KR20070002057A - 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스펙션스페라제의 어떠한발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직 산물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스페라제(알파-1,3.GT)의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직을 제공한다. 이러한 조직은 정형외과적 재구성 및 복원, 피부 복원 및 내부 조직 복원 등의 이종이식분야에서 혹은 의료 기기로서 사용될 수 있다.

Description

기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스펙션스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직 산물{TISSUE PRODUCTS DERIVED FROM ANIMALS LACKING ANY EXPRESSION OF FUNCTIONAL ALPHA 1,3 GALACTOSYLTRANSFERASE}
본 출원은 2004년 3월 17일자 출원된 미국 특허 가출원 제 60/553,895호 및 2004년 4월 6일자 출원된 미국 특허 가출원 제 60/559,816호에 의거한 우선권을 주장한다.
발명의 기술 분야
본 발명은 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스페라제(알파 l,3GT)의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직을 제공한다. 이러한 조직은 정형외과적 재구성과 복원, 피부 복원 및 내부 조직 복원 등의 이종이식(xenotransplantion) 분야 또는 의료 기기로서 이용될 수 있다.
돼지, 양 및 소 등의 반추 동물은 이종이식 기관과 조직의 공급원인 것처럼 여겨진다. 돼지 이종이식편은, 돼지의 공급이 풍부하고, 교배 프로그램도 잘 확립되어 있고, 그들의 크기 및 생리학은 인간과 호환성이 있기 때문에 가장 주목받 고 있다. 소나 양 등의 다른 반추 동물도 경조직 및 연조직 이종이식원으로서 제안되어 왔다. 그러나, 이들 기관이나 조직을 인간에게 이식하는 것을 성공할 수 있기 전에 극복해야만 하는 몇 가지 장애들이 있다. 가장 중요한 것은 면역 거부이다. 첫번째 면역학적 장애는 "초급성 거부"(HAR: hyperacute rejection)이다. HAR은 이물 조직에 대한 미리 형성된 자연 항체의 높은 역가의 편재적인 존재에 의해 규정된다. 제공자(donor) 조직 내피상의 표적 에피토프에 대한 이들 자연 항체의 결합은 HAR에서의 개시 사상을 초래하는 것으로 여겨진다. 제공자 조직의 수혈받은 혈액과의 수분의 관류 내에 이 결합이 일어나고, 이어서, 보체(complement) 활성화, 혈소판 및 섬유소 침착이 일어나며, 궁극적으로는 제공자 기관 내에서 근접 부종 및 출혈을 일으키고, 이들은 모두 수용자의 조직의 거부를 초래한다(Strahan 등의 (1996) Frontiers in Bioscience 1, e 34-41).
인간에게 있어 가장 빈번하게 이식되는 조직은 뼈이다(J. M. Lane 등의 Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America (2) 213(1987)). 미국에서만 매년 100,000건 이상의 뼈 이식 혹은 삽입 시술이 행해져 외상, 감염, 선천성 기형 또는 악성 종양에 기인하는 뼈 결함을 복원(혹은 수복) 혹은 치환(또는 대체)하고 있다. 인간의 뼈는 광물화 바탕질의 세포외 바탕질에 매립된 세포와 교원 섬유로 이루어진 경질의 결합 조직이다(Stedman's Medical Dictionary, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1995)).
뼈 이식편 및 삽입물은 종종 자가이식 뼈로 형성되어 있다. 그러나, 특히 어린이에게 있어 커다란 결함용의 이식가능한 자가 골 조직은 종종 이용불가능하 다. 또한, 자가 뼈 이식은 제공자측에 통증, 출혈, 상처 문제, 미용 장애, 감염 또는 신경 손상을 초래할 수도 있다. 게다가, 이식한 자가 골 조직으로부터 원하는 기능적 형상을 제작하는 데 있어서의 곤란성은 뼈 결함의 최적 충만 미만을 초래할 수도 있다.
힘줄, 인대, 연골, 피부, 심장 조직 및 판막, 그리고 점막밑 조직 등의 연조직도 통상 인간에게 이식되고 있다. 이 구조의 대부분 및 원래 조직의 특성의 대부분은 이종이식 재료의 사용을 통해 이식물에 유지될 수 있다. 이종이식 조직은 인간에게 있어 이식에 대해 안전하게 처리될 수 있다면 이용가능한 재료를 무제한 공급할 수 있음을 나타낸다.
일단 개인에게 이식하면, 이종이식편은 해당 이종이식편의 만성 및 초급성 거부 등의 면역학적 반응을 불러일으킨다. 이 거부 때문에, 뼈 이종이식은 증가된 비율의 골절, 흡수 및 불유합을 나타낸다. 인간에 있어서의 이식물(혹은 삽입물)로서 돼지, 소 혹은 양 등의 동물 조직을 이용하기 위한 주된 면역학적 장애는 천연의 항-갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스 항체이고, 이것은 인간과 원숭이에 있어서 항체의 대략 15를 구성한다.
구세계의 원숭이, 유인원 및 인간을 제외하고, 대부분의 포유 동물은 그들의 세포 표면상에 당단백질을 보유하고, 이 당단백질은 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스 에피토프를 함유한다(Galili 등, J. Biol. Chem. 263: 17755-17762,1988). 이에 대해서, 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스를 함유하는 당단백질은 돼지 등의 기타 포유 동물의 세포 상에 다량으로 발견된다. 인간, 유인원 및 구세계의 원숭 이는 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스를 지니지 않고, 고품질로 생성된 천연으로 존재하는 항-갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스 항체를 지닌다(Cooper 등, Lancet 342: 682-683, 1993). 이것은 갈락토오스 알파-1,3 갈락토오스를 보유하는 당단백질 및 당지질에 특이적으로 결합한다.
포유 동물에 있어서의 "알파-1,3 GT 에피토프"와 항-Gal 항체(즉, 갈락토오스 알파-1,3 갈락토오스를 보유하는 당단백질 및 당지질에 결합하는 항체)와의 이 차별적 분포는 조상 대대의 구세계 영장류 및 인간에 있어서 불활성화(즉, 변이형) 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제를 지닌 종에 대해서 선택된 진화 프로세스의 결과이다. 따라서, 사람은 알파-1,3-GT의 "자연 녹아웃(natural knockouts)"이다. 이 사상의 직접적 결과는 최초에 HAR를 통한 사람 속에 이식된 돼지 기관의 거절 등과 같은 이식 이식편의 거절이다.
돼지 이종이식에 의해 유발되는 항-Gal 체액성 응답을 배제 혹은 조절하기 위해, 각종 전략이 실시되어왔다. 그 전략으로서는 알파-갈락토시다제에 의한 에피토프의 효소적 제거(Stone 등, 이식 63: 640-645, 1997), 특이적 항-gal 항체 제거(Ye 등, 이식 58: 330-337, 1994), 다른 탄수화물 부분에 의한 에피토프의 캐핑화(capping)(이것은 알파-1,3-GT 발현을 제거하는 데 실패하였음)(Tanemura 등, J. Biol. Chem. 27321: 16421-16425, 1998 및 Koike 등, Xonotransplastation 4: 147-153, 1997) 및 보체 저해 단백질의 도입(Dalmasso 등, Clin. Exp. Immunol. 86: 31-35, 1991, Dalmasso emd, Transplastation 52: 530-533 (1991) ) 등을 들 수 있다. Costa 등(FASEB J 13, 1762 (1999))은 H-트랜스페라제 트랜스제닉 돼 지(transferase transgenic pigs)에 있어서의 알파-1,3-GT의 경합저해는 에피토프 수의 단순한 부분 감소를 일으키는 것을 보고한 바 있다. 마찬가지로, Miyagawa 등(J. Biol. Chem 276, 39310 (2001))은 N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 III 트랜스제닉 돼지에 있어서의 gal 에피토프의 발현을 차단하기 위해 시도하고, 또, gal 에피토프 수의 단지 부분적 감소를 일으켜서, 영장류 수용자에 있어서 이식편 생존을 유의하게 확대하는 데 실패한 것을 보고하였다.
Badylak 등은 결합조직 이식편을 포함하는 각종 조직 이식편에 사용하기 위해 돼지의 소장으로부터 점막밑 조직을 단리하여 무릎 인대(앞십자 인대) 및 어깨 회전 근개를 복원하는 방법을 발견하였다. 소장 점막밑(SIS) 물질은 숙주 세포 및 조직 재생의 내증식을 고무시키는 무세포성 세포외 기질을 남기도록 화학적 및 효소적 단계를 이용해서 처리된다(예를 들어, 미국 특허 제 4,902,508호, 제4,956,178호 및 제 5,372,821호 명세서 참조). 이 방법은 현재 인잔 조직 이식편에 대해서 이용된다. 그러나, 화학적 처리 단계에도 불구하고, 갈락토오스 알파 1,3 갈락토오스 당 잔기는 상기 이식편에 매립되어 인간 환자에게 면역활성화 및 감염을 초래한다(Allman 등, 2001, Transplantation 71, 1631-1640; Mcpherson 등, 2000, Tissue Engineering 6(3), 233-239).
Stone 등은 세포 물질을 제거하기 위해 돼지 연조직 및 뼈 조직을 처리하고 나서 이식 전에 조직으로부터 갈락토오스 알파 1,3 갈락토오스를 제거하기 위해 알파-갈락토실시다제에 의한 처리를 행하는 방법을 개발하였다(Stone 등, Transplantation 1997: 63: 646-651; Stone 등, Transplantation 1998: 65: 1577- 83). 이 방법은 앞십자 인대 복원, 메니스칼 복원(meniscal repair), 관절 연골 이종이식, 점막밑 이종이식, 뼈 및 뼈기질 이종이식, 심장 판막 치환 및 연조직 이종이식 등의 각종 용도에 대해 이러한 조직의 이용을 개시한 많은 특허출원의 주제로 되어왔으며, 예를 들어, 미국 특허 제 5,865,849호, 제 5,913,900호, 제 5,984,858호, 제 6,093,204호, 제 6,267,786호, 제 6,455,309호, 제 6,683,732호, 제 5,944,755호, 제 6,110,206호, 제 6,402,783호 및 제 5,902,338호 공보; 미국 특허 출원 제 2002/0087211호, 제 2001/0051828호, 제 2001/0039459호, 제 2003/0039678호, 제 2003/0023304호 및 제 2003/0097179호; 및 PCT 공보인 WO 00/47131, WO 00/47132, WO 99/44533, WO 02/076337, WO 99/51170, WO 99/47080, WO 03/097809, WO 02/089711, WO 01/91671 및 WO 03/105737호 공보를 참조하면 된다.
이와 같이 해서, 당업계에 있어서는 인간에게 유해 효과를 일으키지 않는 조직 이식편을 제공할 필요가 있게 되었다.
Costa 등(FASEB (2003) 17: 109-111)은 야생형 α-1,3-갈락토실트랜스페라제 녹아웃 마우스속으로 이식된 돼지 연골의 지연 거부는 연골에 있어서의 αl, 2-푸코실트랜스페라제(HT 트랜스제닉)의 트랜스제닉 발현에 의해 감소되는 것을 보고하였다.
돼지 세포 및 생존 동물에 있어서의 알파-1,3-GT 유전자 자리(locus)의 단일 대립유전자 녹아웃이 보고되어 있다. Denning 등(Nature Biotechnology 19: 559-562, 2001)은 양에 있어서의 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립유전자의 표적화된 유전자 결손을 보고하였다. Harrison 등(Transgenics Research 11: 143-150,2002)은 reported the production of 이종접합형 알파-1,3-GT 녹아웃 체세포 돼지 태아 섬유모세포의 생산을 보고한 바 있다. 2002년에, Lai 등(Science 295: 1089-1092, 2002) 및 Dai 등(Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002)은 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립유전자는 성공적으로 불활성화된 돼지의 생산을 보고하고 있다. Ramsoondar 등(Biol of Reproduc 69, 437-445 (2003))은 인간 알파-1,2-푸코실트랜스페라제(HT)도 발현하는 이종 접합성 알파-1,3-GT 녹아웃 돼지의 생산을 보고하고 있고, 이 돼지는 HT 및 알파-1,3-GT 에피토프의 양쪽 모두를 벌현하였다.
