CN113056557A - 用于分化间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从间充质干细胞(MSC)获得成软骨‑成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法。本发明还涉及通过所述方法获得的成软骨‑成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，包含所述成软骨‑成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群的药物制剂，以及其在治疗需要移植成软骨‑成骨细胞谱系细胞的受试者中的应用。

Description

用于分化间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于再生疗法领域，特别是可通过微创技术施用的骨细胞治疗产品领域。具体地，本发明涉及从间充质干细胞获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞和细胞群，以及包含此类细胞和细胞群的产品、方法和应用。

背景技术

能够经历成骨分化的干细胞、定型于成骨分化的细胞或具有骨形成能力的细胞的移植是治疗骨相关疾病的有前途的方法，特别是治疗需要产生新骨组织时。

先前已将间充质干细胞(MSC)用于治疗骨病(Gangji et al.，2005Expert OpinBiol Ther 5:437-42)。然而，尽管可以移植这种相对未分化的干细胞，但它们不定型于成骨细胞谱系，因此相当大比例的如此移植的干细胞可能最终不能有助于形成期望的骨组织。此外，这种干细胞的量通常不令人满意。

本领域中已描述了离体生成骨形成细胞，而无需遗传修饰细胞的生成方法。

WO2007/093431涉及体外扩增分离的MSC的方法，其产生显示成骨细胞表型的细胞。在该方法中，在血清或血浆和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)存在下培养人MSC。

WO2009/087213涉及用于体外或离体从人MSC获得骨祖细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的方法，其包括使所述MSC与人血浆或血清、FGF-2和转化生长因子β(TGF-β)接触。

然而，关于同种异体骨形成细胞产品开发的主要关注仍然存在，如生产量，即一次骨髓捐赠产生的剂量数，产品的可用性和成本效益。此外，凭借生产过程的生产力，每年都需要对几十个骨髓进行合格鉴定以确保生产能力。因此，仍然需要提高从一次骨髓捐赠中获得的生产力，更普遍地需要获得特别可用于再生疗法的MSC衍生细胞和细胞产品的进一步和/或改进方法。

发明内容

如阐明本发明的某些代表性实施方案的实验部分所证实，本发明人意识到，成软骨-成骨细胞谱系的间充质干细胞(MSC)衍生细胞的生产量当所述细胞通过包括以下的生产方法获得时可大大改善：三级培养(并因此增加中间细胞传代“P2”)，并且控制二级培养的培养持续时间、三级培养的培养持续时间、三级培养结束时增加冷冻保存步骤、或接种密度(plating density)中的一个或多个设置。

因此，一方面，本发明提供了从MSC获得，诸如分化和/或扩增成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子β(TGFβ)和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得间充质干细胞(MSC)衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；以及

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞达X天的时段，其中第X天是至少20％的MSC衍生细胞增殖的最后一天(如，处于细胞周期的S期、G2期或M期)。

另一方面，本发明提供了从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；以及

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中将MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度，优选以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

另一方面，本发明提供了从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞；

(d)将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞重悬于适于向受试者施用的冷冻保存介质中；以及

(e)冷冻保存成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

另一方面，本发明涉及可通过本文定义的方法获得或通过本文定义的方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群。

另一方面，本发明提供了可通过体外或离体扩增MSC获得或通过体外或离体扩增MSC获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其中悬浮液中至少90％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于25μm(D₉₀≤25μm)的直径，并且其中悬浮液中至多1％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有大于35μm的直径。

另一方面，本发明提供了包含如本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群的药物制剂。

另一方面，本发明提供了如本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，或如本文定义的药物制剂，其用作药物，优选用于治疗需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞的受试者。

本发明人发现，本方法可提供以下所讨论的一个或多个优点。本方法允许显著提高从一个骨髓样品获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的培养产率和生产力。结果，一次骨髓捐赠足以满足令人满意的生产量。此外，本方法增加成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞在临床应用中的可用性。此外，通过本方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的冷冻保存产生可直接向需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞的受试者施用的细胞产品。通过本方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的冷冻保存允许根据要求直接分配和递送细胞产品，并因此立即治疗需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞的受试者。此外，通过本方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的冷冻保存允许进行细胞产品的所有放行测试，并在施用细胞产品之前获得结果。另外，通过本文定义的方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞有利地具有骨诱导和成骨潜能。

在以下各部分和所附权利要求求中描述了本发明的这些和其他方面以及优选实施方案。因此，所附权利要求书的主题特别地并入本说明书中。

附图说明

图1表示显示通过流式细胞术分析A：MSC；B：细胞产品A；C：细胞产品B；D：细胞产品C–新鲜中的CD73(图1A)和CD44(图1B)表达水平的图(对于MSC、细胞产品A、B和C分别为N＝12、6、22、15(CD73)和N＝22、8、22、18(CD44))。

图2表示显示根据现有技术的对比细胞产品和示例本发明细胞产品的细胞尺寸的图：A：MSC；B：细胞产品A；C：细胞产品B；D：细胞产品C–新鲜；E：细胞产品C–冷冻CS10；F：细胞产品C-冷冻CS10稀释HSA1:1；G：细胞产品C–冷冻CS10 5％HSA；H：细胞产品C-冷冻HTS 10％HSA 10％DMSO。

图3表示显示根据培养持续时间的细胞密度的图。计数细胞：图3A：手动(台盼蓝方法和Bürker室)，或图3B：通过细胞计数法(BD Trucount^TM)。

图4表示显示二级培养中不同培养持续时间的细胞的事件/阶段(G0/G1，S和G2/M)的细胞周期分析的图。第24天时，仍有42％的细胞增殖(11％S和31％G2/M)，而从第25天开始，细胞大体上脱离细胞周期。

图5表示显示不同培养持续时间(对于时间点第34天至第38天N＝8，对于第42天N＝6)的细胞分化标志物(BMP2、RUNX2、ZNFS21、SPARC、MMP13、CHI3L1)的表达水平的图。

图6表示显示不同培养持续时间(N＝8)时细胞群的细胞密度的图。

图7表示显示不同培养持续时间(N＝2)时两个细胞群的平均细胞直径尺寸的图。

图8显示通过X射线分析评估的骨诱导和骨形成。A：通过测量与骨不透明度直接相关并因而与骨厚度直接相关的灰度强度值来评估骨诱导(A，左图)。通过测量X射线成像显示折射更强的结节表面来评估骨生成(A，右图)。B：与赋形剂相比，冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)的骨不透明度显著更高(n＝20(赋形剂)和n＝34(来自5个不同批次的B-F细胞C))。C：与未观测到矿化结节的赋形剂相比，骨生成的表面显著更高(n＝20(赋形剂)和n＝34(来自5个不同批次的B-F细胞C))。D至E：与赋形剂相比，冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)具有(图8D)或不具有(图8E)骨生成(由绝对骨形成表示)的骨诱导显著更高。曼-惠特尼U检验(Mann Whitney U-test)：***p<0.001。F：除骨诱导活性外，冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)促进高的成骨活性，其通过4/5个骨髓供体(或批量生产)和65％的小鼠中存在至少一个矿化结节表明(N＝20(赋形剂)和N＝34(来自5个不同批次的B-F细胞C)。

图9显示单次施用冷冻保存的骨形成细胞C或赋形剂后4周的冠状面组织切片。冷冻保存的骨形成细胞C通过以下两种机制显示活性：(i)“骨诱导”：通过导致膜内骨化的旁分泌刺激宿主骨形成，以及(ii)“骨生成”：通过软骨内骨化促进“直接”骨形成(来自供体/人来源)。

图10显示接受了单次注射冷冻保存的骨形成细胞C后4周的小鼠颅盖的组织学分析。冷冻保存的骨形成细胞C显示骨诱导和成骨特性(“fluo”)。人骨形成(“人I型胶原”)在矿化结节(骨生成)中突出显示。在矿化结节中大多检测到成骨细胞(“ALP”，第3个图中黑色箭头所示)和破骨细胞(“TRAP”，第4个图中黑色箭头所示)，表明施用后4周结节中的骨重塑过程仍在进行。突出显示无类骨质(“Goldner's Masson Trichrome染色”)，表明骨形成过程已完成。

图11显示节段性股骨亚临界尺寸缺损模型中冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)的作用。X射线图像表示施用单独的赋形剂或冷冻保存的骨形成细胞C后第0天到第10周的节段性股骨缺损。

图12显示节段性股骨亚临界尺寸缺损模型(sub-CSD模型)中冷冻保存的骨形成细胞C的作用。该图表示手术程序/项目施用当天(“W0”)和施用单独的赋形剂或冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)后长达10周(“W10”)时间的X射线图像的骨修复百分比；平均值±SEM，***p<0.001(双向重复测量ANOVA)。

图13显示节段性股骨亚临界尺寸缺损模型(sub-CSD模型)中冷冻保存的骨形成细胞C的作用。该图表示由手术程序/项目施用当天(“W0”)和施用单独的赋形剂或冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)后长达10周(“W10”)时间的X射线图像确定的RUS评分；平均值±SEM，**p<0.01，***p<0.001(双向重复测量ANOVA)。

具体实施方式

如本文所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和复数指代物，除非上下文另外明确指出。

如本文所用的，术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未叙述的成员、元件或方法步骤。该术语还包括“由……组成”和“基本上由……组成”，其享有专利术语中的公认含义。

由端点表述的数值范围的描述包括包含在相应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。

当涉及可测量值如参数、量、持续时间等时，如本文所用的术语“大约”或“约”是指包括指定值的变化和从指定值的变化，如指定值的以及从指定值的+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，还更优选+/-0.1％或更小的变化，只要这些变化适于在所公开的发明中实施。应当理解，修饰语“大约”所指的值本身也具体地和优选地被公开。

术语“一个或多个”或“至少一个”，例如一个或多个成员或一组成员中的至少一个成员本身是清楚的，通过进一步的示例，该术语尤其包括对所述成员中的任何一个或对所述成员中的任何两个或更多个的引用，例如所述成员中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等，以及直到所有所述成员。在另一个示例中，“一个或多个”或“至少一个”可以指1、2、3、4、5、6、7或更多。

本文中包括对本发明的背景论述以解释本发明的背景。这不应被认为是承认所引用的任何材料在任何权利要求的优先权日之前在任何国家是公开的、已知的或公知常识的一部分。

贯穿本公开内容，通过识别的引用提及各种出版物、专利和公开的专利说明书。本说明书中引用的所有文献都通过引用整体并入本文。特别地，本文特别提及的这些文献的教导或部分通过引用并入。

除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。当结合本发明的特定方面或本发明的特定实施方案来定义特定术语时，除非另外定义，否则此内涵意欲适用于本说明书全文，即，也适用于本发明的其它方面或实施方案的上下文中。

在以下段落中，更详细地限定本发明的不同方面或实施方案。除非明确地相反指出，如此定义的每个方面或实施方案可以与任何其它方面或实施方案组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与任何其他被指示为优选或有利的一个或多个特征组合。

在整个说明书中，提及“一个实施方案”意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书中的各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定全部指代同一实施方案，而是可以指代同一实施方案。此外，如本领域技术人员从本公开中将显而易见的，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性。此外，虽然本文描述的一些实施方案包括在其它实施方案中包括的一些而非其它特征，但是不同实施方案的特征的组合意图在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域技术人员将理解的。例如，在所附权利要求书中，任何要求保护的实施方案可以以任何组合使用。

一方面，本发明提供了从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子β(TGFβ)和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；以及

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

如本文所用的，术语“间充质干细胞”或“MSC”是指成体中胚层来源的干细胞，其能够产生间充质谱系的细胞，通常为两种或更多种间充质谱系，更通常为三种或更多种间充质谱系，例如成软骨-成骨细胞(软骨和骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、生肌细胞(肌肉)、生腱细胞(腱)、成纤维细胞(结缔组织)、生脂细胞(脂肪)和生基质(骨髓基质)谱系。MSC可以从生物样品中分离，优选从人受试者的生物样品中分离，例如骨髓、小梁骨、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)，特别是胎儿和青少年皮肤、骨膜、牙髓、腱和脂肪组织。

如本文所用的，术语“生物样品”或“样品”是指从生物来源获得的样品，例如从生物体，诸如动物或人受试者、细胞培养物、组织样品等获得的样品。动物或人受试者的生物样品是指从动物或人受试者中取出的并包含其细胞的样品。动物或人受试者的生物样品可包含一种或多种组织类型，并且可包含一种或多种组织类型的细胞。获得动物或人受试者的生物样品的方法是本领域熟知的，例如组织生检或抽血。人MSC、其分离、体外扩增和分化已描述于，如美国专利号5,486,359；美国专利号5,811,094；美国专利号5,736,396；美国专利号5,837,539；或美国专利号5,827,740。本领域所述的并且通过本领域所述的任何方法分离的任何MSC都可适用于本发明的方法。特别地，MSC可被定义为显示体外三谱系间充质分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力(Dominici et al.,2006,vol.8,315)。

术语“MSC”还包括MSC的后代，例如通过从动物或人受试者的生物样品获得的MSC的体外或离体增殖(繁殖/扩增)获得的后代。

术语“干细胞”通常指未特化的或相对不太特化的且有增殖能力的细胞，其能够自我更新，即，可以增殖而不分化，并且其或其后代可以产生至少一种相对更特化的细胞类型。该术语包括能够基本上无限制自我更新的干细胞，即其中干细胞的后代或其至少部分基本上保持母干细胞的未特化或相对不肽特化的表型、分化潜能和增殖能力，以及显示有限自我更新的干细胞，即其中后代或其部分进一步增殖和/或分化的能力与母细胞相比明显降低。作为示例而非限制，干细胞可以产生能够沿着一个或多个谱系分化以产生越来越相对更特化的细胞的后代，其中这样的后代和/或越来越相对更特化的细胞本身可以是如本文定义的干细胞，或甚至产生终末分化的细胞，即完全特化的细胞，它们可以是有丝分裂后的。

如本文所用的，术语“成体干细胞”是指存在于处于胎儿阶段或优选地出生后(如，特别地但不限于人生物体，出生后至少1个月龄，如至少2个月，至少3个月，如至少4个月，至少5个月，如出生后至少6个月龄，如1年或更大，5年或更大，至少10年或更大，15年或更大，20年或更大，或出生后25年或更大)，诸如例如成年之后的生物体或从该生物体获得(如分离)的干细胞。例如，成体干细胞可从人受试者获得，其在其它情况下将以常规术语“婴儿”、“儿童”、“青年”、“青少年”或“成人”描述。

优选的MSC具有产生至少成软骨-成骨细胞谱系的细胞的潜力，例如，成骨细胞谱系的细胞，如软骨-骨祖细胞和/或骨祖细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞，和/或成软骨细胞谱系的细胞，如软骨-骨祖细胞和/或软骨祖细胞和/或前成软骨细胞和/或成软骨细胞和/或软骨细胞。

进一步优选的MSC具有产生至少成骨(骨)细胞谱系的细胞，诸如例如软骨-骨祖细胞和/或骨祖细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等；或至少成软骨(软骨)细胞谱系的细胞，诸如例如软骨-骨祖细胞和/或软骨祖细胞和/或前成软骨细胞和/或成软骨细胞和/或软骨细胞；成纤维细胞(结缔组织)谱系，诸如例如成纤维细胞、纤维细胞；或至少滑膜细胞(滑液)；或腱细胞等的潜力。

除非另有说明，“受试者”或“患者”可互换使用，并且是指动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，并且具体包括人患者和非人哺乳动物。优选的患者是人受试者。动物受试者包括动物的产前形式，诸如例如胎儿。人受试者可包括胎儿，而非胚胎。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，所述受试者可以是人受试者。

如本文所用的，术语“细胞产品”是指MSC衍生细胞，如本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，如本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，或者包含如本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或如本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群的药物制剂，例如适于施用的细胞产品(如，冷冻保存介质中的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞)。

在一个实施方案中，MSC可从健康受试者获得，这可有助于确保从所述MSC获得的MSC衍生细胞的功能。

在另一实施方案中，MSC获自需要移植MSC衍生细胞的人受试者。

在如本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对于待治疗的受试者可以是同种异体的。术语“同种异体的”或“同源的”涉及MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞意味着MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞获自除用MSC衍生细胞接触或治疗的受试者以外的一个或多个(合并的)受试者。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对于待治疗的受试者可以是自体的。术语“自体的”涉及MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞意味着MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞获自用成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞接触或治疗的同一受试者。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可包含自体和同种异体(即，同源)MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的混合物。优选地，MSC或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对于待治疗的受试者是同种异体的。

