CN102016008A - 间充质干细胞和骨形成细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及共表达至少一种间充质标志物(优选至少CD105和CD34)的新型间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。还提供了具有相似表型的骨形成细胞。本发明还提供了包含这些的细胞、细胞群和其它产品，及其在骨治疗中的应用。
Description
技术领域
本发明一般地涉及细胞表型和细胞分化领域，以及涉及细胞的医疗应用。更具体地，本发明鉴定出新的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)类型和新的骨形成细胞类型，并涉及所述MSC的骨生成分化以及所述MSC和所述骨形成细胞在骨疾病中的治疗性和预防性应用。
背景技术
移植能够或倾向于进行骨生成分化的干细胞是治疗骨相关疾病(特别是当治疗需要新骨产生时)的有前景的方式。
骨髓基质细胞或间充质干细胞(简写为BMSC(bone marrow stromal cell)或MSC)可以容易地从成人骨髓和其它几种组织中分离和扩增，这基于这些细胞与组织培养塑料制品(tissue culture plastic)的贴附。尽管已报道MSC能产生神经细胞、肝细胞和肌肉细胞(Prockop 1997.Science276：71-4)，但大多数情况下MSC表现出中胚层相关的三种分化潜能，即能够进行骨生成分化、脂肪分化和软骨分化(Pittenger等.1999.Science284：143-7)。
MSC可以通过可溶性标志物和表面标志物(包括CD105、CD90和CD73等)的表达来定义。此外，现有技术通常显示MSC是CD34抗原阴性的，而CD34抗原在未成熟的血液和内皮细胞中高表达。特别地，先前尚未描述过源自骨髓的、CD34阳性的MSC。同样地，先前尚未描述过CD34阳性的MSC(特别是源自骨髓的CD34阳性MSC)具有增强的骨生成和骨再生特性。
骨髓移植已经应用于治疗骨疾病(Gangji等.2005.Expert Opin BiolTher 5：437-42)。然而，MSC只占骨髓样品中存在的所有细胞中较小的比例，并且可表现出不同的骨生成分化倾向性，从而使相当大比例这样移植的细胞未能最终分化为期望的骨组织。事实上，已显示只有约14％的成人间充质干细胞祖细胞保持了骨生成潜能(D’lppolito等.1999.J BoneMiner Res.14：1115-22)。
因此，需要不断地改善从间充质干细胞获得骨祖细胞、成骨细胞或骨形成细胞的产量。
发明概述
本发明人证实了一小亚群分离的且任选扩增的MSC细胞共表达至少一种间充质标志物(如CD90或CD105，更优选地CD105)与CD34，其中CD34一般被认为是未成熟的血液和内皮特征细胞的标志物。
与一般的MSC细胞群相比，这种新的细胞类型表达显著水平的碱性磷酸酶(ALP)(其为骨细胞标志物)并且可以合成和矿化新的骨基质。因此，所述细胞具有产生可用于骨重建之骨形成细胞的相对较高的潜力。本发明人还观察到，所述细胞可以大量扩增，从而可以得到足够量的骨形成细胞用于基于细胞的治疗(尤其是针对骨疾病的治疗)。本发明人成功地富集了上述细胞亚型的MSC细胞，该细胞随后维持了其表型和生物学特性。
本发明的一个方面提供了分离的间充质干细胞(MSC)，其特征为共表达至少一种间充质标志物和CD34。
另一方面提供了用于获得共表达至少一种间充质标志物和CD34之MSC细胞的方法，其包括从MCS细胞群中富集或分离共表达所述至少一种间充质标志物和CD34的细胞亚群。一个实施方案提供了用于获得共表达至少一种间充质标志物和CD34之MSC细胞的方法，其包括(a)从对象的样品中分离MSC细胞；(b)任选地富集和/或扩增(a)的MSC细胞；以及(c)从(a)或(b)的MSC细胞中富集或分离共表达至少一种间充质标志物和CD34的细胞亚群。
另一方面涉及可通过这样的方法获得的MSC细胞，所述方法包括从MSC细胞群中分离共表达至少一种间充质标志物和CD34的细胞亚群。一个实施方案提供了可通过以下步骤获得的MSC细胞，所述步骤包括：(a)从对象的样品中分离MSC细胞；(b)任选地，扩增(a)的MSC细胞；以及(c)从(a)或(b)的MSC细胞分离共表达至少一种间充质标志物和CD34的细胞亚群。
还提供了这样的细胞群，其包含前述任一方面所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的分离的间充质干细胞(MSC)。
应理解，本发明还包括对前面所述的MSC细胞和细胞群(如共表达至少一种间充质标志物和CD34的MSC细胞，以及包含这种MSC细胞的细胞群)的多种操作，包括所述MSC细胞和细胞群的培养、维持、扩增、富集(如通过分选来实现)和富集后扩增等。
另一方面提供了体外扩增分离的间充质干细胞(MSC)(优选本文教导的共表达至少一种间充质标志物和CD34的分离的MSC)的方法，包括将所述MSC细胞暴露于造血生长因子和/或血管生成生长因子，优选地暴露于造血生长因子和血管生成生长因子，例如暴露于一种或多种造血生长因子和/或一种或多种血管生成生长因子。
借助于合适的培养条件，所述方法还可适用于从MSC群(即，相对较异质性的MSC群)中获得共表达至少一种间充质标志物和CD34的MSC细胞和/或富集MSC群(即，相对较异质性的MSC群)中的共表达至少一种间充质标志物和CD34的MSC细胞。这需要将所述相对较异质性的MSC群(如分离自对象之样品的MSC细胞)暴露于造血生长因子和/或血管生成生长因子，优选地暴露于造血生长因子和血管生成生长因子，例如暴露于一种或多种造血生长因子和/或一种或多种血管生成生长因子。
优选地，所述方法可以从初始或起始MSC细胞群中获得和/或富集包含CD34以及一种或多种间充质标志物(如优选CD105、CD90和/或CD73，还优选至少CD105)之表达的MSC细胞。优选地，这样富集的MSC细胞可缺少造血和/或内皮标志物(如CD45、CD133、CD31、CD14和/或CD19)的表达。因此，在一个实施方案中，这样富集的MSC细胞可包含CD34的表达以及CD105、CD90和CD73中一种或多种或优选全部(还优选至少CD105)的表达，并且可缺少CD45、CD133、CD31、CD14和CD19中一种或多种或优选全部的表达。优选地，本发明方法发现了，当应用所述方法时，起始MSC群中、包括CD34以及一种或多种间充质标志物之表达的MSC细胞的比例有所提高(例如，在非限制性的实验中，在培养期间，CD105阳性和CD-34阳性的MSC细胞的比例分别从15％提高到95％以及从1％提高到59.4％)。
优选地，通过本文教导的暴露于造血生长因子和/或血管生成生长因子而扩增和/或富集的MSC细胞可表现出充分的骨生成特性(例如，通过ALP表达和染色来证实)和有利的促血管生成特性(例如，通过vWF和VEGF表达和/或通过在适当测定中毛细血管样结构的形成来证实)。
因此，本文还公开了一般性的MSC细胞以及具体的共表达至少一种间充质标志物和CD34的MSC细胞，其中所述MSC细胞表现出骨生成特性(如适当地但非限制性地通过ALP表达、ALP酶活性和/或ALP染色来证实)和促血管生成特性(如适当地但非限制性地通过vWF和/或VEGF(优选地vWF和VEGF)表达和/或通过在合适的模型(如Matrigel模型)中组织成具有分支的新血管结构或假管道的能力来证实)。还涵盖了包含这种MSC细胞的细胞群。
还提供了这样的MSC细胞，其可通过所述使用造血生长因子和/或血管生成生长因子扩增或富集MSC细胞或细胞群的方法而获得或通过该方法直接获得。
另一方面涉及在体外将前述方面中所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的间充质干细胞(MSC)分化为骨形成细胞(例如成骨细胞或骨祖细胞)的方法。
另一方面提供了骨形成细胞(如成骨细胞或骨祖细胞)，其可通过在体外将前述方面所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的间充质干细胞(MSC)分化骨形成细胞而获得。
由于这样的骨形成细胞中至少一些细胞保持着起源MSC细胞的相关表达谱，因此另一方面提供了分离的骨形成细胞(如成骨细胞或骨祖细胞)，其特征为共表达至少一种间充质标志物和CD34。
