KR20240018687A - 세포성 골 이식편 및 제조 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 골 이식편 재료, 그의 사용 및 제조 방법을 제공한다. 예시적인 골 이식편 재료는 방사선비투과 구성요소를 해면체 골 구성요소와 조합하여 골 이식편 재료를 생성시키는 것을 포함하며, 여기서 해면체 골 구성요소는 고유 골회복 세포를 포함한다. 골 이식편 재료를 사용한 대상체의 치료 방법도 제공된다.
Description
[관련 출원의 상호-참조]
본 특허 출원은 2017년 6월 30일자 U.S. 특허 가출원 제62/527,628호에 대하여 우선권 혜택을 주장하며, 그의 내용이 전체적으로 참조로 포함된다.
본 개시내용은 일반적으로 의료용 이식편 분야, 특히 골 이식편 조성물, 그리고 그의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다. 골은 유기 및 무기 재료로 구성되어 있다. 중량 기준으로, 골은 대략 20 % 수분이다. 건조한 골의 중량은 칼슘 포스페이트와 같은 무기 미네랄 (예컨대 65-70 중량%) 및 주로 콜라겐인 섬유질 단백질의 유기 매트릭스 (예컨대 30-35 중량%)로 구성된다. 미네랄화된 및 탈미네랄화된 골 모두가 의료용 이식 목적으로 사용될 수 있다.
골 이식편은 골 이식편 부위로 숙주 세포를 동원하며, 골모세포로 분화할 수 있는 골생성 선조 세포를 통하여 새로운 골 성장을 촉진한다. 이상적으로는, 골 이식편은 골전도, 골유도 및 골생성 특성을 보유함으로써, 골 결함, 골절 및 기타 외과적 시술 (예컨대 척추 유합술)의 복구를 촉진한다.
의료용 이식 시술은 종종 특정 이상 또는 질환을 치료하기 위한 환자에의 자가, 동종이식 또는 합성 이식편의 이식을 포함한다. 정형외과적 재건 시술 및 기타 의료 시술에서의 근골격 동종이식편 조직의 사용은 근년에 현저하게 증가하여, 수백만개의 근골격 동종이식편이 안전하게 이식되고 있다. 일반적인 동종이식편은 골이다. 통상적으로, 골 이식편은 치유시 환자의 선천 골에 의해 시간이 지나면서 재흡수 및 대체된다. 골 이식편은 예를 들면 신경외과적 및 정형외과적 척추 시술을 포함한 다양한 조치에서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편은 관절을 유합시키거나 부러진 골 또는 골 결함을 복구하는 데에 사용될 수 있다.
동종이식편 및 자가 골은 모두 인간으로부터 유래하며; 차이는 동종이식편 골이 이식편을 제공받는 개체 (예컨대 환자)가 아닌 다른 개체 (예컨대 공여자)로부터 회수된다는 것이다. 동종이식편 골은 종종 그의 사망시 의료상의 치료 목적으로 그의 조직이 공여됨으로써 그것을 필요로 하는 살아있는 사람, 예를 들면 암으로 인하여 그의 골이 변성된 환자를 위하여 그것이 사용될 수 있도록 지명되어 있는 개체로부터 채취된다. 그와 같은 조직은 다른 사람의 삶의 질을 향상시키기 위한 공여자 또는 공여자 가족으로부터의 증여물에 상당한다. 이에 따라, 동종이식 골 이식편 재료는 자가 골 재료에 대한 대안이 된다. 그러나, 동종이식 골 이식편 재료는 보통 공여자와 구별되는 숙주에 이식될 때의 질환 전파 또는 면역학적 반응의 위험성 (예컨대 이식편 대 숙주 질환 (GVHD))을 감소시키기 위하여 철저하게 처리 및 멸균된다. 통상적으로, 동종이식편 골 재료 처리는 골 이식편 재료로부터 골생성 및 골유도 특성을 제거함으로써, 나머지 골전도성 스캐폴드(scaffold)만을 남긴다. 이에 따라, 골전도성 골 이식편이 이식된 환자에서는 골생성 및/또는 골유도 메커니즘을 자극하기 위하여 재조합 골 형태형성 단백질 (예컨대 BMP-2)의 전달이 사용되어 왔다.
현재 골 이식편 조성물 및 방법은 그를 필요로 하는 환자에게 실제적인 이익을 제공하고 있다. 그러나, 개선된 골 이식편 조성물 및 환자의 치료 방법을 제공하기 위해서는, 추가적인 개선을 필요로 한다. 골 이식편 조성물, 치료 방법 및 본원에서 기술되는 제조는 추가적인 해결책을 제공함으로써, 미해결 수요를 충족한다.
배경기술이 개시된 선행기술문헌 목록
- 선행문헌 1: 국제공개공보 WO 2014/110284 A1
- 선행문헌 2: 국제공개공보 WO 2008/027864 A1
[발명의 개요]
일 측면에서, 제공되는 것은 골 이식편 재료의 제조 방법이다. 대표적인 방법은 방사선비투과 구성요소를 해면체 골 구성요소와 조합하여 골 이식편 재료를 생성시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 골 이식편 재료는 고유하거나 내생인 살아있는 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 고유하거나 내생인 살아있는 세포는 골모세포, 파골세포, 섬유모세포, 골세포 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)에서 선택되는 골회복 세포(osteoreparative cell)이다. 일부 경우에서, 상기 방사선비투과 구성요소는 비-탈미네랄화된 피질 골이다. 일부 경우에서, 방사선비투과 구성요소는 비-탈미네랄화된 피질 골, 바륨 술페이트, 비스무트 트리옥시드, 비스무트 서브카르보네이트, 텅스텐, 티타늄, 산화 지르코늄, 아이오딘화된 폴리에스테르 또는 아이오딘화된 지방족 단량체를 포함한다. 일 실시양태에서, 방사선비투과 구성요소는 바륨 술페이트이다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 알긴산, 카르복시-메틸 셀룰로스, 히아루론산, 젤라틴, 폴락사머, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜리드 (PG), 키토산, 키틴 또는 이들 중 어느 것의 금속 염 중 1종 이상을 포함하는 바인더를 포함한다. 상기 금속 염은 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염일 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 형태형성 단백질 (BMP), 섬유모세포 성장 인자-2 (FGF-2), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF-II), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 형질전환 성장 인자 베타 I (TGFβ-I) 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 첨가제를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 첨가제는 재조합 첨가제 (예컨대 인간 재조합 BMP-2 (hrBMP-2))이다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골막, 근막 또는 양자를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 탈미네랄화된 피질 골을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 냉동보존제 중에 냉동보존된다. 일부 실시양태에서, 상기 냉동보존제는 디메틸 술폭시드 (DMSO), CS10®, 트레할로스, 덱스트로스, 알파-토코페롤, 안정화된 아스코르브산, 레스베라트롤, 메탄올, 부탄디올, 프로판디올, 히드록시에틸 전분, 글리콜 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 제조 방법은 해면체 골을 비-효소적으로 처리하여 비-효소적으로 처리된 해면체 골 구성요소를 생성시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 비-효소적 처리는 해면체 골이 그에 의해 세포 배양 배지에 수동적으로 침지되는 수동적 침지 주기(passive soaking cycle)를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 배지는 최소 필수 배지 (MEM), 최소 필수 배지 이글 (MEME) 또는 둘베코 변형 이글 배지/햄 영양소 혼합물 F-12에서 선택되는 포유동물 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 보충제 및/또는 항생제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 보충제는 소 태아 혈청 (FBS), 인간 혈청, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈소판 용해물 (hPL)이다. 일부 실시양태에서, 보충제는 필수 또는 비-필수 아미노산 보충제 (예컨대 MEME 아미노산)이다. 일부 실시양태에서, 상기 항생제는 반코마이신, 겐타마이신, 폴리믹신 B, 시프로플록사신, 암포테리신 B 또는 바시트라신을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 제조 방법은 바인더를 해면체 골 및 방사선비투과 구성요소와 조합하기 전에 바인더를 사전-수화시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 사전-수화 단계는 젤, 검 또는 퍼티(putty)-유사 재료가 형성될 때까지 일정 시간 기간 동안 바인더를 세포 배양 배지에 침지하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 제공되는 것은 대상체에의 이식에 적합한 골 이식편 재료이다. 대표적인 골 이식편 재료는 방사선비투과 구성요소 및 해면체 골 구성요소를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 해면체 골 구성요소는 비-효소적으로 처리된 해면체 골 구성요소이다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 비-탈미네랄화된 피질 골을 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 바인더 및/또는 첨가제를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 고유 해면체 골에 존재하는 내생 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 내생 세포는 골모세포, 파골세포, 골세포, 섬유모세포, MSC 또는 이들의 조합에서 선택되는 골회복 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료에는 백색 혈구 (백혈구) 또는 적색 혈구 (적혈구)가 없거나, 실질적으로 (예컨대 >90 %) 없다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료에는 적혈구가 없다.
일부 경우에서, 골 이식편 재료는 5 % 미만의 CD4+ 세포를 함유한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 5 % 미만의 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 5 % 미만의 CD45+ 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 50 % 초과의 CD44+ 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 30 % 초과의 CD90+ 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 10 % 초과의 무손상이며 (예컨대 생존가능한 살아있는 세포) 골 이식편 재료에 부착되는 CD44+ 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골막, 근막 또는 양자를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 조성물은 골 이식편 재료 그램 당 1,000 내지 1억개 사이의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 조성물은 골 이식편 재료 그램 당 10,000 내지 6천만개 사이의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 조성물은 골 이식편 재료 그램 당 100,000 내지 2천만개 사이의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 MSC 1,000 내지 5천만개 사이의 평균 세포 계수를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 MSC 10,000 내지 3천만개 사이의 평균 세포 계수를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 MSC 100,000 내지 2천만개 사이의 평균 세포 계수를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 MSC 1백만개의 평균 세포 계수를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 MSC 5백만개의 평균 세포 계수를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편은 골 이식편 재료 중 총 세포 조성물을 기준으로 1 % 내지 80 % 사이의 MSC를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편은 골 이식편 재료 중 총 세포 조성물을 기준으로 5 % 내지 30 %의 MSC를 포함한다. 일부 경우에서, 골 이식편은 골 이식편 재료 중 총 세포 조성물을 기준으로 10 % 내지 50 %의 MSC를 포함한다.
또 다른 측면에서, 제공되는 것은 골 이식편 재료를 사용한 대상체의 치료 방법이다. 대표적인 치료 방법은 골 이식편 재료를 대상체에게 (예컨대 대상체의 손상되거나 결함이 있는 골에) 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 골 이식편 재료는 이식 과정 전 또는 동안에 외과용 기구 또는 외과용 구성체에 적용된다 (예컨대 척추 케이지(spinal cage)). 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골절을 복구하기 위하여 대상체에게 투여된다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 정형외과 또는 신경외과 시술 동안 대상체에게 투여된다. 일 실시양태에서, 상기 외과적 시술은 척추 유합술이다.
해당 도면들은 제한이 아니라 예시하고자 하는 것이다. 본 개시내용의 측면들이 일반적으로 이들 도면의 맥락에서 기술되기는 하지만, 해당하는 특정 측면으로 본 개시내용의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
도 1은 본 개시내용의 대표적인 실시양태에 따른 골 이식편 재료 제조 방법의 측면들을 도시한다.
도 2는 본 개시내용의 대표적인 실시양태에 따른 또 다른 골 이식편 재료 제조 방법의 측면들을 도시한다.
도 3은 척추 케이지 내에 위치된 본 개시내용 골 이식편 재료의 영상이다.
도 4는 상이한 양의 방사선비투과 구성요소 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소)를 함유하는 대표적인 본 개시내용 골 이식편 재료들의 X-선 영상이다.
도 5는 유동 세포측정법에 의해 측정된, 다양한 콜라게나제 조제물을 사용한 대표적인 본 개시내용 골 이식편 재료로부터의 총 세포 수율 및 회수율을 보여주는 그래프이다. 최대 세포 회수율은 40 % 또는 60 % 콜라게나제:40 % 중성 프로테아제 조제물을 사용하여 수득되었다. 그램 당 대략 2 x 107개 세포가 회수되었다.
도 6은 대표적인 본 개시내용 골 이식편 재료를 세척하는 것의 결과로서의 CD45+ 세포의 감소를 보여주는 그래프이다. 3회의 세척 단계 후에는 대표적인 골 이식편 재료에서 CD45+ 세포가 검출되지 않았다.
도 7은 대표적인 골 이식편 재료를 세척하는 것의 결과로서의 골생성 세포 (예컨대 골세포 및 MSC)의 제한된 감소를 보여주는 그래프이다. CD44+ 세포는 각 세척 주기에 따라 총 세포 수와 대략 동일한 비율로 감소되었다.
도 8은 대표적인 골 이식편 재료를 세척하는 것의 결과로서의 중간엽 줄기 세포 (CD44+ 및 CD90+)의 제한된 감소를 보여주는 그래프이다. CD44+ 및 CD90+ 세포는 세척 당 대략 17 %의 비율로 감소되었다.
도 9는 다양한 농도의 냉동보호제에 의해 영향을 받았을 때의 대표적인 골 이식편 재료 유래 생존가능한 세포의 총 세포를 보여주는 그래프이다.
도 1은 본 개시내용의 대표적인 실시양태에 따른 골 이식편 재료 제조 방법의 측면들을 도시한다.
도 2는 본 개시내용의 대표적인 실시양태에 따른 또 다른 골 이식편 재료 제조 방법의 측면들을 도시한다.
도 3은 척추 케이지 내에 위치된 본 개시내용 골 이식편 재료의 영상이다.
도 4는 상이한 양의 방사선비투과 구성요소 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소)를 함유하는 대표적인 본 개시내용 골 이식편 재료들의 X-선 영상이다.
도 5는 유동 세포측정법에 의해 측정된, 다양한 콜라게나제 조제물을 사용한 대표적인 본 개시내용 골 이식편 재료로부터의 총 세포 수율 및 회수율을 보여주는 그래프이다. 최대 세포 회수율은 40 % 또는 60 % 콜라게나제:40 % 중성 프로테아제 조제물을 사용하여 수득되었다. 그램 당 대략 2 x 107개 세포가 회수되었다.
도 6은 대표적인 본 개시내용 골 이식편 재료를 세척하는 것의 결과로서의 CD45+ 세포의 감소를 보여주는 그래프이다. 3회의 세척 단계 후에는 대표적인 골 이식편 재료에서 CD45+ 세포가 검출되지 않았다.
도 7은 대표적인 골 이식편 재료를 세척하는 것의 결과로서의 골생성 세포 (예컨대 골세포 및 MSC)의 제한된 감소를 보여주는 그래프이다. CD44+ 세포는 각 세척 주기에 따라 총 세포 수와 대략 동일한 비율로 감소되었다.
도 8은 대표적인 골 이식편 재료를 세척하는 것의 결과로서의 중간엽 줄기 세포 (CD44+ 및 CD90+)의 제한된 감소를 보여주는 그래프이다. CD44+ 및 CD90+ 세포는 세척 당 대략 17 %의 비율로 감소되었다.
도 9는 다양한 농도의 냉동보호제에 의해 영향을 받았을 때의 대표적인 골 이식편 재료 유래 생존가능한 세포의 총 세포를 보여주는 그래프이다.
I. 서론
본 개시내용은 의료용 이식편 분야의 조성물, 방법 및 시스템, 특히 이식가능한 골 이식편 재료, 그리고 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 해당 골 이식편의 제조 및 사용 시스템 및 방법과 함께, 본원에서 개시된 바와 같은 골 이식편 재료는 정형외과, 재건 외과, 구강 외과 및 신경외과를 포함한 다양한 산업에서 유용하다. 대표적인 실시양태에서, 골 이식편 재료는 수용자에서의 골 이상을 치료할 목적으로 수용자 (예컨대 환자 또는 대상체)에 이식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골생성 (골 성장) 및/또는 골 복구를 촉진하는 데에 매우 적합한데, 골 이식편 재료가 천연 발생 (즉 고유하거나 내생인) 골회복 세포를 포함하고 있기 때문이다. 일부 실시양태에서, 상기 골회복 세포는 골 이식편 재료의 구성요소 (예컨대 해면체 골)에 부착된다. 이에 따라, 골회복 세포를 함유하는 골 이식편 재료는 수술에 의해 수용자에 이식됨으로써, 골생성의 촉진을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 적색 혈구 (적혈구) 및/또는 백색 혈구 (백혈구)와 같은 면역원성 구성요소가 골 이식편 재료로부터 제거되도록 제조될 수 있다.
II. 용어
본원에서 사용될 때, "장골(long bone)"이라는 용어는 해당 폭에 비해 길이가 더 긴 인간 골격상의 골 (예컨대 대퇴골, 경골, 비골, 상완골, 요골, 척골, 중수골, 중족골, 손가락뼈 및 쇄골)을 지칭한다. 장골은 근위 및 원위 골단, 그리고 긴 골간 (몸통)을 포함한다. 상기 골간은 각 골간단 부문에 의해 원위 및 근위 골단으로부터 분리된다.
본원에서 사용될 때, "피질 골", "피질 골 구성요소" 또는 "치밀골"은 해면체 골에 비해 더 치밀한 인간 장골의 경질 외부 층을 지칭한다. 피질 골은 통상적으로 윤활한 백색의 고체 표면을 가지는 인간 골의 경질인 외부를 형성한다. 피질 골은 성인 인간 골격의 총 골 질량 중 80 %를 차지한다. 피질 골은 골원(osteon)으로 지칭되는 다수의 미세 컬럼들을 포함한다. 각 컬럼은 하버스관(Haversian canal)으로 지칭되는 중심 관 주변으로 다수의 골모세포 및 골세포 층을 가진다. 직각의 볼크만관(Volkmann's canal)은 골원들을 서로 연결한다. 피질 골은 MSC와 같은 골 선조 세포, 및 골 형태형성 단백질 (BMP)과 같은 자연 발생 골 자극 단백질로 구성되는 "골막"으로 알려져 있는 섬유질 단백질 외부 층으로 덮여 있다. 일부 경우에서, 골막은 피질 골이 방사선비투과 구성요소와 조합됨으로써 골 이식편 재료를 형성하기 전에 피질 골로부터 제거된다.
