ES2960617T3 - Productos de matriz de tejido acelular fluida y métodos de producción - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones de productos tisulares y métodos para tratar a un paciente. La composición del producto tisular puede incluir un vehículo fluido que incluye un material a base de ácido hialurónico y partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro del vehículo. También se proporcionan métodos para producir la composición de producto tisú y un dispositivo de inyección lleno con la composición de producto tisú. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Productos de matriz de tejido acelular fluida y métodos de producción

La presente divulgación reivindica prioridad, en virtud del artículo 119 del Título 35 del Código de los Estados Unidos, a la Solicitud Provisional de Estados Unidos con el número de serie 62/574678, presentada el 19 de octubre de 2017.

La presente divulgación se refiere a matrices tisulares y, más concretamente, a materiales inyectables que pueden utilizarse para procedimientos quirúrgicos o médicos, incluida la regeneración tisular con fines estéticos o no estéticos.

Actualmente existe la necesidad de materiales inyectables mejorados para el tratamiento de tejidos. Por ejemplo, para tratar diversos rasgos faciales (como líneas, arrugas, volumen insuficiente o formas poco deseables), pueden utilizarse materiales inyectables como los basados en ácido hialurónico. Dichos materiales, aunque eficaces, pueden proporcionar sólo mejoras temporales debido a su eventual reabsorción por el organismo. Aunque se ha trabajado en el desarrollo de materiales de ácido hialurónico (AH) que duren más tiempoin vivoantes de la reabsorción, por ejemplo, mediante la reticulación del AH, los materiales actuales seguirán siendo inevitablemente reabsorbidos por el organismo tras la inyección.

Existe una necesidad insatisfecha de composiciones de productos tisulares que puedan producir efectos más duraderos y que a la vez sean adecuados para la inyección mediante una jeringa u otro dispositivo de inyección o sistema de aplicación de fácil manejo.

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona composiciones de productos tisulares que tienen partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro de un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico. La divulgación también proporciona dispositivos de inyección (no con arreglo a la invención reivindicada) con tales composiciones y métodos para producir dichas composiciones.

La presente divulgación proporciona composiciones de productos tisulares de acuerdo con las reivindicaciones 1-11. La composición de producto tisular incluye un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico y una pluralidad de partículas de matriz de tejido acelular mezcladas con el vector.

La presente divulgación también proporciona dispositivos de inyección (no con arreglo a la invención reivindicada). El dispositivo de inyección puede incluir una jeringa que incluye un depósito que define un volumen y una aguja acoplada fluidamente al depósito y una composición de producto tisular contenida en el depósito. La composición del producto tisular puede incluir un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico y una pluralidad de partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro del vector.

La presente divulgación también proporciona métodos para producir una composición de producto tisular de acuerdo con las reivindicaciones 12-17. El método incluye mezclar una pluralidad de partículas de matriz de tejido acelular dentro de un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico.

Puede entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente se exponen exclusivamente a modo de ejemplo y con fines explicativos, y no limitan la invención reivindicada. WO03/017826 A2 divulga composiciones inyectables biocompatibles novedosas, preferiblemente, que comprenden una combinación de tejido procesado particulado y un vector. KR20160049459 A proporciona un método para producir una composición de bioimplante. US2005/159822 A1 describe un método de procesamiento de una matriz de tejido acelular para obtener una matriz de tejido acelular particulada.

Breve descripción de las ilustraciones

Las ilustraciones adjuntas, que se incorporan y forman parte de esta especificación, ilustran realizaciones de ejemplo de la presente divulgación y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la divulgación. La Fig. 1 es un diagrama de flujo que ilustra una realización de ejemplo de un método para producir productos tisulares proporcionados de acuerdo con la presente invención; la Fig. 2 es un gráfico que ilustra realizaciones de ejemplo de composiciones de productos tisulares que tienen diferentes distribuciones de tamaño-e de partícula; la Fig. 3 es un gráfico que ilustra un informe de barrido de amplitud para una composición de producto tisular que comprende partículas de matriz de tejido acelular que no están mezcladas dentro de un vector fluido; la Fig. 4 es un gráfico que ilustra los valores de G' y G" a 5 Hz para diversas composiciones de producto tisular; la Fig. 5 es un gráfico que ilustra el comportamiento de carga y extensión de compresión para composiciones de producto tisular conocidas en comparación con una realización de ejemplo de una composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 6 es un gráfico que ilustra las fuerzas de inyección utilizando diferentes tamaños de aguja para diversas composiciones de producto tisular; la Fig. 7 es una fotografía de microscopio de colágeno teñido con tricrómico de una realización de ejemplo de una composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 8 es una fotografía de microscopio de una composición de producto tisular que comprende partículas de matriz de tejido acelular que no están mezcladas con un vector fluido; la Fig. 9 es una fotografía de microscopio de una realización de ejemplo de una composición de producto tisular que comprende partículas de matriz de tejido acelular que están mezcladas con un vector fluido de acuerdo con la presente invención; la Fig. 10 es una fotografía al microscopio de otra realización de ejemplo de una composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 11 es una fotografía de microscopio de otra composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 12 es una fotografía de microscopio de otra composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 13 es una fotografía de microscopio de otra composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 14 es una fotografía de microscopio de otra composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 15 es una fotografía de microscopio de otra composición de producto tisular formada de acuerdo con la presente invención; la Fig. 16 es una fotografía de microscopio que ilustra la integración de una composición de producto tisular en el tejido dérmico huésped cuatro semanas después de la implantación; las Figs. 17A-D son un grupo de fotografías de microscopio que comparan respuestas biológicas observadas para composiciones de producto tisular implantadas con y sin un vector fluido de ácido hialurónico; las Figs. 18A y 18B son fotografías de microscopio que comparan el espesor dérmico después de la implantación a lo largo del tiempo; la Fig. 19 es un gráfico que ilustra la retención de volumen de las composiciones de productos tisulares implantadas; la Fig. 20 es un gráfico que ilustra la resistencia a la colagenasa de las composiciones de productos tisulares reticulados; y la Fig. 21 es un gráfico que ilustra la retención de volumen de las composiciones de productos tisulares reticulados implantadas que se han sometido a reticulado utilizando diferentes concentraciones de EDC. La Fig. 22 es un gráfico que ilustra las respuestas biológicas en composiciones de productos tisulares reticulados implantadas que se han sometido a reticulado utilizando diferentes concentraciones de EDC.

Descripción detallada de algunas realizaciones de ejemplo

La invención se define en las reivindicaciones. A continuación se hará referencia de forma detallada a determinadas realizaciones de ejemplo de acuerdo con la presente divulgación, algunos de cuyos ejemplos se muestran en las ilustraciones adjuntas. Siempre que sea posible, se utilizarán los mismos números de referencia en las ilustraciones para referirse a partes iguales o similares.

En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural, salvo que se indique específicamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o", salvo que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no tiene carácter limitador. Del mismo modo, el uso del término "que comprende", así como otras formas, como "comprende", tampoco tiene carácter limitador. Se entenderá que cualquier intervalo aquí descrito incluye los puntos extremos y todos los valores entre los puntos extremos.

Los encabezamientos de sección utilizados en el presente documento tienen únicamente fines organizativos y no se deben interpretar como limitadores de la materia descrita.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "matriz de tejido acelular" se refiere a una matriz extracelular derivada de tejido humano o animal, en la que la matriz retiene una cantidad sustancial de colágeno natural y glicoproteínas necesarias para servir como andamiaje sustentador de la regeneración tisular. Las "matrices tisulares acelulares" son diferentes de los materiales de colágeno purificado, como el colágeno purificado extraído con ácido, que carecen sustancialmente de otras proteínas de la matriz y no conservan las características microestructurales naturales de la matriz tisular debido a los procesos de purificación. Aunque se denominan "matrices de tejido acelular", se apreciará que estas matrices tisulares pueden combinarse con células exógenas, incluyendo, por ejemplo, células madre, o células de un paciente en el que puedan implantarse las "matrices tisulares acelulares". Además, se apreciará que "partículas de matriz de tejido acelular" se refiere a partículas de una matriz de tejido acelular, tal como se describirá más adelante en el presente documento.