还公开了包含共表达至少一种间充质标志物和CD34的分离的骨形成细胞的细胞群。因此，还公开了这样的细胞群，其包含本文教导的共表达至少一种间充质标志物和CD34的分离的MSC并且还包含本文教导的共表达至少一种间充质标志物和CD34的分离的骨形成细胞。
应理解，本发明还包括对上述教导的骨形成细胞和细胞群(如共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞和包含这样骨形成细胞的细胞群)的多种操作，包括对所述骨形成细胞和细胞群的培养、维持、扩增、富集(如通过分选来实现)和富集后扩增等。
还公开了用于获得共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞的方法，其包括将共表达所述至少一种间充质标志物和CD34的MSC细胞分化为骨形成细胞。
这样的共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞也可以通过其它方法获得。因此，还公开了用于获得共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞的方法，其包括从骨形成细胞群中富集或分离共表达所述至少一种间充质标志物和CD34的细胞亚群。一个实施方案提供了用于获得共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞的方法，其包括(a)从对象的样品中分离骨形成细胞，或者从分离自对象之样品的MSC细胞分化为骨形成细胞；(b)任选地，富集和/或扩增(a)的骨形成细胞；以及(c)从(a)或(b)的骨形成细胞中富集或分离共表达至少一种间充质标志物和CD34的细胞亚群。
另一方面提供了体外扩增经分离之骨形成细胞(优选本文教导的共表达至少一种间充质标志物和CD34的经分离骨形成细胞)的方法，其包括将所述骨形成细胞暴露于造血生长因子和/或血管生成生长因子，优选地暴露于造血生长因子和血管生成生长因子，例如暴露于一种或多种造血生长因子和/或一种或多种血管生成生长因子。
借助于合适的培养条件，所述方法还可以适用于从骨形成细胞群(即，相对较异质性的骨形成细胞群)获得共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞，和/或富集骨形成细胞群(即，相对较异质性的骨形成细胞群)中共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞。这需要将所述相对较异质性的骨形成细胞群(如，分离自对象之样品的骨形成细胞，或者从对象之样品中分离的MSC细胞分化的骨形成细胞)暴露于造血生长因子和/或血管生成生长因子，优选地暴露于造血生长因子和血管生成生长因子，例如暴露于一种或多种造血生长因子和/或一种或多种血管生成生长因子。
优选地，所述方法可以从初始或起始骨形成细胞群中获得和/或富集包含CD34以及一种或多种间充质标志物(如优选地CD105、CD90和/或CD73，还优选地至少CD105)之表达的骨形成细胞。优选地，这样富集的骨形成细胞可缺少造血和/或内皮标志物(如CD45、CD133、CD31、CD14和/或CD19)的表达。因此，在一个实施方案中，这样富集的骨形成细胞可以包含CD34的表达以及CD105、CD90和CD73中一种或多种或优选全部(还优选至少CD105)的表达，并且可以缺少CD45、CD133、CD31、CD14和CD19中一种或多种或优选全部的表达。优选地，本发明方法发现了，当应用本发明方法时，起始骨形成细胞群中包含共表达CD34以及一种或多种间充质标志物的骨形成细胞的比例有所提高。
优选地，通过如本文教导的暴露于造血和/或血管生成生长因子而扩增和/或富集的骨形成细胞可表现出充分的骨生成特性(例如，通过ALP表达和染色来证实)和有利的促血管生成特性(例如，如通过vWF和VEGF表达和/或通过在适当测定中毛细血管样结构的形成来证实)。
因此，本文还公开了一般性的骨细胞以及具体的共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞表现出骨生成特性(如适当地但非限制性地通过ALP表达、ALP酶活性和/或ALP染色来证实)和促血管生成特性(如适当地但非限制地通过vWF和/或VEGF(优选地vWF和VEGF)表达和/或通过在合适的模型(如Matrigel模型)中组织成具有分支的新血管结构或假管道的能力来证实)。还涵盖了包含这样骨形成细胞的细胞群。
还提供了这样的骨形成细胞，其可通过所述使用造血生长因子和/或血管生成生长因子扩增或富集骨形成细胞或细胞群的方法而获得或通过该方法直接获得。
在一个实施方案中，所述造血生长因子可以包括本领域中已知的可证明具有造血活性(如能够招募造血细胞、诱导造血细胞增殖和/或刺激造血细胞)的任何生长因子。在一个实施方案中，本说明书中的造血生长因子选自包含以下或由以下组成的组：集落刺激因子2(CSF2)、CSF3、巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞单核细胞CSF(GM-CSF)、干扰素(IFN)(包括IFN-α和IFN-γ等)、肿瘤坏死因子(TNF)和造血活性细胞因子(如白介素2(IL2)、IL4、IL17和IL18等)。优选地，所述造血生长因子可以选自GM-CSF和IFN-γ，更优选地可以是IFN-γ。
在一个实施方案中，所述血管生成生长因子可以包括本领域中已知的可证明具有血管生成活性(如能够招募内皮细胞或诱导由内皮细胞形成的毛细血管结构)的任何生长因子。在一个实施方案中，本说明书中的血管生成生长因子选自包含以下或由以下组成的组：血小板衍生生长因子(PDGF)(包括PDGF aa、ab、bb)、血管内皮生长因子(VEGF 1或2)、冯·维勒布兰德因子(Von Willebrand factor，vWF)、血管生成素1或2、成纤维细胞生长因子(FGF1、FGF-3或其它FGF因子，或除了FGF-1和/或FGF-2以外的FGF因子)和促红细胞生成素(EPO)。在另一实施方案中，所述血管生成生长因子可以选自包含以或由以下组成的组：PDGF、VEGF、vWF、血管生成素2和EPO。优选地，所述血管生成生长因子可以选自PDGF、FGF-1和3，更优选地可以选自PDGF或FGF-3，更优选地可以是PDGF。
优选地，除了所述的造血生长因子和/或血管生成生长因子以外，可以将MSC或骨形成细胞暴露于(优选同时暴露于)FGF-2，以进一步刺激所述细胞的维持、扩增、获得、富集和/或骨生成分化。
因此，在一个优选实施方案中，扩增MSC或骨形成细胞(例如本文教导的包含CD34以及一种或多种间充质标志物之表达的MSC或骨形成细胞)可以包括将所述MSC或骨形成细胞暴露于选自GM-CSF、IFN-γ、PDGF、FGF-1和FGF-3的一种或多种生长因子；例如暴露于GM-CSF和IFN-γ中的一种或多种和/或暴露于PDGF、FGF-1和FGF-3中的一种或多种；例如暴露于GM-CSF和IFN-γ中的一种或多种以及PDGF、FGF-1和FGF-3中的一种或多种。任选地，在这些实施方案中，还可以将细胞暴露于(优选同时暴露于)FGF-2。在一个特别优选的实施方案中，扩增MSC或骨形成细胞(例如本文教导的包含CD34以及一种或多种间充质标志物之表达的MSC或骨形成细胞)可以包括将所述MSC或骨形成细胞暴露于IFN-γ。该处理显著地增强了这样处理之细胞的骨生成特性和促血管生成特性。
在另一优选的实施方案中，从起始的MSC或骨形成细胞群中富集本文教导的包含CD34以及一种或多种间充质标志物之表达的MSC或骨形成细胞可包括：将所述起始MSC或骨形成细胞群暴露于选自GM-CSF、IFN-γ、PDGF、FGF-1和FGF-3的一种或多种生长因子；例如暴露于GM-CSF和IFN-γ中的一种或多种和/或暴露于PDGF、FGF-1和FGF-3中的一种或多种；例如暴露于GM-CSF和IFN-γ中的一种或多种以及暴露于PDGF、FGF-1和FGF-3中的一种或多种。任选地，在这些实施方案中，还可以将所述细胞暴露于(优选同时暴露于)FGF-2。在一个特别优选的实施方案中，从起始的MSC或骨形成细胞群中富集本文教导的包含CD34以及一种或多种间充质标志物之表达的MSC或骨形成细胞可包括：将所述MSC或骨形成细胞暴露于IFN-γ。该处理显著地增强了这样处理之细胞的骨生成特性和促血管生成特性。