본원에서 사용될 때, "비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소"는 미네랄 함량이 유지되는 피질 골의 하위세트이다. 비-탈미네랄화된 피질 골은 방사선비투과 재료이다 (도 4 참조).
본원에서 사용될 때, "해면체 골", "해면체 골 구성요소" 또는 "섬유주(trabecular)"는 인간 골격상 골의 내부 부분으로, 골 조직의 다공성 네트워크를 포함한다. 해면체 골은 피질 골에 비해 더 높은 표면적-대-부피 비를 가지며, 그에 따라 덜 치밀해서, 해면체 골을 피질 골에 비해 더 연질이고 더 약하나 더 유연성이 되도록 한다. 해면체 골은 통상적으로 장골 (예컨대 대퇴골)의 근위 말단 및 추골의 내부 내에서 발견된다. 해면체 골은 고도로 혈관성이며, 빈번하게 혈구의 생성이 이루어지는 적색 골수를 함유한다. 해면체 골은 성인 인간 골격의 총 골 질량 중 20 %를 차지하며, 피질 골과 비교하였을 때 거의 10-배 증가된 표면적을 가진다.
본원에서 사용될 때, "탈미네랄화된 골 매트릭스" 또는 "DBM"은 무기 재료 (예컨대 칼슘과 같은 미네랄)가 제거됨으로써 유기 단백질성 (예컨대 콜라겐) 매트릭스만을 남긴 골 조직을 지칭한다. 일부 실시양태에서, DBM 조제물 또는 제제는 원래의 개시 칼슘 양 중 5 % 미만의 칼슘 (예컨대 1 %, 2 %, 3 % 또는 4 %의 칼슘)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 DBM 조제물 또는 제제는 중량 기준 1 % 미만의 칼슘을 포함한다. 무기 재료의 제거는 생물학적으로 활성인 BMP를 노출시킨다. 이에 따라, DBM은 통상적으로 비-탈미네랄화된 골 매트릭스에 비해 더 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. DBM은 비-탈미네랄화된 동종이식 골 이식편 재료에 비해 탁월한 골 이식 특성을 산출하는 것으로 관찰되었는데, 미네랄 함량의 제거가 골 이식편 재료의 골유도성을 증가시키는 것으로 밝혀져 있기 때문이다 (문헌 [Glowacki, et al., J Craniofacial Surg, 2009. 20(l):634-8]). 이에 따라, DBM은 골유도성 재료로 간주된다.
골을 탈미네랄화하기 위한 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Lewandrowski et al., J. Biomed Materials Res., (1996) 31:365-372]; [Lewandrowski et al., Calcified Tissue Int., (1997) 61:294-297]; 및 [Lewandrowski et al., J. Ortho. Res., (1997) 15:748-756]을 참조한다. 일반적으로, DBM을 제조하는 방법은 골을 (예컨대 무균으로) 분리하여, 감염성 요인을 사멸시키는 작용제 (예컨대 항생제 및/또는 항바이러스제)로 처리하는 것을 포함한다. 이후, 골은 적절한 크기 또는 형상 (예컨대 블록, 입자 또는 리본)으로 제분 또는 마쇄된 후, 미네랄 함량이 추출된다. 일 예에서, 골은 미네랄 함량을 제거하기 위하여 산 용액에 침지된다. 미네랄 함량이 제거된 후, 남는 DBM은 가단성이 되어 추가로 가공 및/또는 성형됨으로써, 수용자에의 이식용으로 형상화될 수 있다. 이식 후, DBM은 숙주 세포의 이식 부위로의 세포 동원을 유도하며, 숙주 세포는 결국 골 형성 세포 (예컨대 골모세포)로 분화할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "탈미네랄화된 피질 골" 또는 "DCB"는 DBM의 하위세트로, 무기 재료 (예컨대 칼슘)이 제거된 피질 골을 지칭한다. 따라서, DCB는 골유도 특성을 보유한다 (문헌 [Honsawek et al., 2000] 참조).
본원에서 사용될 때, "골유도성"은 이식 부위로 숙주 세포를 동원하여 새로운 골을 형성하는 이식 재료 또는 화합물의 능력을 지칭한다. 골유도성 점수는 문헌 [Edwards et al., Clin. Ortho. & Rel. Res., (1998) 357:219-228] 또는 다른 동등한 방법에 의해 측정된 바와 같은 0 내지 4 범위의 점수를 지칭한다. 에드워드의 방법에서, "0"의 점수는 새로운 골 성장이 없음을 나타내며, "1"의 점수는 1 % 내지 25 % 사이의 이식물이 새로운 골 성장에 연관되었음을 나타내고, "2"의 점수는 26 % 내지 50 % 사이의 이식물이 새로운 골 성장에 연관되었음을 나타내며, "3"의 점수는 51 % 내지 75 % 사이의 이식물이 새로운 골 성장에 연관되었음을 나타내고, "4"의 점수는 >75 %의 이식물이 새로운 골 성장에 연관되었음을 나타낸다. 통상적으로, 상기 점수는 이식 28일 후에 평가되지만, 더 빠르게 (예컨대 7, 14 또는 21일) 그것이 평가될 수도 있다. 일부 경우에서, 상기 점수는 이식 후 100일만큼 늦게 (예컨대 40 또는 60일) 평가될 수도 있다. 골유도성은 인간에서 평가될 수도 있지만, 일반적으로는 무흉선 래트 (상기함)에서 수행된다.
본원에서 사용될 때, "골전도성"은 새로운 골 성장이 이루어질 수 있는 주형 또는 스캐폴드로 사용되는 이식 재료 (예컨대 골 이식편 재료)의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "골생성"은 새로운 골 조직으로 분화할 수 있는 살아있는 세포를 함유하는 이식 재료를 지칭한다. 골생성 이식물은 골 형성 세포 (예컨대 골모세포)로 분화할 수 있는 MSC와 같은 골연골선조 세포(osteochondroprogenitor cell)를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 골생성 이식 재료는 이식 재료 공여자로부터의 내생인 살아있는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 살아있는 세포는 MSC, 골모세포, 파골세포, 골세포 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용될 때, "골회복 세포"는 새로운 골 조직으로 분화할 수 있는, 골 이식편 재료에 존재하는 생존가능한 살아있는 세포 군집을 지칭한다. 골회복 세포는 MSC, 골모세포, 파골세포, 골세포, 섬유모세포 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 골회복 세포는 골 이식편 재료의 구성요소 (예컨대 해면체 골)에 부착되거나 결합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 골회복 세포는 대상체에서의 이식 전에 (예컨대 골 이식편 재료의 냉동보존 전, 또는 냉동보존된 골 이식편 재료의 해동 후에) 골 이식편 재료에 첨가될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "고유" 또는 "내생 세포"는 분자의 수송, 대사 및 복제와 같은 세포 기능을 수행할 수 있는, 골 이식편 재료 또는 그의 구성요소 (예컨대 해면체 골 또는 피질 골)에 존재하는 살아있는 세포를 지칭한다. 고유 또는 내생 세포는 생존가능한 세포이며, 그에 따라 예를 들면 고유 또는 내생 세포에 의한 화합물의 분비 또는 생성을 측정하는 검정 (예컨대 알칼리 포스파타제 검정)에 의해 검출될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "골 형태형성 단백질" 또는 "BMP"는 골 성장을 자극하고 (즉 골생성성이고) 골모세포를 형성하는 골연골선조 세포로 MSC를 분화시킬 수 있는 (즉 골유도성인) 일군의 성장 인자들을 지칭한다. 이들 단백질은 자연상에서 피질 골에 존재하며, 재조합에 의해 골 이식편 재료에 적용 (예컨대 골 이식편 재료에 첨가)될 수 있다. 특히 중요한 것은 BMP2, BMP3, BMP4, BMP6 및 BMP7이다.
골 형태형성 단백질 2 (BMP2)는 인간에서 BMP2 유전자 (진뱅크(GenBank) 유전자 ID: 650 참조)에 의해 코딩되는 단백질이다. BMP2는 다양한 세포 유형에서 골모세포 분화를 강력하게 유도하며 (문헌 [Marie et al., Histol. Histopathol., 2002, 17(3):877-85]), 새로운 골 성장의 생성을 자극한다 (문헌 [Urist, Science, 1965, 150 (3698): 893-9] 참조). 재조합 형태의 BMP2가 골 성장을 자극하는 것으로 관찰되었다 (문헌 [Geiger et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2003, 55(12):1613-29] 참조). BMP2의 임상 연구는 환자 자신의 골 이식편 재료와 동등하거나 그보다 더 우수하게 성공적으로 척추 유합을 자극하는 것으로 나타났다. BMP2는 척추 케이지의 전방 요추 체간 유합(anterior lumbar interbody fusion)에서의 용도로 FDA 승인을 취득하였다.
골생성 단백질-1 (OP1)로도 알려져 있는 골 형태형성 단백질 7 (BMP7)은 인간에서 BMP7 유전자 (진뱅크 유전자 ID: 655 및 문헌 [Hahn et al., Genomics, (1992), 14(3):759-62] 참조)에 의해 코딩되는 단백질이다. 다른 BMP 계열 단백질의 구성원들과 마찬가지로, BMP7은 중간엽 세포의 골 및 연골로의 전환에서 역할을 한다.
본원에서 사용될 때, "첨가제"는 새로운 골 성장을 촉진하는, 골 이식편 재료에 존재하는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 본원에서 제시된 바와 같이, 대표적인 첨가제에는 BMP (예컨대 BMP2 및 BMP7), 섬유모세포 성장 인자-2 (FGF-2), 인슐린-유사 성장 인자 I 또는 II (IGF-I 또는 IGF-II), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 형질전환 성장 인자-β 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)가 포함된다. 일부 경우에서, 첨가제는 골 이식편 재료 또는 그의 구성요소 (예컨대 해면체 골)에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 골 이식편 재료 (예컨대 BMP-2) 또는 그의 구성요소 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골에 존재함)에 대하여 내생이다. 일부 경우에서는, 2종 (이상)의 첨가제가 골 이식편 재료에 존재하는데, 이 경우 제1 첨가제는 골 이식편 재료에 대하여 내생이며, 제2 첨가제는 골 이식편 재료에 첨가된다 (예컨대 대상체에의 이식 전에 골 이식편 재료와 혼합됨).
본원에서 사용될 때, "방사선비투과" 또는 "방사선비투과 구성요소"는 골과 같은 물질을 통한 방사 에너지의 통과를 차단하는 화합물 또는 재료를 지칭한다. 상기 화합물 또는 재료는 종종 X-선 빔이 물질을 통과할 때 그 중 광자의 에너지 감쇠에 영향을 줌으로써 그것을 흡수하거나 굴절시키는 것에 의해 광자의 강도를 감소시키는 치밀한 금속 분말 (예컨대 텅스텐 또는 바륨)이다. 이들 화합물 및 재료는 연질인 조직 또는 골에 비해 더 높은 감쇠 계수를 나타내기 때문에, 그것이 형광투시경 또는 X-선 필름상에서 더 밝거나 불투명하게 보인다. 이와 같은 가시성은 (예컨대 척추 케이지와 같은 외과용 기구에 성형되거나 삽입되었을 때) 골 이식편 재료를 정밀하게 위치지정하거나, 또는 수용자의 원하는 영역에서의 골 이식편 재료의 위치지정을 확인하기 위한 대조를 제공할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "골막"은 인간 장골의 외부 표면을 덮고 있는 결합 조직 멤브레인을 지칭한다. 일부 경우에서, 본원에서 기술되는 골 이식편 재료는 골막 층을 제거시키지 않은 피질 골의 제분 또는 마쇄에 의해 제조된, 예를 들면 골막 섬유의 형태인 골막을 포함한다. 일부 경우에서, 피질 골 구성요소는 피질 골 및 골막 섬유를 포함하며, 여기서 상기 골막 섬유는 피질 골 구성요소에 대하여 내생이거나 동일 공급원 (예컨대 동일 공여자) 또는 또 다른 공급원 (예컨대 다른 공여자)로부터 보충되어 피질 골에 첨가된 것 중 어느 하나이다.
본원에서 사용될 때, "근막"은 보통 하지에서 발견되는 결합 섬유질 조직을 지칭한다 (예컨대 대퇴 근막). 일부 경우에서, 본원에서 기술되는 골 이식편 재료는 예를 들면 근막 섬유 형태의 근막을 포함한다. 일부 경우에서, 피질 골 구성요소는 피질 골 및 근막 섬유를 포함하며, 여기서 상기 근막 섬유는 피질 골 구성요소에 대하여 내생이거나 (예컨대 동일 공여자의 것) 또 다른 공급원 (예컨대 다른 공여자)로부터 보충되어 피질 골에 첨가된 것 중 어느 하나이다.
본원에서 사용될 때, "비-효소적으로"는 효소적 처리 단계를 포함하지 않는, 골 이식편 재료에서 사용하기 위하여 해면체 골을 처리하는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 해면체 골의 비-효소적 처리는 DMEM 및 FBS와 같은 세포 배양 배지 중에서 일정 시간 기간 (예컨대 30분 또는 1시간) 동안 해면체 골을 인큐베이팅하는 것, 그리고 임의적으로 상기 시간 기간 후에 세포 배양 배지를 경사분리하는 것을 지칭한다 (예컨대 수동적 침지 주기). 일 실시양태에서, 상기 수동적 침지 주기는 비-효소적으로 해면체 골을 처리하기 위하여 1회를 초과하여 (예컨대 1 내지 5회) 반복될 수 있다. 수동적 침지 주기는 임의적으로 온건하게, 그러나 해면체 골 중 내생 세포 구성요소의 완전성을 그것이 붕괴하지는 않는 정도로 해면체 골을 회전시키거나 휘저어 교반하거나 움직이는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 해면체 골은 화학 용액, 예컨대 산 용액을 사용하여 일정 시간 기간 (예컨대 1시간) 동안 골 이식편 재료에서의 용도로 처리되고, 임의적으로 1시간 동안의 인큐베이션 후 산 용액이 경사분리될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "바인더"는 골 이식편 재료 중 바인더의 부재시와 비교하였을 때 골 이식편 재료의 취급, 점착 및 가단 특성을 개선하는, 골 이식편 재료 또는 그의 구성요소에 첨가되는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 일부 경우에서, 바인더는 젤, 검 또는 퍼티-유사 농밀도를 가지는 골 이식편 재료를 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 바인더는 골 이식편 재료가 추가적인 처리 없이 용이하게 조작되고 일단 원하는 입체형태로 성형되고 나면 그의 형상 및 크기를 유지하도록 하는 것에 의해, 골 이식편 재료의 취급을 개선한다. 일부 경우에서, 본원에서 기술된 바와 같은 골 이식편 재료는 이식 후 수술 부위의 세척 동안 (예컨대 척추 케이지에서) 이식 후의 그의 크기 및 형상을 유지한다. 본원에서 제시된 바와 같이, 대표적인 바인더에는 알긴산, 카르복시메틸 셀룰로스, 히아루론산, 젤라틴, 폴락사머, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜리드 (PG), 키토산, 키틴 및 이들 중 어느 것의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염이 포함된다. 적합한 알칼리 금속 염에는 소듐 및 칼륨이 포함된다. 적합한 알칼리 토금속 염에는 칼슘이 포함된다. 일부 경우에서, 바인더는 골 이식편 재료에 첨가된다. 일부 경우에서는, 2종 (이상)의 바인더가 골 이식편 재료에 존재하며, 여기서 제1 바인더는 제1 기능 (예컨대 젤을 생성시킴)을 수행하고, 제2 바인더는 제2 기능 (예컨대 공유 또는 수소 결합을 생성시킴)을 수행한다.
본원에서 사용될 때, "냉동보존"은 골 이식편 재료, 해면체 골, 피질 골 또는 다른 생물학적 구성요소 (예컨대 정액)가 통상적으로 액체 질소, 드라이 아이스 (고체 이산화 탄소) 또는 냉동을 사용하여 (예컨대 -80 ℃에서) 장-기 저장에 적합한 조절되는 방식으로 냉각 및 냉동되는 과정을 지칭한다. 일반적으로, 냉동보존될 재료는 "냉동보호제"를 사용하여 인큐베이팅, 침지 또는 코팅된다. 그러나, 일부 통상적인 냉동보호제는 높은 농도에서는 세포에 독성이다 (예컨대 DMSO). 예를 들면 서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)의 "미스터 프로스티(Mr. Frosty)"를 포함한 시중의 냉동보존용 장치 또는 키트들이 가용하다. 일반적으로, 냉동보존될 생물학적 재료가 들어있는 튜브, 바이알 또는 자는 정해진 시간 기간 동안 냉동보호제를 사용하여 인큐베이팅, 침지 또는 배싱되면서, 생물학적 재료가 냉동될 때까지 분 당 대략 -1 ℃의 속도로 냉각되도록 하는 적합한 냉각 조건 (예컨대 액체 질소)하에 위치된다 (예컨대 속도 조절 냉동). 생물학적 재료는 생물학적 재료를 가시적으로 냉동시키는 데에 걸리는 시간보다 더 오래 유지될 수 있으며 (예컨대 2 내지 4시간), 이후 원할 때까지 장-기 저장 (예컨대 -80 ℃ 또는 -196 ℃)으로 이전될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "냉동보호제"는 얼음 형성으로 인한 냉동 손상으로부터 생물학적 구성요소 (예컨대 골 이식편 재료 또는 골 이식편 구성요소, 예컨대 피질 골 또는 해면체 골)를 보호하기 위하여 사용되는 종류의 분자를 지칭한다. 일반적으로, 냉동보호제는 생물학적 구성요소가 냉동되기 전에 생물학적 구성요소에 침투한다. 또한, 냉동보호제는 냉동보존 과정을 수행하는 데에 사용되는 농도에서 독성이 아닌 것이 바람직하다. 냉동보호제들의 혼합물이 단일-작용제인 냉동보호제에 비해 덜 독성인 것으로 밝혀져 있다 (문헌 [Best et al., (2015) Rejuvenation Res., 18(5):422-436]). 통상적인 냉동보호제에는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤, 트레할로스, 수크로스, 2-메틸-2,4-펜탄디올 (MPD) 및 디메틸 술폭시드 (DMSO)가 포함된다.
