JP5951172B2

JP5951172B2 - 骨移植片組成物

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Publication number: JP5951172B2
Application number: JP2009506715A
Authority: JP
Inventors: コナー，ジェローム; キウ，キン−キン
Original assignee: LifeCell Corp
Current assignee: LifeCell Corp
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-17
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2027-04-17
Also published as: WO2007124302A2; US20070248575A1; EP2007196A2; AU2007240510A1; AU2007240510B2; WO2007124302A3; CA2646487A1; ZA200809010B; EP2007196B1; JP2009534125A; ES2652025T3; EP2007196A4

Description

本発明は組織工学に関し、さらに、特に骨組織の再形成に関する。

骨は、新生骨の形成による治癒が可能であるという点で、脊椎動物の組織の中で独特である。他の組織、例えば筋肉、心臓および脳は、結合組織で置き換えることにより治癒するが、結果として瘢痕が形成される。骨格組織の再生は、３つの成分：細胞、成長因子、および許容状態の（permissive）スカフォールドの間の複雑で動的な相互作用の結果である。骨誘導性スカフォールドは、患者の幹細胞の造骨細胞への動員、分化および成熱に影響を与えることにより、新骨形成を誘導することができる。

本発明者らは、無細胞性組織基材(ATM)の断片と脱ミネラル化骨基材(DBM)の断片の水和混合物を乾燥して骨移植片組成物(BGC)を形成することができ、このBGCが水和した場合に骨誘導性であることを見出した。さらに、本発明者らは、BGCが保存(例えば、長期保存)下で骨誘導性を保持することを観測した。従って、本発明は、BGCの調製方法、BGCを使用した治療方法、およびBGCを含む製造物品を提供する。

さらに具体的には、本発明は、骨移植片組成物(BGC)の調製方法を提供する。本方法は、以下の工程：(a)無細胞性組織基材(ATM)の断片(例えば、複数の断片)を脱ミネラル化骨基材(DBM)の断片(例えば、複数の断片)と混合して混合物を作製し、この際混合物中のATMの断片とDBMの断片は実質的に水和している、工程；および(b)BGCが水和したときに骨誘導性となるように、混合物を乾燥してBGCを形成する工程を含む。ATMの断片は粒子(例えば、均一な大きさの粒子)であることができ、DBMの断片は粒子(例えば、均一な大きさの粒子)であることができる。混合物は半固体のパテであることができ、乾燥する前に、半固体のパテを付形(造形、成形、shaping)することができる。ATMは、真皮(または筋膜組織、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靱帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経接合組織、膀胱組織、尿管組織、もしくは腸管組織)であるか、これらを含むことができ、これらからは全てのまたは実質的に全ての生細胞が除去されている。ATMはヒト組織または非ヒト哺乳動物(例えば、ブタ)の組織から調製することができ、非ヒト哺乳動物は遺伝子操作を行ってα-1,3-ガラクトシル残基の発現を欠失させることができる。遺伝子操作を行った哺乳動物は、機能性α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失し得る。さらに、DBMは、上掲の任意の哺乳動物から調製することができる。乾燥工程には例えば凍結乾燥が含まれ得る。また、本方法は、例えば、γ線、X線、電子線、または紫外線でBGCを照射する工程をさらに含むことができる。BGCは、6 kGy〜30 kGyの放射線を吸収するように照射することができる。BGCを照射するよりも、またはBGCの照射に加えて、乾燥する前に上述の任意の種類および量の放射線を用いてその混合物を照射することができる。本発明は上記方法により調製されたBGCも特徴とする。

本発明の別の態様は治療方法である。この方法は、以下の工程:(a)改善または修復を必要とするレシピエント臓器または組織を有する哺乳動物の対象を特定する工程；および(b)臓器または組織の中または表面に本発明のBGC(上記参照)を配置する工程を含む。BGCは、支持構造デバイス（supportive structural device）により所定位置に保持することができる。BGCを調製する前の混合物は、半固体のパテであってもよく、乾燥する前に、半固体のパテを付形してもよい。レシピエント組織または臓器は、皮質骨または海綿骨であり得る。

本発明は、(a)本発明のBGC(上記参照)；および(b)包装材料、または治療方法の説明を含む添付文書を含む製造物品も提供する。治療方法は、(i)改善または修復を必要とするレシピエント臓器または組織を有する哺乳動物の対象を特定する工程；および(ii)臓器または組織の中または表面にBGCを配置する工程を含むことができる。

本発明の別の実施形態は、(a)DBMの断片(例えば、複数の断片)；(b)ATMの断片(例えば、複数の断片)；および(c)包装材料、またはBGCを調製する方法の説明を含む添付文書を含むキットである。この調製方法は、(i)ATMの断片をDBMの断片と混合して混合物を作製し、この際混合物中のATMの断片およびDBMの断片は実質的に完全に水和している、工程；および(ii)水和したときにBGCが骨誘導性となるように、混合物を乾燥してBGCを形成する工程を含む。

特に言及しない限りは、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明に関連する分野において通常の知識を有する者（当業者）によって通常理解されている意味と同様の意味で用いている。好ましい方法および材料については以下に記載するが、本明細書に記載されているものと同様もしくは等価の方法および材料も、本発明の実施および試験に使用できる。本明細書に記載している全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、参照としてそれらの全体を取り入れておく。本明細書に開示している材料、方法および実施例は例示であり、制限するためのものではない。

本発明のその他の特徴および利点(例えば、骨欠損の修復方法）については、以下の記載、図面および特許請求の範囲から明らかである。

本発明において提供される材料および方法は、損傷または欠損した骨組織に移植して損傷または欠損した骨組織の修復を促進することができる骨移植片組成物(BGC)を調製するのに使用できる。本明細書において使用する用語「骨移植片組成物」とは、a)無細胞性組織基材(コラーゲン含有組織から調製される)および脱ミネラル化骨基材から調製され；b)長期保存用に脱水され；c)長期保存中でさえも、それが調製された天然のコラーゲン含有組織および天然の骨組織の、ほとんどの、最適には全ての生物学的機能を保持する材料である。

本明細書に記載の「骨移植」は、骨または骨の切断部における、骨欠損、例えば、空隙、穴（hole）、または空間の中、表面もしくは周りにまたは隣接して、骨または骨形成材料を配置して治癒を助ける処置である。骨は、有機成分（コラーゲン繊維、脂質、ペプチド、糖タンパク質、多糖およびクエン酸塩が含まれる）と無機成分（リン酸カルシウム、炭酸塩、ならびにナトリウム、マグネシウムおよびフッ化物の塩が含まれる）の両方からなる基材中に包埋（embed）される細胞で構成される高密度で多相の材料、すなわち「複合材料（composite）」である。三次元スカフォールドを提供することによって骨移植片材料は機能することができ、欠落している骨を一時的に置換し、また、骨組み（この骨組みに向かってまたはここから宿主の骨および血管網が再生し、治癒することができる）を提供する。さらに、骨移植片材料は、それらが造骨細胞と相互作用する能力に応じていくつかの方法で骨の修復を促進することができる。

骨伝導性（osteoconductive）材料は、移植片の辺縁部における「クリーピング置換（creeping substitution）」により、血管新生および移植片浸潤（graft infiltration）を促進するスカフォールドを提供する。骨伝導性材料は、移植部位に依存しており(すなわち、それらは骨の中または表面に移植された場合にのみ新骨形成を開始する)、新生骨の支持体としてのみ機能して骨中の欠損部位を架橋する。これに対し、骨誘導性材料は、それらがレシピエント自身の多能性幹細胞を刺激して骨芽細胞および破骨細胞などの機能性の骨形成原細胞を分化させる能力により区別される。従って、骨誘導性材料は移植部位に本質的に依存せずに新骨成長を開始することができる、すなわち、骨誘導性材料は、中または表面に配置されている骨を含む任意の組織においても骨形成を誘導することができる。本発明において提供されるBGCは、長期保存下で骨誘導性を保持し、それ自体が種々の骨障害の治療に有用である組成物である。

I.BGC成分
本発明において提供されるのは骨移植片組成物(BGC)である。骨移植片組成物(BGC)は、無細胞性組織基材(ATM)成分および脱ミネラル化骨基材(DBM)成分を含む。

無細胞性組織基材
本明細書において使用する「無細胞性組織基材」(「ATM」)とは、全てのまたは実質的に全ての生細胞、および好ましくは検出可能な全ての細胞成分ならびに/または細胞を殺すことによって生じた残渣を除去することにより広範なコラーゲン含有組織から調製される組織由来の構造物である。本明細書において使用する「実質的に全ての生細胞」を欠くATMとは、生細胞の濃度が、ATMを調製する前の組織または臓器中の生細胞の濃度の1％未満(例えば、0.1％；0.01％；0.001％；0.0001％；0.00001％；0.000001％未満；または0.000001％未満)であるATMである。ATMはまた、好ましくは、死細胞および/または細胞成分を実質的に欠く。

本発明のATMは、上皮基底膜を有していても、または有していなくてもよい。上皮基底膜は、上皮細胞の基底面に接している細胞外物質の薄層である。凝集した上皮細胞の薄層は上皮を形成する。従って、例えば、皮膚の上皮は表皮と称され、皮膚の上皮基底膜は表皮と真皮との間に存在する。上皮基底膜は分化した細胞外マトリックスであり、上皮様細胞に障壁機能および付着表面（attachment surface）を提供するが、下にある組織(例えば、真皮)に重要な何らかの構造的または生化学的役割を付与するものではない。上皮基底膜に特有な成分には、例えば、ラミニン、コラーゲンVII型、およびニドゲンが含まれる。上皮基底膜に特有な時間的および空間的構造により、上皮基底膜は例えば真皮細胞外マトリックスから区別される。無細胞性基材の異種移植片レシピエントにおいて、抗体産生を誘起し得るおよび/または前に形成された抗体に結合し得る種々の種特異的な成分を上皮基底膜が含むことが多いという点で、ATM中に上皮基底膜が存在することは不都合であり得る。さらに、上皮基底膜は、細胞および/または可溶性因子(例えば、化学誘引物質)の拡散ならびに細胞浸潤に対する障壁として作用し得る。従って、ATM中の上皮基底膜の存在は、レシピエント動物におけるATMからの新しい組織の形成を著しく遅延させ得る。本明細書において使用する、上皮基底膜を「実質的に欠く」ATMとは、ATMの起源である対応する未処理組織が有する上皮基底膜の5％未満(例えば、3％；2％；1％；0.5％；0.25％；0.1％；0.01％；0.001％未満；または0.001％未満)を含む無細胞性組織基材である。

ATMは、それが調製される組織の生物学的特性および構造的特性を保持するが、これには細胞認識および細胞結合ならびに細胞伸展、細胞増殖、および細胞分化を支持する能力が含まれる。そのような機能は、非変性コラーゲン様タンパク質(例えば、I型コラーゲン)および種々の非コラーゲン様分子(例えば、インテグリン受容体などの分子、グリコサミノグリカン類(例えば、ヒアルロナン)などの高い電荷密度を有する分子またはプロテオグリカン類、あるいは他の接着因子に対するリガンドとして働くタンパク質)により提供される。有用な無細胞性基材により保持される構造的機能には、組織学的構造の維持、組織成分の三次元配置および物理的特徴（強度、弾力性、耐久性、特定の空隙率など）の維持、ならびに巨大分子の保持が含まれる。ATMの生物学的機能の効率は、例えば細胞(例えば、上皮細胞)増殖を支持する能力によって測定でき、ATMを調製した天然の組織または臓器が有する能力の少なくとも50％(例えば、少なくとも50％；60％；70％；80％；90％；95％；98％；99％；99.5％；100％；または100％より大きい)である。