另一方面提供了药物组合物，其包含：如前述方面所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的间充质干细胞(MSC)和/或如前述方面所定义的骨形成细胞(如共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞)，以及一种或多种可药用载体/赋形剂。所述药物组合物可以包含含有所述MSC和/或骨形成细胞的细胞群，以及一种或多种可药用载体/赋形剂。
还提供了用于制备所述药物制剂的方法，其包括：将前述方面中所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的间充质干细胞(MSC)和/或前述方面中所定义的骨形成细胞(如共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞)或者包含上述MSC和/或骨形成细胞的细胞群与所述一种或多种可药用载体/赋形剂混合。
本发明的细胞产品特别适合于预防性和治疗性地治疗骨相关疾病。因此，另一些方面涉及：
-如前述方面中所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的间充质干细胞(MSC)或者如前述方面中所定义的骨形成细胞(如共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞)或者包含上述细胞的细胞群或药物组合物，其用于治疗骨相关疾病；
-如前述方面中所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的间充质干细胞(MSC)或者如前述方面中所定义的骨形成细胞(如共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞)或者包含上述细胞的细胞群在制备用于治疗骨相关疾病的药物中的用途；
-用于治疗有此治疗需要的对象中的骨相关疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗或预防有效量的、如前述方面所定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的间充质干细胞(MSC)或者如前述方面所定义的骨形成细胞(如共表达至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞)或者包含上述细胞的细胞群或药物组合物。
本发明还提供了一种装置，其包含适于向对象(例如全身地或者在骨损伤部位)施用组合物的手术器械，还包含上述任何细胞、细胞群或药物组合物。
在上述任何方面和实施方案中，所述至少一种间充质标志物可优选地选自CD105、CD90和CD73，更优选地其可以是CD90或CD105。特别优选地，所述至少一种间充质标志物可以是CD105，即，本文教导的MSC或骨形成细胞可以共表达至少CD105和CD34。
在上述任意方面的一些实施方案中，所述细胞(MSC细胞；骨形成细胞)来源于人。优选地，所述MSC可来源于骨髓。
这些和另一些方面和实施方案在以下部分中和权利要求中将会描述。
附图说明
图1示意CD90(FITC)和CD34(APC)表达的双色流式细胞分析。散点图代表5000个事件，其被汇总为所列的模式数据。
图2示意培养一周后对CD90/CD34+细胞进行光学显微镜检查。
图3示意通过补充培养条件进行扩增后CD90(FITC)和CD34(APC)表达的双色流式细胞分析。散点图代表5000个事件，其被汇总为所列的模式数据。
图4示意CD90/CD34+细胞的矿化(A)和ALP染色。
图5示意矿化能力对CD34+百分比的依赖性。
图6示意通过ALP染色表明的细胞骨生成特性。
图7示意通过毛细血管样结构形成测定表明的细胞促血管生成特性。
发明详述
本发明所用的无数量词修饰形式包括单数和复数含义，除非另有明确指明。
本文使用的术语“包含”和“含有”与“包括”等是同义词，其是非排他性的或开放式的，即不排除另外的未记载的成员、要素或方法步骤。
通过端点描述的数值范围包括各范围内的所有数值和分数以及所述端点。
当涉及可测量的值(如参数、数量、时间段等)时，本文使用的术语“约”意在包括相对于指定值的+/-10％或更小的变化，优选地+/-5％或更小，更优选地+/-1％或更小，以及更加优选地+/-0.1％或更小，在该范围内这些变化适用于本发明。应理解，“约”所修饰的数值本身也被具体地且优选地公开了。
本说明书中引用的所有文献均通过引用作为整体并入本文中。
除非另有定义，本发明所用的所有术语(包括技术和科学术语)都具有本领域普通技术人员常规理解的含义。为了进一步的指导，包括了术语定义以更好地理解本发明的教导。
术语“干细胞”一般是指未特化的或相对较低特化的具有增殖能力的细胞，其能够自我更新，即能够增殖而不进行分化，其或其后代能够产生至少一种相对较高特化的细胞类型。这一术语包括能够基本上无限自我更新的干细胞(即，其中干细胞的后代或其至少一部分基本上保留了母干细胞(mother stem cell)的未特化的或相对较低特化的表型、分化潜力和增殖能力)以及表现出有限自我更新的干细胞(即，其中后代或其部分进一步增殖和/或分化的能力比母干细胞明确地减弱了)。例如但非限制性地，干细胞可以产生能够沿一个或多个谱系分化从而产生逐渐相对更加特化之细胞的后代(其中这些后代和/或逐渐相对更加特化的细胞本身可以是本文中定义的干细胞)或者可以产生终末分化的细胞(即完全特化的细胞，其可以是有丝分裂后的细胞)。
本文使用的术语“成体干细胞”是指存在于或获得自(如分离自)胎儿期或出生后之生物的干细胞。
本文使用的术语“间充质干细胞”或“MSC”是指能够产生间充质谱系之细胞(通常为两种、优选三种或更多种间充质谱系的细胞，如骨细胞谱系(骨)、软骨细胞谱系(软骨)、肌细胞谱系(肌肉)、腱细胞谱系(腱)、成纤维细胞谱系(结缔组织)、脂肪细胞谱系(脂肪)和基质生成谱系(骨髓))的成体的、中胚层来源的干细胞。通常但非限制性地，使用标准的、本领域认可的分化条件和细胞表型评价方法(如Pittenger等，1999(Science 284：143-7)或Barberi等(PLoS Med 2：e161，2005)中所描述地)，如果细胞能够形成脂肪细胞谱系、软骨细胞谱系和骨细胞谱系之每一种的细胞，则该细胞可认为是MSC。MSC细胞可以从例如骨髓、血液、脐带、胎盘、胎儿的卵黄囊、皮肤(尤其是胎儿和青少年的皮肤(Young等.2001.Anat Rec 264：51-62))、骨膜和脂肪组织(Zuk等.2001.TissueEng 7：211-28)中分离。人的MSC、其分离、体外扩增和分化在以下文献中有所描述，如Pittenger等，1999(如上)、美国专利No.5,486,359、美国专利No.5,811,094、美国专利No.5,736,396、美国专利No.5,837,539或美国专利No.5,827,740。
该术语还包括从骨髓获得的MSC，其常被称为“骨髓基质细胞”或“BMSC”。用于分离BMSC的骨髓样品可以例如从髂嵴、股骨、胫骨、脊椎、肋骨或其它髓质空间获得。
在一个优选实施方案中，本文使用的MSC或MSC群可以来源于骨髓，例如可以分离或任选地扩增自骨髓样品。来源于骨髓的MSC和MSC群与来源于其它组织的MSC相比可具有不同的特征(如标志物特征、功能、扩增、分化等)和/或更有利(例如但非限制性地，可以更有效和/或更可控制地分化为骨形成细胞)。
术语MSC和BMSC还包括MSC或BMSC的后代，例如从对象的生物样品中获得的MSC或BMSC体外或离体增殖获得的后代。
当涉及特定组分时，术语“分离”表示将该组分与组合物中至少另一组分分开，即前一组分从组合物中被“分离”。当用于任何细胞、细胞集合或细胞群时，术语“分离”还暗指这些细胞、细胞集合或细胞群不形成动物体或人体的部分。
本文公开的细胞(特别是MSC细胞或骨形成细胞)共表达至少一种间充质标志物和CD34(即，呈阳性)。本说明书中的“共表达”意在覆盖“包括共表达”的含义，从而，除了表征该细胞之具体记载的标志物以外，所述细胞还可以表达其它标志物。
细胞上特定标志物呈阳性意指，当进行合适的测量时，与合适的对照相比，本领域技术人员能够得出该标志物之特有信号(如抗体可检测的信号，或通过逆转录聚合酶链式反应来检测)的存在或证据。当所述方法允许定量评估标志物时，阳性细胞产生与对照显著不同并且更高或更强的信号(例如但非限制性地，与对照细胞产生的该信号相比至少高1.5倍，如至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或更高)。