Se entenderá que las matrices de tejido "acelular" o "descelularizado" se refieren a matrices tisulares en las que no hay células visibles mediante microscopía óptica.

Pueden utilizarse diversos tejidos humanos y animales para producir productos para el tratamiento de pacientes. Por ejemplo, se han producido diversos productos tisulares para la regeneración, reparación, aumento, refuerzo y/o tratamiento de tejidos humanos dañados o perdidos debido a diversas enfermedades y/o daños estructurales (por ejemplo, por traumatismo, cirugía, atrofia y/o desgaste y degeneración a largo plazo). Tales productos pueden incluir, por ejemplo, matrices tisulares acelulares, aloinjertos o xenoinjertos de tejidos, y/o tejidos reconstituidos (es decir, tejidos al menos parcialmente descelularizados que han sido sembrados con células para producir materiales viables).

Los productos tisulares incluyen partículas de matriz de tejido acelular procedentes de tejidos dérmicos o de otros tejidos que han sido procesados para eliminar al menos algunos de los componentes celulares. En algunos casos, se eliminan todos, o sustancialmente todos, los materiales celulares, dejando así las proteínas de la matriz extracelular correspondientes. Aunque el tejido dérmico se describe principalmente en el presente documento como el tejido de origen para las realizaciones de ejemplo de partículas de matriz de tejido acelular, debe apreciarse que las partículas de matriz de tejido acelular descritas aquí pueden proceder de otros tipos de tejido. Los tipos de tejido de ejemplo incluyen, entre otros: tejido adiposo, tejido de la submucosa del intestino delgado (SIS), tejido muscular, tejido vascular y tejido óseo.

Los tejidos de origen aquí descritos pueden derivarse de fuentes humanas o animales. Por ejemplo, el tejido puede obtenerse de cadáveres. Además, el tejido humano puede obtenerse de donantes vivos (por ejemplo, tejido autólogo). Los tejidos también pueden obtenerse de animales como cerdos, monos u otras fuentes. Si se utilizan animales como fuente de origen, los tejidos pueden tratarse adicionalmente para eliminar componentes antigénicos como las fracciones de 1,3-alfa-galactosa, que están presentes en cerdos y otros mamíferos, pero no en humanos o primates. Además, el tejido puede obtenerse de animales que han sido modificados genéticamente para eliminar las fracciones antigénicas. Véase Xu, Hui et al., "A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold that Supports Soft Tissue Regeneration: Removal of Terminal Galactose-a-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure", Tissue Engineering, Vol. 15, 1-13 (2009).

Tal como se utiliza aquí, un "material a base de ácido hialurónico" es un material que comprende ácido hialurónico (AH). AH se refiere al ácido hialurónico y también puede referirse a cualquier sal del mismo, incluyendo, entre otros, hialuronato de sodio, hialuronato de potasio, hialuronato de magnesio, hialuronato de calcio y combinaciones de estos. Tanto el AH como sus sales farmacéuticamente aceptables pueden incluirse en el material a base de ácido hialurónico. Ejemplos de materiales a base de AH se comercializan como JUVEDERM ® y JUVEDERM VOLUMA ®. Debe apreciarse que el material a base de ácido hialurónico puede incluir agentes adicionales como, por ejemplo, lidocaína.

Todas las cifras de este documento que expresan el "peso molecular" del AH deben entenderse como indicativas del peso molecular medio en peso (Mw) en Daltons.

El peso molecular del AH se calcula a partir de una medida de viscosidad intrínseca utilizando la siguiente relación de Mark Houwink: Viscosidad intrínseca (m3/kg) = 9,78 3 10-5 3 Mw0,690. La viscosidad intrínseca se mide de acuerdo con el procedimiento definido por la Farmacopea Europea (monografía sobre AH N°1472, 01/2009).

El AH de alto peso molecular, tal como se utiliza aquí, describe un material de AH que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 1,0 millones de Daltons (mw > 106 Da o 1 MDa) a aproximadamente 4,0 MDa. El AH de alto peso molecular que puede incorporarse en las presentes composiciones de productos tisulares puede tener un peso molecular en el rango aproximadamente de 1,5 MDa a aproximadamente 3,0 MDa, o el AH de alto peso molecular puede tener un peso molecular medio en peso de aproximadamente 2,0 MDa. En otro ejemplo, el AH de alto peso molecular puede tener un peso molecular de aproximadamente 3,0 MDa.

El AH de bajo peso molecular, tal como se utiliza aquí, describe un material de AH que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1,0 MDa. El AH de bajo peso molecular puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 200000 Da (0,2 MDa) a menos de 1,0 MDa, por ejemplo, entre aproximadamente 300000 Da (0,3 MDa) a aproximadamente 750000 Da (0,75 MDa), hasta - pero sin exceder - 0,99 MDa. Preferiblemente, no hay solapamiento entre la distribución del peso molecular de los materiales de AH de bajo y alto peso molecular. Preferiblemente, la mezcla de AH de bajo peso molecular y AH de alto peso molecular tiene una distribución de peso molecular bimodal. La mezcla también puede tener una distribución multimodal. De acuerdo con la invención, las composiciones de productos tisulares comprenden AH que tienen un componente de alto peso molecular y un componente de bajo peso molecular, y el componente de alto peso molecular puede tener un peso molecular medio en peso de al menos el doble del peso molecular medio en peso del componente de bajo peso molecular. Por ejemplo, la relación de peso molecular entre el AH de alto peso molecular y el AH de bajo peso molecular en la composición puede ser de al menos 2:1. Por ejemplo, una composición de producto tisular puede incluir un AH que tenga un componente de bajo peso molecular con un peso molecular medio en peso de aproximadamente 500000 Da, y un componente de alto peso molecular con un peso molecular medio en peso de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 1,0 MDa. En otro ejemplo, una composición de producto tisular de acuerdo con la invención puede incluir un AH que tenga un componente de bajo peso molecular con un peso molecular medio en peso de aproximadamente 800000 Da, y un componente de alto peso molecular con un peso molecular medio en peso de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 1,6 MDa. Debe apreciarse que pueden incorporarse muchos tipos diferentes de AH en la composición del producto tisular y no se pretende que los ejemplos anteriores sean de carácter limitador.

En algunas realizaciones de ejemplo, el AH puede reticularse utilizando uno o más agentes reticulantes adecuados. El agente reticulante puede ser cualquier agente conocido por ser adecuado para reticular polisacáridos y sus derivados a través de sus grupos hidroxilo. Los agentes reticulantes adecuados incluyen, entre otros, el éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (o 1,4- bis(2,3-epoxipropoxi)butano o 1,4-bisglicidiloxibutano, todos ellos conocidos comúnmente como BDDE), 1,2-bis(2,3-epoxipropoxi)etileno, 1-(2,3-epoxipropil)-2,3-epoxiciclohexano, y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (comúnmente conocido como EDC). Otros agentes reticulantes de hialuronano adecuados son los agentes reticulantes multifuncionales basados en PEG como el éter tetraglicidílico de pentaeritritol (PETGE), la divinil sulfona (DVS), el 1,2-bis(2,3-epoxipropoxi)etileno (EGDGE), el 1,2,7,8-diepoxioctano (DEO), (fenilenbis-(etil)-carbodiimida y 1,6 hexametilenbis (etilcarbodiimida), dihidrazida adípica (ADH), bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS), hexametilendiamina (HMDA), 1-(2,3-epoxipropil)-2,3-epoxiciclohexano, o combinaciones de estos.