본원에서 사용될 때, 질환 또는 이상과 연계되어 사용될 때의 "치료하는 것" 및 "치료"는 골 복구 또는 대체 시술을 포함할 수 있는 프로토콜을 실행하는 것을 지칭하며, 여기서 골 이식물은 질환 또는 이상의 징후 또는 증상을 경감하기 위하여 대상체 (예컨대 환자)에게 투여된다. 경감은 질환 또는 이상의 징후 또는 증상이 출현하기 전은 물론, 그의 출현 후에도 이루어질 수 있다. 이에 따라, 치료하는 것 또는 치료에는 질환 또는 바람직하지 않은 상태를 예방하는 것 또는 그의 방지가 포함된다. 더하여, 치료하는 것, 치료, 예방하는 것 또는 예방이 징후 또는 증상의 완전한 경감을 필요로 하는 것은 아니며, 치유를 필요로 하는 것이 아니며, 구체적으로 대상체에 대하여 약간의 효과만을 가지는 프로토콜이 포함된다. 일부 경우에서, 치료하는 것은 골절을 치료하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료하는 것은 골 결함의 복구를 포함한다.
III. 조성물
일 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 본원에서 골 이식편 재료로 지칭되는 골 이식편 조성물에 관한 것이다. 상기 골 이식편 재료는 예를 들면 정형외과 및 신경외과 시술에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 골 그래프 재료는 외과적 시술에 적합한데, 그것이 영상화 (예컨대 X-선 영상화)시 대상체에서의 골 이식편 재료의 검출을 가능케 하는 방사선비투과 구성요소를 함유하기 때문이다. 일부 경우에서, 상기 골 이식편 재료는 바인더가 결핍되어 있는 골 이식편 조성물과는 대조적으로 탁월한 취급 및 점착 특성을 제공하는 바인더를 포함한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 해면체 골 구성요소 및 방사선비투과 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 상기 해면체 골 구성요소는 공여자-유래 척추체, 회장 또는 장골로부터 수득되는 해면체 골을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 해면체 골 구성요소는 공여자-유래인 경골의 근위 골간단상 게르디 결절(Gerdy's tubercle)로부터 수득되는 해면체 골을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 정육면체, 구체, 불규칙하게 형상화된 과립, 또는 기타 입자 또는 입자 형상은 물론, 탈미네랄화된 골로 구성되는 고체 구성체의 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 해면체 골은 100 ㎛ 내지 10 mm 사이의 입자 크기 범위를 가지는 마쇄된 칩(chip)의 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 해면체 골은 200 ㎛ 내지 7 mm, 500 ㎛ 내지 5 mm, 1 mm 내지 4 mm, 및 300 ㎛ 내지 2 mm 사이의 입자 크기 범위를 가지는 마쇄된 칩의 형태로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 해면체 골은 사망한 공여자로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 회수된 후, 처리된 해면체 골을 수득하기 위하여 탈미네랄화 프로토콜, 탈세포화 프로토콜, 또는 탈미네랄화 프로토콜 및 탈세포화 프로토콜 양자를 사용하여 변형될 수 있다. 대표적인 탈미네랄화 프로토콜은 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2014/0255489호; 2017/0035937호 및 U.S. 특허 제9,907,882호에 개시되어 있다. 대표적인 탈세포화 프로토콜은 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2014/0255489호에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 탈미네랄화는 산 용액 (예컨대 염산)의 사용을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 산 용액의 농도는 0.05 N 내지 5 N 사이이다. 예를 들면, 산 용액 농도는 0.05 N 내지 5 N 사이, 2.5 N 내지 3 N 사이, 0.05 N 내지 0.1 N 사이, 0.05 N 내지 0.5 N 사이, 또는 0.1 N 내지 0.5 N 사이일 수 있다. 처리되는 골의 특성 또는 원하는 최종 생성물에 따라, 상이한 산 용액 농도가 선택될 수 있다. 일 예에서는, 2.5 N 내지 3.5 N의 산 용액이 골, 특히 피질 골의 대형 단편을 탈미네랄화하는 데에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서는, 0.1 N 내지 2 N의 산 용액이 해면체 골을 탈미네랄화하는 데에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서는, 0.5 N 내지 1 N의 산 용액이 해면체 골을 탈미네랄화하는 데에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 산 용액에 대한 골 조직의 비는 산 용액 100 mL에 대하여 골 조직 적어도 14 g이다. 일부 경우에서, 산 용액 부피에 대한 골 조직 중량의 비는 1:5 미만일 수 있다. 일부 경우에서, 산 용액 부피에 대한 골 조직 중량의 비는 1:10 이상일 수 있다. 일 예에서, 산 용액 (부피) 대 골 조직 (g) 비는 50 mL:1 g 내지 5 mL:1 g 사이일 수 있다. 일반적으로, 골의 양에 비례하여 산 용액의 부피를 증가시키는 것이 탈미네랄화 과정에 부정적인 영향을 주지는 않는다.
일부 실시양태에서, 해면체 골은 공여자로부터 회수된 후, 적혈구 (적색 혈구), 백혈구 및 기타 면역원성이거나 바람직하지 않은 구성요소는 해면체 골로부터 제거하면서 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 무손상으로 남아 해면체 골에 부착되거나 결합되는 비-효소적 처리 (예컨대 수동적 침지)를 사용하여 변형될 수 있다. MSC는 골회복 세포의 종으로, 골 및 다른 중간엽 조직으로 분화하는 능력을 가지고 있다. MSC는 또한 골 및 다른 중간엽 조직의 재생에 기여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골의 비-효소적 처리는 MSC, 또는 임의적으로는 해면체 골에 결합되어 있는 다른 골회복 세포에 영향을 주지 않으며, 그에 따라 해당 세포들이 골 손상을 복구하기 위한 그의 자연상의 특징들을 유지한다. 일부 실시양태에서, 해면체 골의 비-효소적 처리는 해면체 골로부터의 분리에 의해 MSC를 변경하지 않는다. 일부 실시양태에서, 해면체 골 중 고유 MSC는 골 이식편 재료 형성 전의 시험관내 증식 과정에서 성장 인자에 노출되지 않는다.
일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 해면체 골을 일정 시간 기간 동안 MEM 및 FBS와 같은 세포 배양 배지의 용기에 위치시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 수동적 침지는 2-60분의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지는 5분 또는 10분의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지는 20 또는 30분의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 배지는 최소 필수 배지 이글이지만, 다른 적합한 배지들이 관련 기술분야에 알려져 있다. 일부 경우에서, 배지는 보충제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 보충제는 FBS와 같은 혈청일 수 있다. 보충제는 5 % 내지 10 %의 농도로 배지에 첨가될 수 있다. 일부 경우에서, 보충제는 인간 혈소판 용해물 (hPL)이다. 일부 경우에서, 배지는 ACD-A 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액, 헤파린, 용액 A (시트라 랩스(Citra Labs), 매사추세츠 브레인트리)와 같은 항응고제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 배지는 데옥시리보뉴클레아제 또는 DNase와 같이 DNA를 분해하는 물질을 포함할 수 있다. 해면체 골을 침지하는 데에 사용되는 배지의 부피는 처리되는 해면체 골의 양에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 100 그램의 마쇄된 해면체는 200-300 ml의 배지에 침지될 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 실온 (예컨대 25 ℃)에서 수행된다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 4 ℃ 내지 37 ℃ 사이의 온도에서 수행된다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 37 ℃에서 수행된다. 수동적 침지 프로토콜은 해면체 골이 배지 중에 위치된 다음 배지를 붓는 "정치식(standing still)" 침지 또는 세정으로 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 임의 수의 원하는 침지 주기 (예컨대 1-5회 또는 그 이상의 침지 주기)를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 해면체 골은 능동적인 세정 또는 진탕으로 처리되지 않는데, 이러한 단계들이 해면체 골에 부착 또는 결합되어 있는 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 제거하거나 훼손할 수 있기 때문이다. 일부 경우에서, 해면체 골은 초음파처리에 의해 처리되지 않는데, 초음파처리가 해면체 골에 부착 또는 결합되어 있는 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 제거하거나 훼손할 수 있기 때문이다.
일부 실시양태에서, 해면체 골은 어떠한 성장 프로토콜, 배양 프로토콜, 증식 프로토콜, 계승 프로토콜 등에도 적용되거나 그에 의해 처리되지 않는다. 따라서, 해면체 골은 예를 들면 제분 및/또는 마쇄에 의해 바로 공여자 유래 골로부터 제조될 수 있다. 어떠한 적합한 해면체 골 제분 또는 마쇄 방법도 해면체 골 구성요소를 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 대표적인 마쇄 또는 제분 프로토콜은 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2012/0258178호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 해면체 골은 골 이식편 재료 중 20 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 골 이식편 재료 중 30 % 내지 80 % (w/w), 40 % 내지 60 % (w/w), 20 % 내지 40 % (w/w), 20 % 내지 50 % (w/w), 및 40 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방사선비투과 구성요소는 비-탈미네랄화된 피질 골이다. 일부 실시양태에서, 방사선비투과 구성요소는 비-탈미네랄화된 피질 골, 바륨 술페이트, 비스무트 트리옥시드, 비스무트 서브카르보네이트, 텅스텐, 티타늄, 산화 지르코늄, 아이오딘화된 폴리에스테르 또는 아이오딘화된 지방족 단량체를 포함한다. 일 실시양태에서, 방사선비투과 구성요소는 바륨 술페이트이다.
일부 실시양태에 있어서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 분말 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 세포성 골 이식편 재료 중 10 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 예를 들면 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % 또는 30 % (w/w)와 같이, 세포성 골 이식편 재료 중 5 % 내지 30 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 미립자 형태로 존재할 수 있으며, 입자가 100 마이크로미터 내지 4 mm 범위 내의 평균 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 특히 골 이식편 재료에 일정량의 방사선비투과성을 제공하는 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 또 다른 방사선비투과 구성요소로 대체되거나 보충될 수 있다. 대표적인 방사선비투과 구성요소에는 예를 들면 비-탈미네랄화된 피질 골, 바륨 술페이트, 비스무트 트리옥시드, 비스무트 서브카르보네이트, 티타늄, 산화 지르코늄, 아이오딘화된 폴리에스테르 및 아이오딘화된 지방족 단량체가 포함된다. 어떠한 적합한 피질 골 제분 또는 마쇄 방법도 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소를 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 대표적인 마쇄 또는 제분 프로토콜은 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2012/0258178호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 또한 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 출원 제15/431,309호, U.S. 특허 공개 제2017/0035937호 및 U.S. 특허 제9,486,556호에 기술되어 있는 것들과 같은 리본 또는 다른 입자들을 포함할 수 있는 탈미네랄화된 피질 골 구성요소를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2014/0255489호 및 2017/0035937호에 기술되어 있는 것들과 같은 입자들을 포함할 수 있다. 어떠한 적합한 탈미네랄화 방법도 탈미네랄화된 피질 골을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 골 이식편 재료 중 50 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 골 이식편 재료 중 50 % (w/w) 이하로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 예를 들면 골 이식편 재료 중 1 % 내지 40 % (w/w), 10-50 % (w/w), 1-15 % (w/w), 5-20 % (w/w), 15-30 % (w/w), 10-50 % (w/w) 또는 30-50 % (w/w)로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 또한 골막 및/또는 근막을 포함할 수 있다. 근막은 섬유모세포에 의해 형성된 콜라겐 섬유를 함유하는 유연성 섬유질 조직이다. 본 개시내용은 근막 섬유를 수득하고, 골 이식편 재료에서 사용하기 위하여 근막 섬유를 처리하며, 해당 조성물을 대상체에게 투여하는 기술들을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 근막은 US 특허 공개 제2014/027179호에 기술되어 있는 방법에 따라 골 이식편 재료에의 포함용으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에 존재하는 근막의 양은 골 이식편 재료의 총 중량을 기준으로 0.5 중량% 내지 10 중량%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에 존재하는 근막의 양은 골 이식편 재료의 총 중량을 기준으로 1 중량% 내지 5 중량%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골막을 포함할 수 있다. 골막은 정상적인 골절 복구 과정 동안 초기에 연관되며 다양한 세포 유형들 (예컨대 MSC) 및 골 성장 인자들 (예컨대 BMP)을 동원하여 골절 복구를 촉진할 수 있는 유형의 조직이다. 현재, 골막은 동종이식편 재료의 제조시 폐기되고 있다. 본 개시내용은 골막을 수득하고, 골 이식편 재료에서 사용하기 위하여 골막을 처리하며, 해당 조성물을 대상체에게 투여하는 기술들을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 골막은 US 특허 제9,907,882호에 기술되어 있는 방법에 따라 골 이식편 재료에의 포함용으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에 존재하는 골막의 양은 골 이식편 재료의 총 중량을 기준으로 0.5 중량% 내지 10 중량%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에 존재하는 골막의 양은 골 이식편 재료의 총 중량을 기준으로 1 중량% 내지 5 중량%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골막 섬유, 근막 섬유 또는 이들의 조합은 방사선비투과 구성요소를 해면체 골 구성요소와 조합하여 골 이식편 재료를 형성하기 전에 방사선비투과 구성요소와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 고유하거나 내생인 세포의 1종 이상 세포 군집을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 고유 또는 내생 세포는 골회복 세포이다. 일부 실시양태에서, 골회복 세포는 골모세포, 파골세포, 골세포, 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골회복 세포는 골 이식편 재료의 구성요소 (예컨대 해면체 골) 또는 골 이식편 재료에 부착되거나 결합된다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 대상체에의 이식 전에 골회복 세포가 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 골회복 세포, 예컨대 MSC)의 세포 군집은 수용자에의 이식 전에 보강되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 MSC)의 세포 군집은 수용자에의 이식 전에 정제되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 MSC)의 세포 군집은 수용자에의 이식 전에 배양되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 MSC)의 세포 군집은 수용자에의 이식 전에 시험관 내에서 증식되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 MSC)의 세포 군집은 수용자에의 이식 전에 단리되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 MSC)의 세포 군집은 고유 또는 내생 세포를 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)로부터 해리하거나 분리할 수 있는 임의의 화학적 및/또는 효소적 (예컨대 1종 이상의 단백질 분해 효소 사용) 처리 (예컨대 콜라게나제 처리)에 의해 처리되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 MSC)의 세포 군집은 수용자에의 이식 전에 콜라게나제로 처리되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료와 결합되어 있는 고유 또는 내생 세포 (예컨대 MSC)의 세포 군집은 해면체 골과 결합되어 있는 고유 MSC 군집에 해당한다. 일부 실시양태에서, MSC는 성인 MSC이다. 일부 경우에서, MSC는 공여자의 골수로부터 기원한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골회복 세포가 보충될 수 있다. 예컨대, 최종 생성물 (예컨대 포장된 이식 골 이식편 재료)은 부유성 (또는 비-부착) 골회복 세포 (예컨대 MSC)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 추가로 첨가제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 첨가제는 골 형태형성 단백질 (BMP), 섬유모세포 성장 인자-2 (FGF-2), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF-II), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 형질전환 성장 인자 베타 I (TGFβ-I), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 실시양태에서, 첨가제는 재조합 첨가제 (예컨대 인간 재조합 BMP-2 (hrBMP-2))이다. 일부 경우에서, 첨가제는 골 이식편 재료 또는 그의 구성요소 (예컨대 해면체 골)에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 골 이식편 재료 (예컨대 BMP-2) 또는 그의 구성요소 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골)에 대하여 내생이다. 일부 경우에서는, 2종 (이상)의 첨가제가 골 이식편 재료에 존재하는데, 이 경우 제1 첨가제는 골 이식편 재료에 대하여 내생이며, 제2 첨가제는 골 이식편 재료에 보충된다 (예컨대 대상체에의 이식 전에 골 이식편 재료와 혼합됨). 사용되는 첨가제의 양이 첨가제의 유형, 사용되는 첨가제의 구체적인 활성 및 조성물의 예정 용도에 따라 달라지게 된다는 것은 알고 있을 것이다. 원하는 양은 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 또한 바인더를 포함한다. 일부 경우에서, 바인더는 바인더가 결핍되어 있는 골 이식편 조성물과는 대조적으로 탁월한 취급 및 점착 특성을 제공한다. 일부 실시양태에서, 바인더는 알긴산, 메틸 셀룰로스 (예컨대 카르복시 또는 히드록시프로필 메틸 셀룰로스), 히아루론산, 젤라틴, 폴락사머, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜리드 (PG), 키토산, 키틴 또는 이들 중 어느 것의 금속 염 중 1종 이상을 포함한다. 상기 금속 염은 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 또는 그의 구성요소는 바인더와 함께 인큐베이팅됨으로써, 검, 젤 또는 퍼티-유사 농밀도를 형성한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 바인더와 조합되어, 유동성의 주사기가용성인 퍼티-유사 재료를 형성한다. 예를 들어, 퍼티-유사 재료는 캐뉼러 또는 다른 주사기 부속을 통하여 결함 부위로 전달될 수 있다 (예를 들면 그의 전체 내용이 모든 목적에 있어서 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 출원 제13/712,295호 참조). 퍼티-유사 골 이식편 재료는 분말 또는 액체 형태의 골 이식편 재료와는 대조적으로 개선된 취급 및 점착 특성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 퍼티-유사 골 이식편 조성물은 이식시 제자리에서 유지되고, 적용 부위 (예컨대 골 결함 영역)에서 지속되며, 혈액에 의한 세척 및/또는 접촉에 의한 제거를 견딜 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 백색 혈구 (백혈구) 또는 적색 혈구 (적혈구)가 없거나 실질적으로 (즉 >90 %) 없다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 적혈구 중 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %가 없다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 백혈구 중 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %가 없다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 B 세포 또는 T 세포가 없거나 실질적으로 (즉 >90 %) 없다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 B 세포 중 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %가 없다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 T 세포 중 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %가 없다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 총 세포 조성물을 기준으로 5 % 미만의 CD4+ 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 총 세포 조성물을 기준으로 5 % 미만의 CD3+ 세포를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 총 세포 조성물을 기준으로 5 % 미만의 CD45+ 세포를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 총 세포 조성물을 기준으로 50 % 초과의 CD44+ 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 총 세포 조성물을 기준으로 50 % 초과의 CD90+ 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 총 세포 조성물을 기준으로 60 % 초과의 CD44+ 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 CD44+ 세포는 골 이식편 재료의 적어도 1종의 구성요소 (예컨대 해면체 골)에 부착된다.