如本文所用的，术语“间充质干细胞衍生的细胞”或“MSC衍生的细胞”是指通过MSC的分化获得的间充质谱系(如，成软骨-成骨细胞(骨和软骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、生肌细胞(肌肉)、生腱细胞(腱)、成纤维细胞(结缔组织)、生脂细胞(脂肪)或生基质(骨髓基质)谱系)的细胞，特别是通过MSC的体外(包括离体)分化获得的细胞。

MSC的分化可以包括在能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的条件下培养MSC，更通常在包含能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的一种或多种试剂(如，生长因子)的培养基中培养MSC。MSC分化的方案本身是已知的(参见，尤其是WO2007/093431；以及其它REGER,R.L.et al.‘Differentiation and Characterization of Human MSCs’.In:MesenchymalStem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Edited byD.J.Prockop et al.Humana Press,2008,Vol.449,p.93-107；VERMURI,M.C.et al.(编).Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications(Methods in Molecular Biology).Humana Press,2011,Vol.698,尤其是第201-352页)。

如本文所用的，术语“生长因子”是指单独或当被其它物质调节时影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移，并且可以影响生物体发育、形态和功能变化的生物活性物质。生长因子通常可通过作为配体与响应生长因子的细胞中存在的受体(例如，表面或细胞内受体)结合而起作用。本文的生长因子可以具体是包含一个或多个多肽链的蛋白实体。作为示例而非限制，术语“生长因子”包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族、骨形态发生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、转化生长因子β(TGFβ)家族、神经生长因子(NGF)家族、表皮生长因子(EGF)家族、胰岛素样生长因子(IGF)家族、生长分化因子(GDF)家族、肝细胞生长因子(HGF)家族、造血生长因子(HeGFs)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)家族、糖皮质激素等的成员。技术人员将理解，生长因子或生长因子组合可以是已知能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的任何生长因子或生长因子组合。技术人员将理解，诱导MSC向期望的细胞类型(如，向成软骨-成骨细胞谱系的细胞)分化的体外方法可产生期望的细胞类型的基本上纯的的细胞群(即，主要由期望的细胞类型的细胞组成)。非限制性地，如此衍生的细胞群可包含至少90％(按数量计)的期望的细胞类型，例如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％的期望的细胞类型。

在特定实施方案中，MSC衍生细胞为成软骨-成骨细胞谱系(软骨和骨)。

如本文所用的，描述“成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞”可指具有分化为成骨细胞谱系的细胞的能力的祖细胞，如软骨-骨祖细胞、骨祖细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等，或具有分化为成软骨细胞谱系的细胞的能力的祖细胞，如软骨-骨祖细胞、软骨祖细胞和/或前成软骨细胞和/或成软骨细胞和/或软骨细胞。技术人员将理解，祖细胞可分化为成骨细胞谱系的细胞(如，前成骨细胞或成骨细胞)或分化为成软骨细胞谱系的细胞(如，前成软骨细胞或成软骨细胞)，这取决于它们所暴露的体外或体内条件，例如物理因子，和/或化学或生物成分，例如生长因子。

在某些实施方案中，描述“成骨细胞谱系细胞”或“成骨细胞谱系的MSC衍生细胞”可指具有成骨细胞表型，并且可有助于骨材料或骨基质形成或能够发展为可有助于骨材料或骨基质形成的细胞的细胞类型，如软骨-骨祖细胞、骨祖细胞、前成骨细胞、成骨细胞或骨细胞或其混合物。如本文所用的，“骨祖细胞”可特别包括早期和晚期骨祖细胞。优选地，“成骨细胞谱系细胞”或“成骨细胞谱系的MSC衍生细胞”可等同地指软骨-骨祖细胞、骨祖细胞、前成骨细胞或成骨细胞或其混合物，还更优选地，该短语可指软骨-骨祖细胞或前成骨细胞或成骨细胞或其混合物，例如在某些实例中，该短语可指前成骨细胞，或在某些其它实例中，该短语可指成骨细胞。所有这些术语本身是公知的。

通过进一步的指导而非限制，骨祖细胞、前成骨细胞和成骨细胞，以及包含骨祖细胞、前成骨细胞和/或成骨细胞的细胞群可显示以下特征：

a)细胞包含Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达，其为调节成骨细胞分化和成骨细胞分化期间许多细胞外基质蛋白基因表达的多功能转录因子；

b)细胞包含以下中至少一种的表达：碱性磷酸酶(ALP)，更具体地为骨-肝-肾型ALP；更优选还包括一种或多种其他骨标志物的表达，如骨钙蛋白(OCN，BGLAP)、1型前胶原氨基末端前肽(P1NP)、骨粘连蛋白(ON，SPARC)、骨桥蛋白(OPST，SPP1，OPN)和/或骨唾液蛋白(BSP)，和/或一种或多种其他骨基质蛋白如核心蛋白聚糖和/或骨保护蛋白(OPG)；

c)细胞基本上不表达CD45(如，少于约10％，优选少于约5％，更优选少于约2％的细胞可表达CD45)；

d)细胞显示矿化外部环境或合成含钙细胞外基质的能力的证据(如，当暴露于成骨培养基时；参见Jaiswal et al.J Cell Biochem,1997,vol.64,295-312)。细胞内的钙积累和向基质蛋白的沉积可常规地测量，如通过在⁴⁵Ca²⁺中培养，漂洗和再培养，然后测定细胞内存在或沉积到细胞外基质的任何放射性(US5,972,703)，或使用基于茜素红的矿化测定法(参见，如Gregory et al.Analytical Biochemistry,2004,vol.329,77-84)进行；

e)细胞基本上不向脂肪细胞谱系(如，脂肪细胞)或成软骨细胞谱系(如，成软骨细胞、软骨细胞)的细胞分化。可使用本领域建立的标准分化诱导条件(如，参见Pittenger etal.Science,1999,vol.284,143-7)和测定方法(如，诱导时，脂肪细胞通常用油红O染色，显示脂质积累；软骨细胞通常用阿辛蓝或番红橙(safranin-orange)染色)测试没有向这样的细胞谱系分化。基本上缺乏脂肪形成和/或软骨形成分化的倾向通常可意味着当应用于相应测试时，小于20％、或小于10％、或小于5％、或小于1％的测试细胞将显示脂肪形成或软骨形成分化的迹象。

在某些实施方案中，描述“成软骨细胞(软骨)谱系细胞”或“成软骨细胞(软骨)谱系的MSC衍生细胞”可指具有成软骨细胞表型，并且可有助于软骨或软骨基质形成或能够发育成可有助于软骨或软骨基质形成的细胞的细胞类型。如本文所用的“软骨祖细胞”可特别地包括早期和晚期软骨祖细胞。优选地，“成软骨细胞(软骨)谱系细胞”或“成软骨细胞(软骨)谱系的MSC衍生细胞”可指软骨-骨祖细胞、软骨祖细胞、前成软骨细胞或成软骨细胞或它们的混合物，但更优选地，该短语可指前成软骨细胞或成软骨细胞或它们的混合物，例如在某些示例中，该短语可指前成软骨细胞，或者在某些其他示例中，该短语可指成软骨细胞。所有这些术语本身都是公知的。

通过进一步的指导而非限制，成软骨-成骨细胞和/或成软骨细胞谱系的细胞，如软骨-骨祖细胞、软骨祖细胞、前成软骨细胞和成软骨细胞，以及包含软骨-骨祖细胞、软骨祖细胞、前成软骨细胞和/或成软骨细胞的细胞群可显示以下特征：

a)细胞包含SOX9的表达，其为在软骨祖细胞分化和软骨形成过程中起关键作用的转录因子；

b)细胞包含以下至少一种的表达：聚集蛋白聚糖(ACAN)，II型胶原或CD90；

c)细胞基本上不表达CD45(如，小于约10％，优选小于约5％，更优选小于约2％的细胞可表达CD45)；

d)细胞显示原位产生高水平的II型、IX型和XI型胶原和蛋白聚糖(其为透明细胞外基质(ECM)的主要成分)的能力的证据。软骨形成可如通过使用番红-橙/固绿(fastgreen)测定法分别对蛋白聚糖和非胶原染色而常规测定(参见，如Lee et al.TissueEngineering,2011,vol.18,484-98)。

e)人关节软骨细胞可显示如Diaz-Romero等(J Cell Physiol,vol.202(3),731-42,2005)所总结的细胞表达特征，例如，它们可表达整联蛋白和其他粘附分子(CD49a、CD49b、CD49c、CD49e、CD49f、CD51/61、CD54、CD106、CD166、CD58、CD44)，tetraspanins(CD9、CD63、CD81、CD82、CD151)，受体(CD105 CD119、CD130、CD140a、CD221、CD95、CD120a、CD71、CD14)，胞外酶(CD10、CD26)和其他表面分子(CD90，CD99)。在单层培养过程中，软骨细胞可上调某些被认为是间充质干细胞独特的标志物(CD10、CD90、CD105、CD166)。因而，此类标志物也可由不太成熟的前成软骨细胞或成软骨细胞表达。

f)细胞基本上不向脂肪细胞谱系(如，脂肪细胞)或成软骨细胞谱系(如，成软骨细胞、软骨细胞)的细胞分化。可使用本领域建立的标准分化诱导条件(如，参见Pittenger etal.Science,1999,vol.284,143-7)和测定方法(如，诱导时，脂肪细胞通常用油红O染色，显示脂质积累；软前成骨细胞和成骨细胞通常染色ALP)测试没有向这样的细胞谱系分化。基本上缺乏脂肪形成和/或软骨形成分化的倾向通常可意味着应用于相应测试时，小于20％、或小于10％、或小于5％、或小于1％的测试细胞将显示脂肪形成或软骨形成分化的迹象。

在某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可具有成骨特性。

如本文所用的，术语“成骨特性”、“成骨潜能”或“成骨活性”是指细胞在体内和任选地在体外(转)分化为分泌骨基质的细胞的能力或细胞分泌骨基质的能力(即，不需要(转)分化步骤)。该术语包括细胞通过膜内骨化或软骨内骨化形成骨组织的能力。细胞通过膜内骨化形成骨组织的能力通常代表细胞在不需要钙化软骨基质作为模板的情况下形成骨组织的能力。细胞通过软骨内骨化形成骨组织的能力通常代表细胞通过首先形成钙化软骨基质，随后使用所述钙化软骨基质作为骨组织形成的模板来形成骨组织的能力。该术语不包括细胞的骨诱导潜能。

例如，可通过测量这类细胞的成骨活性来确定成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞潜能。成软骨-成骨细胞谱系的人MSC衍生细胞的成骨活性可以体内测量，例如通过在颅盖上经皮下注射向小鼠施用细胞之后确定存在至少一个(如，人或混合的人-鼠来源的)矿化结节进行。成软骨-成骨细胞谱系的人MSC衍生细胞的成骨活性可以体内测量，例如通过在颅盖上经皮下注射向小鼠施用细胞之后评估(如，人或混合的人-鼠来源的)新矿化结节的厚度，或通过评估小鼠股骨节段性亚临界尺寸缺损(sub-CSD)模型中的骨修复程度进行。

例如，成软骨-成骨细胞谱系的人MSC衍生细胞，例如在100μl赋形剂中配制2.5×10⁶个细胞，可通过在颅盖上进行一次皮下施用向裸鼠施用。为标记随时间的骨新形成，在成软骨-成骨细胞的MSC衍生细胞施用之前3天，以及之后4天、8天和12天，可分别向小鼠腹膜内注射依次施用钙结合荧光染料，如茜素红(红色)，钙黄绿素(绿色)、钙黄绿素(蓝色)和四环素(黄色)。小鼠可在细胞施用后2周实施安乐死，并且可收获每只小鼠的颅盖，通过组织形态学评估骨形成特性(如，骨形成的定量)。颅盖的初始和最终厚度可用于计算施用细胞后的骨新形成百分比。此外，还可通过免疫荧光(如，骨形成的鼠或人来源)评估骨形成特性。成骨细胞活性可使用ALP酶活性检测方法对颅盖切片进行评估。成骨细胞活性可使用TRAP酶活性检测方法对颅盖切片进行评估。新形成骨的矿化状态可使用Masson TrichromeGoldner染色对用ALP染色的颅盖切片进行评估，如使用可商购的试剂盒(如，Bio-

)。软骨形成可使用番红-橙染色对颅盖矢状面石蜡切片进行评估。

在进一步的实例中，成软骨-成骨细胞谱系的人MSC衍生细胞，例如在50μl赋形剂中配制的1.25×10⁶个细胞，可在小鼠经历股骨节段性亚临界尺寸缺损之后1天在骨缺损位置通过经皮注射局部向小鼠施用。可通过X射线成像定量骨修复。通过测量骨缺损的两个边缘之间的距离，可定量骨缺损尺寸。

在某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可具有骨诱导特性。

如本文所用的，术语“骨诱导特性”、“骨诱导潜能”或“骨诱导活性”是指细胞吸引其它骨基质分泌细胞和/或诱导其他细胞(转)分化为骨基质分泌细胞的能力。

例如，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞潜能可通过测量这类细胞的骨诱导活性来确定。成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞诱导骨形成的能力可体内测量，例如通过评估在颅盖经皮下注射向小鼠施用细胞之后新矿化骨的厚度，或通过评估小鼠股骨节段性亚临界尺寸缺损(sub-CSD)模型中的骨修复程度进行。成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞诱导骨形成的能力还可通过如ALP底物染色的碱性磷酸酶(ALP)活性评估来测量。

在某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可具有骨诱导和成骨特性。有利地，本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞在移植到有需要的受试者时允许超过与通过现有技术方法获得的MSC或MSC衍生细胞的移植相比的骨新形成的骨新形成。

作为示例而非限制，用于评估成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞身份的合适的细胞表面标志物可以包括CD73、CD105、CD10和CD44。这些细胞表面标志物可如通过可商购的单克隆抗体来检测，例如允许通过流式细胞术进行细胞检测的荧光染料标记的单克隆抗体。特别地，CD73和CD105是间充质标志物；CD44是粘附标志物；CD10是成骨成软骨细胞标志物，其通常由高分数的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞表达。成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞表面上CD73的量通常较高；成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞表面上CD105的量通常较低；成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞表面上CD44的量通常较高。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD44和CD10呈阳性。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD34呈阴性。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD44和CD10呈阳性；并且基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD34呈阴性。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD45,CD3和CD3呈阴性。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD44和CD10呈阳性；并且基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD45、CD34和CD3呈阴性。

在具体实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有以下的任何一个或多个：CD73的标准化荧光强度中值(nMFI)(nMFI_CD73)为至少500，CD44的nMFI(nMFI_CD44)为至少100，或CD105的nMFI(nMFI_CD105)为至多150。例如，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有以下的任何一个或多个：nMFI_CD73为至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850或至少900；nMFI_CD44为至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、至少300或至少350；或nMFI_CD105为至多180、至多170、至多160、至多150、至多140、至多130、至多120、至多110或至多100。优选地，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有至少500的nMFI_CD73、至少100的nMFI_CD44和至多150的nMFI_CD105。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD10或CD44呈阳性(即，在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44)，并且成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有至少500的nMFI_CD73、至少100的nMFI_CD44或至多150的nMFI_CD105中的一个或多个。例如，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD10和CD44呈阳性(即，在细胞表面表达CD73、CD105、CD10和CD44)，并且成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有以下的任何一个或多个：至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850或至少900的nMFI_CD73；至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、至少300或至少350的nMFI_CD44；或至多180、至多170、至多160、至多150、至多140、至多130、至多120、至多110或至多100的nMFI_CD105。优选地，基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD10或CD44呈阳性(即，细胞表面表达CD73、CD105、CD10或CD44)，并且成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有至少500的nMFI_CD73、至少100的nMFI_CD44或至多150的nMFI_CD105中的一个或多个。

如本文所用的，“标准化荧光强度中值”或“nMFI”是指用一种或多种荧光染料缀合的抗体标记的整个分析细胞群的MFI(MFI_{标志物_通道})与用一种或多种荧光染料缀合的同种型对照抗体，如与荧光染料如异硫氰酸荧光素(FITC)、别藻蓝蛋白(APC)或藻红蛋白(PE)缀合的免疫球蛋白G(IgG)对照标记的细胞群的MFI(MFI_{同种型_通道})之比。nMFI结果与存在于感兴趣的群细胞表面的标志物的量成正比。通常将(n)MFI与测量荧光信号发射的波长相关联。