La composición de producto tisular incluye un vector fluido que comprende un material a base de ácido hialurónico y una pluralidad de partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro del vector. En algunas realizaciones de ejemplo, el vector fluido comprende AH que no se ha mezclado con agentes adicionales; en otras realizaciones de ejemplo, el vector fluido comprende AH mezclado con agentes adicionales. Los agentes adicionales pueden incluir, entre otros, agentes anestésicos, por ejemplo, anestésicos locales aminoamídicos y sus sales o anestésicos locales aminoésteres y sus sales. Por ejemplo, procaína, cloroprocaína, cocaína, ciclometicaína, cimetocaína, propoxicaína, procaína, proparacaína, tetracaína, o sales de estos, o cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, los agentes anestésicos pueden comprender articaína, bupivacaína, cincocaína, etidocaína, levobupivacaína, lidocaína, mepivacaína, piperocaína, prilocaína, ropivacaína, trimecaína o sus sales, o cualquier combinación de estos.

El vector fluido puede estar inicialmente en forma de una solución líquida fluida que puede mezclarse con las partículas de matriz tisular para formar una suspensión. La suspensión formada puede entonces cargarse en una jeringa u otro dispositivo de inyección para su administración a un paciente. En algunas realizaciones de ejemplo, el vector fluido puede ser un AH no reticulado en una cantidad suficiente para mejorar la inyectabilidad de la composición del producto tisular.

Las partículas de matriz de tejido acelular pueden proceder de una matriz de tejido humano o animal, como se ha descrito anteriormente. Las fuentes de tejido adecuadas pueden incluir tejidos de aloinjerto, autoinjerto o xenoinjerto. Cuando se utilizan xenoinjertos, el tejido puede incluir tejidos de animales, incluidos cerdos, vacas, perros, gatos, animales de origen doméstico o salvaje, y/o cualquier otra fuente de tejido mamífero o no mamífero adecuada. En algunas realizaciones de ejemplo, las partículas de matriz de tejido acelular pueden proceder de una matriz dérmica tomada de un animal, como un cerdo. En una realización de ejemplo, la matriz dérmica de origen puede comprender una o más capas de piel que han sido extraídas de un organismo. El tamaño y la forma de la matriz tisular de origen pueden variar, de acuerdo con métodos conocidos, para producir diferentes cantidades de partículas de matriz de tejido acelular, como se describirá más adelante. El tejido de origen puede ser cosechado de fuentes animales usando cualquier técnica recomendable, pero generalmente se puede obtener usando, si es posible, técnicas asépticas o estériles. El tejido puede almacenarse en condiciones de frío o congelación o puede procesarse inmediatamente para evitar cualquier cambio indeseable debido a un almacenamiento prolongado.

Las matrices de tejido acelular pueden proporcionar un andamiaje tisular adecuado para permitir el crecimiento celular y la regeneración tisular. En el contexto de las líneas de la piel, arrugas, etc., un andamio tisular podría representar una solución a largo plazo para rellenar el volumen perdido sin necesidad de ser repuesto como el AH u otros materiales de relleno temporales. Los andamiajes tisulares pueden inyectarse en la piel existente o dañada para permitir la producción de una dermis más gruesa en el lugar de la inyección. Los andamiajes tisulares también pueden ser útiles en otras aplicaciones médicas, como la reparación de tejidos de gran volumen.

Un problema concreto que se ha identificado con el uso de una matriz de tejido acelular es la dificultad de colocación, como la inyección, de material de matriz de tejido acelular en su forma natural, debido a la red formada por la matriz de tejido. Aunque la implantación quirúrgica es una opción adecuada para implantar materiales de matriz de tejido acelular con el fin de reparar determinadas zonas del cuerpo, la inyección puede ser preferible para algunas aplicaciones. Se descubrió que la particulación de la matriz de tejido acelular suponía una mejora para la aplicación y la inyección, en comparación con la aplicación de la matriz de tejido acelular en su forma natural, pero se observó que incluso la matriz de tejido acelular pura particulada no era fácil de aplicar o inyectar en un paciente. En concreto, la aplicación del material de matriz tisular particulado resultó difícil de controlar, debido a la tendencia del material de matriz tisular particulado a extenderse. Además, se observó que la fuerza de inyección necesaria para inyectar la matriz de tejido acelular particulada era relativamente alta y que resultaba relativamente difícil inyectar toda la matriz tisular particulada cargada en un dispositivo de inyección, como una jeringa.

Para abordar algunos de los problemas anteriormente descritos de la inyección de materiales de matriz de tejido acelular, las realizaciones de ejemplo descritas en el presente documento proporcionan composiciones de productos tisulares que incluyen partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro de un vector fluido que comprende un material a base de ácido hialurónico. La composición de producto tisular formada puede aplicarse más fácilmente que las partículas de matriz de tejido acelular puras, como se describirá más adelante, manteniendo al mismo tiempo características que fomentan el crecimiento tisular en la zona de implantación y/o inyección.

Las composiciones de productos tisulares descritas en el presente documento pueden utilizarse para tratar diversos puntos anatómicos. En una realización de ejemplo, las composiciones de producto tisular pueden formarse como una composición de producto tisular inyectable adecuada para implantaciones de pequeño volumen, por ejemplo, para tratar líneas, arrugas, huecos o depresiones, para añadir volumen (por ejemplo, aumentando el grosor dérmico) o reemplazar pequeños volúmenes de tejido perdido. En otras realizaciones de ejemplo, las composiciones de producto tisular pueden formarse como una masilla o pasta adecuada para implantaciones de mayor volumen, como la reparación de grandes áreas de tejido estructural, la sustitución de tejido mamario o cualquier otra zona en la que deba repararse y/o sustituirse un volumen relativamente grande de tejido dañado y/o perdido. En otras realizaciones de ejemplo, las composiciones de producto tisular pueden formarse como una composición de producto tisular inyectable adecuada para su uso en aplicaciones en las que se utilizarían AH u otros rellenos, representando la composición de producto tisular inyectada un tratamiento a largo plazo, en lugar de a corto plazo. En otras realizaciones de ejemplo, las composiciones de productos tisulares pueden proceder de más de una fuente. Por ejemplo, una composición de producto tisular puede originarse a partir de una matriz dérmica y una matriz adiposa.

Con respecto a la Fig. 1, se ilustra una realización de ejemplo de un método 100 para producir una composición de producto tisular de acuerdo con la presente invención. El método 100 generalmente incluye mezclar una pluralidad de partículas de matriz de tejido acelular dentro de un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico para producir la composición de producto tisular. En algunas realizaciones de ejemplo, el método 100 también puede incluir el procesamiento 102 de una matriz de tejido de origen, como una matriz dérmica de origen, para producir las partículas de matriz de tejido acelular antes de mezclar 108 las partículas de matriz de tejido acelular con el vector fluido. En una realización de ejemplo, el método 100 incluye descontaminar inicialmente 101 la matriz de tejido de origen para eliminar contaminantes, tales como suciedad u otros restos o microbios, para limpiar y preparar la matriz de tejido de origen para el procesamiento 102. En algunas realizaciones de ejemplo, la descontaminación 101 puede comprender el lavado de la matriz de tejido de origen. Por ejemplo, la matriz de tejido de origen puede lavarse con uno o más enjuagues con diversos tampones biocompatibles. Por ejemplo, las soluciones de lavado adecuadas pueden incluir solución salina, solución salina tamponada con fosfato u otros materiales biocompatibles o soluciones fisiológicas adecuadas. En una realización de ejemplo, puede utilizarse agua como agente de lavado para romper aún más las células, tras lo cual puede introducirse solución salina tamponada con fosfato, o cualquier otra solución salina adecuada, para permitir que las proteínas de la matriz vuelvan a los tampones biocompatibles. Se conoce una gran variedad de otros procesos de descontaminación adecuados, por lo que, para una mayor brevedad, se omite una descripción más detallada de la descontaminación.

