JP6097479B2 - 新規の間葉系幹細胞及び骨形成性細胞 - Google Patents
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Description
骨関連障害の治療に使用される、上述の態様において規定されるような少なくとも1つの間葉系マーカーとCD34とを共発現する間葉系幹細胞(MSC)、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも1つの間葉系マーカーとCD34とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団若しくは医薬組成物;
骨関連障害の治療用の薬物の製造のための、上述の態様において規定されるような少なくとも1つの間葉系マーカーとCD34とを共発現する間葉系幹細胞(MSC)、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも1つの間葉系マーカーとCD34とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団の使用;
このような治療を必要とする被験体において骨関連障害を治療する方法であって、上記被験体に、上述の態様において規定されるような少なくとも1つの間葉系マーカーとCD34とを共発現する間葉系幹細胞(MSC)、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも1つの間葉系マーカーとCD34とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団若しくは医薬組成物を、治療的又は予防的に有効な量で投与することを含む、方法。
a)細胞がアルカリホスファターゼ(ALP)、より具体的には骨−肝臓−腎臓型のALPの発現を有すること;
b)細胞が1型プロコラーゲンアミノ末端プロペプチド(P1NP)、オステオネクチン(ON)、オステオポンチン(OP)、オステオカルシン(OCN)及び骨シアロタンパク質(BSP)のいずれか1つ又は複数の発現を有すること;
c)細胞が外部環境を石灰化するか、又はカルシウム含有細胞外マトリクスを合成する能力の証拠を示すこと(例えば、骨形成培地に曝露された場合;Jaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64: 295-312を参照されたい)。カルシウムの細胞内での蓄積、及びマトリクスタンパク質中への沈着は、例えば45Ca2+中で培養し、洗浄及び再培養し、そしてその後細胞内に存在する若しくは細胞外マトリクス中に沈着した放射活性を確定すること(米国特許第5,972,703号明細書)により、又はアリザリンレッドベースの石灰化アッセイ(例えば、Gregory et al. 2004. Analytical Biochemistry 329: 77-84を参照されたい)を用いて、従来のように測定することができる;
d)細胞が、脂肪細胞系列(例えば脂肪細胞)又は軟骨細胞系列(例えば軟骨細胞)の細胞のいずれか一方に、好ましくはいずれにも実質的に分化しないこと。これらの細胞系列へ分化しないことは、当該技術分野で確立されている標準的な分化誘導条件(例えばPittenger et al. 1999. Science 284: 143-7を参照されたい)と、アッセイ方法(例えば誘導された場合、脂肪細胞は典型的には脂質蓄積を示すオイルレッドOで染色され、軟骨細胞は典型的にはアルシアンブルー又はサフラニンOで染色される)とを使用して試験することができる。脂肪生成分化及び/又は軟骨形成分化への傾向を実質的に欠くとは、典型的には、試験した細胞の50%未満、又は30%未満、又は5%未満、又は1%未満が、それぞれの試験に適用したときに、脂肪生成分化又は軟骨形成分化の徴候を示すことを意味し得る。
骨髄MSCの単離及び培養
100mlのヘパリン処置した骨髄(BM)を、患者の腸骨稜、又は健康なボランティアから得た。BMを、リン酸緩衝食塩水(PBS、2v:v)と混合し、密度勾配フィコール溶液上に重層した。遠心分離後、単核細胞を界面から回収し、PBS中で2回洗浄した。細胞を、20%血漿を添加し、任意でFGF−2を添加したDMEM培地中に再懸濁した。細胞を、1×107細胞/175cm2でフラスコにプレーティングし(試験範囲1×105〜1×109)、5%CO2を含有する37℃加湿雰囲気中で維持した。細胞を1日〜4日間付着させた後、初期培地を交換し、続いて下記に定めた期間で培養した。
14日間の標準的な間葉培養(DMEM及び20%血漿)後、約1×108個の細胞を回収し、PBS中で維持した。次いで、全細胞集団を室温で1時間、APC標識抗CD34モノクローナル抗体で標識した。PBSによる洗浄工程の後、細胞を遠心分離によって沈降させ、1mlの脱気した(degasses)冷選別バッファー中に再懸濁した。
28日目に、37℃で1分間〜5分間トリプシン溶液を使用して、MSC細胞を剥がした。細胞を計数し、1×106細胞/175cm2でプレーティングし、実施例中で定めた成長因子を用いて又は用いずに、同じ標準的な条件でさらに1週間培養した。
免疫生物学的細胞表面マーカーをフローサイトメトリーにより分析した。細胞を以下の標識モノクローナル抗体:CD105、CD90及びCD73、並びにCD34と共に15分間インキュベートし、その後PBSで洗浄した後、遠心分離し、0.3mlのPBS中に再懸濁した。
28日目又は35日目に、細胞をALP検出のために染色した。細胞をPBSで2回洗浄し、その後室温で30秒間、60%クエン酸緩衝アセトンで固定した後、再度蒸留水で45秒間すすいだ。次いで、細胞を室温、暗所で30分間、ファストブルーRR/ナフトールAS−MXフォスフェート溶液を用いて染色した。細胞を蒸留水で2分間洗浄した後、Mayerのヘマトキシリン溶液中で10分間対比染色した。最後に、細胞を蒸留水で3分間洗浄した。