可使用本领域已知的任何合适的免疫学技术(如免疫-细胞化学或亲和吸附、Western印迹分析、FACS、ELISA等)或者通过任何合适的酶活性生化测定或者通过任何合适的测定标志物mRNA之量的技术(如Northern印迹、半定量或定量RT-PCR等)来检测细胞特异性标志物的表达。
本公开内容中列出的标志物蛋白的核酸和氨基酸序列数据一般是已知的，并且可以从公共数据库(如，来自NIH的“Protein Reviews on theWeb”数据库(http://mpr.nci.nih.gov/prow/)、NIH的“Entrez Gene”数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)或Uniprot/Swissprot数据库(http://www.expasy.org/))获得。用于所述标志物的合适的检测试剂和方法可以根据这些序列信息来设计，或者更常见地可从市场上购买(如经标记的单克隆抗体试剂)。
例如但非限制性地，按上述次序参照所述数据库的条目，人CD34抗原登记为“CD34”，Gene ID 947以及登记号P28906(序列版本2，登记版本74)(也参见Simmons等.1992.J Immunol 148：267-271；Civin等.1984.J Immunol 133：157)；人CD105抗原(也称为内皮糖蛋白(endoglin))登记为“CD105”，Gene ID 2022以及登记号P17813(序列版本2，登记版本91)(也参见Bellon等.1993.Eur J Immunol 23：2340)；人CD90抗原(也称为Thy-1膜糖蛋白)登记为“CD90”，Gene ID 7070以及登记号P04216(序列版本2，登记版本94)(也参见Cell surface Thy-1，ed.AFReif和M Schlesinger，1989，Marcel Dekker Inc.，New York)；人CD73抗原(也称为ecto-5’-核苷酸酶，EC 3.1.3.5)登记为“CD73”，Gene ID 4907以及登记号P21589(序列版本1，登记版本87)(也参见Thomson等.1990.Tissue Antigens 35∶9)。
检测CD34之抗体试剂的可用实例包括单克隆抗体6A6、7E10和4H11等，检测CD105之抗体试剂的可用实例包括单克隆抗体44G4、1G2、E-9和GRE等(Letarte等1995.In：Leukocyte Typing V，ed.SF Schlossman等，Oxford University Press，Oxford，1756-1759页)，检测CD90之抗体试剂的可用实例包括单克隆抗体5E10等(Craig等1993.J Exp Med 177：1331)，检测CD73之抗体试剂的可用实例包括单克隆抗体1E9、7G2(Thompson等，1990，如上)和4G4(Airas等，1993.J Immunol 151：4228)等。
在一个实施方案中，所述至少一种间充质标志物选自CD105、CD90和CD73。优选地，所述至少一种间充质标志物是CD90或CD105，更优选地所述至少一种间充质标志物是CD105。本发明包括共表达CD105和CD34的细胞(特别是MSC细胞或骨形成细胞)、共表达CD90和CD34的细胞以及共表达CD73和CD34的细胞。本发明还涵盖了共表达CD34与CD105、CD90和CD73中任意两种或全部三种的细胞(特别是MSC细胞或骨形成细胞)，例如共表达CD34与至少CD105和CD90的细胞或者共表达CD34与至少CD105和CD73的细胞。
如实施例中所示，具有上述标志物特征的细胞还可共表达碱性磷酸酶(ALP)。因此，还提供了共表达至少一种间充质标志物和CD34并且还表达ALP(更优选为骨-肝-肾型ALP(ALPL))的细胞(特别是MSC细胞或骨形成细胞)。示例性的后一类型人ALP描述于Weiss等.1986(PNAS 83：7182-7186)中，并且Uniprot/Swissprot登记号为P05186(序列版本4，登记版本110)。ALP可基本如上所述进行检测，即利用其已知的序列和市售的检测试剂(如经标记的抗体)。使用底物(如4-甲基伞花基磷酸酯(Fernley等.1965.Biochem J.97：95-103))或对-硝基苯基磷酸酯)的基于酶的测定也是公知的。
具有上述标志物特征的MSC细胞通常还可表现出间充质细胞的另一些特性。例如，MSC细胞还可表达选自CD106(VCAM)、CD166(ALCAM)、CD29、CD44、CD54和GATA-4之间充质标志物的一种、多种或全部。MSC细胞还可表现出某些形态学特征，如以下的任意一种或多种：贴附于组织培养塑料制品；单层生长；单个核，卵圆形、星形或纺锤形，细胞核呈圆形至椭圆形，核仁显著。
本文使用的术语“骨形成细胞”一般是指能够形成骨材料和/或骨基质的细胞，特别是指已部分或全部地沿骨生成分化途径发育的分离的细胞或细胞群。非限制性地，骨形成细胞特别地包括骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞和本领域中已知的骨生成谱系的其它细胞类型。
因此，本领域技术人员一般理解本文所指的“骨形成细胞”的界限。但是，为了进一步引导但非限制性地，本发明的骨形成细胞可表现出以下特征中的一个、多个或全部：
a)细胞包含碱性磷酸酶(ALP)(更优选为骨-肝-肾型ALP)的表达；
b)细胞包含I型前胶原氨基端前肽(procollagen type 1 amino-terminal propeptide，P1NP)、骨连蛋白(ON)、骨桥蛋白(OP)、骨钙蛋白(OCN)和骨唾液酸蛋白(BSP)中一种或多种的表达；
c)细胞显示出能够矿化外部周围或者合成含钙的细胞外基质(如，当暴露于骨生成培养基时；参见Jaiswal等.1997.J Cell Biochem 64：295-312)。可常规地测量细胞中的钙积累和基质蛋白中的钙沉积，例如通过在45Ca2+中培养，清洗以及再次培养，然后测定细胞中存在的或细胞外基质中沉积的放射性(US 5,972,703)来实现，或者使用基于茜素红(Alizarin red)的矿化测定来实现(参见，如Gregory等，2004.AnalyticalBiochemistry 329：77-84)；
d)细胞基本上不向脂肪细胞谱系的细胞(如脂肪细胞)或软骨细胞谱系的细胞(如软骨细胞)中的任意一种分化，优选地不向上述两类细胞分化。可使用本领域确立的标准分化诱导条件(如，参见Pittenger等，1999.Science 284：143-7)和测定方法(如，当诱导时，通常用油红O对脂肪细胞染色来显示脂质积累；通常用阿尔新蓝(alcian blue)或番红O(safraninO)对软骨细胞染色)来测试向这些细胞谱系之分化的缺乏。基本上缺乏向脂肪生成和/或软骨生成分化的倾向通常可意味着，当应用于各测试时，所测试细胞中少于50％、或少于30％、或少于5％、或少于1％显示出脂肪生成或软骨生成分化的迹象。
在一个实施方案中，所述骨形成细胞可表现出上述a)、c)和d)所列出的所有特征。
还包括任何这样的细胞群，其包含本文公开的分离的MSC细胞或骨形成细胞，或包含所述两种细胞类型。本文公开的所述MSC细胞或骨形成细胞或者这两种细胞类型一起可占这些细胞群中存在之细胞的至少2％、优选至少5％(如至少10％)、更优选至少20％(如至少30％)、更优选至少40％(如至少50％)、或非常优选地至少60％(如至少70％、至少80％、至少90％或多达100％)。
优选地，本文公开的MSC细胞或骨形成细胞或者包含这些细胞的细胞群都来源于动物，更优选地来源于非人哺乳动物或人，更加优选来源于人。
可通过已知的方法获得本文公开的共表达至少一种间充质标志物和CD34以及任选地任何其它目的标志物的MSC细胞。
例如，常规的方法允许从对象的生物样品中分离以及任选地扩增MSC或BMSC细胞。
本文所用的术语“生物样品”或“样品”一般是指从生物来源(如从生物体、器官、组织或细胞培养物等)获得的样品。动物对象(如非人哺乳动物或人)的生物样品是指从所述对象取出并包含其细胞的样品。获得对象之生物样品的方法是本领域公知的，如组织活检或者抽取血液或骨髓。对象的可用样品包括其MSC或BMSC细胞。这样的样品通常可以从骨髓中(例如从对象的髂嵴、股骨、胫骨、脊椎、肋骨或其它髓质空间中)获得。另一包含MSC的可用生物样品可源自例如对象的血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤、骨膜或脂肪组织。