如本文所用的，描述“CD73的nMFI”或“nMFI_CD73”是指用APC缀合的抗CD73抗体(如，BD

目录号：560847)标记的整个分析细胞群的MFI与用APC缀合的IgG对照(如，BD

目录号：555751)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFI_CD73用633nm的激发波长及660nm的APC发射波长来测量。

如本文所用的，描述“CD44的nMFI”或“nMFI_CD44”是指用PE缀合的抗CD44抗体(如，BD

目录号：550989)标记的整个分析细胞群的MFI与用PE缀合的IgG对照(如，BD

目录号：556650)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFI_CD44用488nm的激发波长及580nm的PE发射波长来测量。

如本文所用的，描述“CD105的nMFI”或“nMFI_CD105”是指用APC缀合的抗CD105抗体(如，BD

目录号：562408)标记的整个分析细胞群的MFI与用APC缀合的IgG对照(如，BD

目录号：555751)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFI_CD105用633nm的激发波长及660nm的APC发射波长来测量。

如本文所用的，描述“CD10的nMFI”或“nMFI_CD10”是指用PE缀合的抗CD10抗体(如，BD

目录号：555375)标记的整个分析细胞群的MFI与用PE缀合的IgG对照(如，BD

目录号：556650)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFI₁₀用488nm的激发波长及580nm的PE发射波长来测量。

如前所述，上述详细描述的方法可产生具有优异特性的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或其群，例如特别是(i)ALP的高表达，其代表细胞定型于成软骨-成骨细胞谱系或成骨细胞谱系，和(ii)HLA-DR低表达，其代表成软骨-成骨细胞谱系或成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的有限免疫原性，表明细胞更适于细胞移植，如向同种异体受试者移植。

因此，在具体实施方案中，至少70％(按数量计)(如，至少75％(按数量计)，如≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对碱性磷酸酶(ALP)呈阳性；并且少于10％(按数量计)(如，少于5％(按数量计)，如少于3％、少于2％或少于1％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对HLA-DR呈阳性。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(以数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD10和CD44呈阳性；基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD34呈阴性；至少70％(如，至少75％(按数量计)，如≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对碱性磷酸酶(ALP)呈阳性；并且小于10％(如，少于5％(按数量计)，如少于3％、少于2％或少于1％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对HLA-DR呈阳性。

在具体实施方案中，基本上全部(如，至少90％(以数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD73、CD105、CD10和CD44呈阳性；基本上全部(如，至少90％(按数量计)，如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对CD45、CD34和CD3呈阴性；至少70％(如，至少75％(按数量计)，如≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对碱性磷酸酶(ALP)呈阳性；并且小于10％(如，少于5％(按数量计)，如少于3％、少于2％或少于1％)的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞对HLA-DR呈阳性。

细胞被认为对特定标志物呈阳性(或表达特定标志物或包括特定标志物的表达)，这意味着进行适当测量时，与合适的对照相比，技术人员将推断出针对该标志物的不同信号的存在或证据，例如抗体可检测或通过逆转录聚合酶链式反应检测。该方法允许定量评估标志物时，阳性细胞可平均产生与对照显著不同的信号，例如但不限于，比对照细胞产生的这种信号高至少1.5倍，例如，高至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或甚至更高。

上述细胞特异性标志物的表达可使用本领域已知的任何合适的免疫学技术来检测，例如免疫组织化学或亲和吸附、Western印迹分析、流式细胞术、ELISA等，或通过酶活性的任何合适的生化测定法(如，对于ALP)，或通过测量标志物mRNA的量的任何合适的技术，如Northern印迹、半定量或定量RT-PCR等。本公开中列出的标志物的序列数据是已知的，并且可从诸如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的公共数据库获得。

在某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可以是动物细胞，优选恒温动物细胞，更优选哺乳动物细胞，如人细胞或非人哺乳动物细胞，并且最优选人细胞。

如本文所使用的，术语“体外”是指动物或人体外部或之外的。如本文所使用的，术语“体外”应理解为包括“离体”。术语“离体”通常是指从动物或人体内取出且在体外维持或繁殖(例如在培养容器中)的组织或细胞。

如本文意图的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞优选是贴壁的，即需要表面用于生长，并且通常在所述表面上生长为贴壁单层(即，贴壁细胞培养)，而不是在培养基中生长为自由漂浮的细胞(悬浮培养)。细胞与表面如组织培养塑料容器表面的粘附，可容易地通过倒置显微镜目测来检查。在贴壁培养中生长的细胞需要定期传代，其中细胞可以酶促方式(如，使用胰蛋白酶)从表面移出，悬浮于生长培养基中，并且重新接种到新的培养容器。通常，允许细胞粘附于其上的表面或基底可以是任何基本上亲水的基底。如本领域已知，组织培养容器，如培养瓶、孔板、平皿等，通常可由极其多种聚合材料制成，在模制后进行适当的表面处理或涂覆，以提供亲水性基质表面。如本文所用的，术语“接触”是指将一种或多种分子、成分或材料直接或间接地与另一种分子、成分或材料放在一起，从而促进它们之间的相互作用。通常，能够诱导MSC或MSC衍生细胞的扩增和/或分化的一种或多种试剂可通过将它们包含在培养MSC或MSC衍生细胞的培养基中而与MSC或MSC衍生细胞接触。

在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞。步骤(a)在这里也又称为“原代培养”。

术语“成纤维细胞生长因子2(FGF-2)”、“碱性FGF”、“FGF-b”、“FGFB”、“BFGF”、“肝素结合生长因子2(HBGF-2)”或“前列腺素”可互换使用，是指成纤维细胞生长因子家族的已知成员。本发明人已认识到FGF-2在本发明方法中特别有效。

如本文所使用的，术语“转化生长因子β(TGFβ)”、“TGFB”或“TGFβ”是指转化生长因子β(TGFβ)家族的成员。本发明人已认识到TGFβ在本发明方法中特别有效。在另一实施方案中，所述TGFβ家族成员选自TGF-β-1、TGF-β-2、TGF-β-3、TGF-β-4、GDF1(生长分化因子1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-11、GDF-15、INHA(抑制素α链)、INHBA(抑制素βA链)、INHBB(抑制素βB链)、INHBC(抑制素βC链)、INHBE(抑制素βE链)、MIS(Muellerian抑制因子)，以及GDNF亚族的其他成员，包括GDNF(胶质细胞系衍生的神经营养因子)、NRTN(neurturin)、PSPN(perspin)及其混合物。

在如本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，TGFβ可选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物。优选地，TGFβ是TGFβ1。

在另一实施方案中，除FGF-2和TGFβ外，MSC或MSC衍生细胞可与一种或多种其他外源添加的除FGF-2和TGFβ以外的生长因子接触。在另一实施方案中，FGF-2和TGFβ可以是MSC或MSC衍生细胞接触的唯一外源生长因子。

在优选实施方案中，本发明方法中使用的生长因子是人生长因子。如本文所用的，术语“人生长因子”是指与天然存在的人生长因子基本相同的生长因子。例如，生长因子是蛋白实体时，其组成肽或多肽可具有与天然存在的人生长因子相同的一级氨基酸序列。在本发明方法中优选使用人生长因子，因为预期这种生长因子对细胞功能产生期望的作用。

术语“天然存在的”用于描述可在自然界中发现的不同于由人类人工产生的物体或实体。例如，存在于生物体中的多肽序列是天然存在的，其可从天然来源分离并且尚未在实验室中被人有意修饰。提及特定实体如多肽或蛋白时，该术语包括在自然界中如由于个体之间的正常变异而出现的所有形式和变体。例如，提及蛋白生长因子时，术语“天然存在的”包括由于个体之间的正常等位基因变异而在其组成肽或多肽的一级序列中具有差异的生长因子。

本发明的方法可使用生长因子的生物活性变体或片段。在本发明的方法中，其它条件基本上相同时，生长因子的“生物活性”变体或片段与各自的生长因子实现获得如本文教导的来自MSC的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的至少大致相同程度。

多肽的“变体”具有与多肽的氨基酸序列基本相同(即，大部分但非完全相同)的氨基酸序列。本文中，“基本上相同”是指至少85％相同，如至少90％相同，优选至少95％相同，如至少99％相同。序列差异可能是由于一个或多个氨基酸的插入(添加)、缺失和/或取代。

在另一实施方案中，用于本发明方法的生长因子，即至少FGF-2和TGFβ，可以是非人动物生长因子，特别是非人哺乳动物生长因子，或其生物活性变体或衍生物。如本文所用的，术语“非人动物生长因子”和“非人哺乳动物生长因子”是指分别与天然存在的非人动物或非人哺乳动物生长因子基本相同的生长因子。例如，当生长因子是蛋白实体时，其组成肽或多肽可具有与天然存在的非人动物或非人哺乳动物生长因子相同的一级氨基酸序列。技术人员将理解，非人动物或非人哺乳动物生长因子可适用于本发明的方法，虽然程度低于人动物生长因子，因为后者与MSC细胞来源相同。特别地，如果非人动物或非人哺乳动物生长因子引起期望的效果，如类似于(类似的)人生长因子的效果，则可使用它们。

在优选实施方案中，生长因子或其生物活性变体或衍生物是重组的，即由宿主生物体通过重组核酸分子的表达产生，其中重组核酸分子已经被引入宿主生物体或其祖先中，并且其包含编码所述多肽的序列。如本文所用的，术语“重组核酸分子”是指由使用重组DNA技术连接在一起的片段组成的核酸分子(如，DNA或cDNA分子)。

在如本文教导的方法、应用和细胞产品的某些实施方案中，使MSC或MSC衍生细胞另外接触血浆、血清或其替代物中的一种或多种，诸如其中培养基还包含血浆、血清或其替代物中的一种或多种。

术语“血浆”如常规定义，包括新鲜血浆、解冻的冷冻血浆、溶剂/去污剂处理的血浆、经处理的血浆(如，PRP)或其任意两种或多种的混合物。血浆通常从全血样品中获得，全血样品提供有或接触有抗凝剂(如，肝素(浓度非常低，通常约为15×10-5IU/mL)，柠檬酸盐、草酸盐或EDTA)，随后，通过适当技术，通常通过离心将血液样品的细胞组分从液体组分(血浆)中分离出来。通过特定示例但非限制，为获得适用于本发明的血浆，可将血液样品抽入含有抗凝剂EDTA(乙二胺四乙酸)的Vacutainer管(如，BD Vacutainer塑料EDTA管，10mL，1.8mg/mL)中。轻轻摇动样品，然后在室温下10分钟期间以1,000-2,000g离心，从而将血浆与红细胞分离。收集上清液(血浆)，任选地合并(如果使用多个血液样品)，并等分取样到冷冻小瓶中，其于-80℃保存直至使用。术语“血浆”是指不形成人或动物体的一部分的组合物。在某些实施方案中，术语“血浆”特别包括经处理的血浆，即其从全血中分离之后对血浆进行一个或多个处理步骤的血浆，所述处理步骤改变了其成分，特别是其化学、生化或细胞成分。因此，如本文意图的，术语“血浆”可包括富集血小板的血浆，即已富集血小板的血浆。一般，PRP可含约1.0×10⁶个血小板/μL，而全血中的血小板浓度可以是约1.5×10⁵至3.5×10⁵/μL。

血浆可以是溶剂/去污剂处理的。术语“溶剂/去污剂处理的血浆”、“S/D处理的血浆”或“S/D血浆”通常是指通过包括以下步骤的方法可获得的或获得的去细胞血浆：(a)用溶剂和去污剂处理血浆，和(b)过滤溶剂/去污剂处理过的血浆。适于这种处理的溶剂是US4,764,369中描述的溶剂如二-或三烷基磷酸盐/酯和去污剂。用于制备S/D血浆的去污剂优选是无毒去污剂(如，

20或

80)。

术语“血清”如常规定义，包括新鲜血清、解冻的冷冻血清或由血浆制备的血清，或其任意两种或多种的混合物。血清通常可通过首先使样品中发生凝结，随后通过适当的技术(通常通过离心)将血液样品的如此形成的凝块和细胞组分与液体组分(血清)分离而从全血样品中获得。凝结可通过惰性催化剂如玻璃珠或粉末促进。可选择地，可通过除去抗凝血剂和纤维蛋白从血浆中获得血清。作为示例而非限制，为获得适用于本发明的血清，可将血液样品抽到不含抗凝血剂的Vacutainer管(如，BD Vacutainer Plus塑料血清管，10ml)中，并在室温下温育30至45分钟以允许凝固。然后于室温下以1,000-2,000g离心试管15分钟，以从红细胞中分离血清。收集上清液(血清)，任选地合并(如果使用多个血液样品)并等分取样至冷冻小瓶中，其在于-80℃保存直至使用。因此，术语“血清”是指不形成人或动物体的一部分的无细胞组合物。如本文意图的，血清是人血清，即从单个人受试者或从多个人受试者获得的血清(如，血清混合池)。血清可以是未处理的血清，即通过从全血分离而得到，并且不经受除任选的热灭活、保存(低温或非低温)、灭菌、冷冻干燥和/或过滤外的下游处理步骤的血清，所述下游处理步骤改变其化学、生物化学或细胞组分。在某些实施方案中，血清可从溶剂/去污剂处理的血浆获得。

分离的血浆、血清或其替代物可直接用于本发明的方法。它们也可以适当地保存以备以后使用(如，在高于血浆、血清或其替代物的各自冰点但低于环境温度的温度下持续较短的时间段，如至多约1至2周，该温度通常为约4℃至5℃；或通过冷冻储存较长的时间，通常在约-70℃至约-80℃)。

分离的血浆、血清或其替代物可以如本领域已知的热灭活，特别是除去补体。本发明方法使用对于在血浆、血清或其替代物存在下所培养的细胞而言自体的血浆、血清或其替代物时，可能不必热灭活血浆、血清或其替代物。当血浆、血清或其替代物至少部分对于所培养细胞为同种异体时，加热灭活血浆、血清或其替代物可能是有利的。任选地，血浆、血清或其替代物也可在保存或使用前使用常规微生物过滤器灭菌，优选孔径为0.2μm或更小。

在实施方案中，本发明方法可使用人血浆、血清或其替代物，其对于与其接触的人MSC或MSC衍生细胞是自体的。术语“自体的”涉及血浆、血清或其替代物时表示血浆、血清或其替代物与待与所述血浆、血清或其替代物接触的MSC或MSC衍生细胞获自相同的受试者。自体血浆、血清或其替代物的使用可确保受试者对细胞的最佳接受和/或避免来自如其他血清的传染原的意外传播。

在另一实施方案中，所述方法可采用人血浆、血清或其替代物，其对与其接触的人MSC或MSC衍生细胞是“同源的”或“同种异体的”，即从除获得MSC的受试者外的一个或多个(合并的)人受试者获得。

在进一步的实施方案中，所述方法可使用如上定义的自体和同种异体(即同源)血浆、血清或其替代物的混合物。如本文所用的，短语“血清或血浆的替代物”是指具有血浆和/或血清的一种或多种功能的天然或人工无毒组合物，例如，能够诱导MSC或MSC衍生细胞生长和/或扩增的组合物。血清或血浆替代物的非限制性实例包括血小板裂解物和用于细胞培养的组合物，其包含一种或多种血浆或血清的分级组分，如人血清白蛋白。技术人员理解，人血浆、血清及其替代物是复杂的生物组合物，其可以包含一种或多种生长因子、细胞因子或激素。

除血浆、血清或其替代物中的一种或多种之外，即对于血浆、血清或其替代物中的一种或多种而言外源性地或作为血浆、血清或其替代物中的一种或多种的补充，提供了生长因子FGF-2和TGFβ或它们各自的生物活性变体或衍生物。

如本文所用的，术语“肝素”是指分子量范围为3至30kDa的以其抗凝作用为特征的糖胺聚糖碳水化合物家族的聚合物。肝素或其衍生物或类似物的效力可通过生物学测定法体外确定，其中将防止绵羊或山羊或人血浆凝固所必需的肝素浓度与国际公认的参考标准的浓度相比较，国际公认的参考标准基于每毫克肝素活性的单位。1mg肝素通常等于140至180国际单位(IU)。

