JP7463273B2 - 流動性無細胞組織マトリックス製品および製造方法 - Google Patents

Description

本開示は、組織マトリックスに関し、より詳細には、審美的または非審美的目的のための組織再生を含む外科処置または医療処置に使用され得る注入材料に関する。

本開示は、米国特許法第１１９条に基づいて、２０１７年１０月１９日に出願された米国仮出願第６２／５７４，６７８号の優先権を主張するものであり、その全体が引用により本明細書に援用されるものとする。

現在、組織治療のための注入材料の改善に対する要求がある。例えば、様々な顔の特徴（例えば、線、皺、不十分な大きさ、または望ましい形状または形態ではない部分）を治療するために、ヒアルロン酸系材料などの注入材料が使用されることがある。そのような材料は、たとえ効果的であっても、最終的に体に吸収されるため、一時的な改善しか提供することができない。例えばヒアルロン酸（ＨＡ）を架橋することにより、吸収前に生体内でより長く持つヒアルロン酸材料を開発するための研究が行われてきたが、現在の材料は依然として注入後に体に必ず吸収されてしまう。

シリンジまたは他の操作が容易な注入デバイスまたは移植システムによる注入に適していながらも、より長続きする効果をもたらすことができる組織製品組成物に対する満たされていない要求が存在する。

そこで、本開示は、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体内で混合された無細胞組織マトリックス粒子を有する組織製品組成物を提供する。また、本開示は、そのような組成物を有する注入デバイスおよびそのような組成物を製造する方法も提供する。さらに、そのような組成物を使用した治療方法も提供する。

本開示は組織製品組成物を提供する。この組織製品組成物は、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体と、担体内で混合された複数の無細胞組織マトリックス粒子とを含むことができる。

また、本開示は、注入デバイスも提供する。この注入デバイスは、容積を規定するリザーバおよびリザーバに流体的に結合された針を含むシリンジと、リザーバ内に保持される組織製品組成物とを含むことができる。組織製品組成物は、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体と、担体内で混合された複数の無細胞組織マトリックス粒子とを含むことができる。

本開示は、組織製品組成物の製造方法も提供する。この方法は、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体内で複数の無細胞組織マトリックス粒子を混合するステップを含むことができる。

本開示は、開示される組織製品組成物を使用した治療方法も提供する。

上述した全体的な説明および以下の詳細な説明はともに、単なる例示および説明であって、特許請求の範囲に規定される本発明を限定するものではないことが理解されよう。

添付図面は、本明細書中に組み込まれて、その一部を構成するものであり、本開示の例示的な実施形態を例示し、その説明とともに本開示の原理を説明するのに役立つものである。
図１は、本発明に従って提供される組織製品を製造する方法の例示的な一実施形態を示すフローチャートである。 図２は、異なる粒子サイズ分布を有する組織製品組成物の例示的な実施形態を示すグラフである。 図３は、流動性担体内で混合されていない無細胞組織マトリックス粒子を含む組織製品組成物の振幅掃引レポートを示すグラフである。 図４は、様々な組織製品組成物についての５ＨｚでのＧ’値およびＧ”値を示すグラフである。 図５は、本発明に従って形成された組織製品組成物の例示的な一実施形態と比較した既知の組織製品組成物の圧縮伸長および荷重挙動を示すグラフである。 図６は、様々な組織製品組成物について様々な針サイズを使用した注入力を示すグラフである。 図７は、本発明に従って形成された組織製品組成物の例示的な一実施形態のトリクローム染色コラーゲンの顕微鏡写真である。 図８は、流動性担体内で混合されていない無細胞組織マトリックス粒子を含む組織製品組成物の顕微鏡写真である。 図９は、本発明に係る流動性担体と混合された無細胞組織マトリックス粒子を含む組織製品組成物の例示的な一実施形態の顕微鏡写真である。 図１０は、本発明に従って形成された組織製品組成物の別の例示的な実施形態の顕微鏡写真である。 図１１は、本発明に従って形成されたさらに別の組織製品組成物の顕微鏡写真である。 図１２は、本発明に従って形成されたさらに別の組織製品組成物の顕微鏡写真である。 図１３は、本発明に従って形成されたさらに別の組織製品組成物の顕微鏡写真である。 図１４は、本発明に従って形成されたさらに別の組織製品組成物の顕微鏡写真である。 図１５は、本発明に従って形成されたさらに別の組織製品組成物の顕微鏡写真である。 図１６は、移植から４週間後の宿主真皮組織への組織製品組成物の一体化を示す顕微鏡写真である。 図１７Ａ～図１７Ｄは、流動性ヒアルロン酸担体を含む場合と含まない場合の、移植された組織製品組成物について観察された生物学的応答を比較する顕微鏡写真のグループである。 図１８Ａおよび図１８Ｂは、移植後の真皮の厚さを経時的に比較する顕微鏡写真である。 図１９は、移植された組織製品組成物の体積保持を示すグラフである。 図２０は、架橋された組織製品組成物のコラゲナーゼ耐性を示すグラフである。 図２１は、様々な濃度のＥＤＣを使用して架橋された移植架橋組織製品組成物の体積保持を示すグラフである。 図２２は、様々な濃度のＥＤＣを使用して架橋された移植架橋組織製品組成物における生物学的応答を示すグラフである。

ここで、本開示に係る特定の例示的な実施形態を詳細に参照する。その特定の例が添付図面に示されている。同一または類似の部分を指すために、可能な限り、図面全体を通して同じ符号を使用するものとする。

本出願において、単数形の使用は、特に明記しない限り、複数形を含む。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語、並びに、「含む」および「含まれる」などの他の形態の使用は限定的なものではない。同様に、「備えている」という用語、並びに、「備える」などの他の形態の使用も限定的なものではない。本明細書に記載の任意の範囲は、両端点と、両端点間の全ての値を含むものと理解されたい。

本明細書で使用されている節の見出しは、単なる編成目的に過ぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍および論文に限定される訳ではないが、それらを含む、本出願で引用したすべての文書または文書の一部は、如何なる目的に対しても、その全体が引用により本明細書に明示的に援用されるものとする。

本明細書で使用される「無細胞組織マトリックス」という用語は、組織再生を支援する足場として役立つのに必要な相当量の天然コラーゲンおよび糖タンパク質を保持する、ヒトまたは動物組織に由来する細胞外マトリックスを指す。「無細胞組織マトリックス」は、酸抽出精製コラーゲンなどの精製コラーゲン材料とは異なるものであり、それらは、他のマトリックスタンパク質を実質的に含まず、精製プロセスにより組織マトリックスの自然な微細構造特性を保持しない。「無細胞組織マトリックス」と呼ぶが、そのような組織マトリックスは、例えば幹細胞や「無細胞組織マトリックス」が移植される患者からの細胞を含む、外来性細胞と結合されることを理解されたい。さらに、本明細書でさらに説明するように、「無細胞組織マトリックス粒子」とは、無細胞組織マトリックスの粒子を指すことを理解されたい。