已描述，可通过选择和培养能贴附于基底表面(特别是贴附于组织培养塑料制品表面)的细胞来从骨髓或其它来源分离和扩增MSC或BMSC。基于这一原则的操作方法详见Pittenger等.1999(如上)以及本说明书中其它部分提及的相关专利文献，综述见于Alhadlaq&Mao 2004(Stem CellsDev 13：436-48)。这些操作方法在本文中均是可用的。
可通过已知的方法(例如，应用荧光激活细胞分选术(FACS)、磁珠细胞分选术(MACS)或亲和层析等基于亲和力的技术)来从一般的经分离(以及任选地经扩增)MSC或BMSC细胞中选择、富集或分离共表达期望标志物蛋白的细胞。具有期望表达特征的活细胞可以与特异性针对各标志物的试剂(最常见的免疫学试剂例如单克隆抗体)结合，其中所述试剂被依次修饰(如，通过荧光团或通过固定于磁性颗粒或其它类型的固定相来修饰)，从而有利于从不与所述试剂结合的细胞中选择或捕获与所述试剂结合的细胞。
作为这些方法的一般性指导，参考Flow Cytometry and Cell Sorting，第二版，Andreas Radbruch(编)，Springer 1999(ISBN 3540656308)；InLiving Color：Protocols in Flow Cytometry and Cell Sorting，第一版，RADiamond和S Demaggio(编)，Springer 2000(ISBN 3540651497)；FlowCytometry Protocols(Methods in Molecular Biology)，第二版，TS Hawley和RG Hawley(编)，Humana Press 2004(ISBN 1588292355)；AffinitySeparations：A Practical Approach，P Matejtschuk(编)，OxfordUniversity Press，1997(ISBN 0199635501)；以及Dainiak等2007.AdvBiochem Eng Biotechnol 106：1-18。
本发明人还发现了体外扩增MSC细胞或骨形成细胞(特别是体外扩增本文定义的共表达至少一种间充质标志物和CD34的经分离MSC细胞或骨形成细胞)的有利条件，其也可适用于从相对更异质性的MSC或骨形成细胞群富集共表达至少一种间充质标志物和CD34的MSC细胞或骨形成细胞。
本文中使用的术语“富集”是指增加细胞群中期望细胞类型或细胞表型的相对比例。例如，从待进行富集的起始细胞群开始，所述CD34阳性MSC细胞或骨形成细胞可被富集至所得细胞群中存在之细胞的至少2％、优选至少5％(如至少10％)、更优选地至少20％(如至少30％)、更加优选至少40％(如至少50％)、或非常优选地至少60％(如至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。将MSC细胞或MSC细胞群或者骨形成细胞或骨形成细胞群暴露于造血生长因子，或暴露于血管生成生长因子，或暴露于造血生长因子和血管生成生长因子的组合，其中后一组合对细胞扩增或富集具有协同作用。所述造血生长因子和血管生成生长因子可以同时或以任何顺序依次与细胞接触，优选同时与细胞接触。优选地，细胞可以暴露于(优选同时暴露于)FGF-2以进一步增强其扩增和/或富集。
在一个实施方案中，所述造血生长因子选自包含以下或由以下组成的组：集落刺激因子2(CSF2)、CSF3、巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞单核细胞CSF(GM-CSF)、干扰素(IFN)(包括IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)和造血活性细胞因子(如白介素2(IL2)等)。更优选地，所述造血生长因子选自GM-CSF和IFN-γ，更加优选IFN-γ。在一个实施方案中，所述血管生成生长因子选自包含以下或由以下组成的组：血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF 1或2)、冯·维勒布兰德因子(vWF)、血管生成素2、成纤维细胞生长因子(FGF1、FGF-3或其它FGF因子)和促红细胞生成素(EPO)。优选地，所述血管生成生长因子选自PDGF、FGF-1和FGF-3，更加优选PDGF和FGF-3，更优选地可以是PDGF。
本文使用的术语“暴露”意指一种或多种分子、组分或材料与另外的分子、组分或材料直接地或间接地置于一起(即接触)，从而有利于它们之间的相互作用。通常，可通过在培养有细胞的培养基中包含生长因子来使所述细胞与所述生长因子接触。可用于本文中的细胞培养之培养基、一次性用品和培养条件可以是本领域(如增殖和分化MSC、BMSC和骨形成细胞的领域)中一般已知的。
骨形成细胞可以通过本领域中已知的从分离的MSC细胞进行分化而获得。在一个实例中，可以使用WO 2007/093431中的方法，其中分离的MSC细胞在血清或血浆和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)存在下培养。在另一实例中，可以如Pittenger等，1999(如上)和Jaiswal等，1997(如上)所述通过在骨生成培养基中使MSC细胞分化而获得骨生成谱系细胞。任选地，可以向常规的骨生成培养基中补充FGF-2。还可以如Skjodt等，1985(J Endocrinol 105：391-6)所述从骨小梁直接分离和培养骨形成细胞。
在一个实施方案中，可以从共表达至少一种间充质标志物和CD34的分离的MSC细胞分化得到骨形成细胞。在这种情形中，可以在如此获得的骨形成细胞群中富集共表达所述至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞。在另一实例中，骨形成细胞可以从尚未针对共表达至少一种间充质标志物和CD34的细胞进行富集的MSC细胞中获得，或者可以直接分离自对象。在这种情形中，如此获得的骨形成细胞群一般不针对共表达所述至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞进行富集。
在任一这些情形中，可以与从相对更异质性的骨细胞群中选择、富集或分离共表达所述至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞类似地使用上述针对MSC细胞的技术(如FACS、MACS或基于亲和力的技术)。还可以使用本说明书中教导的造血生长因子和/或血管生成生长因子来富集共表达所述至少一种间充质标志物和CD34的骨形成细胞。
在本发明的多个方面中，术语“骨相关疾病”是指针对患有该疾病之对象的治疗可得益于施用骨生成谱系或骨形成细胞(如骨祖细胞、成骨细胞或骨细胞)的任何类型的骨疾病。特别地，这些疾病的特征可在于例如减少的骨形成或过度地骨吸收，骨中存在的成骨细胞或骨细胞数目、生存力或功能的降低，对象中骨量的减少，骨变细，骨长度或弹性的减损等。
例如但非限制性地，该术语包括局部或全身性疾病，如任意类型的骨质疏松或骨质减少(例如原发性、绝经后、老年性、肾上腺皮质激素诱导的、任何继发性、单一部位或多部位的骨坏死)、任意类型的骨折(例如不愈合的(non-union)、愈合不良的(mal-union)、延迟愈合的(delayed union)骨折或压迫性骨折(compression))、需要骨融合的病症(例如脊柱融合和重建)、上颌面骨折、骨重建(例如外伤或癌症手术之后的骨重建)、颅面骨重建、成骨不全、溶骨骨癌、佩吉特病(Paget’s Disease)、内分泌失调、低磷酸盐血症、低钙血症、肾性骨营养不良、骨软化、无动力性骨病(adynamic bone disease)、类风湿性关节炎、甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进、牙周病、Gorham-Stout病和McCune-Albright综合征。
本发明所述的MSC、BMSC和骨形成细胞以及包含这些细胞的细胞群具有多种用途，特别是在研究、预防和治疗骨相关疾病领域中的用途。
一方面，所述细胞或细胞群可用于体外产生骨基质。所述骨基质可例如与所述细胞或细胞群一起或不与其一起地用于骨相关疾病的治疗。