ATMは、周囲の宿主組織と同一の組織から調製される必要はないが、細胞を侵入させるかまたは浸潤させることにより、簡単に再形成されやすくなければならない。このような細胞としては、関連する宿主組織の分化細胞、間葉性幹細胞などの幹細胞、または神経前駆細胞が挙げられる。基材によって上述の特性が保持されている限りは、ATMは、任意のコラーゲン含有軟組織および筋骨格(例えば、真皮、筋膜組織、心膜、硬膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靱帯、靱帯、血管組織(動脈および伏在静脈などの静脈)、神経接合組織、膀胱組織、尿管組織、または腸管組織)から調製できることは自明である。

場合により、本発明に有用なATMは、レシピエント自身のコラーゲンを基にした組織（collagen-based tissue）から調製できる。さらに、一般にATMはBGCのレシピエントと同種の1以上の個体から調製されるが、必ずしもそうとは限らない。従って、例えば、ATMはブタ組織から調製することができ、ヒト患者に移植ことができるBGCを調製するのにこれを使用できる。BGCのレシピエントおよびBGCのATM成分の調製のための組織または臓器のドナーとして使用できる種には、これらに限定されないが、ヒト、ヒト以外の霊長類(例えば、サル、ヒヒ、またはチンパンジー)、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスが含まれ得る。

ドナーとして特に関心が高い動物は、遺伝子操作を行って末端のガラクトース-α-1,3-ガラクトース部分を欠失させた動物(例えば、ブタ)である。適切な動物に関する記載は、同時係属中の米国特許出願公開第2005/0028228号明細書および米国特許第6,166,288号（これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく）を参照のこと。末端の二糖構造、ガラクトースα-1,3ガラクトース(「α-gal」)の形成を触媒する酵素UDP-ガラクトース:β-D-ガラクトシル-1,4-N-アセチル-D-グルコサミニドα-1,3ガラクトシル-トランスフェラーゼ(α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ；「α-GT」)を発現していないレシピエント動物(例えば、ヒト)における異種移植の重大な問題は、そのようなレシピエントにおける異種移植片の超急性拒絶である。この拒絶は、常にではないが、主に、異種移植片中の細胞表面上のα-galエピトープに特異的な抗体の作用によるものである。機能性α-GTを欠失しているか、または実質的に欠失しており、よってα-galエピトープも欠失しているか、または実質的に欠失しているトランスジェニック動物(例えば、ブタ)が得られている。

トランスジェニック動物、特に遺伝子を破壊されたトランスジェニック動物を作製する方法は当技術分野において周知である。遺伝子を破壊された動物を作製する方法には、ある種の個体の生殖細胞系列に、目的の遺伝子の破壊された形態を組み込むことが含まれる。遺伝子は、タンパク質産生物(例えば、α-GT)が産生されない、あるいは天然のタンパク質の活性を欠いているまたは実質的に欠いているタンパク質産生物が産生されるように破壊することができる。本明細書において使用する「実質的にα-GT活性を欠いている」α-GTタンパク質とは、野生型α-GTがα-galエピトープを生成する能力の5％未満(例えば、4％；2％；1％；0.1％；0.01％；0.001％未満；または0.001％未満)の能力を有するα-GTタンパク質である。遺伝子、特にα-GT遺伝子を破壊する方法は、当技術分野において既知であり、一般に、相同組み換えとして知られている手法がこれに含まれる。この手法においては、野生型遺伝子に配列を挿入することによって、遺伝子から転写物が産生されない；あるいはタンパク質が翻訳されない転写物が産生される；あるいは目的のタンパク質の機能活性を欠いているまたは実質的に欠いているタンパク質の合成を指示する転写物が産生されるように、野生型の目的遺伝子の１つのまたは両方のコピーを破壊することができる。このような構築体は、一般に、目的の遺伝子の全部または一部のゲノム配列を含み、そのゲノム配列内に、上述のうちの１つの方法で目的の遺伝子の発現を破壊する配列を含む。遺伝子の発現を破壊するのに用いる配列は、ゲノム中に構築体が組み込まれている標的細胞に抗生物質耐性(例えば、ネオマイシン耐性)を付与するタンパク質をコードする配列であり得る。このようなコード配列は、ゲノム中に遺伝子構築体が組み込まれている細胞のin vitroでの選別を容易にする。当技術分野において既知の追加の薬物選別手法は、構築体と標的遺伝子の少なくとも１つのコピーとの組み換えが発生した細胞を選択するのに使用できる。

遺伝子を破壊された動物を作製するいくつかの方法において、全能細胞(すなわち、胚の全ての細胞型を生じさせることができる細胞)を標的細胞として使用できる。そのような細胞には、例えば胚幹(ES)細胞(ES細胞株の形態)または受精卵(卵母細胞)が含まれる。目的の遺伝子の少なくとも１つのコピーが破壊されたES細胞の集団は好適な胚盤胞に注入することができ、その注入した胚盤胞を仮親に移植することができる。別の方法としては、目的の遺伝子を破壊する構築体を注入した受精卵を仮親に移植することができる。さらに、仮親に移植した卵母細胞は、除核して、首尾よく遺伝子を破壊されたES細胞からの核を注入した、またはこれと融合させた卵母細胞であってもよい[Campbell et al.,(1996) Nature 380: 64-66]。結果として得られる、そのような仮親の中で発生する変異を有する子孫は同定することができ、これらの元祖動物から、当業者に既知の育種手順および選抜手順を用いて異なる動物の系統を作製することができる。

標準的な、および遺伝子を破壊されたトランスジェニック動物は、遺伝子を破壊するために標的細胞として体細胞(例えば、胎児の繊維芽細胞)を使用して作製することもできる。そのような細胞は、例えばES細胞よりもはるかに速く増殖し、in vitroでの取り扱いが容易であるので、遺伝子破壊およびそれに続く遺伝子を破壊された細胞の選抜手順が容易になる。遺伝子を破壊された体細胞の系列がin vitroで選別されれば、遺伝子を破壊された体細胞からの核を全能細胞(例えば、ES細胞または卵母細胞)に組み込むことができ、次にこれらを上述のように取り扱う。核を移植する方法は当業者に既知であり、これには例えば細胞融合または核移植などの技術が含まれ得る。

通常、遺伝子破壊操作により、目的の遺伝子の１つの対立遺伝子のみが破壊される。この場合、トランスジェニック動物は、破壊された遺伝子のヘテロ接合体である。このとき、当業者によく知られているこのようなヘテロ接合体の育種手順および好適な選抜手順を、破壊された遺伝子のホモ接合体である動物を得るのに使用できる。当然のことながら、上述の遺伝子破壊操作により目的の遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊された場合には、このような育種手順は、必須ではない。

BGCの調製には、一般に、断片の形態(すなわち、粒子、糸または繊維)のATMを使用する(以下参照)。ATMは、任意の多様な方法で調製できる。必要なことは、ATMの調製に用いる工程により上述の生物学的および構造的特性を有する基材が得られるということである。特に有用な調製方法には、米国特許第4,865,871号；第5,366,616号；第6,933,326号ならびに同時係属中の米国特許出願公開第2003/0035843号明細書、および第2005/0028228号明細書（これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく）に記載されている方法が含まれる。

概説すると、ATMの調製に必要な工程には、一般に、ドナー(例えば、ヒトの死体または上掲の任意の哺乳動物)からの組織採取、組織を安定化し、生物学的および構造的機能を同様に保持する条件下で細胞除去と共にまたはこの前に生化学的および構造的分解が起こるのを回避するための化学処理が含まれる。ATMは、この場合も基材の上記生物学的および構造的特性を維持するのに必要な条件下で、場合により凍結保存剤で処理して凍結保存することができ、場合により凍結乾燥することができる。凍結または凍結乾燥後、組織を断片化（例えば微粉末または微粉化）して、同様の機能を保持する条件下で粒子状ATMを調製できる。全工程は、一般に、無菌、好ましくは滅菌条件下で行う。

ATMの例示的な調製方法は、米国特許第5,366,616号にさらに詳細に記載されており、以下にこれをまとめる。

組織は、ドナーから取り出した後、最初の安定化溶液中に入れる。最初の安定化溶液は、浸透性、低酸素性、自己分解性、およびタンパク質分解性の分解を阻止および防止し、微生物汚染から保護し、例えば平滑筋成分(例えば、血管)を含む組織で起こり得る物理的損傷を減少させる。安定化溶液は、一般に、適切な緩衝液、1種以上の抗酸化剤、1種以上の膨張剤、1種以上の抗生物質、1種以上のプロテアーゼ阻害剤、および場合により平滑筋弛緩薬を含む。

次に、組織を処理溶液中に入れ、基底膜コンプレックスまたはコラーゲン基材の生物学的および構造的完全性（integrity）を損傷することなく、構造基材から生細胞(例えば、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および繊維芽細胞)を除去する。処理溶液は、一般に、適切な緩衝液、塩、抗生物質、1種以上の界面活性剤、1種以上の架橋形成阻止剤（agents to prevent cross-linking）、1種以上のプロテアーゼ阻害剤、および/または1種以上の酵素を含む。組織の処理は、(a)ある濃度の活性剤を含む処理溶液を用いて(b)基材の構造的完全性が維持されるような期間内に行わねばならない。

組織から細胞質を除去した後、組織を凍結し(すなわち、凍結保存)、場合により凍結乾燥することができる。凍結前に、凍結保存溶液中で組織をインキュベートすることができる。この溶液は、一般に1種以上の抗凍結剤を含み、凍結中に起こり得る氷晶による構造基材の損傷を最小限に抑える。組織を凍結乾燥する場合、溶液は、乾燥中の構造的損傷を最小限に抑えるために一般に1種以上の乾燥保護成分も含み、また、凍結中に膨張もしくは収縮が起こらない有機溶媒と水との組み合わせを含み得る。抗凍結剤および乾燥保護剤は、同一の1種以上の物質であり得る。組織を凍結乾燥しない場合、滅菌容器中の組織を約-80℃の冷凍庫の中に置くことにより、または滅菌液体窒素中に沈めて、使用まで-160℃未満の温度で保存することにより、組織を凍結させることができる。サンプルは、例えば、滅菌非透過性容器（以下を参照）に入れた状態で約37℃の水浴中に浸す、または、周囲条件下で組織を放置して室温にすることにより、使用前に解凍することができる。