「無細胞」または「脱細胞化」組織マトリックスは、光学顕微鏡を使用しても細胞が見えない組織マトリックスを指すことが理解されよう。

様々なヒトおよび動物組織を使用して、患者を治療するための製品を製造することができる。例えば、様々な疾患および／または構造的損傷（例えば、外傷、手術、萎縮、および／または長期の摩耗や変性により）に起因して損傷または喪失したヒト組織の再生、修復、増加、補強および／または治療のための様々な組織製品が製造されている。そのような製品は、例えば、無細胞組織マトリックス、組織同種移植片または異種移植片、および／または再構成組織（すなわち、成長できる材料をもたらすために細胞が播種された、少なくとも部分的に脱細胞化された組織）を含むことができる。

組織製品は、細胞成分の少なくとも一部を除去するために処理された真皮または他の組織からの無細胞組織マトリックス粒子を含むことができる。場合によっては、すべてまたは実質的にすべての細胞物質が除去され、それにより対応する細胞外マトリックスタンパク質が残る。本明細書では、真皮組織を無細胞組織マトリックス粒子の例示的な実施形態の供給源組織として主に説明するが、本明細書で説明する無細胞組織マトリックス粒子は他の組織タイプに由来し得ることを理解されたい。他の例示的な組織タイプには、脂肪組織、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）組織、筋肉組織、血管組織および骨組織が含まれるが、これらに限定されものではない。

本明細書に記載の供給源組織は、ヒトまたは動物の供給源に由来する。例えば、組織は死体から得られるものであってもよい。さらに、ヒトの組織は、生体ドナー（例えば、自己組織）から得ることもできる。組織は、ブタ、サルなどの動物または他の供給源から取得することもできる。動物の供給源を使用する場合、組織をさらに処理して、ブタや他の哺乳類には存在するがヒトや霊長類には存在しない１，３－α－ガラクトース部分などの抗原成分を除去することができる。さらに、組織は、抗原部分を除去するために遺伝的に改変された動物から得られるものであってもよい。Ｘｕ，Ｈｕｉ等による「Ａ Ｐｏｒｃｉｎｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｒｍａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｈａｔ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ－α－（１，３）－Ｇａｌａｃｔｏｓｅ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１５，１－１３（２００９）を参照されたい。この文献は、引用によりその全体が援用されるものとする。

本明細書で使用される「ヒアルロン酸系材料」は、ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む材料である。ＨＡはヒアルロン酸を指すとともに、その任意の塩も指し、それには、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸カルシウムおよびそれらの組合せが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒアルロン酸系材料には、ＨＡおよびその薬学的に許容される塩の両方を含むことができる。例示的なＨＡ系材料は、ＪＵＶＥＤＥＲＭ（登録商標）およびＪＵＶＥＤＥＲＭ ＶＯＬＵＭＡ（登録商標）として市販されている。ヒアルロン酸系材料は、例えばリドカインなどの追加の薬剤を含むことができることを理解されたい。

本明細書におけるＨＡの「分子量」を表す数値はすべて、ダルトンでの重量平均分子量（Ｍｗ）を示すものとして理解されたい。

ＨＡの分子量は、固有粘度（ｍ３／ｋｇ）＝９．７８×１０^－５×Ｍｗ^{０．６９０}、というＭａｒｋ Ｈｏｕｗｉｎｋの関係を使用する固有粘度測定から計算される。固有粘度は、欧州薬局方で規定されている手順（ＨＡモノグラフ Ｎ°１４７２，０１／２００９）に従って測定される。

本明細書で使用される高分子量ＨＡは、少なくとも約１．０百万ダルトン（ｍｗ≧１０^６Ｄａまたは１ＭＤａ）～約４．０ＭＤａの分子量を有するＨＡ材料を云う。本組織製品組成物に組み込まれる高分子量ＨＡは、約１．５ＭＤａ～約３．０ＭＤａの範囲の分子量を有するか、または高分子量ＨＡは、約２．０ＭＤａの重量平均分子量を有することができる。別の例では、高分子量ＨＡが約３．０ＭＤａの分子量を有するようにしてもよい。

本明細書で使用される低分子量ＨＡは、約１．０ＭＤａ未満の分子量を有するＨＡ材料を云う。低分子量ＨＡは、約２００，０００Ｄａ（０．２ＭＤａ）～１．０ＭＤａ未満、例えば、約３００，０００Ｄａ（０．３ＭＤａ）～約７５０，０００Ｄａ（０．７５ＭＤａ）の分子量を有することができるが、最大０．９９ＭＤａである。好ましくは、低分子量ＨＡ材料と高分子量ＨＡ材料の分子量分布の間に重なりは存在しない。好ましくは、低分子量ＨＡと高分子量ＨＡの混合物は、二峰性の分子量分布を有する。混合物は、マルチモーダル分布を持つ場合もある。

本発明の一態様では、組織製品組成物が、高分子量成分および低分子量成分を有するＨＡを含み、高分子量成分が、低分子量成分の重量平均分子量の少なくとも２倍の重量平均分子量を有し得る。例えば、組成物中の高分子量ＨＡと低分子量ＨＡの分子量比が少なくとも２：１であってもよい。例えば、組織製品組成物は、約５００，０００Ｄａの重量平均分子量を有する低分子量成分と、約１．０ＭＤａまたは少なくとも約１．０ＭＤａの重量平均分子量を有する高分子量成分とを有するＨＡを含むことができる。別の例では、本発明に係る組織製品組成物が、約８００，０００Ｄａの重量平均分子量を有する低分子量成分と、約１．６ＭＤａまたは少なくとも約１．６ＭＤａの重量平均分子量を有する高分子量成分とを有するＨＡを含むことができる。なお、多くの異なるタイプのＨＡを組織製品組成物に組み込むことができ、上述した例は限定することを意図していないことを理解されたい。

いくつかの例示的な実施形態では、ＨＡが、１または複数の適切な架橋剤を使用して架橋される。架橋剤は、多糖およびそれらの誘導体をそれらのヒドロキシル基を介して架橋するのに適していることが知られている任意の薬剤であってもよい。適切な架橋剤には、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（または１，４－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）ブタンまたは１，４－ビスグリシジルオキシブタン；これらはすべてＢＤＤＥとして一般的に知られている）、１，２－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）エチレン、１－（２，３－エポキシプロピル）－２，３－エポキシシクロヘキサン、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（一般にＥＤＣとして知られている）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の適切なヒアルロン酸架橋剤には、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル（ＰＥＴＧＥ）などの多機能ＰＥＧ系架橋剤、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、１，２－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）、１，２，７，８－ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、（フェニレンビス－（エチル）－カルボジイミドおよび１，６ヘキサメチレンビス（エチルカルボジイミド）、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）、１－（２，３－エポキシプロピル）－２，３－エポキシシクロヘキサン、またはそれらの組合せが含まれるが、それらに限定されるものではない。

本発明に従って形成された組織製品組成物の例示的な一実施形態では、組織製品組成物が、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体と、担体内で混合される複数の無細胞組織マトリックス粒子とを含む。いくつかの例示的な実施形態では、流動性担体が、追加の薬剤と混合されていないＨＡを含み、他の例示的な実施形態では、流動性担体が、追加の薬剤と混合されたＨＡを含む。追加の薬剤としては、麻酔薬、例えば、アミノアミド局所麻酔薬およびその塩、またはアミノエステル局所麻酔薬およびその塩が挙げられるが、それらに限定されるものではない。例えば、プロカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、シメトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロパラカイン、テトラカイン、またはそれらの塩、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、麻酔薬には、アルチカイン、ブピバカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカイン、またはそれらの塩、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