将本发明的细胞或细胞群导入对象可用于治疗骨折和骨相关疾病。术语“对象”或“患者”优选是指作为治疗、观察或实验之客体的对象动物，更优选为温血动物，更加优选为脊椎动物，更优选地为哺乳动物(具体包括人和非人哺乳动物)。术语“哺乳动物”包括这样分类的任何动物，包括但不限于人、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物(sport animal)、宠物动物、陪伴动物和实验动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、豚鼠、牛、奶牛、绵羊、马、猪和灵长类(如猴和猿)。特别优选包括两种性别和所有年龄段的人对象。
本发明的治疗特别地施与有此需要的对象，所谓“有此需要的对象”包括得益于针对给定病症(如骨折或骨相关疾病)之治疗的对象。这些对象可包括但不限于已被诊断为所述病症、倾向于发展为所述病症和/或有待预防所述病症的对象。
术语“治疗”包括对已发生之疾病的治疗性治疗(如对已发生的骨相关疾病的治疗)以及预防性的治疗(其目的是预防或降低不期望之病痛的发生几率，如防止骨相关疾病得病和发展的机会)。有益的或期望的临床结果包括但不限于：一种或多种症状的缓解或者一种或多种生物标志物的减少，疾病程度减轻，稳定的(即不愈加恶化的)疾病状况，推迟或减缓疾病进展，疾病状态的改善或减轻等。“治疗”还可意指：与未接受治疗的预期生存期相比，延长了生存期。
术语“预防有效量”是指由研究人员、兽医、医生或其它临床医师找出的能抑制或推迟对象发病的活性化合物或药剂的量。本文使用的术语“治疗有效量”是指由研究人员、兽医、医生或其它临床医师找出的能引发对象中的生物学或医学响应(其可包括缓解所治疗之疾病或病症的症状等)的活性化合物或药剂的量。用于确定治疗和预防有效量的方法是本领域中已知的。
所述治疗可应用自体的(即来自待治疗对象的细胞)、同种异体的(即来自除了待治疗对象以外的、属于同一物种的对象的细胞)或异种的(即来自属于除所治疗对象以外之物种的对象的细胞)本文定义的MSC、BMSC或骨形成细胞或者细胞群。
特别是还包括使用人自体的或同种异体的本文获得的MSC、BMSC或骨形成细胞或细胞群进行治疗。
适当地，可以将本文得到的MSC、BMSC或骨形成细胞和细胞群作为药物组合物进行配制和施用。
药物组合物通常包含作为活性成分的本发明MSC、BMSC或骨形成细胞或细胞群，以及一种或多种可药用的载体/赋形剂。本文使用的“载体”或“赋形剂”包括任何或所有的溶剂、稀释剂、缓冲剂(如中性缓冲盐溶液或磷酸盐缓冲液)、增溶剂、胶体、分散介质、运载体(vehicle)、填充剂、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(如甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、增香剂、增稠剂、为实现贮存效果的试剂、包衣、抗真菌剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、渗透压控制剂(tonicity controlling agent)、吸收延迟剂等。这些介质和试剂在药物活性成分中的用途是本领域公知的。这些材料应当是无毒的并且应当不干扰细胞的活性。
所述载体或赋形剂或其它材料的具体性质取决于施用途径。例如，所述组合物可采用肠道外可用的水溶液形式，该水溶液是无热源的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。作为药物配制的一般性原则，读者可参考Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn&W.Sheridan编，Cambridge UniversityPress，1996；以及Hematopoietic Stem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister&P.Law，Churchill Livingstone，2000。
这些药物组合物还可包含确保其中细胞之生存力的组分。例如，所述组合物可包含合适的缓冲系统(如磷酸盐或碳酸盐缓冲系统)以实现期望的pH(更常用为接近中性pH)，并且可包含足够的盐以确保针对细胞的等渗条件以防止渗透压。例如，为这些目的的合适溶液可以是本领域已知的磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化钠溶液、林格注射液或乳酸林格注射液。此外，所述组合物可包含载体蛋白质(如白蛋白)，其可以提高细胞的生存力。
所述药物组合物还可包含可用于修复骨损伤和缺陷的组分。例如，这样的组分可包括但不限于骨形态生成蛋白、骨基质(如由本发明的细胞或由其它方法在体外产生的骨基质)、羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒(hydroxyapatite/tricalcium phosphate particle，HA/TCP)、明胶、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、透明质酸、壳聚糖、聚L-赖氨酸和胶原蛋白。例如，可以将成骨细胞与去矿化的骨基质(demineralised bone matrix，DBM)或其它基质联用以制备具有骨生成(其自身形成骨)和骨诱导作用的复合物。使用自体骨髓细胞与同种异体DBM的类似方法也得到了好的结果(Connolly等.1995.Clin Orthop 313：8-18)。
所述药物组合物还可包含补充性生物活性因子(如骨形态生成蛋白(如BMP-2、BMP-7或BMP-4)或任何其它生长因子)或与之共施用。其它可能的附加组分包括适于辅助骨再生的无机钙源或磷酸源(WO00/07639)。需要时，可利用载体基质或材料来施用细胞制备物，以提供改善的组织再生。例如，所述材料可以是陶瓷颗粒或生物聚合物，如明胶、胶原蛋白、骨连蛋白、纤维蛋白原或骨钙蛋白。可根据标准技术合成多孔基质(如，Mikos等，Biomaterials 14：323，1993；Mikos等，Polymer 35：1068，1994；Cook等，J.Biomed.Mater.Res.35：513，1997)。
作为替代或另外地，在导入骨损伤(如手术或骨折部位)之前，本发明的细胞可以用目的核酸稳定地或瞬时地转化。目的核酸序列包括但不限于那些编码增强成骨细胞之生长、分化和/或矿化的基因产物的序列。例如，为治疗非愈合性骨折或骨质疏松，可以稳定或瞬时的方式导入BMP-2表达系统。细胞转化的方法是本领域技术人员已知的。
另一方面，本发明涉及一种装置，其包含用于向对象(例如全身地、局部地或者在骨损伤部位)施用组合物的手术器械，还包含本发明的细胞或细胞群或者包含所述细胞或细胞群的药物组合物，其中所述装置适用于(例如全身地、局部地或者在骨损伤部位)施用药物组合物。例如，合适的手术器械可以例如全身地或在骨损伤部位注射包含本发明之细胞的液体组合物。
所述细胞或细胞群可以这样的方式施用，即允许它们移植或迁移到期望的组织部位并使功能缺陷的区域重建或再生。所述组合物的施用取决于所修复的肌骨骼部位。例如，重塑组织或插入裂隙的手术操作或者假肢设备(如髋关节置换)有利于骨生成。在另一些情况下，不需要侵入性手术，可使用引导式内窥镜通过注射来施用所述组合物(如用于修复脊柱)。
在一个实施方案中，上述定义的药用细胞制备物可以液体组合物的形式来施用。在一些实施方案中，所述细胞或包含该细胞的药物组合物可全身性地、局部地或在损伤部位处施用。
在另一实施方案中，所述细胞或细胞群可被移至和/或培养于合适的基底上，以提供植入物。细胞可施加和培养于其上的基底可以是金属(如钛、钴/铬合金或不锈钢)、生物活性表面(如磷酸钙)、聚合物表面(如聚乙烯)等。尽管并非优选地，也可以使用硅质材料(如玻璃陶瓷)作为基底。最优选的是金属(如钛)和磷酸钙(即使磷酸钙并非基底的必不可少的组分)。所述基底可以是多孔的或无孔的。
例如，需要时，可以将已增殖的细胞或正在培养皿中进行分化的细胞转移至三维固体支持物上，从而通过将该固体支持物孵育在本发明的液体营养培养基中来使所述细胞扩增和/或继续分化进程。可以例如通过用含有所述细胞的混悬液浸渍所述支持物来使细胞转移至三维固体支持物上。经上述方法获得的经浸渍的支持物可被植入人对象中。在最终植入前，还可以通过使所述经浸渍支持物浸没于液体培养基中而对其进行再次培养。