La matriz tisular de origen se procesa 102 para dividirla en una pluralidad de partículas de matriz tisular. La matriz tisular de origen puede, en términos generales, estar en una forma que es inicialmente inadecuada para una fácil aplicación o inyección a través de una jeringa u otro dispositivo de inyección, debido a la estructura de la matriz tisular de origen. Por ejemplo, una matriz dérmica de origen puede tener la forma de una lámina plana, con la que no es fácil trabajar, cargar o expulsar de un dispositivo de inyección. Para procesar 102 la matriz tisular de origen, puede emplearse una trituradora u otro dispositivo de separación mecánica para dividir la matriz tisular de origen en partículas de matriz tisular mediante trituración, mezcla, picado, rallado y/u otra agitación mecánica de la matriz tisular de origen. En algunas realizaciones de ejemplo, el procesamiento 102 puede producir partículas de matriz tisular de diferentes tamaños (diámetros), que se describirán más adelante. En algunos casos, el procesamiento 102 puede realizarse procesando mecánicamente el tejido con la adición de poco o ningún fluido de lavado o lubricante. Por ejemplo, el tejido puede procesarse mecánicamente por trituración o mezcla sin utilizar disolventes. Cuando la trituración del tejido requiere humedad, por ejemplo, puede utilizarse agua en lugar de otras soluciones, tales como solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Alternativamente, el tejido puede procesarse añadiendo una cierta cantidad de disolvente que sea biocompatible, como solución salina (por ejemplo, solución salina normal, solución salina tamponada con fosfato o soluciones que incluyan sales y/o detergentes). También pueden ser apropiadas otras soluciones que faciliten la lisis celular.

El método 100 puede incluir además la descelularización 103 de la matriz de tejido de origen o de las partículas de matriz de tejido producidas para eliminar sustancialmente todo el material celular nativo, que puede causar una respuesta antigénica en el paciente tras la inyección. La descelularización 103 puede incluir una serie de procesos adecuados. Por ejemplo, los métodos adecuados para eliminar las células de la matriz tisular de origen o de las partículas de matriz tisular pueden incluir el tratamiento con detergentes tales como ácido desoxicólico, polietilenglicoles u otros detergentes a concentraciones y tiempos suficientes para alterar las células y/o eliminar los componentes celulares. En algunas realizaciones de ejemplo, la descelularización 103 puede tener lugar después del procesamiento 102 de la matriz tisular de origen en partículas de matriz tisular; en otras realizaciones de ejemplo, la descelularización 103 puede tener lugar antes de procesar 102 la matriz tisular de origen en partículas de matriz tisular. En otras realizaciones de ejemplo, la descelularización 103 puede tener lugar tanto antes como después del procesamiento 102 de la matriz tisular de origen en partículas de matriz tisular. Con independencia del momento en el que se produzca la descelularización 103, las partículas de matriz de tejido acelular deben producirse tras el procesamiento 102 y la descelularización 103. Opcionalmente, el método 100 puede incluir descontaminar adicionalmente 104 las partículas de matriz de tejido acelular formadas para eliminar los contaminantes que puedan haberse introducido o producido involuntariamente durante el procesamiento 102 y/o la descelularización 103. La descontaminación 104 puede ser similar a la descontaminación 101 descrita anteriormente, o puede comprender un lavado o tratamiento adicional de las partículas de matriz de tejido acelular. Por ejemplo, puede realizarse un lavado o tratamiento adicional para eliminar materiales antigénicos como las fracciones de alfa-1,3-galactosa, que pueden estar presentes en tejidos animales no primates. Además, durante, antes y/o después de los pasos de lavado, pueden utilizarse soluciones o reactivos adicionales para procesar el material. Por ejemplo, pueden utilizarse enzimas, detergentes y/u otros agentes en uno o más pasos para eliminar más materiales celulares o lípidos, eliminar materiales antigénicos y/o reducir las bacterias u otra carga biológica del material. Por ejemplo, pueden incluirse uno o más pasos de lavado utilizando detergentes, como dodecilsulfato sódico o TRIS para ayudar a la eliminación de células y lípidos. Además, pueden utilizarse enzimas como lipasas, ADNsas, ARNsas, alfa-galactosidasa u otras enzimas para asegurar la destrucción de materiales nucleares, antígenos de fuentes xenogénicas, componentes celulares residuales y/o virus. Además, pueden utilizarse soluciones ácidas y/o peróxidos para ayudar a eliminar aún más los materiales celulares y destruir bacterias y/o virus, u otros agentes potencialmente infecciosos.

En algunas realizaciones de ejemplo, las partículas de matriz de tejido acelular pueden esterilizarse 107 antes o después de mezclarse 108 con el vector fluido. En una realización de ejemplo, la esterilización 107 puede comprender la esterilización por haz de electrones, como se conoce en la técnica. También pueden emplearse técnicas de esterilización alternativas conocidas en la técnica.

Las partículas de matriz de tejido acelular y el vector fluido pueden mezclarse 108 de cualquier forma adecuada. En una realización de ejemplo, las partículas de matriz de tejido acelular y el vector fluido pueden mezclarse en un lote de gran volumen en condiciones generalmente estériles para formar una composición de producto tisular de acuerdo con la presente invención. La mezcla 108 puede comprender, por ejemplo, agitar las partículas de matriz de tejido acelular y el vector fluido para formar una suspensión. Los parámetros y la técnica de la mezcla 108 pueden modificarse en función de las propiedades del vector fluido y de las partículas de matriz de tejido acelular, así como de las cantidades generales de cada uno en la composición del producto tisular, y pueden deducirse fácilmente por un experto en la materia a partir de la experimentación rutinaria.

En algunas realizaciones de ejemplo, el material a base de ácido hialurónico se reticula para estabilizarlo. La reticulación puede producirse antes, después o durante la mezcla 108 con las partículas de matriz de tejido acelular. En algunas realizaciones de ejemplo, el material se reticula después de la liofilización. Sin embargo, el material también puede reticularse antes o durante el proceso de liofilización. La reticulación puede realizarse de varias maneras. En una realización de ejemplo, la reticulación se produce poniendo en contacto el material a base de ácido hialurónico con uno o más agentes reticulantes como glutaraldehído, genepina, carbodiimidas (por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida clorhidrato (EDC)), diisocianatos, o 1,4-butanodiol diglicidil éter (o 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano o 1,4-bisglicidiloxibutano, todos ellos conocidos comúnmente como BDDE. Además, la reticulación puede realizarse calentando el material. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el material puede calentarse entre 70°C y 120°C, o entre 80°C y 110°C, o a unos 100°C, o a cualquier valor entre los rangos especificados a presión reducida o al vacío. Además, pueden utilizarse otros procesos de reticulación, o una combinación de procesos, para producir cualquiera de los productos reticulados divulgados, incluyendo radiación ultravioleta, radiación gamma y/o radiación de cañón de electrones. Además, el vacío no es necesario pero puede reducir el tiempo de reticulación. Además, pueden utilizarse temperaturas más bajas o más altas siempre que no se produzca la fusión de las proteínas de la matriz y/o se proporcione tiempo suficiente para la reticulación.

En diversas realizaciones (no con arreglo a invención reivindicada), el proceso de reticulación puede controlarse para producir una composición de producto tisular con las características mecánicas, biológicas y/o estructurales deseadas. Por ejemplo, la reticulación puede influir en la resistencia global de la composición del producto tisular, y el proceso puede controlarse para producir la resistencia deseada. Además, la cantidad de reticulación puede afectar a la capacidad de la composición del producto tisular para mantener una forma y estructura deseadas (por ejemplo, porosidad) cuando se implanta. Por consiguiente, la cantidad de reticulación puede seleccionarse para producir una forma tridimensional estable cuando se implanta en un cuerpo, cuando entra en contacto con un entorno acuoso y/o cuando se comprime (por ejemplo, por tejidos o materiales circundantes).

Una reticulación excesiva puede alterar los materiales de la matriz extracelular. Por ejemplo, una reticulación excesiva puede dañar el colágeno u otras proteínas de la matriz extracelular. Las proteínas dañadas pueden no favorecer la regeneración tisular cuando las composiciones de productos tisulares se inyectan en un paciente. Además, una reticulación excesiva puede hacer que el material sea quebradizo o débil. Por consiguiente, la cantidad de reticulación puede ser controlada para producir un nivel deseado de estabilidad, manteniendo al mismo tiempo las características biológicas, mecánicas y/o estructurales deseadas.