流動性担体は、当初は、組織マトリックス粒子と混合してスラリーを形成することができる流動性液体溶液の形態であってもよい。その後、形成したスラリーは、患者への投与のためにシリンジまたは他の注入デバイスに装填することができる。いくつかの例示的な実施形態では、流動性担体は、組織製品組成物の注入性を改善するのに十分な量の非架橋ＨＡであってもよい。本明細書では、流動性担体がＨＡを含むとして記載しているが、ＨＳＧＡＧ、ＣＳＧＡＧおよび／またはケラチン硫酸型ＧＡＧなど、他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を流動性担体として利用できると考えられる。

前述したように、無細胞組織マトリックス粒子は、ヒトまたは動物の組織マトリックスに由来するものであってもよい。適切な組織源には、同種移植組織、自家移植組織または異種移植組織が含まれる。異種移植片が使用される場合、組織には、ブタ、ウシ、イヌ、ネコを含む動物、家畜または野生の供給源、および／または他の任意の適切な哺乳動物または非哺乳動物の組織供給源からの組織が含まれる。いくつかの例示的な実施形態では、無細胞組織マトリックス粒子が、ブタなどの動物から採取された源真皮マトリックスに由来するものであってもよい。例示的な一実施形態では、源真皮マトリックスが、生物から除去された皮膚の１または複数の層を含むことができる。本明細書でさらに説明するように、既知の方法に従って、源組織マトリックスのサイズおよび形状を変化させて、様々な量の無細胞組織マトリックス粒子を生成することができる。

供給源組織は、任意の望ましい手法を使用して動物供給源から採取することができるが、可能であれば、無菌または滅菌技術を使用して通常は採取するようにしてもよい。組織は、低温または凍結状態で保存するようにしてもよく、あるいは長期保存による望ましくない変化を防ぐために直ちに処理するようにしてもよい。

無細胞組織マトリックスは、細胞の内殖および組織再生を可能にする適切な組織足場を提供することができる。皮膚の線、皺などにおいては、組織足場が、ＨＡや他の一時的な充填材料のように交換する必要なく、失われたボリュームを埋めるための長期的な解決策になる。組織足場を既存の皮膚または損傷した皮膚に注入して、注入部位でより厚い真皮を生成することができる。組織の足場は、大量の組織の修復など、他の医療用途にも役立つ場合がある。

無細胞組織マトリックスの使用に関して特定される具体的な問題の一つは、組織マトリックスにより形成されるネットワークに起因する、無細胞組織マトリックス材料の自然な形態での注入などの配置の困難さである。外科的移植は、無細胞組織マトリックス材料を移植して身体の特定の領域を修復するのに適した選択肢であるが、一部の用途では注入が好ましい場合がある。無細胞組織マトリックスの粒子化は、自然の形態で無細胞組織マトリックスを適用する場合と比較して、適用および注入を改善することが分かったが、粒子化されていても、純粋な無細胞組織マトリックスは、患者に容易に適用または注入されないことが分かった。特に、粒子状組織マトリックス材料の拡散する傾向に起因して、粒子状組織マトリックス材料の適用は制御が難しいことが分かった。さらに、粒子状無細胞組織マトリックスを注入するのに必要な注入力は比較的高く、シリンジなどの注入デバイスに装填された粒子状組織マトリックスのすべてを注入することは比較的難しいことが分かった。

無細胞組織マトリックス材料を注入する上記問題のいくつかに対処するために、本明細書に記載の例示的な実施形態は、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体内で混合される無細胞組織マトリックス粒子を含む組織製品組成物を提供する。形成した組織製品組成物は、本明細書でさらに説明するように、移植および／または注入領域での組織成長を促進する特性を維持しながら、純粋な無細胞組織マトリックス粒子よりも容易に適用することができる。

本明細書に記載の組織製品組成物は、様々な異なる解剖学的部位を治療するために使用され得る。例示的な一実施形態では、組織製品組成物は、例えば、皮膚の厚さを増加させることにより、線、皺、空隙または窪みを治療して、（例えば、真皮の厚みを増すことにより）ボリュームを追加するための、または少量の失われた組織を交換するための、少量の移植に適した注入可能な組織製品組成物として形成されるものであってもよい。他の例示的な実施形態では、組織製品組成物は、構造組織の広い領域の修復、乳房組織置換、または比較的大量の損傷および／または喪失した組織を修復および／または交換する必要がある他の領域の修復など、大量移植に適したパテまたはペーストとして形成することができる。他の例示的な実施形態では、組織製品組成物は、ＨＡまたは他の充填剤が利用される用途での使用に適した注入可能な組織製品組成物として形成されてもよく、注入された組織製品組成物が短期の治療ではなく長期の治療を示すものとなる。さらに他の例示的な実施形態では、組織製品組成物が、複数の供給源に由来するものであってもよい。例えば、組織製品組成物は、真皮マトリックスおよび脂肪マトリックスから生成されるものであってもよい。

ここで図１を参照すると、本発明に係る組織製品組成物を製造する方法１００の例示的な一実施形態が示されている。この方法１００は、概して、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体内で複数の無細胞組織マトリックス粒子を混合して、組織製品組成物を生成するステップを含む。いくつかの例示的な実施形態では、方法１００は、無細胞組織マトリックス粒子を流動性担体と混合１０８する前に、無細胞組織マトリックス粒子を生成するために、源真皮マトリックスなどの源組織マトリックスを処理するステップ１０２も含むことができる。例示的な一実施形態では、方法１００は、最初に源組織マトリックスを浄化するステップ１０１を含み、それにより汚れまたは他の破片または微生物などの汚染物質を除去して、処理１０２のために源組織マトリックスを洗浄および準備する。いくつかの例示的な実施形態では、浄化１０１が、源組織マトリックスを洗浄することを含む。例えば、源組織マトリックスは、様々な生体適合性緩衝液での１回または複数回のすすぎで洗浄することができる。例えば、適切な洗浄溶液には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または他の適切な生体適合性材料または生理学的溶液が含まれる。例示的な一実施形態では、水をリンス剤として使用して細胞をさらに破壊し、その後、リン酸緩衝生理食塩水または他の適切な生理食塩水を導入して、マトリックスタンパク質を生体適合性緩衝液に戻すことができる。多種多様な他の適切な浄化プロセスが知られていることから、ここでは、簡潔にするために浄化の詳細な説明は省略する。

源組織マトリックスは、源組織マトリックスを複数の組織マトリックス粒子に分解するために処理される（１０２）。源組織マトリックスは、一般的に言えば、源組織マトリックスの構造に起因して、当初は、シリンジまたは他の注入デバイスを介した容易な適用または注入に適さない形態である可能性がある。例えば、源真皮マトリックスは平面シートの形態である場合もあり、その場合、容易に、注入デバイスで機能したり、注入デバイスに装填したり、あるいは注入デバイスから排出したりすることができない。源組織マトリックスを処理するために（１０２）、粉砕機または他の機械的分離装置を使用して、源組織マトリックスの粉砕、混合、細断、すりおろしおよび／または他の機械的撹拌により、源組織マトリックスを組織マトリックス粒子に分解するようにしてもよい。いくつかの例示的な実施形態では、処理１０２は、本明細書でさらに説明するように、多くの異なる粒子サイズ（直径）を有する組織マトリックス粒子を生成することができる。