所述三维固体支持物需要是生物相容性的，从而使其能够被植入人中。它可以采用任意合适的形状，如圆柱状、球状、盘状或任意形状的一部分。对于适合于生物相容性三维固体支持物的材料来说，可特别关注碳酸钙特别是霰石(特别是珊瑚骨骼的形式)，基于氧化铝、氧化锆、磷酸三钙和/或羟磷灰石的多孔性陶瓷，通过水热交换使碳酸钙转化成羟磷灰石而制得的仿珊瑚骨骼，或者其它磷灰石-硅矿石玻璃陶瓷、生物活性玻璃陶瓷(如Bioglass(TM)玻璃)。
以下非限制性实施例进一步支持了上述方面和实施方案。
实施例表明了分离这样的一群新的骨祖细胞亚群，其源自共表达高水平之CD34(造血-血管生成特性)和CD105(间充质特性)的间充质基质细胞，具有提高的骨形成特性和促血管生成特性。该细胞群占正常扩增之间充质基质细胞的不足1％。但是，通过双重细胞分选或在特定条件下进行培养，该细胞群可被成功地富集了高达90倍。由于该富集的细胞群具有显著更高的增殖潜力和显著更高的骨重建特性，因此该富集的CD105/CD34+细胞群(如高达5～50％)对于治疗骨疾病具有非同寻常的意义。此外，它们的血管生成(CD34+)特性增加了治疗益处，这是因为血管重建之诱导和骨重建的组合可能是优选的。
实施例1
分离和培养骨髓MSC。从患者的髂嵴或健康志愿者中获得100ml经肝素化的骨髓(BM)。将BM与磷酸盐缓冲液(PBS，2v∶v)混合，并利用密度梯度Ficoll溶液进行分层。离心后，从界面处收获单个核细胞，并用PBS清洗两次。用添加了20％血浆、任选地添加了FGF-2的DMEM培养基重悬细胞。以1×107个细胞/175cm2培养瓶的密度将细胞铺板(测试范围：1×105～1×109)，并维持在37℃、含5％CO2的潮湿空气中。使细胞贴附1～4天，然后首次更换培养基，随后以如下所述的时间间隔进行培养。
分离CD34阳性细胞。14天标准的间充质培养(DMEM和20％血浆)后，收获约1×108个细胞，并维持在PBS中。然后在室温下用经APC标记的抗CD34单克隆抗体标记整个细胞群1小时。用PBS清洗后，通过离心沉淀细胞，再用1ml冷的经除气的分选缓冲液进行重悬。
利用Becton Dickinson免疫细胞系统纯化细胞。使用680nm绿色荧光参数对细胞进行分选，然后将含有荧光细胞的液滴收集进无菌微离心管(Fisher scientific)中，通过离心进行沉淀，并立即接种在合适的培养瓶中。
通过培养进行富集。在第28天，于37℃使用胰蛋白酶溶液1-5分钟以剥离MSC细胞。对细胞进行计数，并以1×106个细胞/175cm2的密度铺板，在含或不含生长因子(如实施例中所示)的同样的标准条件下，再培养一周。
表型分析。利用流式细胞术分析免疫生物学细胞表面标志物。将细胞与下述经标记的单克隆抗体一起孵育15分钟：CD105、CD90和CD73以及CD34，然后用PBS清洗，继而进行离心以及用0.3ml PBS重悬。
ALP染色。在第28天或第35天对细胞进行染色以进行ALP检测。用PBS清洗细胞两次，然后在室温下用60％柠檬酸缓冲丙酮固定30秒，之后用蒸馏水再次冲洗45秒。然后，在室温下用固蓝(Fast Blue)RR/萘酚AS-MX磷酸盐溶液避光染色30分钟。用蒸馏水清洗细胞2分钟，然后用Mayer’s苏木精溶液复染细胞10分钟。最后，用蒸馏水清洗细胞3分钟。
矿化测定。通过与胰蛋白酶一起孵育，在第28天或第35天回收培养物中的细胞，并以60～120000个细胞/孔在6孔板的扩增培养基(12 500个细胞/cm2)中铺板。第二天，用2.5ml骨生成培养基更换该培养基。将细胞培养2、3或4周。培养基每3～4天更换一次。培养2周后，用3.7％甲醛/PBS固定细胞，并用茜素红染色。
网络形成测定。进行Matrigel管道形成测定，以评估细胞群形成毛细血管样结构网络的能力。简言之，根据制造商的说明，用10μl(3.5mg/ml)纯的生长因子减少的Matrigel(BD Matrigel Basement Membrane Matrix，BD Biosciences，Erembodegem-Aalst，Belgium)包被24孔培养板的每个孔，然后在37℃使其聚合30分钟。将总共30.103个细胞/孔接种在Matrigel上，在37℃孵育6小时。清洗后，用倒置相差显微镜观察网络和管道的形成。
培养基
地塞米松稀释剂：
Dex1(5.10-4M)：2μl地塞米松母液(5.10-2M)+198μlαMEM
Dex2(10-6M)：2μl Dex1(5.10-4M)+998μlαMEM
骨生成培养基(40ml)
| 体积 | 终浓度 | |
| αMEM | 31ml | / |
| FCS | 6ml | 15％ |
| PenStrepGlu(100×) | 400μl | 1× |
| 地塞米松(Dex2) | 400μl | 10-8M |
| 抗坏血酸 | 200μl | 50μg/ml |
| β-甘油磷酸酯 | 2ml | 10mM |
实施例2
细胞表型
如实施例1(“分离和培养骨髓MSC”)中所述获得、未经细胞分选或生长因子刺激的MSC细胞群表达高水平的间充质标志物(CD90、CD105和CD73)，这与其间充质来源是相符的。造血CD34表面分子表达水平低(通常为整个细胞群的5％～15％)。代表细胞之骨分化潜力的ALP标志物也为高表达(表1和2)。三分之一的CD34+细胞也是CD90+(图1-低和高水平表达的CD90/CD34+)。
表1：MSC的表型标志物(FACS测定为阳性的细胞百分比)
＊获得针对CD105和CD73的类似结果
表2：MSC的表型标志物(FACS测定为阳性的细胞百分比)
细胞主要是骨钙蛋白阴性的(＜33％)。
实施例3
CD34阳性细胞的分离
在如实施例1(“分离和培养骨髓MSC”)中所述进行的第一次扩增步骤最后，在细胞分选前，将MSC细胞从培养瓶中收集。利用流式细胞术分选，使用阳性选择方法来分离CD90/CD34+细胞群。首先用特异性的偶联有APC的抗CD34抗体溶液对细胞染色，然后将细胞群注射穿过Becton-Dickinson荧光激活细胞分选仪，以从细胞群中分离经CD34标记的细胞。然后，将CD34+细胞收集于磷酸缓冲盐溶液中。
对一份细胞进行分析以检测纯度。从1×108个初始细胞分选得到平均约50×106个细胞(其中15～90％为CD90/CD34+骨祖细胞)，相应地富集因数为10～30。在同样的条件下对这些细胞进一步培养。
实施例4
扩增方法
将如实施例3中所述获得的经分离CD34+细胞采用一周培养方案进行扩增。经分离级分中约70～75％在纯化步骤仍存活。所述细胞孵育在包含补充有生长因子和细胞因子之血浆的标准培养基中。或者，也可以培养未分选的细胞。无论是否分选都得到类似的结果。
与造血因子(如CSF2、CSF3、M-CSF、GM-CSF、IFN、TNF或细胞因子(如IL2))中单独一种或多种组合一起孵育的细胞可以得到与在标准条件下培养之细胞同样的产量。但是，与血管生成因子(如FLT1、PDGF、VEGF、vWF，、血管生成素2、FGF1、FGF3和EPO)中单独一种或多种组合一起孵育的细胞产量比标准条件下获得的产量平均高出25％。更令人感兴趣的是，造血因子和血管生成因子的组合能够得到扩增产量的最高增加(接近50％)，这表明该组合具有协同作用。
在骨生成培养基中孵育的细胞可用作对照，其得到最初CD90/CD34+初始细胞群的中等扩增率。
作为一个实例，与单独用GM-CSF或FGF-2孵育的细胞相比，在FGF-2存在下用造血因子GM-CSF孵育的细胞的产量显著增加(表3)。
表3：CD90/CD34+的扩增产量(％为标准条件)
而且，经过一周的培养，CD90/CD34+细胞的表型与最初的骨形成细胞呈同样的纺锤形(图2)。
所述骨祖细胞在(培养期间)整个过程中均保持贴附，这表明该新的细胞群不会进入循环，并因而区别于进入循环的成骨细胞谱系(如Eghbali-Fatourechi等.2007.Bone 40：1370-7中的一种细胞)。
在标准培养条件下，于扩增结束时对这些细胞的表面标志物特征进行分析：CD34标志物维持在高水平，而其它间充质标志物或骨特异性标志物维持不变，这支持了该新的细胞群具有骨生成特征(ALP)和造血特征(CD34呈阳性)(表4和图3)。
表4：在经补充的培养条件下扩增一周后，CD90/CD34+细胞的表型标志物(FACS测定为阳性的细胞百分数)。
实施例5
骨重建特性