일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 5 % 미만이 적혈구이다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 1 % 미만이 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 적혈구가 없다 (즉 시험 조건하에서 적혈구가 검출되지 않음). 적혈구는 비제한적으로 현미경법, 혈구계, 또는 골 이식편 재료 중 적색 혈구를 검출하는 항체의 사용을 포함하여, 관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 방법에 의해서도 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 5 % 미만이 백혈구이다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 1 % 미만이 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료에는 백혈구가 없다 (즉 시험 조건하에서 백혈구가 검출되지 않음). 백혈구는 비제한적으로 현미경법, 혈구계, 또는 백색 혈구와 연관되어 있는 특정 세포 표면 마커 (예컨대 CD45+)의 발현을 검출하는 항체의 사용을 포함하여, 관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 방법에 의해서도 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 10 % 미만이 세포 표면 마커 CD45+를 발현한다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 8 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % 또는 1 % 미만이 세포 표면 마커 CD45+를 발현한다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 1 % 미만이 세포 표면 마커 CD45+를 발현한다.
일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 10 % 미만이 세포 표면 마커 CD4+를 발현한다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 5 %, 4 %, 3 % 또는 2 % 미만이 세포 표면 마커 CD4+를 발현한다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 1 % 미만의 세포 표면 마커 CD4+를 발현하는 총 세포 조성물을 함유한다.
일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 총 세포 조성물 중 5 %, 4 %, 3 % 또는 2 % 미만이 세포 표면 마커 CD3+를 발현한다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 1 % 미만의 세포 표면 마커 CD3+를 발현하는 총 세포 조성물을 함유한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 50 %를 초과하는 세포 표면 마커 CD44+를 발현하는 총 세포 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 %를 초과하는 세포 표면 마커 CD44+를 발현하는 총 세포 조성물을 함유한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 50 %를 초과하는 세포 표면 마커 CD90+를 발현하는 총 세포 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 %를 초과하는 세포 표면 마커 CD90+를 발현하는 총 세포 조성물을 함유한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 1,000 내지 1억개 사이의 고유 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 100억 내지 6천만개 사이의 고유 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 100,000 내지 2천만개 사이의 고유 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 MSC 1,000 내지 5천만개의 평균 세포 계수를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 평균 10,000 내지 3천만개의 MSC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 평균 100,000 내지 2천만개의 MSC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 평균 250,000 내지 1천만개의 MSC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 평균 500,000 내지 5백만개의 MSC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 중 총 세포 조성물을 기준으로 1 % 내지 80 % 사이의 MSC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 중 총 세포 조성물을 기준으로 5 % 내지 30 %의 MSC를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편은 골 이식편 재료 중 총 세포 조성물을 기준으로 10 % 내지 50 %의 MSC를 포함한다.
일 실시양태에서, 골 이식편 재료는 약 1 % 내지 약 20 % (w/w) 양의 방사선비투과 구성요소, 약 1 % 내지 약 10 % (w/w) 양의 바인더, 약 1 % 내지 약 20 % (w/w) 양의 세포 배양 배지, 및 약 50 % 내지 약 97 % (w/w) 양의 해면체 골 구성요소를 포함하며, 여기서 상기 해면체 골 구성요소는 5 % 미만의 적혈구 또는 백혈구를 포함하고, 골 이식편 재료 그램 당 골회복 세포 1,000 내지 5천만개 사이의 평균 세포 계수를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 골회복 세포는 MSC이다. 일부 경우에서, 해면체 골 구성요소는 마쇄된 해면체 골 (해면체 골 분말)을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 방사선비투과 구성요소는 피질 골이다. 일부 경우에서, 상기 피질 골은 마쇄된 피질 골 (피질 골 분말)이다. 일부 경우에서, 상기 바인더는 수화된 바인더이다. 일부 경우에서, 바인더는 알긴산 (알기네이트로도 지칭됨)이다. 일부 경우에서, 상기 알긴산은 고분자량 알긴산이다. 일부 경우에서, 상기 세포 배양 배지는 무혈청이다.
일 실시양태에서, 골 이식편 재료는 10 %의 비-미네랄화 피질 분말 (w/w), 4 %의 알긴산 (w/w), 16 %의 DMEM 세포 배양 배지 (w/w), 및 70 %의 해면체 골 (w/w)을 포함하며, 여기서 상기 해면체 골은 골 이식편 재료 그램 당 골회복 세포 1,000 내지 5천만개 사이의 평균 세포 계수를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 골회복 세포는 MSC이다. 일부 경우에서, 상기 알긴산은 고분자량 알긴산이다. 일부 경우에서, 상기 DMEM은 무혈청이다.
일 실시양태에서, 골 이식편 재료는 10 %의 비-미네랄화 피질 분말 (w/w), 4 %의 알긴산 (w/w), 16 %의 DMEM 세포 배양 배지 (w/w), 및 70 %의 해면체 골 (w/w)을 포함하며, 여기서 상기 해면체 골은 골 이식편 재료 그램 당 MSC 1 % 내지 80 % 사이의 총 세포 조성을 가진다. 일부 경우에서, 상기 알긴산은 고분자량 알긴산이다. 일부 경우에서, 상기 DMEM은 무혈청이다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 각 구성요소는 단일 공여자로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골 및 피질 골은 동일한 공여자로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 공여자는 사망한 인간 공여자 (예컨대 시신)이다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 상이한 공여자로부터 수득될 수 있다.
종종 세포성 골 이식편 재료를 제조하는 데에 사용하기 위하여 사망한 공여자로부터 피질 또는 해면체 골과 같은 조직이 회수되는 경우, 상기 조직은 심장무수축 36시간 이내에 회수되거나, 또는 허혈 시간이 36시간 미만이었다. 다른 말로 하면, 공여자는 36시간 이내에 사망한 공여자였다.
A. 공여자
골 이식편 재료는 1명 이상의 공여자로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 단일 공여자로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 공여자와 동일한 개체이다 (자가). 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 공여자와 상이한 개체이다 (동종이형). 공여자는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 비-인간 동물에는 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 양 등이 포함된다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 살아있는 인간 공여자로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 사망한 인간 공여자 (예컨대 시신)으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 인간 대상체에의 이식에 적합하다 (예컨대 이식 부위에서 골생성을 촉진하기에 충분한 양의 고유 세포를 보유함).
B. 대상체
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 골 결함 또는 골절이 있는 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 척추 변형 또는 척추 손상이 있는 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 치아 변형 또는 결함이 있는 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 공여자와 동일하다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 수용자는 골 이식편 재료 공여자와 상이하다. 이식물로서 골 이식편 재료를 제공받는 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 비-인간 동물에는 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 양 등이 포함된다.
IV. 제조 방법 및 시스템
일 측면에서, 본 개시내용은 골 이식편 재료의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 방사선비투과 구성요소를 해면체 골 구성요소와 조합하여 골 이식편 재료를 생성시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 골 이식편 재료는 임의적으로 바인더, 첨가제, 탈미네랄화된 피질 골 또는 이들의 조합을 포함한다.
이제 도면을 보면, 도 1은 본 개시내용의 실시양태에 따른 골 이식편 재료를 제조하기 위한 대표적인 기술의 측면들을 도시하고 있다. 여기에 나타낸 바와 같이, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)는 조합된 피질 골 구성요소 (130)를 생성시키기 위하여 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)와 조합될 수 있다. 조합된 피질 골 구성요소 (130)는 세포성 골 이식편 재료 (150)를 생성시키기 위하여 처리된 해면체 골 구성요소 (140)와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 세포성 골 이식편 재료 (150)를 형성시키기 전에, 바인더 (190)가 탈미네랄화된 피질 골 (110), 비-탈미네랄화된 피질 골 (120), 조합된 피질 골 (130) 또는 처리된 해면체 골 (140)과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110), 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120) 및 처리된 해면체 골 구성요소 (140)는 동일한 사망 공여자로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 출원 제15/431,309호, U.S. 특허 공개 제2017/0035937호 및 U.S. 특허 제9,486,556호에 기술되어 있는 것들과 같은 리본 또는 입자들을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2014/0255489호 및 2017/0035937호에 기술되어 있는 것들과 같은 입자들을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)는 세포성 골 이식편 재료 (150)의 매트릭스로 지칭될 수 있다. 일부 경우에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)는 세포성 골 이식편 재료 (150) 중 50 % (w/w)로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 분말 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 세포성 골 이식편 재료 (150) 중 10 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 미립자 형태로 존재할 수 있으며, 입자가 100 마이크로미터 내지 4 mm 범위 내의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 특히 세포성 골 이식편 재료 (150)에 일정량의 방사선비투과성을 제공하는 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 또 다른 방사선비투과 구성요소로 대체되거나 보충될 수 있다. 대표적인 방사선비투과 구성요소에는 예를 들면 비-탈미네랄화된 피질 골, 바륨 술페이트, 비스무트 트리옥시드, 비스무트 서브카르보네이트, 텅스텐, 티타늄, 산화 지르코늄, 아이오딘화된 폴리에스테르 또는 아이오딘화된 지방족 단량체가 포함된다.
도 1에 도시되어 있는 바와 같이, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110) 및 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 함께 첨가되어 조합된 피질 골 구성요소 (130)를 생성시킬 수 있다. 일부 경우에서, 조합된 피질 골 구성요소 (130)는 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)와 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)를 함께 혼합하는 것에 의해 생성될 수 있다. 다양한 혼합, 교반 또는 전도 기술들 중 어느 것이 이와 같은 결과를 달성하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110) 및 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 궤도 진탕기(orbital shaker) 내에 위치된 후, 거기에서 혼합될 수 있다. 일부 경우에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110) 및 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120)는 용기 또는 컨테이너에 배치된 후, 레소딘 랩램 레조넌트아쿠스틱(Resodyn LabRAM ResonantAcoustic)® 믹서 (레소딘 아쿠스틱 믹서스(Resodyn Acoustic Mixers), Inc., 몬태나 부테) 또는 유사한 공명 음향 진동 장치 또는 고강도 혼합 장치를 사용하여 혼합될 수 있다. 대표적인 관련 혼합 기술에 대해서는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2017/0035937호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에 있어서, 처리된 해면체 골 구성요소 (140)는 공여자-유래 척추체, 회장 또는 장골로부터 수득되는 해면체 골을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 처리된 해면체 골 구성요소 (140)는 공여자-유래인 경골의 근위 골간단상 게르디 결절로부터 수득되는 해면체 골을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 정육면체, 구체, 불규칙하게 형상화된 과립, 또는 기타 입자 또는 입자 형상은 물론, 탈미네랄화된 골로 구성되는 고체 구성체의 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 처리된 해면체 골은 10 ㎛ 내지 10 mm 사이의 입자 크기 범위를 가지는 마쇄된 칩의 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 해면체 골은 200 ㎛ 내지 7 mm, 500 ㎛ 내지 5 mm, 1 mm 내지 4 mm, 및 300 ㎛ 내지 2 mm 사이의 입자 크기 범위를 가지는 마쇄된 칩의 형태로 존재할 수 있다.
사망한 공여자 골 조직 유래의 해면체 골은 회수된 후, 처리된 해면체 골 구성요소 (140)를 수득하기 위하여 탈미네랄화 프로토콜, 탈세포화 프로토콜, 또는 탈미네랄화 프로토콜 및 탈세포화 프로토콜 양자를 사용하여 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사망한 공여자 골 조직 유래의 해면체 골은 회수된 후, 적혈구 (적색 혈구) 및 기타 면역원성이거나 원치않는 요소는 해면체 골로부터 제거하면서 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 무손상으로 남아 해면체 골에 부착되는 비-효소적 처리 (예컨대 수동적 침지 또는 용리)를 사용하여 변형될 수 있다.
일부 경우에서, 처리된 해면체 골 구성요소 (140)는 골 이식편 재료 (150) 중 20 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 골 이식편 재료 중 30 % 내지 80 % (w/w), 40 % 내지 60 % (w/w), 20 % 내지 40 % (w/w), 20 % 내지 50 % (w/w), 및 40 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다.
일부 경우에서, 골 이식편 재료 (150)는 예를 들면 최종 조성물 중 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % 또는 80 % (w/w)와 같이 최종 조성물 중 20-80 % (w/w)로 피질 리본을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료 (150)는 예를 들면 최종 조성물 중 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % (w/w)와 같이 최종 조성물 중 10-70 % (w/w)로 처리된 해면체를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료 (150)는 예를 들면 최종 조성물 중 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % 또는 20 % (w/w)와 같이 최종 조성물 중 1-20 % (w/w)로 비-탈미네랄화된 피질 골 분말을 포함할 수 있다. 예를 들어, 골 이식편 재료 (150)는 최종 조성물 중 50 % (w/w)의 피질 리본, 최종 조성물 중 40 % (w/w)의 처리된 해면체, 최종 조성물 중 10 % (w/w)의 비-탈미네랄화된 피질 골 분말 또는 이들 중 어느 것의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110), 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120) 또는 다른 방사선비투과 재료, 및 처리된 해면체 골 구성요소 (140)는 직접적으로 조합될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서는, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)와 처리된 해면체 골 구성요소 (140)가 먼저 함께 조합될 수 있으며, 이후 그 조합이 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120) 또는 다른 방사선비투과 재료와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서는, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (120) 또는 다른 방사선비투과 재료와 처리된 해면체 골 (140)이 먼저 함께 조합될 수 있으며, 이후 그 조합이 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (110)와 조합될 수 있다.
일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 해면체 골을 일정 시간 기간 동안 최소 필수 배지 (MEM)와 같은 세포 배양 배지의 용기 내에 위치시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 수동적 침지는 2-60분의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지는 5분 또는 10분의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지는 20분 또는 30분의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 배지는 최소 필수 배지 이글이지만, 다른 적합한 배지들이 관련 기술분야에 알려져 있다. 일부 경우에서는, 예를 들면 5-10 %의 소 태아 혈청 (FBS)과 같은 혈청이 배지에 보충된다. 일부 경우에서, 배지에는 인간 혈소판 용해물 (hPL)이 보충된다. 일부 경우에서, 배지는 ACD-A 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액, 헤파린, 용액 A (시트라 랩스, 매사추세츠 브레인트리)와 같은 항응고제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 배지는 데옥시리보뉴클레아제 또는 DNase와 같이 DNA를 분해하는 물질을 포함할 수 있다. 해면체 골을 침지하는 데에 사용되는 배지의 부피는 처리되는 해면체 골의 양에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 100 그램의 마쇄된 해면체는 200-300 ml의 배지에 침지될 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 실온 (예컨대 대략 25 ℃)에서 수행된다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 4 ℃ 내지 37 ℃ 사이의 온도에서 수행된다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 37 ℃에서 수행된다. 수동적 침지 프로토콜은 해면체 골이 배지 중에 위치된 다음 배지를 붓는 "정치식" 침지 또는 세정으로 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 수동적 침지 프로토콜은 임의 수의 원하는 침지 주기 (예컨대 1-5회 또는 그 이상의 침지 주기)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 1 % 내지 20 % 사이의 세포 배양 배지를 포함한다. 일 실시양태에서, 골 이식편 재료는 5 % 내지 20 % 사이의 세포 배양 배지를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 골 이식편 재료는 10 % 내지 16 % 사이의 세포 배양 배지를 포함한다.
일부 경우에서, 해면체 골은 능동적인 세정 또는 진탕으로 처리되지 않는데, 이러한 단계들이 해면체 골에 부착 또는 결합되어 있는 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 제거하거나 훼손할 수 있기 때문이다. 일부 경우에서, 해면체 골은 초음파처리에 의해 처리되지 않는데, 초음파처리가 해면체 골에 부착 또는 결합되어 있는 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 제거하거나 훼손할 수 있기 때문이다.
일부 실시양태에서, 해면체 골은 어떠한 성장 프로토콜, 배양 프로토콜, 증식 프로토콜, 계승 프로토콜 등에도 적용되거나 그에 의해 처리되지 않는다. 따라서, 해면체 골은 예를 들면 제분 및/또는 마쇄에 의해 바로 공여자 유래 골로부터 제조될 수 있다. 어떠한 적합한 해면체 골 제분 또는 마쇄 방법도 해면체 골 구성요소를 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 대표적인 마쇄 또는 제분 프로토콜은 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 공개 제2012/0258178호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 해면체 골은 골 이식편 재료 중 20 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 골 이식편 재료 중 30 % 내지 80 % (w/w), 40 % 내지 60 % (w/w), 20 % 내지 40 % (w/w), 20 % 내지 50 % (w/w), 및 40 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 골 이식편 재료 중 30 % 내지 80 % (w/w), 40 % 내지 60 % (w/w), 20 % 내지 40 % (w/w), 20 % 내지 50 % (w/w), 및 40 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다.
도 2는 본 개시내용의 실시양태에 따른 골 이식편 재료를 제조하기 위한 또 다른 대표적인 기술의 측면들을 도시하고 있다. 여기에 나타낸 바와 같이, 방사선비투과 구성요소 (230)는 골 이식편 재료 (250)를 생성시키기 위하여 해면체 골 (240)과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 해면체 골 (240) 및 방사선비투과 구성요소 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골) (230)는 동일한 사망 공여자로부터 수득된다.
