 1.5 x 105 내지 3.5 x 105/㎕일 수 있다.
혈장은 용매/세제 처리될 수 있다. "용매/세제-처리된 혈장", "S/D-처리된 혈장" 또는 "S/D 혈장"이라는 용어는 일반적으로 (a) 혈장을 용매 및 세제로 처리하고, (b) 용매/세제-처리된 혈장을 여과하는 단계를 포함하는 방법으로 수득 가능하거나 수득된 탈세포화 혈장을 지칭한다. 이러한 처리에 적합한 용매는 US 4,764,369에 기재된 디- 또는 트리알킬포스페이트 및 세제와 같은 용매이다. S/D 혈장을 제조하는데 사용되는 세제는 바람직하게는 무독성 세제 (예를 들어, Tween® 20 또는 트윈 Tween® 80)이다.
용어 "혈청"은 통상적으로 정의된 바와 같고 신선한 혈청, 해동된 냉동 혈청 또는 혈장에서 준비한 혈청, 또는 이들 중 임의의 2 이상의 혼합물을 포함한다. 혈청은 보통 먼저 샘플에서 응고 (clotting)를 일으킨 후, 이어서 적절한 기술, 전형적으로 원심분리에 의해 액체 성분 (혈청)으로부터 혈액 샘플의 형성된 응고물 (clot) 및 및 세포 구성성분을 분리함으로써, 전혈 샘플에서 얻을 수 있다. 응고는 불활성 촉매, 예를 들면, 유리구슬 또는 분말로 촉진될 수 있다. 다른 한편으로, 혈청은 혈장에서 혈액응고방지제 및 피브린을 제거하여 얻을 수도 있다. 제한적이지 않은 특정 예로서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 혈청을 수득하기 위해 혈액을 혈액응고방지제를 함유하지 않는 배큐테이너 튜브 (예를 들어, BD Vacutainer Plus 플라스틱 혈청 튜브, 10 ml)로 추출하고, 응고를 허용하도록 실온에서 30 내지 45 분동안 인큐베이션할 수 있다. 이어 튜브를 실온에서 1,000-2,000 g으로 15 분동안 원심분리하여 적혈구와 혈청을 분리한다. 상등액 (혈청)을 수거하고 임의로 풀화하고 (복수의 혈액 샘플을 사용하는 경우), 저온 바이알에 분주하여 사용하기 전까지 -80 ℃에서 저장한다. 그러므로 "혈청"이라는 용어는 인체 또는 동물체의 일부를 형성하지 않는 세포 성분이 없는 조성물을 의미한다. 본원에서 의도하는 혈청은 인간 혈청, 즉 단일의 인간 대상체 또는 복수의 인간 대상체 (예를 들어, 혈청 혼합 풀)으로부터 얻어지는 혈청이다. 혈청은 바람직하게는 비가공 혈청, 즉 전혈로부터 분리에 의해 유도되고 임의의 열 불활성화, 저장 (저온 또는 비-극저온), 살균, 동결 건조 및/또는 여과 외에 그의 화학적, 생화학적 또는 세포 조성을 변경시키는 하류 처리 단계에 적용되지 않은 혈청일 수 있다.
단리된 혈장, 혈청 또는 이의 대체물은 본 발명의 방법에 직접 사용될 수 있다. 이들은 또한 나중에 사용하기 위해 적절하게 저장할 수 있다 (예를 들어, 혈장, 혈청 또는 이의 대체물의 각각의 빙점보다 높은 온도에서 짧은 시간, 예를 들어, 약 1 내지 2 주 이하동안, 그러나 주변 온도보다 낮은 경우, 이 온도는 보통 약 4 내지 5 ℃; 또는 보통 약 -70 ℃ 내지 약 -80 ℃ 사이에서 냉동 저장으로 장시간 동안).
단리된 혈장, 혈청 또는 이의 대체물은 당 업계에 공지된 바와 같이, 특히 보체를 제거하기 위해 열 불활성화될 수 있다. 본 발명의 방법이 그 존재하에 배양된 세포에 대해 자가인 혈장, 혈청 또는 이의 대체물을 사용하는 경우, 혈장, 혈청 또는 이들의 대체물은 열 불활성화되지 않아도 된다. 혈장, 혈청 또는 이의 대체물이 배양된 세포에 적어도 부분적으로 동종이계인 경우, 혈장, 혈청 또는 이의 대체물을 열 불활성화하는 것이 유리할 수 있다. 임의로, 혈장, 혈청 또는 이의 대체물은 또한 0.2 ㎛ 이하의 기공 크기를 갖는 통상의 미생물 필터를 사용하여 저장 또는 사용 전에 멸균될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 방법은 접촉된 인간 MSC 또는 MSC-유래 세포에 대해 자가인 인간 혈장, 혈청 또는 이의 대체물을 사용할 수 있다. 혈장, 혈청 또는 이의 대체물과 관련하여 용어 "자가"는 혈장, 혈청 또는 이의 대체물이 상기 혈장, 혈청 또는 이의 대체물과 접촉될 MSC 또는 MSC-유래 세포와 동일한 대상체로부터 수득됨을 의미한다. 자가 혈장, 혈청 또는 이의 대체물의 사용은 대상체에 의한 세포의 최적의 수용을 보장하고/하거나 예를 들어 다른 혈청으로부터 감염원이 우발적으로 전파되는 것을 피할 수 있다.
다른 실시양태에서, 방법은 접촉된 인간 MSC 또는 MSC-유래 세포와 "상동성" 또는 "동종이계"인, 즉, MSC를 얻는 대상체 이외의 하나 이상의 (풀화된) 인간 대상체로부터 수득된 인간 혈장, 혈청 또는 이들의 대체물을 사용할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 방법은 상기 정의된 바와 같은 자가 및 동종이계 (즉, 상동성) 혈장, 혈청 또는 이들의 대체의 혼합물을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 어구 "혈청 또는 혈장의 대체물"은 혈장 및/또는 혈청의 기능 중 하나 이상을 갖는 천연 또는 인공 비독성 조성물, 예를 들어 MSC 또는 MSC-유래 세포의 성장 및/또는 확장을 유도할 수 있는 조성물을 지칭한다. 혈청 또는 혈장 대체물의 비제한적인 예는 혈소판 용해물 및 혈장 또는 혈청의 하나 이상의 분획화 성분, 예컨대 인간 혈청 알부민을 포함하는 세포 배양용 조성물을 포함한다. 당업자는 인간 혈장, 혈청 및 이의 대체물이 하나 이상의 성장 인자, 사이토카인 또는 호르몬을 포함할 수 있는 복잡한 생물학적 조성물임을 이해한다.
성장 인자 FGF-2 및 TGFβ 또는 이들 각각의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 혈장, 혈청 또는 이의 대체물에 추가하여, 즉 외인적으로 또는 보충적으로 제공되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "헤파린"은 항응고 효과를 특징으로 하는 분자량이 3 내지 30 kDa인 글리코사미노글리칸 패밀리 탄수화물의 중합체를 지칭한다. 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 효능은 양 또는 염소 또는 인간 혈장의 응고를 방지하는데 필요한 헤파린의 농도를 밀리그램 당 헤파린 활성 단위를 기준으로 한 국제 허용 표준 기준으로 국제적으로 인정되는 기준 표준의 농도와 비교하는 생물학적 분석법에 의해 시험관 내에서 결정될 수 있다. 헤파린 1 mg은 전형적으로 140-180 국제 단위 (IU)와 같다.
용어 "IU" 또는 "국제 단위"는 상기 생물학적 물질의 생물학적 활성 또는 효과로 표현된 생물학적 물질의 양의 표준 척도이다. 이 단위가 할당된 모든 물질은 국제적으로 승인된 생물학적 절차에 따라 시험할 때 1 IU의 용량으로 예상되는 국제적으로 인정되는 생물학적 활성 또는 효과가 있다.
특정 실시양태에서, 헤파린 또는 헤파린 유도체 또는 유사체는 비분획 헤파린 (UFH); 저분자량 헤파린 (LMWH), 예컨대 에녹사파린, 달테파린, 나드로파린, 틴자파린, 세르토파린, 레비파린, 아르데파린, 파르나파린, 베미파린 또는 이들의 혼합물; 헤파리노이드, 예컨대 헤파란 설페이트, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 아카란 설페이트, 케라탄 설페이트, 또는 이들의 혼합물, 예컨대 다나파로이드; 헤파린 염; 헤파리노이드 염; 헤파린 단편; 헤파리노이드 단편; 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 헤파린 또는 헤파린 유도체 또는 유사체는 UFH, 달테파린, 다나파로이드 및 헤파란 설페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 FGF-2, 상기 TGFβ, 상기 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체, 및 임의로 하나 이상의 혈장, 혈청 또는 그 대체물은 배지, 일반적으로 액체 세포 배양 배지에 포함된다. 전형적으로, 배지는 당 업계에 공지된 기본 배지 제제를 포함할 것이다. 다수의 기본 배지 제제 (예를 들어, ATCC (American Type Culture Collection), 또는 캘리포니아 칼스배드에 소재한 Invitrogen으로부터 입수 가능함)는 이글스 최소 필수 배지 (MEM), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 알파 변형 최소 필수 배지 (알파-MEM), 기본 필수 배지 (BME), BGJb, F-12 영양소 혼합물 (Ham), Iscove의 변형 둘베코 배지 (IMDM) 또는 X-VIVOTM 무혈청 배지 (임상 등급), Invitrogen 또는 Cambrex (뉴저지 소재)로부터 입수 가능), 이의 변형 및/또는 조합들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것들이 본원에서 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 상기 기본 배지의 조성은 당 업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 배양 세포에 필요한 배지 및/또는 배지 보충제의 농도를 변형시키거나 조절하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 이러한 기본 배지 제제는 그 자체로 공지된 포유동물 세포 발달에 필요한 성분을 함유한다. 제한이 아닌 예시로서, 이들 성분은 무기염 (특히 Na, K, Mg, Ca, Cl, P 및 가능하게는 Cu, Fe, Se 및 Zn을 함유하는 염), 생리학적 완충제 (예를 들어, HEPES, 중탄산염), 뉴클레오타이드, 뉴클레오시드 및/또는 핵산 염기, 리보스, 데옥시리보스, 아미노산, 비타민, 항산화제 (예를 들어, 글루타티온) 및 탄소 공급원 (예를 들어, 글루코스, 피루브산나트륨, 아세트산나트륨) 등을 포함할 수 있다.
배양에 사용하기 위해, 기본 배지에는 하나 이상의 추가 성분이 제공될 수 있다. 예를 들어, 최적의 성장과 확장에 필요한 미량 원소와 물질을 세포에 공급하기 위해 추가 보충제를 사용할 수 있다. 이러한 보충제는 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 염 및 이들의 조합을 포함한다. 이들 성분은 행크스 평형염 용액 (Hanks' Balanced Salt Solution) (HBSS), 얼 (Earle) 염 용액이 포함되나 이에 제한되지 않는 염 용액에 포함될 수 있다. 추가의 항산화 보충제, 예를 들어 β-머캅토에탄올이 첨가될 수 있다. 많은 기본 배지가 이미 아미노산을 함유하고 있지만, 일부 아미노산, 예를 들어 L-글루타민은 나중에 보충될 수 있는데, 이는 용액 중에 있을 때 덜 안정한 것으로 알려져 있다. 배지에 항생제 및/또는 항진균제 화합물, 예컨대 전형적으로 페니실린 및 스트렙토마이신의 혼합물, 및/또는 암포테리신, 암피실린, 겐타마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 날리딕산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리믹신, 푸로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 타일로신 및 제오신이 예시되나 이에 제한되지 않는 기타 화합물이 추가로 보충될 수 있다. 지질 및 지질 담체가 또한 세포 배양 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 지질 및 담체에는 그 중에서도 사이클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민에 접합된 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레산과 올레산, 미접합 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레산-올레산-아라키돈산, 알부민에 접합된 올레산 및 미접합된 올레산이 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 알부민이 지방산이 없는 제제에 유사하게 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 인간 혈장, 혈청 또는 이의 대체물 중 하나 이상이 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 15%, 더욱 바람직하게는 2% 내지 10%의 비율 (혈장, 혈청 또는 이의 대체물 중 하나 이상의 부피/배지 부피)로 상기 배지에 포함될 수 있다. 본 방법은 비교적 적은 양의 하나 이상의 혈장, 혈청 또는 이들의 대체물, 예를 들어 약 5 또는 10 부피% 이하, 예를 들어 약 1, 약 2, 약 3 또는 약 4 부피%로 만족스럽게 수행될 수 있어, MSC 또는 MSC-유래 세포를 배양하기 위해 수득될 필요가 있는 하나 이상의 혈장, 혈청 또는 이의 대체물의 부피를 감소시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 농축된 혈장 산물 (예를 들어, 동결된 혈장으로부터의 농축물과 같은 혈장 농축물), 농축된 혈청 산물 또는 혈장 또는 혈청의 농축된 대체물의 산물이 사용될 수 있다. 이러한 농축된 산물은 농도 인자를 상쇄 (평형, 보상)하기 위해 혈장, 혈청 또는 이들의 대체물 중 하나 이상의 원하는 농도보다 낮은 농도로 조성물에 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 인간 혈장, 혈청 및/또는 이들의 대체물 중 임의의 2 이상의 조합 또는 혼합물이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, FGF-2 및 TGFβ는 원하는 세포 유형으로의 분화를 유도하기에 충분한 농도로 상기 배지에 포함된다.
특정 실시양태에서, FGF-2 및 TGFβ는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포로의 MSC의 분화를 유도하기에 충분한 농도로 상기 배지에 포함된다. 전형적으로, FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편은 0.1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 0.5 내지 20 ng/ml, 예를 들어 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml 이하, 예를 들어 약 4, 3, 2, 1 또는 0.5 ng/ml의 농도로 배지에 포함될 수 있다. 전형적으로, TGFβ, 예컨대 TGFβ1, 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편은 0.1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 0.25 내지 20 ng/ml, 예를 들어 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml 이하, 예를 들어 약 4, 3, 2, 1 또는 0.5 ng/ml의 농도로 배지에 포함될 수 있다. 상기 값은 배지에 외인적으로 보충된 각각의 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편의 농도를 의미하는 것으로 의도된다.
특정 실시양태에서, 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체는 적어도 0.01 IU/ml, 적어도 0.02 IU/ml, 적어도 0.03 IU/ml, 적어도 0.04 IU/ml, 적어도 0.05 IU/ml, 적어도 0.06 IU/ml, 적어도 0.07 IU/ml, 적어도 0.08 IU/ml, 적어도 0.09 IU/ml, 적어도 0.1 IU/ml, 적어도 0.5 IU/ml, 적어도 1 IU/ml, 적어도 5 IU/ml, 적어도 10 IU/ml, 적어도 20 IU/ml, 적어도 30 IU/ml, 적어도 40 IU/ml, 적어도 50 IU/ml, 적어도 60 IU/ml, 적어도 70 IU/ml, 적어도 80 IU/ml, 적어도 90 IU/ml, 또는 적어도 100 IU/ml의 농도로 상기 배지에 포함된다. 특정 실시양태에서, 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체는 적어도 0.10 IU/ml의 농도로 상기 배지에 포함된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체는 약 0.1 IU/ml의 농도로 상기 배지에 포함된다. 특정 실시양태에서, 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체는 약 0.10 IU/ml, 0.20 IU/ml, 0.30 IU/ml, 0.40 IU/ml, 0.50 IU/ml, 0.60 IU/ml, 0.70 IU/ml, 0.80 IU/ml, 0.90 IU/ml 또는 1.0 IU/ml의 농도로 상기 배지에 포함될 수 있다.