組織を凍結し、凍結乾燥する場合、凍結保存溶液中でインキュベーションした後、水蒸気に対しては透過性であるが細菌に対しては非透過性である滅菌容器（例えば水蒸気透過性のパウチまたはガラスバイアル）内に組織を封入することができる。好ましいパウチの片面は、医療用等級の多孔性Tyvek（登録商標）膜（DuPont社（Wilmington、DE）の商標製品）で構成される。この膜は水蒸気を透過させ、細菌および埃を通さない。Tyvek膜を非透過性ポリエチレンラミネートシートにヒートシールし、片面を開けたままにし、このようにして二面パウチにする。使用前に、開いているパウチを照射(例えば、γ線照射)により滅菌する。組織は、開いている側から無菌パウチ内に無菌的に入れる。次に、開いている側を無菌的にヒートシールしてパウチを閉じる。以後、封入された組織は、続いて行う処理工程を通して、微生物による汚染から保護される。

組織を入れた容器は、凍結による損傷を最小限に抑えるための特定の抗凍結剤に適合する特定の速度で低温に冷却する。適切な冷却プロトコールの例については、米国特許第,336,616号を参照のこと。次に、真空下、低温で組織を乾燥させ、各氷晶相（ice crystal phase）から順次水蒸気を除去する。

水蒸気透過性容器内でのサンプルの乾燥が完了した時点で、窒素、ヘリウムまたはアルゴンなどの乾燥不活性気体を用いて凍結乾燥装置の真空状態を解除する。同様の気体環境を維持しながら、半透過性容器を不透性（すなわち、水蒸気および微生物に対して非透過性である）容器（例えば、パウチ）の中に入れ、例えば加熱および／または加圧によってこれをさらに密封する。組織サンプルをガラスバイアル内で凍結し乾燥した場合には、バイアルは、適切な不活性栓を用いて真空下密封し、乾燥装置の真空状態は、バイアルを取り出す前に不活性気体を用いて解除する。いずれの場合においても、最終生成物は、不活性気体雰囲気下において密封される。凍結乾燥された組織は、断片化または、所望により再水和に供するまで冷凍条件下で保存することができる。

粒子状ATMは、一般に、1000ミクロン以下の最長寸法を有する球状のまたは不規則な形状を有する。粒子状ATMは、上述の生物学的および構造的機能を保持するような上述の任意の非粒子状ATMから調製できるが、このとき、特に、繊維末端の剪断を含むコラーゲン繊維に対する損傷を最小限に抑えるべきである。

粒子状ATMを調製するための適切な方法のひとつは、米国特許第6,933,326号（これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく）に記載されている。処理については、凍結乾燥皮膚ATMに関して以下に概説しているが、当業者であれば、その方法を本明細書に挙げているその他任意の組織由来の凍結または凍結乾燥ATMに容易に適用できるはずである。

無細胞性皮膚基材は、例えば、非断続性「連続」回転刃を取り付けたZimmer mesherを用いて細片にすることができる。次に、得られた長い細片を約1 cm〜約2 cmの長さに切る。ホモジナイザーおよび滅菌したホモジナイザープローブ（例えば、OMNI International、Warrenton、VAから市販されているLabTeck Macroホモジナイザー）を組み立て、ホモジナイザー装置に注入される滅菌液体窒素を用いて、極低温（すなわち、約-196℃〜約-160℃）に冷却する。ホモジナイザーが極低温に達したら、液体窒素が入ったホモジナイザー装置にATMの切片を加える。次に、ホモジナイザーを稼働させ、ATMの細片を極低温断裂させる。極低温断裂工程に要する時間は、使用するホモジナイザー、ホモジナイズ槽の大きさ、ならびにホモジナイザーを稼働させる速度および時間によって異なり、当業者であれば容易に判断できる。別の方法としては、極低温断裂処理は、極低温に冷却した低温ミル（cryomill）内で実施できる。

極低温断裂した粒子状ATMは、場合により、粒子径によって選別するが、そのような操作は、ホモジナイズ後の生成物を滅菌液体窒素で洗浄し、極低温に冷却した一連の金属ふるいに通すことによって行う。一般に、比較的目が大きいふるいを用いて所望しない大きな粒子を除去した後に、より目が小さい1以上のふるいにかけることが有用である。単離後、粒子を凍結乾燥することにより、操作中に吸着された全ての残留水分を確実に除去できる。一般に、最終生成物は、粉末（通常、白色または淡白色）であり、粒子径は、約1ミクロン〜約900ミクロン、約30ミクロン〜約750ミクロン、または約150〜約300ミクロンである。

ATM断片は繊維または糸であり得る。このような繊維または糸は、一般に、長さが5 cm以下(例えば、4.5 cm；4.0 cm；3.5 cm；3.0 cm；2.5 cm；2.0 cm；1.5 cm；1.0 cm；0.5 cm；0.25 cm；0.1 cm；0.05 cm；または0.02 cm以下)、最大幅が3 mm以下(例えば、2.5 mm；2.0 mm；1.5 mm；1.0 mm；0.5 mm；0.2 mm；0.1 mm；0.05 mm；0.02 mm；または0.01 mm以下)である。凍結または凍結乾燥ATMから繊維および糸を調製する方法は、当業者に明らかであり、また、これには凍結または凍結乾燥ATMを手動または機械で切断することが含まれる。

断片化ATMは、通常の生理食塩水または当技術分野において既知のその他任意の適切な再水和剤中に懸濁させることによって容易に再水和される。当技術分野において既知の任意の適切なキャリヤー（carrier）に懸濁させてもよい(例えば、参照として本明細書中に取り入れる米国特許第5,284,655号を参照)。高濃度（例えば、約600mg/mL）で懸濁した場合には断片化ATMは「パテ」を形成し、また、ある程度低い濃度（例えば、約330 mg/mL）で懸濁した場合には「ペースト」を形成し得る。上述の方法は、任意の形態の保存ATM、例えば、凍結乾燥した断片化ATMまたは凍結した断片化ATMに適用することができる。

ひとつの非常に適切な凍結乾燥ATMは、LifeCell Corporation(Branchburg、NJ)によってヒトの真皮から調製されたものであり、小さな薄片の形態でAlloDerm（登録商標）として市販されている。そのような薄片は、例えば、1cm×2cm、3cm×7cm、4cm×8cm、5cm×10cm、4cm×12cm、および6cm×12cmの大きさの長方形の薄片としてLifeCell Corporationにより市販されている。AlloDerm（登録商標）の凍結および乾燥に使用する抗凍結剤は、35％のマルトデキストリンおよび10mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の溶液である。従って、最終乾燥生成物は、約60重量％のATMおよび約40重量％のマルトデキストリンを含む。LifeCell Corporationは、AlloDerm（登録商標）と同様の割合でATMおよびマルトデキストリンを含有するブタ真皮由来の類似の製品（XenoDerm（商標））も製造している。さらに、LifeCell Corporationは、AlloDerm（登録商標）（上述）を極低温断裂することによって製造した粒子状無細胞性皮膚基材をCymetra（登録商標）という名称で市販している。Cymetraの粒子径は、質量測定から、約60ミクロン〜約150ミクロンの範囲である。粒子状もしくは微粉末（粉末）状ATMの粒子は、その最長寸法が1.0mm未満である。これより大きい寸法のATM細片は、非粒子状無細胞性基材である。

脱ミネラル化骨基材
本明細書において使用する「脱ミネラル化骨基材」(DBM)とは、全てのまたは実質的に全ての、無機鉱物成分を除去するように処理した骨を意味する。実質的に全ての鉱物成分を除去したDBMは、DBMを調製した骨に見出されるミネラル濃度の5％未満のミネラル濃度を有する骨基材である。脱ミネラル化に関与する抽出手順によって、骨基材から、全てのまたは実質的に全ての生細胞も除去される。実質的に全ての生細胞を除去したDBMは、DBMを調製した骨に見出される生細胞の濃度の1％未満(例えば、0.1％；0.01％；0.001％；0.0001％；0.00001％；0.000001％；または0.0％未満)の生細胞の濃度を有する骨基材である。

DBMの主なタンパク質成分は、骨基材の非ミネラル化（non-mineralized）成分の70〜90％を占めるコラーゲンである。他の非コラーゲン様マトリックスタンパク質の構成要素には、糖タンパク質(例えば、オステオネクチンおよびトロンボスポンジン）；プロテオグリカン（例えば、ビグリカンおよびデコリン）；シアロタンパク質（例えば、オステオポンチンおよび骨シアロタンパク質）；および骨Glaタンパク質（例えば、オステオカルシン）が含まれる。骨基材は、成長因子、様々な群のペプチドおよび小タンパク質が豊富であり、これらは、細胞の増殖、機能、および運動性に対するそれらの作用を通して新しい組織の形成を調節する。DBMは、通常、新しい骨または軟骨の形成を誘導する能力の高い多機能性の成長因子のファミリーである骨形成タンパク質(BMP)、ならびに骨成長の制御に重要な役割を担う形質転換成長因子-β1(TGF-β1)およびインスリン様成長因子-1(IGF-1)などの他の成長因子を含む。

DBMは、骨移植を成功させるのに重要な天然の骨のほとんどの、理想的には全ての、生物学的特性を有する。DBMは骨誘導性である。DBM中のBMPおよび他の成長因子は、間葉性幹細胞に、骨前駆細胞に分化して新骨成長を引き起こすシグナルを送る。従って、DBMにより、欠損の辺縁部のみではなく、修復を必要とする欠損全域にわたって、再生が起こる。DBMは、血管新生および骨芽細胞の侵入を支持するという点で、骨伝導性（osteoconductive）でもある。

DBMは、BGCのレシピエントと同一種の1以上の個体から調製できるが、BGCのレシピエントと異なる種の個体からも調製できる。従って、例えば、DBMは、ブタ組織から調製でき、これをヒト患者に移植し得るBGCの調製に使用する。BGCのレシピエントおよびDBMを調製するための組織または臓器のドナーとして使用できる種には、これらに限定されないが、ヒト、ヒト以外の霊長類(例えば、サル、ヒヒ、またはチンパンジー)、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスが含まれる。DBMは、遺伝子操作により末端ガラクトース-α-1,3-ガラクトース部分を欠失している動物(例えば、ブタ)から調製することもできる。このようなトランスジェニック動物の作製は上に述べた。

DBMは、長骨、頭蓋冠骨またはその他任意の種類の骨から調製できる。通常、DBMは、例えば、死後約24時間以内に採取したヒトの死体骨組織から得ることができる。採取は、ドナーおよびドナーの家族の詳細な病歴を検査した後に行われる。ドナーの血液は、種々の病原性の症状、例えば、A型肝炎抗体、B型肝炎ウイルス表面抗原、B型肝炎コア抗体、C型肝炎抗体、HIV-1および-2ウイルス抗体、HIV抗原（HIV direct antigen）、ヒトT細胞リンパ腫ウイルス-1/2抗体、梅毒、ならびに好気性および嫌気性細菌のためのマーカーについて検査する。周辺組織も、表面および延髄（medullary）の汚染について検査する。

DBMは種々の方法により調製できる。必要なことは、使用する方法により、上述の生物学的および構造的特性(上記参照)を有するDBMが調製されるということである。ヒト組織からDBMを調製する基準および指針は、米国薬局方および米国組織バンク協会により開発されている。基本的に、骨サンプルは、組織、血液および脂質を除去するように処理し、比較的均一な大きさに断片化し、酸による抽出により脱ミネラル化し、滅菌し、長期保存のために凍結乾燥する。