일부 실시양태에 있어서, 해면체 골 구성요소 (240)는 비-효소적으로 처리된 해면체 골을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 정육면체, 구체, 불규칙하게 형상화된 과립, 또는 기타 입자 또는 입자 형상은 물론, 탈미네랄화된 골로 구성되는 고체 구성체의 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 해면체 골은 10 ㎛ 내지 10 mm 사이의 입자 크기 범위를 가지는 마쇄된 칩의 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 해면체 골은 200 ㎛ 내지 7 mm, 500 ㎛ 내지 5 mm, 1 mm 내지 4 mm, 및 300 ㎛ 내지 2 mm 사이의 입자 크기 범위를 가지는 마쇄된 칩의 형태로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 공여자 유래의 해면체 골은 회수된 후, 해면체 골 구성요소 (240)를 수득하기 위하여 탈미네랄화 프로토콜, 탈세포화 프로토콜, 또는 탈미네랄화 프로토콜 및 탈세포화 프로토콜 양자를 사용하여 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골은 공여자로부터 회수된 후, 적혈구, 백혈구, 및 기타 면역원성인 요소는 해면체 골로부터 제거하면서 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 무손상으로 남아 해면체 골에 부착되거나 결합되는 비-효소적 처리 (예컨대 수동적 침지 또는 용리)를 사용하여 변형될 수 있다.
일부 경우에서, 해면체 골 (240)은 골 이식편 재료 (250) 중 20 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 해면체 골 (240)은 골 이식편 재료 (250) 중 30 % 내지 80 % (w/w), 40 % 내지 60 % (w/w), 20 % 내지 40 % (w/w), 20 % 내지 50 % (w/w), 및 40 % 내지 90 % (w/w)로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 방사선비투과 구성요소 (230)는 분말 형태로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 방사선비투과 구성요소는 골 이식편 재료 (250) 중 10 % (w/w)로 존재하는 비-탈미네랄화된 피질 골을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 방사선비투과 구성요소 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골)는 미립자 형태로 존재할 수 있으며, 입자가 100 마이크로미터 내지 4 mm 범위 내의 평균 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 특히 세포성 골 이식편 재료 (250)에 일정량의 방사선비투과성을 제공하는 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 바륨 술페이트, 비스무트 트리옥시드, 비스무트 서브카르보네이트, 텅스텐, 티타늄, 산화 지르코늄, 아이오딘화된 폴리에스테르 또는 아이오딘화된 지방족 단량체와 같은 또 다른 방사선비투과 구성요소 (230)로 대체되거나 보충될 수 있다.
도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 해면체 골 (240) 및 방사선비투과 구성요소 (230)는 함께 첨가되어 골 이식편 재료 (250)를 생성시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 (250)는 해면체 골 (240)과 방사선비투과 구성요소 (230)를 함께 혼합하는 것에 의해 생성될 수 있다. 다양한 혼합, 교반 또는 전도 기술들 중 어느 것이 이와 같은 결과를 달성하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 해면체 골 구성요소 (240) 및 방사선비투과 구성요소 (230)는 궤도 진탕기상 플라스크 내에 위치된 후, 거기에서 혼합될 수 있다. 일부 경우에서, 해면체 골 (240) 및 방사선비투과 구성요소 (230)는 용기 또는 컨테이너에 배치된 후, 레소딘 랩램 레조넌트아쿠스틱® 믹서 (레소딘 아쿠스틱 믹서스, Inc., 몬태나 부테) 또는 유사한 공명 음향 진동 장치 또는 고강도 혼합 장치를 사용하여 혼합될 수 있다. 대표적인 관련 혼합 기술에 대해서는 U.S. 특허 공개 제2017/0035937호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에 있어서, 골 이식편 재료 (250)는 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (210)를 포함할 수 있으며, 그것은 U.S. 특허 출원 제15/431,309호, U.S. 특허 공개 제2017/0035937호 및 U.S. 특허 제9,486,556호에 기술되어 있는 것들과 같은 리본 및/또는 입자들을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (210)는 U.S. 특허 공개 제2014/0255489호 및 2017/0035937호에 기술되어 있는 것들과 같은 입자들을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소 (210)는 골 이식편 재료 (250) 중 50 % (w/w) 이하의 양으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈미네랄화된 피질 골 구성요소는 방사선비투과 구성요소를 해면체 골 구성요소와 조합하기 전에 방사선비투과 구성요소와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 골 이식편 재료 (250)는 바인더가 결핍되어 있는 골 이식편 재료와 비교하였을 때 골 이식편 재료의 취급, 점착 특성을 개선하는 바인더 (220)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 알긴산, 메틸 셀룰로스, 히아루론산, 젤라틴, 폴락사머, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜리드 (PG), 카르복시-메틸 셀룰로스, 키토산, 키틴 또는 이들 중 어느 것의 금속 염 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 금속 염은 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 골 이식편 재료 (250) 중 0.5 % 내지 50 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 골 이식편 재료 (250) 중 1 % 내지 25 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 골 이식편 재료 (250) 중 2 % 내지 10 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 골 이식편 재료 (250) 중 1 % 내지 5 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 골 이식편 재료 (250) 중 10 % 내지 25 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 골 이식편 재료 (250) 중 20 % 내지 40 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더 (220)는 골 이식편 재료 (250) 중 30 % 내지 50 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더는 골 이식편 재료 (250) 중 4 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바인더는 방사선비투과 구성요소의 해면체 골 구성요소와의 조합 전에 해면체 골 또는 방사선비투과 구성요소와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 골 이식편 재료 (250)는 첨가제가 결핍되어 있는 골 이식편 재료와 비교하였을 때 골 이식편 재료의 골생성 특성을 촉진하는 첨가제 (260)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 첨가제 (260)는 골 형태형성 단백질 (BMP), 섬유모세포 성장 인자-2 (FGF-2), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF-II), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 형질전환 성장 인자 베타 I (TGFβ-I) 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제 (260)는 골 이식편 재료 구성요소 (예컨대 해면체 골)의 고유하거나 내생인 세포이다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 BMP (예컨대 BMP-2)이다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 재조합 BMP이다. 골 이식편과 함께 사용하기 위한 어떠한 적합한 재조합 BMP 제조 방법도 사용될 수 있다. 대표적인 재조합 BMP에 대해서는 그의 내용이 전체적으로 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 제5,849,880호 및 7,300,772호에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 골 이식편 재료 (250) 중 0.5 % 내지 50 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 골 이식편 재료 (250) 중 1 % 내지 25 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 골 이식편 재료 (250) 중 2 % 내지 10 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 골 이식편 재료 (250) 중 1 % 내지 5 % (w/w)로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가제는 골 이식편 재료 (250) 중 4 % (w/w)로 존재할 수 있다.
도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 골 이식편 재료는 영-하 온도에서의 골 이식편 재료의 장기 저장을 가능케 하기 위한 냉동보존에 적용될 수 있다. 어떠한 적합한 냉동보존 방법도 골 이식편 재료를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 대표적인 냉동보존 프로토콜에 대해서는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 US 특허 제5,071,741호; 8,367,059호; 8,460,860호; 9,192,695호; 9,808,558호; 9,814,803호; 및 U.S. 특허 공개 제2012/0258178호에 개시되어 있다.
도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 해면체 골 (240) 및 방사선비투과 구성요소 (230)는 함께 조합되어 골 이식편 재료 (250)를 생성시킬 수 있다. 다양한 혼합 기술들 중 어떠한 것도 이와 같은 결과를 달성하는 데에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 해면체 골 및 방사선비투과 구성요소는 플라스크 내에 위치된 후, (예컨대 궤도 진탕기를 사용하여) 혼합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 방사선비투과 구성요소를 해면체 골 구성요소와 조합하는 것이며, 여기서 해면체 골 구성요소는 골회복 세포를 포함하는 것; 세포 배양 배지 중에서 약 5분 내지 약 60분 동안 바인더를 수화시킴으로써, 수화된 바인더를 형성시키는 것; 및 수화된 바인더를 방사선비투과 구성요소 및 해면체 골 구성요소와 조합하여 골 이식편 재료를 형성시키는 것이며, 여기서 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 그램 당 골회복 세포 1,000 내지 5천만개 사이의 평균 세포 계수를 가지는 것에 의해 제조된다. 일부 경우에서, 상기 해면체 골 구성요소는 마쇄된 해면체 골 (해면체 골 분말)을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 방사선비투과 구성요소는 피질 골이다. 일부 경우에서, 상기 피질 골은 마쇄된 피질 골 (피질 골 분말)이다. 일부 경우에서, 상기 바인더는 알긴산 (알기네이트로도 지칭됨)이다. 일부 경우에서, 세포 배양 배지는 무혈청이다.
일 실시양태에서, 골 이식편 재료는 비-탈미네랄화된 피질 골을 해면체 골과 조합하는 것이며, 여기서 해면체 골은 골회복 세포를 함유하는 것; 세포 배양 배지 중에서 일정 시간 기간 (예컨대 30분) 동안 알긴산을 수화시킴으로써 (예컨대 4 % (w/v) 알긴산), 수화된 알긴산을 형성시키는 것; 및 수화된 알긴산을 비-탈미네랄화된 피질 골 및 해면체 골과 조합하여 골 이식편 재료를 형성시키는 것이며, 여기서 골 이식편 재료는 10 %의 비-탈미네랄화된 피질 골 (w/w) 및 70 %의 해면체 골 (w/w)을 포함하며, 골 이식편 재료가 골 이식편 재료 그램 당 MSC 1,000 내지 5천만개 사이의 평균 세포 계수를 가지는 것에 의해 제조된다. 일부 경우에서, 상기 세포 배양 배지는 무혈청이다. 일부 경우에서, 상기 수화된 알긴산은 DMEM 중 4 % (w/v) 알긴산일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 수화된 알긴산, 비-탈미네랄화된 피질 골 및 해면체 골은 균질해질 때까지 혼합되어 골 이식편 재료를 형성한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 예를 들면 구체 또는 정육면체와 같은 특정 3-차원 형상으로 형성된다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 이후 냉동보존된다.
일부 경우에서, 골 이식편 구성요소들은 상이한 구성요소들을 덜어내어 혼합 또는 교반 또는 진탕이 없는 대신 골 이식편 구성요소들을 함께 용기 내에 위치시키는 것에 의해 포장될 수 있다. 예를 들면, 원하는 양의 골 이식편 재료를 제공하도록, 예정된 양의 각 구성요소를 스푼 또는 주걱에 적재하는 것이 가능하다. 세포성 골 이식편 재료의 개별 구성요소들은 혼합 없이 용기 내에 (예컨대 중첩하여) 층상화될 수 있다. 예를 들어, 도 1을 참조하면, 10 cc의 생성물은 혼합 없이 층상화 및 포장된 저부의 골 리본 5 cc, 해면체 골 4 cc 및 비-탈미네랄화된 피질 분말 1 cc를 포함할 수 있다. 피질 골 구성요소 (130)와 처리된 해면체 골 구성요소 (140)를 조합하는 과정은 해면체 골에 부착 또는 결합되어 있는 혈액-유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 유지하도록 운용되어야 한다. 예를 들어, 도 2를 참조하면, 10 cc의 생성물은 혼합 없이 층상화 및 포장된 저부의 해면체 골 9 cc 및 방사선비투과 구성요소 1 cc를 포함할 수 있다. 해면체 골 (240)과 방사선비투과 구성요소 (230)를 조합하는 과정은 해면체 골 (240)에 부착 또는 결합되어 있는 MSC와 같은 고유 골회복 세포를 유지하도록 운용되어야 한다.
다양한 품질 조절 또는 검정 기술들 중 어떠한 것도 골 이식편 재료 (150)상에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 품질 조절은 트립신 160에 의한 MSC 회수, 또는 CD90+ 및 다른 중간엽 줄기 세포 마커의 세포 계수를 수득하기 위한 최종 처리 후의 세포 증식과 같은 현재 알려져 있는 다른 방법론을 통하여 달성될 수 있다. 일부 경우에서는, 효소적 방출 프로토콜 (예컨대 트립신, 콜라게나제, 중성 프로테아제 또는 리파제와 같은 효소를 사용함) 후 이어지는 유동 세포측정법 프로토콜을 수행하여 세포 표면 마커 (예컨대 CD90, CD105 및/또는 CD73)를 평가하는 것에 의해 품질 조절이 달성될 수 있다. 예를 들면, 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Bara et al., Stem Cells, (2014), 32:1713-1723] 및 [Boxal and Jones, Stem Cell International (2012), 1-12 (DOI:10.1155/2012/975871)]을 참조한다. 관련하여, 품질 조절은 세포 증식용인 처리된 해면체 골의 체외이식편 배양물을 배양 배지를 포함하는 페트리 접시에 위치시킨 후, (예컨대 본원에서 논의된 바와 같은) 적절한 항체를 사용하여 세포 표면을 표지하고, 이어서 유동 세포측정법을 통하여 측정하는 것을 포함할 수 있다.
임의적으로, MSC가 부착 또는 결합되어 있는 해면체 골의 기능적 완전성을 평가 또는 입증하기 위하여, 검정, 예를 들면 문헌 [Calvi et al., Nature, 425, 841-846 (2003)]에 기술되어 있는 검정과 같은 알칼리 포스파타제 (ALP) 검정 170이 수행될 수 있다. 예를 들면, MTT 또는 프레스토 블루(Presto Blue)®와 같은 대사 검정이 사용될 수도 있다 (하기에서 논의됨). 일부 경우에서는, 시중에서 구입가능한 알칼리 포스파타제 기질 키트 (예컨대 캘리포니아 벌링감의 벡터 라보래토리즈(Vector Laboratories) 또는 캘리포티아 밀피타스의 바이오비전(BioVision), Inc.)가 골 이식편 재료 (또는 그의 구성요소)에서 살아있는 세포를 검출하기 위한 알칼리 포스파타제 (ALP) 분석에 사용될 수 있다 (본원의 실시예 8, 9 및 11 참조).
일부 실시양태에 있어서는, 다른 생체외 검정, 예컨대 닭 배아 융모요막 멤브레인 (CAM) 검정 180, 또는 변형된 CAM 검정 (예컨대 문헌 [Moreno-Jimenez et al., Sci. Rep., (2016)]에 기술되어 있는 검정)이 고유 MSC가 해면체 골에 결합되어 유지되는 해면체 골의 기능적 완전성을 평가 또는 입증하는 데에 사용될 수 있다.
C. 냉동보존
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 -80 ℃ 또는 -196 ℃와 같은 영하 온도에서의 장-기 저장을 가능케 하기 위한 냉동보존에 적용된다. 어떠한 적합한 냉동보존 방법도 골 이식편 재료를 냉동보존하는 데에 사용될 수 있다. 예로는 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US 특허 제5,071,741호; 8,367,059호; 8,460,860호; 9,192,695호; 9,808,558호; 9,814,803호; 그리고 발명의 명칭 "cryopreservation of cartilage and osteochondral tissue"의 2018년 1월 16일자 US 가출원 62/618,000호에 제시되어 있는 방법들이 포함된다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 또는 골 이식편 재료의 개별 구성요소 (예컨대 피질 골 또는 해면체 골)는 개별적으로 냉동보존될 수 있다. 일부 실시양태에서, 냉동보존은 냉동보호제를 함유하는 냉동보존 용액을 사용하여 골 이식편 재료를 인큐베이팅, 배싱 또는 침지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 냉동보존 용액은 1종 이상의 냉동보호제를 포함하는 완충제 또는 세포 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제는 디메틸 술폭시드 (DMSO), CS10®, 트레할로스, 덱스트로스, 알파-토코페롤, 안정화된 아스코르브산, 레스베라트롤, 메탄올, 부탄디올, 프로판디올, 글리세롤, 히드록시에틸 전분, 글리콜 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 글리콜은 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 부틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제는 DMSO이다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제 용액은 단일-작용제 냉동보호제와는 대조적으로 2종 이상의 냉동보호제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제 용액은 DMSO 및 알기네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 알기네이트는 소듐 염 알기네이트이다.
일부 실시양태에서, 냉동보호제는 예를 들면 완충제 또는 세포 배양 배지 중 냉동보호제의 최종 농도가 1 % 내지 40 % (vol/vol) 사이가 되도록 골 이식편 재료에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제는 냉동보호제의 최종 농도가 5 % 내지 30 % (vol/vol) 사이가 되도록 골 이식편 재료에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제는 냉동보호제의 최종 농도가 10 % 내지 20 % (vol/vol) 사이가 되도록 골 이식편 재료에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 냉동보호제 용액은 10 ml 내지 2,500 mL 사이의 부피로 제공된다. 예를 들면, 냉동보존 용액은 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 1.1 L, 1.2 L, 1.3 L, 1.4 L, 1.5 L, 1.6 L, 1.7 L, 1.8 L, 1.9 L, 2.0 L, 2.1 L, 2.2 L, 2.3 L. 2.4 L, 2.5 L, 또는 10 mL 내지 2,500 mL 범위 내의 또 다른 부피일 수 있다. 일부 경우에서, 냉동보존 용액의 부피는 골 이식편 재료를 냉동보존하는 데에 사용되는 용기의 용량 (예컨대 1 L 플라스크)에 의해 제한된다.
일반적으로, 냉동보호제는 골 이식편 재료의 고유 또는 내생 세포가 냉동보호제의 독성으로 인하여 실질적으로 영향 (예컨대 사멸)을 받지는 않는 최종 농도로 골 이식편 재료에 첨가되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제의 최종 농도는 골 이식편 재료 중 총 세포의 수에 대하여 10 %를 초과하는 독성은 초래하지 않는다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제의 최종 농도는 골 이식편 재료 중 총 세포의 수에 대하여 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 %를 초과하는 독성은 초래하지 않는다. 일부 실시양태에서, 냉동보존 용액 중 냉동보호제의 최종 농도는 골 이식편 재료에 존재하는 총 세포의 수에 대하여 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % 미만, 또는 10 % 미만의 독성을 초래한다.