28日目又は35日目に、細胞をトリプシンと共にインキュベートすることによって培養物から回収し、60〜120000細胞/ウェルで、6ウェルプレートの増加培地にプレーティングした(12500細胞/cm2)。翌日、培地を2.5mlの骨形成培地と交換した。細胞を2週間、3週間又は4週間培養した。培地は3日〜4日毎に交換した。2週間の培養後、細胞を、3.7%ホルムアルデヒド/PBS中で固定し、アリザリンレッドにより染色した。
細胞集団が毛細血管様構造のネットワークを形成する能力を評価するために、マトリゲル管形成アッセイを行った。簡潔に述べると、24ウェル培養プレートを、1ウェル当たり10μl(3.5mg/ml)の純粋な成長因子低減マトリゲル(BD Matrigel Basement Membrane Matrix、BD Biosciences、Erembodegem-Aalst、Belgium)を用いて、メーカーの使用説明書に従ってコーティングした後、37℃で30分間重合させた。合計で30×103細胞/ウェルをマトリゲル上に播種し、37℃で6時間インキュベートした。洗浄した後、倒立位相差顕微鏡を用いてネットワーク形成及び管形成を観察した。
デキサメタゾン希釈物:
Dex1(5×10−4M):2μlのデキサメタゾン原液(5×10−2M)+198μlのα−MEM
Dex2(10−6M):2μlのDex1(5×10−4M)+998μlのαMEM
骨形成培地(40ml)
容量 最終濃度
αMEM 31ml /
FCS 6ml 15%
PenStrepGlu(100×) 400μl 1×
デキサメタゾン(Dex2) 400μl 10−8M
アスコルビン酸 200μl 50μg/ml
β−グリセロリン酸 2ml 10mM
細胞表現型
実施例1(「骨髄MSCの単離及び培養」)で説明したように得られ、細胞選別又は成長因子刺激を行っていないMSC細胞集団は、その間葉系起源と一致して、高レベルの間葉系マーカー(CD90、CD105及びCD73)を発現した。造血CD34表面分子は低レベル(通常、全集団の5%〜15%)で発現された。細胞の骨分化能(bone potential)を表すALPマーカーも高度に発現された(表1及び表2)。CD34+細胞の3分の1がCD90+でもあった(図1−低レベル及び高レベルのCD90/CD34+発現)。
CD34陽性細胞の単離
実施例1(「骨髄MSCの単離及び培養」)で説明したように行った、細胞選別前の第1の増加工程の終了時に、MSC細胞をフラスコから回収した。CD90/CD34+集団を単離するために、フローサイトメトリー選別による陽性選択の方法を用いた。細胞をまず、特異的APC結合抗CD34抗体溶液で染色した。次いで、細胞集団をBecton Dickinsonの蛍光活性化細胞選別装置に注入し、CD34標識細胞を集団から単離した。CD34+細胞を次に、リン酸緩衝食塩溶液中に収集した。
増加方法
実施例3で説明したように得られた単離CD34+細胞を、1週間の培養プロトコルで増加させた。単離画分のうち約70%〜75%が精製工程まで生存した。これらの細胞を、成長因子及びサイトカインを添加した、血漿を含有する標準培地中でインキュベートした。代替的に、選別していない細胞を同様に培養することができた。選別の有無にかかわらず同様の結果が得られた。
骨再構築性
この(GM−CSF及びFGF−2の組み合わせの存在下で実施例3において得られるような)新たな集団の生物学的性質を、ALP産生(ALP染色)、並びに新たな骨マトリクスを形成及び石灰化するその能力を測定することによって評価した。CD34+細胞は、相当量の骨マトリクスを産生し(最大値2のスコアで2)、ALP染色処置に対して有意に陽性であり(最大値2のスコアで2)、この細胞集団に高い骨再構築可能性があったことが示唆される(図4)。比較としては、標準的なMSC培養物の骨マトリクススコアは1〜1.5であり、ALP染色スコアは1.5である。
MSC及び骨形成性細胞の増加、富化及びその性質
造血成長因子及び/又は血管新生成長因子の存在下での増殖(表5)
細胞に対し、実施例1(「培養による富化」)で説明したような富化プロトコルを行った。
増加させた骨形成性細胞のフローサイトメトリー分析(n=3)によって、この選択された細胞集団が、CD34をCD105、CD73及びCD90等の典型的な間葉系細胞マーカーと共に発現するが、CD45、CD133及びCD31抗原等の造血細胞表面マーカー及び内皮細胞表面マーカーを欠くという特異的な表現型プロファイルを示したことが実証された。
増加させた骨形成性細胞集団のフローサイトメトリー分析及びALP染色によって、これらの細胞が強い骨形成性を示すことが示された(n=3)。さらに、興味深いことに、IFN−γがALP発現及び染色の両方を選択的かつ大幅に増大させ、それにより細胞の骨形成特性を向上させることが示された。
増加させた骨形成性細胞のフローサイトメトリー分析によって、vWF及びVEGF分子発現の上方制御が実証された(n=3)。さらに、図7に示すように(n=1)、本発明者らのデータによって、この骨形成性細胞集団がマトリゲルモデルにおいて分岐した新生血管構造及び偽管へと分化及び組織化可能であることが示された。加えて、IFN−γがこのネットワーク形成を、対照(及び他の造血因子及び/又は血管新生因子)と比較して明らかに向上させることが示された。これらのin vitroでの結果は、IFN−γ及び増加させた骨形成性細胞集団の両方が、管形成及び毛細血管様構造の発生を促進する能力(血管新生促進効果)を有することを示す。
Claims (8)
- 少なくともCD105及びCD34を共発現する骨髄から単離されたMSC細胞、又はCD105、CD90、CD73及びCD34を共発現する骨髄から単離されたMSC細胞をin vitroで増加及び骨形成分化させる方法であって、
前記骨髄から単離されたMSC細胞を、線維芽細胞成長因子2(FGF−2)と共に、顆粒球単球CSF(GM−CSF)、インターフェロン(IFN)−ガンマ、血小板由来成長因子(PDGF)、FGF−1、及びFGF−3から選択される1つ又は複数の因子に曝露することを含む、方法。 - 前記骨髄から単離されたMSCを、FGF−2と共に、GM−CSF、PDGF、FGF−1及びFGF−3から選択される1つ又は複数の因子に曝露することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記骨髄から単離されたMSCを、FGF−2及びIFN−γに曝露することを含む、請求項1に記載の方法。