Austin Research Institute에 의한 PCT 공개 공보 WO 94/21799 및 미국 특허 제 5,821,117호; Bresatec에 의한 PCT 공개공보 WO 95/20661; 및 BioTransplant, Inc. 및 The General Hospital Corporation에 의한 PCT 공개공보 WO 95/28412, 미국특허 제 6,153,428호, 미국특허 제 6,413,769호 및 미국특허 출원 제 2003/0014770호에는 알파-1,3-GT 유전자의 cDNA의 지견에 의거해서(그리고 유전자 조직화나 서열에 대한 지식은 지니지 않은 채) 알파-1,3-GT 음성 돼지 세포의 생산에 대한 고찰을 제공하고 있다. 그러나, 이러한 세포가 이들 츨원의 출원일 전에 실체로 생산된 것의 증거는 없고, 실시예는 모두 예언적인 것이었다.
이종 접합형 알파-1,3-GT 음성 돼지 세포의 성공적인 생산에 대한 최초의 공적인 개시는 Lake Tahoe Transgenic Animal Conference(David Ayares, PPL Therapeutics, Inc. ,"Gene Targeting in Livestock", Transgenic Animal Research Cinference, July 1999, Abstract, pg. 20; Ayares, IBS News Report, Nov. 1999: 5-6)에 있어서 1999년 7월에 행해졌다. 최근까지 동종 접합성 알파 1,3GT 음성 돼지 세포의 생산에 대해 공개도 공공연히 개시한 적은 없었다. 또한, 돼지 배아 줄기 세포는 지금까지 입수된 적은 없었으므로, 살아 있는 동종 접합성 알파 1,3GT 녹아웃 돼지를 제조하는 것을 시도하기 위해 알파-1,3-GT 동종 접합성 배아 줄기 세포를 사용하는 방법은 여전히 없었다.
또, 2003년 2월 27일에, Sharma 등(Transplantation 75: 430-436 (2003))은 알파-1,3-GT 유전자의 녹아웃에 대해서 동종 접합성인 태아 돼지 섬유 모세포의 성공적인 생산을 설명하는 보고를 공개하였다.
PPL Therapeutics에 의한 PCT 공개공보 WO 00/51424호에는 핵이입을 위한 체세포의 유전적 변형을 기재하고 있다. 이 특허 출원에는 돼지 체세포 세포에서의 알파-1,3-GT 유전자의 유전자 파괴와, 알파-1,3-GT 유전자의 적어도 하나의 카피(copy)를 결여하는 이들 세포의 핵을 핵 이입을 위해 후속적으로 이용하는 것을 개시하고 있다.
Cooper & Koren에 의한 미국 특허 제 6,331, 658호 공보에는 시알릴트랜스페라제 또는 푸코실트랜스페라제 단백질을 발현하는 유전자조작된 포유 동물의 실제의 생산을 특허청구하고 있으나 그에 대해서 어떠한 확인도 되어 있지 않다. 이 특허는 상기 유전자조작된 포유 동물이 그 포유 동물의 세포 표면상에서의 갈락토실화 단백질 에피토프의 감소를 나타낸다고 주장하고 있다.
미국의 미주리대학의 학장(The Curators of the University of Missouri)에 의한 PCT 공개 WO 03/055302호는 이종 접합형 알파 1,3GT 녹아웃 미니어처 돼지(swine)의 생산을 확인하고 있다. 이 출원은 일반적으로 파괴된 알파-1,3-GT 유전자를 포함하는 녹아웃 돼지에 관한 것으로, 그 녹아웃 돼지에 있어서의 기능성 알파-1,3-GT의 발현은 야생형과 비교해서 감소하고 있다. 이 출원은 이 돼지가 이종 이식에 유용하도록 하기 위해 어느 정도 알파-1,3-GT가 감소해야 한다는 것에 어떠한 지침을 제공하고 있지 않다. 또, 이 출원은 그 생산된 이종 접합형 돼지가 기능성 알파 l,3GT의 감소된 발현을 나타내는 증거는 아무것도 제공하지 않는다. 또한, 이 출원에서는 동종 접합성 알파 1,3GT 녹아웃 돼지에 관한 것이지만, 실제로 생산하거나 생산가능한 증거도, 이 출원 중에 하등 개시되어 있지 않고, 더군다나 얻어진 자손이 생존가능하거나 이종이식에 이용하기 위한 표현형적으로 유용하다고 하더라도 실제로 생산된 또는 생산가능하다고 하는 증거는 없다.
갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스를 함유하는 당단백질의 전체적인 결핍은 명백히 이종이식용 돼지 동물의 생산을 위한 최선의 접근법이다. 알파 1,3GT 유전자의 더블 녹아웃 또는 양쪽 카피의 파괴가 하기 두 가지 방법에 의해 생산될 수 있는 것은 이론적으로는 가능하다: 1) 자손을 생산하기 위하여 2마리의 단일 대립유전자 녹아웃 동물을 교배하는 것(이 경우, 멘델의 유전학에 의거해서 4개 중 하나가 더블 녹아웃인 것을 추정됨) 또는 2) 세포 중의 제 2 대립유전자를 기존의 단일 녹아웃을 이용해서 유전자 변형하는 것. 사실상, 이것은 녹아웃 돼지 세포에 관한 최초의 출원이 1993년에 출원된 한편, 최초의 동종 접합성 알파 1,3GT 녹아웃 돼지는 2002년 7월까지 생산되지 않은 것을 예시한 바와 같이 상당히 어려웠 다(본 명세서 중에 기재됨).
트랜스제닉 마우스(돼지가 아님)는 역사적으로는 많은 이유 때문에, 포유동물의 생리에 대한 유전자 변형의 효과를 연구하기 위한 바람직한 모델이었다. 그 가장 큰 이유는 마우스 배아 줄기 세포는 이용가능하지만 돼지 배아 줄기 세포는 이용가능하지 않기 때문이다. 마우스는 기본적 연구 적용을 위하여 이상적인 동물이다. 왜냐하면 이들은 비교적 취급하기 용이하고, 신속하게 증식하고, 그리고 분자레벨에서 유전조작할 수 있기 때문이다. 과학자들은 결장암으로부터 정신지체까지에 이르는 각종 유전자 베이스의 질환의 분자 병리를 연구하기 위하여 마우스 모델을 사용한다. 수천 마리의 유전자 변형 마우스가 오늘날까지 제작되었다. "Mouse Knockout and Mutation Database"는 마우스 녹아웃 및 고전적 돌연변이에 대한 표현형 및 유전자형 정보의 포괄적 데이터베이스를 제공하도록 BioMedNet에 의해 제작되었고(http ://research. bmn. com/mkmd; Brandon et al Current Biology 5 [7]: 758-765 (1995); ; Brandon 등, Current Biology 5 [8]: 873-881 (1995)), 이 데이터베이스는 3,000개가 넘는 단일 유전자에 관한 정보를 제공하며 이들 유전자는 오늘날까지 마우스 유전자에 있어서 표적화되어 있다.
마우스를 이용한 이 광범위한 경험에 의거해서, 트랜스제닉 기술이 몇 가지 중요한 제한을 지니는 것을 알게 되었다. 발생결함 때문에, 유전자 녹아웃 기술에 의해 제작된 많은 유전자 변형 마우스, 특히 널 마우스(null mouse)는 연구자가 실험용 모델을 사용할 기회를 얻기 전에 배아로서 죽는다. 그 마우스들이 생존한 경우에도, 이들은 유의하게 변화된 표현형을 발생시킬 수 있어, 그 표현형에 의해 그 마우스들은 심각하게 기능부전으로 될 수 있거나, 변형될 수 있거나 혹은 쇠약해질 수 있게 된다(Pray, Leslie, The Scientist 16 [13]: 34 (2002); Smith, The Scientist 14 [15]: 32, (2000); Brandon 등, Current Biology 5 [6]: 625-634 (1995); Brandon 등, Current Biology 5 [7]: 758-765 (1995); Brandon 등, Current Biology 5 [8]:873- 881 (1995); http://research. bmn. com/mkmd). 또, 소정의 유전자가 그 생물의 발생에 있어서 중요한 역할을 하는지의 여부, 따라서, 그 유전자의 배제에 의해 치사적 혹은 변화된 표현형이 생기는 지의 여부를 예측하는 것은 그 녹아웃이 성공적으로 제작되어서 생존 자손이 생산될 때까지 불가능한 것으로 알려져 있었다.
마우스는 기능성 알파-1,3-GT 발현을 배제하도록 유전자 변형되었다. 더블-녹아웃 알파-1,3-GT 마우스가 제작되었다. 이들은 발생적으로 생존가능하고, 정상의 기관을 지닌다(Thall 등, J Biol Chem 270: 21437-40 (1995); Tearle 등, Transplantation 61: 13-19 (1996), 미국 특허 제 5,849,991호 공보 참조). 그러나, two phenotypic abnormalities in 이들 마우스에 있어서의 2개의 표현형 이상이 명백하였다. 첫번째로, 모든 마우스가 짙은 피질 백내장을 발병하였다. 두번째로, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽의 대립유전자의 배제는 그 마우스의 발생에 유의하게 영향을 미쳤다. 알파-1,3-GT 유전자에 대한 이종 접합형 마우스의 교배는 추정된 멘델비 1: 2: 1로부터 유의하게 이탈한 유전자형비를 생성하였다(Tearle 등, Transplantation 61: 13-19 (1996)).
돼지는 마우스에 있어서 발견되는 것보다 100배 내지 1000배 높은 갈락토오 스 알파 1,3-갈락토오스를 함유하는 세포 표면 당단백질의 레벨을 지닌다(Sharma 등, Transplantation 75: 430-436 (2003); Galili 등, Transplantation 69: 187-190 (2000) ). 따라서, 알파 1,3-GT 활성은 마우스에 있어서 보다 중요하고 또 풍부하다.
예측 및 예언적 진술에도 불구하고, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립 유전자의 파괴가 치사성이거나 혹은 돼지의 발생에 영향을 미치거나 혹은 표현형 변화를 일으키는 지의 여부는 누구도 알지 못했다(Ayares 등, Graft 4 (1) 80-85 (2001); Sharma 등, Transplantation 75: 430-436 (2003); Porter & Dallman Transplantation 64: 1227-1235 (1997); Galili, U. Biochimie 83 : 557-563 (2001)). 실제로, 이 분야의 많은 전문가는, 동종 접합성 알파-1,3-GT 녹아웃 돼지가 조금이나마 생존가능한지, 더군다나 정상적으로 발생하는지의 여부에 관해서 심각한 의문을 표명하였다. 따라서, 생존가능한 더블 알파-1,3-GT 녹아웃 돼지가 생산될 때까지, 당시의 당업자에 의하면, (i) 자손이 생존가능한지의 여부, 또는 (ii) 자손이 인간 속으로의 이식을 위해 그 기관을 사용하는 것이 가능한 표현형을 제시하는 지의 여부에 대해서도 결정하는 것은 가능하지 않았다.
이러한 중대사는 더블 녹아웃 돼지가 생산될 때까지 표명되었다. 2003년에, Phelps 등(Science 299: 411-414 (2003))은 알파 1,3 갈락토실트랜스페라제의 어떠한 기능적 발현도 결여된 살아있는 돼지를 첫번째로 생산한 것으로 보고하였고, 이것은 이종이식에 있어서 중대한 돌파구를 상징하였다.
본 출원인인 Revivicor, Inc.사에서 출원한 PCT 공개 공보인 WO 04/028243호 에는, 알파 1,3 갈락토실트랜스페라제의 어떠한 기능적 발현도 결여된 생육가능한 돼지의 성공적인 생산뿐만 아니라 그로부터 유래한 기관, 세포 및 조직에 대해 개시하고 있다. 또, ImmergeBiotherapeutics, Inc.에서 출원한 PCT 공개공보 WO 04/016742호에도 f알파 1,3 갈락토실트랜스페라제 녹아웃 도재의 생산을 개시하고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 상당한 거부를 일으킴이 없이 인간에게 이식할 수 있는 조직 산물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인간에 있어서의 정형외과적 재구성 및 복원, 피부 복원 및 내부 조직 복원에 이용하기 위한 동물로부터의 조직을 제공하는 데 있다.