일 실시양태에서, 냉동보존제 용액은 10 % DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 냉동보존 용액은 완충제 또는 세포 배양 배지 중에 5 % 내지 40 %의 냉동보호제 또는 냉동보호제 조합을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 냉동보존 용액은 혈청 (예컨대 인간 혈청) 또는 혈소판 풍부 혈장 (예컨대 인간 혈소판 용해물) 또는 양자, 그리고 1종 이상의 냉동보호제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 냉동보호제 용액은 5 %-40 %, 10 %-30 % 또는 5-20 %의 DMSO를 함유하는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 냉동보존 용액은 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % 또는 30 %의 DMSO를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 다수의 냉동보존 용액들이 냉동보존 과정에 사용되는 경우, 냉동보존 용액은 냉동보존 과정의 상이한 시점에 사용될 상이한 양 (예컨대 농도)의 DMSO를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 냉동보호제는 냉동보호제가 골 이식편 재료의 세포들을 코팅하고/거나 거기에 진입하도록 하는 시간 기간 동안 냉동보존 용액 (예컨대 냉동보호제를 함유하는 세포 배양 배지)을 사용하여 골 이식편 재료를 인큐베이팅, 침지 또는 교반 (예컨대 궤도 진탕기를 사용함)하는 것에 의해 골 이식편 재료에 적용된다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 적어도 2분 내지 4시간 동안 냉동보호제 용액을 사용하여 인큐베이팅된다. 예를 들면, 골 이식편 재료는 2분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 40분, 50분, 60분, 75분, 90분, 120분, 180분, 200분, 220분, 또는 4시간 미만인 기타 시간 기간 동안 침지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 5 내지 60분 사이 동안 냉동보호제 용액을 사용하여 인큐베이팅된다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 실온 또는 냉장 온도 (예컨대 4 ℃)에서 냉동보호제 용액을 사용하여 인큐베이팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 인큐베이팅되는 동안 궤도 진탕기, 로커(rocker) 또는 교반 플레이트 (예컨대 골 이식편 재료 및 냉동보존 용액이 들어있는 용기에서 자석 교반기를 사용함) 상에서 교반될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 냉동보존 용액 중에서 침지되는 동안 (연속적으로 침지 기간의 일부 동안 또는 침지 기간 중 간헐적으로) 초음파처리될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 냉동보호제 용액을 사용한 인큐베이션 후 및 속도 조절 냉동 전에 냉동보호제 용액이 골 이식편 재료로부터 경사분리되는 반-건조 냉동보존 단계가 수행된다. 이와 같은 방법의 예는 실시예 12에 나타내었다. 일부 실시양태에서, 냉동보호제 용액 중에서의 인큐베이션 후의 골 이식편 재료는 속도 조절 냉동 전에 두드려 건조된다(patted dry). 일부 실시양태에서는, 냉동보호제 용액을 사용한 인큐베이션 후에 냉동보호제 용액이 골 이식편 재료로부터 경사분리되고 (즉 반-건조 냉동보존), 속도 조절 냉동 전에 골 이식편 재료가 두드려 건조된다.
일부 실시양태에서는, 냉동보호제 용액에서의 골 이식편 재료의 인큐베이션 후 골 이식편 재료가 속도 조절 냉동을 통하여 냉동보호제 용액 중에서 냉동되는 습윤 냉동보존 단계가 수행된다. 이와 같은 방법의 예는 실시예 1에 나타내었다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 냉동된 골 이식편 재료를 생성시키기 위하여 드라이 아이스, 액체 질소 또는 냉동을 사용하여 냉동될 수 있다. 일단 냉동되고 나면, 냉동된 골 이식편 재료는 원할 때까지 영하의 섭씨 온도, 바람직하게는 -80 ℃ 이하 (예컨대 -196 ℃)에서 저장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 냉동보존 용액은 냉동 전에 골 이식편 재료로부터 제거 또는 배수될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 냉동 전에 추가적인 냉동보존 용액이 배수된 골 이식편 재료에 적용될 수 있으며, 적절한 시간 기간 동안 추가적인 냉동보존 용액이 골 이식편 재료와 함께 인큐베이팅될 수 있다. 일반적으로, 임의의 냉동보존 용액을 사용한 골 이식편 재료의 인큐베이션 기간은 골 이식편 재료에 존재하는 고유 골회복 세포의 1 세포-주기 또는 계승 미만인 시간 기간이다.
일부 실시양태에서, 냉동보존 용액은 세포 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 배양 배지는 포유동물 세포 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 무영양소이거나, 또는 1종 이상의 필수 영양소가 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 최소 필수 배지 이글 (MEME) 또는 완전 중간엽 줄기 세포 배지 (예컨대 셀바이오로직스(CellBiologics).com의 카탈로그 번호: M5566)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 보충제를 포함한다. 대표적인 보충제에는 소 태아 혈청 (FBS), 인간 혈청, 인간 혈청 알부민 및 인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 항생제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 항생제는 반코마이신 HCl, 겐타마이신 술페이트, 폴리믹신 B 술페이트, 시프로플록사신 HCl, 암포테리신 B, 바시트라신 중 1종 이상일 수 있다.
MEM은 기본 배지 이글 (BME) 배지의 초기 제제를 기재로 한다. MEM은 CO2 인큐베이터에서 사용하기 위한 얼 염(Earle's salt)으로, 또는 CO2 없이 사용하기 위한 행크 염(Hanks' salt)으로 가용하다. 분말 또는 액체 형태의 것이 가용하다. MEM은 단백질, 지질 또는 성장 인자를 함유하지 않으며, 그에 따라 보통 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 사용한 보충을 필요로 한다. MEM은 수많은 제조자 (예컨대 서모피셔 사이언티픽)로부터 시중에서 구입가능하다.
FBS는 소 태아의 혈액으로부터 기원하는 낙농 산업 부산물이다. FBS는 성장 인자 및 기타 단백질을 함유하지 않으며, 그에 따라 시험관 내에서 세포 배양 배지를 보충하는 데에 사용된다. 통상적으로, 해당 세포 (예컨대 골회복 또는 MSC)는 세포 배양 배지 및 보충제 (예컨대 FBS) 중에서 인큐베이팅되며, 1회 이상 계승 후에는 해당 재료로부터 FBS를 함유하는 세포 배양 배지가 제거된다.
인간 혈청 알부민 (HSA)은 인간 혈액에서 발견되는 것으로, 혈장에서 가장 풍부한 단백질이다. HSA는 ALB 유전자에 의해 코딩되며, 통상적으로 세포 배양 배지에서의 보충제로 사용된다. HSA는 또한 세포 세척 및 냉동보존에 이용되고 있다. HSA는 인간 혈액으로부터 수득될 수 있거나, 또는 예컨대 재조합에 의해 HSA를 발현하는 식물을 사용하여 "무-동물"로 제조될 수 있다.
인간 혈소판 용해물 (hPL)은 세포 배양 배지용 보충제이다. 그것은 수회의 냉동/해동 주기 후 인간 혈액 혈소판으로부터 수득되는 액체이다. hPL은 수많은 제조자 (예컨대 밀 크릭 라이프 사이언시즈(Mill Creek Life Sciences))로부터 시중에서 구입가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법에 따라 제조되는 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 중 고유 골회복 세포 (예컨대 MSC 또는 골모세포)의 1 세포-주기 또는 계승 미만인 시간 동안 세포 배양 배지 중에서 인큐베이팅, 침지 또는 배싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 세포 배양 배지 중에서 인큐베이팅되며, 골 이식편 재료 중에 존재하는 고유 골회복 세포는 시험관 내에서 계승되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 세포 배양 배지 중에서 인큐베이팅되며, 골 이식편 재료 중 고유 골회복 세포는 시험관 내에서의 군집 배가에 적용되지 않는다. 일반적으로, 골 이식편 재료 중 고유 골회복 세포는 시험관 내에서 증식되거나 계승되지 않으며, 대신 대상체의 원하는 부위에 (예컨대 골 결함에, 또는 척추 케이지 내에) 이식되며, 고유 골회복 세포는 수용자에서 (예컨대 생체 내에서) 군집 배가에 적용되는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 냉동보존되는 골 이식편 재료는 대상체에의 이식 전에 적어도 10분 동안 실온 또는 37 ℃로 얼음상에서 해동된다. 바람직하게는, 냉동된 골 이식편 재료는 대상체에의 이식 전에 10 내지 60분 사이 동안 실온 또는 37 ℃로 얼음상에서 해동된다. 일부 실시양태에서, 일단 해동되고 나면, 골 이식편 재료는 냉동보존-전 골 이식편 재료와 비교하였을 때 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % 이상의 고유 골회복 세포를 유지한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 냉동보존 전 및 후의 골 이식편 재료의 세포 계수에 의해 측정하였을 때, 냉동 및 해동 후 적어도 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % 또는 95 %의 세포 생존율을 유지한다. 일 예에서, 냉동보존된 골 이식편 재료는 냉동보존 전의 골 이식편 재료와 비교하였을 때 적어도 20 %의 세포 생존율을 유지한다.
골 이식편 재료는 고유하거나 생존가능한 세포에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 골 이식편 재료 중 세포의 생존율이 프레스토 블루® 시약 또는 MTT와 같은 시약을 사용하여 대사적으로 평가될 수 있다. 일부 경우에서는, 트리판 블루(Trypan Blue)®가 세포 생존율을 평가하는 데에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 일정 시간 기간 (예컨대 1주) 동안 냉동된 다음, 해동된 후, 세포 생존율에 대하여 평가된다. 골 이식편 재료 중 살아있는 세포의 존재를 측정하기 위한 어떠한 적합한 방법도 사용될 수 있다. 대표적인 방법에는 US 특허 공개 제2014/0093480호; 2016/0290994호; US 특허 제8,163,495호, 및 본원의 실시예 8, 9 및 11에 제시되어 있는 것들이 포함된다.
D. 골 이식편 재료의 평가
일부 경우에서는, 골 이식편 재료의 적어도 1종의 특징을 평가하기 위하여, 냉동보존 전 및/또는 후에 골 이식편 재료가 평가된다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 1종 이상 고유 세포 (예컨대 백혈구)의 존재 및/또는 부재를 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 1종 이상 고유 골회복 세포 (예컨대 MSC)의 존재 및/또는 부재를 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 미네랄 함량 (예컨대 칼슘)을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 1종 이상 골회복 세포 (예컨대 골세포)의 존재 및/또는 양을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 적색 및/또는 백색 혈구의 존재 및/또는 부재를 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 CD45+ 세포의 부재 및/또는 양을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 CD4+ 세포의 부재 및/또는 양을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 CD3+ 세포의 부재 및/또는 양을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 CD44+ 세포의 존재 및/또는 양을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료에서의 CD90+ 세포의 존재 및/또는 양을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료의 1종 이상 취급 또는 점착 특성을 측정하는 평가가 수행될 수 있다. 상기에서 제시된 1종 이상의 특징을 측정하기 위한 어떠한 적합한 방법도 사용될 수 있다. 대표적인 방법에는 유동 세포측정법, 세포 표면 마커 항체 결합, 혈구계 세포 계수, 및 본원의 실시예에서 개시되는 방법들 중 어느 것이 포함된다.
E. 세포 생존율
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료의 세포 생존율을 측정하거나 평가하는 것은 골 이식편 재료 내에서의 세포의 대사 활성의 평가를 포함할 수 있다. 예를 들면, 프레스토블루® 또는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)와 같은 시약들을 사용하여 세포 생존율이 측정될 수 있다. MTT 세포 생존율 검정은 비색측정 플레이트 판독기를 사용하여 시험 샘플 중 살아있는 세포 수를 측정하기 위한 방법이다. 또 다른 예에서, 세포 생존율은 세포 계수 키트 8 (CCK-8) 검정을 사용하여 측정될 수 있다. CCK-8 검정은 생존가능한 세포 수의 측정을 위한 비색측정 검정이다. CCK-8 검정의 시약은 WST-8 [2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노소듐 염]로, 살아있는 세포에서 데히드로제나제에 의해 환원되어 세포 배양 배지에 가용성인 황색 색상의 생성물 (포르마잔)을 생성한다. 이에 따라, 살아있는 세포에서의 데히드로제나제의 활성에 의해 생성되는 포르마잔 염료의 양은 시험 샘플 중 살아있는 세포의 수에 정비례한다.
일부 실시양태에서는, 골 이식편 재료가 일정 시간 기간 (예컨대 1주, 1개월, 1년 또는 5년까지) 동안 냉동된 후에 세포 생존율이 평가될 수 있다. 냉동된 골 이식편 재료는 해동된 후, 세포 생존율에 대하여 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 생존율은 해동된 골 이식편 재료에 존재하는 MSC의 수 또는 백분율을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, (골 이식편 재료 중 총 세포 조성물의 백분율로서의) 골 이식편 재료 중 MSC의 백분율은 적어도 5 %이다. 일부 실시양태에서, (골 이식편 재료 중 총 세포 조성물의 백분율로서의) 골 이식편 재료 중 MSC의 백분율은 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 이상이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료 중 총 세포 조성물의 백분율로서의 골 이식편 재료 중 MSC의 백분율은 5 % 내지 30 % 사이이다. 예를 들면, MSC 세포 표면 마커를 발현하는 세포 (예컨대 CD44+ 및 CD90+)는 특이적 항체 및 유동 세포측정법의 사용에 의해 식별될 수 있다 (본원의 실시예 4 참조). 골 이식편 재료에서 살아있는 세포의 존재 및/또는 양을 측정하거나 평가하기 위한 어떠한 적합한 방법도 사용될 수 있다는 것은 잘 알고 있을 것이다.
F. 성형
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 골 이식편 재료는 원하는 형상, 크기로 가공 또는 성형되거나, 또는 대상체에의 이식 전에 기존의 외과용 구성체 (예컨대 척추 케이지)에 적용될 수 있다. 골 이식편 재료는 비제한적으로 구체, 원추, 컬럼, 쐐기, 피라미드, 디스크, 정육면체 및 띠와 같은 형상으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 불규칙한 형상으로 성형 또는 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 이식 시술 동안 (예를 들자면 이식 후 이식 부위의 세척 동안) 그의 크기 및 형상을 유지한다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 퍼티-유사 농밀도를 보유하며, 그에 따라 어떠한 원하는 형상 또는 크기로도 용이하게 성형될 수 있다.
V. 치료 방법
일 측면에서, 본 개시내용은 골 이식편 재료를 사용한 대상체의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 골 이식편 재료를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 골 이식편 재료는 방사선비투과 구성요소 및 해면체 골 구성요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골회복 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 고유 골회복 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 결함 또는 골절을 복구하기 위하여 대상체에게 투여된다. 예를 들면, 골 결함은 암, 유전성 질환, 연령-관련 골 상실 (예컨대 골다공증), 외상 (예컨대 손상), 감염 등의 결과일 수 있다. 골 이식편 재료의 사용은 정형외과학, 재건 외과학, 치과학 및 족학과 관련된 산업에서 실행될 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 치유시 환자의 선천 골에 의해 재흡수 및 대체될 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 이식 후 대상체에서 유지되면서 상실되었거나 손상된 골을 대체한다. 골 이식편 재료는 또한 예를 들면 골의 상실된 부문 (예컨대 암성 골의 외과적 제거)의 맥락에서 재건상의 적용성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 골 이식편 재료는 다수의 골 결함을 치료하는 데에 있어서 형상, 크기 및 조성물 면에서 맞춤식 치료 선택사항을 제공한다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 외상-후 재건상의 미용 용도로 사용될 수 있다. 치료 방법은 일반적으로 외과의와 같은 의료 전문가에 의해 수행된다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 정형외과 또는 신경외과 시술시 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 정형외과 또는 신경외과 시술은 척추 유합술이다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료를 직접 이식 부위 (예컨대 골소강 또는 결함)에 성형시켜 위치시키는 것에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료를 외과용 구성체 (예컨대 척추 케이지)에 성형시켜 위치시키고, 상기 외과용 구성체를 이식 부위 (예컨대 추골)에 위치시키는 것에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 대상체에 투여하기 전에 식염수 용액, 항생제, 세포 배양 배지 또는 이들의 조합과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 수용자에의 이식 전에 적절한 용액 (예컨대 식염수 또는 알긴산)을 사용하여 수화 또는 재수화됨으로써, 젤, 검 또는 퍼티-유사 농밀도를 형성한다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 유동성의 주사가능한 퍼티-유사 재료로서 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 캐뉼러 또는 다른 주사 부속을 통하여 결함 부위로 퍼티-유사 성형가능 재료가 전달될 수 있다 (예컨대 그의 전체 내용이 모든 목적에 있어서 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 출원 제13/712,295호 참조). 분말 또는 액체 형태의 골 이식편 재료와는 대조적으로, 퍼티-유사 조성물은 개선된 취급 및 점착 특성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 퍼티-유사 조성물은 이식시 제자리에서 유지될 수 있다. 관련하여, 퍼티-유사 조성물은 적용 부위 (예컨대 골 결함 영역)에서 지속되며, 혈액에 의한 세척 및/또는 그와의 접촉에 의한 제거를 견딜 수 있다.
본원에서 기술되는 골 이식편 재료는 결함 부위가 있는 대상체에의 이식용으로 유용하다. 상기 결함 부위는 변성되거나 손상된 척추 디스크, 골 결함, 구강 결함 또는 악안면 결함일 수 있다. 본원에서 기술되는 골 이식편 재료는 손상되거나, 제거되거나, 변성된 골을 대체하는 데에 사용될 수 있다. 상기 골 이식편 재료는 골 성장 (즉 골생성)을 촉진하는 것에 의해 결함 부위를 치유하는 치료효험이 있는 고유 골회복 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료의 공여자로부터 유래하는 MSC를 포함할 수 있다. "환자" 및 "대상체"라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용된다.
본원에서 제공되는 것은 대상체에서의 골 결함의 치료 방법으로, 여기서 상기 치료 방법은 대상체의 골 결함 부위 (본원에서는 이식 부위로도 지칭됨)에서 골 이식편 재료를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 골 결함 부위에는 변성되거나 손상된 척추 디스크, 구강 결함 및 악안면 결함이 포함될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 구강 및 악안면 결함에는 두부, 경부, 안면, 턱, 그리고 구강 (입) 및 악안면 (턱 및 안면) 영역 경질 및 연질 조직의 결함이 포함된다. 대표적인 골 결함에는 손상되거나, 이환되거나, 변성되거나, 상실된 골이 포함된다. 예를 들면, 골 결함 부위는 장골, 단골, 편평골, 불규칙 골, 추간 디스크 또는 이러한 골들 중 어느 것의 일부일 수 있다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들자면 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 돼지, 소, 조류 등일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 인간이다.