En algunas realizaciones de ejemplo, las células semilla pueden introducirse en el vector fluido y/o en las partículas de matriz de tejido acelular antes, durante o después de la mezcla 108. Las células semilla pueden, en algunas realizaciones, comprender células de un paciente, es decir, células autólogas, para su siembra en la composición del producto tisular antes de la aplicación de la composición del producto tisular. En algunas realizaciones de ejemplo, las células semilla pueden cultivarse con el vector fluido y las partículas de matriz de tejido acelular antes de la aplicación; en otras realizaciones de ejemplo, las células semilla pueden aplicarse a la composición del producto tisular tras la aplicación. Las células semilla pueden incluir, entre otras, adipocitos, diversas células madre, células sanguíneas, etc., que pueden promover la adhesión, infiltración y/o crecimiento de otras células a la composición del producto tisular inyectado. Del mismo modo, pueden incluirse diversos factores de crecimiento u otras sustancias en la composición del producto tisular para fomentar el crecimiento de células en la composición del producto tisular inyectado.

Como se ha descrito antes, las composiciones de productos tisulares deben tener la capacidad de favorecer el crecimiento celular y la regeneración tisular. Además, las composiciones de productos tisulares pueden tener la capacidad de actuar como vectores y favorecer el crecimiento de células, como las células autólogas del paciente. Por consiguiente, los procesos descritos en el presente documento no deberían alterar las proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, dañando la estructura proteica y/o eliminando glicosaminoglicanos y/o factores de crecimiento importantes). En algunas realizaciones, los productos tendrán bandas de colágeno normales tal y como se pone de manifiesto mediante microscopía y se describe más adelante.

En varias realizaciones (no con arreglo a invención reivindicada), los productos tisulares se tratan con un proceso que retiene el ácido hialurónico nativo y el condroitín sulfato, o ambos. Por consiguiente, los productos tisulares pueden incluir ácido hialurónico y sulfato de condroitina, o ambos. Además, se puede seleccionar el proceso para que mantenga los factores de crecimiento nativos. Por ejemplo, los productos tisulares pueden producirse de forma que contengan uno o más factores de crecimiento seleccionados entre PECAM-1, HGF, VEGF, PDGF-BB, follistatina, IL-8 y FGF básico.

A. Composiciones de ejemplo de productos tisulares

Pueden mezclarse diversos materiales a base de ácido hialurónico con partículas de matriz de tejido acelular para producir diversas composiciones de productos tisulares descritas en la Tabla 1 siguiente, de acuerdo con la presente invención. Debe apreciarse que los materiales a base de ácido hialurónico descritos en el presente documento son sólo de ejemplo, y que pueden mezclarse otros materiales a base de ácido hialurónico con las partículas de matriz de tejido acelular. Además, las composiciones expuestas en la Tabla 1 son sólo de ejemplo, y pueden formarse otras formulaciones de composiciones de productos tisulares de acuerdo con la presente invención.

Para formular las composiciones de productos tisulares descritas en la Tabla 1, se utilizaron cuatro tipos diferentes de materiales a base de ácido hialurónico. Todos los tipos de AH utilizados para formar las composiciones 1-11 estaban inicialmente en una solución con una concentración de 20 mg de AH/mL. El AH Tipo 1 es un ácido hialurónico no reticulado con un valor G' de 320 Pa; el AH Tipo 2 y el AH Tipo 3, en cambio, son ácidos hialurónicos reticulados con un agente de reticulación EDC con diferentes valores G' y G", como puede verse en la Fig. 4, dependiendo del grado de reticulación. El AH Tipo 2 tenía un valor G' de 160 Pa y el AH Tipo 3 tenía un valor G' de entre 500-550. El AH Tipo 4 también está reticulado, pero utiliza BDDE como agente reticulante. El AH Tipo 4 puede tener un valor G' de 350 Pa.

Tabla 1

Por lo que respecta a la Tabla 1, se describen realizaciones de ejemplo de composiciones de productos tisulares formadas de acuerdo con la presente invención. Las composiciones 1-11, que representan diversas composiciones de productos tisulares, se ilustran en la Tabla 1, pero debe apreciarse que se pueden formar otras composiciones de productos tisulares de acuerdo con la presente invención. Para cada Composición 1 11, las partículas de matriz de tejido acelular proceden de matriz dérmica acelular (ADM) porcina y, cuando se combinan con el vector fluido, producen suspensiones de matriz dérmica acelular (ADMS), que también pueden denominarse "ADM fluida". Antes de mezclarlas con el vector fluido, que se proporcionó en una concentración de 20 mg AH/mL, las partículas de matriz de tejido acelular estaban en una concentración de 150 AH/mL. Como puede apreciarse en la Tabla 1, la relación ADM:AH puede ajustarse para producir suspensiones con diferentes propiedades de fluidez, como se describe más adelante. Debe entenderse que las proporciones aquí descritas pueden ser por volumen o por masa; en las realizaciones de ejemplo mostradas en la Tabla 1, la proporción se da como volumen ADM : volumen AH. En algunas realizaciones de ejemplo, la proporción de<a>D<m>: AH puede variar entre 1:9 y 19:1. Como se ejemplifica en las Composiciones 1 y 2, la proporción de ADM : AH puede ser 9:1; como se ejemplifica en las Composiciones 3 y 4, la proporción de ADM :<a>H puede ser 7:3; como se ejemplifica en las Composiciones 5 y 6, la proporción de ADM :<a>H puede ser 4:6; como se ejemplifica en la Composición 7, la proporción de ADM : AH puede ser 1:9; como se ejemplifica en las Composiciones 8, 9 y 10, la proporción de ADM : AH puede ser 5:5; y como se ejemplifica en la Composición 11 (no con arreglo a invención reivindicada), la proporción de ADM : AH puede ser 19:1. Debe apreciarse que las proporciones descritas anteriormente son sólo de ejemplo, y otras realizaciones de ejemplo de composiciones de productos tisulares pueden tener otras proporciones de ADM : AH, incluyendo valores entre las proporciones de ejemplo.

De acuerdo con determinados aspectos de la presente divulgación, puede utilizarse una composición de producto tisular con un contenido sólido de partículas de matriz tisular deseado. Por ejemplo, se puede desear un material que tenga un contenido sólido del 2% al 20%, tal como un contenido sólido del 10% al 15%, dependiendo de qué tipo de material basado en ácido hialurónico se mezcle con las partículas de matriz tisular. En algunas realizaciones de ejemplo, la composición del producto tisular tiene un contenido sólido del 15%, correspondiente a 150 mg/mL, de partículas de matriz de tejido acelular.

Por lo que respecta de nuevo a la Fig. 1, el método 100 de formación de composiciones de productos tisulares puede incluir además la clasificación 105 de las partículas de matriz tisular por tamaño de partícula. En algunas realizaciones de ejemplo, la clasificación 105 puede incluir filtrar las partículas de matriz tisular a través de uno o más tamices. Si bien se muestra que la clasificación 105 ocurre después de la descelularización 103 y antes de la esterilización 107, debe apreciarse que la clasificación 105 puede ocurrir antes de la descelularización 103 y/o después de la esterilización 107, si se desea. Además, las partículas de matriz tisular pueden clasificarse de otras formas distintas al filtrado.

En una realización de ejemplo, las partículas de matriz tisular pueden filtrarse a través de un primer tamiz que define un primer diámetro de tamiz y un segundo tamiz que define un segundo diámetro de tamiz que es menor que el primer diámetro de tamiz. El primer tamiz permite el paso de partículas de matriz tisular con tamaños de partícula inferiores al diámetro del primer tamiz, mientras que el segundo tamiz permite el paso de partículas de matriz tisular con tamaños de partícula inferiores al diámetro del segundo tamiz. En este sentido, una primera mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas que quedan en el primer tamiz puede definir un primer tamaño medio de partícula mayor que el diámetro del primer tamiz, y una segunda mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas que quedan en el segundo tamiz puede definir un segundo tamaño medio de partícula menor que el diámetro del primer tamiz pero mayor que el diámetro del segundo tamiz.