最初の試験の後、骨サンプルから軟組織を除去する。輸送するために、骨を抗菌剤、例えばバシトラシンおよびポリミキシンBの溶液中でインキュベートすることができる。次に、骨サンプルを、当業者に知られている方法、例えばのこぎりおよび粉砕機（grinder）を用いて小片に切断し、次に骨髄、血液および脂質を除去するように処理することができる。骨髄、血液および脂質を除去する典型的な手順には、70％エタノールまたはクロロホルム：メタノールの1:1の混合物中で、6時間室温にてインキュベートすることが含まれ得る。脱ミネラル化は、酸、例えば0.6 N塩酸で3〜24時間抽出することにより行うことができる。酸抽出により、カルシウム含有量が、脱ミネラル化していない骨基材中に見出されるカルシウム含有量の5％未満に減少する。骨のカルシウム含有量を測定する方法は、当業者に知られている。次に、サンプルを水ですすぎ、生物学的に適合性の緩衝液、例えば0.1 Mリン酸ナトリウム中で中和することができる。他の分別（differential）抽出手順には、例えば、骨誘導に対して阻害作用を有する恐れのある分子を除去するためのアルカリ-尿素（alkali-urea）による抽出[Behnam et al.(2004) Connective Tissue Research 45: 257-60]も含まれ得る。DBMは、米国特許第5,284,655号に記載されているようにも調製することができ、これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく。

BGCの調製のためには、一般に、断片の形態(例えば、粒子、繊維、および糸)のDBMを使用する(以下参照)。DBM断片は、種々の任意の方法により調製できる。必要なことは、その調製に用いた工程により、上述の生物学的および構造的特性を有する基材が得られるということである。このような手順は、凍結したまたは乾燥した(例えば、凍結乾燥した）ATMからATM断片を調製するのに用いた手順と同様である(上記参照)。DBM断片は、形状が不規則であってもよく、不均一なサイズ分布を有していてもよい。骨基材を好適な大きさの粒子にミル処理する工程は、調製中の幾つかの時点、例えば、脂質除去に続いてまたは酸抽出の後に行うことができる。ミル処理工程は、通常、標準的な粉砕機（grinder）または混合機（blender）を用いて行うことができ、湿った骨基材または乾燥した骨基材のどちらに対しても実施することができる。DBM繊維は、骨基材からの削りくず（shaving）として調製できる。DBMの粒子径は、一般に、粒子状ATMと同様である(上記参照)。例えば、DBM粒子の最長寸法は、50〜3000ミクロンの範囲；例えば、100〜250ミクロン；100〜500ミクロン；100〜850ミクロン；100〜1000ミクロン；100〜1500ミクロン；100〜2000ミクロン；100〜2500ミクロン；100〜3000ミクロン；125〜300ミクロン；125〜500ミクロン；125〜600ミクロン；125〜850ミクロン；200〜500ミクロン；200〜850ミクロン；200〜1000ミクロン；200〜1500ミクロン；200〜2000ミクロン；200〜3000ミクロン；500〜1000ミクロン；500〜1500ミクロン；500〜2000ミクロン；500〜2500ミクロン；500〜3000ミクロン；1000〜2000ミクロン；1000〜2500ミクロン；または1000〜3000ミクロンであり得る。特定の大きさの粒子は、市販のふるいを用いて得ることができる。DBM断片は、米国特許第5,284,655号および第5,510,396号に記載されているように調製することができ、これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく。

長期保存のために、断片化DBMを1サイクル以上の凍結乾燥に供することができる。凍結乾燥は、ATMについて記載したように行うことができる(上記参照)。滅菌は、DBMサンプルに対して、任意の標準的な方法、例えば、エチレンオキシド処理、γ線照射、電子線照射、X線照射、または紫外線照射を用いて行うことができる。

DBMは、任意のAATT組織バンク、例えば、LifeLink(Tampa、FL)、LifeNet(Virginia Beach、VA)またはAlloSource(Centennial、Colorado)を含む、市販供給源から得ることができる。DBMの例には、Accell DBM100(IsoTis OrthoBiologics、Irvine、California)、Accell Connexus(商標)(IsoTis OrthoBiologics、Irvine、California)、Allogro(AlloSource、Denver、Colorado)、AlloMatrix Putty(Wright Medical Technologies、Arlington、Tennessee)DBX(登録商標)Putty(Synthes、Paoli、Pennsylvania)、DynaGraft(商標)(GenSci Regeneration Sciences and Innova Technologies Corporation、Toronto、Ontario、Canada)、Grafton(商標)Allogenic Bone Matrix(Osteotech、Shrewsbury、New Jersey)、InterGro(商標)Putty(Interpore Cross International、Irvine、California)、Opteform(Exactech、Gainesville、Florida)、Optium(LifeNet、Virginia Beach、Virginia)、およびOsteofil(商標)(Regeneration Technologies、Alachua、Florida)が含まれる。

粒子状DBMの非常に好適な調製の１つは、AlloCraft DBM（商標）(LifeCell Corporation、Branchburg、NJ)により提供される。

II.BGCの調製
BGCの形成
本発明において提供されるBGCは、断片化ATMと断片化DBMの混合物である。断片化ATMと断片化DBMは、重量で、5％ATM：95％DBM〜95％ATM：5％DBMの範囲の任意の比、例えば、5％ATM：95％DBM；10％ATM：90％DBM；15％ATM：85％DBM；20％ATM：80％DBM；25％ATM：75％DBM；30％ATM：70％DBM；35％ATM：65％DBM；40％ATM：60％DBM；45％ATM：55％DBM；50％ATM：50％DBM；55％ATM：45％DBM；60％ATM：40％DBM；65％ATM：35％DBM；70％ATM：30％DBM；75％ATM：25％DBM；80％ATM：20％DBM；85％ATM：15％DBM；90％ATM：10％DBM、95％ATM：5％DBMで混合することができる。

任意の種類の断片化ATMと断片化DBMを混合することができる。従って、任意の形態の断片化ATM、例えば、粒子、糸または繊維を、任意の形態の断片化DBM、例えば、粒子、糸または繊維と混合することができる。1以上の種類の断片化ATMと断片化DBMを混合することもでき、例えば、断片化ATMはATMの粒子、繊維または糸の混合物を含んでいてよく、DBMはDBMの粒子、繊維または糸の混合物を含んでいてよい。異なる形態の断片化ATMと断片化DBMの任意の組み合わせを使用できる。従って、断片化ATMと断片化DBMの両方が凍結乾燥していてもよく、あるいは凍結乾燥した断片化ATMまたは凍結乾燥した断片化DBMのどちらかを、凍結した断片化ATMまたは凍結した断片化DBMと混合してもよく、あるいは断片化ATMと断片化DBMの両方が凍結していてもよい。

BGCの形成に使用する断片化ATM/断片化DBM混合物は、実質的に水和している。実質的に水和した混合物は、完全に水和した基材の20％〜70％、すなわち、少なくとも20〜30％の水分レベルを有することができる。完全に水和した基材は、その基材が大気圧下で含み得る最大量の結合水および非結合水を含む基材である。

本明細書において使用する実質的に水和した断片化ATM/断片化DBM混合物とは、関連する断片化ATM/断片化DBM混合物が完全に水和した場合に含む水の20％以上(例えば、20％；25％；30％；35％；40％；45％；50％；55％；60％；65％；70％以上)を含む。本明細書において使用する「完全に水和した断片化ATM/断片化DBM混合物」とは、その断片化ATM/断片化DBM混合物が大気圧下で含み得る最大量の結合水および非結合水を含む断片化ATM/断片化DBM混合物である。２以上の完全に水和した断片化ATM/断片化DBM混合物中の水(非結合および/または結合)の量を比較する際、任意の特定の組織から調製した断片化ATM/断片化DBM混合物中の最大量の水は断片化ATM/断片化DBM混合物の温度によって変化するので、２以上の断片化ATM/断片化DBM混合物の測定は同じ温度において行うことが当然重要である。断片化ATM/断片化DBM混合物中の結合水は、断片化ATM/断片化DBM混合物中の水の運動性を制限する、水分子と断片化ATM/断片化DBM混合物の分子との間の分子間相互作用(例えば、水素結合)および/または他の現象(例えば、表面張力および幾何学的制限)により、分子運動性(回転および並進)が(純粋なバルキー状態（pure bulky）と比較して)減少している断片化ATM/断片化DBM混合物中の水である。断片化ATM/断片化DBM混合物中の非結合水は、例えば体液などの希釈水溶液中のバルキー水と同じ分子運動特性を有する。本明細書において使用する「実質的に水和した断片化ATM/断片化DBM混合物」とは、同じ断片化ATM/断片化DBM混合物が完全に水和した場合に大気圧で含む非結合水および/または結合水の20％を超える(例えば、20％；25％；30％；35％；40％；45％；50％；55％；60％；65％；70％を超える)非結合水および/または結合水を大気圧で含む断片化ATM/断片化DBM混合物である。実質的に水和したおよび完全に水和した断片化ATM/断片化DBM混合物中の水量の測定は、同じ温度で行わなければならない。

本明細書において使用する用語「周囲温度」とは、2℃〜30℃(例えば、4℃〜10℃；4℃〜15℃；4℃〜25℃；4℃〜30℃；10℃〜15℃；10℃〜20℃；10℃〜25℃；10℃〜30℃；15℃〜20℃；15℃〜25℃；15℃〜30℃；20℃〜25℃；20℃〜25℃；20℃〜30℃；または25℃〜30℃)の温度を意味する。

凍結乾燥した断片化ATMについては、再水和中の浸透力および表面張力の影響を最小限に抑えることが重要である。再水和の目的は、細胞外支持マトリックスの選択的保存を増大させることである。適切な再水和は、例えば、最初に、相対湿度約100％の環境下、乾燥した断片化ATMをインキュベートし、次に、適切な再水和溶液に浸すことによって行うことができる。別の方法としては、事前のインキュベート無しに、高湿度環境下、乾燥した断片化ATMを直接再水和溶液に浸してもよい。再水和によってサンプルに浸透圧性損傷を与えてはならない。蒸気再水和では、理想的には、残留水分レベルが少なくとも15％に達し、液体（fluid）再水和では、断片化ATMの水分レベルは20％〜70％に達する。再水和させる断片化ATMに応じて、再水和溶液は、例えば、通常の生理食塩水、PBS、乳酸リンゲル液、または標準的な細胞培養培地であり得る。断片化ATMに対し、内因性コラゲナーゼ、エラスターゼ、または事前に除去した細胞の残留自己溶解活性を作用させる場合、再水和溶液に対する添加剤を調製し、プロテアーゼ阻害剤を加える。フリーラジカル活性が残留している場合、抗酸化剤およびフリーラジカルによる損傷を防御する酵素性薬剤を含む、フリーラジカルに対する防御剤を使用する。抗生物質を加えて細菌の混入を阻害してもよい。プロテオグリカン類、デキストランおよび/またはアミノ酸の形態の膨張剤を加え、再水和中に基材に生じる浸透圧による損傷を防いでもよい。乾燥サンプルの再水和は、本過程に特に適しているが、これは、再水和溶液の成分が迅速かつ均一に分布できるからである。さらに、再水和溶液は、特別な成分、例えば、アルカリホスファターゼを阻害し、続いて生じる石灰化を阻止するためのジホスホナート類を含む場合がある。再水和溶液には、再水和細胞外マトリックスを移植した後の血管新生および宿主細胞浸潤を刺激するための薬剤を加えてもよい。再水和および混合工程は、任意の順番で行うことができる。従って、断片化ATMおよび断片化DBMは別個に再水和させてから混合することも、混合してから再水和させることもできる。