일부 경우에서, 대표적인 치료 방법은 이식 부위에 골 이식편 재료를 제공하는 것을 포함한다. 이와 같은 단계는 환자의 평가 후에 수행될 수 있다. 일부 경우에서는, 의료 전문가가 대상체를 평가하여, 치료를 필요로 하는 골 결함의 특성 및 대상체를 치료하는 데에 적절한 골 이식편 재료를 확인한다. 일부 경우에서, 이와 같은 과정은 골 결함 부위의 치수를 제공하며 골 이식편 재료의 원하는 배열구조 (예컨대 크기 및/또는 형상)를 결정하는 데에 이용될 수 있는 의료용 영상화, 예컨대 X-선 영상화, MRI 스캔 또는 CT 스캔을 포함할 수 있다. 상기 적절한 골 이식편 재료는 골 결함 부위에서의 골 성장 및 치유를 촉진하는 고유 골회복 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 골생성성인 골 이식편 재료가 골 결함을 치료하는 데에 적절할 수 있다.
일부 경우에서, 골 이식편 재료는 이식 부위의 배열구조 및/또는 치수에 부합하도록 의료 전문가에 의해 형상화될 수 있다. 골 이식편 재료는 예컨대 절단, 굽힘, 접음 등에 의해 형상화될 수 있을 것으로 생각된다. 예를 들면, 골 이식편 재료는 골 결함 부위에 맞도록 외과용 메스 또는 가위와 같은 외과용 도구를 사용하여 재단될 수 있다. 일부 경우에서, 이와 같은 단계는 예를 들면 적절한 배지 또는 용액 (예컨대 식염수 또는 알긴산)을 사용하여 골 이식편 재료를 수화 또는 재수화시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 대상체의 이식 부위에 투여된다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 골 결함 부위에, 또는 그 내부에 이식될 수 있다. 예를 들면, (손상, 질환 또는 외과적 제거를 통한 것인지에 관계없이) 고유 골이 상실되어 있는 골 결함 부위에 골생성성 이식편이 이식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 이식편 재료는 성형되어 척추 케이지와 같은 외과용 구성체에 삽입되고, 외과용 구성체가 고정구(fastener) (예컨대 스크류)를 사용하여 이식 부위에 봉합 또는 부착될 수 있다.
일부 경우에서는, 골 이식편 재료가 대상체에 이식될 때, 이식 부위에서 안정한 물리적 지지 구성체로 골 이식편 재료가 작용함으로써, 손상되거나, 제거되거나, 변성된 골을 대체 또는 지지할 수 있다. 일부 경우에서, 골 이식편 재료가 외과용 구성체 (예컨대 척추 케이지) 내에 함유되어 대상체에 이식되는 경우, 골 이식편 재료는 이식 부위에서 안정한 물리적 지지 구성체로 작용함으로써, 손상되거나, 제거되거나, 변성된 골을 대체 또는 지지할 수 있다.
VI. 키트
본 개시내용의 방법 및 조성물은 1종 이상의 키트로 제공될 수 있다. 상기 키트는 골 이식편 재료, 또는 골 이식편 재료를 제조하는 데에 필요한 개별 구성요소 (예컨대 방사선비투과 구성요소 및 해면체 골 구성요소), 그리고 사용 지침을 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 키트는 추가로 본 개시내용과 관련하여 기술되는 임의의 추가적인 구성요소 (예컨대 재조합 BMP 또는 골회복 세포, 예컨대 MSC), 및 본 개시내용에 적절한 임의의 다른 재료 또는 항목 (예를 들면 DMSO 및 알긴산을 함유하는 냉동보존 용액과 같은 것)을 포함할 수 있다. 또한, 사용 지침은 본원에서 기술되는 방법들 중 어느 것을 제시할 수 있다.
[실시예]
실시예 1: 골 이식편 재료를 제조하기 위한 대표적인 프로토콜
하기는 본원에서 기술된 바와 같은 골 이식편 재료를 제조하기 위한 대표적인 프로토콜이다.
띠톱을 사용하여 장골의 근위 및 원위 골단 및 골간단으로부터 피질 골 및 연골을 재단 분리하는 것, 및 생성되는 해면체 골 블록을 대략 2 cm2 크기의 단편으로 절단하는 것에 의해 해면체 골을 제조하였다. 상기 해면체 골을 단일 경로를 사용하여 XXXF 실린더 블레이드가 구비된 포르셔스 본 밀(Fortios Bone Mill) (스피어링스 티슈 프로세싱(Spierings Tissue Processing) B.V., 네덜란드)로 통과시켰다. 생성되는 마쇄된 해면체 골을 수집하여, 일회용 플라스크로 옮겼다. 70 RPM 궤도 진탕기 플랫폼을 사용하여 세척 당 10분의 기간 동안 37 ℃로, 상기 마쇄된 해면체 골을 항생제 (반코마이신 HCl, 겐타마이신 술페이트, 암포테리신 B, 폴리믹신 B 술페이트, 시프로플록사신 HCl)를 함유하는 1 L의 포유동물 배지 (DMEM-F12)를 포함하는 2 L 일회용 에를렌마이어 플라스크에서 세차례 (3회) 세척하였다. 세척들 사이에, 포유동물 배지는 경사분리하였다.
다음에, 핏츠 그라인더(Fitz Grinder)를 사용하여 대략 500-1,000 ㎛로 피질 골을 마쇄한 후 이어서 크기 체질하는 것에 의해, 피질 골 부문으로부터 비-탈미네랄화된 피질 골 분말 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소)을 제조하였다.
상기에서 제조된 바와 같은 해면체 골 90 그램을 상기에서 제조된 바와 같은 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소 10 그램과 조합하는 것에 의해, 골 이식편 재료를 제제화하였다.
상기 골 이식편 재료는 예를 들면 알로스템 자(AlloStem Jar) 및 중량 기준 체 삽입물을 사용하여 척추 케이지 또는 다른 정형외과용 시술에 적합한 1 CC, 1.5 CC, 5 CC, 10 CC 또는 15 CC 단위로 포장될 수 있다. 냉동보존제 (예컨대 90 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 10 % 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 각 자에 첨가하고, 프로콘드릭스(ProChondrix) 냉동-자를 사용하여 -80 ℃까지 속도 조절 냉동 (-1 ℃/분)을 수행하였다. 다음에, 냉동된 냉동보존 골 이식편 재료를 저장하여, 이후 사용에 대비하였다.
일단 해동되고 나면, 골 이식편 재료는 골 복구 및 성장을 촉진하기 위하여 척추 케이지 또는 다른 골소강으로 성형되어 위치될 수 있다 (도 3 참조). 골 이식편 재료는 용이하게 성형되며, 대상체에의 삽입을 위하여 외과 요원에 의해 척추 케이지가 조작되는 동안에도 그의 성형된 형상을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 골 이식편 재료의 취급 농밀도는 퍼티 또는 페이스트-유사 재료와 유사하였다.
실시예 2: 골 이식편 재료의 방사선비투과 특성
본원에서 기술되는 골 이식편 재료는 그의 방사선비투과 특성으로 인하여, 예를 들면 X-선에 의해 관찰될 수 있다. 예를 들어, 일단 골 이식편 재료가 골소강, 골 결함 또는 기타 외과용 기구 (예컨대 척추 케이지)에 삽입되고 나면, 골 이식편 재료는 외과용 기구의 잠재적인 재위치지정, 또는 대상체에서의 골 복구의 모니터링을 돕는 데에 사용될 수 있다.
여기에서는, 골 이식편 재료의 방사선비투과 특성을 입증하기 위하여, 본질적으로 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 골 이식편 재료에 0 % 내지 20 % 범위의 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소를 포함시켰다. 표준 임상 환경을 사용하여 골 이식편 재료의 X-선을 생성시켰다 (문헌 [Hauser and Cukla, J. Prolotherapy, (2009), 1(1):22-28] 참조).
도 4는 골 이식편 재료의 검출에 대한 비-탈미네랄화된 피질 골 농도의 효과를 도시한다. 0 %의 비-탈미네랄화된 피질 골 분말을 함유하는 골 이식편 재료 (상부 좌측 영상)는 가시성인 반면, 골 이식편 재료 중 비-탈미네랄화된 피질 골 분말의 농도가 증가하면서 골 이식편 재료는 점점 더 불투명해졌다. 예컨대, 90 %의 마쇄된 해면체 골 및 10 %의 비-탈미네랄화된 피질 골을 함유하는 제제는 골 이식편 재료의 취급 및 점착 특성을 훼손하지 않으면서도 우수한 X-선 영상화를 제공하는 것으로 나타났다.
실시예 3: 골 이식편 재료의 세포 생존율
선행 동종이식 골 이식편 재료의 한 가지 장애는 일단 골 이식편 재료가 대상체에 이식된 후의 면역 시스템 반응 (예컨대 GVHD)을 피하기 위하여 골 이식편 재료 유래의 모든 또는 실질적으로 모든 면역원성 요소가 제거되는 정도까지 골 이식편 재료가 처리된다는 것이다. 그렇게 함으로써, 골 이식편 재료는 종종 골생성 특성이 결핍된다. 골생성 특성을 제공하는 1종 이상의 내생 세포 군집을 유지하는 골 이식편 재료라면, 골 이식편 복구를 촉진하는 데에 특히 유용할 것이다.
고유 조직 매트릭스로부터 내생 세포를 분리하는 데에는 콜라게나제가 사용될 수 있다. 그러나, 콜라게나제 단독으로는 모든 조직 유형으로부터 살아있는 세포를 방출시키기에 충분하지 않다. 이에 따라, 어떤 제제(들)가 본원에서 기술되는 골 이식편 재료의 세포 생존율을 유지하는지를 확인하기 위하여, 콜라게나제 및 콜라게나제/중성 프로테아제의 다양한 제제를 제조하였다.
상이한 농도의 콜라게나제 (0 %-80 %) 및/또는 중성 프로테아제를 함유하는 제제들을 실시예 1에서 기술된 골 이식편 재료로부터의 살아있는 세포의 방출에 대하여 평가하였다 (도 5). 다양한 비율의 콜라게나제 및 프로테아제를 함유하는 시중의 가용 키트들이 용이하게 구입가능하며 (예를 들면 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)의 비타사이트 콜라게나제(VitaCyte Collagenase) IX (C9407)로부터의 DE 콜라게나제 최적화 키트), 대조로 사용하였다. 1 mg/ml의 농도로 모든 콜라게나제 제제를 시험하고, 대략 12.5 ml/그램의 골 이식편 재료로 37 ℃에서 3시간 동안 무혈청 성장 배지 중에 위치시켰다. 인큐베이션 기간 후, 트리판 블루 염색을 사용하여 골 이식편 재료로부터 분리된 생존가능한 세포를 계수하였다 (예컨대 염색에 의한 1:1 세포 희석 및 혈구계에서의 계수).
도 5는 각 콜라게나제 제제에서의 총 세포 수율을 제공한다. 비타사이트 DE40/400 및 DE60/600은 대략 골 이식편 재료 그램 당 2.0 x 107개 세포로 최고의 세포 수율을 제공하였다. 이러한 결과에 기초하여, 60 % 콜라게나제:40 % 중성 프로테아제를 포함하는 DE60을 이후 연구에서의 용도로 선택하였다.
실시예 4: 골 이식편 재료에 존재하는 세포의 특성화
골 이식편 재료는 골소강에의 배치시 골 복구를 촉진한다. 이와 같은 목적은 중간엽 줄기 세포 (MSC)와 같은 생존가능한 바람직한 살아있는 세포 및 제한된 양의 바람직하지 않은 세포 (예컨대 백혈구 및 적혈구)를 함유하는 골 이식편 재료를 제공하는 것에 의해 수행된다. 특히, 잔류 백색 혈구 (즉 세포 표면 마커 CD45를 발현하는 세포)는 골 이식편 재료가 유래하지 않은 개체에게 골 이식편 재료가 이식될 경우 (예컨대 동종이식), 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)과 같은 심각한 면역 시스템 자극 위험성을 야기한다.
유동 세포측정법을 사용하여, 실시예 3에서 기술된 콜라게나제 제제 (DE60/600)를 사용하여 골 이식편 재료로부터 생존가능한 살아있는 세포를 방출시키는 것에 의해, 실시예 1에서 기술된 골 이식편 재료에 존재하는 세포의 유형을 확인하였다.
골 이식편 재료의 콜라게나제 처리 (즉 세포 분리) 후, 백혈구 및 골생성 세포 (예컨대 골세포 및 MSC)를 검출하는 항체를 사용하여 세포를 염색한 후, 아세아 노보사이트(Acea NovoCyte) 기기 및 노보익스프레스(NovoExpress) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. CD44+는 골세포에 대한 세포 표면 마커로 작용하는 반면; CD90은 MSC에 대한 일차적인 세포 표면 마커로 작용한다.
실시예 1로부터의 골 이식편 재료의 유동 세포측정법 평가로 회수가능한 생존가능한 골세포 (CD44+) 및 MSC (CD90+, CD73+, CD105+, CD146+, Stro-1+, CD271+)를 식별하고 (예컨대 문헌 [Bara et al., Stem Cells, (2014), 32:1713-1723]; [Hughes et al., J. Bone Mineral Res., (1994) 9(1):39-44]; 및 [Nakashima et al., Nat. Med., 17:1231-34] 참조), 데이터를 표 1에 제공하였다. 잔류 백색 혈구 (CD45+)도 골 이식편 재료로부터 검출하였다. 골 이식편 재료에서 골모세포를 관찰하기를 기대하였지만, 대표적인 세포 표면 마커가 아직 식별되지 않았다. 상기에서 언급된 바와 같이, 잔류 백색 혈구 (CD45+)는 이식편에 대한 환자 또는 환자에 대한 이식편 (즉 동종이식)의 면역학적 반응으로 인하여 골 이식편의 수용자에게 건강상의 위험성을 야기할 수 있다. 따라서, 골 이식편 재료로부터 CD45+ 세포는 제한하거나 제거하는 것이 바람직하다. 하기 표 1은 골 이식편 재료의 유동 세포측정법에 의한 세포 표면 마커 특성화 및 정량의 개요를 제공한다.
<표 1>
실시예 5: 골 이식편 재료로부터의 백혈구의 제거
단-핵화된 혈구 (백혈구)는 골 이식편 재료에서 바람직하지 않으며, 본원에서 기술되는 방법에 따라 골 이식편 재료를 세척하는 것에 의해 제거될 수 있다. 여기에서, 골 이식편 재료는 골 이식편 재료 100 그램 당 저온 배지 250 ml 비의 무-혈청 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium):영양소 혼합물 F12 (DMEM-F12) 포유동물 배지 (서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 카탈로그 번호: 11330-099)에서 세척하였다. 세척 주기는 80 RPM으로 설정된 궤도 플랫폼 진탕기에서 10분의 기간 동안 실온으로 수행하였다. 세척 후에는, 세포 계수 유동 세포측정법 절차를 수행하여 백혈구의 제거를 평가하고, 각 세척 단계 후 골 이식편 재료 중 나머지 세포를 특성화하였다.
세척 프로토콜로부터의 결과를 도 6에 제공하며, 3회의 세척 단계면 골 이식편 재료로부터 백혈구를 제거하는 데에 충분하다는 것을 나타내었다. 이와 같은 경우에서, 3회의 세척 단계 후에는 CD45+를 발현하는 세포 (즉 백혈구)가 검출되지 않았다.
서로 다른 인간 공여자로부터 제조된 골 이식편 재료를 사용한 두 번째 연구는 세척 후 골 이식편 재료에서 T-세포의 존재를 조사하는 데에 사용하였다. CD3 및 CD4는 백혈구의 면역원성 하위세트인 T-세포의 마커이다. CD4는 T-헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포의 마커이다. 이러한 T-세포의 제거는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD) 합병증에 의해 야기되는 위험성을 감소시키거나 제거하는 것에 의해 골 이식편 재료의 안전성을 향상시키게 된다. 하기 표 2에 제공된 데이터에서 볼 수 있는 바와 같이, 도 6에 대하여 상기한 바와 같이 수행된 3회의 세척 주기 후에는 CD4+ 세포가 골 이식편 재료에서 검출되지 않았다. 이와 같은 경우에서, 3회의 세척 후 전체 백혈구 중 97 % 초과가 골 이식편 재료로부터 제거되었으며, 3회의 세척 주기 후 골 이식편 재료에서 CD4+ 발현 세포는 검출되지 않았다.
<표 2>
실시예 6: 골 이식편 재료 골생성 특성의 유지
실시예 5에서 기술된 세척 프로토콜은 골 이식편 재료의 골생성 특성에 유의성 있는 영향을 주지 않았다. 여기에서는, 골 이식편 재료에 존재하는 세포의 트리판 블루 염색을 수행한 후, 이어서 세포 계수 및 유동 세포측정법을 수행함으로써, 실시예 5에서 기술된 세척 단계 동안의 골생성 세포의 상실을 측정하였다.
도 7은 각 세척 단계에 따른 바람직한 세포 (CD44+)의 부수적인 상실을 도시한다. CD44+ 세포는 각 세척에 따라 총 세포 (예컨대 CD44+, CD90+ 및 CD45+ 세포)와 대략 동일한 속도로 상실되었다.
도 8은 각 세척 단계에 따른 중간엽 줄기 세포 (CD90+ 세포)의 상실을 도시한다. 각 세척 단계에 따라 MSC 중 대략 17 %가 상실되었다. 3회의 세척 단계가 골 이식편 재료로부터 백혈구를 제거하면서도 MSC 및 골세포와 같은 바람직한 세포의 최대 수를 유지하는 데에 적절한 것으로 확인되었다.