발명의 개요
본 발명은 이종이식편으로서 이용하기 위한 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직 산물에 관한 것이다. 이 조직은 can be 뼈와 같은 경조직 또는 진피와 같은 연조직일 수 있다. 상기 경조직 및 연조직은 예를 들어 정형외과적 재구성 및 복원, 피부 복원 및/또는 내부 조직 복원에 이용하기 위한 인공삽입물로서 이용될 수 있다. 동물은 소, 돼지 혹은 양 등의 반추 동물 혹은 유제 동물(ungulate)일 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 동물은 돼지이다. 알파-1,3-GT 유전자의 소정의 기능성 발현 결여 동물로부터의 조직은 돼지, 소 혹은 양 등의 태아, 신생, 미숙 또는 완숙 동물로부터 얻어질 수 있다. 또, 상기 조직은 인간 등의 동물에서의 조직 복원에 이용하기 위해 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 조직은 얻어진 알파-1,3-GT 효소가 세포 표면상에 더이상 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스를 생산할 수 없도록 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자에 불활성을 부여하기 위해 제공된다. 일실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자는 RNA 속으로 전사될 수 있지만, 단백질 속으로는 전사될 수 없다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자는 불활성의 각뿔 형상으로 전사될 수 있다. 이러한 각뿔형 RNA는 비작용성 단백질 속으로 전이될 수 없거나 혹은 전이될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자는 유전자의 전사가 일어나지 않는 방식으로 불활성화될 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 적어도 하나의 대립유전자가 유전자 표적화를 통해서 불활성화되어 있는 것이 조직이 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 유전자 표적화를 통해서 불활성화되어 있는 동물로부터의 조직이 제공된다. 또, 유전자는 균질 재결합을 통해 표적화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 유전자는 파괴될 수 있고, 즉, 유전 부호의 일부가 변경됨으로써, 유전자의 분절의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유전자의 파괴는 치환, 결손("녹아웃(knockout)") 또는 삽입("녹인(knockin)") 기술을 통해 일어날 수 있다. 기존의 서열을 조작한 소망의 단백질 또는 규칙적인 서열에 대한 추가의 유전자도 삽입될 수 있다.
본 발명의 일측면으로서, 알파-1,3-GT 유전자에 있어서 적어도 하나의 점 돌연변이(point mutation)를 보유한 동물로부터의 조직이 제공된다. 이러한 동물은 항생제-내성 유전자가 없으므로, 사람용의 안전한 산물을 만드는 잠재성을 지닌다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, 제오신, 히스D, 오르블라스티시딘 등의 항생제 내성이나 기타 선택가능한 표지유전자(marker gene)를 지니지 않은 동종 접합성 알파-1,3-GT 녹아웃으로부터의 조직에 관한 것이다. 일실시형태에 있어서, 이 점 돌연변이는 유전자 표적화를 통해서 일어날 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 이 점 돌연변이는 자연적으로 발생할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자에 있어서 돌연변이원을 통해서 유도될 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자의 엑소 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이일 수 있다(도 2; Phelps 등의 Science 299: 411-414 (2003) 참조). 다른 실시형태에 있어서, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 4, 적어도 10 또는 적어도 20개의 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자에 불활성을 부여하도록 존재할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3- GT 유전자의 양쪽 대립 유전자가 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 방지하는 점 돌연변이를 함유하는 조직이 제공된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립 유전자에 있어서의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이를 포함하는 조직이 제공된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 한쪽 대립유전자는 유전자 표적화에 의해 불활성화되어 있고, 다른 한쪽의 대립유전자는 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이의 존재에 의해 불활성화되어 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 한쪽의 대립유전자는 엑손 9에 대한 표적화 구축물을 통해 불활성화되어 있고, 다른 쪽 대립유전자가 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이의 존재에 의해 불활성화되어 있는 동물로부터의 조직이 제공된다(도 2; Phelps 등의 Science 299: 411-414 (2003) 참조).
또 다른 실시형태에 있어서, 경조직 혹은 연조직은 추가의 유전 변형을 포함할 수 있는 알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능적 발현도 결여된 동물로부터 얻어질 수 있다. 이러한 유전자 변형은 거부를 방지하고, 상처치유를 촉진하고/하거나, 원치 않는 병원체(프리온 또는 레트로바이러스 등)를 최소화하거나 제거하도록 다른 유전자의 부가 및/또는 결손을 포함할 수 있다.
일실시형태에 있어서, 조직은 그의 "자연적"(동물로부터 직접 제거됨) 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로는, 조직은 또 다른 처리를 받거나 변형될 수도 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 동물 또는 조직으로부터 유래된 탈세포화된(decellularized) 조직이 제공된다. 다른 실시형태는 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 조직을 제조하여 얻는 방법 및 프로세스를 제공한다.
소정의 실시형태에 있어서, 조직을 제조하는 프로세스는 조직 복원 및 재형성뿐만 아니라, 필요에 따라 가교 및 멸균화의 처리에 사용되는 단지 무세포 기질 또는 골격 뒤에 남아 있는 모든 살아있는 세포(탈세포화된)를 박리하거나 죽이는 공정을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 동물로부터 유래된 탈세포화된 경조직 혹은 연조직이면 어느 것이라도 제공된다. 일실시형태에 있어서, 탈세포화된 연질 진피 조직이 제공된다. 다른 실시형태에 있어서, 탈세포화된 점막밑 조직이 제공된다. 다른 실시형태에 있어서, 이러한 탈세포화된 재료는 덜 면역원성일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 이러한 탈세포화된 조직은 특정 인체 부분을 복원 및/또는 재구축하기 위한 골격 또는 기질로서 사용될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 탈세포화된 조직은 이들로 한정되는 것은 아니지만 탈장, 복벽, 회전 근개, 성형 수술 또는 당업자에게 공지된 혹은 본 명세서에 개시된 기타 소정의 연조직 결함을 포함하는 것을 복원하는 데 이용될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 점막밑 및/또는 진피 탈세포화된 재료가 제공된다.
조직 및 그 조직의 동물 공급원은 상처 치유를 촉진하고; 감염성 질환 전달(프리온 및 레트로바이러스 등) 등의 원치 않는 병원균을 최소화 혹은 제거하고; 조직 재형성을 촉진하고, 조직을 멸균하고/하거나 조직의 생체 역학적 또는 물리적 특성을 향상시키는 성장인자를 추가하도록 더욱 변형 혹은 처리될 수도 있다. 이러한 처리는 알코올 혹은 과산화물 처리 등의 화학적 처리, 효소 및/또는 기체, 자외선 조사 혹은 감마선 조사에의 폭로 등의 기계적 또는 물리적 처리일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 소정의 기능성 발현 결여 동물로부터의 조직은 받는 환자에게 추가의 기계적 강도나 다른 이익을 제공하기 위하여, 플라스틱, 금속(스테인레스강 및 티탄을 포함하지만 이들로 제한되지 않음) 등의 다른 불활성 물질과 결합될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 소정의 기능성 발현 결여 동물로부터의 조직은 이식된 물질의 부위에 수용자의 세포를 보충하는 역할을 하는 골격으로서 사용될 수 있다. 이 골격은 세포외 기질(ECM: extracellular matrix) 성분을 함유할 수도 있고, 이러한 ECM 성분은 알파-1,3-GT 유전자의 소정의 기능성 발현 결여 동물로부터 임의로 유래될 수 있다. 대안적으로는, 조직은, 예를 들어, 이식된 조직이 조직의 동일한 생체역학적 기능을 수행하여, 복원 혹은 대체되도록 완전한 조직 치환물로서 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 조직은 이식 전에 미리 조정(화학적 및/또는 기계적으로)되어 이식 후의 조직의 최적의 이동범위를 허용하거나, 또는 수용자에게 "맞춤 적합성"을 허용하거나, 또는 그렇지 않으면 생물학적 혹은 생체역학적 특성을 제공한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 정형외과적 재구성 및 복원에 이용될 수 있다. 이러한 조직은 결합 조직, 힘줄, 인대, 근육, 연골, 뼈 및 뼈 유도체를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 조직은 앞십자 인대 (ACL) 또는 뒤십자 인대 (PCL) 치환물 등의 무릎 복원용으로 이용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 뼈-힘줄-뼈 이식편, 회전근개 복원(rotator cuff repair)에 또는 봉합전(suture plug)으로서 이용될 수 있다. 골 조직은 전체 혹은 일부로서 뼈 대치물, 뼈 플러그(bone plug), 뼈 나사 혹은 뼈 조각(뼈 조각이 페이스트로서 제조될 수 있는 제제를 포함함)으로서 이용될 수 있다. 골 조직은 치주 적용물(periodontal application)에 또는 척수 스페이서로서도 이용될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터의 연조직 및 경조직은 피부 복원, 예를 들어, 피부의 깊은 조직 화상을 복원하는 데 이용될 수 있다. 피부 조직은 진피 또는 표피 조직 또는 그의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 can be used in 내부 조직 복원, such as 복벽 복원, 탈장 복원, 심장판막 복원 또는 교체, 성형 수술/복원, 악안면 복원, 부인과 혹은 비뇨기과 조직의 복원용, 및 경질막 복원 등의 내부 조직 복원에 이용될 수 있다. 내부 조직은 심장막 조직, 심장판막 및 점막밑 조직을 포함한다. 일실시형태에 있어서, 점막밑 조직은 can be used to repair or replace 결합 조직을 복원하거나 교체하는 데 이용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이종이식에 이용하기 위한 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직 산물에 관한 것이다. 조직은 뼈 등의 경조직, 또는 피부 등의 연조직일 수 있다. 이 경조직 및 연조직은 정형외과적 재구성 및 복원, 피부 복원 및 내부 조직 복원 등의 이종 이식에 이용될 수 있다. 동물은 소, 돼지 또는 양 등의 반추동물 혹은 유제 동물일 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 동물은 돼지(pig)이다. 알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능적 발현도 결여된 동물로부터의 조직은 돼지, 소 또는 양 등의 출생전, 신생, 미숙, 또는 완숙 동물로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 대립유전자는 얻어진 알파-1,3-GT 효소가 더 이상 세포 표면상에 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스를 생성할 수 없게 되도록 불활성화된다.
알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능성 발현도 결여된 동물로부터의 조직은 돼지, 소 또는 양 등의 출생전, 신생, 미숙, 또는 완숙 동물로부터 얻어질 수 있다. 일실시형태에 있어서, 조직은 그의 "자연적"(동물로부터 직접 제거됨) 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로는, 조직은 또 다른 처리를 받거나 변형될 수도 있다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 정형외과적 재구성 및 복원에 이용될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 피부 복원에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 내부 조직 복원에 이용될 수 있다.
정의
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "동물"("유전자 변형 (또는 변화) 동물"에 있어서와 같은)이란 임의의 비인간 동물, 특히 임의의 비인간 포유 동물(돼지, 양, 염소, 축우(소), 사슴, 노새, 말, 원숭이, 개, 고양이, 래트, 마우스, 조류, 닭, 파충류, 어류 및 곤충을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)을 의미한다. 본 발명의 일실시형태에 있어서, 유전자 변형화된 돼지 및 그의 생산 방법이 제공된다.
본 명세서에 이용되는 바와 같이, "기관"이란 조직화된 구조물이며, 이것은 1개 이상의 조직으로 이루어질 수 있다. "기관"은 1개 이상의 구체적인 생물학적 기능을 실시한다. 기관은 심장, 간, 신장, 췌장, 폐, 갑상선 및 피부를 포함한다.
본 명세서에 이용되는 바와 같이, "조직"이란 세포와 그 세포를 둘러싸는 세포간 기질을 포함한다. "조직"은 단독으로 또는 다른 세포 혹은 조직과 조합해서 1개 이상의 생물학적 기능을 수행할 수 있다. 조직은 경조직 또는 연조직일 수 있다. "조직 산물"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조직 및/또는 그의 조직 단편 또는 조직 유도체를 포함한다. "조직 산물"은 인간 조직을 치환 혹은 복원하는 데 이용될 수 있다. 이러한 "조직 산물"은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 탈세포화된 것과 같이 변형될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "돼지", "돼지 동물", "피그"("돼지"라고도 칭함) 및 "스와인"("돼지"라고도 칭함)은 성별, 크기 혹은 품종에 관계없이 동종의 동물을 의미하는 용어이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 인공삽입물(prostheses) 또는 인공 기구(prosthetic device)란 신체 복원을 위해 적절한 형태로 만들어진 경조직 혹은 연조직을 의미한다. 일실시형태에 있어서, 복원 중인 신체는 인체일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 예를 들어, 말, 개, 고양이 또는 기타 가축 등의 포유 동물 몸체부가 복원될 수 있다.