通过测量ALP产生(ALP染色)以及新细胞群形成和矿化新骨基质的能力来对该新细胞群(如实施例3中获得，在GM-CSF和FGF-2的存在下)的生物学特性进行评估。CD34+细胞产生大量的骨基质(在最高分为2的评分中打2分)，并对ALP染色处理显著呈阳性(在最高分为2的评分中打2分)，这表明该细胞群具有高的骨重建潜力(图4)。作为比较，标准的MSC培养物得到1～1.5的骨基质评分以及1.5的ALP染色评分。
令人感兴趣的是，已显示CD34+细胞在细胞群中所占百分比越高，其矿化能力则越高(图5)。
实施例6
MSC和骨形成细胞的扩增、富集和特性
在造血生长因子和/或血管生成生长因子存在下的增殖(表5)
对细胞采用如实施例1中所述的富集方案(“通过培养进行富集”)。
如表5所示(n＝3)，与对照条件(FBS 15％)相比，FGF-2(2ng/ml)诱导特定的骨形成细胞群的增殖和扩增。我们的数据进一步表明，在FGF-2存在下，使用GM-CSF(10ng/ml)或IFN-γ(10ng/ml)可获得和/或维持该骨形成细胞群的产生和/或扩增，并且在使用FGF-1(2ng/ml)、FGF-3(2ng/ml)或PDGF(1ng/ml)血管生成生长因子时显著增加。
表5：在造血生长因子和/或血管生成生长因子存在下的增殖
1存在FGF-2；＊A＝血管生成，H＝造血
表型特征(表6)
对经扩增的骨形成细胞进行流式细胞分析(n＝3)，表明该被选择的细胞群表现出特异性的表型特征，即表达CD34连同典型的间充质细胞标志物(如CD105、CD73和CD90)，而缺乏造血细胞和内皮细胞表面标志物(如CD45、CD133和CD31抗原)。
表6：表型特征
1存在FGF-2
骨生成特性(表7，图6)
对经扩增的骨形成细胞群进行流式细胞分析和ALP染色，显示这些细胞表现出强的骨生成特性(n＝3)。此外令人感兴趣的是，IFN-γ选择性地且显著地提高ALP表达和染色，从而增强细胞的骨生成特性。
表7：骨生成特性-ALP测量
1存在FGF-2
促血管生成特性和毛细血管样结构形成潜力(表7，图7)
对经扩增的骨形成细胞进行流式细胞分析表明vWF和VEGF分子表达上调(n＝3)。而且，如图7(n＝1)所示，我们的数据显示该骨形成细胞群能分化并组织成有分支的新生血管结构和Matrigel模型中的假管道。另外，与对照(以及其它造血因子和/或血管生成因子)相比，IFN-γ显著地增强该网络结构的形成。这些体外结果显示，IFN-γ和经扩增的骨形成细胞群能够促进管道形成和毛细血管样结构的发育(促血管生成作用)。
Claims (23)
1.分离的间充质干细胞(MSC)，其特征为共表达至少CD105和CD34。
2.权利要求1所述的分离的MSC细胞，其共表达CD105、CD90、CD73和CD34。
3.用于获得共表达至少CD105和CD34的MSC细胞的方法，其包括从MSC细胞群中富集共表达至少CD105和CD34的细胞亚群。
4.根据权利要求3所述的方法，其包括：
(a)从对象的样品中分离MSC细胞；
(b)任选地，富集和/或扩增(a)中的MSC细胞；以及
(c)从(a)或(b)的MSC细胞中富集共表达至少CD105和CD34的细胞亚群。
5.用于体外扩增MSC细胞、优选权利要求1或2中任一项所述的MSC细胞的方法，其包括将所述MSC细胞暴露于一种或多种造血生长因子，或暴露于一种或多种血管生成生长因子，或暴露于一种或多种造血生长因子和一种或多种血管生成生长因子，以及任选地和优选地还包括将所述MSC细胞暴露于FGF-2。
6.从MSC细胞群在体外获得如权利要求1或2中任一项所定义的MSC细胞和/或富集MSC细胞群中如权利要求1或2中任一项所定义的MSC细胞的方法，其包括将所述MSC细胞群暴露于一种或多种造血生长因子，或暴露于一种或多种血管生成生长因子，或暴露于一种或多种造血生长因子和一种或多种血管生成生长因子，以及任选地和优选地还包括将所述MSC细胞暴露于FGF-2。
7.权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述造血生长因子选自包含以下的组：集落刺激因子2(CSF2)、CSF3、巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞单核细胞CSF(GM-CSF)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)和造血活性细胞因子，所述血管生成生长因子选自包含以下的组：血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、冯·维勒布兰德因子(vWF)、血管生成素1或2、成纤维细胞生长因子和促红细胞生成素(EPO)。
8.权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述造血生长因子为GM-CSF或IFN-γ，更优选为IFN-γ，所述血管生成生长因子是PDGF、FGF-1或FGF-3，更优选为PDGF或FGF-3。
9.可通过权利要求3至8中任一项所述方法获得的MSC细胞。
10.可通过使权利要求1、2或9中任一项的MSC细胞体外分化为骨形成细胞而获得的骨形成细胞。
11.分离的骨形成细胞，其特征为共表达CD105和CD34。
12.权利要求11所述的分离的骨形成细胞，其共表达CD105、CD90、CD73和CD34。
13.体外扩增骨形成细胞、优选权利要求10至12中任一项所述的骨形成细胞的方法，其包括将所述骨形成细胞暴露于一种或多种造血生长因子，或暴露于一种或多种血管生成生长因子，或暴露于一种或多种造血生长因子和一种或多种血管生成生长因子，以及任选地和优选地还包括将所述骨形成细胞暴露于FGF-2。
14.从骨形成细胞群在体外获得如权利要求10至12中任一项所定义的骨形成细胞和/或富集骨形成细胞群中如权利要求10至12中任一项所定义的骨形成细胞的方法，其包括将所述骨形成细胞群暴露于一种或多种造血生长因子，或暴露于一种或多种血管生成生长因子，或暴露于一种或多种造血生长因子和一种或多种血管生成生长因子，以及任选地和优选地还包括将所述骨形成细胞暴露于FGF-2。
15.权利要求13或14中任一项所述的方法，其中所述造血生长因子选自包含以下的组：集落刺激因子2(CSF2)、CSF3、巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞单核细胞CSF(GM-CSF)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)和造血活性细胞因子，所述血管生成生长因子选自包含以下的组：血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、冯·维勒布兰德因子(vWF)、血管生成素1或2、成纤维细胞生长因子和促红细胞生成素(EPO)。
16.权利要求13或14中任一项所述的方法，其中所述造血生长因子为GM-CSF或IFN-γ，更优选为IFN-γ，所述血管生成生长因子是PDGF、FGF-1或FGF-3，更优选为PDGF或FGF-3。
17.可通过权利要求13至16中任一项所述方法获得的骨形成细胞。
18.根据权利要求1、2或9中任一项所述的MSC细胞或者根据权利要求10至12或17中任一项所述的骨形成细胞，其中所述MSC细胞或所述骨形成细胞表现出骨生成特性和促血管生成特性。
19.根据权利要求1、2、9或18中任一项所述的MSC细胞或者根据权利要求10至12、17或18中任一项所述的骨形成细胞，其来源于人。
20.包含根据权利要求1、2、9、18或19中任一项所述的MSC细胞和/或根据权利要求10至12、17至19中任一项所述的骨形成细胞的细胞群。
21.根据权利要求1、2、9、18或19中任一项所述的MSC细胞和/或根据权利要求10至12、17至19中任一项所述的骨形成细胞或者权利要求20的细胞群，其用于治疗骨相关疾病。
22.药物组合物，其包含权利要求1、2、9、18或19中任一项所述的MSC细胞和/或权利要求10至12、17至19中任一项所述的骨形成细胞或者权利要求20的细胞群，以及一种或多种可药用的载体/赋形剂。
23.用于制备权利要求21所述药物制剂的方法，其包括：将权利要求1、2、9、18或19中任一项所述的MSC细胞和/或权利要求10至12、17至19中任一项所述的骨形成细胞或者权利要求20的细胞群与一种或多种可药用的载体/赋形剂混合。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110413 |