본원에 교시된 바와 같은 방법 또는 용도의 특정 실시양태에서, 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 농도는 적어도 0.05 IU/ml, 바람직하게는 약 0.1 IU/ml이다.
일 실시양태에서, 상기 농도는 배지 중 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편 또는 상기 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 총 농도, 즉 혈장, 혈청 또는 그 대체물에 의해 기여되고 이에 부가하여 제공되는 상기 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편 또는 상기 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 합한 농도를 지칭할 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 농도는 혈장 또는 혈청에 의해 이미 기여된 것에 더하여 제공된 바와 같은 상기 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편 또는 상기 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 농도를 지칭할 수 있다. 이해할 수 있는 바와 같이, 첨가될 성장 인자 또는 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체가 혈장, 혈청 또는 이의 대체물에 정상적으로 존재하지 않는 경우 (검출 불가능), 성장 인자 또는 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 총 및 첨가 농도는 (실질적으로) 동일할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본원의 다른 곳에 정의된 바와 같은 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC는 배양 용기에서 배양된다. 배양 용기는 세포 부착을 가능하게 하는 플라스틱 표면을 제공할 수 있다. 다른 실시양태에서, 표면은 유리 표면일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표면은 세포의 부착 및 성장을 가능하게 하는 적절한 물질, 예를 들어 Matrigel®, 라미닌 또는 콜라겐으로 코팅될 수 있다.
특정 실시양태에서, MSC는 기질 표면, 예를 들어 플라스틱 표면에 부착될 수 있는 (단핵성) 세포를 선택함으로써 골수 (또는 다른 공급원)로부터 회수될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 (예를 들어 단계 (a)의 일부로서) 비-부착성 물질을 제거하고 (a)에 정의된 배지에서 부착성 세포를 추가로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포는 비부착성 물질을 제거하기 전에 약 1 일 내지 8 일, 보다 일반적으로 약 2 일 내지 6 일, 보다 일반적으로 약 4 일 동안 부착되도록 허용될 수 있다. 그렇지 않으면, 부착되지 않은 물질의 제거는 단계 (a)를 시작한 후 최대 8 일, 최대 6 일, 최대 4 일, 바람직하게는 최대 4 일 동안 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 (예를 들어 단계 (a)의 일부로서) 배양 배지의 일부 또는 전부를 (a)에 정의된 배지로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 유리하게, 이것은 성장 인자가 새로 교체되도록 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 대체는 1 차 배양 동안 적어도 1 회, 예컨대 1 회, 2 회 또는 3 회 수행될 수 있다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 13 일 내지 약 15 일의 기간 동안 배양될 수 있다. 바람직하게는, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 14 일 동안 배양된다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 (b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양 ("계대 1" 또는 "P1")하고 추가로 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (b)는 또한 본원에서 "2 차 배양"으로 지칭될 수 있다.
일 실시양태에서, 단계 (b)는 단계 (a)에서 수득된 MSC-유래 세포를 수집하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 단계 (b)는 MSC-유래 세포를 분리, 재플레이팅하고 (a)에 정의된 배지, 즉 FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 그의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배지에서 바람직하게는 추가 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 약 8 일 내지 약 12 일의 기간 동안 배양된다. 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 약 9 일 내지 약 11 일의 기간 동안 배양된다. 바람직하게는, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 약 10 일 동안 배양된다.
특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일 동안 배양될 수 있으며, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 20%가 증식하는 마지막 날이다.
따라서, 일 측면은 다음을 포함하는, MSC로부터 연골-골모세포 계통의 중간엽 줄기 세포 (MSC)-유래 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 그 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계,
여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일 동안 배양되고, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 20%가 증식하는 마지막 날이다.
특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일의 기간 동안 배양될 수 있으며, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 25%가 증식하는 마지막 날이다 (예를 들어, S 및 G2/M 기). 예를 들어, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일 동안 배양될 수 있으며, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45, 적어도 50%, 적어도 55, 또는 적어도 60%가 증식하는 마지막 날이다 (예: S 및 G2/M 기에서).
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 증식하는 MSC-유래 세포는 S 기, G2 기 또는 M기의 세포 주기에 있다. 이벤트/기 (G0/G1, S 및 G2/M 기)를 갖는 세포 주기 분석은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)와 같은 유세포 분석에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일의 기간 동안 배양될 수 있고, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 수가 x-1 일에서보다 더 높은 마지막 날이다. 예를 들어, MSC-유래 세포의 수가 x-1 일에서보다 더 높은 마지막 날인 x 일을 결정하기 위해, MSC-유래 세포를 2 차 배양 동안 28 일 동안 배양하고 (선행 기술의 방법에 따라), 샘플을 매일 수확한 뒤, 각 샘플에 대한 세포 수 또는 세포 밀도 (예: 세포 수/㎠로 표시)를 예를 들어 수동으로 (예: Buerker 챔버) 또는 유세포분석법 (예: BD TrucountTM)을 통해 결정할 수 있다. 세포 수를 기반으로 MSC-유래 세포의 수가 전날 (즉, x-1 일)에서보다 많은 마지막 날 (즉, x 일)을 결정할 수 있다.
특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일 동안 배양될 수 있으며, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 20%가 증식하는 마지막 날이고, MSC-유래 세포는 x-1 일에서보다 높다.
특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 5x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다. 바람직하게는, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계,
여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠, 바람직하게는 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅된다.
용어 "밀도" 및 "세포 밀도"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 단위 표면 당 세포의 수를 지칭한다 (예를 들어, 세포/㎠로 표시됨).
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 단계 (c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양 ("계대 2" 또는 "P2")하고 추가로 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (c)는 또한 본원에서 "3 차 배양"으로 지칭될 수 있다.
단계 (c)에서 얻은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 "계대 3" 또는 "P3" 세포로 간주될 수 있다.
본원에서 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서 약 10 일 내지 약 14 일의 기간 동안 배양된다. 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서 약 11 일 내지 약 13 일의 기간 동안 배양된다. 바람직하게는, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서 약 12 일 동안 배양된다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 5x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다. 바람직하게는, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계,
여기서 MSC-유래 세포는 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠, 바람직하게는 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅된다.
당업자는 본원에서 교시된 방법이 추가 계대를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 이것이 계대 4 (P4), 계대 5 (P5), 계대 6 (P6), 계대 7 (P7), 계대 8 (P8), 계대 9 (P9) 또는 계대 10 (P10)의 세포 배양을 생성할 수 있음을 이해할 것이다. 계대 0 (P0)은 분리 및/또는 재플레이팅되지 않은 MSC 또는 MSC-유래 세포를 지칭할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 (d) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 재현탁하는 단계를 포함할 수 있다. 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 재현탁함으로써 대상체에게 직접 투여하기에 적합한 세포 산물을 얻을 수 있다. 세포 산물은 동결 보존을 통해 편리하게 보관될 수 있으며, 동결 보존된 세포 산물은 운반이 용이할 수 있으며 요청시 배송될 수 있다. 따라서 투여에 적합한 세포 산물은 요청시 치료에 즉시 이용 가능하다. 더욱이, 본 방법에 의해 수득된 세포 산물의 동결 보존은 세포 산물의 모든 방출 시험을 수행하고 세포 산물 투여 전에 결과를 얻는 것이 가능하다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 (d) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 재현탁하는 단계; 및 (e) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계;
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(d) (단계 (c)의) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 재현탁하는 단계; 및
(e) (단계 (d)의) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하는 단계.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 (d) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 임상 농도로 재현탁하는 단계; 및 (e) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 임상 농도는 유리하게는 본 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 투여 전에 임의의 추가 희석 또는 농축 단계없이 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 추가 세척 단계없이 대상체에게 직접 투여할 수 있게 한다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 방법은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존함으로써 투여에 적합한 세포 산물을 수득하는 것을 포함할 수 있다. 투여에 적합한 세포 산물은 투여 전 추가적인 세척 단계없이 이를 필요로 하는 대상체에게 직접 전달될 수 있다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 단계 (d)에서 약 1x107 세포/ml 내지 약 1x108 세포/ml의 농도로 동결 보존 배지에 재현탁된다. 예를 들어, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 단계 (d)에서 약 1x107 세포/ml 내지 약 8x107 세포/ml, 약 1x107 세포/ml 내지 약 6x107 세포/ml, 또는 약 2x107 세포/ml 내지 약 5x107 세포/ml의 농도로 동결 보존 배지에 재현탁된다. 바람직하게는, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 단계 (d)에서 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 동결 보존 배지에 재현탁된다.
특정 실시양태에서, 투여에 적합한 세포 산물은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 내지 약 1x108 세포/ml의 농도로 포함한다. 예를 들어, 투여에 적합한 세포 산물은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 내지 약 8x107 세포/ml, 약 1x107 세포/ml 내지 약 6x107 세포/ml, 또는 약 2x107 세포/ml 내지 약 5x107 세포/ml 농도의 포함한다. 바람직하게는, 투여에 적합한 세포 산물은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 포함한다.
특정 실시양태에서, 투여에 적합한 세포 산물은 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 내지 약 1x108 세포/ml의 농도로 포함한다. 예를 들어, 투여에 적합한 세포 산물은 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 내지 약 8x107 세포/ml, 약 1x107 세포/ml 내지 약 6x107 세포/ml, 또는 약 2x107 세포/ml 내지 약 5x107 세포/ml의 농도로 포함한다. 바람직하게는, 투여에 적합한 세포 산물은 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 포함한다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 벤조피란과 같은 항산화 화합물을 포함할 수 있다.
본원에서 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 디메틸설폭사이드 (DMSO), 인간 혈청 알부민 (HSA), 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 DMSO, HSA, 아데노신, (폴리)펩타이드, 항산화 화합물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 동결 보존 배지는 유리하게는 대상체에게 투여하기 전에 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 추가 세척 단계없이 본 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 투여 가능토록 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 투여에 적합한 세포 산물은 DMSO, HSA, 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란, 또는 이들의 조합을 포함하는 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 및 약 1x108 세포/ml의 농도로 포함한다. 예를 들어, 투여에 적합한 세포 산물은 DMSO, HSA, 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란 또는 이들의 조합을 포함하는 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 내지 약 8x107 세포/ml, 약 1x107 세포/ml 내지 약 6x107 세포/ml, 또는 약 2x107 세포/ml 내지 약 5x107 세포/ml의 농도로 포함한다. 바람직하게는, 투여에 적합한 세포 산물은 DMSO, HSA, 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란, 또는 이들의 조합을 포함하는 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 포함한다.
특정 실시양태에서, 투여에 적합한 세포 산물은 DMSO, HSA, 아데노신, (폴리)펩타이드, 항산화 화합물 또는 이들의 조합을 포함하는 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 내지 약 1x108 세포/ml의 농도로 포함한다. 예를 들어, 투여에 적합한 세포 산물은 DMSO, HSA, 아데노신, (폴리)펩타이드, 항산화 화합물 또는 이들의 조합을 농도로 포함하는 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 세포/ml 내지 약 8x107 세포/ml, 약 1x107 세포/ml 내지 약 6x107 세포/ml, 또는 약 2x107 세포/ml 내지 약 5x107 세포/ml의 농도로 포함한다. 바람직하게는, 투여에 적합한 세포 산물은 DMSO, HSA, 아데노신, (폴리)펩타이드, 항산화 화합물 또는 이들의 조합을 포함하는 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 포함한다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 뉴클레오시드 (예: 아데노신), 당 (예: 덱스트란-40, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 락토비온산), 트리펩타이드 (예: L-글루타티온), 완충액 (예: N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 염 (예: 수산화나트륨, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘) 및 DMSO를 포함하는 조성물일 수 있다. 시판 동결 보존 배지는 CryoStor® CS10 세포 동결 보존 배지 (C2874, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)이다. 다른 예로는 CryoStor® CS5, CS2 또는 CSB 세포 동결 보존 배지 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)가 있다.
특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 DMSO를 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 또는 적어도 10% 포함할 수 있다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 뉴클레오시드 (예: 아데노신), 당 (예: 덱스트란-40, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 락토비온산), 트리펩타이드 (예: L-글루타티온), 완충액 (예: N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 염 (예: 수산화나트륨, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘) 및 벤조피란 (예: 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산)을 포함하는 조성물일 수 있다. 시판 동결 보존 배지는 HypoThermosol® FRS 보존 용액 (H4416, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)이다.
용어 "트롤록스" 또는 "6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 벤조피란을 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 또는 적어도 10% 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 동결 보존 배지는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산을 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 또는 적어도 10% 포함할 수 있다.
본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 13 일 내지 약 15 일의 기간 동안, 단계 (b)에서 약 8 일 내지 약 12 일의 기간 동안 배양될 수 있다. 본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 13 일 내지 약 15 일의 기간 동안, 단계 (c)에서 약 10 일 내지 약 14 일의 기간 동안 배양될 수 있다. 본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 약 8 일 내지 약 12 일의 기간 동안, 단계 (c)에서 약 10 일 내지 약 14 일의 기간 동안 배양될 수 있다. 본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 13 일 내지 약 15 일의 기간 동안, 단계 (b)에서 약 8 일 내지 약 12 일의 기간 동안, 단계 (c)에서 약 10 일 내지 약 14 일의 기간 동안 배양될 수 있다.
본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 14 일 동안, 단계 (b)에서 약 10 일 동안 배양될 수 있다. 본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 14 일 동안, 단계 (c)에서 약 12 일 동안 배양될 수 있다. 본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 약 10 일 동안, 단계 (c)에서 약 12 일 동안 배양될 수 있다. 본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 14 일 동안, 단계 (b)에서 약 10 일 동안, 단계 (c)에서 약 12 일 동안 배양될 수 있다.
본원에서 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있고, 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다.
본원에 교시된 방법의 특정 실시양태에서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있고, 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 제공한다.
"연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단" 또는 "연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포"의 언급은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "집단"은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포와 같은 원하는 세포 유형의 실질적으로 순수하고 (즉, 주로 구성되는) 동종의 세포 그룹을 지칭한다.
추가 측면은 MSC의 시험관 내 또는 생체 외 확장에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단에 관한 것으로, 이에 의해 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 90%는 직경이 25 μm 이하 (D90 ≤25 μm)이고 현탁액에 포함된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 직경이 35 μm 초과이다. 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 본원에 정의된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된다.