I. 조직의 종류 및 제조
알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능적 발현도 결여된 동물로부터의 조직은 돼지, 소 또는 양 등의 출생전, 신생, 미숙 혹은 완숙 동물로부터 얻어질 수 있다.
일실시형태에 있어서, 조직은 그의 "자연적" 형태(동물로부터 직접 제거됨)로 사용될 수 있다. 대안적으로는, 조직은 또 다른 처리를 받거나 변형될 수도 있다. 조직 및 조직의 동물 공급원은 상처치유를 촉진하고; 감염성 질병 전파 등의 원치 않는 병원체(프리온 또는 레트로바이러스 등)를 최소화하거나 제거하도록 더욱 변형 혹은 처리되거나; 조직을 멸균화하고/하거나 조직의 생체역학적 혹은 물리적 특성을 향상시키기 위해 성장인자를 부가할 수 있다.
일실시형태에 있어서, 처리의 종류는 효소 및/또는 기체에의 폭로, 에틸렌 옥사이드 처리, 프로필렌옥사이드 처리, 가스 플라스마 멸균, 퍼아세트산 멸균, 자외선 조사 또는 감마 방사선, 또는 감마선 조사 등의 화학적, 기계적 혹은 물리적인 것일 수 있다. 본 발명의 방법은 방사선 처리, 1회 이상의 동결 및 해동, 화학적 가교제에 의한 처리, 알코올 또는 오존 처리를 단독으로 혹은 조합해서 포함한다. 이들 처리의 하나 이상을 이종이식편에 실시할 경우, 그 처리의 순서는 임의일 수 있다.
일실시형태에 있어서, 이종이식 조직은 자외선 조사, 예를 들어, 자외선에 약 15분 동안 폭로시킴으로써 처리할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 감마 방사선에 폭로시킬 수 있다. 조직은 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 7.0, 10, 15 또는 20 MegaRad 또는 약 0.5 내지 3 혹은 1.5 내지 3의 양의 감마방사선으로 노광할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 이종이식편은 오존처리된될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 멸균을 위해 허용된 표준에 따라 처리될 수 있고, 이것은 예를 들어, 문헌 American National Standard, ANSI/AAMI/ISO 11137-1994, Sterilization of health care products-Requirements for validation and routine control-Radiation sterilization, 1994, American National Standard, ANSI/AAMI ST32-1991, Guidelines for Gamma Radiation Sterilization, 1991, Scholla, M. H. and Wells, M. E. "Tracking Trends in Industrial Sterilization", Medical Device and Diagnostic Industry, September 1997, pp. 92-95, AAMI Recommended Practice-"Process Control Guidelines for Gamma Radiation Sterilization of Medical Devices", ISBN No. Radiation sterilization, 1994, American National Standard,ANSI/AAMI ST32-1991, Guideline for Gamma Radiation Sterilization, 1991, American National Standard, ANSI/AAMI ST31-1990, Guideline for Electron Beam Radiation Sterilization of Medical Devices, 1990, Genova, Hollis, Crowell and Schady, "A Procedure for Validating the Sterility of an Individual Gamma Radiation Sterilized Production Batch", Journal of Parenteral Science and Technology, Volume. 41, No. 1, pp. 33-36, Jan 1987, 및 Gaughran and Morrissey, “Sterilization of Medical Products,” Volume 2, ISBN-0-919868-14-2, pp. 35-39, 1980를 참조하면 된다.
다른 실시형태에 있어서, 이종이식 조직은 알코올 용액 중에서 침지처리될 수 있다. 어떠한 알코올 용액이라도 이 처리를 수행하는 데 이용될 수 있지만, 예를 들어, 페놀, 헤테로방향족 알코올, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 메틸-프로판올, 이소프로필알코올, 2-프로판올, 사이클로부탄올, 1,2-에탄디올 4,4-디메틸-2-펜탄올, 4-펜텐-2-올, 4-아미노-3-이소프로필헥산올 5-머캅토-2,4-사이클로헥산디올 등의 1차 알코올, 2차 알코올, 3차 알코올, 폴리올, 고급 알코올, 방향족 알코올 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 알코올 용액은 10, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 알코올일 수 있다. 예를 들어, 이소프로판올의 70% 용액을 들 수 있다. 알코올 용액은 실온(대략 20 내지 30℃, 또는 25℃) 또는 저온(대략 0 내지 20 ℃)에서 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 이종이식 조직은 동결/해동 사이클로 처리될 수 있다. 예를 들어, 이종이식 조직은 어떠한 동결 방법을 이용해서 동결될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 조직은 비동결 조직을 함유하는 내부의 온점이 남지않도록 완전히 동결된다. 일실시형태에 있어서, 이종이식 조직은 소정 시간 동안 액체 질소 속에 침지될 수 있다. 조직은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15 분 동안 침지될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 이종이식편은 동결될 수 있다. 조직은 냉동고에 놓이거나 0℃ 이하의 저온에 폭로될 수 있다. 이어서, 동결/해동 사이클 처리의 다음 공정에 있어서, 이종이식 조직은 적절한 용액, 예를 들어, 등장성 식염수욕에의 침지에 의해 해동될 수 있다. 욕의 온도는 약 25 ℃와 같은 대략 실온일 수 있다. 조직은 예를 들어, 적어도 5분, 적어도 10분 또는 적어도 15분 해동을 가능하게 하는 기간 동안 식염수욕 중에 침지될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 동결-해동 처리 전 또는 동안 동결 방지제에 의해 처리될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 이종이식편은 세포외 기질 내에서 단백질을 가교시키거나 화학 약품에 폭로시킬 수 있다. 어떠한 폭로 혹은 가교제도 이 처리에 이용될 수 있고, 1개 이상의 가교 공정이 수행될 수 있고, 또는 1조 이상의 가교제가 고도의 가교를 얻는 데 이용될 수 있다. 가교제는 예를 들어, 다음과 같이 작용할 수 있다: 제 2 분자상의 티올에 하나의 생체 분자상의 아민기를 결합시키고, 생체 고분자의 아민 간에 가교를 형성하고, 아민과 티올을 가교시키고, 이민과 카복실산 또는 티올과 카복실산 간에 가교를 형성한다.
일실시형태에 있어서, 산성 pH 등에 폭로된 글루타르알데하이드, 포름알데하이드, 파라포름알데하이드, 포르말린, 알데하이드류, 아디프 디알데하이드 등의 알데하이드류를 이용해서 조직의 세포외 기질 내에서 교원질(collagen)과 가교시킬 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 지방족 및 방향족 디아민류, 카보디이미드류, 디이소시아네이트류, 및 당업자에게 공지된 기타 재료를 가교제로서 사용할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 이종이식 조직은 글루타르알데하이드에 의해서 처리될 수 있다. 예를 들어, 조직은 글루타르알데하이드를 적어도 0.25, 0.5, 1,2, 2.5, 3,3. 5,4, 4.5, 5, 5.5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20% 또는 약 0.05 내지 약 5.0% ; 약 1-3% 혹은 약 2-7% 함유할 수 있는 완충액 중에 놓일 수 있다. 이 용액의 pH는 약 7.4, 7.5 또는 7.6일 수 있다. 인산염 완충 식염수 또는 트리스하이드록시메틸아미노메탄 등의 어떠한 적절한 완충액도 이용될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 이종이식 조직은 증기 형태의 가교제에 의해 처리될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 가교제는 예를 들어, 기화 포름알데하이드 등의 기화된 알데하이드 가교제일 수 있다. 일실시형태에 있어서, 조직은 적어도 0.25, 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20% 혹은 약 0.05 내지 약 5.0% ; 약 1-3% 또는 약 2-7%의 농도의 기화된 가교제에 폭로될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 기화된 가교제의 pH는 약 7.4, 7.5 또는 7.6일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 가교제에 의해서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 또는 적어도 16일 처리될 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 조직은 가교제에 의해서 3일, 4일 혹은 5일간 처리될 수 있다.
가교제는 디티오트레이톨(DTT, D-1532), 트리스-(2-카복시에틸)포스핀(TCEP, T-2556)트리스-(2-시아노에틸) 포스핀(T-6052), 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP, S-1531), 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트(SATA, S-1553), 머캅토트립토판, SPDP/DTT 조합체, SPDP/TCEP 조합체, 디브로모비만(D-1379), BODIPYFL 비스-(메틸렌아이오도아세트아마이드)(D-10620), 비스-((N-아이오도아세틸)피페라지닐)설포네르포다민(B-10621), 비스(이미도 에스테르류), 비스(숙신이미딜 에스테르), 디이소시아네이트류, 이산염화물(dicid chlorides), 비스-(4-카복시피페리디닐)설포네르호다민, 디(숙신이미딜에스테르)(B-10622), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDAC, E-2247), 6-((아크릴로일)아미노)헥산산의 숙신이미딜 에스테르(아크릴로일-lX, SE ; A-20770) 및 스트렙타비딘 아크릴아마이드(S- 21379, Section 7.5)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능성 발현도 결여된 동물로부터의 조직은 수용자 환자에게 부가적인 기계적인 강도 혹은 기타 적용 이득을 제공하기 위해 플라스틱, 생체 고분자 및 금속(스테인레스 강 및 티탄을 포함하지만 이들로 제한되지 않음) 등의 기타 불활성 물질과 배합될 수 있다. 생체 고분자로는 셀룰로오스, 알긴산, 키토산, 교원질, 엘라스티리(elastiri) 및 레티쿨린, 그리고 이들의 유사체 혹은 이들의 혼합물을 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
다른 실시형태에 있어서, 인공삽입물은 중합체(혹은 고분자) 및 세라믹 등의 합성 재료를 더 포함할 수 있다. 적절한 세라믹으로서는 예를 들어, 수산화 인회석, 알루미나, 흑연 및 열분해 카본을 들 수 있다. 적절한 합성 재료로서는 심한 탈수에 견딜 수 없는 하이드로겔 및 기타 합성 재료를 들 수 있다. 이종이식편은 합성 중합체뿐만 아니라 정제된 생체 고분자도 함유할 수 있다. 이들 합성 중합체는 매트릭스 혹은 유사한 구조를 형성하도록 망상으로 직조하거나 편성될 수 있다. 대안적으로는, 합성 중합체 제료는 적절한 형상으로 성형 혹은 캐스트될 수 있다.
적합한 합성 중합체로서는 폴리아마이드류(예를 들어, 나이론), 폴리에스테르류, 폴리스티렌류, 폴리아크릴레이트류, 비닐중합체(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리염화비닐), 폴리카보네이트류, 폴리우레탄류, 폴리디메틸실록산류, 셀룰로오스 아세테이트류, 폴리메틸메타크릴레이트류, 에틸렌비닐아세테이트류, 폴리설폰류, 니트로셀룰로오스 및 유사한 공중합체를 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 덱스트란, 하이드록시에틸 스타치, 젤라틴, 젤라틴의 유도체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리[N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아마이드], 폴리(하이드록시산류), 폴리(엡실론-카프로락톤), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(디메틸글리콜산), 폴리(하이드록시부테레이트) 및 유사한 공중합체 등의 생흡수성 중합체도 이용될 수 있다. 이들 합성 중합체 재료는 기질 혹은 기재를 형성하도록 직조 혹은 편성될 수 있다. 대안적으로는, 합성 중합체 재료는 적절한 형태로 성형 혹은 캐스트될 수 있다.