いくつかの場合において、処理１０２は、洗浄液または潤滑液を殆どまたは全く添加せずに組織を機械的に処理することにより実行することができる。例えば、組織は、溶媒を使用せずに粉砕または混合することにより機械的に処理されるようにしてもよい。例えば、組織の粉砕に水分が必要な場合、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水などの他の溶液ではなく、水を使用するようにしてもよい。代替的には、生理食塩水（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または塩および／または界面活性剤を含む溶液）などの生体適合性である一定量の溶媒を加えることにより、組織を処理することもできる。細胞溶解を促進する他の溶液が適切である場合もある。

本方法１００はさらに、源組織マトリックスまたは生成された組織マトリックス粒子を脱細胞化１０３して、注入後に患者に抗原応答を引き起こし得る実質的にすべての天然細胞物質を除去することを含むことができる。脱細胞化１０３は、複数の適切なプロセスを含むことができる。例えば、源組織マトリックスまたは組織マトリックス粒子から細胞を除去するための適切な方法には、細胞を破壊および／または細胞成分を除去するのに十分な濃度および時間で、デオキシコール酸、ポリエチレングリコールまたは他の界面活性剤などの界面活性剤で処理することが含まれる。いくつかの例示的な実施形態では、源組織マトリックスを組織マトリックス粒子に処理１０２した後に、脱細胞化１０３を行うことができ、他の例示的な実施形態では、源組織マトリックスを組織マトリックス粒子に処理１０２する前に、脱細胞化１０３を行うことができる。さらに他の例示的な実施形態では、源組織マトリックスを組織マトリックス粒子に処理１０２する前と後の両方で、脱細胞化１０３を行うことができる。脱細胞化１０３をいつ行うかにかかわらず、無細胞組織マトリックス粒子は、処理１０２と脱細胞化１０３の両方の後に生成されるべきである。

任意選択的には、本方法１００は、形成した無細胞組織マトリックス粒子をさらに浄化１０４して、処理１０２および／または脱細胞化１０３中に不注意で導入または生成された汚染物質を除去することを含むことができる。浄化１０４は、前述した浄化１０１と同様のものであっても、あるいは無細胞組織マトリックス粒子の追加の洗浄または処理を含むものであってもよい。例えば、追加の洗浄または処理を行って、霊長類以外の動物組織に存在し得るアルファ－１，３－ガラクトース部分などの抗原性物質を除去することができる。さらに、洗浄ステップの間、前および／または後に、追加の溶液または試薬を使用して材料を処理するようにしてもよい。例えば、酵素、界面活性剤および／または他の薬剤を１または複数のステップで使用して、細胞材料または脂質をさらに除去し、抗原性材料を除去し、かつ／または材料の細菌または他のバイオバーデンを低減することができる。例えば、細胞および脂質の除去を補助するために、ドデシル硫酸ナトリウムまたはＴＲＩＳなどの界面活性剤を使用する、１または複数の洗浄ステップを含むようにしてもよい。さらに、酵素、例えば、リパーゼ、ＤＮＡｓｅｓ、ＲＮＡｓｅｓ、アルファ－ガラクトシダーゼまたは他の酵素を使用して、核物質、異種源からの抗原、残留細胞成分および／またはウイルスを確実に破壊することができる。さらに、酸性溶液および／または過酸化物を使用して、細胞材料をさらに除去し、細菌および／またはウイルス、または他の潜在的な感染性病原体を破壊するのを助けることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、無細胞組織マトリックス粒子が、流動性担体との混合１０８の前または後に滅菌１０７されるようにしてもよい。例示的な一実施形態では、当技術分野で知られているように、滅菌１０７が電子ビーム滅菌を含むことができる。当技術分野で知られているように、代替的な滅菌技術も使用することができる。

無細胞組織マトリックス粒子および流動性担体は、任意の適切な方法で混合１０８することができる。例示的な一実施形態において、無細胞組織マトリックス粒子および流動性担体は、本発明に係る組織製品組成物を形成するために、ほぼ滅菌の条件下で大容量バッチで混合されるものであってもよい。混合１０８は、例えば、無細胞組織マトリックス粒子と流動性担体を一緒に攪拌してスラリーを形成することを含むことができる。混合１０８のパラメータおよび手法は、流動性担体および無細胞組織マトリックス粒子の特性、および組織製品組成物中のそれぞれの大体の量に従って、変更することができ、当業者であれば日常的な実験から容易に導き出すことができる。

いくつかの例示的な実施形態では、安定化のためにヒアルロン酸系材料が架橋されている。架橋は、無細胞組織マトリックス粒子との混合１０８の前、後またはその間に起こるようにしてもよい。いくつかの実施形態において、材料が凍結乾燥後に架橋される。しかしながら、凍結乾燥プロセスの前または最中に材料を架橋することもできる。架橋は様々な方法で実行することができる。例示的な一実施形態では、ヒアルロン酸系材料を、グルタルアルデヒド、ジェネピン、カルボジイミド（例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ））およびジイソシアネート、または１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（または１，４－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）ブタンまたは１，４－ビスグリシジルオキシブタン（これらはすべてＢＤＤＥとして一般的に知られている）などの１または複数の架橋剤と接触させることにより、架橋を行うことができる。さらに、材料を加熱することにより、架橋を行うようにしてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、材料を、減圧または真空で、７０℃～１２０℃、または８０℃～１１０℃、または約１００℃まで、または特定の範囲内の任意の値に加熱するようにしてもよい。さらに、紫外線照射、ガンマ線照射および／または電子ビーム照射を含む、他の架橋プロセス、またはプロセスの組合せを使用して、開示された架橋製品の何れかを生成するようにしてもよい。さらに、真空は必須ではないが、架橋時間を短縮する場合がある。さらに、マトリックスタンパク質の融解が起きない限り、かつ／または架橋に十分な時間が提供される限りは、より低い又は高い温度を使用することができる。

様々な実施形態では、架橋プロセスを制御して、所望の機械的、生物学的および／または構造的特徴を有する組織製品組成物を生成することができる。例えば、架橋は組織製品組成物の全体的な強度に影響を与える可能性があり、プロセスは所望の強度を生み出すように制御される。さらに、架橋の量は、移植時に組織製品組成物が所望の形状および構造（例えば、多孔性）を維持する能力に影響を与える可能性がある。このため、体内に移植されたとき、水性環境と接触したとき、かつ／または（例えば、周囲の組織または材料によって）圧縮されたとき、安定した三次元形状を生成するように架橋の量を選択することができる。

過剰な架橋は、細胞外マトリックス材料を変化させる可能性がある。例えば、過剰な架橋はコラーゲンまたは他の細胞外マトリックスタンパク質を損傷する可能性がある。損傷したタンパク質は、組織製品組成物が患者に注入されたときに、組織再生を支援しない場合がある。さらに、過剰な架橋により、材料が脆くなったり、弱くなったりする場合がある。このため、所望の生物学的、機械的および／または構造的特徴を維持しながら、所望のレベルの安定性をもたらすように、架橋の量が制御される。