La primera mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas y la segunda mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas pueden combinarse 106 para producir una mezcla de partículas de matriz tisular con una distribución de tamaños deseada. Se apreciará que se pueden utilizar más de dos tamices, cada uno de los cuales define un diámetro de tamiz respectivo, para clasificar 105 las partículas de matriz tisular por tamaño de partícula. En una realización de ejemplo, los tamaños de las partículas de matriz tisular pueden oscilar entre 50 micras y 3.500 micras.

Por ejemplo, las partículas de matriz tisular pueden tamizarse para recuperar partículas con las siguientes dimensiones: partículas Extrafinas (por ejemplo, 50-100 micras); partículas Finas (por ejemplo, 100-400 micras); partículas Medianas (por ejemplo, 0,4 mm a 0,6 mm); partículas Grandes (por ejemplo, 0,8 mm a 1 mm); y partículas Mayores (por ejemplo, >1 mm). En algunos aspectos de la presente divulgación, los tamaños de partículas en este rango pueden no invocar una respuesta biológica variada. En otras palabras, por ejemplo, puede que no haya diferencia en las respuestas biológicas con tamaños de partículas que oscilen entre 50 micras y 3.500 micras. Diferentes aplicaciones que pueden requerir un tamaño específico de una aguja de inyección pueden seleccionar un tamaño específico de partícula(s) sin necesidad de considerar si las respuestas biológicas serán diferentes.

Con respecto a la Fig. 2, se ilustran distribuciones de tamaño de partícula de matriz tisular de ejemplo. Como puede verse, el gráfico ilustra un primer diagrama de tamaño de partícula 201, un segundo diagrama de tamaño de partícula 202, y un tercer diagrama de tamaño de partícula 203 de varias composiciones de producto tisular formadas de acuerdo con la presente invención. El primer gráfico de tamaño de partícula 201 muestra una primera composición de producto tisular que tiene una mayoría de tamaños de partícula que van de 200 a 2000 mm; el segundo gráfico de tamaño de partícula 202 muestra una segunda composición de producto tisular que tiene una mayoría de tamaños de partícula que van de 200 a 2000 mm; y el tercer gráfico de tamaño de partícula 203 muestra una tercera composición de producto tisular que tiene una mayoría de tamaños de partícula que van de 500 a 2500 mm, como se muestra. El control de la distribución del tamaño de las partículas de la matriz tisular puede permitir el ajuste de las propiedades de flujo y/o propagación de la composición del producto tisular.

B. Propiedades de composiciones de ejemplo de productos tisulares

Para determinar cómo contrastan las propiedades de las composiciones de producto tisular formadas de acuerdo con la presente invención con las láminas y/o partículas de matriz de tejido acelular pura, se realizaron varias pruebas para medir las propiedades de las composiciones de producto tisular. Una de estas pruebas que se realizó fue calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la temperatura de inicio de varias realizaciones de ejemplo de composiciones de producto tisular que incluyen un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico y partículas de matriz de tejido acelular. A partir del análisis DSC, se observó que las composiciones de producto tisular probadas con el vector fluido y las partículas de matriz de tejido acelular pueden tener una temperatura de inicio en un intervalo entre 55 °C y 60 °C, que es similar a la temperatura de inicio (56 °C - 58 °C) de la matriz dérmica acelular en láminas.

Por lo que respecta a las Figs. 3 y 4, se ilustran los análisis reológicos de varias composiciones de productos tisulares. La Fig. 3 ilustra un informe de barrido de amplitud de matriz dérmica acelular en una forma fluida (suspensión) que tiene un contenido sólido del 15%, correspondiente a una concentración de 150 mg/mL. El barrido de frecuencia se realizó a una deformación del 0,3% para determinar un gráfico de módulo elástico ("almacenamiento") (G') 301, un gráfico de módulo viscoso ("pérdida") (G") 302, y un gráfico de ángulo de fase (8) 303 como funciones de porcentajes de deformación pura compleja. Como es sabido en reología, G' indica generalmente la capacidad de un material para recuperar su forma después de la deformación, es decir, la elasticidad, mientras que G" indica generalmente la viscosidad de un material.

Por lo que respecta a la Fig. 4, se ilustran los valores G' y G" de varias composiciones de productos tisulares y vectores fluidos. Los valores G' y G" de la Fig. 4 se determinaron utilizando barrido de amplitud a una frecuencia de 5 Hz; el valor G' se muestra a la izquierda para cada material, mientras que el valor G" se muestra a la derecha para cada material. Como puede observarse, los valores G' y G" para la matriz tisular pura son superiores a los valores respectivos de cualquiera de las Composiciones 1-7 que incluyen partículas de matriz tisular mezcladas dentro de un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico o AH Tipos 1-4. En particular, la viscosidad de las Composiciones 1-7 son significativamente inferiores a la viscosidad de las partículas de matriz tisular pura. El valor G" de las Composiciones 1-7, como se muestra, es inferior a 600 Pa, y algunas de las composiciones tienen valores G" inferiores a 500 Pa.

La Fig. 5 ilustra un gráfico 500 que muestra la carga de compresión como una función de la extensión de compresión para varias composiciones de producto tisular inyectadas usando una jeringa con una aguja de calibre 18. Como se puede observar, los gráficos de carga frente a extensión 501, 502, 503 para varias inyecciones de partículas de matriz de tejido acelular pura tienen grandes grados de fluctuación de la carga de compresión y cargas de compresión máximas por encima de 10N durante la inyección. Por el contrario, el diagrama de carga frente a extensión 504 para una inyección de una composición de producto tisular que comprende partículas de matriz de tejido acelular mezcladas con AH Tipo 1 en una proporción ADM : AH de 9:1, es decir, la composición de producto tisular es un 90% partículas de matriz de tejido acelular y un 10% vector fluido, tiene una carga de compresión relativamente constante y baja durante la inyección. Por lo tanto, debe apreciarse que mezclar las partículas de matriz de tejido acelular con el vector fluido puede tanto reducir las cargas de compresión pico en las partículas de matriz tisular durante la inyección como hacer que la inyección sea "más suave."

Por lo que respecta a la Fig. 6, un gráfico 600 ilustra las cargas de compresión máximas para varias<composiciones de producto tisular inyectadas a través de una aguja de calibre>18<y, cuando es factible, a través>de una aguja de calibre 21. En cada ensayo se colocó 1 mL de composición de producto tisular en un depósito para inyección a través de una aguja de calibre 18 o 21 presionando un émbolo, con el émbolo siendo presionado un total de 40 mm a una velocidad de 1 mm/seg. Como es sabido, una aguja de calibre 21 tiene un diámetro interior significativamente reducido en comparación con una aguja de calibre 18. La carga de compresión máxima para una aguja de calibre 18 se muestra a la izquierda para cada material, mientras que la carga de compresión máxima para una aguja de calibre 21 se muestra a la derecha para cada material; no se muestra una carga de compresión máxima para la inyección de matriz de tejido acelular puro a través de una aguja de calibre 21 porque las partículas son generalmente demasiado grandes para pasar a través de una aguja de calibre 21 en forma pura. Como se puede observar en la Fig. 6, la carga de compresión máxima para inyectar partículas de matriz de tejido acelular puro a través de una aguja de calibre 18 fue significativamente mayor que la carga de compresión máxima para inyectar cualquiera de las Composiciones 1-7, formadas de acuerdo con la presente invención, a través de una aguja de calibre 18. No se ilustra una carga de compresión máxima para inyectar partículas de matriz de tejido acelular puro a través de una aguja de calibre 21. Se observó que la inyección de las Composiciones 1, 2, 4 y 6 que comprenden partículas de matriz de tejido acelular y un vector fluido a través de una aguja de calibre 21 producía una carga de compresión máxima menor que la inyección de partículas de matriz de tejido acelular puras a través de una aguja de calibre 18, significativamente mayor. La inyección de las Composiciones 3, 5 y 7 también fue posible a través de una aguja de calibre 21, aunque las cargas de compresión máximas respectivas resultaron ser más elevadas que para las Composiciones 1, 2, 4 y 6. Por lo tanto, debe apreciarse que la mezcla de partículas de matriz de tejido acelular dentro de un vector fluido que comprende un material a base de ácido hialurónico puede producir una composición de producto tisular adecuada para la inyección a través de una aguja de calibre 21.