- CD105及びCD34を共発現する骨髄から単離されたMSC細胞から分化した細胞である、CD105及びCD34を共発現する骨形成性細胞、又はCD105、CD90、CD73及びCD34を共発現する骨髄から単離されたMSC細胞から分化した細胞である、CD105、CD90、CD73及びCD34を共発現する骨形成性細胞をin vitroで増加させる方法であって、
前記骨形成性細胞を、FGF−2と共に、GM−CSF、IFN−ガンマ、PDGF、FGF−1、及びFGF−3から選択される1つ又は複数の因子に曝露することを含む、方法。 - 前記骨形成性細胞を、FGF−2と共に、GM−CSF、PDGF、FGF−1及びFGF−3から選択される1つ又は複数の因子に曝露することを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記骨形成性細胞を、FGF−2及びIFN−γに曝露することを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記MSC細胞又は前記骨形成性細胞がヒト起源の細胞である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 得られた骨形成性細胞を、1つ又は複数の薬学的に許容可能な担体/賦形剤と混合することによって、1つ又は複数の薬学的に許容可能な担体/賦形剤と前記骨形成性細胞を含む医薬品製剤を調製することをさらに含む、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
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US20030032034A1 (en) * | 2001-03-05 | 2003-02-13 | Tang Y. Tom | Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides |
DE10158680B4 (de) * | 2001-11-30 | 2004-04-08 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Verfahren zur ex vivo-Expansion und -Differenzierung von multipotenten Stammzellen |
WO2003050273A1 (fr) * | 2001-12-13 | 2003-06-19 | Japan Science And Technology Agency | Milieu de culture pour des cellules humaines et methode de culture |
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EP1649007A4 (en) * | 2003-07-17 | 2008-05-14 | Gamida Cell Ltd | PROCESS FOR THE EX-VIVO EXPANSION OF STEM / PROVIDER CELLS |
JP4749331B2 (ja) * | 2003-10-07 | 2011-08-17 | 株式会社バイオマスター | 脂肪由来前駆細胞の細胞分化 |
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US20060134781A1 (en) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | Bacterin International, Inc. | Three-dimensional cell culture system |
JP2006230316A (ja) * | 2005-02-25 | 2006-09-07 | Japan Health Science Foundation | 瘢痕のない創傷治癒能を有する細胞およびその調製方法 |
JPWO2006134951A1 (ja) | 2005-06-13 | 2009-01-08 | 株式会社バイオマスター | 脂肪由来幹細胞の長期培養増殖法 |
US7989205B2 (en) * | 2005-10-06 | 2011-08-02 | American Cryostem Corporation | Cell culture media, kits and methods of use |
CZ301148B6 (cs) * | 2006-01-25 | 2009-11-18 | Univerzita Karlova V Praze | Zpusob pestování lidských mezenchymových kmenových bunek, zejména pro lécbu nehojících se fraktur, a bioreaktor k provádení tohoto zpusobu |
PT1989295T (pt) * | 2006-02-16 | 2020-10-29 | Univ Bruxelles | Processo para diferenciação osteogénica de células estaminais de medula óssea (cemo) e as suas utilizações |
JP5155530B2 (ja) * | 2006-07-25 | 2013-03-06 | 株式会社カネカ | 成体幹細胞分離・培養システム |
WO2008018190A1 (fr) | 2006-08-09 | 2008-02-14 | Biomaster, Inc. | Cellules de la crête neurale dérivées de tissu adipeux |
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