실시예 섹션에 예시된 바와 같이, 본원에서 교시된 방법은 앞서 기술된 MSC-유래 세포보다 특히 더 작고 더 균질한 크기와 같은 우수한 특성을 갖는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포, 또는 이를 포함하는 집단을 생성한다. 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득 가능한 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 더 작고 더 균질한 크기는 세포가 개선된 이식 특성을 가지도록 만든다. 보다 구체적으로, 본원에 기술된 방법에 의해 수득 가능한 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 더 작고 더 균질한 크기는 특히 우수한 생체 내 안전성 프로파일 및/또는 주사성을 제공하여 폐색전증 및 경색의 위험을 감소시키거나 없앰으로써 세포가 모든 투여 경로 및 특히 혈관 내 투여에 적합하게 한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득 가능한 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 제한된 부피가 투여되는 부위에서 조정 가능하고 높은 세포 농도가 전달될 수 있게 한다.
특정 실시양태에서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 평균 직경은 25 μm 미만, 24 μm 미만, 23 μm 미만, 22 μm 미만, 21 μm 미만, 또는 20 μm 미만이다. 바람직하게는, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 평균 직경은 20 ㎛ 미만이다.
용어 "현탁액" 및 "세포 현탁액"은 일반적으로 액체상에 분산된 MSC-유래 세포, 특히 생존 가능한 MSC-유래 세포를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 현탁액에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 평균 직경은 10 μm 초과, 11 μm 초과, 12 μm 초과, 13 μm 초과, 14 μm 초과, 또는 15 μm 초과이다.
특정 실시양태에서, 현탁액에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 평균 직경은 10 ㎛ 내지 25 ㎛, 바람직하게는 15 ㎛ 내지 20 ㎛이다.
특정 실시양태에서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 90%는 25 μm 이하 (D90 ≤25 μm), 24 μm 이하 (D90 ≤24 μm), 23 μm 이하 (D90 ≤23 μm), 22 μm 이하 (D90 ≤22 μm), 21 μm 이하 (D90 ≤21 μm), 또는 20 μm 이하 (D90 ≤20 μm), 바람직하게는 25 μm 이하 (D90 ≤25 μm)의 직경을 갖는다.
특정 실시양태에서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 25 μm 이하의 D90 (D90 ≤25 μm)을 갖고 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 35 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 24 μm 이하 (D90 ≤24 μm), 23 μm 이하 (D90 ≤23 μm), 또는 22 μm 미만 (D90 ≤22 μm), 21 μm 이하 (D90 ≤21 μm), 20 μm 이하 (D90 ≤20 μm)의 D90 (D90 ≤25 μm)을 갖고, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 35 μm 초과 직경을 갖는다.
특정 실시양태에서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 25 μm 이하의 D90 (D90 ≤25 μm)을 갖고 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 30 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 24 μm 이하 (D90 ≤24 μm), 23 μm 이하 (D90 ≤23 μm), 또는 22 μm 미만 (D90 ≤22 μm), 21 μm 이하 (D90 ≤21 μm), 20 μm 이하 (D90 ≤20 μm)의 D90 (D90 ≤25 μm)을 갖고, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 30 μm 초과 직경을 갖는다.
특정 실시양태에서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 D90이 약 25 μm 내지 약 10 μm (10 μm ≤ D90 ≤ 25 μm), 약 24 μm 내지 약 10 μm (10 μm ≤ D90 ≤ 24 μm), 약 23 μm 내지 약 10 μm (10 μm ≤ D90 ≤ 23 μm), 약 22 μm 내지 약 10 μm (10 μm ≤ D90 ≤ 22 μm), 약 21 μm 내지 약 10 μm (10 μm ≤ D90 ≤ 21 μm) 또는 약 20 μm 내지 약 10 μm (10 μm ≤ D90 ≤ 20 μm), 바람직하게는 약 25 μm 내지 약 10 μm (10 μm ≤ D90 ≤ 25 μm)이다.
세포의 직경은 당 업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 디지털 현미경 및 이미지 분석을 위한 동반 소프트웨어 (예: Motic Image Plus® 2.02)에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 언급되는 평균 세포 직경은 자유 부유, 비-부착 상태에 있는 세포의 직경, 따라서 현탁액에 있는 세포의 직경에 기초하여 결정되어야 한다. 세포는 바람직하게는 PBS와 같은 투명한 무독성 등장성 완충액, 및 선택적으로 트리판 블루와 같은 살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위한 염료를 포함하는 용액에 현탁된다. 가급적이면 통계적으로 유의미한 분석을 고려하기 위해 적어도 100 개의 세포가 측정되어야 한다.
따라서, 추가의 측면은 본원에 정의된 바와 같은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포의 생존력을 유지 또는 향상시킬 수 있는 성분이 포함될 수 있다. 예로서 제한없이, 이러한 성분은 실질적으로 등장 조건을 보장하기 위한 염, 완충 시스템(들)과 같은 pH 안정제 (예를 들어, 인산염 또는 탄산염 완충 시스템과 같이 실질적으로 중성 pH를 보장하기 위한 것), 예를 들어, 알부민과 같은 담체 단백질, 기본 배지 및/또는 배지 보충제, 혈청 또는 혈장을 포함하는 배지, 영양소, 탄수화물 공급원, 보존제, 안정제, 산화방지제 또는 당업자에게 잘 알려진 기타 물질을 포함할 수 있다. 각각의 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 상기 하나 이상의 추가 성분과 혼합함으로써 상기 조성물을 제조하는 방법이 또한 개시된다. 조성물은 예를 들어 액체가거나 반고체 또는 고체일 수 있다 (예를 들어, 냉동 조성물일 수 있거나 겔로서 존재할 수 있거나 고체 지지체 또는 스캐폴드 등에 존재할 수 있다).
용어 "조성물", "제형" 또는 "제제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 본원에 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 약학적 제형을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 당 업계와 일맥상통하며 약학적 조성물의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에게 유해하지 않은 것을 의미한다.
본원에 사용된 "담체" 또는 "부형제"는 임의의 모든 용매, 희석제, 완충제 (예를 들어, 중성 완충 염수 또는 인산염 완충 염수), 가용화제, 콜로이드, 분산 매질, 비히클, 충전제, 킬레이트제 (예를 들어, EDTA 또는 글루타티온), 아미노산 (예를 들어, 글리신), 단백질, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 향미제, 방향제, 증점제, 데포 효과를 달성하기 위한 제제, 코팅제, 항진균제, 방부제, 안정제, 산화방지제, 장성 조절제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 이러한 물질은 독성이 없어야 하며 세포의 활동을 방해해서는 안된다.
담체 또는 부형제 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 조성물은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 의약 제형의 일반적인 원리에 대해서는 문헌[Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000]를 참조한다.
액체 약학적 조성물은 일반적으로 물 또는 약학적으로 허용되는 수용액과 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생리 염수 용액, 조직 또는 세포 배양 배지, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.
조성물은 하나 이상의 세포 보호 분자, 세포 재생 분자, 성장 인자, 항-아폽토시스 인자 또는 세포에서 유전자 발현을 조절하는 인자를 포함할 수 있다. 이러한 물질은 세포를 그의 환경과 무관하게 만들 수 있다.
상기 약학적 조성물은 세포의 생존성을 보장하는 추가 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 바람직한 pH, 보다 일반적으로 거의 중성에 가까운 pH를 달성하기에 적합한 완충 시스템 (예를 들어, 인산염 또는 탄산염 완충 시스템)을 포함할 수 있고, 삼투 스트레스를 방지하기 위해 세포에 등삼투압 조건을 보장하기에 충분한 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 목적에 적합한 용액은 당 업계에 공지된 바와 같은 인산염 완충 염수 (PBS), 염화나트륨 용액, 링거 주사제 또는 락테이트화 링거 주사제일 수 있다. 또한, 조성물은 세포의 생존성을 증가시킬 수 있는 담체 단백질, 예를 들어 알부민 (예를 들어, 소 또는 인간 알부민)을 포함할 수 있다.
추가의 적절한 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제가 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 콜라겐 또는 젤라틴과 같은 단백질, 전분과 같은 탄수화물, 다당류, 당 (덱스트로스, 글루코스 및 수크로스), 나트륨 또는 칼슘 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 전호화 전분, 펙틴 한천, 카라기난, 점토, 친수성 검 (아카시아검, 구아검, 아라비아검 및 크산탄검), 알긴산, 알기네이트, 히알루론산, 폴리글리콜산 및 폴리락트산, 덱스트란, 펙틴, 수용성 아크릴 중합체 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 합성 중합체, 프로테오글리칸, 인산칼슘 등으로부터 선택될 수 있다
필요에 따라, 세포 제제는 개선된 조직 재생을 제공하기 위해 지지체, 스캐폴드, 매트릭스 또는 재료상에 투여될 수 있다. 예를 들어, 물질은 과립상 세라믹, 또는 젤라틴, 콜라겐 또는 피브리노겐과 같은 바이오폴리머일 수 있다. 다공성 매트릭스가 표준 기술에 따라 합성될 수 있다 (예를 들어, Mikos et al., Biomaterials 14: 323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997). 이러한 지지체, 스캐폴드, 매트릭스 또는 물질은 생분해성 또는 비생분해성일 수 있다. 따라서, 세포는 다공성 또는 비다공성 기질과 같은 적합한 기질로 전달 및/또는 배양되어 임플란트를 제공할 수 있다. 예를 들어, 필요한 경우 고체 지지체를 본 발명의 액체 영양 배지에서 배양함으로써 복제를 일으키고/거나, 분화 과정을 계속하도록 하기 위해 배양 접시에서 증식하거나 분화되는 세포가 삼차원 고체 지지체로 전달될 수 있다. 세포는 예를 들어 상기 지지체를 상기 세포를 함유하는 액체 현탁액에 함침시킴으로써 삼차원 고체 지지체 상으로 전달될 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 함침된 지지체가 대상체에 이식될 수 있다. 이렇게 함침된 지지체는 또한 최종 이식되기 전에 액체 배양 배지에 침지시킴으로써 재배양될 수도 있다. 삼차원 고체 지지체는 인간에게 이식될 수 있도록 생체적합성이어야 한다. 이것은 생분해성 또는 비생분해성일 수 있다.
세포 또는 세포 집단은 이들이 예를 들어 골모세포와 같은 원하는 세포 유형으로 생존, 성장, 증식 및/또는 분화할 수 있는 방식으로 투여될 수 있다. 세포 또는 세포 집단은 예를 들어 뼈 결함과 같은 의도한 기관 내로 이동하여 생착될 수 있다. 다른 장소에서의 세포 또는 세포 집단의 생착이 구상될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 약학 세포 제제는 액체 조성물 형태로 투여될 수 있다. 실시양태에서, 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 전신, 국소, 기관 내, 기관 이상 기능 또는 병변 부위 또는 조직 병변 부위에 투여될 수 있다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 목적 세포를 포함할 수 있다. 용어 "치료적 유효량"은 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 생물학적 또는 의약 반응을 유도할 수 있고, 특히 치료되는 질환 또는 상태의 국소 또는 전신 증상 또는 특징 중 하나 이상을 예방 또는 완화시킬 수 있는 양을 지칭한다. 적절한 치료적 유효량은 목적 세포의 특성, 질환 상태 및 중증성, 및 대상체의 연령, 크기 및 상태를 고려하여 적격한 의사가 결정할 수 있다.
본 발명의 세포를 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 성분 및 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 약학적 부형제와 혼합함으로써 상기 약학적 조성물을 제조하는 방법이 또한 제공된다.
일 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 약학적 제형은 액체 또는 점성 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 약학적 제형은 인산삼칼슘, 하이드록시아파타이트, 하이드록시아파타이트/인산삼칼슘 입자의 조합, 폴리-락트산, 폴리락트 글리콜산, 히알루론산 또는 이의 유도체, 키토산, 폴리-L-라이신, 젤라틴, 콜라겐, 오스테오넥틴, 피브리노겐, 오스테오칼신 또는 이들의 조합과 같은 골전도 특성을 갖는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "골전도성"은 본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포와 같은 세포가 새로운 뼈에 부착, 이동, 성장 및 생성할 수 있는 스캐폴드 역할을 하도록 하는 구성 요소의 능력을 의미한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본원에서 교시된 약학적 제형은 뼈 치유 및 뼈 결손의 복구에 유용한 성분을 포함할 수 있다. 약학적 제형은 골전도 특성을 갖는 스캐폴드 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 약학적 제형은 탈광물화 매트릭스 (DBM) 또는 기타 매트릭스와 조합되어 복합물을 골형성뿐만 아니라 골 전도성 및 골유도성으로 만들 수 있다. 동종 DBM과 함께 자가 골수 세포를 사용하는 유사한 방법은 좋은 결과를 가져 온다 (Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313:8-18).
본원에서 교시된 약학적 제형은 BMP-2, BMP-7 또는 BMP-4와 같은 뼈 형태 형성 단백질, 또는 임의의 다른 성장 인자와 같은 상보적 생체 활성 인자 또는 골-유도성 단백질을 추가로 포함하거나 이와 함께 공동 투여될 수 있다. 다른 잠재적 동반 성분으로는 뼈 재생을 돕는 데 적합한 칼슘 또는 인산염의 무기 공급원이 있다 (WO 00/07639). 원하는 경우, 세포 제제는 개선된 조직 재생을 제공하기 위해 담체 매트릭스 또는 재료에 투여될 수 있다. 예를 들어, 재료는 하이드로겔, 또는 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산 또는 이의 유도체, 오스테오넥틴, 피브리노겐 또는 오스테오칼신과 같은 바이오 폴리머일 수 있다. 생체 재료는 표준 기술 (예를 들면 Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997)에 따라 합성할 수 있다.
또한 대상체에게 본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 본원에 교시된 약학적 제형을 예를 들어 전신적으로, 예를 들면 주사에 의해 투여하기 위한 수술 기구 또는 장치를 포함하고 본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 본원에 교시된 약학적 제형을 추가로 포함하는 부품의 배열 또는 키트가 개시된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 본원에 정의된 약학적 제형을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 연골-골모세포 계통의 세포 이식을 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 본원에 정의된 약학적 제형을 제공한다.
관련 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 약학적 제형의 치료적 유효량을 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체의 치료용 의약의 제조를 위한, 상기 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 약학적 제형의 용도를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 모두를 지칭하며, 여기서의 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 늦추는 (덜하게 하는) 것이다. 유익하거나 바람직한 임상 결과는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행 및 합병증 발생의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 완화 또는 경감을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않으면 예상되는 생존과 비교하여 생존 연장을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연골-골모세포 계통의 이식이 필요한 대상체"은 주어진 상태, 바람직하게는 상기와 같은 상태 또는 질환의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체, 예컨대 포유동물 또는 인간 대상체를 포함한다. 이러한 대상체는 전형적으로 상기 상태로 진단된 대상체, 상기 상태를 갖거나 이로 발생하기 쉬운 대상체 및/또는 상태를 예방하기 위한 대상체를 제한없이 포함할 것이다.