C. Las composiciones de productos tisulares tienen una estructura de colágeno intacta

Por lo que respecta a las Figs. 7-15, se muestran varias imágenes de microscopio para ilustrar la estructura general y la distribución de varias composiciones de productos tisulares.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 7, se muestra la tinción tricrómica de una composición de producto tisular que incluye partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro de un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico. Como puede verse en la Fig. 7, no hay daño apreciable de las fibras de colágeno y el colágeno tiene patrones de bandas normales.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 8, se muestra una imagen de microscopio de tinción de hematoxilina-eosina (H&E) de partículas de matriz de tejido acelular puro. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 9, se muestra una imagen de microscopio de tinción H&E de una composición de producto tisular que incluye una proporción 5:5 de partículas de matriz de tejido acelular frente a vector AH4. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales y las moléculas de AH4 tienden a congregarse alrededor de las periferias de las partículas.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 10, se muestra una imagen de microscopio de tinción H&E de una composición de producto tisular que incluye una proporción 9:1 de partículas de matriz de tejido acelular frente a vector AH2. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales y las moléculas de AH2 tienden a intercalarse entre las partículas.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 11, se muestra una imagen de microscopio de tinción H&E de una composición de producto tisular que incluye una proporción 1:9 de partículas de matriz de tejido acelular frente a vector AH3. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales y las moléculas de AH3 rodean las partículas.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 12, se muestra una imagen de microscopio de tinción con azul alcián de partículas de matriz de tejido acelular puro. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 13, se muestra una imagen de microscopio de tinción con azul alcián de una composición de producto tisular que incluye una proporción 5:5 de partículas de matriz de tejido acelular frente a vector AH4. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales y las moléculas de AH4 tienden a congregarse alrededor de las periferias de las partículas.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 14, se muestra una imagen de microscopio de tinción con azul alcián de una composición de producto tisular que incluye una proporción 9:1 de partículas de matriz de tejido acelular frente a vector AH2. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales y las moléculas de AH2 tienden a intercalarse entre las partículas.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 15, se muestra una imagen de microscopio de tinción con azul alcián de una composición de producto tisular que incluye una proporción 1:9 de partículas de matriz de tejido acelular frente a vector AH3. Como se puede observar, las fibras de colágeno son normales y las moléculas de AH3 rodean las partículas.

Por lo tanto, debe apreciarse que las composiciones de productos tisulares que incluyen un vector fluido que comprende un material a base de ácido hialurónico y partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro del vector pueden tener una estructura adecuada para soportar el crecimiento tisular.

D. Implantaciónin vivode las composiciones de productos tisulares utilizando ácido hialurónico (AH) como vector (no con arreglo a la invención reivindicada).

Las composiciones de productos tisulares divulgadas que utilizan ácido hialurónico (AH) como vector fluido pueden tener ciertas ventajas cuando se utilizan como implantesin vivoen un tejido dérmico huésped.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 16, se mezclaron partículas de matriz de tejido acelular (15% de contenido sólido) con un vector de AH no reticulado de 20 mg/mL (2%) en una proporción de volumen de 19:1. El contenido sólido final de las partículas de matriz de tejido acelular fue del 14,25%, y la concentración final del vector de HA fue del 0,1%. Para la implantación del tejido, se inyectaron 120 mL de la mezcla en el espacio subdérmico entre la dermis y las capas musculares de la región dorsal de una rata. Se sometieron a ensayo cinco ratas con 4 brazos de ensayo cada una. Se realizó una explantación 4 semanas después de la implantación, y el explante se colocó en 15 mL de formalina al 10% para su procesamiento histológico seguido de una tinción H&E. Se tomaron imágenes a 20 aumentos. Como se muestra en la Fig. 16, el producto tisular implantado con AH como vector se integró bien en el tejido dérmico del huésped 4 semanas después de la implantación. Se produjo una notable infiltración celular con fibroblastos y vascularización con poca o ninguna inflamación.

Por lo que respecta a la Fig. 17, se probaron las respuestas biológicas en implantes de tejido con o sin AH como vector. Se utilizaron partículas de matriz de tejido acelular con un contenido sólido del 15%. Cuando se utilizó AH como vector, la matriz de tejido acelular se mezcló con un vector de AH no reticulado de 20 mg/mL (2%) en una proporción de volumen de 9:1. El contenido sólido final de las partículas de matriz de tejido acelular fue del 13,5% y la concentración final de AH fue del 0,2%. Para la implantación tisular, se inyectaron por vía subcutánea 500 mL de partículas de matriz de tejido acelular solas o de la mezcla de partículas de matriz de tejido acelular con AH como vector en la región dorsal de una rata. Se sometieron a ensayo cinco ratas con 4 brazos de ensayo cada una. Se realizó una explantación 4 semanas o 12 semanas después de la implantación, y los explantes se colocaron en 15 mL de formalina al 10% para el procesamiento histológico seguido de una tinción H&E. Las imágenes se tomaron a 10 aumentos. Se examinaron las respuestas biológicas, como la infiltración celular, la vascularización y la inflamación mínima. Como se muestra en las Figs. 17A-D, se observaron respuestas biológicas similares en los explantes de tejido con la matriz de tejido acelular sola y la matriz de tejido acelular con AH como vector. Estos resultados demuestran que el uso de AH como vector no afecta negativamente a las respuestas biológicas del huésped a los implantes de tejido, y los resultados duran al menos 12 semanas después de la implantación.

Por lo que respecta específicamente a las Figs. 18A y 18B, se probó el aumento del grosor dérmico en la zona implantada. Se mezclaron partículas de matriz de tejido acelular (15% de contenido sólido) con un vector de AH no reticulado de 20 mg/mL (2%) en una proporción de volumen de 19:1. El contenido sólido final de las partículas de matriz de tejido acelular fue del 14,25% y la concentración final del vector de AH fue del 0,1%. Para la implantación del tejido, se inyectaron 120 mL de la mezcla en el espacio subdérmico entre la dermis y las capas musculares de la región dorsal de una rata. Se sometieron a ensayo 5 ratas con 4 brazos de ensayo cada una. Se realizó una explantación 4 semanas o 12 semanas después de la implantación, y los explantes se colocaron en 15 mL de formalina al 10% para el procesamiento histológico seguido de una tinción de H&E. Como se muestra en la Fig. 18, la implantación de la matriz de tejido acelular con AH como vector aumentó significativamente el grosor del tejido dérmico, y el aumento del grosor dérmico dura hasta 12 semanas después de la implantación (Fig. 18<b>).

E. Retención de volumen de composiciones de productos tisulares implantados (no con arreglo a la invención reivindicada)

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 19, se probó la retención de volumen de la matriz de tejido acelular implantada. Para la implantación de tejido, se inyectaron 500 mL de partículas de matriz de tejido acelular (15% de contenido sólido) por vía subcutánea en la región dorsal de una rata. Se realizó una explantación 4 semanas, 12 semanas o 24 semanas después de la implantación. Para la explantación de 4 semanas, se sometieron a ensayo 10 ratas con 4 brazos de ensayo cada una. Para las explantaciones de 12 y 24 semanas, se sometieron a ensayo 5 ratas por cada grupo con 4 brazos de ensayo en cada rata. Se recuperaron y pesaron los explantes. Como se muestra en la Fig. 19, la matriz de tejido acelular implantada retuvo bien al menos el 90% de su volumen original (línea de puntos) durante al menos 24 semanas después de la implantación.