术语“IU”或“国际单位”是生物物质的量的标准量度，表示为所述生物物质的生物活性或作用。对于该单位所指定的每种物质，根据国际公认的生物学程序进行测试时，存在有剂量为1IU时预期的国际公认的生物学活性或作用。

在特定实施方案中，肝素或肝素衍生物或其类似物可以选自未分级肝素(UFH)；低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素(eno×aparin)、达肝素(dalteparin)、那屈肝素(nadroparin)、亭扎肝素(tinzaparin)、舍托肝素(certoparin)、瑞肝素(reviparin)、阿地肝素(ardeparin)、帕肝素(parnaparin)、贝米肝素(bemiparin)或其混合物；类肝素(heparinoid)，如硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸acharan、硫酸角质素或其混合物，如达那肝素(danaparoid)；肝素盐；类肝素盐；肝素片段；类肝素片段；以及它们的混合物。优选地，肝素或肝素衍生物或类似物选自UFH、达肝素、达那肝素和硫酸乙酰肝素。

在具体实施方案中，所述FGF-2、所述TGFβ、所述肝素或其衍生物或类似物，以及任选的血浆、血清或其替代物中的一种或多种包含在培养基中，通常是液体细胞培养基。通常，培养基将包含本领域已知的基础培养基配方。许多基础培养基配方(如，可获自美国典型培养物保藏中心，ATCC；或获自Invitrogen，Carlsbad，California)可用于培养本文的细胞，包括但不限于Eagle极限必需培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、α改良极限必需培养基(α-MEM)、基础培养基必需培养基(BME)、BGJb、F-12营养混合物(HAM)、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)或×-VVOTM无血清培养基(临床级)，可从Invitrogen或Cambre×(New Jersey)获得，以及其修饰和/或组合。上述基础培养基的组分通常是本领域已知的，并且本领域技术人员能够根据培养细胞的需要来改变或调节培养基和/或培养基补充物的浓度。这种基础培养基配方含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。作为示例而非限制，这些成分可以包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P和可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲液(如，HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(如，谷胱甘肽)和碳源(如，葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠)等。

为了用于培养，可向基础培养基提供一种或多种其它成分。例如，可使用额外的补充物为细胞提供用于最佳生长和扩增的必需微量元素和物质。这样的补充物包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐及其组合。这些组分可包含在盐溶液中，例如但不限于Hanks平衡盐溶液(HBSS)、Earle盐溶液。可加入另外的抗氧化剂补充物，如β-巯基乙醇。虽然许多基础培养基已经含有氨基酸，但后来可补充一些氨基酸，如L-谷氨酰胺，已知其在溶液中较不稳定。培养基可进一步提供抗生素和/或抗真菌化合物，例如，通常是青霉素和链霉素的混合物，和/或其它化合物，例如但不限于，两性霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、霉酚酸、萘啶酮酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、大观霉素、四环素、泰乐菌素和博来霉素(zeocin)。脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基。这样的脂质和载体可包括但不限于环糊精、胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、非缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸-油酸-花生四烯酸、非缀合的和与白蛋白缀合的油酸等。白蛋白可类似地用于无脂肪酸的配方中。

在具体实施方案中，人血浆、血清或其替代物中的一种或多种可以约0.5％至约30％，优选约1％至约15％，更优选2％至10％的比例(血浆、血清或其替代物中的一种或多种的体积/培养基的体积)包含在所述培养基中。本发明方法可令人满意地进行，其中血浆、血清或其替代物中的一种或多种的量相对较低，如约5或10体积％或更低，例如，约1、约2、约3或约4体积％，从而允许减少为培养MSC或MSC衍生细胞而需要获得的血浆、血清或其替代物中的一种或多种的体积。

在更进一步的实施方案中，可使用浓缩的血浆产品(如，血浆浓缩物，例如来自冷冻血浆的浓缩物)、浓缩的血清产品或浓缩的血浆或血清替代品的产品中的一种或多种。这种浓缩产品可以低于血浆、血清或其替代物中的一种或多种的期望浓度的浓度包含在组合物中，以便抵消(平衡、补偿)浓缩因子。

在具体实施方案中，可使用人血浆、血清和/或其替代物中的任何两种或更多种的组合物或混合物。

在具体实施方案中，FGF-2和TGFβ以足以诱导向期望的细胞类型分化的浓度包含在所述培养基中。

在具体实施方案中，FGF-2和TGFβ以足以诱导MSC分化为MSC衍生的成骨细胞谱系或成骨细胞谱系细胞的浓度包含在所述培养基中。通常，培养基可包含FGF-2或其生物活性变体或片段，其浓度为0.1至100ng/ml，优选0.5至20ng/ml，例如约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6ng/ml，或约5ng/ml或更低，例如约4、3、2、1或0.5ng/ml。通常，培养基可包含TGFβ如TGFβ1或其生物活性变体或片段的浓度为0.1至100ng/ml，优选0.25至20ng/ml，例如约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6ng/ml，或约5ng/ml或更低，例如约4、3、2、1或0.5ng/ml。所述值旨在指外源补充到培养基中的相应生长因子或其生物活性变体或片段的浓度。

在具体实施方案中，肝素或其衍生物或类似物以至少0.01IU/ml、至少0.02IU/ml、至少0.03IU/ml、至少0.04IU/ml、至少0.05IU/ml、至少0.06IU/ml、至少0.07IU/ml、至少0.08IU/ml、至少0.09IU/ml、至少0.1IU/ml、至少0.5IU/ml、至少1IU/ml、至少5IU/ml、至少10IU/ml、至少20IU/ml、至少30IU/ml、至少40IU/ml、至少50IU/ml、至少60IU/ml、至少70IU/ml、至少80IU/ml、至少90IU/ml或至少100IU/ml的浓度包含在所述培养基中。在具体实施方案中，肝素或其衍生物或类似物以至少0.10IU/ml的浓度包含在所述培养基中。在某些优选实施方案中，肝素或其衍生物或类似物以约0.1IU/ml的浓度包含在所述培养基中。在某些实施方案中，肝素或其衍生物或类似物可以约0.10IU/ml、0.20IU/ml、0.30IU/ml、0.40IU/ml、0.50IU/ml、0.60IU/ml、0.70IU/ml、0.80IU/ml、0.90IU/ml或1.0IU/ml的浓度包含在所述培养基中。

在特定实施方案中，肝素或其衍生物或类似物的浓度可为至少0.05IU/ml，优选约0.1IU/ml。

在实施方案中，上述浓度可指培养基中生长因子或其生物活性变体或片段或所述肝素或其衍生物或类似物的总浓度，即指由血浆、血清或其替代物贡献的和另外提供的所述生长因子或其生物活性变体或片段或者所述肝素或其衍生物或类似物的总浓度。

在某些实施方案中，上述浓度可指除由血浆或血清的贡献者外提供的所述生长因子或其生物活性变体或片段或者所述肝素或其衍生物或类似物的浓度。可以理解，如果待添加的生长因子或肝素或其衍生物或类似物在血浆、血清或其替代物中通常不存在(检测不到)，则生长因子或肝素或其衍生物或类似物的总浓度和添加浓度将(基本)相同。

在优选实施方案中，从本文别处定义的受试者的生物样品回收的MSC在培养容器中培养。培养容器可提供塑料表面以使细胞能够粘附。在另一实施方案中，所述表面可以是玻璃表面。在另一实施方案中，表面可用实现粘附和生长细胞的合适材料，例如

层粘连蛋白或胶原涂覆。

在具体实施方案中，MSC可通过选择那些可粘附于基质表面(如，塑料表面)的(单核)细胞而从骨髓(或其他来源)回收。

在某些实施方案中，本文教导的方法可包括(如，作为步骤(a)的一部分)去除非粘附物质并在步骤(a)定义的培养基中进一步培养粘附细胞。

在特定实施方案中，在除去非粘附物质之前，可允许细胞附着约1至8天，通常约2至6天，更通常约4天。否则，在开始步骤(a)后至多8天、至多6天、至多4天，优选至多4天进行除去非粘附物质。

在某些实施方案中，本文教导的方法可包括(如，作为步骤(a)的一部分)用(a)中定义的培养基更换部分或全部培养基。有利地，这允许更新生长因子。在某些实施方案中，可在原代培养期间至少进行一次更换，例如一次、两次或三次。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(a)中培养约13天至约15天的时段。优选地，MSC衍生细胞在步骤(a)中培养约14天的时段。

在某些实施方案中，本文教导的方法可包括(b)第一次传代所述MSC衍生细胞(“第1代”或“P1”)，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞。步骤(b)在本文又称为“继代培养”。

在实施方案中，步骤(b)可包括收集步骤(a)中获得的MSC衍生细胞。

在实施方案中，步骤(b)可包括在步骤(a)定义的培养基中分离、再接种和进一步培养所述MSC衍生细胞，即包含FGF-2、TGFβ和优选浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(b)中培养约8天至约12天的时段。在某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(b)中培养约9天至约11天的时段。优选地，MSC衍生细胞在步骤(b)中培养约10天的时段。

在某些实施方案中，可在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞X天的时段，其中第X天是至少20％的MSC衍生细胞增殖的最后一天。

因此，一方面涉及从间充质干细胞(MSC)获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子β(TGFβ)和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得间充质干细胞(MSC)衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；和

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞X天的时段，其中第X天是至少20％的MSC衍生细胞增殖的最后一天。

在某些实施方案中，可在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞X天的时段，其中第X天是至少25％的MSC衍生细胞增殖(如，处于S和G2/M期)的最后一天。例如，MSC衍生细胞可在步骤(b)中培养X天的时段，其中第X天是至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的MSC衍生细胞增殖(如，处于S和G2/M期)的最后一天。

在本文教导的方法、用途或细胞产品的某些实施方案中，增殖的MSC衍生细胞处于细胞周期的S期、G2期或M期。事件/阶段(G0/G1、S和G2/M期)的细胞周期分析可通过流式细胞术进行，如通过荧光激活细胞分选(FACS)。

在某些实施方案中，可在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞X天的时段，其中第X天是MSC衍生细胞数量高于第X-1天的最后一天。例如，为将第X天确定为MSC衍生细胞数量高于第X-1天的最后一天，可在第二次培养期间培养所述MSC衍生细胞28天(根据如现有技术方法)，可每天收集样品，并且可例如通过手动计数(如，Bürker室)或通过流动细胞术(如，BD Trucount^TM)来确定每个样品的细胞数量或细胞密度(如，表示为#个细胞/cm²)。根据细胞数量，可确定MSC衍生细胞数相对于前一天(即，第X-1天)的最后一天(即，第X天)。

在某些实施方案中，可在步骤(b)培养MSC衍生细胞X天的时段，其中第X天是至少20％的MSC衍生细胞增殖的最后一天，并且MSC衍生细胞高于第X-1天。

在某些实施方案中，在步骤(b)中可将MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。在某些实施方案中，在步骤(b)中可将MSC衍生细胞以5×10²至1×10³个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。优选地，在步骤(b)中可将MSC衍生细胞以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

因此，另一方面，本发明提供了从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；以及

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中将MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度，优选以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

术语“密度”和“细胞密度”在本文中可以互换使用，是指每个单位表面的细胞数量(如，表示为个细胞/cm²)。

在某些实施方案中，本文教导的方法可包括步骤(c)第二次传代所述MSC衍生细胞(“第2代”或“P2”)，并进一步在如(a)中定义的培养基中培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。步骤(c)在本文中也称为“三级培养”。

在步骤(c)中获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可被认为是“第3代”或“P3”细胞。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，在步骤(c)中培养所述MSC衍生细胞约10天至约14天的时段。在某些实施方案中，在步骤(c)中培养所述MSC衍生细胞约11天至约13天的时段。优选地，在步骤(c)中培养所述MSC衍生细胞约12天的时段。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，在步骤(c)中可将MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。在某些实施方案中，在步骤(c)中可将MSC衍生细胞以5×10²至1×10³个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。优选地，在步骤(c)中可将MSC衍生细胞以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

因此，另一方面，本发明提供了从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；以及

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(c)中将MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度，优选以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

技术人员将理解，本文教导的方法可包括进一步的传代。技术人员将理解，这可产生第4代(P4)、第5代(P5)、第6代(P6)、第7代(P7)、第8代(P8)、第9代(P9)或第10代(P10)的细胞培养物。第0代(P0)可指尚未分离和/或再接种的MSC或MSC衍生细胞。

在某些实施方案中，本文教导的方法可包括冷冻保存成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。在某些实施方案中，本文教导的方法可包括(d)将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞重悬于适于向受试者施用的冷冻保存介质中。通过将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞重悬于适于向受试者施用的冷冻保存介质中，可获得适于直接向受试者施用的细胞产品。细胞产品可通过冷冻保存方便地保存，冷冻保存的细胞产品根据要求可容易地运输和递送。因此，适于施用的细胞产品可根据要求立即用于治疗。此外，通过本方法获得的冷冻保存的细胞产品允许进行细胞产物的所有放行测试并在施用细胞产品之前获得结果。

在某些实施方案中，本文教导的方法可包括(d)将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞重悬于适于向受试者施用的冷冻保存介质中；(e)冷冻保存成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

因此，另一方面，本发明涉及从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞；

(d)将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞重悬于适于向受试者施用的冷冻保存介质中；以及

(e)冷冻保存成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在某些实施方案中，本文所教导的方法可包括(d)将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以临床浓度重悬于适于向受试者施的冷冻保存介质中；(e)冷冻保存成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。这样的临床浓度有利地允许通过本发明方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞直接施用于受试者，而在施用成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞之前无需任何进一步稀释或浓缩步骤或额外的漂洗步骤。

在某些实施方案中，本文教导的方法可包括冷冻保存成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，从而获得适于施用的细胞产品。适于施用的细胞产品可直接递施用于需要其的受试者，而无需在施用之前进行额外的漂洗步骤。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，在步骤(d)中将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的浓度重悬于冷冻保存介质中。例如，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以约1×10⁷个细胞/ml至约8×10⁷个细胞/ml，约1×10⁷个细胞/ml至约6×10⁷个细胞/ml，或约2×10⁷个细胞/ml至约5×10⁷个细胞/ml的浓度重悬于步骤(d)的冷冻保存介质中。优选地，在步骤(d)中将成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的浓度重悬于冷冻保存介质中。

在某些实施方案中，适于施用的细胞产品包括浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。例如，适于施用的细胞产品包括浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约8×10⁷个细胞/ml，约1×10⁷个细胞/ml至约6×10⁷个细胞/ml，或约2×10⁷个细胞/ml至约5×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。优选地，适于施用的细胞产品包括浓度为约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在某些实施方案中，适于施用的细胞产品包括在冷冻保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。例如，适于施用的细胞产品包括在冷冻保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约8×10⁷个细胞/ml，约1×10⁷个细胞/ml至约6×10⁷个细胞/ml，或约2×10⁷个细胞/ml至约5×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。优选地，适于施用的细胞产品包括在冷冻保存介质中浓度为约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，冷冻保存介质可包含抗氧化化合物，如苯并吡喃。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，冷冻保存介质可包含二甲基亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合。在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，冷冻保存介质可包含DMSO、HAS、腺苷、(多)肽、抗氧化化合物或其组合。这样的冷冻保存介质有利地允许施用通过本发明方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，而在成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞施用于受试者之前无需额外的漂洗步骤。

在某些实施方案中，适于施用的细胞产品包括在包含DMSO、HAS、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合的低温保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。例如，适于施用的细胞产品包括在包含DMSO、HAS、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合的冷冻保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约8×10⁷个细胞/ml，约1×10⁷个细胞/ml至约6×10⁷个细胞/ml，或约2×10⁷个细胞/ml至约5×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。优选地，适于施用的细胞产品包括在包含DMSO、HAS、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合的冷冻保存介质中浓度为约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在某些实施方案中，适于施用的细胞产品包括在包含DMSO、HAS、腺苷、(多)肽、抗氧化化合物或其组合的冷冻保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/毫升的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。例如，适于施用的细胞产品包括在包含DMSO、HAS、腺苷、(多)肽、抗氧化化合物或其组合的冷冻保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约8×10⁷个细胞/ml，约1×10⁷个细胞/ml至约6×10⁷个细胞/ml，或约2×10⁷个细胞/ml至约5×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。优选地，适于施用的细胞产品包括在包含DMSO、HAS、腺苷、(多)肽、抗氧化化合物或其组合的冷冻保存介质中浓度为约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，冷冻保存介质可以是包含核苷(如，腺苷)，糖(如，右旋糖酐40、右旋糖、蔗糖、甘露醇、乳糖酸)，三肽(如，L-谷胱甘肽)，缓冲液(如，N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸))，盐(如，氢氧化钠、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、氯化钙、氯化镁)和DMSO。可商购的冷冻保存介质是

CS10细胞冷冻保存介质(C2874，Merck KGaA，Darmstadt，Germany)。其他实例是C

CS5、CS2或CSB细胞冷冻保存介质(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)。

在某些实施方案中，冷冻保存介质可包含至少1％、至少2％、至少5％或至少10％的DMSO。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，冷冻保存介质可以是包含核苷(如，腺苷)，糖(如，右旋糖酐40、右旋糖、蔗糖、甘露醇、乳糖酸)，三肽(如，L-谷胱甘肽)，缓冲液(如，N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸))，盐(如，氢氧化钠、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、氯化钙、氯化镁)和苯并吡喃(如，6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二-2-羧酸)。可商购的冷冻保存介质是Hypo

FRS保存液(H4416,Merck KGaA,Darmstadt,Germany).