いくつかの例示的な実施形態では、混合１０８の前、間または後に、流動性担体および／または無細胞組織マトリックス粒子に種細胞を導入することができる。種細胞は、いくつかの実施形態では、患者からの細胞、すなわち自己細胞を含み、組織製品組成物の適用前に組織製品組成物に播種される。いくつかの例示的な実施形態では、種細胞が、適用前に流動性担体および無細胞組織マトリックス粒子とともに培養されるようにしてもよく、他の例示的な実施形態では、種細胞は、適用後に組織製品組成物に適用されてもよい。種細胞には、注入された組織製品組成物への他の細胞の付着、浸潤および／または成長を促進する、脂肪細胞、様々な幹細胞、血液細胞などが含まれるが、これらに限定されるものではない。同様に、様々な成長因子または他の物質を組織製品組成物に含めるようにして、注入された組織製品組成物に対する細胞の成長を促進することができる。

上述したように、組織製品組成物は、患者の中または上に埋め込まれたときに、細胞の内殖および組織再生を支援する能力を有する必要がある。さらに、組織製品組成物は、患者の自己細胞などの細胞のための担体として機能するとともに、そのような細胞の成長を支援する能力を備える必要がある。このため、本明細書に記載のプロセスは、（例えば、タンパク質構造に損傷を与えたり、かつ／または重要なグリコサミノグリカンおよび／または成長因子を除去したりすることにより）細胞外マトリックスタンパク質を変えてはならない。いくつかの実施形態では、製品が、顕微鏡検査によって証明され、かつ本明細書でさらに説明するように、正常なコラーゲンバンディングを有するであろう。

種々の実施形態では、組織製品が、天然ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸の何れか一方または両方を保持するプロセスで処理される。このため、組織製品は、ヒアルロン酸および硫酸コンドロイチンの何れか一方または両方を含むことができる。さらに、ネイティブの成長因子を維持するプロセスを選択することができる。例えば、組織製品は、ＰＥＣＡＭ－１、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、フォリスタチン、ＩＬ－８およびＦＧＦ－ｂａｓｉｃのなかから選択される１または複数の成長因子を含むように生産されるものであってもよい。

Ａ．例示的な組織製品組成物
本発明に従って、様々なヒアルロン酸系材料を脂肪組織マトリックス粒子と混合して、以下の表１に記載の様々な組織製品組成物を生成することができる。なお、本明細書に記載のヒアルロン酸系材料は単なる例示に過ぎず、他のヒアルロン酸系材料を脂肪組織マトリックス粒子と混合できることを理解されたい。さらに、表１に示す組成物は例示に過ぎず、本発明に従って他の配合の組織製品組成物を形成することも可能である。

表１に記載の組織製品組成物を配合するために、異なる４タイプのヒアルロン酸系材料を使用した。組成物１～１１を形成するために使用されたすべてのＨＡタイプは、当初は、２０ｍｇＨＡ／ｍＬの濃度の溶液に含まれていた。ＨＡタイプ１は、３２０ＰａのＧ’値を有する非架橋ヒアルロン酸であり、ＨＡタイプ２とＨＡタイプ３は、対照的に、図４に示すように、架橋度に応じて異なるＧ’値およびＧ”値を持つＥＤＣ架橋剤で架橋されたヒアルロン酸である。ＨＡタイプ２のＧ’値は１６０Ｐａであり、ＨＡタイプ３のＧ’値は５００～５５０であった。ＨＡタイプ４も架橋されているが、架橋剤としてＢＤＤＥが使用されている。ＨＡタイプ４のＧ’値は３５０Ｐａである。

ここで表１を参照すると、本発明に従って形成された組織製品組成物の例示的な実施形態が記載されている。なお、様々な組織製品組成物を表す組成物１～１１を表１に例示するが、本発明に従って他の組織製品組成物を形成することができることを理解されたい。各組成物１～１１では、無細胞組織マトリックス粒子がブタ無細胞真皮マトリックス（ＡＤＭ）に由来し、流動性担体と混ぜ合わせたときに、「流動性ＡＤＭ」とも呼ばれる無細胞真皮マトリックススラリー（ＡＤＭＳ）を生成した。２０ｍｇのＨＡ／ｍＬの濃度で提供された流動性担体と混合する前に、無細胞組織マトリックス粒子は１５０ｍｇ／ｍＬの濃度であった。表１から分かるように、ＡＤＭ：ＨＡの比率は、本明細書でさらに説明されるように、様々な流動特性を有するスラリーを生成するように調整することができる。本明細書に記載の比率は、体積または質量の何れかによるものであり、表１に示す例示的な実施形態では、比率が、体積ＡＤＭ：体積ＨＡとして与えられることを理解されたい。いくつかの例示的な実施形態では、ＡＤＭ：ＨＡの比率が１：９から１９：１の間で変化し得る。組成物１、２に例示するように、ＡＤＭ：ＨＡの比率は９：１にすることができ、組成物３、４で例示するように、ＡＤＭ：ＨＡの比率は７：３とすることができ、組成物５、６に例示するように、ＡＤＭ：ＨＡの比率は４：６にすることができ、組成物７に例示するように、ＡＤＭ：ＨＡの比率は１：９にすることができ、組成物８、９、１０で例示するように、ＡＤＭ：ＨＡの比率は５：５にすることができ、組成物１１に例示するように、ＡＤＭ：ＨＡの比率は１９：１にすることができる。これらの比率は例示に過ぎず、組織製品組成物の他の例示的な実施形態は、例示的な比率の間の値を含む、ＡＤＭ：ＨＡの他の比率を有することができることを理解されたい。

本開示の特定の態様によれば、所望の組織マトリックス粒子固形分を有する組織製品組成物を使用することができる。例えば、固形分が１０％～１５％など、固形分が２％～２０％の材料が、組織マトリックス粒子と混合されるヒアルロン酸系材料の種類に応じて、望ましい場合がある。いくつかの例示的な実施形態では、組織製品組成物が、１５０ｍｇ／ｍＬに相当する１５％の無細胞組織マトリックス粒子の固形分を有する。

再び図１を参照すると、組織製品組成物を形成する方法１００は、粒子サイズにより組織マトリックス粒子を選別するステップ１０５をさらに含むことができる。いくつかの例示的な実施形態では、選別１０５が、１または複数の篩を通して組織マトリックス粒子を濾過することを含み得る。選別１０５は、脱細胞化１０３の後であって、滅菌１０７の前に行われるように示されているが、必要に応じて、選別１０５は、脱細胞化１０３の前かつ／または滅菌１０７の後に行うことができることを理解されたい。さらに、組織マトリックス粒子は、濾過以外の方法で選別されるものであってもよい。

例示的な一実施形態では、組織マトリックス粒子が、第１の篩径を規定する第１の篩と、第１の篩径よりも小さい第２の篩径を規定する第２の篩にかけられる。第１の篩は、第１の篩径よりも小さい粒子サイズの組織マトリックス粒子を通過させ、第２の篩は、第２の篩径より小さい粒子サイズの組織マトリックス粒子を通過させる。この意味で、第１の篩に残留する選別された組織マトリックス粒子の第１の混合物は、第１の篩径より大きい第１の平均粒子サイズを規定することができ、第２の篩に残留する選別された組織マトリックス粒子の第２の混合物は、第１の篩径より小さいが第２の篩径より大きい第２の平均粒子サイズを規定することができる。