생체 고분자는 자연적으로 생성되거나, 또는 발효 등에 의해 혹은 재조합 유전 공학법에 의해 시험관내에서 생산될 수 있다. 재조합 DNA 기술은 공학자가 실질적으로 임의의 폴리펩타이드 서열을 이용해서 세균 혹은 포유 동물 세포에 있어서의 단백질을 증폭 및 발현하는 것이다. 정제된 생체 고분자는 직조, 편성, 캐스팅, 성형, 압출, 폴리셀룰러 얼라인먼트 및 자성 얼라인먼트 등의 수법에 의해 기재에 적절하게 형성될 수 있다. 적절한 생체 고분자로서는 교원질, 엘라스틴, 비단, 케라틴, 젤라틴, 폴리아미노산, 다당류(예를 들어, 셀룰로오스 및 전분) 및 이들의 공중합체를 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일실시형태에 있어서, 조직은 예를 들어, 이식된 조직이 해당 조직의 생체역학적 기능성을 수행하여 그것이 대체하거나 복원하도록 완전한 조직 대체물로서 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 조직은, 이식 후의 조직의 움직임의 최적 범위를 허용하거나, 또는 수용자에 대해 "맞춤적합성"을 하용가능하도록, 이식하기 전에 (화학적으로 및/또는 기계적으로) 미리 조정될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 조직은 탈세포화된 산물을 형성하도록 이하에 기재된 바와 같이 더욱 처리 및/또는 가공될 수 있어, 일단 이식되면 골격으로서 사용될 수 있다.
A. 조직 재구축, 복원 및/또는 대체
본 발명의 일실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 수술 용도에 사용될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 조직은 정형외과적 재구성 및 복원에 이용될 수 있다. 이러한 조직으로는 결합 조직, 힘줄, 인대, 근육 및 연골 등의 연조직뿐만 아니라, 뼈 및 뼈 유도체 등의 경조직을 포함한다. 일실시형태에 있어서, 조직은 앞십자 인대(ACL) 또는 뒤십자 인대(PCL) 치환 등의 무릎 복원에 이용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 뼈-힘줄-뼈 이식편, 회전근개 복원을 위해서 또는 봉합전으로서 사용될 수 있다. 골 조직은 전체 혹은 일부로서 뼈 복원, 뼈 플러그, 뼈 나사 또는 뼈 조각(뼈 조각이 페이스트로서 제조될 수 있는 제제를 포함함)을 이용할 수 있다. 골 조직은 치주 적용물, 미용, 및/또는 안면 재구축에도 이용될 수 있다. 조직은 또한 척추 복원을 위한 척수 스페이서로서 이용될 수도 있다. 조직은 소골, 고막, 추골이 부착된 고막, 귀 뼈 플러그, 관자뼈s, 갈비뼈 연골 및 경질막 등의 귀의 조직을 대체하는 데도 이용될 수 있고, 이것은 임의로 내부 귀 재구축에 이용될 수 있다.
1. 골 조직
일실시형태에 있어서, 본 발명은 인간에게 이식 혹은 접목하기 위한 뼈 이종이식편ㅇ르 제조하는 방법을 제공하고, 이것은 이종이식편을 제공하기 위해 동물로부터 적어도 뼈의 일부 혹은 뼈의 전체 편을 제거하는 것을 포함한다.
뼈는 본 발명의 이종이식편을 제조하기 위해 임의의 비인간 동물로부터 수확될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 뼈는 소, 양 또는 돼지 동물로부터 얻어질 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 뼈는 미숙아 돼지, 소 또는 양으로부터 얻어진다. 젊은 동물의 뼈는 더 많은 해면 뼈로 이루어지고, 일반적으로 나이 든 동물의 것보다 덜 휜다. 다른 실시형태에 있어서, 뼈는 동물 6 내지 18 개월령의 동물로부터 얻어질 수 있다.
무손상 뼈 부분은 동물의 뼈로부터 제거될 수 있다. 이 뼈는 새로이 죽은 동물로부터 회수될 수 있다. 대안적으로는, 뼈는 살아있는 동물로부터 수술적으로 제거될 수 있다. 제거된 뼈는 앞쪽, 가쪽 혹은 뒷쪽 등의 두개골; 척추, 목(대표적으로는 고리뼈, 축), 흉부(윗쪽, 안쪽, 가쪽), 허리 (윗쪽, 안쪽, 가쪽), 엉치뼈, 골반, 흉강, 흉골, 갈비, 상부 팔다리 뼈, 견갑골, 복부, 등, 쇄골, 상박골(앞쪽 또는 뒷쪽), 반경-척골(radius-ulna)(앞쪽 또는 뒷쪽), 손 (손등 혹은 손바닥), 넙다리뼈(앞쪽 또는 뒷쪽), 경골-종아리뼈(앞쪽 또는 뒷쪽) 및/또는 발(발등 혹은 바닥쪽) 등을 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일실시형태에 있어서, 제거후, 뼈는 can be placed in a 적절한 멸균 등장액 또는 기타 조직 보존액에 놓을 수 있다. 동물의 도살 후의 뼈 부분의 수확은 도살 후 가능한 한 빨리 행하는 것이 가능하고, 저온에서, 예를 들어, 약 5℃ 내지 약 20℃, 약 0℃ 내지 약 20℃, 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 0℃ 내지 약 25℃에서 수행될 수 있다.
다음에, 이종이식편 조직은 멸균한 임의로 냉수로 세척하여 잔류 혈액 단백질 및 수가용성 물질을 제거하였다. 일실시형태에 있어서, 이종이식편 조직은 을 전술한 바와 같은 조건하에 알코올 속에 침지할 수 있다. 이종이식편은 전술한 바와 같이 화학적, 기계적 혹은 생물학적 처리를 할 수 있다.
일실시형태에 있어서, 수확한 뼈 부분은 스트립 또는 블록으로 절단할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 수확한 뼈는 뼈 합정, 척수 스페이서, 뼈 플러그, 뼈 조각, 뼈 나사, 뼈 시멘트, D-형상 스페이서 및 피질 고리 등을 포함하는(그러나 이들로 제한되지 않음) 뼈 이식편의 유용한 형태로 만들어질 수 있다. 스트립, 블록 또는 기타 뼈 이식편은 해면체 뼈가 피질 뼈에 부착되도록 작성될 수 있다. 대안적으로는, 스트립, 블록 또는 기타 뼈 이식편은 해면체 뼈가 피질 뼈에 부착되지 않도록 작성될 수 있다.
뼈 시멘트 및 뼈 플러그
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 뼈 시멘트 및 뼈 플러그가 제공된다.
뼈 시멘트 조성물은 이식재료의 결합 또는 고정에 유용할 뿐만 아니라 손상된 천연 뼈의 강도강화에도 유용하다. 이러한 적용은 예를 들어, 정형외과학, 치의학 및 관련된 의학 분야에도 유용하다. 정형외과학 분야는 골절, 뼈 종양 및 뼈의 기타 질환에 의한 뼈 결함을 다룬다. 처치는 뼈의 전부 혹은 일부의 수술적 절제를 필요로 할 수 있다. 치의학 용도에 있어서, 결함 턱뼈는 치아, 암 또는 기타 질환의 추출에 기인할 것이다. 이식 재료는 이러한 뼈 결함의 절제 후 남아 있는 뼈를 복원 혹은 재구성하는 데 유용하다. 이러한 절차 동안 사용된 이식 재료는 금속, 세라믹스 및 중합체일 수 있다. 뼈 시멘트는 뼈에 다른 이식 재료이 첨가에 사용될 수 있고, 또한 남아 있는 살아 있는 뼈에 이식편을 고정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)는 정형외과학의 하드웨어 기구와 함께 광범위하게 사용되어 왔다.
종래의 PMMA 뼈 시멘트는 40 년에 걸쳐서 정형외과적 수술에 이용되어 왔지만, 1) 뼈 내부 성장을 촉진하지 못했고, 2) 뼈 피질보다 약한 이식편이었고, 3) 높은 발열과 단량체 독성을 지녔다.
따라서, 본 발명은 뼈 시멘트 속에 배합될 수 있는 본 명세서에 기재된 것 등의 기질 재료를 제공한다. 이러한 뼈 시멘트는 신속한 경화시간 및/또는 화학적 결합을 발휘하여 인공 생체재료(예를 들어, 이식 재료)를 고정한다. 이 시멘트는 생체내 생활성을 표시할 수 있고, 기계적 강도를 유지하여, 적절한 굳기 및 모듈러스를 특징으로 하고/하거나 그의 물리적 및 화학적 작용을 통해 뼈 덩어리를 개량할 수 있다. 뼈 시멘트는 분말 및 액체 성분을 함유할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 생활성 뼈 시멘트는 분말 상 재료와 액상 재료를 포함하는 분말-액체 상으로 제공된다. 다른 실시형태에 있어서, 생활성 뼈 시멘트는 2개의 별도의 페이스트 재료를 포함하는 페이스트-페이스트 상으로 제공된다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 뼈 시멘트 재료는 PMMA 뼈 시멘트 등의 다른 종류의 뼈 시멘트와 배합될 수 있다. 뼈 시멘트는 주사기를 개재한 주입 등의 통상의 임의의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 뼈 시멘트는 주사기에 의한 주입을 통한 척수 수술에 이용될 수 있다.
주사기 주입은 주사기 및 보다 큰 구멍의 바늘을 이용한 최소 침투 전달 기술을 제공한다. 또한, 시멘트를 그의 배치 영역에 정확하게 일치시키는 것이 가능하다. 또, 뼈 시멘트 또는 페이스트는 BMPs(bone morphogenic proteins)를 포함하는(단, 이것으로 제한되지 않음) 성장 인자 또는 사이토킨과 배합될 수 있다.
뼈 플러그는 긴 뼈에 도관을 영구적으로 혹은 일시적으로 차단하기 위해 사용될 수 있다. 뼈에 있어서 관내인공삽입물 또는 예를 들어 인공 엉덩이 인공삽입물과 같은 인공 연결부의 고정을 위해서, 인공삽입물의 줄기는 뼈 시멘트로 채워진 길이가 긴 뼈의 척수내 관에 삽입된다. 뼈 시멘트가 줄기의 고정을 위해 필요로 하는 것 이상으로 관내로 돌출하는 것을 방지하고, 또한 뼈 시멘트가 줄기와 뼈의 공내 벽 사이에만 존재하는 것을 확보하고, 또한 뼈 시멘트가 척수내 관으로 더 이상 누출되는 것을 방지하기 위해, 줄기 밑의 관은 뼈 플러그에 의해 차단된다(예를 들어, 미국 특허 제 6,669,733호, 제 6,494,883호 참조).
뼈 플러그는 연골 대체 상황의 넓은 영역을 수용하기 위해, 각종 높이 대 직경 비를 지니고 넓은 크기 범위에서 모델화될 수 있다. 뼈 플러그는 다각형 또는 원형 단면일 수 있다. 예를 들어, 플러그는 평판 원반에서 원통에까지 이르는 형상을 지니는 둥근 형상의 기구일 수 있다. 뼈 치환 플러그 또는 플러그들이 이식되어야 하는 장소, 복원되어야 하는 뼈 결함의 크기, 및 결함의 절제에 의해, 혹은 동공의 임의의 후속의 외과적 윤곽에 의해 형성된 것을 시작으로 해서, 연골 대체 플러그가 삽입되어야 하는 빈 공동(void cavity)의 크기와 모양 등의 각종 인자가 각각 특정 용도를 위해 고려될 수 있다.