术语“Trolox”或“6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸”可互换使用。

在某些实施方案中，冷冻保存介质可包含至少1％、至少2％、至少5％或至少10％的苯并吡喃。在某些实施方案中，冷冻保存介质可包含至少1％、至少2％、至少5％或至少10％的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸。

在本文教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(a)中培养约13天至约15天的时段，并且在步骤(b)中培养约8天至大约12天的时段。在本文教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(a)中培养约13天至约15天的时段，并且在步骤(c)中培养约10天至约14天的时段。在本文教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(b)中培养约8天至约12天的时段，并且在步骤(c)中培养约10天至约14天的时段。在本文教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(a)中培养约13天至约15天的时段，在步骤(b)中培养约8天至约12天的时段，并且在步骤(c)中培养约10天至约14天的时段。

在本文所教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(a)中培养约14天的时段，并且在步骤(b)中培养约10天的时段。在本文教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(a)中培养约14天的时段，并且在步骤(c)中培养约12天的时段。在本文教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(b)中培养约10天的时段，并且在步骤(c)中培养约12天的时段。在本文教导的方法的某些实施方案中，MSC衍生细胞可在步骤(a)中培养约14天的时段，在步骤(b)中培养约10天的时段，并在步骤(c)中培养约12天的时段。

在本文教导的方法的某些实施方案中，可将MSC衍生细胞在步骤(b)中以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度接种以进一步培养，并在步骤(c)中以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

在本文教导的方法的某些实施方案中，可将MSC衍生细胞在步骤(b)中以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养，并在步骤(c)中以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

另一方面，本发明提供了通过本文定义的方法可获得或获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群。

描述“成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群”或“成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“群”是指期望的细胞类型的细胞(如，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞)的基本上纯(即，主要由其组成)和均一的组。

另一方面涉及通过体外或离体扩增MSC可获得或获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其中悬浮液中至少90％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于25μm(D90≤25μm)的直径，并且悬浮液中至多1％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有大于35μm的直径。在成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群的某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞通过本文定义的方法可获得或获得。

如在实施例部分的示例，本文教导的方法产生成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或包含其的群，其具有优异的特性，例如，特别是比先前所述MSC衍生细胞更小且更均一的尺寸。通过本文所述的方法可获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的更小且更均一的尺寸使得细胞具有改善的移植特性。更特别地，通过本文所述方法可获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的更小且更均一的尺寸使得细胞适于所有施用途径，特别是血管内施用，尤其是通过提供良好的体内安全性和/或可注射性减少或消除肺栓塞和梗死的风险。此外，通过本文所述方法可获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞允许以有限的施用体积现场递送可调的高细胞浓度。

在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的平均直径小于25μm、小于24μm、小于23μm、小于22μm、小于21μm或小于20μm。优选地，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的平均直径小于20μm。

术语“悬浮液”和“细胞悬浮液”通常是指分散在液相中的MSC衍生细胞，特别是活的MSC衍生细胞。

在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的平均直径大于10μm、大于11μm、大于12μm、大于13μm、大于14μm或大于15μm。

在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的平均直径为10μm至25μm，优选15μm至20μm。

在特定实施方案中，悬浮液中至少90％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的直径等于或小于25μm(D90≤25μm)，等于或小于24μm(D90≤24μm)，等于或小于23μm(D90≤23μm)，等于或小于22μm(D90≤22μm)，等于或小于21μm(D90≤21μm)或等于或小于20μm(D90≤20μm)，优选等于或小于25μm(D90≤25μm)。

在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于25μm的D₉₀(D₉₀≤25μm)，并且悬浮液中至多1％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有大于35μm的直径。在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于24μm(D90≤24μm)，等于或小于23μm(D90≤23μm)，等于或小于20μm小于22μm(D90≤22μm)，等于或小于21μm(D90≤21μm)或等于或小于20μm(D90≤20μm)的D90，且悬浮液中至多1％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有大于35μm的直径。

在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于25μm的D90(D90≤25μm)，并且悬浮液中至多1％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有大于30μm的直径。在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于24μm(D90≤24μm)，等于或小于23μm(D90≤23μm)，等于或小于22μm(D90≤22μm)，等于或小于21μm(D90≤21μm)或等于或小于20μm(D90≤20μm)的D90，且悬浮液中至多1％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有大于30μm的直径。

在特定实施方案中，悬浮液中成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有约25μm至约10μm(10μm≤D90≤25μm)，约24μm至约10μm(10μm≤D90≤24μm)，约23μm至约10μm(10μm≤D90≤23μm)，约22μm至约10μm(10μm≤D90≤22μm)，约21μm至约10μm(10μm≤D90≤21μm)或约20μm至约10μm(10μm≤D90≤20μm)，优选约25μm至约10μm(10μm≤D90≤25μm)的D90。

细胞直径可通过本领域已知的任何方法来确定，例如通过数字显微镜和用于图像分析的附带软件(如，Motic Image

2.02)。本文提及平均细胞直径应基于自由漂浮、非附着状态的细胞的直径来确定，因此细胞处于悬浮液中。优选将细胞悬浮于包含透明、无毒、等渗缓冲液如PBS和任选的用于分化活细胞和死细胞的染料如台盼蓝的溶液中。优选地，至少应测量上百个细胞以考虑统计学上显著的分析。

另一方面涉及包含本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群的组合物。在某些实施方案中，该组合物还可包含一种或多种其他组分。例如，可包括能够维持或增强细胞存活力的组分。作为示例而非限制，这些组分可包括确保基本上等渗条件的盐、pH稳定剂如缓冲系统(如，确保基本上中性的pH，如磷酸盐或碳酸盐缓冲系统)、载体蛋白如白蛋白、包括基础培养基和/或培养基补充物的培养基、血清或血浆、营养物、碳水化合物源、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂或本领域技术人员公知的其它物质。还公开了通过将各自的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞与上述一种或多种其他成分混合来生产所述组合物的方法。组合物可以是如液体，或者可以是半固体或固体(如，可以是冷冻组合物，或可作为凝胶存在，或可存在于固体支持物或支架上等)。

术语“组合物”、“配制剂”或“制剂”在本文可互换使用。

在特定实施方案中，该组合物是药物制剂，其包含本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。

因此，另一方面，本发明提供了包含本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群的药物制剂。

如本文所用的，术语“药学上可接受的”与本领域一致，意指与药物组合物的其它组分相容，并且对其接受者无害。

如本文所用的，“载体”或“赋形剂”包括任何和全部溶剂、稀释剂、缓冲剂(如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、增溶剂、胶体、分散介质、媒介物、填充剂、螯合剂(如，EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(如，甘氨酸)、蛋白、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、用于实现储库效应的试剂、包衣、抗真菌剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、张力控制剂、吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。这些物质应该是无毒的，并且不应干扰细胞的活性。

载体或赋形剂或其他物质的精确种类将取决于施用途径。例如，组合物可以是肠胃外可接受的水溶液形式，其无热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性。对于药物制剂的一般原理，读者可以参考Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,by G.Morstyn&W.Sheridan eds.,Cambridge UniversityPress,1996；以及Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000。

液体药物制剂通常可包括液体载体，如水或药学上可接受的水溶液。例如，可包括生理盐水溶液、组织或细胞培养基、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

组合物可包括一种或多种细胞保护分子、细胞再生分子、生长因子、抗凋亡因子或调节细胞中基因表达的因子。这些物质可使细胞不依赖于其环境。

这样的药物制剂可包含确保其中细胞存活力的其它组分。例如，组合物可包含合适的缓冲体系(如，磷酸盐或碳酸盐缓冲体系)以达到期望的pH，更通常接近中性pH，并且可包含足够的盐以确保细胞的等渗条件以防止渗透应激。例如，用于这些目的合适溶液可以是本领域已知的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、氯化钠溶液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液。此外，组合物可包含载体蛋白，如白蛋白(如，牛或人白蛋白)，其可增加细胞的存活力。

进一步合适的药学上可接受的载体或添加剂是本领域技术人员熟知的，例如，可选自蛋白如胶原或明胶，碳水化合物如淀粉、多糖、糖(右旋糖、葡萄糖和蔗糖)，纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠或羧甲基纤维素钙、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素，预胶化淀粉，果胶琼脂，角叉菜胶，粘土，亲水胶(金合欢胶、瓜尔胶、阿拉伯胶和黄原胶)，藻酸，藻酸盐，透明质酸，聚乙醇酸和聚乳酸，葡聚糖，果胶，合成聚合物如水溶性丙烯酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，蛋白聚糖，磷酸钙等。

如果需要，可在支持物、支架、基质或材料上施用细胞制剂以提供改善的组织再生。例如，该材料可以是粒状陶瓷，或生物聚合物如明胶、胶原或纤维蛋白原。多孔基质可根据标准技术合成(如，Mikoset Al，Biomaterials14:323,1993；Mikoset Al，Polymer35:1068,1994；Cooket Al，Biomed.Material.Res.35:513,1997)。这样的支持物、支架、基质或材料是可生物降解的或不可生物降解的。因此，细胞可被转移到合适的基质和/或在合适的基质培养，例如多孔或无孔基质，以提供植入物。例如，如果需要，可将已经增殖或在培养皿中分化的细胞转移到三维固体支持物，以便通过在本发明的液体营养培养基中温育固体支持物来使它们增殖和/或继续分化过程。细胞可转移到三维固体支持物，例如通过用含有所述细胞的液体悬浮液浸渍所述支持物。以这种方式获得的浸渍载体可植入受试者体内。在最终植入之前，也可通过将这些浸渍的支持物浸入液体培养基中来再培养它们。三维固体支持物需要是生物相容的，以便其能够被植入人中。它可以是生物可降解的或非生物可降解的。

细胞或细胞群可以允许它们存活、生长、繁殖和/或分化成期望的细胞类型如肝细胞的方式施用。细胞或细胞群可移植到或可迁移到并植入预期器官如骨损伤内。可设想将细胞或细胞群植入其它部位。

在实施方案中，以上定义的药物细胞制剂可以液体组合物的形式施用。在实施方案中，细胞或包含其的药物组合物可以全身、局部、在器官内、在器官功能障碍或损伤的部位或在组织损伤的部位施用。

优选地，药物组合物可包含治疗有效量的期望的细胞。术语“治疗有效量”是指可在组织、系统、动物或人中引起研究者、兽医、医生或其他临床医师所寻求的生物学或医学反应，并且尤其可预防或减轻所治疗的疾病或病症的一种或多种局部或全身症状或特征的量。合适的治疗有效量可由有资格的医师根据所需细胞的性质、疾病状况和严重性以及受试者的年龄、尺寸和状况来确定。

还提供了通过将本发明的细胞与一种或多种以上所述的其他组分以及与一种或多种如上所述的药物赋形剂混合来制备所述药物组合物的方法。

在实施方案中，上文定义的药物制剂可以液体或粘性组合物的形式施用。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，药物制剂还可包括具有骨传导特性的组分，如磷酸三钙、羟磷灰石、羟磷灰石/磷酸三钙颗粒的组合物、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸、透明质酸或其衍生物、壳聚糖、聚l-赖氨酸、明胶、胶原、骨粘连蛋白、纤维蛋白原、骨钙素、或其组合。

术语“骨传导”是指组分用作支架的能力，在该支架上的细胞，如本文所教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，可附着、迁移、生长和产生新骨。

如上所述，本文教导的药物制剂可包括在修复骨创伤和骨缺损中有用的组分。药物制剂可包含具有骨传导性能的支架或基质。药物制剂可与脱钙骨基质(DBM)或其他基质组合，以制备成骨及骨传导和骨诱导的复合物。使用具有同种异体DBM的自体骨髓细胞的类似方法已产生较好结果(Connolly et al.1995.Clin Orthop 313:8-18)。

本文教导的药物制剂可进一步包括以下或与以下共同施用：补充生物活性因子或骨诱导蛋白如骨形态发生蛋白，如BMP-2、BMP-7或BMP-4或任何其他生长因子。其他潜在的伴随组分包括适于辅助骨再生的钙或磷酸盐的无机来源(WO 00/07639)。如果需要，可在载体基质或材料上施用细胞制剂以提供改善的组织再生。例如，该材料可以是水凝胶，或生物聚合物如明胶、胶原、透明质酸或其衍生物、骨胶、纤维蛋白原或骨钙蛋白。生物材料可根据标准技术合成(如，Mikos et al.,Biomaterials 14:323,1993；Mikos et al.,Polymer35:1068,1994；Cook et al.,J.Biomed.Mater.Res.35:513,1997)。

还公开了布置或试剂盒，其包含用于如例如全身性，如通过注射向受试者施用本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或本文教导的药物制剂的手术仪器或设备，其还进一步包含本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或本文教导的药物制剂。

另一方面，本发明提供了本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，或本文所定义的药物制剂，其用作药物。

另一方面，本发明提供了如本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，或本文定义的药物制剂，其用于治疗需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞的受试者。

在相关方面，本发明提供了治疗需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞的受试者的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的本文定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或药物制剂，其中该药物制剂包含成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群。在相关方面，本发明提供了以上定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或药物制剂在制备用于治疗需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞的药物中的用途，其中该药物制剂包含成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群。

如本文所用的，术语“治疗”或“处理”是指治疗性处理和预防性或防止性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减轻、病情稳定(即，未恶化)、疾病进展和并发症发生的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻。“治疗”也可指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活。

如本文所用的，术语“需要移植成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的受试者”包括将受益于治疗给定病症，优选本文定义的病症或疾病的受试者，如哺乳动物或人受试者。这样的受试者通常包括但不限于已诊断出所述病症的那些、倾向于患有或发展所述病症的那些和/或待预防所述病症的那些。

术语“移植”或“细胞移植”具有其正常含义，并且特别是指向受试者施用细胞。术语“细胞移植”可与“细胞疗法”互换使用。细胞移植可通过本领域已知的任何技术进行。作为示例而非限制，细胞可通过输注移植到受试者。通常，细胞输注可以胃肠外进行，如血管内、皮下、皮内或肌内，优选血管内。细胞可例如但不限于全身、局部或在损伤部位施用。很明显，取决于具体应用、靶组织、治疗目的或细胞类型，可相应地调整施用途径以及制剂、浓度等。

在本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或药物制剂可适于经皮、骨内、关节内、椎间或血管内施用。

在本文所教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或药物制剂可适于在骨缺损的部位施用。

本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的均一且小的细胞尺寸导致在静脉内向受试者施用所述细胞时减少或废除急性毒性。因此，本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞特别适于血管内或经皮施用。

因此，在特定实施方案中，可经皮或血管内向需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞的受试者施用以上定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞或成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或药物制剂。

此外，发明人发现，通过本文教导的方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有成骨特性。

因此，在特定实施方案中，需要移植成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的受试者可以是患有肌肉骨骼疾病的受试者。

如本文所用的，术语“肌肉骨骼疾病”是指任何类型的骨病、肌肉疾病、关节病或软骨营养障碍，其治疗可能会受益于向患有疾病的受试者施用本药物制剂。特别地，这种疾病可通过以下表征：例如，降低的骨和/或软骨形成或过量的骨和/或软骨吸收，减少骨中存在的成骨细胞或骨细胞和/或软骨中存在的成软骨细胞或软骨细胞的数量、存活力或功能，减少受试者的骨量和/或软骨量，骨变薄，骨强度或弹性受损等。