選別した組織マトリックス粒子の第１の混合物および選別した組織マトリックス粒子の第２の混合物を混ぜ合わせて（１０６）、所望のサイズ分布を有する組織マトリックス粒子混合物を生成することができる。なお、それぞれの篩径を規定する３以上の篩を使用して、粒子サイズによって組織マトリックス粒子を選別（１０５）することができることを理解されたい。例示的な一実施形態では、組織マトリックス粒子サイズが、５０ミクロン～３５００ミクロンの範囲であり得る。例えば、組織マトリックス粒子を篩にかけて、超微細粒子（例えば、５０～１００ミクロン）、微細粒子（１００～４００ミクロンなど）、中程度の粒子（例えば、０．４ｍｍ～０．６ｍｍ）、大きな粒子（例えば、０．８ｍｍ～１ｍｍ）、さらに大きな粒子（例えば、１ｍｍ超）というような、寸法の粒子を回収することができる。本開示のいくつかの態様では、この範囲の粒子サイズが、様々な生物学的応答を引き起こさない場合がある。言い換えれば、例えば、５０ミクロン～３，５００ミクロンの範囲の粒子サイズでは、生物学的反応に差異が生じない可能性がある。特定のサイズの注射針を必要とする様々なアプリケーションでは、生物学的反応が異なるかどうかを考慮する必要なく、特定のサイズの粒子を選択することができる。

ここで図２を参照すると、例示的な組織マトリックス粒子サイズ分布が例示されている。このグラフは、図示のように、本発明に従って形成された様々な組織製品組成物の第１の粒子サイズプロット２０１、第２の粒子サイズプロット２０２、および第３の粒子サイズプロット２０３を示している。第１の粒子サイズプロット２０１は、２００～２０００μｍの範囲の粒子サイズを主に有する第１の組織製品組成物を示し、第２の粒子サイズのプロット２０２は、２００～２０００μｍの範囲の粒子サイズを主に有する第２の組織製品組成物を示し、第３の粒子サイズプロット２０３は、図示のように、５００～２５００μｍの範囲の粒子サイズを主に有する第３の組織製品組成物を示している。組織マトリックスの粒子サイズ分布を制御することにより、組織製品組成物の流れおよび／または拡散特性を調整することができる。

Ｂ．例示的な組織製品組成物の特性
純粋な無細胞組織マトリックスシートおよび／または粒子と比較して、組織製品組成物の特性が本発明に従って如何に形成されたのかを判断するために、組織製品組成物の特性を測定するための様々な試験を行った。実施したそのような試験の一つは、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体と無細胞組織マトリックス粒子とを含む組織製品組成物の様々な例示的な実施形態の開始温度を測定する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）であった。ＤＳＣ分析から、流動性担体および無細胞組織マトリックス粒子を含む試験済みの組織製品組成物は、無細胞真皮マトリックスのシートの開始温度（５６℃～５８℃）と同様の５５℃～６０℃の範囲の開始温度を持つことが分かった。

ここで図３および４を参照すると、様々な組織製品組成物のレオロジー分析が示されている。図３は、１５０ｍｇ／ｍＬの濃度に対応する、１５％の固形分を含む流動性（スラリー）形態の無細胞真皮マトリックスの振幅掃引レポートを例示している。使用した周波数掃引は、０．３％歪みであり、複合せん断歪みパーセンテージの関数として、弾性（「保存」）係数（Ｇ’）プロット３０１、粘性（「喪失」）係数（Ｇ”）プロット３０２、および位相角（δ）プロット３０３を求めた。レオロジーにおいて知られているように、Ｇ’は一般に、材料が変形後に形状を回復する能力、つまり弾性を示し、Ｇ”は一般に材料の粘度を示している。

ここで図４を参照すると、様々な組織製品組成物および流動性担体のＧ’値およびＧ’値が示されている。図４のＧ’値およびＧ”値は、５Ｈｚの周波数で振幅掃引を使用して求められたものである。Ｇ’値は各材料の左側に表示され、Ｇ”値は各材料の右側に表示されている。見て分かるように、純粋な組織マトリックスのＧ’値およびＧ”値は、ヒアルロン酸系材料またはＨＡタイプ１～４を含む流動性担体内で混合された組織マトリックス粒子を含む組成物１～７の何れか１つのそれぞれの値よりも高い。特に、組成物１～７の粘度は、純粋な組織マトリックス粒子の粘度よりも著しく低い。図示のように、組成物１～７のＧ”値は６００Ｐａ未満であり、組成物のいくつかは５００Ｐａ未満のＧ”値を有する。

図５は、１８ゲージ針を備えたシリンジを使用して注射された様々な組織製品組成物の圧縮伸長の関数として圧縮荷重を示すグラフ５００を例示している。見て分かるように、純粋な無細胞組織マトリックス粒子の様々な注射についての荷重対伸長プロット５０１、５０２、５０３はすべて、注射中に大きな圧縮荷重変動を有し、注射中に１０Ｎを超えるピーク圧縮荷重を有する。対照的に、ＡＤＭ：ＨＡの比率が９：１のＨＡタイプ１と混合された無細胞組織マトリックス粒子を含む組織製品組成物（９０％の無細胞組織マトリックスと１０％の流動性担体からなる組織製品組成物）の注射についての荷重対伸長プロット５０４は、注射中に比較的一定で低い圧縮荷重を有する。このため、無細胞組織マトリックス粒子を流動性担体と混合すると、注射中の組織マトリックス粒子へのピーク圧縮荷重が減少し、かつ注射が「より滑らか」になることを理解されたい。

図６を参照すると、グラフ６００は、１８ゲージの針を介して、可能なときは２１ゲージの針を介して注射された様々な組織製品組成物の最大圧縮荷重を示している。各試行では、プランジャを押し込んで１８ゲージまたは２１ゲージの針から注射するために、１ｍＬの組織製品組成物をリザーバに入れた。プランジャは、１ｍｍ／秒の速度で合計４０ｍｍ押し込んだ。既知のように、２１ゲージの針は、１８ゲージの針と比較して内径が大幅に小さくなっている。１８ゲージの針の最大圧縮荷重は各材料の左側に示され、２１ゲージの針の最大圧縮荷重は各材料の右側に示されている。２１ゲージの針から純粋な無細胞組織マトリックスを注射する場合の最大圧縮荷重は示されていない。これは、粒子が全体的に大き過ぎて純粋な形態では２１ゲージの針を通り抜けることができないためである。図６から分かるように、１８ゲージの針から純粋な無細胞組織マトリックス粒子を注射するための最大圧縮荷重は、本発明に従って形成された組成物１～７の何れか一つを１８ゲージの針から注射するための最大圧縮荷重よりも著しく高かった。２１ゲージの針を通して純粋な無細胞組織マトリックス粒子を注射するための最大圧縮荷重は示されていない。無細胞組織マトリックス粒子と流動性担体を含む組成物１、２、４、６を２１ゲージ針から注射した場合には、純粋な無細胞組織マトリックス粒子を大幅に大きい１８ゲージの針から注射した場合よりも、最大圧縮荷重が小さくなることが分かった。組成物３、５、７の注射は、２１ゲージの針からも可能であったが、それぞれの最大圧縮荷重は、組成物１、２、４、６よりも高いことが分かった。このため、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体内の無細胞組織マトリックス粒子の混合は、２１ゲージ針からの注射に適した組織製品組成物を生成できることを理解されたい。