"이식" 또는 "세포 이식"이라는 용어는 그의 보통의 의미를 지니며, 특히 대상체에게 세포를 투여하는 것을 의미한다. 용어 "세포 이식"은 "세포 요법"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 세포 이식은 당 업계에 공지된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 예로서, 제한없이, 세포는 대상체로의 주입에 의해 이식될 수 있다. 전형적으로, 세포 주입은 비경구, 예를 들어 혈관 내, 피하, 피내 또는 근육 내, 바람직하게는 혈관 내로 수행될 수 있다. 세포는, 예를 들어, 전신, 국소 또는 병변 부위에 제한없이 투여될 수 있다. 특정 적용, 표적 조직, 치료 목적 또는 세포 유형에 따라, 투여 경로뿐 아니라 제형, 농도 등에 조정이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 또는 약학적 제형은 경피, 골내, 관절 내, 추간 또는 혈관 내 투여에 적합할 수 있다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 또는 약학적 제형은 골 결손 부위에서의 투여에 적합할 수 있다.
본원에 교시된 바와 같은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 균질하고 작은 세포 크기는 상기 세포를 대상체에게 정맥 내 투여하는 경우 급성 독성을 감소시키거나 제거한다. 따라서, 본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 특히 혈관 내 또는 경피 투여에 적합하다.
따라서, 특정 실시양태에서, 상기 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 또는 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 또는 약학적 제형은 연골-골모세포 계통의 이식을 필요로 하는 상기 대상체에게 경피 또는 혈관 내로 투여될 수 있다.
또, 본 발명자들은 본원에서 교시된 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포가 골형성 특성을 갖는다는 것을 발견했다.
따라서, 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체는 근골격계 질환을 갖는 대상체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "근골격계 질환"은 질환에 걸린 대상체에 본 발명의 약학 제형을 투여하였을 때 치료 혜택이 있을 수 있는 임의 형태의 골 질환, 근육 질환, 관절 질환, 또는 연골위축증을 가리킨다. 특히, 이러한 질환은 예를 들면, 뼈 및/또는 연골 형성 감소 또는 뼈 및/또는 연골 재흡수 과다, 뼈에 존재하는 골모세포 또는 골세포 및/또는 연골에 존재하는 연골모세포 또는 연골세포의 수, 생존성 및/또는 또는 기능의 저하, 대상체에서 골 질량 /또는 연골 질량 감소, 뼈 가늘어짐, 훼손된 뼈 강도 또는 탄성 등으로 특정화될 수 있다.
근골격 질환의 비한정적인 예로서 국소 또는 전신 장애, 예컨대, 임의 타입의 골다공증 또는 골연화증, 예를 들면, 초기, 폐경후, 노인성, 코르티코이드-유도성, 비스포스포네이트-유도성, 및 방사선치료-유도성의 것; 임의의 이차, 단- 또는 다부위 골괴사; 임의 타입의 골절, 예를 들면, 위관절 (non-union), 변형치유골절 (mal-union), 지연 유합 (delayed union) 골절 또는 압박, 악안면 골절; 뼈 융합을 필요로 하는 상태 (예를 들면, 척추 융합 및 재건), 선천성 뼈 결손; 예를 들면, 외상성 손상 또는 암 수술후 뼈 재건, 및 두개-안면 뼈 재건; 외상성 관절염, 초점성 연골 및/또는 관절 결손, 초점성 퇴행성 관절염; 골관절염, 퇴행성 관절염, 변형성 슬관절증, 및 변형성 고관절증; 골형성부전; 용골성 골암; 파제트병 (Paget's disease), 내분비계 장애; 저인산혈증; 저칼슘혈증; 신성 골이영양증; 골연화증; 무력성 골 질환; 부갑상선기능항진증, 원발성 부갑상선기능항진증, 이차 부갑상선기능항진증; 치주 질환; 고람-스타우트 (Gorham-Stout) 질환 및 맥큔-알브라이트 (McCune-Albright) 증후군; 류마티스성 관절염; 강직성 척추염, 건선성 관절염, 장질환성 관절증, 및 미분화 척추관절염 및 반응성 관절염을 비롯한 척추관절증; 전신 홍반성 낭창 및 관련 증후군; 경피증 및 관련 장애; 쇼그렌 (Sjogren's) 증후군; 거대 세포 동맥염 (호튼병 (Horton's disease), 다카야스 (Takayasu's) 동맥염, 류마티스성 다발성근육통, ANCA-관련 맥관염 (예컨대 베그너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 현미경 다발성맥관염 및 척스츠라우스 (Churg-Strauss) 증후군), 베체트 (Behcet's) 증후군, 및 기타 다발성동맥염 및 관련 장애 (예컨대 결절성 다발성동맥염, 코간 (Cogan's) 증후군, 및 버거병 (Buerger's disease)을 비롯한 전신성 맥관염; 아밀로이드증 및 유육종증을 비롯한 기타 전신성 염증성 질환을 동반한 관절염; 통풍, 인산칼슘 또는 옥살산칼슘 결정의 관절 침착과 관련한 피로인산칼슘 이수화물 침착 질환, 장애 또는 증후군을 비롯한 결정성 관절증; 연골석회화 및 신경장애성 관절염; 펠티 (Felty's) 증후군 및 라이터 (Reiter's) 증후군; 라임병 및 류마티스성 열을 들 수 있다.
특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체는 골 관련 장애를 갖는 대상체일 수 있다.
따라서, 본원에 사용된 용어 "골 관련 장애"는 장애가 있는 대상체에게 연골-골모세포 계통의 세포, 예를 들어 연골-골전구세포, 골전구세포, 전조골세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형의 이식으로 치료 혜택이 있을 수 있는 임의 형태의 골 질환을 가리킨다. 특히, 이러한 장애는 예를 들면, 골 형성 감소 또는 골 재흡수 과다, 뼈에 존재하는 골모세포 또는 골세포의 수, 생존성 및/또는 또는 기능의 저하, 대상체에서 골 질량 감소, 뼈 가늘어짐, 훼손된 뼈 강도 또는 탄성 등으로 특정화될 수 있다.
예로서 제한없이, 본 발명의 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 (예를 들어 골모세포 계통의 세포)의 이식으로 치료 혜택이 있을 수 있는 골 관련 장애는 국소 또는 전신 장애, 예를 들어, 임의의 유형의 골다공증 또는 골감소증, 예를 들면, 초기, 폐경후, 노인성, 코르티코이드-유도성, 임의의 이차, 단- 또는 다부위 골괴사, 임의 타입의 골절, 예를 들면, 위관절 (non-union), 변형치유골절 (mal-union), 지연 유합 (delayed union) 골절 또는 압박, 뼈 융합을 필요로 하는 상태 (예를 들면, 척추 융합 및 재건), 턱-안면 골절, 예를 들면, 외상성 손상 또는 암 수술후 뼈 재건, 두개-안면 뼈 재건, 골형성부전, 용골성 골암, 파제트병, 내분비계 장애, 저인산혈증, 저칼슘혈증, 신성 골이영양증, 골연화증, 무력성 골 질환, 류마티스성 관절염, 부갑상선기능항진증, 원발성 부갑상선기능항진증, 이차 부갑상선기능항진증, 치주 질환, 고람-스타우트 질환 및 맥큔-알브라이트 증후군을 들 수 있다.
본원에 기재된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 및 약학적 조성물은 단독으로 또는 각각의 장애에 대해 공지된 임의의 요법 또는 활성 화합물과 함께 사용될 수 있다. 다른 곳에 기술된 바와 같이, 투여는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 일어날 수 있다.
세포가 이종성 (즉, 비자가, 비동종 또는 비동종이계) 공급원으로부터 유래되는 경우, 수반되는 면역 억제 요법은 전형적으로 예를 들어, 사이클로스포린 또는 타크롤리무스 (FK506)와 같은 면역억제제를 사용하여 투여될 수 있다.
투여할 세포의 양은 치료할 대상체에 따라 달라질 것이다. 바람직한 실시양태에서, 투여할 세포의 양은 102 내지 1010 또는 102 내지 109, 또는 103 내지 1010 또는 103 내지 109, 또는 104 내지 1010 또는 104 내지 109, 예컨대 104 내지 108, 또는 105 내지 107, 예를 들면, 예를 들면 약 1x105, 약 5x105, 약 1x106, 약 5x106, 약 1x107, 약 5x107, 약 1x108, 약 5x108, 약 1x109, 약 2x109, 약 3x109, 약 4x109, 약 5x109, 약 6x109, 약 7x109, 약 8x109, 약 9x109 또는 약 1x1010 세포가 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 체중 kg 당 106 내지 108 세포 또는 체중 kg 당 1x107 내지 9x107 세포, 예를 들어 체중 kg 당 약 1x107, 약 2x107, 약 3x107, 약 4x107, 약 5x107, 약 6x107, 약 7x107, 약 8x107, 약 9x107 또는 약 1x108 세포가 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포 수 또는 체중 kg 당 세포 수는 특히 대상체에게 투여되는 세포의 총 수를 지칭할 수 있으며, 투여는 하루 이상동안 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 일 이상) 하나 이상의 용량으로 적절하게 분배 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상의 용량으로 분배)될 수 있다. 그러나, 치료적 유효 용량의 정확한 결정은 환자의 크기, 연령, 조직 손상 크기 , 및 손상이 발생한 때로부터의 시간을 포함하여 각 환자에 대한 개별 인자에 기초할 수 있고, 본 개시 및 당 업계의 지식으로부터 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.
적합하게는, 투여될 약학적 조성물에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 약 104/ml 내지 약 109/ml, 바람직하게는 약 105/ml 내지 약 108/ml, 보다 더 바람직하게는 약 1x106/ml 내지 약 1x108/ml의 농도로 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 투여될 약학적 제형은 약 1x107 세포/ml 내지 약 1x108 세포/ml의 농도로 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 투여될 약학적 제형은 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 투여될 약학적 제형은 약 1x107 세포/ml 내지 약 1x108 세포/ml의 농도로 동결 보존 배지에 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 투여될 약학적 제형은 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 동결 보존 배지에 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 투여될 약학적 제형은 DMSO, HSA, 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란 또는 이들의 조합을 포함하는 동결 보존 배지에 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 1x107 개 세포/ml 및 약 1x108 세포/ml의 농도로 포함한다. 특정 실시양태에서, 투여될 약학적 제형은 DMSO, HSA, 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란 또는 이들의 조합을 포함하는 동결 보존 배지에서 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 포함한다.
본원에 교시된 방법, 용도 또는 세포 산물의 특정 실시양태에서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 예를 들어 투여될 약학적 제형에서 약 1x107 세포/ml 내지 약 1x108 세포/ml, 바람직하게는 약 2x107 세포/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 존재할 수 있다.
본원에 교시된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 감소된 세포 크기는 조정 가능하고/하거나 높은 세포 농도를 허용한다. 따라서, 조성물이 액체 조성물인 경우, MSC-유래 세포의 이식을 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 본원에 교시된 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 포함하는 조성물의 부피는 다른 방법으로 수득된 MSC-유래 세포를 포함하는 조성물의 부피보다 작다.
본 출원은 또한 다음 구현예에 기재된 측면 및 실시양태를 제공한다:
구현예 1. 다음을 포함하는, 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, 섬유아세포 성장 인자-2 (FGF-2), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 중간엽 줄기 세포 (MSC)-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계,
여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일 동안 배양되고, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 20%가 증식하는 마지막 날이다.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 약 8 일 내지 약 12 일 동안, 바람직하게는 약 10 일 동안 배양되는, 방법.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, MSC-유래 세포는 단계 (a)에서 약 13 일 내지 약 15 일 동안, 바람직하게는 약 14 일 동안 배양되는, 방법.
구현예 4. 구현예 1 내지 구현예 3 중 어느 하나에 있어서, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서 약 10 일 내지 약 14 일 동안, 바람직하게는 약 12 일 동안 배양되는, 방법.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 증식하는 MSC-유래 세포는 S 기, G2 기 또는 M기의 세포 주기에 있는, 방법.
구현예 6. 다음을 포함하는, MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계,
여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠, 바람직하게는 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅된다.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, MSC-유래 세포는 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도, 바람직하게는 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅되는, 방법.
구현예 8. 다음을 포함하는, MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법:
(a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(b) MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계;
(c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
(d) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 재현탁하는 단계; 및
(e) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하는 단계.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 단계 (d)에서 동결 보존 배지에 약 1x107/ml 내지 약 1x108/ml의 농도, 바람직하게는 약 2x107/ml 내지 약 4x107/ml의 농도로 재현탁되는, 방법.
구현예 10. 구현예 8 또는 9에 있어서, 동결 보존 배지는 디메틸설폭사이드 (DMSO), 인간 혈청 알부민 (HSA), 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, TGFβ는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되고; 바람직하게는 TGFβ는 TGFβ1인, 방법.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서,
- 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 농도는 약 0.1 IU/ml이고/이거나;
- 헤파린 또는 헤파린 유도체 또는 이의 유사체는 미분획 헤파린 (UFH); 저분자량 헤파린 (LMWH), 예컨대 에녹사파린, 달테파린, 나드로파린, 틴자파린, 세르토파린, 레비파린, 아르데파린, 파르나파린, 베미파린 또는 이들의 혼합물; 헤파리노이드, 예컨대 헤파린 설페이트, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 아카란 설페이트, 케라탄 설페이트, 또는 이들의 혼합물, 예컨대 다나파로이드; 헤파린 염; 헤파리노이드 염; 헤파린 단편; 헤파리노이드 단편; 및 이들의 혼합물으로 구성된 군에서 선택되는,
방법.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, MSC 또는 MSC-유래 세포는 추가로 접촉되고, 예를 들어 배지는 혈장, 혈청 또는 그의 대체물 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간 대상체 체인 방법.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단.
구현예 16. MSC의 시험관 내 또는 생체 외 확장에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단으로서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 90%는 직경이 25 μm 이하 (D90 ≤25 μm)이고, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 직경이 35 μm를 초과하는, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단.
구현예 17. 구현예 16에 있어서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 것인, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단.
구현예 18. 구현예 15 내지 17 중 어느 하나에 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 약학적 제형.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, 인산삼칼슘, 하이드록시아파타이트, 하이드록시아파타이트/인산삼칼슘 입자의 조합, 폴리-락트산, 폴리-락틱 글리콜산, 히알루론산 또는 이의 유도체, 키토산, 폴리-L-라이신, 젤라틴, 콜라겐, 오스테오넥틴, 피브리노겐, 오스테오칼신, 또는 이들의 조합과 같은 골전도 특성을 갖는 성분을 추가로 포함하는, 약학적 제형.
구현예 20. 의약으로서, 바람직하게는 연골-골모세포 계통의 세포의 이식이 필요한 대상체의 치료에 사용하기 위한, 구현예 15 내지 17 중 어느 하나에 따른 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 구현예 18 내지 19에 따른 약학적 제형의 용도.
구현예 21.
- 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포는 약 1x107/ml 내지 약 1x108/ml, 바람직하게는 약 2x107/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 존재하고/하거나;
- 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 또는 약학적 제형은 경피, 골내, 관절 내, 추간 또는 혈관 내 투여에 적합하고;
- 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 또는 약학적 제형은 골 결손 부위에 투여하기에 적합한,
구현예 20에 따라 사용하기 위한 집단 또는 약학적 제형.
본 발명이 특정 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 전술한 설명에 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 이어지는 청구범위의 사상 및 넓은 범위에 이러한 모든 대안, 수정 및 변형이 포함되도록 의도된다.