실시예 7: 6명의 다른 공여자로부터의 골 이식편 재료에서의 세포 유지
앞서 기술된 트리판 블루 방법 (예컨대 염색에 의한 1:1 세포 희석 및 혈구계에서의 계수)을 사용하여, 6명의 서로 다른 인간 공여자로부터 제조된 골 이식편 재료의 세포 유지를 평가하였다. 각 골 이식편 재료는 본질적으로 실시예 1에 따라 제조하였다.
전체적으로, 제조된 각 골 이식편 재료에 있어서, 상당한 수의 바람직한 골생성 세포가 유지되었다. 골 이식편 재료에서의 세포의 유지는 골 이식편 재료 그램 당 4백2십만개 세포 내지 골 이식편 재료 그램 당 5천2백만개 세포의 범위였으며, 전체 평균은 골 이식편 재료 그램 당 1천9백만개의 총 세포였다. MSC는 골 이식편 재료의 총 세포 중 평균 10.7 %를 나타내었으며, 평균 MSC 세포 계수는 골 이식편 재료 그램 당 1백7십만개의 MSC이었다.
흥미롭게도, 시험된 6명의 공여자 중 2명이 57세 연령이었다. 상기 2명의 공여자들은 나머지 4명의 공여자와 비교하였을 때 더 낮은 전체 세포 계수 및 더 낮은 줄기 세포 계수 (표 3 참조)를 나타내었다. 따라서, 골 이식편 재료 그램 당 총 세포 수 및 MSC에 있어서의 연령 상관 감쇠가 예상되었으며, 이에 따라 골 이식편 재료를 위한 공여자의 최대 연령은 연령 55세 이하가 되도록 권장하였다.
<표 3>
실시예 8: 냉동보존 및 해동 후 골 이식편 재료로부터의 생존가능한 세포의 회수
냉동보존 및 해동 후 골 이식편 재료에서 유지되는 생존가능한 세포의 수를 최대화하기 위하여, 냉동보호제에서의 골 이식편 재료의 다양한 인큐베이션 시간을 평가하였다. 여기에서는, 10 내지 60분의 인큐베이션 시간이 속도 조절 냉동 단계를 개시하기 전의 골 이식편 재료로의 냉동보호제의 침투를 가능케 하는 것으로 평가되었다.
냉동보존제로서 소 태아 혈청 (FBS) 중 10 % 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 사용하여 실온에서 골 이식편 재료의 샘플을 인큐베이팅하였다. 10 내지 60분 사이로 샘플을 인큐베이팅한 후, -80 ℃로의 냉동을 위하여 이소프로판올 냉동보존 자로 옮겼다. 샘플을 냉동시키고 이어서 실온으로 해동한 후, 세포 계수기 (예컨대 넥셀롬 셀로미터(Nexcelom CelloMeter) 기기)를 사용하여 각 샘플 중 세포를 계수하고, 살아있는 세포 및 사멸된 세포를 염색하거나, 또는 형광 알칼리 포스파타제 검정 (바이오비전(BioVision) K422-500)을 사용하여 평가함으로써, 살아있는 세포를 검출하였다.
결과 (표 4에 제공되어 있음)는 냉동보존제 중에서의 10분의 인큐베이션 기간이면 골 이식편 재료에의 냉동보호제의 침투를 가능케 하는 데에 충분하다는 것을 나타내었다. 이와 같은 특별한 제제를 사용한 더 오랜 인큐베이션은 아마도 DMSO 독성으로 인하여 생존가능한 세포의 상실을 초래하는 것으로 보였다.
<표 4>
표 4의 데이터는 두 가지 상이한 방법 (예컨대 셀로미터 대 알칼리 포스파타제 검정)을 사용할 때 골 이식편 재료 그램 당 총 세포 계수가 동일하지 않기는 하지만, 60분 동안 냉동보호제로서 10 % DMSO가 존재한 경우에도 골 이식편 재료로부터의 전체 생존가능한 세포 중 59 % 초과가 MSC라는 것을 나타내었다. 10 % DMSO 중에서의 더 짧은 인큐베이션의 경우, 골 이식편 재료로부터의 생존가능한 MSC의 백분율이 거의 70 %에 달하였다. 이에 따라, 10 % DMSO 중에서의 10분 냉동보존 처리이면 추가 연구에 충분한 것으로 간주하였다.
실시예 9: 냉동보존 시약의 최적화
본 실시예에서는, 냉동보존 용액 중 DMSO의 농도를 변화시킴으로써, 해동된 골 이식편 재료에서의 바람직한 세포 (예컨대 골회복 세포)의 최대 수를 유지하면서도의 골 이식편 재료를 위한 냉동보호제의 최적 농도를 확인하였다.
여기에서는, 해동 후 세포 생존율에 대한 영향을 평가하기 위하여, 소 태아 혈청 (FBS) 중 DMSO의 농도를 5 %에서 20 %까지 변경하였다. 실시예 8에서와 같이, 셀로미터 살아있는 세포/사멸된 세포 계수 및 알칼리 포스파타제 검정을 사용하여 각 골 이식편 재료의 해동 후 세포 계수를 측정하였다.
결과를 도 9에 제공하였는데, FBS 중 10 % DMSO가 골 이식편 재료를 위한 최적의 해동-후 세포 생존율을 제공한다는 것을 나타내었다.
실시예 10: 골 이식편 재료에서의 내생 골 형태형성 단백질 (BMP)의 검출
골 형태형성 단백질 (BMP)은 TGF-β 성장 인자 계열의 구성원으로, 골 성장을 능동적으로 자극하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Linkhart et al., Bone, (1996) 19(1)1S-12S] 및 [Chen et al., Growth Factors, (2004) 22(4)233-41] 참조). 검출가능한 수준의 1종 이상 BMP를 함유하는 골 이식편 재료는 대상체에서의 이식 후에 골 복구 및 성장을 촉진하는 데에 특히 유용할 것으로 예상된다.
여기에서는, R&D 시스템즈(Systems)의 표준화된 효소 연관 면역흡착제 (ELISA)를 이용하여, 본질적으로 실시예 1에 따라 제조된 골 이식편 재료에서 BMP-2 (DBP200), BMP-4(DBP400) 및 BMP-7(DBP700)을 정량하였다. 비교용으로는, 이전에 알로소스(AlloSource)에서 시험되었던 탈미네랄화된 해면체 골로부터의 데이터가 제공된다. ELISA 결과를 하기 표 5에 제공하였다.
<표 5>
골 이식편 재료 및 탈미네랄화된 해면체 골 모두에서 유사한 수준의 BMP-7이 검출되었다 (4291 대 5257 pg/그램). 그러나, BMP-2 및 BMP-4 양자는 탈미네랄화된 해면체 골에 비해 골 이식편 재료에서 더 높은 수준으로 검출되었다. 공여자마다 BMP 수준이 가변적일 것으로 예상되기는 하지만, 본 개시내용의 골 이식편 재료는 일단 대상체에 이식되고 나면 새로운 골 성장을 촉진할 수 있는 내생 BMP를 상당한 검출가능 수준으로 함유한다.
실시예 11: 세포성 골 이식편 재료에서의 골생성 세포의 검출 - 정성 조절 검정
바이오비전 키트 K422-500을 사용하여 검정법을 개발함으로써, 골 이식편 재료에서 살아있는 세포의 존재를 측정하여, 예를 들면 -80 ℃에서의 저장 전 또는 해동-후에 골생성 세포에 대하여 골 이식편 재료의 배치를 검정하는 데에 사용될 수 있는 정성적 알칼리 포스파타제 검정을 확립하였다. 이와 같은 실험은 세포 배양 계승 또는 장기간의 배양 시간에 대한 필요성이 없이 알칼리 포스파타제를 검출하도록 설계되었다. 골 이식편 재료는 해동 후에 바로 시험되며, 골 이식편 재료에서의 알칼리 포스파타제의 검출은 골 이식편 재료 중 골생성 세포의 존재를 입증해주었다. 이와 같은 실험에서는, 3종의 비-식별 골 이식편 재료를 시험하였다 (예컨대 서로 다른 공여자들).
K422-500형광 키트는 높은 감도를 필요로 하는 검정에 유용하다. 희석된 골 이식편 재료의 샘플에서 신호 포화가 관찰되었는데, 골 이식편 재료의 생존가능한 세포 계수가 매우 높기 때문이다. 그러나, 골 이식편 재료의 1:110 희석물 및 5분의 인큐베이션 단계를 사용하였을 때, 만족스러운 결과가 수득되었다. 살아있는 세포를 검출하기 위한 알칼리 포스파타제 검정의 결과를 하기 표 6에 제공하였다.
<표 6>
덜 민감성인 검정 (예컨대 바이오비전 키트 K420-500)도 골 이식편 재료의 배치에서 골생성 세포의 존재를 측정하는 데에 이용될 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간에는 더 높은 희석율의 골 이식편 재료 (예컨대 1:200 또는 1:500)가 유용할 수 있으며, 일부 골 이식편 재료에 대해서는 더 긴 인큐베이션 시간과 증가된 골 이식편 재료 희석율의 조합이 필요할 수도 있다. 표준 곡선 회귀는 R2 = 0.9934이었다.
실시예 12: 세포성 골 이식편 재료의 제조를 위한 대안적인 프로토콜
하기는 대상체에서 골 이식편 이식물로 사용하기에 적합한 골 이식편 재료를 제조하기 위한 대안적인 대표적 프로토콜이다.
실시예 1에서 제시된 방법에 따라 해면체 골을 제조하였다. 비-탈미네랄화된 피질 골 분말 (예컨대 비-탈미네랄화된 피질 골 구성요소)도 본질적으로 실시예 1에서 제시된 바와 같이 제조하였다. 바인더를 함유하는 두 가지 서로 다른 제제를 시험하여, 취급 및 세포 생존율의 개선에 대하여 평가하였다.
제제 A의 경우, 4 그램의 소듐 알기네이트 분말을 16 ml의 DMEM-F12 중에서 30분 동안 수화시킴으로써, 젤 또는 검 농밀도를 수득하였다. 이어서, 상기 소듐 알기네이트 검을 72 % 해면체 골 및 8 % 비-탈미네랄화된 피질 골에 첨가하여, 4 % 알긴산의 최종 농도를 형성시켰다. 상기 3종의 구성요소를 잘 혼합하여 골 이식편 재료를 형성시키고, 원하는 형상 (예컨대 구체)으로 성형하였다. 다음에, 상기 골 이식편 재료를 10 ml FBS/10 % DMSO의 냉동보존 용액 중에서 20분 동안 인큐베이팅한 후, -80 ℃까지의 속도 조절 냉동보존에 골 이식편 재료를 적용하였다 (예컨대 프로콘드릭스 냉동-자 사용).
제제 B의 경우, 4 그램의 소듐 알기네이트 분말을 16 ml의 냉동보존 용액 (FBS/10 % DMSO)을 사용하여 20분 동안 바로 수화시킴으로써, 젤 또는 검 농밀도를 수득하였다. 이어서, 상기 소듐 알기네이트 검을 72 % 해면체 골 및 8 % 비-탈미네랄화된 피질 골에 첨가하여, 4 % 알긴산의 최종 농도를 형성시키고, 그것을 동일한 냉동보존 용액 (FBS/10 % DMSO) 중에 5분 동안 침지시켰다. 상기 3종의 구성요소를 잘 혼합하여 골 이식편 재료를 형성시키고, 원하는 형상 (예컨대 구체)으로 성형하였다. 다음에, 상기 골 이식편 재료를 냉동보존 용액 중에서 10분 동안 인큐베이팅한 후, -80 ℃까지의 속도 조절 냉동에 적용하였다.
먼저, 평가를 위하여 서로 다른 인간 공여자로부터의 2종의 골 이식편 재료를 제조하였다. 제제 A 및 B 역시 3중으로 시험하였다. 결과를 하기 표 7에 제공하였다.
<표 7>
표 7의 데이터에서 나타난 바와 같이, 냉동보존제의 존재하 또는 부재하 중 어느 하나에서 알기네이트를 사용하여 골 이식편 재료를 사전-수화하는 것 (즉 제제 A)이 서로 다른 골 이식편 재료들의 세포 생존율에 영향을 주지는 않았다.
다음에, 본원에서 이미 개시된 세포 염색 및 유동 세포측정법을 사용하여, 냉동보존-전 및 -후 양자에, 제제 A를 통하여 제조된 골 이식편 재료에 존재하는 총 세포 생존율 및 세포 군집을 특성화하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
<표 8>
표 8의 데이터에서 나타난 바와 같이, 제제 A (사전-수화 알기네이트 제제)를 사용하여, 22 %의 세포 생존 백분율을 수득하였다.
전체적으로, 골세포의 백분율은 냉동보존 -전 및 -후 측정 사이에서 총 생존가능한 세포 계수 기준 50 % 초과까지 저하하였다. 반면, 골 이식편 재료에서의 생존가능한 MSC의 백분율은 알기네이트를 사전-수화하는 제제 A를 사용할 경우 냉동보존 -전 및 -후 측정 사이에서 거의 100 %까지 증가하였다.
본원에서 개시되는 세포 염색 및 유동 세포측정법을 사용하여, 속도 조절 냉동 전에 30분 또는 60분 중 어느 하나인 냉동보호제 용액 인큐베이션 기간을 사용하는 제제 B를 통하여 제조된 골 이식편 재료의 총 세포 생존율도 특성화하였다. 또한, 냉동보호제 용액 중에서의 인큐베이션 (30 또는 60분) 후 및 속도 조절 냉동 전에 냉동보호제 용액이 골 이식편 재료로부터 경사분리되는 반-건조 냉동보존 방법도 시험하였다.
60분 동안 냉동보호제 용액 중에서 인큐베이팅되거나, 또는 60분 동안 냉동보호제 용액 중에서 인큐베이팅된 후 반-건조 냉동보존 (즉 냉동보호제 용액 중에서의 인큐베이션 후 골 이식편 재료로부터의 냉동보호제 용액의 경사분리)이 이어진 골 이식편 재료의 해동-후 세포 생존력은 반-건조 냉동보존 단계가 있거나 없는 냉동보호제 용액 중에서의 30분의 인큐베이션 기간과 비교하였을 때, 세포 생존율의 적어도 배가를 초래하는 것으로 밝혀졌다.
기술된 시스템의 모든 특징들은 필요한 변경을 가하여 기술된 방법들에 적용가능하며, 그 반대도 마찬가지이다. 기술된 조성물 및/또는 키트의 모든 특징들은 필요한 변경을 가하여 기술된 방법들에 적용가능하며, 그 반대도 마찬가지이다.
본 출원에서 논의된 모든 특허 출원, 과학 잡지 논문, 서적, 문헌, 및 기타 출판물 및 자료들은 모든 목적에 있어서 그 전체가 의거 참조로 포함된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 분명하게 달리 나타내지 않는 한, 그 범위의 상위 및 하위 한계 사이의 각 개재 값 역시 하위 한계의 단위 또는 값의 최소 분율까지 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급 값 또는 개재 값과 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급 또는 개재 값 사이의 어떠한 포괄되는 범위도 개시되는 것이다. 상기 더 작은 범위의 상위 및 하위 한계는 독립적으로 그 범위에 포함되거나 배제될 수 있으며, 더 작은 범위 내에 양 한계 중 어느 하나가 포함되거나 어느 것도 포함되지 않거나 모두가 포함되는 각 범위 역시 언급된 범위 내의 기술, 임의의 구체적으로 배제되는 한계의 대상, 값 또는 포괄 범위 내에 개시되어 포괄되는 것이다. 언급된 범위가 한계들 중 하나 또는 양자를 포함하는 경우, 그 포함되는 한계들 중 어느 하나 또는 양자를 배제하는 범위 역시 포함된다.
본 개시내용의 도면 및 상세한 설명이 개시내용의 분명한 이해에 적격인 요소들을 예시하기 위하여 단순화되었다는 것이 이해되어야 한다. 도면은 해설도로서가 아니라 예시 목적으로 제공된 것임을 알아야 한다. 생략된 세부사항 및 변형 또는 대안적인 실시양태들은 관련 기술분야 통상의 기술자의 영역에 속한다.
본 개시내용의 특정 측면에서는, 요소 또는 구조를 제공하거나 주어진 기능 또는 기능들을 수행하기 위하여, 단일 구성요소가 다수의 구성요소로 대체될 수 있으며, 다수의 구성요소가 단일 구성요소로 대체될 수 있음을 알 수 있다. 그와 같은 대체가 특정 실시양태를 실시하는 데에 실효가 없게 되는 경우 이외에, 그와 같은 대체는 본 개시내용의 영역에 속하는 것으로 간주된다.
본원에서 제공된 예들은 본 발명의 잠재적인 구체적 실시양태들을 예시하고자 하는 것이다. 예들이 주로 관련 기술분야 통상의 기술자에 대한 예시 목적으로 의도된 것임을 알 수 있다. 본 발명의 기술사상에서 벗어나지 않고도, 본원에서 기술되는 해당 도표 또는 작용에 대하여 변형이 있을 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에서는, 방법 단계 또는 작용이 다른 순서로 수행 또는 실행될 수 있거나, 또는 작용이 첨가, 삭제 또는 변형될 수 있다.
도면에서 도시되거나 상기에서 기술된 구성요소들의 다른 배열은 물론, 도시되거나 기술되지 않은 구성요소 및 단계들이 가능하다. 마찬가지로, 일부 특징 및 하위-조합은 유용해서, 다른 특징 및 하위-조합에 대한 언급 없이도 사용될 수 있다. 본 발명의 측면 및 실시양태들은 제한 목적이 아니라 예시를 위하여 기술된 것으로, 본 특허의 판독시, 대안적인 실시양태들이 떠오르게 될 것이다. 따라서, 본 발명이 상기에서 기술되거나 도면에서 도시된 실시양태로 제한되는 것은 아니며, 하기 청구범위의 영역에서 벗어나지 않고도 다양한 실시양태 및 변형들이 이루어질 수 있다.
대표적인 실시양태들이 예에 의해, 그리고 이해의 명료성을 위하여 다소 상세하게 기술되기는 하였지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다양한 변형, 개조물, 대안적인 구성체, 등가물 및 변화들이 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 영역은 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.
Claims (1)
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