Ｃ．組織製品組成物が無傷のコラーゲンの構造を有する
ここで、図７～図１５を参照すると、様々な顕微鏡画像が示され、様々な組織製品組成物の全体的な構造および分布が例示されている。

具体的に図７を参照すると、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体内で混合された無細胞組織マトリックス粒子を含む組織製品組成物のトリクローム染色が示されている。図７に見られるように、コラーゲン線維に目に見える損傷はなく、コラーゲンは正常なバンディングパターンを有している。

具体的に図８を参照すると、純粋な無細胞組織マトリックス粒子のヘモトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン繊維は正常である。

具体的に図９を参照すると、無細胞組織マトリックス粒子と担体ＨＡ４を５：５の比率で含む組織製品組成物のＨ＆Ｅ染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン繊維は正常であり、ＨＡ４分子は粒子の周辺に集まる傾向がある。

具体的に図１０を参照すると、無細胞組織マトリックス粒子と担体ＨＡ２を９：１の比率で含む組織製品組成物のＨ＆Ｅ染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン線維は正常であり、ＨＡ２分子は粒子間に散在する傾向がある。

具体的に図１１を参照すると、無細胞組織マトリックス粒子と担体ＨＡ３を１：９の比率で含む組織製品組成物のＨ＆Ｅ染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン線維は正常であり、ＨＡ３分子が粒子を取り囲んでいる。

具体的に図１２を参照すると、純粋な無細胞組織マトリックス粒子のアルシアンブルー染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン繊維は正常である。

具体的に図１３を参照すると、無細胞組織マトリックス粒子と担体ＨＡ４を５：５の比率で含む組織製品組成物のアルシアンブルー染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン繊維は正常であり、ＨＡ４分子は粒子の周辺に集まる傾向がある。

具体的に図１４を参照すると、無細胞組織マトリックス粒子と担体ＨＡ２を９：１の比率で含む組織製品組成物のアルシアンブルー染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン線維は正常であり、ＨＡ２分子は粒子間に散在する傾向がある。

具体的に図１５を参照すると、無細胞組織マトリックス粒子と担体ＨＡ３を１：９の比率で含む組織製品組成物のアルシアンブルー染色の顕微鏡画像が示されている。見られるように、コラーゲン線維は正常であり、ＨＡ３分子が粒子を取り囲んでいる。

このように、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体と、担体内で混合された無細胞組織マトリックス粒子とを含む組織製品組成物は、組織成長を支援するのに適した構造を有することができることを理解されたい。

Ｄ．担体としてヒアルロン酸（ＨＡ）を使用した組織製品組成物の生体内移植
流動性担体としてヒアルロン酸（ＨＡ）を使用する開示の組織製品組成物は、宿主真皮組織における生体内インプラントとして使用される場合に、特定の利点を有する。

具体的に図１６を参照すると、無細胞組織マトリックス粒子（固形分１５％）を２０ｍｇ／ｍＬ（２％）の非架橋ＨＡ担体と１９：１の体積比で混合した。無細胞組織マトリックス粒子の最終固形分は１４．２５％であり、ＨＡ担体の最終濃度は０．１％であった。組織移植では、混合物１２０μＬを、ラットの背部の真皮と筋肉層との間の皮下空間に注射した。５匹のラットをそれぞれ４つの試験アームで試験した。移植の４週間後に外植を実施し、組織学処理とその後のＨ＆Ｅ染色のために、外植片を１０％ホルマリン１５ｍＬ中に置いた。画像は２０倍の倍率で撮影した。図１６に示すように、移植後４週間で、担体としてＨＡを含む移植された組織製品は、宿主真皮組織内に良好に統合された。線維芽細胞および血管新生による顕著な細胞浸潤が、炎症を殆どまたは全く伴わずに発生した。

図１７に示すように、担体としてＨＡを含む又は含まない組織インプラントにおける生物学的応答を試験した。１５％の固形分を持つ無細胞組織マトリックス粒子を使用した。ＨＡを担体として使用する場合、無細胞組織マトリックスを２０ｍｇ／ｍＬ（２％）の非架橋ＨＡ担体と９：１の体積比で混合した。無細胞組織マトリックス粒子の最終固形分は１３．５％で、ＨＡの最終濃度は０．２％であった。組織移植のために、５００μＬの無細胞組織マトリックス粒子のみ、または無細胞組織マトリックス粒子と担体としてのＨＡの混合物をラットの背部に皮下注射した。５匹のラットをそれぞれ４つの試験アームで試験した。移植の４週間後または１２週間後に外植を行い、組織学処理とその後のＨ＆Ｅ染色のために、外植片を１０％ホルマリン１５ｍＬ中に置いた。画像は１０倍の倍率で撮影した。細胞浸潤、血管新生および最小限の炎症などの生物学的反応を調べた。図１７Ａ～図１７Ｄに示すように、同様の生物学的応答が、無細胞組織マトリックスのみを有する組織外植片と、担体としてＨＡを含む無細胞組織マトリックスとにおいて観察された。これらの結果は、ＨＡを担体として使用しても、組織インプラントに対する宿主の生物学的反応に悪影響を与えず、結果は移植後少なくとも１２週間持続することを示している。

具体的に図１８Ａおよび図１８Ｂに示すように、移植領域における真皮の厚さの増加を試験した。無細胞組織マトリックス粒子（１５％固形分）を２０ｍｇ／ｍＬ（２％）の非架橋ＨＡ担体と１９：１の体積比で混合した。無細胞組織マトリックス粒子の最終固形分は１４．２５％であり、ＨＡ担体の最終濃度は０．１％であった。組織移植のために、混合物１２０μＬを、ラットの背部の真皮と筋肉層との間の皮下空間に注射した。５匹のラットをそれぞれ４つの試験アームで試験した。移植の４週間後または１２週間後に外植を行い、組織学処理とその後のＨ＆Ｅ染色のために、外植片を１０％ホルマリン１５ｍＬ中に置いた。図１８に示すように、担体としてＨＡを使用した無細胞組織マトリックスの移植は、真皮組織の厚さを大幅に増加させ、真皮の厚さの増加は移植後１２週間程度続いた（図１８Ｂ）。

Ｅ．移植した組織製品組成物の体積保持
具体的に図１９に示すように、移植した無細胞組織マトリックスの体積保持を試験した。組織移植のために、５００μＬの無細胞組織マトリックス粒子（固形分１５％）をラットの背部に皮下注射した。外植は、移植の４週間後、１２週間後または２４週間後に行った。４週間の外植については、１０匹のラットをそれぞれ４つの試験アームで試験した。１２週間および２４週間の外植では、各グループに５匹のラットを試験し、各ラットに４つの試験アームを使用した。外植片を採取して、重みを加えた。図１９に示すように、移植した無細胞組織マトリックスは、移植後少なくとも２４週間、元の体積（点線）の少なくとも９０％を良好に保持した。