본원에 개시된 본 발명의 측면 및 실시양태가 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 뒷받침된다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 일 실시양태에 따른 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법
5% OctaPlasLG® (Octapharma), 0.1 UI/ml 헤파린 (LEO Pharma), FGF-b (CellGenix) 및 TGFβ-1 (Humanzyme)이 보충된 종래 배양 배지를 배양 배지로 사용하였다.
건강한 자원자 기증자의 장골릉으로부터 인간 골수 (BM) 흡인물 20 내지 60 ml를 채취하였다. 채취 후, 골수 백혈구를 계수하고, 배양 배지에 50,000 세포/㎠의 밀도로 파종하고 5% CO2가 함유된 가습 배양기에서 37 ℃에서 배양하였다. 세포 파종 4 일 후, 비부착 세포를 제거하고 배지를 배양 배지로 교체하였다. 파종 7 일 및 11 일 후, 배양 배지의 절반을 제거하고 성장 인자 재생을 위해 새로운 배지로 교체하였다. 세포를 1 차 배양 동안 14 일 동안 배양하였다. 14 일째에 Trypzean (Lonza)으로 분리하고 와동 및 위아래로 피펫팅하여 세포를 수확하였다 (계대 1: P1). 중간 세포를 동결 보존 (CryoStor® CS10)하고 액체 질소에 보관하였다. 각 세포 스톡은 기증자 간에 풀링없이 한 기증자로부터 유래되었다.
다음으로, 중간 세포를 해동하고 2 차 배양을 위해 572 세포/㎠의 밀도로 재플레이팅하였다. 세포를 2 차 배양 동안 10 일에 걸쳐 배양하였다. 24 일째에, Trypzean (Lonza)으로 분리하고 와동 및 위아래로 피펫팅하여 세포를 수확하였다 (계대 2: P2). 중간 세포를 동결 보존 (CryoStor® CS10)하고 액체 질소에 보관하였다.
그 후, 중간 세포를 해동하고 3 차 배양을 위해 572 세포/㎠의 밀도로 재플레이팅하였다. 세포를 3 차 배양 동안 10 일에 걸쳐 배양하였다. 34 일째에 Trypzean (Lonza)으로 분리하고 와동 및 위아래로 피펫팅하여 세포를 수확하였다 (계대 3: P3). 세포를 25x106 세포/ml의 최종 농도로 OctaPlasLG®에 재현탁시켜 최종 세포 산물을 얻었다. 이 세포 산물은 본원에서 "세포 산물 C - 신선"으로 지칭될 것이다.
3 차 배양이 종료되면 세포를 장기간 보관을 위해 동결 보존하였다. 여기에서는, 세포를 원하는 농도 (25x106 세포/ml)에 도달하도록 동결 보존 배지에 재현탁하였다. 그 다음 세포 현탁액을 액체 질소에 저장된 냉동 튜브로 옮겼다. 이 세포 산물은 본원에서 "세포 산물 C - cryo" 또는 "(보존된) 뼈 형성 세포 C cryo"로 지칭될 것이며 "B-F 세포 C"라고도 약칭된다. 동결 보존 배지는 다음과 같다:
- CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.), 또는
- 50% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) 및 50% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma), 또는
- 95% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) 및 5% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma), 또는
- 80% (v/v) Hypothermosol® (BioLife Solutions Inc.), 10% (v/v) DMSO, 및 10% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma).
비교예 1: 중간엽 줄기 세포 및 MSC-유래 세포를 얻기 위한 선행 기술 방법
종래 기술에 따른 비교 세포 산물 및 그 제조 방법은 다음과 같다.
중간엽 줄기 세포
건강한 지원자 기증자의 장골능으로부터 인간 골수 (BM) 흡인물을 얻어 미분화 MSC를 준비하였다. 채취 후 골수 백혈구를 계수하고 통상적인 배양액에 50,000 세포/㎠의 밀도로 파종하고 5% CO2가 함유된 가습 배양기에서 37 ℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 배양 배지를 제거하고 신선한 세포 배양 배지를 첨가하였다. 배양 배지를 2-3 일마다 교체하였다. 콜로니의 절반 이상이 80%의 합류점에 도달하거나 일부 콜로니가 100%의 합류점에 도달하면 세포를 수확하였다 (계대 1: P1). 이 1차 계대에서 세포를 CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.)에서 직접 동결 보존하였다. 배양 과정을 완료하기 위해 MSC를 해동하고 2 차 배양을 위해 572 세포/㎠로 플레이팅하고 배양하였다. 콜로니의 절반 이상이 80%의 합류점에 도달하거나 일부 콜로니가 100%의 합류점에 도달했을 때 세포를 수확하여 계대 2 (P2)에서의 MSC를 얻었다. 이 세포 산물은 본원에서 "MSC"로 지칭된다.
세포 산물 A
5% Octaserum (50:50 자가 혈청 및 OctaPlasLG® (Octapharma)), FGF-b (CellGenix) 및 TGFβ-1 (Humanzyme)이 보충된 기존 배양 배지를 배양 배지로 사용하였다.
동결 배지: 80% 기존 배양 배지, 10% Octaserum (50:50 자가 혈청 및 OctaPlasLG® (Octapharma)), 10% DMSO.
건강한 지원자 기증자의 장골릉으로부터 인간 BM 흡인물을 얻어 본원에서 "세포 산물 A"로 지칭되는 시험관 내 분화된 MSC-유래 세포를 준비하였다. 채취 후 골수 백혈구를 계수하고 배양액에 50,000 세포/㎠의 밀도로 파종하고 5% CO2가 함유된 가습 배양기에서 37 ℃에서 배양하였다. 세포 파종 4 일 후, 비부착 세포를 제거하고 배지를 배양 배지로 교체하였다. 파종 7 일 및 11 일 후, 배양 배지의 절반을 제거하고 새로운 배지로 교체하였다. 세포를 1 차 배양 동안 14 일에 걸쳐 배양하였다. 14 일째에 Trypzean (Lonza)으로 분리하고 와동 및 위아래로 피펫팅하여 세포를 수확하였다 (계대 1: P1). 중간 세포를 CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) 또는 동결 배지에 동결 보존하고 액체 질소에 보관하였다.
2 차 배양을 위해 세포를 해동하고 1144 세포/㎠의 밀도로 재플레이팅하였다. 세포를 2 차 배양 동안 14 일에 걸쳐 배양하였다. 28 일째에 Trypzean (Lonza)으로 분리하고 와동 및 위아래로 피펫팅하여 세포를 수확하였다 (계대 2: P2). 세포를 25x106 세포/ml의 최종 농도로 OctaPlasLG®에 재현탁하여 최종 세포 산물을 얻었다. 이 세포 산물은 본원에서 "세포 산물 A"로 지칭된다.
세포 산물 B
5% OctaPlasLG® (Octapharma), 0.1 UI/ml 헤파린 (LEO Pharma), FGF-b (CellGenix) 및 TGFβ-1 (Humanzyme)이 보충된 기존 배양 배지를 배양 배지로 사용하였다.
건강한 지원자 기증자의 장골릉으로부터 인간 BM 흡인물을 얻어 시험관 내 분화 MSC-유래 세포를 준비하였다. 채취 후 골수 백혈구를 계수하고 배양 배지에 50,000 세포/㎠의 밀도로 파종하고 5% CO2가 함유된 가습 배양기에서 37 ℃에서 배양하였다. 세포 파종 4 일 후, 비부착 세포를 제거하고 배지를 배양 배지로 교체하였다. 파종 7 일 11 일 후, 배양 배지의 절반을 제거하고 새로운 배지로 교체하여 성장 인자를 재생시켰다. 세포를 1 차 배양 동안 14 일에 걸쳐 배양하였다. 14 일째에 Trypzean (Lonza)으로 분리하고 와동 및 위아래로 피펫팅하여 세포를 수확하였다 (계대 1: P1). 중간 세포를 CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.)에 동결 보존하고 액체 질소에 보관하였다.
다음으로, 중간 세포를 해동하고 2 차 배양을 위해 286 세포/㎠의 밀도로 재플레이팅하였다. 세포를 2 차 배양 동안 14 일에 걸쳐 배양하였다. 28 일째에 Trypzean (Lonza)으로 분리하고 와동 및 위아래로 피펫팅하여 세포를 수확하였다 (계대 2: P2). 세포를 25x106 세포/ml의 최종 농도로 OctaPlasLG®에 재현탁하여 최종 세포 산물을 얻었다. 이 세포 산물은 본원에서 "세포 산물 B"로 지칭된다.
실시예 2: 본 발명의 실시양태에 따른 방법에 의해 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 및 선행 기술 방법에 의해 수득된 MSC 및 MSC-유래 세포의 시험관 내 세포 특성화
재료 및 방법
세포
본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 신선한 세포 산물 C 및 동결 보존된 세포 산물 C)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다. 비교 세포 산물 (즉, MSC, 세포 산물 A 및 세포 산물 B)은 비교예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다.
세포 계수 및 생존성
트리판 블루 배제 분석을 사용하여 세포 밀도 및 생존성을 결정하였다. 수확 후, 세포를 트리판 블루 (0.4%, Lonza BioWhittaker®)로 1:2로 희석하고, 뷔르커 (Buerker) 챔버 (Surma-Aldrich®) 및 도립 현미경 (AE31, Motic®)을 사용하여 세포 생존성을 분석하였다. 또, 아미노-액티노마이신 D (7-AAD, BD Biosciences®), BD FACSCanto II™ 및 BD FACSDiva™ 소프트웨어 (Becton Dickinson®)를 사용하여 유세포 분석법에 의해 세포 생존성을 분석하였다. 수확 후, 50,000 세포를 2.5 ㎕의 7-AAD와 함께 임산염 완충 염수 (PBS) - 1% 소 혈청 알부민 (BSA) (Lonza BioWhittaker®)에서 실온에서 10 분 동안 암실에서 인큐베이션하였다.
유세포 분석
상기 비교예 1 및 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된 비교 세포 산물 (즉, MSC 및 MSC-유래 세포: 세포 산물 A 및 B) 및 본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포: 세포 산물 C)을 수확하고, 세포 표면 마커를 유세포 분석법 (BD FACSCanto II™ 및 BD FACSDiva™ 소프트웨어; Becton Dickinson)에 의해 분석하였다. 세포를 다음의 접합된 모노클로날 항체: 항-CD73, 항-CD90, 항-CD105 및 항-CD166 (중간엽 마커이며, MSC 또는 MSC-유래 세포에 의해 고도로 발현되어야 함), 항-CD3, 항-CD34 및 항-CD45 (조혈 마커이고, MSC 또는 MSC-유래 세포에는 실질적으로 없어야 함), 항-CD44, 항-CD51/61, 항-CD49a-e, 항-CD29 (부착성 마커임), 항-CD40, 항-CD86 및 항-HLA-DR (면역원성 마커임) 및 항-알칼리 포스파타제 (ALP)와 실온에서 15 분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 세척하고, 원심분리후 0.3 ml PBS에 재현탁시켰다.
세포 표면 마커 CD105, CD73, CD10 및 CD44의 특성 분석을 위해, PBS - 1% BSA 중 1x106 세포/ml의 농도에서 5x104 개의 세포를 5 ㎕의 항체와 함께 암실에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 시간 후, 세포를 PBS로 1 회 세척하였다. 세포 외 염색에 사용된 상이한 항체는 다음과 같다: CD105 (BD Biosciences®, Cat No: 562408), CD73 (BD Biosciences®, Cat No: 560847)에 대해 알로피코시아닌 (APC)-접합 항체, CD10 (BD Biosciences®, Cat No: 555375), CD44 (BD Biosciences®, Cat No: 550989)에 대해 피코에리트린 (PE)-접합 항체. 세포를 FITC, APC 및 PE와 접합된 면역글로불린 G (IgG) 대조군 (각각 BD Biosciences®, Cat No: 556649; 555751; 556650)과 인큐베이션하여 비특이적 염색을 결정하였다. 분석 전에, 싱글릿 및 관심 집단의 게이팅을 수행하였다. FACSCantoTM II (BD Biosciences®) 및 FACSDiva® 8.0 소프트웨어 (BD Biosciences®)를 사용하여 1x104 이벤트의 게이트 집단에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 설정 파라미터는 비드 (BD CompBeads Plus®, Cat No 560497)로 자동 수행되었다. 각 접합체에 대해, 양성 컷오프를 대조군 동형 항체 양성의 1%로 고정하고, 각 마커의 양성을 결정하였다. 전체 분석된 집단의 형광 강도의 중앙값 (MFI)을 또한 결정하고 상응하는 동형 대조군 항체의 MFI로 나눠 정규화된 MFI (nMFI)를 얻었다.
실시예에 사용된 항체의 공급업체 및 카탈로그 번호 요약
항체 공급업체 카탈로그 번호
항-ALP BD Biosciences 561433
항-CD166 BD Biosciences 560903
항-CD3 BD Biosciences 555340
항-CD34 BD Biosciences 555824
항-CD40 BD Biosciences 555588
항-CD44 BD Biosciences 550989
항-CD45 BD Biosciences 555485
항-CD49a BD Biosciences 559596
항-CD49b BD Biosciences 555669
항-CD49c BD Biosciences 556025
항-CD49d BD Biosciences 555503
항-CD49e BD Biosciences 555617
항-CD51/61 BD Biosciences 550037
항-CD73 BD Biosciences 561254
항-CD29 BD Biosciences 556048
항-CD86 BD Biosciences 555660
항-CD90 R&D System FAB7335P
항-HLA-DR BD Biosciences 555558
항-CD105 BD Biosciences 562408
항-CD10 BD Biosciences 555375
항-HLA-DR-DP-DQ BD Biosciences 555558
항-HLA-ABC BD Biosciences 555552
ALP 효소 활성 측정
p-니트로페닐 포스페이트 (pNPP)의 가수 분해에 기초한 생화학적 분석에 의해 ALP 효소 활성을 측정하였다. ALP에 의해 탈인산화 후, pNPP는 황색이 되고 410 nm에서 분광광도계에 의해 검출될 수 있다. 세포의 ALP 효소 활성을 정제된 송아지 장 ALP 활성에 기초한 표준 곡선에 대해 결정하였다. ALP 활성은 ALP/단백질 mg 단위로 보고되었다. 1 단위의 ALP는 37 ℃에서 1 분 후에 1 ㎛ol의 pNPP를 가수분해한다.