Por lo que respecta específicamente a la Fig. 20, las partículas de matriz de tejido acelular se trataron con diferentes concentraciones de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (0,00625%, 0,0125%, 0,025% y 0,05%) durante 18 horas para formar productos de tejido reticulado. Los productos reticulados se sometieron a una esterilización final y se lavaron tres veces con PBS, durante 30 min en cada ocasión. Se registraron el peso del tubo y el peso del tejido húmedo antes de tratar los tejidos con 1250 U/mL de colagenasa durante 4h, 8h y 16h, respectivamente. Se analizaron tres muestras para cada condición. Tras la incubación, los tejidos restantes se secaron durante la noche y se registró el peso de los tejidos secos en el tubo. Se calcularon las proporciones de peso de los tejidos secos respecto a los tejidos húmedos antes del tratamiento enzimático para cada punto temporal. Como se muestra en la Fig. 20, la matriz de tejido acelular reticulado presentaba una resistencia a la colagenasa significativamente mayor que la matriz de tejido acelular no reticulado. Las concentraciones más altas del agente reticulante dieron como resultado una mayor resistencia a la colagenasa para el mismo periodo de incubación.

Por lo que respecta específicamente a las Figs. 21 y 22, se sometieron a ensayo matrices de tejido acelular reticulado para la implantaciónin vivo.Se reticularon 500 mL de partículas de matriz de tejido acelular (15% de contenido sólido) con EDC al 0,0125% (L modificado) o al 0,05% (H modificado), respectivamente, y se inyectaron por vía subcutánea en la región dorsal de una rata. Se sometieron a ensayo cinco ratas para cada condición, con 4 brazos de ensayo en cada rata. Se realizó una explantación 4 o 24 semanas después de la implantación. Se cosecharon y pesaron los explantes. Los explantes recolectados se tiñeron con tinción H&E y se tomaron imágenes representativas a 20 aumentos. Como se muestra en la Fig. 21, los volúmenes de las matrices de tejido implantadas se mantuvieron bien durante al menos 24 semanas, y un mayor nivel de reticulación dio lugar a una mejor retención del volumen. Como se muestra en la Fig. 22, se observaron respuestas biológicas similares en los explantes con matrices tisulares sin modificar, L modificado y H modificado.

F. Usos de ejemplo de la composición del producto tisular

En una realización de ejemplo proporcionada de acuerdo con la presente invención, una composición de producto tisular que incluye un vector fluido que comprende un material basado en ácido hialurónico y partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro del vector puede cargarse en una jeringa para formar un dispositivo de inyección. En algunas realizaciones de ejemplo, la composición de producto tisular puede ser cualquiera de las composiciones de producto tisular descritas anteriormente. La jeringa generalmente incluye un depósito que define un volumen y una aguja acoplada fluidamente al depósito. La composición del producto tisular se mantiene en el depósito, y en algunas realizaciones de ejemplo puede llenar completamente el volumen del depósito, que puede ser cualquier volumen deseado, por ejemplo entre 0,5 mL y 5 mL. Para determinados procedimientos, puede utilizarse un depósito con un volumen considerablemente mayor, como 200 mL. El diámetro interior de la aguja puede seleccionarse, según se desee, de acuerdo con el lugar de inyección y el procedimiento que se vaya a realizar. En algunas realizaciones de ejemplo (no con arreglo a la invención reivindicada), la aguja puede ser una aguja de calibre 18, una aguja de calibre 19, una aguja de calibre 20, una aguja de calibre 21, o una aguja de calibre superior (diámetro interior inferior). El dispositivo de inyección puede llenarse previamente con la composición del producto tisular y almacenarse antes de ser inyectado.

Alternativamente, el dispositivo de inyección puede formarse durante el procedimiento por un usuario, como un médico, cargando la composición del producto tisular en una jeringa vacía. Además, las composiciones divulgadas pueden proporcionarse como un kit (no con arreglo a la invención reivindicada), en el que las partículas de matriz tisular se mantienen en un recipiente separado del vector o componente HA, y un usuario puede mezclar el componente antes del uso. El kit puede incluir dos o más jeringas, dos o más viales, una combinación de vial/jeringa, o un sistema de compartimentos múltiples que permita una mezcla fácil en el momento del uso. Debe apreciarse que, si bien el dispositivo de inyección se describe como una jeringa, el dispositivo de inyección puede adoptar otras formas adecuadas para inyectar la composición del producto tisular en un paciente.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de producto tisular, que comprende: un vector fluido que comprende un material a base de ácido hialurónico; y una pluralidad de partículas de matriz de tejido acelular mezcladas dentro del vector, donde la composición comprende una relación de volumen de matriz tisular frente a vector de 1:9 a 9:1, y en la que el material a base de ácido hialurónico tiene un componente de bajo peso molecular y un componente de alto peso molecular; el componente de bajo peso molecular tiene un peso molecular de 200000 Daltons a 1 000000 Daltons y el componente de alto peso molecular tiene un peso molecular que al menos duplica el peso molecular del componente de bajo peso molecular.

2. La composición de la reivindicación 1, donde el material a base de ácido hialurónico es un ácido hialurónico reticulado.

3. La composición de la reivindicación 1, donde el material a base de ácido hialurónico es un ácido hialurónico no reticulado.

4. La composición de la reivindicación 1, donde el vector tiene una concentración de aproximadamente 20 mg/mL de ácido hialurónico antes de la mezcla.

5. La composición de la reivindicación 1, donde las partículas de matriz tisular proceden de una matriz dérmica.

6. La composición de la reivindicación 5, donde las partículas de matriz tisular proceden de una matriz dérmica y una matriz adiposa.

7. La composición de la reivindicación 1, donde la proporción es 9:1, 7:3, 5:5, 4:6 o 1:9.

8. La composición de la reivindicación 1, donde el vector y las partículas de matriz tisular se mezclan para formar una suspensión con un contenido sólido del 1,5% al 14,25%.

9. La composición de la reivindicación 8, donde la suspensión tiene un valor G" a 5 Hz inferior a 600 Pa.

10. La composición de la reivindicación 9, donde el valor G" a 5 Hz es inferior a 500 Pa.

11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además una pluralidad de células semilla entremezcladas con las partículas de la matriz tisular y el vector.

12. Un método para producir una composición de producto tisular, que comprende: mezclar una pluralidad de partículas de matriz de tejido acelular dentro de un vector fluido que comprende un material a base de ácido hialurónico, donde la composición comprende una relación de volumen de matriz tisular frente a vector de 1:9 a 9:1, y donde el material a base de ácido hialurónico tiene un componente de bajo peso molecular y un componente de alto peso molecular; el componente de bajo peso molecular tiene un peso molecular de 200000 Daltons a 1000000 Daltons y el componente de alto peso molecular tiene un peso molecular que al menos duplica el peso molecular del componente de bajo peso molecular.

13. El método de la reivindicación 12, que comprende además clasificar las partículas de matriz tisular por tamaño de partícula.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la clasificación comprende filtrar las partículas de matriz tisular a través de al menos un tamiz.

15. El método de la reivindicación 14, en el que la clasificación comprende colar las partículas de matriz tisular a través de un primer tamiz que define un primer diámetro de tamiz y un segundo tamiz que define un segundo diámetro de tamiz que es diferente del primer diámetro de tamiz.

16. El método de la reivindicación 13, que comprende además combinar una primera mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas con una segunda mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas, definiendo la primera mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas un primer tamaño medio de partícula y la segunda mezcla de partículas de matriz tisular clasificadas un segundo tamaño medio de partícula diferente del primer tamaño medio de partícula.

17. El método de la reivindicación 13, donde la clasificación se produce antes de la mezcla.