뼈 시멘트 플러그도 사용될 수 있고, 이러한 기구는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 뼈 시멘트 플러그는 뼈 시멘트 디스펜서와 협동해서 인공 기구를 그 뼈 관내에 고착시키기 전에 뼈 관 내에 뼈 시멘트를 충전시키는 데 이용될 수 있다. 예로서, 뼈 시멘트 플러그는 뼈 시멘트 디스펜서와 협동해서 인공 엉덩이의 넙다리뼈 줄기를 그 관내에 고착시키기 전에 넙다리뼈의 골수관 내에 뼈 시멘트를 충전시키는 데 이용될 수 있다. 특히, 엉덩이 및 어깨 대체물 등의 총 접합 대체물 수술에 있어서, 뼈 시멘트는 인공 기구의 줄기를 접합부의 뼈의 골수관내로 고착시키는 데 이용될 수 있다. 그 점에 있어서, 일반적으로 인공 기구는 인공 기구의 줄기가 뼈 관내에 위치되기 전에 뼈 관내에 충분히 충전될 수 있다면 뼈 관에 더욱 확고하게 고착될 것으로 판명되었다. 일례에 있어서, 뼈 관의 초기 제작 및 세정 후, 그 관의 원위 부는 일반적으로 플러그로 폐쇄될 수 있다. 뼈 시멘트 플러그는 뼈 시멘트의 미제어 흐름을 뼈 관의 원위 부 속으로 제한하는 역할을 할 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 뼈 시멘트 플러그는 인공삽입물의 줄기의 원위 선단을 넘어 약 1 내지 2 cm까지 뼈 시멘트의 기둥을 제한할 수 있다. 플러그가 뼈 관의 원위 부에 설정된 후, 뼈 시멘트는 긴 노즐을 지닌 뼈 시멘트 디스펜서를 이용해서 플러그와 인접한 폐쇄된 뼈 관의 가장 원위 부 속으로 주입될 수 있다. 이어서, 뼈 관은 노즐로부터 시멘트가 방출됨에 따라 뼈 관의 원위 말단에서부터 뼈 관의 근위 말단까지 뼈 시멘트 디스펜서의 노즐을 철회함으로써 역행 방식으로 뼈 시멘트로 충전될 수 있다. 이러한 역행 충전은 뼈 관의 가장 근위 부분에서 공기의 트랩핑을 피하도록 도울 수 있다. After the 뼈 관이 뼈 시멘트로 충전된 후, 뼈 관 압력유지기를 뼈 시멘트 디스펜서에 접속할 수 있다. 상기 압력 유지기는 뼈 관의 근위 말단을 폐쇄하도록 뼈의 개방 단부에 대향해서 가압될 수 있다. 다음에, 압력 유기기를 통해 가압하에 뼈 관에 더 많은 시멘트를 주입할 수 있다. 이러한 가압 하에, 뼈 관 속의 시멘트는 뼈 관을 규정하는 뼈 벽의 내면의 간극 속으로 들어가게 된다. 그 후 뼈 시멘트가 세트되고, 시멘트와 뼈 벽의 내부면의 불균일부 사이에 마이크로인터록이 확립될 수 있다. 이것은 뼈 관 내에 있어서의 인공 기구의 고착을 유의하게 증대시킬 수 있다.
일실시형태에 있어서, 뼈 시멘트 플러그는 그 뼈 관을 폐쇄하는 데 효과적인 뼈 관내의 소망의 깊이에 배치되기 쉽고, 뼈 시멘트 플러그가 후속으로 제거될 필요가 있는 경우, 뼈 관의 원위 말단으로부터 철회되기 용이하다.
각종 뼈 시멘트 플러그가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,245,359호; 제 4,276,659호; 제 4,293,962; 제 4,302,855호; 제 4,344,190호; 제 4,447,915호; 제 4,627,434호; 제 4,686,973호; 제 4,697,584호; 제 4,745,914호; 제 4,936,859호; 제 4,950,295호; 제 4,994,085호; 제 5,061,287호; 제 5,078,746호; 제 5,092,891호; 제 5,376,120호; 제 4,011,602; 제 4,523,587호; 제 4,904,267호; 제 6,299,642호; 제 6,306,142호 및 제 5,383,932호 공보, 그리고 WO 94/15544호 공보를 참조하면 된다.
뼈 플러그를 이식하기 위한 수술 기법은 손상 부위에 천공하거나 구멍을 절개함으로써 그 손상된 골 조직을 제거하고, 뼈 플러그를 이용해서 이 구멍을 막는 것을 포함할 수 있다. 수술 기구는 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여한 동물로부터 제공자 부위로부터의 뼈 플러그를 수확하거나 추출하는 데 이용될 수 있다. 다음에, 뼈 플러그를 수용자 부위의 미리 형성된 구멍에 이식할 수 있다. 통상의 수확 기구는 말단에 커팅 에지를 지니는 관을 포함할 수 있다. 플러그를 추출하기 위해, 상기 기구를 제공자 부위의 뼈 속으로 구동해 넣은 후, 제거하여, 그것을 이용해서 골조직의 플러그를 취할 수 있다.
뼈 나사
다른 실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 뼈 나사가 제공된다.
뼈 골절을 감소시키는 방법 중 하나는 통상적인 석고처리 (plastering)가 부적절하게 또는 비실용적으로 제공된다 할지라도, 특히 관절 가까운 것일 수 있는 것처럼, 매우 중요한 부분으로 강화될 수 있는 골절, 또는 피부 조직에 대해 치료될 수 있는 심각한 손상에 관여하는 골절을 허용하는 외부의 고정 장치를 사용하는 것일 수 있다. 가장 예상치 못한 우발적인 상황에 대해 적응하기 위한 다양한 구조에서 사용되며, 복합한 구조물인, 상기 장치는 부러진 뼈의 비손상 부위의 골 물질 (bone material)에 견고하게 고정시키는 나사를 사용하여, 해당하는 상기 부위에 단단히 고정되는 반대편 말단을 가진다. 그러므로, 예를 들어, 정강뼈 골절의 경우, 해당하는 (정강뼈) 고정 장치의 반대편 말단은 골절된 부위를 가로질러 고정된다. 다른 경우, 골절이 발목과 관절에 관절에 관여할 경우, 해당하는 외부의 고정 장치의 뼈 나사는 정강뼈 및 목말뼈에 고정된다.
외부의 고정 장치를 고정하여, 장치의 유효성을 보장하는 뼈 나사는 적절한 드라이버에 의해 사용되도록 고안된 나사 헤드, 및 대개 테이퍼가 상기 헤드로부터 반대편 말단에서 나사 팁을 향하는 스레디드 부분 (threaded portion)을 가지는 나사 생크 (screw shank)를 포함할 수 있다. 나사 헤드는 나사 생크의 한 명에서 밀링된, 나사 축에 대해 평행으로 뻗은 플랫으로 형성될 수 있다. 뼈 나사는 다양한 길이를 가질 수 있으므로, 나사는 삽입될 수 있는 뼈의 특정 모양 및 크기에 적합하다.
척추 스페이서
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 척추의 구성요소가 제공된다. 상기 구성요소는 척추 스페이서, 척추원판, 속질핵 및/또는 섬유테를 포함하나, 그에 국한되는 것은 아니다.
척추 고정술은 구조적 변형, 외상 불안정, 퇴행성 불안정, 및 절제(술) 후 의인성 불안정과 같은 장애 및 고통스런 척추 이동을 위한 척주의 안정화를 제공하는 것으로 표시된다. 고정술 (fusion), 또는 관절고정술은 근접한 이동 세그먼트 간의 골절 브릿지의 형성에 의해 수행된다. 이는 근접한 척추뼈 몸통 간의 전방 또는 연속적인 가로돌기 간의 후방의 디스크 공간 (disc space), 라미내 (laminae) 또는 척추의 다른 후방 내에서 수행될 수 있다. 성공적인 고정술은 골원성 또는 골잠재성 (osteopotential) 세포, 적합한 혈액공급, 충분한 염증 반응, 및 적합한 국소골 (local bone) 제조를 필요로 한다.
고정술 또는 관절고정술 과정은 척추원판에 관여하는 아노몰리 (anomoly)를 치료하기 위해 수행될 수 있다. 근접한 척추의 종말판 사이에 위치한 척추원판은 척추를 안정화시키고, 척추 간의 힘을 분배하고, 척추뼈 몸통의 충격을 흡수한다. 정상적인 척추원판은 섬유테로 불리우는 외부 섬유고리에 의해 둘러싸여 한정되는 세미-젤라틴성 (semi-gelatinous) 구성요소, 속질핵을 포함한다. 건강한 비손상 척추에서, 섬유테는 속질핵이 디스크 공간에서 튀어나오는 것을 방지한다.
척추 디스크 (spinal disc)는 외상, 질환 또는 노화로 인해 옮겨지거나 손상될 수 있다. 섬유테의 파열은 속질핵이 척주관으로 튀어나오게 하는데, 이는 보통 추간판탈출증 (herniated disc) 또는 디스크 파열 (ruptured disc)으로 언급되는 상태이다. 튀어나온 속질핵은 척수신경을 눌러, 신경 손상, 통증, 무감각, 근무력 및 마비를 유발할 수 있다. 척추원판은 또한, 정상적인 노화 과정 또는 질환에 기인하여 악화될 수 있다. 디스크가 탈수되거나 경화됨에 따라, 디스크 공간 높이는 감소되어 척추의 불안정, 감소된 이동성 및 통증을 유발할 것이다. 상기 용태의 치료방법 중 하나는 척추원반 절제술, 또는 인접한 척추의 고정술에 따른 척추원판의 전부 또는 일부분의 외과적 제거이다. 손상되거나 건강하지 못한 디스크의 제거는 디스크 공간을 붕괴시킬 수 있다. 디스크 공간의 붕괴는 심각한 통증외에도, 척추의 불안정, 비정상적인 관절 역학 (joint mechanics), 관절염 또는 신경 손상의 조기 발달을 유발할 수 있다. 통증은 척추원반 절제술을 통해 경감되고, 관절고정술은 디스크 공간의 보존 및 영향을 받은 이동 세그먼트 최종적 고정술을 필요로 한다.
골 이식 또는 척추 스페이서는 디스크 공간 붕괴를 방지하고, 디스크 공간을 가로질러 인접한 척추의 고정술을 촉진하기 위하여 추간강을 채우는 데 사용될 수 있다. 디스크의 제거 이후 척추원판 공간을 회복하기 위한 많은 시도는 금속장치에 의존한다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,878,915호, 제 5,044,104호; 제 5,026,373호, 제 4,961,740호; 제 5,015,247호, 제 5,147,402호 및 제 5,192,327호 참고)
기능성 알파-1,3-GT의 발현이 결여된 동물로부터의 척추 구성요소는 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 뼈는 동물로부터 수득될 수 있으며, 그런 다음 세정하여 조직 및 혈액을 제거할 수 있다. 뼈를 알코올 및 과산화물과 같은 약제, 또는 상기 기재된 바와 같은 다른 약제로 처리하여, 세포성 물질, 지방 및 비교원질성 단백질을 제거할 수 있다. 골 물질은 유리된 교원질을 제거하도록 처리되어, 결합성 또는 구조성 교원질을 남길 수 있다. 유리된 교원질 및 다른 잔존 지방을 제거하기 위한 약제 중 하나는 SDS(sodium dodecyl sulfate)이다.
2. 연조직
연조직은 몸통 (body)의 구조 및 기관을 연결하거나, 지지하거나, 혹은 둘러싼다. 연조직은 예를 들어, 근육, 힘줄, 지방, 혈관, 림프관, 신경, 관절 피부 주변의 조직 또는 뼈 이외의 다른 조직 주변의 조직을 포함한다.
결합 조직, 힘줄, 반달 연골, 인대, 근육 및 연골과 같은 연조직은 동물의 관절에서 추출될 수 있다. 조직의 공급원은 갓 죽인 동물로부터 수득될 수 있다. 대안적으로는, 조직은 살아있는 동물로부터 외과적으로 제거될 수 있다. 어떤 관절이라도 연조직의 공급원으로 사용될 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 해당하는 제공자 관절에서 유래한 조직은 이종이식 조직을 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대퇴뼈-정강뼈 (네발무릎) 관절에서 유래한 연골은 무릎으로의 이식(술)을 위한 연골 이종이식편을 제조하는데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 제공자 동물의 고관절에서 유래한 연골은 인간 고관절을 위한 연골 이종이식을 제조하는데 사용될 수 있다.
일실시형태에 있어서, 연조직은 무릎 관절에서 추출될 수 있다. 무릎은 다양한 이동을 창출하기 위해 상호작용하는 연골성 구조, 공간적으로 상호연관된 뼈, 및 인대를 함유하는 복잡한 관절이다. 특히, 대퇴 관절융기는 연골성의 내측 및 외측 반달연골을 통해서, 정강뼈의 표면 고원(surface plateaus)과 연관되고, 상기 모든 구조는 다양한 인대에 의해 적소에 유지된다. 무릎 관절을 안정화시키는 4개의 개별적인 인대는 필수적이다(예를 들어, 도 7 참조). 관절의 일면에 관절의 측측(side-to-side) 안정성을 위한 안정제로 작용하는 안쪽곁 인대(MCL) 및 가쪽곁 인대(LCL)가 존재한다. MCL은 실질적으로 2개의 인대 구조, 심층적 및 표면적 구성요소로 구성된 광범위한 인대인 반면, LCL은 전혀 다른 삭상의 구조 (cord-like structure)이다. 관절 중심의 전방부는 앞십자 인대(ACL)이다. 이러한 인대는 정강뼈에 대한 대퇴골의 매우 중요한 안정제이며, 여림(agility), 점핑, 및 감속 활동 동안 정강뼈가 앞쪽으로 회전하거나 미끄러지는 것을 방지하도록 작용한다. 직접적으로 ACL의 후방은 그 반대편, 뒤십자 인대 (PCL)이다. PCL는 정강뼈가 후방으로 미끄러지는 것을 방지한다.