具体的に図２０に示すように、無細胞組織マトリックス粒子を様々な濃度の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（０．００６２５％、０．０１２５％、０．０２５％、０．０５％）で１８時間処理して、架橋組織製品を形成した。架橋製品を最終滅菌にかけ、ＰＢＳで３回、それぞれ３０分間洗浄した。組織をそれぞれ４時間、８時間および１６時間、１２５０Ｕ／ｍＬコラゲナーゼで処理する前に、チューブの重量と湿潤組織の重量を記録した。各条件で三つ組のサンプルを試験した。定温放置後、残りの組織を一晩乾燥させ、チューブ内の乾燥組織の重量を記録した。酵素処理前の湿潤組織に対する乾燥組織の重量比を各時点で計算した。図２０に示すように、架橋された無細胞組織マトリックスは、架橋されていない無細胞組織マトリックスと比較して、コラゲナーゼ耐性を大幅に増加させた。同じ定温放置期間では、架橋剤の濃度が高いほど、コラゲナーゼ耐性が高くなった。

具体的に、図２１および図２２に示すように、架橋した無細胞組織マトリックスを生体内移植で試験した。５００μＬの無細胞組織マトリックス粒子（固形分１５％）をそれぞれ０．０１２５％（修飾Ｌ）または０．０５％（修飾Ｈ）ＥＤＣで架橋させ、ラットの背部に皮下注射した。５匹のラットを各条件で試験し、各ラットに４つの試験アームを使用した。外植は、移植後４週間または２４週間行った。外植片を採取して、加重した。採取した外植片をＨ＆Ｅ染色で染色し、代表的な画像を２０倍の倍率で撮影した。図２１に示すように、移植した組織マトリックスの体積は少なくとも２４週間良好に維持され、架橋のレベルが高い程、体積保持が良好であった。図２２に示すように、同様の生物学的応答が、非修飾、修飾Ｌおよび修飾Ｈの組織マトリックスを含む外植片で観察された。

Ｆ．組織製品組成物の例示的な使用
本発明に従って提供される例示的な一実施形態では、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体と、担体内で混合された無細胞組織マトリックス粒子とを含む組織製品組成物を、シリンジに装填して、注入デバイスを形成することができる。いくつかの例示的な実施形態では、組織製品組成物を、前述した組織製品組成物の何れかとすることができる。シリンジは、一般に、容積を規定するリザーバと、リザーバに流体的に結合された針とを含む。組織製品組成物は、リザーバ内に保持され、いくつかの例示的な実施形態では、リザーバの容積を完全に満たすことができ、その容積は、０．５ｍＬ～５ｍＬなど、任意の所望の容積とすることができる。特定の手順では、２００ｍＬなど、非常に大きな容量のリザーバを使用することができる。針の内径は、実行される注入部位と手順に基づいて、必要に応じて選択することができる。いくつかの例示的な実施形態では、針が、１８ゲージ針、１９ゲージ針、２０ゲージ針、２１ゲージ針またはより高いゲージ（より小さい内径）の針である。注入デバイスは、組織製品組成物で事前に満たされていてもよく、あるいは注入される前は保存されていてもよい。

代替的には、注入デバイスは、組織製品組成物を空のシリンジ内に装填することによって、医師などのユーザにより処置中に形成されるものであってもよい。さらに、開示の組成物はキットとして提供することができ、その場合、組織マトリックス粒子が担体またはＨＡ成分とは別の容器に保持され、ユーザが使用前に成分を混合することができる。キットは、２以上のシリンジ、２以上のバイアル、バイアル／シリンジの組合せ、または使用時に簡単に混合できるマルチコンパートメントシステムを含むことができる。注入デバイスをシリンジとして説明したが、注入デバイスは、組織製品組成物を患者に注入するのに適した他の形態を取り得ることを理解されたい。

本発明に従って提供される例示的な一実施形態では、患者を治療する方法が提供される。この方法は、組織製品組成物を患者の体内に注入するステップを含み、組織製品組成物が、ヒアルロン酸系材料を含む流動性担体と、担体内で混合された無細胞組織マトリックス粒子とを含む。いくつかの例示的な実施形態では、組織製品組成物を、前述した組織製品組成物の何れかとすることができる。美容整形術の場合、組織製品組成物は、例えば皮膚の皺または他の線が現れるのを減らすために、患者の皮膚の１または複数の層内に注入される注入可能な組成物とすることができる。さらに、他の例示的な実施形態では、組織製品組成物が、患者の他の解剖学的位置に適用して大量の喪失および／または損傷した組織を修復および／または復元できるペーストまたはパテとして形成されるようにしてもよい。このように、本発明に従って形成される組織製品組成物は、多くの様々な用途に合わせて調整でき、様々な異なる方法で適用できることを理解されたい。

本開示の原理は、特定の用途の例示的な実施形態を参照して本明細書に記載したが、本開示はそれに限定されないことを理解されたい。当業者および本明細書で提供される教示へのアクセスを有する者は、追加の変更、応用、実施形態、および均等物の置換がすべて本明細書に記載の実施形態の範囲内に含まれることを認識するであろう。よって、本発明は、上述した説明によって限定されると見なされるべきではない。

Claims (12)

1. 組織製品組成物であって、
   低分子量成分および高分子量成分を有するヒアルロン酸系材料を含む流動性の担体であって、前記低分子量成分が、２００，０００ダルトンから１，０００，０００ダルトン未満の間の分子量を有するヒアルロン酸を含み、前記高分子量成分が、前記低分子量成分の分子量の少なくとも２倍の分子量を有するヒアルロン酸を含む、流動性の担体と、
   前記担体内で混合された複数の真皮無細胞の組織マトリックス粒子と、を含み、
   前記組織製品組成物は、前記組織マトリックス粒子と前記担体との体積の比率が１：１～１：９であり、
   前記担体および前記組織マトリックス粒子が混合されて、２％～２０％の固形分を有するスラリーを形成することを特徴する組成物。
2. 請求項１に記載の組成物において、
   前記ヒアルロン酸系材料が架橋ヒアルロン酸であることを特徴する組成物。
3. 請求項１に記載の組成物において、
   前記ヒアルロン酸系材料が非架橋ヒアルロン酸であることを特徴する組成物。
4. 請求項１に記載の組成物において、
   前記担体が、混合前に２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸濃度を有することを特徴する組成物。
5. 請求項１に記載の組成物において、
   前記組織マトリックス粒子が真皮マトリックスに由来することを特徴する組成物。
6. 請求項１に記載の組成物において、
   前記比率が５：５であることを特徴する組成物。
7. 請求項１に記載の組成物において、
   前記比率が４：６であることを特徴する組成物。
8. 請求項１に記載の組成物において、
   前記比率が１：９であることを特徴する組成物。
9. 請求項１に記載の組成物において、
   前記担体および前記組織マトリックス粒子が混合されて、２％～１４．２５％の固形分を有するスラリーを形成することを特徴する組成物。
10. 請求項９に記載の組成物において、
    スラリーが、５Ｈｚで、６００Ｐａ未満のＧ”値を有することを特徴する組成物。
11. 請求項１０に記載の組成物において、
    ５ＨｚでのＧ”値が、５００Ｐａ未満であることを特徴する組成物。
12. 請求項１乃至１１の何れか一項に記載の組成物において、
    前記担体および前記組織マトリックス粒子と混合された複数の種細胞をさらに含むことを特徴する組成物。

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