断片化ATMと断片化DBMは、BGCの骨誘導性特性を維持する任意の方法で一緒に混合することができる。例えば、断片化ATMおよび断片化DBMをボウルまたは容器に入れ、へらで混合することができる。別の好適な混合方法は、２個のルアーロック式シリンジ中で断片化ATMおよび断片化DBMを往復運動させて、均質なパテを形成することである。

BGCの調製に使用する混合物の粘度は、基材成分の濃度に依存して変化し得る。基材を比較的低濃度で懸濁する場合、材料はペーストを形成し得る；より高濃度では、材料は半固体状パテを形成し得る。当業者であれば、十分に慣用の実験方法を用いて、所望する特定の粘度を有する混合物を得るための当該断片化ATMと当該断片化DBMの相対的比率を確立することができるであろう。

混合された断片化ATMと断片化DBM成分は、骨移植における使用に好適な形状に成型（mold）することができる。材料は、さらなる処理のために、シリンジに直接分割することができる。別の方法としては、混合物は、骨移植に使用するために都合のよい大きさまたは形状の任意の形態に成型または付形することができる。このような形状には、これらに限定されないが、薄片、立方体、直方体、円盤、くさび（wedges）、球、卵形、円筒、円錐、または多面体あるいは天然の骨の形状を模倣した任意の形態が含まれ得る。BGCは、適切な任意の天然または合成材料から調製したスカフォールド成分の周囲に成型または付形することもできる。

混合物は、骨誘導性を保持するような当技術分野において既知の任意の方法、例えば、空気乾燥、不活性ガス(例えば、窒素またはアルゴン)の雰囲気中またはこの気流下での乾燥、あるいは凍結乾燥により乾燥することができる。凍結乾燥は、当技術分野において使用される慣用的な技術であり(例えば、米国特許第4,619,257号；第4,676,070号；第4,799,361号；第4,865,871号；第4,964,280号；第5,024,838号；第5,044,165号；第5,154,007号；第6,194,136号；第5,336,616号；第5,364,756号；および第5,780,295号を参照のこと。これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく。)、好適な装置はLabconco(Kansas City、MI、USA)などの市販供給元から入手可能である。凍結乾燥では、昇華と呼ばれる工程により凍結した生成物から水または他の溶媒を除去する。昇華は、凍結した液体が液体状態を経ずに直接気体状態に変化する場合に起こる。当業者は、当技術分野における種々の凍結乾燥方法を熟知している[例えば、"A Guide to Freeze-drying for the Laboratory"-an industry service publication by Labconco,(2004)；およびFranks (1994) Proc.Inst.Refrigeration.91: 32-39を参照のこと]。凍結乾燥は、例えば、マニホールド、バッチ、またはバルク法を含む種々の任意の方法により達成することができる。

一般に、BGCは、移植または埋め込みの前に再水和させる。別の方法としては、BGCを事前の再水和なしに移植するかまたは埋め込むことができ、この場合、in vivoで再水和が起こる。再水和のために、BGCは、任意の生物学的適合性溶液、例えば、通常の生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液または標準的な細胞培養培地中でインキュベートすることができる。BGCは、BGCが完全に水和される、または、該BGCを調製した混合物と実質的に同じ量の水をBGCが取り込むのに十分な時間をかけて、溶液中でインキュベートする。一般に、再水和溶液中でのインキュベーション時間は、約2分〜約1時間（例えば、約5分〜約45分、または約10分〜約30分）である。再水和溶液は、場合により、所望する回数だけ、新しい溶液と交換することができる。このことは、水置換処理において使用する水置換剤のうちの1種以上が生体不適応性または毒性である場合に望ましい。一般に、インキュベーション温度は、周囲温度（例えば、室温）、または約15℃〜約40℃（例えば、約20℃〜約35℃）であり、BGCおよび再水和溶液が入った容器は、所望する場合、インキュベーション中穏やかに振とうさせることができる。再水和後、BGCは、移植に好適な形態にさらに成型または付形することができる。

再水和したBGCの粘度は、BGCに加えた液体（fluid）の量に依存して変化する。例えば、比較的多量の液体を加える場合、これを加えるとBGCはペーストを形成し得る；比較的少量の液体を加える場合、これを加えるとBGCは半固体状パテを形成し得る。当業者であれば、十分に慣用の実験方法を用いて、所望する粘度を有する再水和したBGCを得るために、加えるべき液体の当該BGCに対する相対量を確立することができるであろう。

BGCは、DBMが再水和によりペースト状またはパテ状組成物を形成する能力を向上させ得る1種以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12)の担体物質(例えば、一般にマルトデキストリンおよびポリヒドロキシル化合物)を含むことができる。一般に、BGCのATM成分はこの機能を提供し、本発明のBGCはそのような担体物質含まなくてもよい。BGCが担体物質を含む場合には、これらを(例えば、凍結乾燥によって)乾燥した混合物に加えてBGCを調製できる(上記参照)。従って、例えば、このような混合物を作製するのに使用するATM、DBM、またはATMの調製物とDBMの調製物の両方は、担体物質を含むことができる。別の方法としては、担体物質を、BGCの再水和の前、同時、または後にBGCに加えることができる。好適な担体物質、および特に好適なポリヒドロキシル化合物は、米国特許第5,284,655号および第5,510,396号に記載されており、これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく。

骨誘導性
本発明において提供されるBGCは、骨誘導性であり、すなわち、それは、骨形成幹細胞の動員を刺激することにより、レシピエントの骨組織中もしくは表面または非骨組織中もしくは表面における新骨形成を誘導することができる。本発明はいずれの特定の作用機序によっても限定されないが、骨成長は、一般に、骨の形成、維持および吸収にそれぞれ関与する３種の細胞型、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞により媒介される。BGCの骨誘導性は、当技術分野において既知の標準的な方法によって評価することができる。骨誘導性のためのin vivoとin vitroの両方のアッセイが開発されている。in vivoモデルには、免疫不全の動物モデル、例えばヌードラットまたはマウスの筋肉内部位にBGCを移植すること、あるいは骨格異常モデルにおいてBGCをアッセイすることが含まれ得る。移植部位において形成された骨の量は、骨形成骨芽細胞に豊富にある酵素、例えばアルカリホスファターゼのレベルを監視する、組織形態学的分析、カルシウム含有量の測定、または酵素学的アッセイを含む標準的な方法により評価することができる。in vitro細胞培養モデルを、骨誘導性の潜在能力を評価するのに使用することもできる。一定の細胞株、例えばSaos 2骨肉腫細胞は、骨誘導剤の存在下で培養した場合に増殖することが示されている。この増殖活性の指標は、BGCの骨誘導性の潜在能力と相関させることができる。

保存
脱水したBGCは、長期間、例えば1日間、2日間、5日間、1週間、2週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、9ヶ月間、1年間、2年間、3年間保存することができる。保存は、周囲温度でまたは冷蔵下であって、例えば、液体N₂中でまたは-80℃、-50℃、-20℃、-10℃、0℃、4℃、10℃、20℃、もしくは25℃であり得る。

場合により、BGCは、汚染微生物数を減少させるための処理に提供することができる。この処理は、BGC中の感染性の微生物のレベルを減少させることが期待される。本明細書において使用するBGC中の「実質的に全ての」微生物(例えば、細菌、菌類(酵母を含む)、および/またはウィルス)を不活化または殺すのに用いる処理は、BGC中の微生物のレベルを、処理前のBGC中のレベルと比較して少なくとも10倍(例えば、少なくとも100倍；1,000倍；10⁴倍；10⁵倍；10⁶倍；10⁷倍；10⁸倍；10⁹倍；または10¹⁰倍)に減少させる処理である。処理が成功したかを決定するのに、標準的な任意のアッセイ方法を用いてもよい。これらのアッセイには、微生物増殖、例えば人工の増殖培地上でのスワブサンプルの培養物を直接測定する技法、または定量PCRなどの分子検出法が含まれ得る。

BGCは、生存している細菌および/または菌類および/または感染性ウイルスのレベルを減少させる、またはこれを除去するために、γ線、X線、電子線、および/または紫外線(10 nm〜320 nm、例えば、50 nm〜320 nm、100 nm〜320 nm、150 nm〜320 nm、180 nm〜320 nm、または200 nm〜300 nmの波長)照射に暴露することができる。BGCが暴露される照射線量よりも、BGCにより吸収される線量が重要である。厚いBGCについては、一般に吸収量と暴露量は近いが、薄いBGCにおいては、暴露量は吸収量よりも高いことがある。さらに、特定の照射線量を低線量率で長時間(例えば、2〜12時間)にわたって施す場合には、高線量率で短時間(例えば、2秒〜30分間)施す場合に比べて多くの照射線が吸収される。当業者は、特定のBGCについて吸収量がBGCが暴露される量よりも顕著に少ないかどうかを試験する方法、および暴露量の選択においてこのような違いをどのように考慮するかを知っているであろう。γ線、X線、または電子線照射の好適な吸収量は6 kGy〜45 kGy、例えば、8 kGy〜38 kGy、10 kGy〜36 kGy、12 kGy〜34 kGyであり得る。従って、γ線、X線、および/または電子線照射の量は、例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、または34 kGyであり得る。

BGC成分、断片化ATMおよび断片化DBMは、混合してまたは別個に、BGC調製の任意の段階で(上記の任意の量で)照射することができる。さらに、BGCの照射は、BGC成分の２回目または３回目の照射への暴露であり得る。従って、例えば、断片化ATMおよび断片化DBMを別個に照射し、混合してBGCを形成し、次にBGCを照射することができる。

BGCは、過酢酸を用いて滅菌することができる(米国特許第5,460,962号参照のこと。これらの全ての開示を参照として本明細書中に取り入れておく。)。従って、過酢酸は、例えば、断片化ATM/断片化DBM混合物に、混合物を乾燥する前に加えることができる。

一般に、BGCは、適切な病院または治療施設に輸送してから再水和させるが、再水和は、移植または埋め込みの直前に医療従事者が行う。しかしながら、病院または治療施設に輸送する前に再水和させることもでき、この場合、BGCは一般に冷蔵状態で輸送する。輸送は、標準的な運送業者を介して、通常の温度曝露および輸送時間に対して標準的な条件下で行う。

III.骨障害の治療
骨障害
本発明において提供されるBGCは、改善または修復が必要な任意の広範な骨障害の治療に有用である。骨障害は、種々の医学的症状、例えば、外傷、先天性奇形、腫瘍学的切除術、および感染から発生し得る。これらの全ての症状に共通するのは、遅延癒合または偽関節に特になりやすい治癒部位における欠損である。従って、骨移植の用途には、骨折治癒の増強、骨格異常の再建、関節の癒合、関節の再建処置、粉砕踵骨骨折、関節固定のための関節のパッキング（packing）（すなわち、外科的に引き起こされたまたは自発的な関節の癒合）、骨腫瘍の切除に起因する骨中の空隙の充填、および切除された感染した骨の中の空隙の充填が含まれる。