역전사 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR)
수확 후, 세포를 RNA 추출까지 건조 펠렛 (500,000 세포)으로서 -80 ℃에서 보관하였다. 제조업체의 지침에 따라 RNeasy® Mini 키트 (Qiagen®)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. RNA 농도를 DropSense® 16 (Trinean®)을 사용하여 측정하였다. 제조업체의 지침에 따라 PrimeScript® RT 시약 키트 (Takara®)를 사용하여 전체 RNA 추출물 1 ㎍으로부터 RNA 역전사 (RT)를 수행하였다. qPCR은 제조업체의 지시에 따라 2 ㎕ cDNA에서 Premix Ex Taq® (Takara®)를 사용하여 수행되었다. 하기 관심 유전자의 발현 수준을 정량화하였다: RUNX2 (정방향: GGTTCCAGCAGGTAGCTGAG (서열 번호 1), 역방향: AGACACCAAACTCCACAGCC (서열 번호 2)), SOX9 (F: TAAAGGCAACTCGTACCCAA (서열 번호 3), R: ATTCTCCATCATCCTCCACG (서열 번호 4), BMP2 (F: GGAACGGACATTCGGTCCTT (서열 번호 5), R: CACCATGGTCGACCTTTAGGA (서열 번호 6)), ALPL (F: ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG (서열 번호 7), R: AGACATTCTCTCGTTCACCGCC (서열 번호 8)), MMP13 (F: TGGAATTAAGGAGCATGGCGA (서열 번호 9), R: AACTCATGCGCAGCAACAAG (서열 번호 10)), CHI3L1 (F: TGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGA (서열 번호 11), R: GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA (서열 번호 12)), DCN (F: AAAATGCCCAAAACTCTTCAGG (서열 번호 13), R: GCCCCATTTTCAATTCCTGAG (서열 번호 14)), OCN (F: AAGGTGCAGCCTTTGTGT (서열 번호 15), R: GCTCCCAGCCATTGATACAG (서열 번호 16)), SPON1 (F: CCTGCGGAACTGCCAAGTA (서열 번호 17), R: CACGGGTGAGCCCAATTCT (서열 번호 18)), POSTN (F: TTTGGGCACCAAAAAGAAAT (서열 번호 19), R: TTCTCATATAACCAGGGCAACA (서열 번호 20)). qPCR은 LightCycler® 480 (Roche®)을 사용하여 중복 실행되었다. 다음 세 하우스키핑 유전자로부터 얻은 기하 평균을 사용하여 정규화를 수행하였다: RPL13A (F:CATAGGAAGCTGGGAGCAAG (서열 번호 21), R:GCCCTCCAATCAGTCTTCTG (서열 번호 22)), TBP (F:AACAACAGCCTGCCACCTTA (서열 번호 23), R:GCCATAAGGCATCATTGGAC (서열 번호 24)), HPRT (F:CCCTGGCGTCGTGATTAGT (서열 번호 25), R: GTGATGGCCTCCCATCTCCTT (서열 번호 26)). 관심있는 각각의 유전자에 대해 2-△△Ct 방법을 사용하여 유전자 발현 (배수 변화)을 계산함으로써 동일한 기증자로부터의 상이한 MSC-유래 세포 산물 간 비교를 수행하였다 (Schmittgen and Livak, 2008, 3(6), 1101-8; Nature Protocols, 3(6), 1101-1108).
JMP® (13.1.0) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 배수 변화로 표현된 RT-qPCR 데이터를 로그 변환시키고, 스튜던트 검정 (α = 0.05로)을 수행하여 세포 유형 사이에서 관찰된 차이의 통계적 유의성을 평가하였다. 통계적 유의성을 얻은 p-값 (p)에 따라 그래프로 나타내었다: p <0.05에 대해 *, p <0.01에 대해 **, p <0.001에 대해 ***.
멀티플렉스 분석
수확 후, 세포를 50,000 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하였다. 5% CO2를 함유 한 가습된 분위기에서 37 ℃에서 48 시간 인큐베이션 후, 세포 배양 상등액을 수거하고 원심분리 (실온에서 1500 rpm으로 5 분)한 후 -80 ℃에서 저장하였다. 상등액을 Human Magnetic Luminex® Assays (R&D System®)를 사용하여 Luminex® 분석으로 분석하였다. 사전 혼합된 멀티플렉스는 주문제조되었다 (R&D System®). 다음 분비 인자를 조사하였다: BMP-2, COL1A1, MMP13, OPN, OPG, SPARC, RANKL, CHI3L. 제조업체의 지시에 따라 분석을 수행하였고, 분석은 MAGPIX® (R&D System®) 및 Bio-Plex Manager 5.0TM 소프트웨어 (Bio-Rad®)를 사용하여 수행하였다.
세포 크기 측정
비교예 1 및 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된 비교 세포 산물 (즉, MSC 및 MSC-유래 세포: 세포 산물 A 및 B) 및 본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포: 세포 산물 C) 를 수확하고 12.5x106 세포/ml의 세포 밀도로 0.4% 트리판 블루와 PBS에 현탁시켰다. 10 ㎕의 세포 현탁액을 눈금 슬라이드 (Motic®)에 놓고 커버슬립 (coverslip)으로 보호하여 40X 배율 (AE31; Motic)의 도립 현미경 하에 놓았다. 현미경에 배치된 카메라 (Moticam, Motic®)로 촬영한 이미지를 세포 직경을 측정하기 위해 Motic Image Plus® 2.02 소프트웨어로 분석하였다. 분석이 통계적으로 유의하도록 적어도 100 개의 세포를 측정하였다.
상이한 시간의 생체 외 배양물에서 수득된 세포의 크기를 또한 유세포 측정법 (BD FACSCanto™ II 및 BD FACSDiva™ 소프트웨어; Becton Dickinson)으로 분석하였다. 간략하게, 실시예 1 또는 비교예 1에 기술된 생체 외 세포 배양의 개시 후 21, 23, 26 및 28 일에, 세포를 수확하고, ml 당 1x106 세포의 세포 밀도로 인산염 완충 염수 (PBS)에 현탁시키고 전방 산란 (FSC) 측정용 유세포 분석기로 분석하였다 (상대 형광 단위로 표시). 전방 산란은 레이저 경로의 방향으로 산란된 광을 측정하므로 유동 챔버를 통과하는 셀에 대한 상대 크기를 제공한다.
결과
배양물 수율
본 발명을 나타내는 방법은 전체적인 배양 수율이 현저히 증가함에 따라 임상 사용을 위한 동종이계 세포 가용성 (즉, 하나의 골수 기증으로부터 얻은 세포의 수)을 상당히 증가시켰다 (표 2, 신선한 세포 산물 C 대 세포 산물 A 및 B).
비교 세포 산물 (즉, 세포 산물 A, 세포 산물 B) 및 본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 세포 산물 C)의 각 배양 수율
세포 산물 A 세포 산물 B 신선한 세포 산물 C
1 차 배양 수율 63±168%
(n=93)		 139±91%
(n= 57)		 212±74% (n= 6)
2 차 배양 수율
(14 일에 1차 계대)		 1,656±1,126%
(n=183)		 25,254±7,547%
(n= 41) 		17,837±5,973% (n=6)
3 차 배양 수율 NA NA 10,641%±4,295 (n=6)
전체 수율* 1,068±2,353%
(n=183)		 46,768±33,201%
(n= 41)		 5,145,960±6,103,554%
(n=6)
누적 (이론상) PDL
(D0에서 제조 공정 끝까지)		 16±2 22±2 28±1
평균±SD, 기증자 효과로 인한 가변성을 포함하는 배치 간의 가변성 (골수 출발 물질 간의 가변성) 고려. PDL: 집단 배가 수준은 세포 수가 배가되는 횟수이다. * 전체 수율은 모든 연속 배양물로부터의 배양 수율의 누적을 고려한다 (0 일째의 세포 플레이팅부터 제조 공정 종료 및 MSC-유래 세포 생성까지). NA: 해당 없음
세포 마커 발현 프로파일
유세포 분석법에 의한 분석에 따라 세포 산물 A, 세포 산물 B (종래 기술에 따른 비교 방법으로 생성됨) 및 최종 동결 보존 존재 또는 부재 세포 산물 C (본 발명을 나타내는 방법으로 생성됨)의 세포 표면 마커 발현 프로파일을 기반으로 한 일반적인 세포 정체성은 비슷했다.
이들 모두 중간엽 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 조혈 마커 CD45, CD34 및 CD3을 발현하지 않았다 (세포 집단의 5% 미만이 이들 마커를 발현함) (표 3). 세포 산물 B 및 세포 산물 C (최종 동결 보존 존재 또는 부재)는 (i) 낮은 수준의 HLA-DR과 같은 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체를 발현하고 (ii) ALP를 고도로 발현하였다 (표 3 및 4). HLA-DR의 약한 발현으로 제시되는 약한 면역원성은 유리하게는 동종이계 대상체에게 세포 이식을 허용한다 (표 3). 또한 세포 산물 A, 세포 산물 B 및 세포 산물 C는 (최종 동결 보존 존재 또는 부재)는 미분화 MSC와 비교하여 표면에서 부착 마커 CD49e 및 효소 ALP를 고도로 발현하였다 (표 3 및 4). ALP의 높은 발현은 세포 산물 A, 세포 산물 B 및 세포 산물 C (최종 동결 보존 존재 또는 부재)에 대한 골모세포 계통으로의 투입을 강조한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
비교 세포 산물 (즉, MSC, 세포 산물 A, 세포 산물 B) 및 본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 세포 생성물 C)의 ALP 발현 수준
통계 MSCs 세포
산물 A 		세포
산물 B 		신선한 세포
산물 C 		세포 산물 C 동결 보존 (동결 보존된 세포 산물 C라고도 함)
CS10 CS10 희석된 HSA 1:1 CS10 5%HSA HTS 10%DMSO 10%HSA
ALP-PE 집단 양성(%) 평균 40.7 88.7 94.8 96.2 96.2 98.7 97.7 98.4
표준 편차 　 5.6 6.6 4.4 3.6 0.9 2.0 1.7
N 1 5 10 18 10 2 3 3
ALP-PE 세포 표면 발현
수준 (nMFI) 		평균 2.4 19.8 56.1 60.3 38.0 57.7 42.7 41.2
표준 편차 　 10.8 27.4 38.9 24.2 43.1 37.2 31.3
N 1 5 10 18 10 2 3 3
ALP 효소
활성 (mU/총 단백질 mg) 		평균 176.3 671.9 874.7 895.5 801.5 ND 719.9 633.6
표준 편차 252.9 305.8 772.9 387.3 351.3 277.0 263.9
N 3 9 26 12 5 0 2 2
약어: ALP: 알칼리성 포스파타제; ND: 결정되지 않음; PE: 피코에리트린
세포 표면 상에 마커의 존재 (집단 양성 백분율)뿐만 아니라 상이한 마커의 세포 표면 상에 발현된 마커의 양 (집단 정규화 형광 중앙값)을 분석하여 세포 표면 마커 발현 프로파일을 특성화하였다. 이러한 분석은 상이한 MSC-유래 골 형성 세포 간의 일부 차이를 강조하였다.
헤파린 존재하에 배양된 세포 산물 B 및 세포 산물 C (최종 동결 보존 존재 또는 부재)는 헤파린 부재하에 배양된 MSC 및 세포 산물 A (ALP-PE nMFI 결과)보다 더 높은 수준의 ALP를 발현하여 뼈 형성 세포의 골모세포 계통에 대한 그들의 투입을 입증한다.
세포 표면에서 중간엽 마커 CD73 및 CD105의 발현도 세포 유형에 따라 달라졌다. 헤파린 존재하에 생성된 세포 산물 (세포 산물 B 및 최종 동결 보존 존재 또는 부재 세포 산물 C)은 세포 산물 A보다 더 높은 수준의 CD73 및 CD105를 발현하였다. 또한 세포 산물 C는 특히 세포 산물 C가 최종 동결 보존을 거치지 않은 경우 세포 산물 B보다 표면에 더 많은 CD73 및 CD105를 보유하는 것으로 나타났다 (표 5). 분화된 세포 산물 A, B 및 C는 미분화 MSC보다 더 많은 양의 세포 마커 CD10을 발현한다. 또한 세포 산물 C는 세포 산물 A 및 B보다 표면에 더 많은 CD10을 보유한다 (표 5).
nMFI 유세포 분석법에 의한 분석은 CD73 및 CD44 단백질 발현이 다른 세포 유형에서보다 세포 산물 C에서 더 많이 증가했음을 보여주었다 (도 1).
비교 세포 산물 (즉, MSC, 세포 산물 A, 세포 산물 B) 및 본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 세포 산물 C)의 추가 세포 표면 마커 발현 결과
마커
발현
(nMFI) 		통계 MSCs 세포
산물 A 		세포
산물 B 		신선한 세포
산물 C 		세포 산물 C 동결 보존 (동결 보존된
세포 산물 C라고도 함)
CS10 CS10 희석된 HSA 1:1 CS10 5%HSA HTS 10%DMSO 10%HSA
ALP-PE 평균 2.4 19.8 56.1 60.3 38.0 57.7 42.7 41.2
표준 편차 　/ 10.8 27.4 38.9 24.2 43.1 37.2 31.3
N 1 5 10 18 10 2 3 3
CD73-APC 평균 234.8 130.7 646.3 996.9 703.9 777.8 719.2 784.2
표준 편차 84.3 80.1 138.8 181.1 150.0 73.3 90.6 47.3
N 6 11 22 15 10 2 3 3
CD105-APC 평균 207.7 26.6 59.1 99.7 70.2 74.6 72.6 67.0
표준 편차 67.6 15.2 13.1 27.0 13.1 2.3 4.2 3.9
N 8 12 20 18 10 2 3 3
CD44-PE 평균 139.8 62.0 156.6 362.8 378.4 185.5 227.5 261.3
표준 편차 57.5 19.1 40.7 250.4 205.3 19.6 80.1 147.7
N 8 12 22 18 10 2 3 3
CD49e-PE 평균 81.0 22.5 33.5 44.3 39.6 35.7 35.2 36.87
표준 편차 51.4 9.9 11.0 8.0 7.4 3.3 3.5 10.0
N 8 12 19 18 10 2 3 3
HLA-ABC-FITC 평균 26.1 21.6 80.2 115.7 104.7 71.5 79.5 70.1
표준 편차 　/ 5.2 17.4 22.0 24.9 27.2 22.1 18.0
N 1 4 8 16 10 2 3 3
CD10-PE 평균 0.8 36.2 32.2 64.0 59.3 63.8 64.1 57.9
표준 편차 1.1 16.4 16.8 38.5 30.5 45.5 35.4 32.9
N 8 12 22 18 10 2 3 3
약어: ALP: 알칼리성 포스파타제; APC: 알로피코시아닌; FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트; HLA-ABC: 인간 백혈구 항원 ABC; HLA-DR: 인간 백혈구 항원 - DR 동형; MSC: 중간엽 줄기 세포; NA: 해당 없음. ND: 결정되지 않음; PE: 피코에리트린; SD: 표준 편차
RT-qPCR 및 멀티플렉스 분석
분석 결과 신선한 세포 산물 C에서 유전자 RUNX2가 MSC에 비해 유의하게 (*) 과발현되었지만 세포 산물 B에 비해서는 유의하게 (*) 하향 조절된 것으로 나타났다 (표 6a). 신선한 세포 산물 C의 MMP13 유전자는 MSC 및 세포 산물 A에 비해 유의하게 (*) 상향 조절되었지만 그 발현은 세포 산물 B에서 유의하게 (*) 높게 유지되었다 (표 6a).