내측 및 외측 반달연골은 단백질 교원질의 섬유의 간질 매트릭스인 섬유성 연골세포(fibrochondrocyte)로 불리우는 세포로 구성된 구조이며, 프로테오글리칸로 형성된 바탕질 내에 있다. 손상되지 않은 반달연골은 무릎 관절 내에서 상호작용을 하는 골표면을 위해 적합한 힘 분포, 안정화, 및 윤활을 보장함으로써 무릎을 위한 충격 흡수를 제공하며, 이는 일상적으로 일반적인 활성 동안 반복된 압박 로딩(compression loading)에 노출된다. 내측 및 외측 반달연골의 충격 흡수 기능 중 대부분은 연골 고유의 탄력성에서 유래된 것이다. 반달연골이 손상, 질환, 또는 염증을 통해 손상될 경우, 관절염(성) 변화는 기능 손상의 결과로서 무릎 관절에서 발생한다.
무릎의 앞십자 인대(ACL)는 모든 굽힘 위치에서 대퇴골로부터 정강뼈의 앞쪽 전위에 저항하는 기능을 한다. ACL는 또한 젖힘을 저지하고, 내부 및 외부 정강뼈 회전 동안 충분히 뻗은 무릎의 회전적 안정성에 기여한다. ACL는 고유감각에 관여할 수 있다. ACL은 세포, 물, 교원질, 프로테오글리칸, 섬유결합소, 엘라스틴, 및 다른 당단백질로 구성된 결합 조직 구조로 이루어진다 (예를 들어, Cyril Frank, M. D. 등의 Normal Ligament: Structure, Function, and Composition. Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissues, 2: 45-101 참조). 구조적으로, ACL은 외측 대퇴 관절융기의 안쪽벽에 대해서 가장 위쪽 뒤로 뻗어 있는 경골의 과간 융기(intercondyloid eminence)의 앞에 있는 오목부에 부착된다. ACL의 부분 혹은 완전한 열창은 해마다 미국에서 약 30,000명에 달하는 환자 시술을 포함하는 매우 통상적인 것이다.
관절 연골은 인간 및 동물에서 통합하는 관절을 형성하는 모든 뼈의 말단을 덮는다. 연골은 다양한 프로테오글리칸뿐만 아니라, 섬유성 연골세포라 불리우는 세포 및 교원 섬유의 세포외 기질로 구성된다. 연골은 힘 분포를 위한 기작으로서 관절에서 작용하고, 뼈 간의 접촉 부위에서 윤활제로서 작용한다. 관절 연골 없이, 스트레스 농도 및 마찰은 관절이 이동의 용이함을 제공하지 않는 정도까지 발생할 수 있다. 관절 연골의 손실은 대개 고통스러운 관절염 및 감소된 관절 이동을 유발한다. 성인에게 있어서 관절 연골은 한 번 파괴되면 중요한 정도까지 자연적으로 재생되지 않기 때문에, 손상된 성인 관절 연골은 역사적으로 복구, 대체, 또는 절제(술)을 포함한 다양한 외과적 시술에 의해 치료되어 왔다.
일실시형태에 있어서, 반달연골의 연조직은 무릎 힘줄을 절개하여 관절로부터 추출될 수 있으며, 그런 다음, 반달연골의 돌기(horn)는 조직에 부착하지 않고 절개될 수 있다. 택일적으로, 소량의 뼈는 돌기, 예를 들어, 뼈 플러그와 같이, 실질적으로 뼈의 원통형 플러그에 부착된 채로 남아있을 수 있다. 일특정 실시형태에 있어서, 뼈 플러그는 길이가 대략 5 ml이고, 깊이는 5 ml이다. 일실시형태에 있어서, 반달연골의 윤활막 이음부는 확인될 수 있으며, 반달 연골 조직 그자체로부터 유리되어, 매트릭스 물질을 형성할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 손상되지 않은 반달연골의 연조직은 이식을 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 관절 연골 연조직은 관절에서 추출될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 연골하 골의 작은 층(small layer)을 이용한 관절 연골의 뛰어난 박피술은 확인되어 제공자 관절로부터 깎여질 수 있는데, 이는 매트릭스 물질을 형성할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 손상되지 않은 관절 연골 연조직은 이식을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 인대 연조직은 앞십자 인대, 뒤십자 인대, 가쪽곁 인대 또는 안쪽곁 인대와 같은 관절로부터 추출될 수 있다. 인대를 제거하기 위하여, 관절은 표준적인 수술기법을 사용하여 오픈될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 인대는 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착된 뼈의 블록과 함께 회수될 수 있다. 일구현예에서, 실질적으로 원통형 플러그를 나타내는 뼈의 블록은 인대와 함께 추출될 수 있고, 뼈 플러그는 대략 9-10 mm의 지름 및 대략 20-40 mm의 길이를 가질 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 인대는 뼈 없이 회수된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 인대는 뼈 없이 회수될 수 있으며, 그런 다음 매트릭스 물질을 회수하기 위하여 조직에 부착하지 않도록 절개될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 손상되지 않은 인대 연조직은 이식을 위해 사용될 수 있다.
제거된 다음, 조직은 적절한 무균 등장액 또는 조직 보존 용액에 존재할 수 있다. 동물을 죽여서 조직을 회수하는 것은 도살 후에 가능한 한 빨리 수행될 수 있으며, 저온에서, 예를 들어, 약 5℃ 내지 약 20℃, 약 0℃ 내지 약 20℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 0℃ 내지 약 25℃에서 수행될 수 있다.
교원질
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 교원질 조직은 교원질 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 비정상적인 유전자 또는 교원질 단백질의 비정상적인 가공으로 인한 교원질 구조 상의 변형은 라센 증후군, 괴혈병, 불완전 골생성증 및 엘러스-단로스 증후군과 같은 다양한 질환을 유발시킨다. 엘러스-단로스 증후군은 교원질 구조의 결함으로 인해 생화학적으로나 의학적으로나 각각 결합 조직의 명백한 모든 구조적 허약함인, 실질적으로 적어도 10개의 개별 장애와 관련된 이름이다. 불완전 골생성증은 또한 하나 이상의 장애를 포함한다. 생화학적 및 의학적으로 구별할 수 있는 적어도 4개의 장애는 복합 골절 및 그로 인한 골 변형으로 특징지어지는 모든 것으로 밝혀졌다. 마르팡 증후군은 그 자체가 결합 조직의 장애로서 밝혀졌으며, 이상 교원질로 되는 것으로 여겨졌다. 그러나, 최근의 증거는 마르팡 증후군이 세포외 단백질, 피브릴린에서 돌연변이로 인한 것이며, 이는 세포외 기질의 비-콜라겐성 미세원섬유의 필수성분이라는 것을 보여준다.
표 3: 교원 질환
장애 콜라겐 결함 증후학
엘러스-단로스 Ⅳ 타입 Ⅲ에서 감소 동맥, 창자 및 자궁 파열, 얇고 쉽게 멍드는 피부
엘러스-단로스 Ⅴ 감소된 크로스-링킹 피부 및 관절 과신전
엘러스-단로스 Ⅵ 감소된 하이드록시라이신 빈약한 상처치유, 근골격 변형, 피부 및 관절 과신전
엘러스-단로스 Ⅶ N-말단 전펩타이드 제거 안됨 쉽게 멍드는 피부, 고관절 탈구, 과신전
불완전골생성증 타입 Ⅰ에서 감소 청색 공막, 골 변형
괴혈병 감소된 하이드록시프롤린 빈약한 상처치유, 결핍된 성장, 모세관 허약
연골 플러그
다른 실시형태에 있어서, 연골 플러그는 기능성 알파-1,3-GT의 발현이 부족한 동물로부터 얻어진 것으로 제공된다. 연골 플러그는 자연 연골중의 공동을 메꾸기 위해 사용될 수 있다. 자연 연골중 공동은 외상적인 손상 또는 고질적 질환에 의한 것일 수 있다. 대안적으로는, 플러그는 날아갈 수 있는 중합체를 연골하 골에 고정시키기 위해 사용될 수 있다. 플러그는 원하는 이식에 적합한 어떤 크기, 형태, 및 윤곽으로도 만들어질 수 있다. 플러그는 임의 적용을 위한 임의의 크기의 공동을 메꾸기 위해 단독으로 또는 복수로 이용될 수 있다. 플러그는 복구 부위의 생리적 필요에 맞추기 위해 층상 구조를 형성하거나 또는 포함할 수 있다. 부가적으로, 주변의 연골, 골 및/또는 이웃한 플러그에 대한 고정을 용이하게 하기 위해 플러그의 가장자리에 능선이 형성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,632,246 참고).
연골 플러그는 다각형 또는 원형 단면일 수 있다. 다각형 또는 원형 단면은 높이-지름 비율의 1대1 이하에서 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1까지 포함할 수 있다. 플러그는 넓은 범위의 연골 대체 상태를 적용시키기 위해 넓은 범위의 크기로 및 다양한 높이-지름 비율을 가진 것으로 몰딩될 수 있다. 예를 들어, 플러그는 플랫 디스크로부터 실린더 범위의 형태를 가진 둥근 장치일 수 있다.
각기 특별한 적용을 위해 다양한 요소가 고려될 수 있는데, 예를 들면 연골 대체 플러그 또는 플러그가 어느 위치에 이식될 수 있는지, 복구될 연골 결함의 크기 및 공동의 크기 및 형태, 결함의 절제(술)에 의해 초기 형성되었는지, 또는 임의의 연속적인 외과적 능선의 공동에 의한 것인지 이것의 안으로 연골 대체 플러그가 이식될 수 있다.
예를 들어, 연골 대체 플러그 장치는 플랫하게 된 것을 가진, 디스크 형태가 더 넓으나 얕은 결점에 대하여 가장 적절한 반면, 큰 높이-지름 비율을 가진 장치는 더 작은 표면적을 가진 결함에 적절하나, 이것은 연골 및/또는 골 층안으로 깊게 확장된다.
본 발명의 연골 플러그의 표면은 다공성 또는 거칠어진 표면을 노출시키기 위해 처리될 수 있다. 거칠어지거나 결이 있도록 플러그의 표면을 처리함으로써, 세포 접착성은 증가될 수 있고, 세포 이동 및 조직층의 과성장을 허용할 수 있다.
적합한 표면 거칠기로, 얻어진 세포는 고정을 증진시키는 플러그 표면으로의 외부성장(ongrowth) 및 내부성장(ingrowth)을 통해 접착할 수 있다. 이러한 세포 내부성장은 궁극적으로 골질의 플러그와의 경계로 전환될 수 있고, 원하는 특성으로 고려된다. 이러한 변화에서 중요한 것은 장치에서 주변 조직으로 얼마의 부하가 전이되는가이다. 플러그 및 주변 조직간 변형에서의 많은 부적당한 짝지음은 플러그 주변의 섬유 조직층을, 비록 유연하지만, 원하는 고정을 제공하지 않게 이끌수 있다. 다공성은, 거칠음과 유사하게, 생물학적 고정을 고려할 때 중요하며, 이로울 수 있다.