一定の群の患者は、骨障害に対して高い危険性がある。本発明において提供されるBGCは、これらの障害から発生する症状を治療するのに使用できる。例えば、弱い骨、例えば骨粗しょう症または骨形成不全症を引き起こす症状を有する患者は、骨折または重篤な損傷の傾向が高い。他の医学的症状は、骨折治癒の正常な過程を妨害し得る。急速な骨治癒に不利な個体には、骨沈着よりも骨吸収（bone resporbtion）が高い確率で起こる、骨粗しょう症、骨減少症、シャルコー神経関節症などの症状を有する個体、ならびに骨治癒を妨げる薬剤、例えば、化学療法剤、非ステロイド系抗炎症剤または喫煙による全身性のニコチンにさらされている個体の患者が含まれる。

例えば、本発明において提供されるBGCは、上述の損傷または欠損のいずれかを有する骨の修復に使用できる。BGCは任意の形態で使用でき、また、上掲の任意の方法によって調製できる。そのような治療法を適用できる骨には、これらに限定されないが、長骨(例えば、脛骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨または腓骨)、手および足の骨(例えば、踵骨または舟状骨)、頭および首の骨(例えば、側頭骨、頭頂骨、前頭骨、上顎骨、下顎骨)、または脊椎骨が含まれる。上述したように、骨の重篤な空隙欠損は、BGCを用いて治療できる。そのような重篤な空隙欠損においては、例えば上述のように再水和したBGCのパテまたは任意の形態の成型または付形したBGCを用いて空隙を充填することができる。

BGCは、他の骨移植片材料（bone graft material）、スカフォールドまたは支持構造デバイスの組み込みを促進するために使用することもできる。例えば、BGCは、皮質移植片を増強するために機械的強度を呈する移植体またはインプラントとともに使用することができ、または、構造的移植片と宿主骨との結合性を増加させる処置を延長するのに使用することができる。これら他の骨移植片材料、スカフォールドまたは支持構造デバイスには、金属、セラミックスならびに天然ポリマーおよび合成ポリマーが含まれ得る。セラミック材料には、天然の供給源、例えば、サンゴのハイドロキシアパタイトまたは合成化合物（例えば、合成ハイドロキシアパタイトまたはβ-リン酸三カルシウム）由来のセラミックスが含まれ得る。骨移植に有用な天然ポリマーには、デンプン、フィブリン、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸およびポリヒドロキシブチレートが含まれ得る。好適な合成ポリマーは、ポリ(α-ヒドロキシ酸）、ポリ(ε-カプロラクトン）、ポリ(プロピレンフマレート)ポリ(BPAイミノカーボネート）、ポリ(ホスファゼン)であり得る。このような追加のスカフォールドまたは物理的な支持成分は、任意の好都合な大きさまたは形状、例えば、薄片、立方体、直方体、円盤、または球であり得ることが理解される。

BGCは、(a)損傷している、または欠損を含む骨を包み込むことができ；(b)損傷している、または欠損を有する骨の表面に配置することができ；(c)骨の空洞、空隙または空間に、巻いて挿入することができ；または(d)骨形成を誘導するために非骨部位（non-bony site）に配置することができる。1以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30以上)のこのようなBGCは、任意の特定の部位において使用できる。移植片は、例えば、当技術分野において既知の縫合糸、ステープル、鋲、または組織用接着剤もしくはシーラントによって所定位置に保持することができる。別の方法としては、例えば、欠損または空洞に十分に隙間なく詰め込んだ場合には、固定用デバイスを必要としない。

BGCが、骨および/または隣接する骨を修復または再生するために組織または臓器に適用することができることは自明である。従って、例えば、BGCを、長骨の重篤な空隙欠損に挿入して空隙欠損を囲む骨膜等価物を再生することができ、次に、該骨膜等価物は、骨中の空隙における骨形成を促進することができる。同様に、BGCは、抜歯窩に埋め込み、例えば抜歯により結果的に失われた窩の基底部の骨の再生を促進することができる。BGCは、脊椎癒合にも使用できる。

治療剤の送達
BGCは、新生骨の形成用のスカフォールドとして、および/または骨治癒および新骨形成を促進する薬剤の送達用の媒体として使用することもできる。これらの薬剤には、細胞、成長因子または小分子治療薬が含まれ得る。これらの薬剤は、基材を対象中に配置する前に、BGCに組み込むことができる。別の方法としては、それらを既に対象中に配置されているBGCに注入することができる。これらの薬剤は、単独で投与しても、組み合わせて投与してもよい。例えば、BGCは、細胞、成長因子および小分子治療薬を同時に送達するのに、あるいは細胞と成長因子、または細胞と小分子治療薬、または成長因子と小分子治療薬を送達するのに使用できる。

当然、上記薬剤の投与は、単回、または複数回(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、80、90、100、または必要とする回数)であり得る。複数回の場合、投与は、当業者により容易に決定され得る時間間隔であり得る。種々の物質および因子の容量は対象の種、年齢、体重、体格、および性別に依存して大きく変化し、これも当業者により容易に決定され得る。

組織適合性の生存している細胞をBGCに戻して、宿主により再形成され得る永久的に許容される移植片を作成することができる。細胞は、意図するレシピエントまたは同種のドナーから得ることができる。BGCが再共存することができる細胞型には、これらに限定されないが、胚幹細胞(ESC)、成人または胚間葉性幹細胞(MSC)、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、単核細胞、造血幹細胞、歯肉上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、または歯根膜幹細胞が含まれる。２以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)のこれらの細胞型の任意の組み合わせをBGCを再共存させるのに使用してもよい。特定の細胞型を分離する方法は当技術分野において周知である。ドナー細胞を採取後に直接使用してもよいし、またはそれらを標準的な組織培養技術を用いてin vitroで培養することもできる。ドナー細胞は、哺乳動物の対象中にBGCを配置する直前にin situでBGCに移入または注射することができる。ドナー細胞は、当業者に公知の標準的な組織培養方法を用いてBGCと共に共培養することもできる。

BGCに組み込むことができる成長因子には、当技術分野において既知の広範な細胞増殖因子、血管新生因子、分化因子、サイトカイン、ホルモン、およびケモカインが含まれる。２以上の因子の任意の組み合わせを、以下に述べる任意の方法によって対象に投与することができる。関連する因子の例には、骨形成タンパク質(BMP)、特に、BMP 2、4、6、および7(BMP-7はOP-1とも呼ばれる)、線維芽細胞成長因子(FGF)(例えば、FGF1-10)、上皮細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、血管内皮細胞成長因子(VEGF)(例えば、VEGF A、B、C、D、およびE)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子(IGF)IおよびIGF-II、インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、β、またはγ)、形質転換成長因子(TGF)(例えば、TGFαまたはβ)、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン(IL)(例えば、IL-1 - IL-18)、Osterix、Hedgehog(例えば、ソニックまたはデザート)、SOX9、副甲状腺ホルモン、カルシトニンプロスタグランジン、またはアスコルビン酸が含まれる。

タンパク質である因子は、次のものを対象に投与することによってレシピエント対象に送達することもできる：（a）タンパク質である上述の因子のうちの任意の1以上をコードしている核酸配列を含む発現ベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス性ベクター)；あるいは、（b）そのような発現ベクターを用いて安定的にもしくは一過的にトランスフェクトした、または形質転換した細胞。好ましくは、トランスフェクションまたは形質導入した細胞は、レシピエント由来であるか、またはレシピエントに組織適合性である。しかしながら、因子に接触させる時間を短くすることが必要とされることもあり得ることから、組織非適合生細胞も使用できる。

BGCは、小分子薬剤を局所送達するための媒体として使用することもできる。骨髄炎、すなわち、骨の感染症は、一般に、感染した領域の掻爬（curettage）、続いて行う骨移植および抗生物質の長期間全身投与により治療される。抗菌剤をBGCに組み込むことにより、抗生物質を局所的に高濃度で提供することができ、よって長期間の高い全身投与量に関連する副作用の危険性が最小限に抑えられる。抗菌剤は抗生物質であり得る。抗生物質の例には、これらに限定されないが、抗生物質の任意の代表的な群、例えば、1)アミノグリコシド系（ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシンまたはトブラマイシンなど)；2)セファロスポリン系（セファクロル、セファドロキシルまたはセフォタキシムなど)；3)マクロライド系（アジスロマイシン、クラリスロマイシン、またはエリスロマイシンなど)；4)ペニシリン系（アモキシシリン、カルベニシリンまたはペニシリンなど)；5)ペプチド系（バシトラシン、ポリミキシンBまたはバンコマイシンなど)；6)キノロン系（シプロフロキサシン、レポフロキサシン、またはエノキサシなど)；7)スルホンアミド系（スルファメタゾール（sulfamethazole）、スルファセタミド（sulfacetimide）；またはスルファメトキサゾールなど)；8)テトラサイクリン系（ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはテトラサイクリンなど)；9)多様な作用機序を有する他の抗生物質（リファンピン、クロラムフェニコール、またはニトロフラントイン（nitrofuratoin）が含まれる。

BGCは、他の抗菌剤、例えば、抗真菌薬および抗ウイルス薬のための送達媒体として使用することもできる。

BGC は、化学療法剤の局所送達用に使用することもできる。悪性骨腫瘍は、通常、腫瘍切除および抗癌剤の全身投与により治療する。BGCへの抗癌剤の組み込みにより、局所的な高濃度での化学療法を行うことができ、よって長期間の高い全身投与量に関連する毒性を軽減することができる。化学療法剤の群の例には、これらに限定されないが、1)アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）；2)アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン）；3)細胞骨格破壊物質（cycloskeletal disruptor）（例えば、パクリタキセル）；4)トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、エトポシド）；5)ヌクレオチド類似体（例えば、アザシチジン（azacitidine）、フルオロウラシル、ゲムシタビン）；6)ペプチド（例えば、ブレオマイシン）；7)白金を基にした薬剤（platinum-based agent）（例えば、カルボプラチン、シスプラチン）；8)レチノイド（例えば、オールトランス型レチノイン酸）；および9)ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチンまたはビンクリスチン）が含まれる。

IV.製造物品
本発明において提供されるBGCは、製造物品中にまたはキットとして含むことができる。一実施形態において、キットは、BGC、包装材料、または治療方法の説明を含む添付文書を含むことができる。包装材料は、BGCの長期間の安定性および滅菌状態を促進する成分を含むことができる。別の実施形態において、キットは、使用者がBGCを直接調製することができるようにBGC成分を含むことができる。そのようなキットは、断片化DBM成分、断片化ATM成分、成分を混合してBGCを調製する方法の説明および好適な包装材料を含むことができる。キットは、成分およびBGCを水和させるための生物学的に適合性の緩衝液を含むこともできる。

本発明に従う多数の実施形態について記載した。しかしながら、本発明の趣旨および範囲を超えることなく、多様な変形を行うことができることは自明である。従って、その他の実施形態も請求項の範囲に含まれる。