반면에, 유전자 SPARC 및 KI67은 다른 모든 세포 유형에 비해 신선한 세포 산물 C에서 유의하게 (**) 하향 조절되었다 (표 6a). 유전자 PPARG는 신선한 세포 산물 C 및 MSC에 대해 동일하게 발현되었고 세포 산물 A 및 B에 비해 유의하게 (***) 하향 조절되었다 (표 6a).
또한, 동결 보존된 세포 산물 C에서 유전자 BMP2, SOX9, MMP13 및 ALPL은 MSC에 비해 유의하게 과발현되어 (표 6b) 연골-골모세포 계통에 대한 관여를 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
세포 크기
(i) Motic Image Plus® 2.0 소프트웨어 및 (ii) 유세포 분석법 FSC 분석을 사용한 세포 크기 측정에 의해 세포 산물 B, 신선한 세포 산물 C 및 동결 보존된 세포 산물 C가 세포 산물 A보다 작고 더 균질한 것으로 확인되었다 (표 7, 도 2).
매우 흥미롭게도, 대부분의 세포 산물 C (적어도 90%)는 직경이 25 μm를 초과하지 않았고 이중 1% 미만이 직경이 35 μm를 초과하였다. 대조적으로, 세포 산물 A는 직경 25 μm를 초과하지 않는 세포가 불과 35.4%, 직경이 35 μm를 초과하는 세포는 26.9%였다 (표 8, 도 2). 세포 산물 B는 직경 25 μm를 초과하지 않는 세포 73.7%와 직경이 35 μm보다 큰 세포 3.3%를 포함하였다 (표 8, 도 2).
비교 세포 산물 (즉, MSC, 세포 산물 A, 세포 산물 B) 및 본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 세포 산물 C)의 직경
세포 직경 (μm) 평균±SD Min - max N
MSCs 19.2±4.8 9.8 - 41.8 450
세포 산물 A 30.2±9.9 11.4 - 67 1205
세포 산물 B 22.4±6.4 7.9 - 74.5 1744
세포 산물 C - 신선 17.6±7.3 7.3 - 44.3 2238
세포 산물 C cryo CS10 17.9±4.8 9.1 - 53.8 876
세포 산물 C cryo CS10 희석된 HSA 1:1 18.3±3.9 10.9 - 33.8 209
세포 산물 cryo CS10 5% HSA 18.7±4.3 11.2 - 35.7 339
세포 산물 C cryo
HTS 10%HSA 10%DMSO 		19.7±3.5 12.9 - 31.4 361
비교 세포 산물 (즉, MSC, 세포 산물 A, 세포 산물 B) 및 본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 세포 산물 C)의 세포 크기 분포
다음 직경의 세포 ≥ 25 μm > 35 μm
MSCs 89.9% 1.3%
세포 산물 A 35.4% 26.9%
세포 산물 B 73.7% 3.3%
세포 산물 C - 신선 94.6% 0.9%
세포 산물 C cryo CS10 91.3% 0.3%
세포 산물 C cryo CS10 희석된 HSA 1:1 94.3% 0.0%
세포 산물 cryo CS10 5% HSA 92.3% 0.3%
세포 산물 C cryo
HTS 10%HSA 10%DMSO 		92.0% 0.0%
실시예 3: 실시예 1의 방법으로 얻은 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 생체 내 뼈 형성
재료 및 방법
세포
본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 동결 보존된 세포 산물 C)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다.
마우스
10-11 주령의 암컷 NMRI-누드 (nu/nu) 마우스를 Janvier S.A.S. (Le Genest-St-Isle France)에서 구입하고, 음식과 물을 자유롭게 섭취하도록 하면서 표준 조건에 수용하였다.
두개관 골 형성 마우스 모델
12 주령 암컷 NMRI-누드 (nu/nu) 마우스를 이소플루란 (IsoFlo®)으로 마취시키고, 동결 보존된 세포 산물 C (마우스 당 100 ㎕에 2.5 x 106 개 세포) 또는 부형제 (100 ㎕)를 두개관 뼈 위에 단일 피하 투여하였다. 경시적인 골 신 형성을 표지하기 위해, 칼슘-결합 플루오로크롬을 마우스에 순차적으로 투여하였다. 알리자린 레드 (적색), 칼세인 (녹색 및 청색) 및 테트라사이클린 (황색) (모두 Sigma-Aldrich® 제품)을 각각 세포 투여 2 또는 3 일 전 및 5 일, 12 일 및 19 일 후에 복강 내 주사하였다. 투여 후 4 주 동안 실험 동물의 체중, 일반적인 임상 징후 및 투여 부위에서의 임상 징후를 모니터링하였다. 세포 투여 4 주 후, 경부 탈구시켜 마우스를 안락사시키고, 각 마우스의 두개관을 수확하여 X-선 영상화, 조직 형태 계측 (골 형성의 정량화) 및 면역형광법에 의해 골 형성 세포의 골 형성 특성을 평가하였다.
X-선 분석에 의한 뼈 형성 정량화
안락사 후, Faxitron® MX-20 장치를 사용하여 나란히 놓인 각 마우스의 두개골에 대한 생체 외 X-선 영상화를 수행하였다. 디지털 이미지는 전압을 35kV, 노출 시간을 4.8 초로, 밝기/대비를 8300/6000으로 설정하여 수동 모드에서 1.5X 배율로 촬영하였다. 생성된 X-선 이미지는 0 (검은색 영역)에서 255 (흰색 영역) 범위의 회색 강도값을 가진 회색 수준 이미지이며 방사선 불투명도 및 따라서 뼈의 불투명도 또는 뼈 두께에 정비례한다. 두정골 (수동 선택)에서 뼈 형성 골유도 부분 (선택에서 폐기된 광물화된 결절)의 회색 수준 강도값을 AdobePhotoshop® 소프트웨어의 히스토그램 도구를 사용하여 분석하였다.
광물화된 결절의 표면을 정량화하는 데 X-선 영상화 및 AdobePhotoshop® 소프트웨어가 또한 사용되었다 (수동 선택).
샘플 포매 및 조직학적 절편화
조직 형태 측정, ALP, TRAP (타르트레이트 내성 산 포스파타제), Masson Trichrome Goldner 염색 및 면역형광법을 위해, 두개관을 고정하고 4 ℃에서 12 시간 동안 70%, 80% 및 90% 에탄올 조에서 온화한 진탕 하에 연속 인큐베이션으로 탈수시키고, 하이드록시에틸메타크릴레이트 (HEMA) 플라스틱 수지 (HistoResin, Leica®)에 포매시켰다. 마이크로톰 (Leica®, RM2255)을 사용하여 4 ㎛ 두께 및 8 ㎛ 두께의 관상 절편을 절단하였다.
면역형광 염색
두개관의 4 ㎛ 두께의 관상 플라스틱 조직학적 절편에서 면역형광에 의한 인간 및 뮤린 콜라겐 I의 평가를 수행하였다. 간략하게, 실온 (RT)에서 30 분 동안 PBS 1X/트리톤 0.3%의 용액을 사용한 투과 단계 후, 조직학적 절편을 차단 용액 (즉, PBS/BSA/말 혈청/TritonTM)에서 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 포화시켰다. 이어서, 조직학적 슬라이드를 마우스 항-인간 및 토끼 항-뮤린 콜라겐 I 일차 항체 (각각 Abcam; #ab138492 및 Abcam; #ab21286)와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. RT에서 5 분 동안 PBS로 3 헹굼 단계 후, 차단 용액으로 1 시간 동안 RT에서 차단을 실현하였다. 이어서 차단 용액에서 희석시킨 이차 항체를 광 보호하에 RT에서 2 시간 동안 첨가하였다. 이차 항체 Alexa Fluor® 488 당나귀 항-토끼 IgG H&L (ThermoFisher, #A21206) 및 Alexa Fluor® Cy3® 염소 항-마우스 IgG H&L (Abcam; #ab97035)을 사용하여 뮤린 콜라겐 I를 녹색으로, 인간 콜라겐 I를 적색으로 각각 시각화하였다. 이어서, 슬라이드를 실온에서 5 분 동안 PBS 1X로 3 회 헹구고 RT에서 1 분 동안 NucBlue® 용액과 함께 인큐베이션하여 핵을 염색시켰다. 마지막으로, 슬라이드를 PBS에서 한 번 간단히 헹구고 GlycerGel® 시약에 올렸다. 면역형광의 음성 대조군으로서, 인접한 조직학적 슬라이드에서 일차 항체 누락을 수행하였다.
조직학적 염색
ALP 및 TRAP 효소 활성 검출 방법을 각각 사용하여 골모세포 및 파골세포 활성을 각각 두개관 절편에서 평가하였다. ALP 염색을 위해, 4 ㎛ 두께의 두개관 관상 플라스틱 절편을 Fast Blue RR 염 (Sigma-Aldrich®) 및 나프톨 AS-MX 포스페이트 알칼리 (Sigma-Aldrich®)의 용액과 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TRAP 염색은 제조업체의 지시에 따라 산 포스파타제, 백혈구 (TRAP) 키트 (Sigma-Aldrich®)를 사용하여 두께 8 ㎛인 두개관 관상 플라스틱 절편에서 수행되었다. 신 형성 골의 광물화 상태를 평가하기 위해, Masson Trichrome Goldner 염색을 제조업체의 지시에 따라 키트 (Bio-Optica®)를 사용하여 ALP로 염색된 두개관 절편에서 수행하였다. 광학 현미경 (Leica®) 및 Leica® LAS EZ 소포트웨어를 사용하여 디지털 이미지를 취하였다.
두개관의 조직 형태학적 분석
뼈 형성의 정량화 (즉, 절대 뼈 형성)를 플라스틱 포매 조직에서 수행하였다. 광물화된 결절이 있거나 없는 절대 신 형성 뼈 두께 (알리자린 레드로 형광 표지된 기저 광물화 전면에서 칼세인 및 테트라사이클린으로 형광 표지된 뼈 신 형성까지)의 측정값을 ZEN® 이미지 분석 소프트웨어 (Zeiss)에 의해 4 μm 두께의 관상 단면에서 측정하였다 (μm 단위). 각 동물에 대해, 각 레벨 사이에 200 μm의 거리를 두고 5 개의 독립적인 레벨로 4 회 절대 두께 측정을 수행하였다. 첫 단계로, 각 동물에 대해 두께 평균 (결절 존재 또는 부재) ± SD (즉, 5 개 레벨에서 레벨 당 4 회 측정값의 평균)를 계산하였다.
통계 분석
결과를 평균±표준 편차 (SEM)로 표시하였다. JMP® 소프트웨어 (SAS Institute Inc.) 또는 GaphPad Prism® 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. p<0.05일 때 그룹 간 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
동결 보존된 세포 산물 C가 투여된 마우스는 투여 4 주 후 대조군보다 더 높은 뼈 형성을 나타내었다 (도 8A 내지 C). 뼈 불투명도는 부형제에 비해 동결 보존된 뼈 형성 세포 C에서 상당히 더 높았다 (도 8B). 골형성 표면은 광물화된 결절이 관찰되지 않은 부형제에 비해 상당히 높았다 (도 8C). 골형성 유무에 관계없이 골유도의 조직 형태학적 측정 (절대 골형성으로 표시)은 부형제에 비해 동결 보존된 뼈 형성 세포에서 상당히 높았다 (도 8D 내지 E). 또 골유도 활성 외에, 동결 보존된 뼈 형성 세포 C는 광물화된 결절의 존재로 강조되는 높은 골형성 활성을 촉진시켰다. 이러한 골형성 활성은 4/5 골수 기증자 (또는 배치 생산) 및 마우스의 65%에서 관찰되었다 (도 8F). 그룹당 하나의 마우스에서 적어도 하나의 광물화된 결절이 관찰되면 하나의 기증자/배치는 골형성적인 것 (양성)으로 간주하였다. 부형제 투여 후 결절은 관찰되지 않았다.
보다 구체적으로, 동결 보존된 세포 산물 C는 골유도 특성 (두개골에서 뮤린 기원으로부터 균질한 뼈 형성)과 골형성 특성 (인간 및 뮤린 기원으로부터 광물화된 결절)을 모두 나타내었다 (도 9).
막 내 숙주 골화가 두개골 표면을 따라 유도되었다 (도 9 및 10). 보다 구체적으로, 동결 보존된 뼈 형성 세포 C가 골유도 및 골형성 특성을 나타내었다 (도 10, "fluo"). 마우스/인간 I 형 콜라겐 이중 면역 표지 (도 10, "인간 I 형 콜라겐")는 숙주 및 기증자 기원의 뼈의 존재 (골형성)를 나타내었다. 골모세포 (도 10, "ALP+") 및 파골세포 (도 10, "TRAP") 활성은 주로 광물화된 결절에서 발견되었으며, 이는 결절에서 뼈 재형성 과정이 투여 후 4 주 동안 계속되고 있음을 보여준다. 이러한 관찰은 결절의 크기에 따라 달라졌다: 결절이 클수록 투여 후 4 주에 더 많은 ALP 및 TRAP 활성이 여전히 존재한다. 약한 유골 (도 10, "Goldner의 Masson trichrome 염색")의 부분 염색으로 뼈 형성 과정이 완료되었음을 나타낸다.
따라서, 뼈 형성 세포 C는 골 신 형성을 증가시켰다.
이것은 장골뿐만 아니라 편평골의 골 결손의 치료에 대해 명세서 및 실시예에 기술된 바와 같은 세포 산물 및 세포 조성의 유용성을 입증한다.
실시예 4: 실시예 1의 방법에 의해 수득된 동결 보존된 세포 산물 C에 의해 수복된 생체 내 마우스 분절 대퇴 아임계 크기 결손 (sub-CSD)
실험 절차
세포
본 발명을 나타내는 세포 산물 (즉, 동결 보존된 세포 산물 C)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다.
분절 대퇴 (아)-임계 크기 결손 (SFCSD) 모델
수술 절차는 문헌[(Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80; Manassero et al., 2016, Journal of Visualized Experiments; (116): 52940)]에 따라 무균 조건 하에서 수행되었다. 간략하면, 13 주령 암컷 NMRI-누드 (nu/nu) 마우스 (n = 27)에 이소플루란 (IsoFlo®) 또는 덱스메데토미딘 하이드로클로라이드 (Dexdomitor®, Orion Pharma, 1 mg/kg 체중)와 케타민 (Nimatek®, Euronet, 150 mg/kg 체중)의 믹스를 복강 내 주사하여 마취시키고, 복부를 가온 플레이트상에 위치시켰다. 왼쪽 대퇴골의 전방측에 6 홀 PEEK 미세 고정판 (RISystem AG®)을 적용한 후 기글리 (Gigli) 톱과 지그 (jig) (RISystem AG®)를 사용하여 2 mm 길이의 중 골간 대퇴골 절골술을 시행하였다. 수술 전날 예방 약물로서 (식수 중) 항생제 (Baytril®, 10 mg/kg 체중) 및 수술 전날 및 수술 후 적어도 3 일 동안 12 시간마다 진통제 (부프레노르핀 하이드로클로라이드, Temgesic®, Schering-Plough, 0.1 mg/kg 체중)를 투여하였다. 수술 당일에 동결 보존된 MSC-유래 세포 C (마우스 당 50 ㎕ 부피로 1.25 x 106 세포) 또는 부형제 (대조군)를 100 ㎕-Hamilton® 주사기를 사용하여 경피 주사로 골 결손 부위에 국소 투여하였다. 세포 또는 부형제 투여 10 주 후 마우스를 경부 탈구시켜 안락사시켰다. 각 마우스의 왼쪽 대퇴골을 절개하여 수거하고, X-선 영상화까지 실온에서 0.9% NaCl에 유지시켰다.