肌肉骨骼疾病的非限制性实例可包括局部或全身性病症，如任何类型的骨质疏松或骨质减少，如原发性、绝经后、老年、肾上腺皮质激素诱导的、双膦酸盐诱导的和放射疗法诱导的；任何继发性、单位点或多位点骨坏死；任何类型的骨折，如不愈合、畸形愈合、延迟愈合骨折或压缩、颌面骨折；需要骨愈合的病症(如，脊柱愈合和重建)；先天性骨缺损；骨重建，如在外伤或癌症手术后，和颅面骨重建；创伤性关节炎、局灶性软骨和/或关节缺损、局灶性退行性关节炎；骨关节炎、退行性关节炎、膝关节病和髋关节病；成骨不全症；溶骨性骨癌；佩吉特病；内分泌紊乱；低磷酸盐血症；低血钙症；肾性骨营养不良；骨软化症；动力缺失性骨病、甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进；牙周病；Gorham-Stout病和McCune-Albright综合征；类风湿性关节炎；脊椎关节病，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎、肠病性关节病、和未分化的脊椎关节炎和反应性关节炎；系统性红斑狼疮和相关综合征；硬皮病和相关病症；干燥综合征；全身性血管炎，包括巨细胞动脉炎(Horton’s病)、Takayasu’s动脉炎、风湿性多肌痛、ANCA-相关的血管炎(例如韦格纳肉芽肿病、显微多血管炎和Churg-Strauss综合征)、Behcet’s综合征和其它多动脉炎和相关病症(例如结节性多动脉炎、Cogan’s综合征和Buerger’s病)；伴随其他全身性炎性疾病的关节炎，包括淀粉样变性和结节病；晶体关节病，包括痛风、焦磷酸钙二水合物疾病、与磷酸钙或草酸钙晶体的关节沉积有关的病症或综合征；软骨软化和神经性关节病；费尔特综合征和赖特综合征；莱姆病和风湿热。

在具体实施方案中，需要移植成软骨-成骨细胞谱系的受试者可以是患有骨相关病症的受试者。

因此，如本文所用的，术语“骨相关病症”是指任何类型的骨病，其治疗可受益于向患有病症的受试者移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞，如骨软骨祖细胞、骨祖细胞、前成骨细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。特别地，这样的病症可通过以下表征：例如，降低的骨和/或软骨形成或过量的骨和/或软骨吸收，减少骨中存在的成骨细胞或骨细胞的数量、存活力或功能，减少受试者的骨量，骨变薄，骨强度或弹性受损等。

作为示例而非限制，可受益于移植通过本发明方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的骨相关病症可包括局部或全身性病症，如任何类型的骨质疏松症或骨质减少，如原发性、绝经后、老年、皮质激素诱导的、任何继发性、单或多位骨坏死，任何类型的骨折，如不愈合、畸形愈合、延迟愈合骨折或压迫，需要骨愈合的病症(如，脊柱重建和愈合)、上颌面骨骨折、骨重建，如创伤性损伤或癌症手术后的骨重建、颅面骨重建、成骨不全、溶骨性骨癌、佩吉特病、内分泌疾病、低磷酸盐血症、低钙血症、肾性骨营养不良、骨软化关节炎、老年性骨病、类风湿性骨机能亢进、甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进、牙周病、Gorham-Stout病和McCune-Albright综合征。

本文所述的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞、成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群和药物制剂可单独使用或与用于各自病症的任何已知疗法或活性化合物组合使用。施用可同时进行或按任何顺序进行，如其他地方所述。

如果细胞源自异源(即，非自体、非同源或非同种异体)来源，通常可施用伴随的免疫抑制疗法，如使用免疫抑制剂，如环孢菌素或他克莫司(FK506)。

待施用的细胞量将随待治疗的受试者而变化。在优选实施方案中，可向人受试者施用的待施用的细胞量是10²至10¹⁰或10²至10⁹，或10³至10¹⁰或10³至10⁹，或10⁴至10¹⁰或10⁴至10⁹，例如10⁴至10⁸，或10⁵至10⁷，例如约1×10⁵，约5×10⁵，约1×10⁶，约5×10⁶，约1×10⁷，约5×10⁷，约1×10⁸，约5×10⁸，约1×10⁹，约2×10⁹，约3×10⁹，约4×10⁹，约5×10⁹，约6×10⁹，约7×10⁹，约8×10⁹，约9×10⁹或约1×10¹⁰个细胞。在其他实施方案中，可向人受试者施用10⁶至10⁸个细胞/kg体重或1×10⁷至9×10⁷个细胞/kg体重，例如，约1×10⁷、约2×10⁷、约3×10⁷、约4×10⁷、约5×10⁷、约6×10⁷、约7×10⁷、约8×10⁷、约9×10⁷或约1×10⁸个细胞/kg体重。例如，这样的细胞数量或这样的细胞数/kg体重可特别指待施用于受试者的细胞总数量，所述施用可适当地分布在一天或多天(如，1、2、3、4或5天或更多天)施用的一个或多个剂量中(如，分布在2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个剂量中)。然而，治疗有效剂量的精确确定可基于每个患者独特的因素，包括他们的尺码、年龄、组织损伤大小和自损伤发生的时间量，并且可由本领域技术人员根据本公开和本领域的知识容易地确定。

适当地，在待施用的药物制剂中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可以约10⁴个细胞/ml至约10⁹个细胞/ml，优选约10⁵个细胞/ml至约10⁸个细胞/ml，更优选约1×10⁶个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的浓度存在。

在某些实施方案中，待施用的药物制剂包含浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。在某些实施方案中，待施用的药物制剂包含浓度为约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在某些实施方案中，待施用的药物制剂包含在冷冻保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。在某些实施方案中，待施用的药物制剂包含在冷冻保存介质中浓度为约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在某些实施方案中，待施用的药物制剂包括在包含DMSO、HAS、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合的冷冻保存介质中浓度为约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。在某些实施方案中，待施用的药物制剂包括在包含DMSO、HAS、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合的冷冻保存介质中浓度为约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

在如本文教导的方法、应用或细胞产品的某些实施方案中，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可以约1×10⁷个细胞/ml至约1×10⁸个细胞/ml的浓度，优选约2×10⁷个细胞/ml至约4×10⁷个细胞/ml的浓度存在于如待施用的药物制剂药物中。

本文教导的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞尺寸减小允许可调和/或高细胞浓度。因此，如果组合物是液体组合物，则包含通过本文教导的方法获得的待向需要转移MSC衍生细胞的受试者施用的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的组合物的体积小于包含通过其他方法获得的MSC衍生细胞的组合物的体积。

本申请还提供了以下陈述中列出的方面和实施方案：

陈述1.从间充质干细胞(MSC)获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子β(TGFβ)和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得间充质干细胞(MSC)衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；和

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞X天的时段，其中第X天是至少20％的所述MSC衍生细胞增殖的最后一天。

陈述2.根据陈述1的方法，其中在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞约8天至约12天的时段，优选约10天的时段。

陈述3.根据陈述1或2的方法，其中在步骤(a)中培养所述MSC衍生细胞约13天至约15天的时段，优选约14天的时段。

陈述4.根据陈述1至3中任一项的方法，其中在步骤(c)中培养所述MSC衍生细胞约10天至约14天的时段，优选约12天的时段。

陈述5.根据陈述1至4中任一项的方法，其中所述增殖的MSC衍生细胞处于细胞周期的S期、G2期或M期。

陈述6.从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；以及

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中将所述MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度，优选以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

陈述7.根据陈述6的方法，其中在步骤(c)中将所述MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度，优选以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

陈述8.从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，该方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞；

(d)将所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞重悬于适于向受试者施用的冷冻保存介质中；以及

(e)冷冻保存所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

陈述9.根据陈述8的方法，其中在步骤(d)中将所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以约1×10⁷/ml至约1×10⁸/ml的浓度，优选约2×10⁷/ml至约4×10⁷/ml的浓度重悬于冷冻保存介质中。

陈述10.根据陈述8或9的方法，其中所述冷冻保存介质包括二甲基亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合。

陈述11.根据陈述1至10中任一项的方法，其中TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物；优选其中TGFβ是TGFβ1。

陈述12.根据陈述1至11中任一项的方法，其中：

-肝素或其衍生物或类似物的浓度为约0.1IU/ml；和/或

-肝素或肝素衍生物或其类似物选自：未分级肝素(UFH)；低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素、达肝素、那屈肝素、亭扎肝素、舍托肝素、瑞肝素、阿地肝素、帕肝素、贝米肝素或它们的混合物；类肝素，如硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸acharan、硫酸角质素或其混合物，如达那肝素；肝素盐；类肝素盐；肝素片段；类肝素片段；及其混合物。

陈述13.根据陈述1至12中任一项的方法，其中使所述MSC或MSC衍生细胞另外接触血浆、血清或其替代物中的一种或多种，如其中所述培养基另外包含血浆、血清或其替代物中的一种或多种。

陈述14.根据陈述1至13中任一项的方法，其中所述受试者是人受试者。

陈述15.成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其可通过陈述1至14中任一项的方法获得或通过陈述1至14中任一项的方法获得。

陈述16.成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其可通过体外或离体扩增MSC获得或通过体外或离体扩增MSC获得，其中悬浮液中至少90％的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于25μm的直径(D₉₀≤25μm)，并且其中悬浮液中至多1％的成骨软骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有大于35μm的直径。

陈述17.根据陈述16的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其中所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可通过陈述1至14中任一项定义的方法获得或通过陈述1至14中任一项定义的方法获得。

陈述18.药物制剂，其包含陈述15至17中任一项定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群。

陈述19.根据陈述18的药物制剂，其中所述药物制剂还包含具有骨传导性质的组分，如磷酸三钙、羟基磷灰石、羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒的组合物、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸、透明质酸或其衍生物、壳聚糖、聚-L-赖氨酸、明胶、胶原、骨连接蛋白、纤维蛋白原、骨钙蛋白或其组合。

陈述20.根据陈述15至17中任一项的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，或者根据陈述18或19的药物制剂，其作为药物应用，优选用于治疗需要移植成软骨-成骨细胞谱系的细胞受试者。

陈述21.根据陈述20的应用的群或药物制剂，其中：

-所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以约1×10⁷/ml至约1×10⁸/ml的浓度，优选约2×10⁷/ml至约4×10⁷细胞/ml的浓度存在；和/或

-所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或药物制剂适于经皮、骨内、关节内、椎间或血管内施用；

-所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或药物制剂适于在骨缺损部位施用。

虽然已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显然，根据前面的描述，许多替换、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，在所附权利要求的精神和宽范围内，本发明包括所有这些替代、修改和变化。

本文公开的方面和实施方案进一步由以下非限制性实施例支持。

实施例

实施例1：根据本发明实施方案获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法

补充有5％

(Octapharma)、0.1UI/ml肝素(LEO Pharma)、FGF-b(CellGenIX)和TGFβ-1(Humanzyme)的常规培养基用作培养基。

从健康志愿者供体的髂嵴获得20至60ml人骨髓(BM)抽吸物。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm²的密度接种于培养基中，并在含有5％CO₂的加湿培养箱中于37℃温育。细胞接种后4天，除去未贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，除去一半培养基，并用新鲜培养基更换以更新生长因子。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第1代：P1)。将中间细胞冷冻保存(

CS10)并于液氮中储存。每个细胞库都来自一个供体，并且供体之间没有合并。

接着，将中间细胞解冻并以572个细胞/cm²的密度重新接种进行继代培养。在继代培养期间培养细胞10天。第24天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第2代：P2)。将中间细胞冷冻保存(

CS10中)并于液氮中储存。

随后，将中间细胞解冻并以572个细胞/cm²的密度重新接种进行三级培养。在三级培养期间培养细胞10天。第34天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第3代：P3)。为获得最终细胞产品，将细胞以25×10⁶个细胞/ml的终浓度重悬于

中。该细胞产品在本文中称为“细胞产品C-新鲜”。

三级培养结束时，也将细胞冷冻保存以长期储存。再将细胞重悬于冷冻保存培养基中以达到期望的浓度(25×10⁶个细胞/ml)。然后将细胞悬浮液转移到冷冻管，将所述冷冻管于液氮中储存。该细胞产品在本文中称为“细胞产品C-冷冻”或“骨形成细胞C-冷冻(保存)”，又被简称为“B-F细胞C”。冷冻保存介质为：

-

CS10(BioLife Solutions公司)，或

-50％(v/v)

CS10(BioLife Solutions公司)和50％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)，或

-95％(v/v)

CS10(BioLife Solutions公司)和5％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)，或

-80％(v/v)

(BioLife Solutions公司)，10％(v/v)DMSO和10％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)。

比较实施例1：用于获得间充质干细胞和MSC衍生细胞的现有技术方法

下面描述根据现有技术的比较细胞产品及其生产方法。

间充质干细胞

从健康志愿者供体的髂嵴获得人骨髓(BM)抽吸物来制备未分化的MSC。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm²的密度接种于常规培养基中，并在含有5％CO₂的加湿培养箱中于37℃温育。24小时后，除去培养基，并添加新鲜培养基。每隔2-3天更换培养基。当超过一半的集落达到80％汇合或一些集落达到100％汇合时，收获细胞(第1代：P1)。第一次传代时，将细胞直接冷冻保存于

CS10中。为完成培养过程，将MSC解冻，以572个细胞/cm²接种进行继代培养。当超过一半的集落达到80％汇合或一些集落达到100％汇合时收获细胞，获得第2代(P2)MSC。该细胞产品在本文中称为“MSC”。

细胞产品A

将补充有5％

(50:50自体血清和

(Octapharma))，FGF-b(CellGenIX)和TGFβ-1(Humanzyme)的常规培养基用作培养基。

冷冻培养基：80％常规培养基，10％Octaserum(50:50自体血清和

(Octapharma))，10％DMSO。

通过从健康志愿者供体的髂嵴获得人BM抽吸物来制备本文称为“细胞产品A”的体外分化的MSC衍生细胞。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm²的密度接种于培养基中，并在含有5％CO₂的加湿培养箱中于37℃温育。细胞接种后4天，除去未贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，除去一半培养基，并用新鲜培养基更换。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第1代：P1)。将中间细胞于

CS10(BioLife Solutions公司)或冷冻介质中冷冻保存并于液氮中储存。

为进行继代培养，将细胞解冻并以1144个细胞/cm²的密度重新接种。在继代培养期间培养细胞14天。第28天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第2代：P2)。为获得最终细胞产品，将细胞以25×10⁶个细胞/ml的终浓度重悬于

中。该细胞产品在本文中称为“细胞产品A”。

细胞产品B

将补充有5％

(Octapharma)，0.1UI/ml肝素(LEO Pharma)，FGF-b(CellGenIX)和TGFβ-1(Humanzyme)的常规培养基用作培养基。

通过从健康志愿者供体的髂嵴获得人BM抽吸物来制备体外分化的MSC衍生细胞。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm²的密度接种于培养基中，并在含有5％CO₂的加湿培养箱中于37℃温育。细胞接种后4天，除去未贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，除去一半培养基，并用新鲜培养基更换以更新生长因子。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第1代：P1)。将中间细胞于

CS10(BioLife Solutions公司)中冷冻保存并于液氮中储存。

接着，将细胞解冻并以286个细胞/cm²的密度重新接种进行继代培养。在继代培养期间培养细胞14天。第28天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第2代：P2)。为获得最终细胞产品，将细胞以25×10⁶个细胞/ml的终浓度重悬于

中。该细胞产品在本文中称为“细胞产品B”。

实施例2：通过根据本发明实施方案的方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以及通过现有技术方法获得的MSC和MSC衍生细胞的体外细胞表征

材料与方法

细胞

如实施例1所述获得示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C新鲜和细胞产品C冷冻)。如比较例1所述获得比较细胞产品(即，MSC、细胞产品A和细胞产品B)。