方法および材料
脱ミネラル化骨基材の調製
実施例４および５に記載する実験には、LifeCell corporationにより製造されたAlloCraft DBM（商標）キットの成分であり、LifeLinkにより供給されているDBMを使用した。DBMは以下のように調製できる。死体骨サンプルを洗浄して軟組織および血液を除去する。洗浄した骨を小片に切断し、過酸化水素およびアルコール中で一連のインキュベーションを行うことにより消毒し、125〜850ミクロンの大きさの粒子に粉砕する。希HClで処理してカルシウム含有量を5％未満に減少させた後、得られたDBMを凍結乾燥し、以下の実施例４および５に記載する実験に使用する。

無細胞性組織基材の調製
以下の実施例４および５に記載する実験においては、関連するATMは、LifeCell Corporationにより製造されたAlloCraft DBM（商標）キットの成分であり、LifeCell所有の方法を用いて調製した。ATMを真皮から調製した場合、これを無細胞性皮膚基材(ADM)と呼ぶ。ヒトドナーの皮膚は、多様な米国の組織バンクおよび米国全体の病院から入手したが、それらの皮膚サンプルは、ドナーの家族からの承認を得た後、死亡したドナーから採取した。調達した皮膚は、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含むRPMI 1640組織培養培地に入れ、同一の培地に入れた状態で湿潤氷に載せ、LifeCell（Branchburg、New Jersey）の施設に輸送した。到着するとすぐに皮膚組織容器の温度を測定し、温度が10℃を越える場合、皮膚組織を廃棄した。無菌条件下でRPMI1640培地を交換し、種々の病原体（梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）：RPRおよびVDRL法によって試験した）、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）IおよびII、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ならびにHTLV（ヒトT細胞白血病ウイルス）IおよびII）についての血清学的試験をこの皮膚サンプルに対して実施する間、皮膚を4℃で保存した。何らかの病原体が検出された場合、皮膚を廃棄した。そうでない場合は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にマルトデキストリン（M180）を35％（w/v）添加した前凍結用（pre-freezing）水溶液に移した。室温（20℃〜25℃）で2〜4時間放置した後、皮膚が入った溶液を-80℃で凍結させ、以下の処理に供するまで、-80℃の冷凍庫内で保存した。

凍結させた皮膚は、37℃の水浴中、氷が見えなくなるまで溶融した。残存する液体を捨て、皮膚を次の処理工程に供した：（i）脱表皮（de-epidermization）；（ii）脱細胞（de-cellularization）；（iii）洗浄。

（i）脱表皮：皮膚の表皮は、脱表皮溶液（1 MのNaCl、0.5％（w/v）のTriton X100、10mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA））中、室温で8〜32時間緩やかに振とうしながら組織サンプルをインキュベートすることによって除去した。ブタの皮膚を処理する場合、このインキュベーションは、室温で30〜60時間行った。表皮層は真皮から物理的に除去した。表皮を廃棄し、真皮を以下で述べるさらなる処理に供した。

（ii）脱細胞（Decellularization）：細胞を殺し、細胞成分および残渣を除去することを目的として、脱細胞溶液（decellularizing solution）（2％ w/vのデオキシコール酸ナトリウム、10 mMのEDTA、10 mMのHEPES緩衝液（pH 7.8〜8.2））を用いて真皮を5〜60分間すすぎ、次に新しいロットの同一溶液中、室温で12〜30時間穏やかに振とうしながら真皮をインキュベートした。

（iii）洗浄：洗浄は、死んだ細胞、細胞残渣、およびこれまでの処理工程で使用した残留化学物質を洗い流すことを目的とする。脱細胞した真皮は、第一の洗浄液（0.5％ w/v Triton X-100および10 mMのEDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS））に移した後、室温で5〜60分間緩やかに振とうしながらインキュベートした。次に、第二の洗浄液（10 mMのEDTAを含むPBS）中、室温で穏やかに振とうしながら真皮を連続して3回洗浄した。はじめの2回の洗浄は短時間（それぞれ、15〜60分）、3回目は長時間（6〜30時間）行った。

洗浄後、得られた無細胞性組織基材を「無細胞性組織基材」の章で述べたような粒子状ATMの調製に使用した。

BGCの調製
BGCは、２種の成分、AlloCraft DBM（商標）キットに同梱されている粒子状ATMおよび粒子状DBMから調製した。このキットに含まれる粒子状ATMはCymetraであり、これはAlloDerm（登録商標）の微粉化された粒子(50〜150 μm)の形態として提供される無細胞性皮膚基材であって、洗浄されて抗凍結剤が除去され、滅菌生理食塩水中に再懸濁されている。粒子状ATM成分を調製するために、5 gのCymetraをプラスチック製カップ中の約200 mLの滅菌した0.9％NaCl生理食塩水(Irrigation USP、Abbott、Laboratories、Abbott Park、Illinois)に懸濁し、攪拌し、次に遠心分離した。上清を除去し、10 mLの生理食塩水をそのカップに加えてATMを再懸濁した。次に、8 mLの再懸濁したATMを10mLシリンジに移した。粒子状DBMを調製するために、1 mL(〜0.4g)の粒子状DBMを3 mLシリンジに入れ、1 mLの滅菌生理食塩水を加えることにより水和した。水和した粒子状ATM(8 mL)および水和した粒子状DBM(6 mL)を、２つのルアーロック式シリンジ間の往復運動を介したシリンジ-シリンジ混合により混合した。次に、混合物の1 mL アリコートを一連の3 mLシリンジ中に移し、-80℃で凍結し、次に標準的な条件下、凍結乾燥機(Savant Modulyo Freeze drying system、Newark、NJ)を用いて真空乾燥した。次に、シリンジをシール用エンドキャップで蓋をし、ホイルパウチ中に密閉した。得られた骨移植片組成物は、円筒の形状であり、長さ約15 mmおよび直径0.7 mmであった。使用するために、移植前に凍結乾燥した骨移植片組成物を1.0 mLの生理食塩水で15分間水和させた。

サンプル照射
STERIS Isomedix Services(Whippany、NJ)の断熱ドライアイス容器中-80℃にて、26.6〜28.9 kGyの照射線量で、サンプルをγ線照射した。Titan Scan Technologies(Denver、CO)において周囲温度にて、14〜16 kGyの照射線量で、サンプルを電子線照射した。

動物の準備およびサンプルの移植
動物移植実験は、Toxikon Laboratories （Bedford、MA）において実施した。無胸腺ヌードラットを麻酔し、後肢の半膜様筋と短内転筋との間にパウチを外科的に作製した。約0.1〜0.2 mLの試験物質をシリンジを介して筋肉パウチに注入した。28日後、ラットをCO₂ ガスで安楽死させ、インプラントを外科的に除去した。各部位からの生体組織サンプルを二等分した。片方を10％中性緩衝ホルマリン中で固定し、組織学的検査用に処理した。他方を-80℃で凍結しアルカリホスファターゼ活性の分析用に処理した。

新骨形成の組織学的評価
生体組織サンプルを、新たに沈着した軟骨と新たにミネラル化した骨マトリックスの両方の存在について組織学的に評価した。固定したサンプルを標準的な方法で組織学的検査用に処理し、ヘマトキシリン/エオシンおよびトルイジンブルーで染色した。コードしたサンプルについて顕微鏡分析を実施した。各サンプルを、以下のスコアシステムに基づく0〜5のスケールで、新骨形成の存在について採点した：
0＝新生骨なし。
1＝少なくとも1個の新骨形成部位。
2＝全生体組織中＜10％の新生骨領域である、1を超える新生骨部位。
3＝全生体組織中＞10％の新生骨領域であるが、不均一に分布している複数の新生骨部位。
4＝生体組織全域にわたって良好に均一に分布している、複数のおよび多数の新生骨部位。
5=生体組織の大部分に相当する、生体組織全域にわたる広範な新骨形成。

新骨形成の酵素学的評価
骨芽細胞または造骨細胞は、新生骨のミネラル化において重要な役割を担う酵素アルカリホスファターゼを合成する。従って、サンプル中のアルカリホスファターゼ活性のレベルは、新骨形成の指標となり得る。

凍結生体組織サンプルを、解凍し、切開して視覚的に筋肉組織のないきれいな状態にした。サンプルをAP緩衝液(1.2 M 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、25℃でpH 10.5)中でホモジナイズし、得られた溶解物を遠心分離して不溶性残渣をペレット化した。アッセイを実施するために、200 μLの上清を、アルカリホスファターゼ基材(リン酸p-ニトロフェノール、4 mg/mL)を含む250μL AP緩衝液に加え、30分間37℃でインキュベートした。n-ニトロフェノール生成物の生成を、415 nmにおける吸光分光分析により監視した。別個の較正曲線(既知量のn-ニトロフェノールを用いて得た)を生体組織サンプルから生成した生成物の量を決定するのに使用した。BCAタンパク質アッセイキットを用い、その供給者の指示(Pierce Biotechnology、Inc.、Rockford、Illinois)に従って、抽出物の総タンパク質含有量を測定した。実験サンプル中のアルカリホスファターゼ活性をタンパク質濃度について規格化し、μm pNP/mgタンパク質/hrとして表した。

許容基準
≧1の組織学的スコアおよび≧1 μm/mgタンパク質/minのAP活性を、新骨形成の証拠とみなした。

BGCの骨誘導性：γ線滅菌
実験設計
BGCの骨誘導性を、保存条件と骨誘導性との関係を系統的に調べるように設計した処理(以下の表１にまとめる)に粒子状DBM成分を供した調合物の骨誘導性と比較した。関連する変量には、保存温度、γ線滅菌、および粒子状DBMの保存に対する粒子状DBMと粒子状ATM成分を混合するタイミング（すなわち、粒子状DBMの保存の前または後のどちらに粒子状DBMと粒子状ATMを混合するか）が含まれる。全ての実験サンプルを移植前に６ヶ月間保存した。この実験では、16匹の動物を使用した。実施例１の「動物の準備およびサンプルの移植」で上述した試験動物にサンプルを移植した。各動物はそれぞれの後肢に１個の移植を受けた。個々の動物間のばらつきを制御するために、各群(AからH)の試験物質を4個のアリコートに分割し、各アリコートを異なる動物の別の部位に移植した。28日後、サンプルの生検を行い、サンプルの骨誘導の潜在性を実施例１の「新骨形成の組織学的評価」および「新骨形成の酵素学的評価」で述べたように評価した。

実験群をAからHに指定し、以下の条件に供した。FおよびG群においては、粒子状DBMを粒子状ATMと混合してBGCを形成した。BGCは、実施例１「BGCの調製」で述べた方法に従って調製した。すなわち、粒子状DBMと粒子状ATMを水和させ、混合して混合物を形成し、凍結乾燥し、γ線照射し、次に移植前に６ヶ月間保存した。このように、これらのサンプル中の粒子状DBMと粒子状ATMを保存前に混合した。F群は-80℃で保存し、G群は室温で保存した。

AおよびB群においては、粒子状DBM(粉末の形態)はγ線照射乾燥粉末として保存した。保存期間の終わりに、粒子状DBMを水和させ、水和した粒子状ATMと混合し、移植した。すなわち、これらのサンプル中の粒子状DBMと粒子状ATMは保存後に混合した。A群は-80℃で保存し、B群は室温で保存した。