X-선 분석에 의한 골 수복의 정량화
판 고정, 분절 대퇴부 결손 크기를 제어하고 기준선을 얻기 위해 수술 직후, 그리고 MSC-유래 세포 또는 부형제의 투여 후 10 주까지 2 주마다 Faxitron® MX-20 장치를 사용하여 각 마우스의 왼쪽 대퇴골에 대해 생체 내 X-선 영상화를 수행하였다. 35 kV로 설정된 전압, 4.8 초의 노출 시간, 4,300의 밝기, 7,100의 콘트라스트로 하여 수동 모드에서 5 배 확대로 중측방 및 전후방 사진으로 디지털 이미지를 찍었다.
효능을 3 가지 상이한 방법, 즉 뼈 수복률, 개작된 방사선 통합 점수 (RUS) 및 융합 점수로 2 주마다 모니터링하면서 측정하였다:
- 골 수복률은 수복 결손 크기를 초기 결손 크기로 나누어 계산하였다. ImageJ® 소프트웨어를 사용하여 중측방 및 전후방 X-선 영상 (총 4 개 측정값)의 두 위치 (양 피질)에서 뼈 결손 두 가장자리 사이의 거리 (μm)를 측정하여 각 마우스에 대한 결손 크기를 경시적으로 정량화하였다. 각 마우스에 대해 각 시점에서의 네 측정값의 평균을 계산하였다.
- SFCSD 모델에 적용한 RUS (방사선 통합 점수)는 골 신 형성, 브리징 및 골절선 (전후방 및 중측방 방사선 영상에서)의 유무에 따른 반정량적 측정이다. 점수는 두 관점에서 두 피질 결손 부위에서 결정된 네 점수의 합계에 해당한다 (각각 1에서 4까지의 총 4 개의 점수). 따라서 점수 범위는 4 (치유 징후 없음)에서 16 (완전 융합)까지이다.
- 융합 점수는 대퇴 결손 가장자리 사이의 융합율을 평가하는 이진 점수이다. 융합을 정의하는 데 사용되는 방사선 기준은 적어도 3 개의 피질에서 결손의 브릿징 시각화이다 (Cekic E et al., Acta Orthop Traumatol Turc. 2014, 48 (5), 533-40). 점수는 0 (융합 없음) 또는 1 (융합)이다. 이 파라미터의 경우에는 마지막 시점만이 분석되었다 (여기서는 W10).
통계 분석
결과를 평균±표준 편차 (SD)로 표현하였다. 이원 ANOVA 반복 측정에 이어 Bonferroni 사후 검정으로 구성된 통계 분석을 JMP® (SAS Institute Inc.) 또는 GraphPad Prism® 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. p<0.05인 경우 그룹 간 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
분절 대퇴부 sub-CSD 모델에서, 동결 보존된 뼈 형성 세포 C는 투여 후 2 주에서 10 주 사이에 부형제에 비해 골절 복구 비율을 현저하게 개선하고 가속화하였다 (도 11 및 12) (p<0.001). 또한, RUS 점수는 부형제 그룹에 비해 동결 보존된 뼈 형성 세포 C 그룹에서 유의하게 증가하였다 (도 13). 마지막으로, 융합 속도 또한 부형제 투여 후 융합이 없는 것에 비해 동결 보존된 뼈 형성 세포 C 투여 후 마우스의 9/19 (47%)에서 10W 융합으로 개선되었다.
이것은 장골뿐만 아니라 편평골의 골 결손의 치료에 대해 명세서 및 실시예에 기술된 바와 같은 세포 산물 및 세포 조성의 유용성을 입증한다.
실시예 5: 동역학 연구 및 마커 발현 분석에 따른 2 차 및 3 차 배양 기간
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 2 차 배양 후 수득된 본 발명의 실시양태에 따른 MSC-유래 세포를 상이한 시점 (D21, D22, D23, D24, D25 및 D28)에서 수확하고 세포 주기를 유세포 분석법 (BD FACSCanto II™ 및 BD FACSDiva™ 소프트웨어, Becton Dickinson)으로 분석하였다.
전체 세포 DNA를 BD PharmigenTM BrdU Flow Kits를 사용하여 7-아미노-액티노마이신 D (7-AAD)로 염색하였다. 요약하면, 105 개의 세포를 100 ㎕의 BD Cytofix/Cytoperm 완충액에 고정시킨 다음, 주위 온도에서 20 분 동안 인큐베이션하고 1 ml BD Perm/Wash Buffer로 세척한 다음 300 g으로 5 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 세포를 100 ㎕의 BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus에서 투과시킨 다음 4 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하고 BD Perm/Wash Buffer로 세척한 뒤, 300 g으로 5 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고 세포를 다시 100 ㎕의 BD Cytofix/Cytoperm Buffer (주위 온도에서 5 분)에 고정시키고 BD Perm/Wash Buffer로 세척한 뒤, 300 g으로 5 분 동안 원심분리하였다. 전체 세포 DNA를 20 ㎕의 7-AAD 용액에서 염색한 다음 암실에서 주위 온도에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 1 ml 염색 완충액을 유세포 분석 적응 튜브로 옮기기 전에 샘플에 첨가하였다.
샘플을 FACSCantoTM II 유세포 분석기 (Becton-Dickinson)로 분석하고 650 nm 롱 패스 필터 통과 후 7-AAD 방출을 수집하였다.
도 3 및 4는 D24에서의 세포가 증식 곡선의 끝 부분에 가까이 위치했음을 보여준다. 이 세포는 아직 세포 주기를 벗어나지 않은 반면, D25로부터의 세포는 대부분 세포 주기에서 벗어났으며, 즉 더 이상 증식하지 않았다.
도 4는 다양한 배양 기간에서 2 차 배양 중인 세포의 이벤트/기 (G0/G1, S 및 G2/M)로의 세포 주기 분석을 보여준다. D24에서는 세포의 42%가 여전히 증식하고 있는 반면 (11% S 및 31% G2/M), D25에서는 세포가 대부분 세포 주기에서 벗어났다. 따라서 2 차 배양의 최적 기간은 24 일이었다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 3 차 배양 후 수득된 MSC-유래 세포를 상이한 시점에서 수확하였다: 34 일 (D34) 내지 42 일 (D42)에 매일 세포 표면 마커 발현을 실시예 2, 유세포 측정법에 기재된 바와 같이 유세포 측정법에 의해 분석하였다.
연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단에 대해 수행된 유세포 분석 마커 발현 분석은 배양 기간 동안 분화 마커 (BMP2, RUNX2, ZNFS21, SPARC, MMP13, CHI3L1) 발현이 D34에서 D42로 증가하고 (도 5), 증식 마커 KI67 발현은 감소 (D34에서 D42까지)하는 것으로 나타났다.
도 6은 8 개 배치에 대한 다양한 배양 기간에서의 세포 밀도를 보여준다. 세포 밀도는 일반적으로 D36에서 더 높았다. 세포 측정법 (BD TrucountTM)으로 세포를 계수하였다. 도 7은 2 개의 배치에 대해 상이한 배양 기간에서의 평균 세포 직경 크기를 보여준다. 세포 직경은 D35 및 D36에서 최소였다. 따라서, 세포 계수 및 세포 크기 측정은 세포가 D35와 D38 사이에 증식 정체에 도달했고 세포 크기가 D35와 D36에서 최소라는 것을 보여준다 (도 6 및 7).
상기에 비추어 D36에서 가장 높은 세포 밀도를 고려할 때 3 차 배양을 위한 최적의 기간은 D36이었다.
SEQUENCE LISTING <110> Bone Therapeutics SA <120> METHODS FOR DIFFERETIATING MESENCHYMAL STEM CELLS <130> BONE-018-PCT <150> EP18196717.5 <151> 2018-09-25 <150> EP19169084.1 <151> 2019-04-12 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Runx2 forward primer <400> 1 ggttccagca ggtagctgag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Runx2 reverse primer <400> 2 agacaccaaa ctccacagcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SOX9 forward primer <400> 3 taaaggcaac tcgtacccaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SOX9 reverse primer <400> 4 attctccatc atcctccacg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BMP2 forward primer <400> 5 ggaacggaca ttcggtcctt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BMP2 reverse primer <400> 6 caccatggtc gacctttagg a 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ALPL forward primer <400> 7 accattccca cgtcttcaca tttg 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ALPL reverse primer <400> 8 agacattctc tcgttcaccg cc 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> MMP13 forward primer <400> 9 tggaattaag gagcatggcg a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> MMP13 reverse primer <400> 10 aactcatgcg cagcaacaag 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CHI3L1 forward primer <400> 11 tgggtctcaa agattttcca aga 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CHI3L1 reverse primer <400> 12 gctgtttgtc tctccgtcca 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DCN forward primer <400> 13 aaaatgccca aaactcttca gg 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DCN reverse primer <400> 14 gccccatttt caattcctga g 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OCN forward primer <400> 15 aaggtgcagc ctttgtgt 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OCN reverse primer <400> 16 gctcccagcc attgatacag 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SPON1 forward primer <400> 17 cctgcggaac tgccaagta 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SPON1 reverse primer <400> 18 cacgggtgag cccaattct 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> POSTN forward primer <400> 19 tttgggcacc aaaaagaaat 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> POSTN reverse primer <400> 20 ttctcatata accagggcaa ca 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RPL13 forward primer <400> 21 cataggaagc tgggagcaag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RPL13 reverse primer <400> 22 gccctccaat cagtcttctg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TBP forward primer <400> 23 aacaacagcc tgccacctta 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> TBP reverse primer <400> 24 gccataaggc atcattggac 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HPRT forward primer <400> 25 ccctggcgtc gtgattagt 19 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HPRT reverse primer <400> 26 gtgatggcct cccatctcct t 21

Claims (21)

  1. (a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 섬유아세포 성장 인자-2 (FGF-2), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 중간엽 줄기 세포 (MSC)-유래 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
    (c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계를 포함하고,
    여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서 x 일 동안 배양되고, 여기서 x 일은 MSC-유래 세포의 적어도 20%가 증식하는 마지막 날인,
    중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, MSC 유래 세포가 단계 (b)에서 약 8 일 내지 약 12 일의 기간, 바람직하게는 약 10 일의 기간 동안 배양되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, MSC-유래 세포가 단계 (a)에서 약 13 일 내지 약 15 일의 기간, 바람직하게는 약 14 일의 기간 동안 배양되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, MSC-유래 세포가 단계 (c)에서 약 10 일 내지 약 14 일의 기간, 바람직하게는 약 12 일의 기간 동안 배양되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 증식하는 MSC-유래 세포가 S 기, G2 기 또는 M기의 세포 주기에 있는, 방법.
  6. (a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
    (c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계를 포함하고,
    여기서 MSC-유래 세포는 단계 (b)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠, 바람직하게는 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅되는,
    MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, MSC-유래 세포가 단계 (c)에서의 추가 배양을 위해 3x102 내지 1x103 세포/㎠의 밀도, 바람직하게는 3x102 내지 8x102 세포/㎠의 밀도로 플레이팅되는, 방법.
  8. (a) 대상체의 생물학적 샘플로부터 회수된 MSC를, FGF-2, TGFβ 및 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체를 적어도 0.01 IU/ml의 농도로 포함하는 배양 배지에서 배양하여 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 MSC-유래 세포를 1차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계;
    (c) MSC-유래 세포를 2차 계대 배양하고 MSC-유래 세포를 (a)에 정의된 배지에서 추가로 배양하여 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 단계;
    (d) 상기 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 대상체에게 투여하기에 적합한 동결 보존 배지에 재현탁하는 단계; 및
    (e) 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 동결 보존하는 단계를 포함하는,
    MSC로부터 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포를 수득하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포가 단계 (d)에서 동결 보존 배지에 약 1x107/ml 내지 약 1x108/ml의 농도, 바람직하게는 약 2x107/ml 내지 약 4x107/m이의 농도로 재현탁되는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 동결 보존 배지가 디메틸설폭사이드 (DMSO), 인간 혈청 알부민 (HSA), 아데노신, 폴리펩타이드, 벤조피란 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TGFβ가 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되고; 바람직하게는 TGFβ는 TGFβ1인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 헤파린 또는 이의 유도체 또는 유사체의 농도가 약 0.1 IU/ml이고/이거나;
    - 헤파린 또는 헤파린 유도체 또는 이의 유사체는 미분획 헤파린 (UFH); 저분자량 헤파린 (LMWH), 예컨대 에녹사파린, 달테파린, 나드로파린, 틴자파린, 세르토파린, 레비파린, 아르데파린, 파르나파린, 베미파린 또는 이들의 혼합물; 헤파리노이드, 예컨대 헤파린 설페이트, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 아카란 설페이트, 케라탄 설페이트, 또는 이들의 혼합물, 예컨대 다나파로이드; 헤파린 염; 헤파리노이드 염; 헤파린 단편; 헤파리노이드 단편; 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는,
    방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, MSC 또는 MSC-유래 세포가 추가로 접촉되고, 예컨대 배지는 혈장, 혈청 또는 그의 대체물 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단.
  16. MSC의 시험관 내 또는 생체 외 확장에 의해 수득 가능하거나 수득된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단으로서, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 적어도 90%는 25 μm 이하의 직경 (D90 ≤25 μm)을 갖고, 현탁액 중 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포의 최대 1%는 직경이 35 μm를 초과하는, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단.
  17. 제16항에 있어서, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포가 제1항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된, 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단을 포함하는 약학적 제형.
  19. 제18항에 있어서, 인산삼칼슘, 하이드록시아파타이트, 하이드록시아파타이트/인산삼칼슘 입자의 조합, 폴리락트산, 폴리락틱 글리콜산, 히알루론산 또는 이의 유도체, 키토산, 폴리-L-라이신, 젤라틴, 콜라겐, 오스테오넥틴, 피브리노겐, 오스테오칼신, 또는 이들의 조합과 같은 골전도 특성을 갖는 성분을 추가로 포함하는 약학적 제형.
  20. 의약으로서, 바람직하게는 연골-골모세포 계통의 세포 이식이 필요한 대상체의 치료에 사용하기 위한, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단, 또는 제18항 또는 제19항에 따른 약학적 제형.
  21. 제20항에 있어서,
    - 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포가 약 1x107/ml 내지 약 1x108/ml, 바람직하게는 약 2x107/ml 내지 약 4x107 세포/ml의 농도로 존재하고/하거나;
    - 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 또는 약학적 제형은 경피, 골내, 관절 내, 추간 또는 혈관 내 투여에 적합하고;
    - 연골-골모세포 계통의 MSC-유래 세포 집단 또는 약학적 제형은 골 결손 부위에 투여하기에 적합한,
    집단 또는 약학적 제형.
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