细胞计数和存活力

使用台盼蓝排除测定法来确定细胞密度和存活力。收获后，用台盼蓝(0.4％，Lonza

)以1:2稀释细胞，并使用Bürker室(Sigma-

)和倒置显微镜(AE31，

)分析细胞存活力。细胞存活力还使用氨基放线菌素D(7-AAD,BD

)、BD FACSCanto II^TM和BD FACSDiva^TM软件(Becton

)通过流式细胞术分析。收获后，将50,000个细胞在具有2.5μl 7-AAD的磷酸盐缓冲盐水PBS-1％牛血清白蛋白(BSA)(Lonza

)中于室温下黑暗温育10分钟。

流式细胞术

收获如以上比较实施例1和实施例1所述获得的比较细胞产品(即，MSC和MSC衍生细胞：细胞产品A和B)和示例本发明的细胞产品(即，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞：细胞产品C)，并通过流式细胞术(BD FACScanto^TM II和BD FACSdiva^TM软件；BectonDickinson)分析细胞表面标志物。将细胞与以下缀合的单克隆抗体于室温下一起温育15分钟：抗CD73、抗CD90、抗CD105和抗CD166(它们是间充质标志物，并且应当由MSC或MSC衍生细胞高度表达)、抗CD3、抗CD34和抗CD45(它们是造血标志物，并且应当基本上不存在于MSC或MSC衍生细胞中)、抗CD44、抗CD51/61、抗CD49a-e、抗CD29(它们是粘附标志物)、抗CD40、抗CD86和抗HLA-DR(它们是免疫原性标志物)和抗碱性磷酸酶(ALP)，然后用PBS漂洗，之后离心并再悬浮于0.3ml PBS。

为了表征细胞表面标志物CD105、CD73、CD10和CD44，将在PBS-1％BSA中1×10⁶个细胞/ml浓度的5×10⁴个细胞与5μl抗体一起黑暗温育10分钟。在该温育时间后，细胞用PBS漂洗一次。用于细胞外染色的不同抗体如下：别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD105抗体

目录号：562408)，抗CD73抗体(BD

目录号：560847)，藻红蛋白(PE)缀合的抗CD10抗体(BD

目录号：555375)，抗CD44抗体(BD

目录号：550989)。非特异性染色通过将细胞与缀合有FITC、APC和PE的免疫球蛋白G(IgG)对照(全部为BD

目录号分别为：556649；555751；556650)一起温育来确定。分析之前，对单峰(singlets)和感兴趣的群体进行门控。使用FACSCanto^TMII(BD

)和FACS

8.0软件

对门控群体的1×10⁴个事件进行流式细胞术分析。用于分析的设置参数用珠(BD ComppBeads

目录号：560497)自动进行。对于每种缀合物，将阳性截止值固定在1％的对照同种型抗体阳性并且确定各标志物的阳性。还测定了整个分析群体的荧光强度中值(MFI)，并除以相应同种型对照抗体的MFI，以获得标准化MFI(nMFI)。

表1：实施例中使用的抗体的供应商和目录号概述

ALP酶活性测量

ALP酶活性通过基于对硝基苯磷酸盐/酯(pNPP)水解的生物化学测定法来测量。pNPP经ALP脱磷酸化后，变为黄色，可用分光光度计在410nm处检测。相对于基于纯化的小牛肠ALP活性的标准曲线测定细胞的ALP酶促活性。ALP活性报告为单位ALP/mg蛋白。1单位ALP于37℃下1分钟内水解1μmol pNPP。

逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

收获后，将细胞以干燥沉淀的形式(500,000个细胞)于-80℃保存直至RNA提取。根据制造商的说明，使用

Mini试剂盒

提取总RNA。使用

16

测量RNA浓度。根据制造商的说明，使用

RT试剂盒

对1μg总RNA提取物进行RNA反式转录(RT)。按照制造商的说明，自2μl cDNA使用

进行qPCR。定量下列感兴趣基因的表达水平：RUNX2(正向：GGTTCCAGCAGGTAGCTGAG(SEQ ID NO:1),反向：AGACACCAAACTCCACAGCC(SEQ ID NO:2)),SOX9(F:TAAAGGCAACTCGTACCCAA(SEQ ID NO:3),R:ATTCTCCATCATCCTCCACG(SEQ ID NO:4),BMP2(F:GGAACGGACATTCGGTCCTT(SEQ ID NO:5),R:CACCATGGTCGACCTTTAGGA(SEQ ID NO:6)),ALPL(F:ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG(SEQ ID NO:7),R:AGACATTCTCTCGTTCACCGCC(SEQID NO:8)),MMP13(F:TGGAATTAAGGAGCATGGCGA(SEQ ID NO:9),R:AACTCATGCGCAGCAACAAG(SEQ ID NO:10)),CHI3L1(F:TGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGA(SEQ ID NO:11),R:GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA(SEQ ID NO:12)),DCN(F:AAAATGCCCAAAACTCTTCAGG(SEQ ID NO:13),R:GCCCCATTTTCAATTCCTGAG(SEQ ID NO:14)),OCN(F:AAGGTGCAGCCTTTGTGT(SEQ IDNO:15),R:GCTCCCAGCCATTGATACAG(SEQ ID NO:16)),SPON1(F:CCTGCGGAACTGCCAAGTA(SEQID NO:17),R:CACGGGTGAGCCCAATTCT(SEQ ID NO:18)),POSTN(F:TTTGGGCACCAAAAAGAAAT(SEQ ID NO:19),R:TTCTCATATAACCAGGGCAACA(SEQ ID NO:20))。使用

480

进行qPCR，一式两份。使用从三个管家基因获得的几何平均值进行标准化：RPL13A(F:CATAGGAAGCTGGGAGCAAG(SEQ ID NO:21),R:GCCCTCCAATCAGTCTTCTG(SEQ ID NO:22)),TBP(F:AACAACAGCCTGCCACCTTA(SEQ ID NO:23),R:GCCATAAGGCATCATTGGAC(SEQ IDNO:24)),HPRT(F:CCCTGGCGTCGTGATTAGT(SEQ ID NO:25),R:GTGATGGCCTCCCATCTCCTT(SEQID NO:26))。通过使用2-ΔΔCt方法计算每个感兴趣的基因的基因表达(倍数变化)，对来自同一供体的不同MSC衍生细胞产品进行比较(Schmittgen and Livak，2008，3(6)，1101-8；Nature Protocols，3(6)，1101-1108)。

使用

(13.1.0)软件进行统计分析。将以倍数变化表示的RT-qPCR数据进行对数(log)转换，并进行学生检验(α＝0.05)以评估在各细胞类型之间观测到统计学显著的差异。统计学显著性根据获得的p值(p)以图形表示：*表示p<0.05，**表示p<0.01，和***表示p<0.001。

多重测定

收获后，将细胞以50,000个细胞/cm²的密度接种。在含有5％CO₂的潮湿气氛中于37℃温育48小时后，收获细胞培养上清液，离心(1500rpm，室温下5分钟)并于-80℃保存。上清液使用Human Magnetic

测定法(R&

通过

分析进行分析。预混合的多重体系是定制的(R&

)。研究以下分泌因子：BMP-2、COL1A1、MMP13、OPN、OPG、SPARC、RANKL、CHI3L1。按照制造商的说明进行分析，并使用

(R

和Bio-PlexManager 5.0TM软件

进行分析。

细胞尺寸测量

收获比较实施例1和实施例1所述获得的比较细胞产品(即，MSC和MSC衍生细胞：细胞产品A和B)和示例本发明的细胞产品(即，成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞：细胞产品C)，并以12.5×10⁶个细胞/ml的细胞密度悬浮于含有0.4％台酚蓝的PBS中。将10μl细胞悬浮液置于刻度载玻片

然后用盖玻片保护，置于放大40倍的倒置显微镜下(AE31；Motic)。通过Motic Image

2.02软件分析用置于显微镜的照相机(Moticam)拍摄的图像以测量细胞直径。测量至少100个细胞，认为分析是统计学显著的。

还通过流式细胞术(BD FACS Canto II^TM和BD FACS Diva^TM软件；BectonDickinson)分析在离体培养的不同时间获得的细胞尺寸。简言之，如实施例1或对比实施例1所述离体细胞培养开始后第21、23、26和28天，收获细胞，以1×10⁶个细胞/ml的细胞密度悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并用流式细胞仪分析以进行前向散射(FSC)测量(以相对荧光单位表示)。前向散射测量激光路径方向上的散射光，因此给出通过流动室的细胞的相对尺寸。

结果

培养产率

示例本发明的方法显著增加了临床应用的同种异体细胞的可用性(即，从一份骨髓捐赠中获得的细胞数量)，因为总体培养产率显著增加(表2，细胞产品C-新鲜相比细胞产品A和B)。

表2：比较细胞产品(即，细胞产品A、细胞产品B)和示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C)各自的培养产率

平均值±SD，考虑批次之间的可变性，包括由于供体效应的可变性(骨髓起始材料之间的可变性)；PDL:群翻倍水平是细胞数量翻倍的时间；*总体产率考虑所有连续培养(从第0天细胞接种到生产过程结束和生成MSC衍生细胞)的培养产率的积累；NA:不可用

细胞标志物表达谱

流式细胞术分析显示，基于细胞产品A、细胞产品B(根据现有技术的比较方法产生)和进行或未进行最终冷冻保存的细胞产品C(由示例本发明的方法产生)的细胞表面标志物表达谱的一般细胞身份是类似的。

它们全部表达间充质标志物CD73、CD90和CD105，并且不表达造血标志物CD45、CD34和CD3(少于5％的细胞群表达这些标志物)(表3)。细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)(i)表达低水平的II类MHC细胞表面受体如HLA-DR，和(ii)高度表达ALP(表3和表4)。以HLA-DR弱表达代表的弱免疫原性有利于允许将细胞移植到例如同种异体受试者中(表3)。另外，与未分化的MSC相比，细胞产品A、细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)在其表面上高度表达粘附标志物CD49e和酶ALP(表3和表4)。ALP的高表达突出显示细胞产品A，细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)定型于成骨细胞谱系。

细胞表面标志物表达谱不仅通过细胞表面标志物的存在(群体的阳性率)来表征，而且还通过分析不同标志物的细胞表面上表达的标志物的量(群体标准化荧光中值)来表征。这些分析突出显示不同MSC衍生细胞之间的一些差异。

在肝素存在下培养的细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)表达的ALP水平高于在没有肝素下培养的MSC和细胞产品A(ALP-PE nMFI结果)，从而增强了它们定型于骨形成细胞的成骨细胞谱系。

间充质标志物CD73和CD105的细胞表面表达还取决于细胞类型。在肝素存在下产生的细胞产品(细胞产品B和细胞产品C，进行或未进行最终冷冻保存的)表达的CD73和CD105水平高于细胞产品A。此外，细胞产品C的表面似乎比细胞产品B具有更多的CD73和CD105，尤其是当细胞产品C未经过最终的冷冻保存时(表5)。分化的细胞产品A、B和C比未分化的MSC表达更高量的细胞标志物CD10。此外，细胞产品C在其表面上比细胞产品A和B具有更多的CD10(表5)。

nMFI流式细胞术分析表明，与其他细胞类型相比，细胞产品C中CD73和CD44蛋白表达更加升高(图1)。

RT-qPCR和多重测定

分析显示，与MSC相比，细胞产品C-新鲜中的基因RUNX2显著(*)过表达，但与细胞产品B相比显著(*)下调(表6a)。与MSC和细胞产品A相比，细胞产品C-新鲜中的MMP13基因显著(*)上调，但是其表达在细胞产品B中仍然显著(*)更高(表6a)。

另一方面，与所有其他细胞类型相比，细胞产品C-新鲜中的基因SPARC和KI67显著(**)下调(表6a)。对于细胞产品C-新鲜和MSC，相等表达PPARG基因，且与细胞产品A和B相比显著(***)下调(表6a)。

此外，与MSC相比，细胞产品C-冷冻保存中的基因BMP2、SOX9、MMP13和ALPL显著过表达(表6b)，表明它们参与成软骨-成骨细胞谱系。

表6a：比较细胞产品(即，MSC、细胞产品A、细胞产品B)和示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C-新鲜)的基因表达谱(以相对于平均MSC值的倍数变化表示—统计学显著性根据获得的p值(p)用图表示：*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，NS：不是统计学显著的)

SD：标准差

表6b：比较细胞产品(即，MSC)和示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C-冷冻保存)的基因表达谱(以相对于平均MSC值的倍数变化表示)

SD：标准差

细胞尺寸

使用(i)Motic

2.0软件和(ii)流式细胞仪FSC分析进行细胞尺寸测量，证实细胞产品B、细胞产品C-新鲜和细胞产品C-冷冻比细胞产品A更小且更均一(表7，图2)。

非常有趣的是，绝大多数细胞产品C(至少90％)的直径不超过25μm，其中少于1％的直径超过35μm。相反，细胞产品A仅包括35.4％的直径不超过25μm的细胞和26.9％的直径大于35μm的细胞(表8，图2)。细胞产品B包括73.7％的直径不超过25μm的细胞和3.3％的直径大于35μm的细胞(表8，图2)。

表7比较细胞产品(即，MSC、细胞产品A、细胞产品B)和示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C)的直径

表8比较细胞产品(即，MSC、细胞产品A、细胞产品B)和示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C)的细胞尺寸分布

实施例3：通过实施例1的方法获得的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的体内骨形成

材料与方法

细胞

如实施例1所述获得示例本发明的细胞产品(即，细胞产品-冷冻)。

小鼠

10-11周的雌性NMRI-裸鼠(nu/nu)购自Janvier S.A.S.(Le Genest-St-Isle,France)，并在标准条件下饲养，随意取食和饮水。

颅盖骨形成小鼠模型

将12周龄的雌性NMRI-裸鼠(nu/nu)用异氟烷

麻醉，并在颅盖骨上接受单次皮下施用细胞产品C-冷冻(每只小鼠2.5×10⁶个细胞/100μl)或赋形剂(100μl)。为标记随时间的骨新形成，将钙结合的荧光染料依次施用于小鼠。分别在细胞施用之前2或3天和之后5、12和19天腹膜内注射茜素红(红色)，钙黄绿素(绿色和蓝色)和四环素(黄色)(均来自Sigma-

)。施用后，监测实验动物的体重、整体临床体征和施用部位的临床体征达4周。在细胞施用后4周，通过颈脱位法对小鼠实施安乐死，并收集每只小鼠的颅盖，通过X射线成像、组织形态学(骨形成的定量)和免疫荧光法评估骨形成细胞的骨形成特性。

通过X射线分析定量骨形成

安乐死时，使用

MX-20设备对并排放置的每只小鼠的颅盖进行离体X射线成像。在手动模式下以1.5X放大率拍摄数字图像，其中电压设置为35kV，曝光时间为4.8秒，亮度/对比度为8300/6000。生成的X射线图像是灰度图像，其灰度强度值的范围为0(黑色区域)到255(白色区域)，并且与射线不透明度成正比，因而与骨不透明度或骨厚度成正比。使用

软件的直方图工具分析顶骨(手动选择)上骨形成的骨诱导部分(从选择中丢弃矿化结节)的灰度强度值。

X射线成像和

软件还用于定量矿化结节的表面(手动选择)。

样品包埋和组织切片法

为进行组织形态测定术，ALP、TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)、Masson TrichromeGoldner染色和免疫荧光法，将颅盖固定并脱水，其中在70％、80％和90％乙醇浴中于4℃下在轻轻摇动的情况下各自连续温育12小时，并包埋在甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)塑料树脂(HistoResin，

)中。使用切片机(

RM2255)切下4μm厚和8μm厚的冠状面。

免疫荧光染色

在4μm厚的颅盖冠状面塑料组织切片上通过免疫荧光评估人和鼠胶原I。简言之，于室温(RT)下使用PBS 1X/Triton 0.3％溶液透化30分钟的步骤后，将组织切片在封闭溶液(即，PBS/BSA/马血清/Triton^TM)中于室温下温育1小时，以使非特异性结合位点饱和。然后将组织切片与小鼠抗人和兔抗鼠胶原I一抗(分别为Abcam；#ab138492和Abcam；#ab21286)于4℃温育过夜。在PBS中于室温下进行5分钟的3次漂洗步骤后，于室温下用封闭液封闭1小时即可实现封闭。然后添加稀释于封闭溶液的二抗，室温避光2小时。将二抗

488驴抗兔IgG H&L(ThermoFisher，#A21206)和

山羊抗小鼠IgG H&L(Abcam；#ab97035)分别用于显现小鼠胶原I(绿色)和人胶原I(红色)。然后将载玻片在1X PBS中于室温下漂洗3次，达5分钟，然后于室温下与