C、D、およびE群においては、粒子状DBMはペーストとして、すなわち水和後に保存した。これらのサンプルについて、1 mL(〜0.4 g)の粒子状DBMを「BGCの調製」で上述したように1 mLの生理食塩水と混合した。サンプルDおよびE中の粒子状DBMペーストは、水和した後にγ線照射し、サンプルC中の粒子状DBMペーストはγ線照射しなかった。次に、この群の全てのサンプルを保存し、保存期間の最後に水和した粒子状ATMと混合し移植した。従って、これらのサンプル中の粒子状DBMと粒子状ATMを保存後に混合した。D群は-80℃で保存し、CおよびE群は室温で保存した。

保存および照射に関連する因子の対照であるH群においては、移植する直前に照射していない粒子状DBM粉末を水和させ、水和した粒子状ATMと混合した。従って、この群の粒子状DBMと粒子状ATMは保存期間を介在させずに混合した。

結果
移植した各アリコート(1、2、3、および4と表示した欄)の組織学的スコアを表２に示す。FおよびG群の両方のBGCインプラントは、≧1の組織学的スコアを有した。従って、新骨形成の組織学的証拠を示した。

**これらの部分ではインプラントが消失した。よって生体組織サンプルを分析しなかった。

移植した各アリコート(1、2、3、および4と表示した欄)のアルカリホスファターゼ活性スコアを表３に示す。全体的に、BGCサンプル(FおよびG群)は、保存した粒子状DBMペースト(サンプルDおよびE)から調製した比較サンプルよりも高レベルのAP活性を示した。

サンプルの骨誘導性(OI)の分析結果を表４にまとめる。AP活性が≧1であり、かつ組織学的スコアが≧1であった場合に、サンプルを骨誘導性であるとみなした。FおよびG群の両方のBGCサンプルは骨誘導性であり；さらに、周囲温度で保存したBGC(G群)は、骨誘導性を保持したが、DBMペーストを室温で保存したサンプル(E群)は保持しなかった。

上の表に示されていない追加の対照サンプルは、上述のように6ヶ月間の保存、γ線照射、および移植の前にATMとDBMを混合することにより調製したパテからなる。これらのサンプルは平均組織学的スコア1.0および平均AP活性0.8を有する。よって、上述の骨誘導性の基準を満たさない。

BGCの骨誘導性：電子線滅菌
実験設計
BGCの骨誘導性を、保存条件と骨誘導性との関係を系統的に調べるように設計した処理(以下の表５にまとめる)に粒子状DBM成分を供した調合物の骨誘導性と比較した。関連する変量には、保存温度、電子線(e-beam)滅菌、および粒子状DBMの保存に対する粒子状DBMと粒子状ATM成分を混合するタイミング（すなわち、粒子状DBMの保存の前または後のどちらに粒子状DBMと粒子状ATMを混合するか）が含まれる。全ての実験サンプルを６ヶ月間保存した。この実験では、17匹の動物を使用した。実施例１の「動物の準備およびサンプルの移植」で上述した試験動物にサンプルを移植した。各動物はそれぞれ0.2 mLずつ、それぞれの後肢に１個ずつ、2個の移植を受けた。個々の動物間のばらつきを制御するために、各群(AからG)の試験物質を5個のアリコートに分割し、各アリコートを異なる動物の別の部位に移植した。28日後、サンプルの生検を行い、サンプルの骨誘導性を実施例１の「新骨形成の組織学的評価」で述べたように評価した。生体組織サンプルを1％ triton-x-100を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に均質化した以外は「新骨形成の酵素学的評価」で述べた方法に従って、アルカリホスファターゼ活性を測定した。

実験群をAからGに指定し、以下の条件に供した。FおよびG群においては、粒子状DBMを粒子状ATMと混合してBGCを形成した。BGCは、実施例１で述べた方法(「BGCの調製」)に従って調製した。すなわち、粒子状DBMと粒子状ATMを水和させ、混合して混合物を形成し、凍結乾燥し、γ線照射し、次に移植前に６ヶ月間保存した。すなわち、これらのサンプル中の粒子状DBMと粒子状ATMは保存前に混合した。E群は-80℃で保存し、F群は室温で保存した。

AおよびB群においては、粒子状DBM(粉末の形態)は電子線照射乾燥粉末として保存した。保存期間の終わりに、粒子状DBMを水和させ、水和した粒子状ATMと混合し、移植した。すなわち、これらのサンプル中の粒子状DBMと粒子状ATMは保存後に混合した。A群は-80℃で保存し、B群は室温で保存した。

C、およびD群においては、粒子状DBMはペーストとして、すなわち水和後に保存した。これらのサンプルについて、1 mL(〜0.4 g)の粒子状DBMを「BGCの調製」で上述したように1 mLの生理食塩水と混合した。これらの群の粒子状DBMペーストは、水和した後に電子線照射し、保存し、保存期間の最後に水和した粒子状ATMと混合し移植した。すなわち、これらのサンプル中の粒子状DBMおよび粒子状ATMは保存後に混合した。C群は-80℃で保存し、D群は室温で保存した。

保存および照射に関連する因子の対照であるG群においては、移植する直前に照射していない粒子状DBM粉末を水和させ、水和した粒子状ATMと混合した。すなわち、この群の粒子状DBMと粒子状ATMは保存期間を介在させずに混合した。

結果
移植した各アリコート(1、2、3、4、および5と表示した欄)の組織学的スコアを表６に示す。両方のBGC群は、新骨形成の組織学的証拠を示した。

移植した各アリコート(1、2、3、4、および5と表示した欄)の対応するアルカリホスファターゼ活性を表７に示す。BGCサンプルの大部分が新骨形成の酵素学的証拠を示した。

サンプルの骨誘導性(OI)の分析結果を表８にまとめる。この実験では、組織学的スコアが≧1であった場合に、サンプルを骨誘導性であるとみなした。-80℃で保存した骨移植片組成物サンプル(サンプルE)は、水和し、保存したペースト(サンプルC)から調製した比較サンプルよりも高い骨誘導性活性を示した。周囲温度で保存した骨移植片組成物サンプルにも同様の傾向が観察された。

上の表に示されていない追加の対照サンプルは、上述したように6ヶ月間または1年間の保存、電子線照射、および移植の前にATMとDBMを混合することにより調製したパテからなる。6ヶ月間保存したサンプルは平均組織学的スコア1.9および平均AP活性0.5を有した。従って、それらは上述の骨誘導性の基準を満たすが、表８に挙げた他のいずれのサンプルよりも低い組織学的スコア(およびAP活性)を有した。1年間保存したサンプルは平均組織学的スコア0および平均AP活性0.2を有した。従って、上述の骨誘導性の基準を満たさない。

Claims

骨移植片組成物(BGC)の調製方法であって、
a)真皮無細胞性組織基材(ATM)の断片を脱ミネラル化骨基材(DBM)の断片と合わせて混合物を作製する工程、ここで、該混合物中の該真皮ATMの断片および該DBMの断片は水和している、および
b)該混合物を乾燥してBGCを形成する工程、ここで、該BGCは水和したときに骨誘導性（osteoinductive）である、
を含む前記方法。
前記真皮ATMの断片が粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記真皮ATMの粒子が均一な大きさであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
前記DBMの断片が粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記DBMの粒子が均一な大きさであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
前記混合物が半固体のパテであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
乾燥する前に前記半固体のパテを付形する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
前記真皮ATMをヒト組織から調製することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記真皮ATMを非ヒト哺乳動物組織から調製することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記非ヒト哺乳動物がブタであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
前記非ヒト哺乳動物が遺伝子操作により、α-1,3-ガラクトシル残基の発現を欠失していることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
前記非ヒト哺乳動物が、機能性α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失していることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
前記DBMをヒト組織から調製することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記DBMを非ヒト哺乳動物組織から調製することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記非ヒト哺乳動物がブタであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
前記非ヒト哺乳動物が遺伝子操作により、α-1,3-ガラクトシル残基の発現を欠失していることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
前記非ヒト哺乳動物が、機能性α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失していることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
乾燥する工程が凍結乾燥を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記BGCを照射する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
γ線を照射することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
X線を照射することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
電子線を照射することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
紫外線を照射することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
前記BGC が6 kGy〜20 kGyの放射線を吸収するようにBGCを照射することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
前記混合物を照射する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
γ線を照射することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
X線を照射することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
電子線を照射することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
紫外線を照射することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
前記BGCが6 kGy〜20 kGyの放射線を吸収するようにBGCを照射することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
(a)DBMの断片；
(b)真皮ATMの断片；および
(c)包装材料、またはBGCの調製方法の説明を含む添付文書
を含むキットであって、該方法が
i)該真皮ATMの断片を該DBMの断片と合わせて混合物を作製する工程、ここで、該混合物中の該真皮ATMの断片および該DBMの断片は完全に水和している、および
ii)該混合物を乾燥して該BGCを形成する工程、ここで、該BGCは水和したときに骨誘導性である、
を含む、上記キット。
真皮無細胞性組織基材(ATM)の断片と脱ミネラル化骨基材(DBM)の断片の乾燥した混合物を含む骨移植片組成物(BGC)であって、水和したときに骨誘導性である、上記骨移植片組成物(BGC)。
前記真皮ATMの断片が粒子であることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
前記真皮ATMの粒子が均一な大きさであることを特徴とする、請求項３３に記載の組成物。
前記DBMの断片が粒子であることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
前記DBMの粒子が均一な大きさであることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
前記混合物が半固体のパテであることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
前記混合物が骨移植のために適した形状であることを特徴とする、請求項３７に記載の組成物。
前記真皮ATMがヒト組織由来の真皮ATMであることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
前記真皮ATMが非ヒト哺乳動物組織由来の真皮ATMであることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
前記非ヒト哺乳動物がブタであることを特徴とする、請求項４０に記載の組成物。
前記非ヒト哺乳動物が遺伝子操作により、α-1,3-ガラクトシル残基の発現を欠失していることを特徴とする、請求項４０に記載の組成物。
前記非ヒト哺乳動物が、機能性α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失していることを特徴とする、請求項４２に記載の組成物。
前記DBMがヒト組織由来のDBMであることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
前記DBMが非ヒト哺乳動物組織由来のDBMであることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
前記非ヒト哺乳動物がブタであることを特徴とする、請求項４５に記載の組成物。
前記非ヒト哺乳動物が遺伝子操作により、α-1,3-ガラクトシル残基の発現を欠失していることを特徴とする、請求項４５に記載の組成物。
前記非ヒト哺乳動物が、機能性α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失していることを特徴とする、請求項４７に記載の組成物。
(a)請求項３２に記載のBGC；および
(b)包装材料、または治療方法の説明を含む添付文書
を含む製品であって、該方法が、
i)改善または修復を必要とするレシピエント臓器または組織を有する哺乳動物の対象を特定する工程；および
ii)該臓器または組織の中または表面に該BGCを配置する工程
を含む、上記製品。
修復を必要とする臓器または組織を有する哺乳動物を治療するための医薬品の製造における、真皮無細胞性組織基材(ATM)の断片と脱ミネラル化骨基材(DBM)の断片の乾燥した混合物を含む骨移植片組成物(BGC)の使用であって、該BGCは水和したときに骨誘導性である、上記使用。
前記医薬品が骨障害の治療を必要とする哺乳動物に投与するためのものである、請求項５０に記載の使用。