溶液一起温育1分钟，以染色细胞核。最后，将载玻片在PBS中短暂冲洗一次，然后在

试剂中封固。作为免疫荧光的阴性对照，在邻近的组织切片上省略了一抗。

组织学染色

分别使用ALP和TRAP酶活性检测方法在颅盖切片上评估成骨细胞和破骨细胞的活性。为了进行ALP染色，将4μm厚的颅盖冠状面塑料切片与固蓝RR盐(Sigma-

)和萘酚AS-MX碱性磷酸盐(Sigma-

)溶液一起温育1小时。根据制造商的说明，使用酸性磷酸酶，白细胞(TRAP)试剂盒(Sigma-

)在8μm厚的颅盖冠状面塑料切片上进行TRAP染色。为评估新形成骨的矿化状况，根据制造商的说明，使用试剂盒(Bio-

)对用ALP染色的颅盖切片进行Masson Trichrome Goldner染色。用光学显微镜

和

LAS EZ软件拍摄数字图像。

颅盖的组织形态计量学分析

对塑料包埋的组织进行骨形成(即，绝对骨形成)的定量。通过

图像分析软件(Zeiss)，在4μm厚的冠状面上测量有矿化结节和无矿化结节的绝对新形成的骨厚度(从茜素红荧光标记的基底矿化前缘到钙黄绿素和四环素荧光标记的骨新形成)的测量值(以μm计)。对于每只动物，在5个独立水平上进行4次绝对厚度测量，每个水平之间的距离为200μm。第一步，计算每只动物的平均厚度(有结节或无结节)±SD(即，5个水平上每个水平的4个测量值的平均值)。

统计分析

结果表示为平均值±标准差(SD)。使用

(SAS Institute公司)或

软件进行统计分析。p＜0.05时，组之间的差异被认为是统计学显著的。

结果

施用了细胞产物C-冷冻的小鼠在施用后4周显示出比对照更高的骨形成(图8A-C)。与赋形剂相比，骨形成细胞C-冷冻的骨不透明度显著更高(图8B)。与未观测到矿化结节的赋形剂相比，骨生成表面显著更高(图8C)。与赋形剂相比，骨形成细胞C-冷冻的有或无骨生成(由绝对骨形成表示)的骨诱导的组织形态学测量值显著更高(图8D-E)。另外，除骨诱导活性外，骨形成细胞C-冷冻促进高成骨活性，突出显示为矿化结节的存在。在4/5个骨髓供体(或批量生产)和65％的小鼠中观测到这种成骨活性(图8F)。在每组一只小鼠中观测到至少一个矿化结节时，该供体/批次被认为是成骨的(阳性)。施用赋形剂后未观测到结节。

更特别地，细胞产品C-冷冻显示骨诱导特性(颅盖上的来自鼠来源的均一骨形成)和成骨特性(来自人和鼠来源的矿化结节)(图9)。

沿颅盖表面诱导膜内宿主骨化(图9和图10)。更具体地，骨形成细胞C-冷冻显示骨诱导和成骨特性(图10，“fluo”)。小鼠/人I型胶原双免疫标记(图10，“人I型胶原”)显示存在宿主和供体来源的骨(成骨)。在矿化结节中大多检测到成骨细胞(图10，“ALP+”)和破骨细胞(图10，“TRAP”)活性，表明施用后4周结节中的骨重塑过程仍在进行。该观测结果取决于结节的大小：结节越大，施用后4周仍存在更多的ALP和TRAP活性。突出显示弱的类骨质(图10，“Goldner’s Masson Trichrome染色”)，表明完成骨形成过程。

因此，冷冻保存的骨形成细胞C增加了骨新形成。

这表明如说明书和实施例所述的细胞产品和细胞组合物在治疗扁平骨和长骨的骨缺损中的有用性。

实施例4：通过实施例1的方法获得的细胞产品C-冷冻修复的体内小鼠节段性股骨亚临界尺寸缺损(sub-CSD)

实验程序

细胞

如实施例1所述获得示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C-冷冻)。

节段性股骨(亚)临界尺寸缺损(SFCSD)模型

根据文献((Manassero et al.,2013,Tissue Engineering,Part C Methods,19(4):271-80；Manassero et al.,2016,Journal of Visualized Experiments；(116):52940)在无菌条件下进行手术程序。简言之，用异氟烷

或腹膜内注射盐酸右美托咪定(

Orion Pharma，1mg/kg体重)和氯胺酮(

Euronet，150mg/kg体重)的混合物麻醉13周龄的NMRI-雌性裸鼠(nu/nu)，并将其腹部位置置于加热板上。在左股骨前侧应用6孔PEEK微锁定板

之后，使用Gigli锯和夹具

进行2mm长的骨干中段股骨截骨术。作为预防性药物，在手术前一天(在饮用水中)施用抗生素(

10mg/kg体重)，并在手术前一天和手术后每隔12个小时至少3天施用镇痛剂(盐酸丁丙诺啡，

Stemring-Plough，0.1mg/kg体重)。手术后第二天使用100

注射器通过经皮注射在骨缺损部位局部施用冷冻保存的MSC衍生细胞C(1.25×10⁶个细胞/小鼠，体积为50μl)或赋形剂(对照组)。在细胞或赋形剂施用后10周，通过颈脱位对小鼠实施安乐死。解剖每只小鼠的左股骨，收获，并在X射线成像前于室温保持在0.9％NaCl中。

通过X射线分析定量骨修复

手术后使用

MX-20设备，对每只小鼠的左股骨进行体内X射线成像，以控制板固定，节段性股骨缺损尺寸并获得基线，并且施用MSC衍生细胞或赋形剂后每两周进行直到10周。在手动模式下以5倍放大倍数拍摄中外侧和前后视图的数字图像，电压设置为35kV，曝光时间为4.8秒，亮度为4,300，对比度为7,100。

通过3种不同方法测量效力，即，骨修复百分比、改编的影像学联合评分(radiographic union score，RUS)和融合评分，每两周监测：

-通过将修复缺损尺寸除以初始缺损尺寸来计算骨修复百分比。使用

软件，通过测量中外侧和前后X射线图像上两个位置处(两个皮质)骨缺损的两个边缘之间的距离(μm)，对每只小鼠的缺损尺寸进行定量。计算每只小鼠在每个时间点的4次测量值的平均值。

-针对SFCSD模型改编的RUS(影像学联合评分)是基于存在或不存在骨新形成、桥接和骨折线(来自前后和中外侧的影像学图像)的半定量测量。评分对应于两个视图上2个皮质缺损部位确定的4个评分的总和(总共4个评分，每个范围为1-4)。因此，评分范围从4(无愈合迹象)至16(完全愈合)。

-融合评分是二进制分数，其评估股骨缺损边缘之间的融合速率。用于定义融合的放射学标准是可视化至少3个皮质中缺损的桥接(

E et al.,Acta Orthop TraumatolTurc.2014,48(5),533-40)。分数是0(无融合)或1(融合)。对于此参数，仅分析最后一个时间点(此处为W10)。

统计分析

结果表示为平均值±标准差(SD)。使用

(SAS Institute公司)或

软件进行统计分析，该统计分析包括双向ANOVA重复测量，接着Bonferroni事后检验。p＜0.05时，组之间的差异被认为是统计学显著的。

结果

与赋形剂相比，施用后2至10周，在节段性股骨亚CSD模型中冷冻保存的骨形成细胞C显著改善并加速骨折修复的百分比(图11和图12)(p<0.001)。此外，与赋形剂组相比，冷冻保存的骨形成细胞C组的RUS评分显著提高(图13)。最后，与施用赋形剂后无融合相比，施用冷冻保存的骨形成细胞C后10W，也改善了融合速率，9/19(47％)的小鼠中具有融合。

这表明说明书和实施例所述的细胞产品和细胞组合物在治疗长骨和扁平骨的骨缺损中的有用性。

实施例5：根据动力学研究和标志物表达分析的继代和三级培养的持续时间

在不同时间点(D21，D22，D23，D24，D25和D28)收获在以上实施例1所述的继代培养后获得的根据本发明实施方案的MSC衍生细胞，并通过流式细胞术(BD FACSCanto II^TM和BDFACSDiva^TM软件；Becton Dickinson)分析细胞周期。

使用BD Pharmigen^TM BrdU Flow试剂盒，用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色总细胞DNA。简言之，将10⁵个细胞固定在100μl BD Cytofix/Cytoperm缓冲液中，然后于环境温度下温育20分钟，并用1ml BD Perm/洗涤缓冲液漂洗，然后以300g离心5分钟。弃去上清液，将细胞在100μl BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus中透化，然后于4℃温育10分钟，并用BD Perm/洗涤缓冲液漂洗，然后以300g离心5分钟。弃去上清液，将细胞再次固定在100μl BD Cytofix/Cytoperm缓冲液中(于环境温度下5分钟)，并用BD Perm/洗涤缓冲液漂洗，以300g离心5分钟。在20μl 7-AAD溶液中染色总细胞DNA，然后于环境温度下黑暗温育10分钟。将1ml染色缓冲液添加到样品，之后转移到流式细胞术的改编管中。

用FACSCanto^TMII流式细胞仪(Becton-Dickinson)分析样品，并在通过650nm长通滤光片后收集7-AAD发射。

图3和图4显示D24时细胞位于靠近增殖曲线的末端。细胞尚未脱离细胞周期，而从D25开始，细胞大体上脱离细胞周期，即它们不再增殖。

图4示出在不同培养持续时间下继代培养中细胞的事件/阶段(G0/G1，S和G2/M)的细胞周期分析。D24时仍有42％的细胞增殖(11％S和31％G2/M)，而从D25开始，细胞大体上脱离细胞周期。因此，继代培养的最佳持续时间为24天。

在不同的时间点收获如实施例1所述在三级培养后获得的MSC衍生细胞：从第34天(D34)至第42天(D42)的每一天，并如实施例2所述通过流式细胞术分析细胞表面标志物的表达。

对成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的细胞群进行的流式细胞术标志物表达分析表明，分化标志物(BMP2、RUNX2、ZNFS21、SPARC、MMP13、CHI3L1)的表达从D34增加至D42(图5)，并且增殖标志物KI67表达在培养持续期间(从D34至D42)降低。

图6示出8个批次的不同培养持续时间的细胞密度。D36时细胞密度通常更高。通过细胞计数法(BD Trucount^TM)对细胞进行计数。图7示出2个批次的不同培养持续时间的平均细胞直径尺寸。细胞直径在D35和D36最小。因此，细胞计数和细胞尺寸测量表明，细胞在D35和D38之间达到增殖平台期，并且在D35和D36时细胞尺寸最小(图6和图7)。

鉴于此并且考虑到D36时最高的细胞密度，三级培养的最佳持续时间为36天。

序列表

<110> 骨治疗股份公司

<120> 用于分化间充质干细胞的方法

<130> BONE-018-PCT

<150> EP18196717.5

<151> 2018-09-25

<150> EP19169084.1

<151> 2019-04-12

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Runx2正向引物

<400> 1

ggttccagca ggtagctgag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Runx2反向引物

<400> 2

agacaccaaa ctccacagcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOX9正向引物

<400> 3

taaaggcaac tcgtacccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOX9反向引物

<400> 4

attctccatc atcctccacg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP2正向引物

<400> 5

ggaacggaca ttcggtcctt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP2反向引物

<400> 6

caccatggtc gacctttagg a 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALPL正向引物

<400> 7

accattccca cgtcttcaca tttg 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALPL反向引物

<400> 8

agacattctc tcgttcaccg cc 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP13正向引物

<400> 9

tggaattaag gagcatggcg a 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP13反向引物

<400> 10

aactcatgcg cagcaacaag 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHI3L1正向引物

<400> 11

tgggtctcaa agattttcca aga 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHI3L1反向引物

<400> 12

gctgtttgtc tctccgtcca 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DCN正向引物

<400> 13

aaaatgccca aaactcttca gg 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DCN反向引物

<400> 14

gccccatttt caattcctga g 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCN正向引物

<400> 15

aaggtgcagc ctttgtgt 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCN反向引物

<400> 16

gctcccagcc attgatacag 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SPON1正向引物

<400> 17

cctgcggaac tgccaagta 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SPON1反向引物

<400> 18

cacgggtgag cccaattct 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POSTN正向引物

<400> 19

tttgggcacc aaaaagaaat 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POSTN反向引物

<400> 20

ttctcatata accagggcaa ca 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPL13正向引物

<400> 21

cataggaagc tgggagcaag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPL13反向引物

<400> 22

gccctccaat cagtcttctg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBP正向引物

<400> 23

aacaacagcc tgccacctta 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBP反向引物

<400> 24

gccataaggc atcattggac 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPRT正向引物

<400> 25

ccctggcgtc gtgattagt 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPRT反向引物

<400> 26

gtgatggcct cccatctcct t 21

Claims (21)

1.从间充质干细胞(MSC)获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，所述方法包括：

(a)在包含成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子β(TGFβ)和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得间充质干细胞(MSC)衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；和

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞达X天的时段，其中第X天是至少20％的所述MSC衍生细胞增殖的最后一天。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中培养所述MSC衍生细胞约8天至约12天的时段，优选约10天的时段。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)中培养所述MSC衍生细胞约13天至约15天的时段，优选约14天的时段。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中培养所述MSC衍生细胞约10天至约14天的时段，优选约12天的时段。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述增殖的MSC衍生细胞处于细胞周期的S期、G2期或M期。

6.从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，所述方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；以及

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞，

其中在步骤(b)中将所述MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度，优选以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(c)中将所述MSC衍生细胞以3×10²至1×10³个细胞/cm²的密度，优选以3×10²至8×10²个细胞/cm²的密度接种以进一步培养。

8.从MSC获得成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的方法，所述方法包括：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品回收的MSC，从而获得MSC衍生细胞；

(b)第一次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞；

(c)第二次传代所述MSC衍生细胞，并在如(a)中定义的培养基中进一步培养所述MSC衍生细胞，从而获得所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞；

(d)将所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞重悬于适于向受试者施用的冷冻保存介质中；以及

(e)冷冻保存所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤(d)中将所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以约1×10⁷/ml至约1×10⁸/ml的浓度，优选约2×10⁷/ml至约4×10⁷/ml的浓度重悬于所述冷冻保存介质中。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述冷冻保存介质包括二甲基亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)、腺苷、多肽、苯并吡喃或其组合。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物；优选其中所述TGFβ是TGFβ1。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中：

-肝素或其衍生物或类似物的浓度为约0.1IU/ml；和/或

-肝素或肝素衍生物或其类似物选自：未分级肝素(UFH)；低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素、达肝素、那屈肝素、亭扎肝素、舍托肝素、瑞肝素、阿地肝素(ardeparin)、帕肝素、贝米肝素或它们的混合物；类肝素，如硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸acharan、硫酸角质素或其混合物，如达那肝素；肝素盐；类肝素盐；肝素片段；类肝素片段；及其混合物。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中使所述MSC或MSC衍生细胞另外接触血浆、血清或其替代物中的一种或多种，如其中所述培养基另外包含血浆、血清或其替代物中的一种或多种。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。

15.成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其可通过如权利要求1至14中任一项定义的方法获得或者通过如权利要求1至14中任一项定义的方法获得。

16.成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其可通过体外或离体扩增MSC获得或通过体外或离体扩增MSC获得，其中悬浮液中至少90％的所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞具有等于或小于25μm的直径(D₉₀≤25μm)，并且其中悬浮液中至多1％的所述MSC衍生的成软骨-成骨细胞谱系细胞具有大于35μm的直径。

17.根据权利要求16所述的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，其中所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞可通过如权利要求1至14中任一项定义的方法或通过如权利要求1至14中任一项定义的方法获得。

18.药物制剂，其包含如权利要求15至17中任一项所定义的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群。

19.根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述药物制剂还包含具有骨传导性质的组分，如磷酸三钙、羟基磷灰石、羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒的组合物、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸、透明质酸或其衍生物、壳聚糖、聚-L-赖氨酸、明胶、胶原、骨连接蛋白、纤维蛋白原、骨钙蛋白或其组合。

20.根据权利要求15至17中任一项所述的成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群，或者根据权利要求18或19的药物制剂，其作为药物应用，优选用于治疗需要移植成软骨-成骨细胞谱系细胞的受试者。

21.根据权利要求20使用的群或药物制剂，其中：

-所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞以约1×10⁷/ml至约1×10⁸/ml的浓度，优选约2×10⁷/ml至约4×10⁷细胞/ml的浓度存在；和/或

-所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或所述药物制剂适于经皮、骨内、关节内、椎间或血管内施用；

-所述成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞群或所述药物制剂适于在骨缺损部位施用。

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