봉합 유지 ( suture anchor )
본 발명에서 제공된 연조직은 봉합 유지를 형성하는데 사용될 수 있는데, 이는 관절재건 수술 및 관절경 외과적 과정 동안 뼈에서 형성된 오프닝에서 봉합을 안전하게 하는데 사용될 수 있다. 유지는 뼈에서 존재할 수 있으며, 밀집된 골절의 물질로 안전하게 할 수 없는 봉합으로 연결될 수 있다. 이러한 봉합 유지는 예를 들어, 인대 또는 힘줄을 무릎, 어깨 및 팔꿈치 재구축 및 복구 수술에서 뼈로 고정시키는데 사용될 수 있다. 뼈 유지 (bone anchor)의 중요한 속성은 견고한 유지를 삽입하고 제공하기 쉽다는 것이다. 수술 후 유지의 의도하지 않은 제거 (dislodgement)는 심각하게 불리한 결과를 가질 수 있으므로, 다수의 중요성은 부착된 봉합에 의해 가해지는 추출 또는 위축 (withdrawal) 힘을 저해하는 유지의 능력에 둔다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,738,255, 4,013,071, 4,409,974, 4,454,875, 및 5,236,445 참고)
본 발명은 또한, 뼈에 봉합을 유지하는 방법을 제공한다. 우선, 보링 구멍 (bore hole)은 뼈에서 천공될 수 있다. 그런 다음, 뼈 유지는 보링 구멍으로 삽입될 수 있다. 직사각형 또는 타원형 단면을 가진 로드와 같은, 팽창기구는 유지의 오픈 근위단을 가로질러 팽창 챔버로 삽입될 수 있다. 그런 다음, 뼈 유지의 홈이 있는 근위단은 기구가 회전하는 것처럼 기구를 벽과 접촉시키는 기구를 회전시킴으로써 팽창된다. 기구의 직사각형 또는 타원형 단면도는 벽과 접촉하기 전에 적어도 회전의 일부분을 가로질러 회전할 수 있게 하여, 뼈 유지가 기구와 회전할 가능성이 낮다. 일실시형태에 있어서, 기구의 말단 팁 (distal tip)은 팽창 멤버의 근위단에서 해당하는 오목 (recess)에 설치된다. 오목은 유지를 확장하기 위하여 로드가 회전하는 것에 대한 고정된 피봇 포인트 (pivot point )를 제공한다.
3. 골격
소정의 실시형태에 있어서, 조직을 제조하는 방법은 조직 복원 및 재형성에 이용할 뿐만 아니라, 필요에 따라 임의로 가교 및 멸균화를 위한 처리에 이용하기 위한 무세포 기질 혹은 골격만을 남기도록 모든 살아있는 세포를 박리하거나 희생시키는 단계(탈세포화)를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 동물로부터 유래된 임의의 탈세포화된 경조직 혹은 연조직이 제공된다. 일실시형태에 있어서, 탈세포화된 연질의 진피 조직이 제공된다. 다른 실시형태에 있어서, 탈세포화된 점막밑 조직이 제공된다. 다른 실시형태에 있어서, 이러한 탈세포화된 재료는 보다 적은 면역원성일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 이러한 탈세포화된 조직은 특히 인체 부분을 복원 및/또는 재구축하기 위한 골격형성 또는 기질로서 사용될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 탈세포화된 조직은 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 공지된 탈장, 복벽, 회전 근개, 성형 수술 또는 기타의 연조직 결함을 복원하는 데 이용될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 실시형태에 있어서, 점막밑 및/또는 진피 탈세포화된 재료가 제공된다.
본 발명의 일측면에 있어서, 이들 알파 1,3GT 동물로부터 유래된 조직은 회수(수확)되고 이어서 더욱 처리되어 예를 들어, 골격으로서 이용하기 위한 탈세포화된 조직을 형성할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 조직은 다단계 프로세스로 처리될 수 있고, 그 공정의 예로서는, 조직을 안정화용액에 의해 처리하는 공정, 탈세포화처리에 의해 세포 및 임의의 남아 있는 항원 조직성분을 제거하는 공정, 효소처리, 가교에 이해 조직의 구조적 일체성을 향상시키거나, 혹은 임의의 남아 있는 항원 조직성분을 제거하고, 멸균화하여 천연의 바이러스를 제거하고/하거나 불활성화시키고, 및/또는 장기간 보존하는 방법 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일실시형태에 있어서, 안정화 용액은 적절한 완충액, 1종 이상의 항산화제, 1종 이상의 산화 방지제, 1종 이상의 삼투제 및 항생제를 포함할 수 있고, 또한, 1종 이상의 프로테아제 저해제를 더 함유할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 탈세포화된 조직을 생성하는 조직 처리는 예를 들어, 기질을 손상시키는 일 없이, 조직 거부 및 이식 실패를 초래할 수 있는 세포의 제거를 포함할 수 있다. 탈세포화 프로세스는 합성에 강하고 더욱 유연한 조직을 부여하고, 장력 및 기능적 특징을 유지하고, 접착을 방지하는 것을 돕고, 감염 및 이식 거부의 감소, 그리고 주위의 숙주 조직의 재형성을 촉진하는 이점을 지닌다. 다른 실시형태에 있어서, 다수의 화학적 처리를 이용해서 행할 수 있고, 예를 들면, 소정의 염, 세정제 또는 효소 및/또는 진공/가압 프로세스에서 인큐베이트하는 것을 포함한다. 일실시형태에 있어서, 세정제는 Triton X-100 (Rohm and Haas Company of Philadelphia, Pa.)일 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, Triton X-100은 세포막을 제거하고, 예를 들면, 미국 특허 제 4,801,299호르 참조한다. 기타 탈세포화 세정제는 폴리에틸렌(20) 소르비탄 모노-올레에이트 및 폴리옥시에틸렌(80) 소르비탄 모노-올레에이트(Tween 20 및 0), 데옥시콜산 나트륨, 3-[(3-클로로아미도프로필)-디메틸아미노]-1-프로판-설포네이트, 옥틸-글루코사이드 및/또는 도데실황산 나트륨 또는 기타 당해 기술분야에서 공지된 소정의 세정제를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 실시형태에 있어서, 효소는 탈세포화를 수행하는 데 이용될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 효소는 디파제 II, 트립신 및/또는 테르몰린신 또는 기타 당해 기술분야에서 공지된 소정의 기타 효소를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이들 효소는 교원질 및 세포내 결합의 상이한 성분과 작용할 수 있다. 예를 들어, 디파제 II는 타입 IV 교원질을 공격할 수 있고, 이것은 바닥판의 성분이고 기저막의 섬유질을 고정하고 있다. 다른 예에 있어서, 테르몰리신은 케라티노사이트의 기본층의 반교소체에 있어서의 구부 펨피고이드 항원(bulbous phemphigoid antigen)을 공격할 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 트립신은 세포 사이의 결합체를 공격할 수 있다.
추가의 혹은 대안적인 실시형태에 있어서, 탈세포화 이종이식편은 약품에 폭로되어 단단해지거나(tanning), 세포외 단백질내에서 단백질과 가교하여 이종이식편에 존재하는 면역 결정인자를 더욱 감소 혹은 저감시킬 수 있다. 임의의 탄닝(tanning) 또는 가교제는 이 처리에 사용될 수 있고, 1개 이상의 가교공정을 수행할 수 있고, 또는 1종 이상의 가교제를 이용해서, 완전한 가교를 확보하는 동시에 이종이식의 면역원성을 최적으로 저감시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타르알데하이드, 포름알데하이드, 아디프 디알데하이드 등의 알데하이드류를 이용해서 조직의 세포외 기질 내에서 교원질과 가교시킬 수 있다. 기타 적합한 가교제는 지방족 및 방향족 디아민류, 카보디이미드류, 디이소시아네이트류 등을 포함한다. 또는, 이종 이식편을 예를 들어 기화된 포름알데하이드 등의 기화된 알데하이드 가교제(이들로 한정되지 않음)와 같은 기체 형태로 가교제에 폭로시킬 수 있다. 가교반응은 면역원성 결정인자가 이종발생성 조직으로부터 실질적으로 제거될 때까지 계속될 필요가 있지만, 이종이식편의 기계적 성질의 유의적인 변화 전에 반응이 종료될 필요가 있다. 가교제는 당업자에게 공지된 또는 본 명세서에 기재된 어떠한 것일 수도 있다.
소정의 실시형태에 있어서, 이러한 연조직으로부터 유래된 기질 재료는 골격 또는 인공 기구를 형성하는 데 이용될 수 있다. 기질 재료는 임의로 가교될 수 있는 부분인 건조된 다공질 공간 기질로 변환될 수 있다. 인공기구의 다공질 기질은 반달형상 섬유연골세포, 내피 세포, 섬유모세포, 및 통상 세포외 기질을 점유할 뿐만 아니라 세포외 기질 성분을 합성하여 침착시키는 기타 세포 등의 세포의 내부증식을 촉진시킨다. 교원질, 엘라스틴, 레티쿨린, 이의 유사물 및 그의 혼합물 등의 세포외 기질 섬유가 기질 재료에 첨가될 수 있다. 이들 섬유도 알파-1,3-gal의 어떠한 기능성 발현도 결여한 동물로부터 얻어질 수 있다. 일실시형태에 있어서, 섬유는 기질을 통해 랜덤하게 배향될 수 있다. 대안적으로는, 섬유는 기질을 통해 실질적으로 원주방향으로 뻗거나 실질적으로 방사상으로 뻗는 것을 가정할 수 있다. 기질의 섬유의 밀도는 균일 혹은 불균일할 수 있다. 불균일 형태에 있어서는, 비교적 높은 밀도의 섬유가 높은 응력이 관여하는 지점에 확립될 수 있다.
기질 재료는 전술한 바와 같이 생체 고분자 등의 다른 형태의 물질을 함유할 수 있다. 기질 재료는 글리코사미노글리칸 분자(GAGs)를 함유할 수 있고, 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트, 히알루론산 및 이들의 혼합물은 기질 재료의 성분일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 기질 재료는 섬유를 통해서 삽입된 GAGs를 함유할 수 있다. GAGs는 개별의 분자로서 기질을 통해 균일하게 분산될 수 있거나, 또는 이들은 기구의 상이한 영역에 있어서 다양한 양으로 존재할 수도 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능적 발현도 결여한 동물로부터 형성된 조직은 세포외 기질 (ECM) 성분을 포함할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 이러한 ECM 성분은 알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능적 발현을 결여한 동물로부터 유도될 수 있다.
세포외 기질 재로는 피부, 요로, 방광 또는 기관 점막밑 조직을 포함하는 임의의 조직으로부터 유도될 수 있고, 이때의 조직은 이들로 제한되는 것은 아니다. 골격은 인공 기구로서 기능할 수 있다. 골격은 분절된 ECM 성분으로부터 합성될 수 있고, 또는 바람직한 실시형태에 있어서는, 무손상 조직의 탈세포화 혹은 처리를 통해 유도되고, 따라서, 살아있는 세포를 제거하여, 3-차원 구조를 지닌 미리 성형된 골격 및 천연 조직과 유사한 섬유 형태로서 ECM 뒤에 남게 된다. 골격 또는 기구는 알파- 1,3-Gal의 어떠한 기능적 발현도 결여한 동물의 연조직으로부터 얻어진 기질 재료로부터 유도될 수 있다. 연조직은 진피, 기관 점막밑(즉, 소장 점막밑(SIS)), 무릎 접합부로부터 제거된 가쪽 반달 연골 , 임의의 접합부로부터 제거된 관절 연골, 아킬레스 건과 같은 인대 및/또는 힘줄을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다음에, 조직은 이하에 설명하는 바와 같이 처리되어, 생체 적합성이고 생체흡수성 섬유 등의 기질 재료가 얻어질 수 있다.
세포외 기질(ECM)은 포유 동물 조직 내에서 발견되는 세포를 둘러싸고 지지하는 복합 구조 전체이다. ECM도 결합 조직이라 칭할 수 있다. ECM은 교원질 및 엘라스틴 등의 구조 단백질, 피브릴린, 섬유결합소 및 라미닌 등의 특수 단백질, 그리고 프로테오글리칸으로 구성된다.
글리코사미노글리칸(GAGs)은 ECM의 극히 복합된 고분자량 성분을 형성하는 이당류 유닛이 반복되는 장쇄이다. 이들 이당류 단위는 N-아세틸화 헥소스아민을 함유하고, 윤활 및 가교를 제공한다. GAGs의 예는 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트 및 히알루론산을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
표 1 : 척추동물 세포에 의해 생산된 대표적인 기질 형
교원질 고정자(Anchor) 프로테오글리칸 세포표면 수용자 세포
I 섬유결합소 콘드로이틴 및 더마탄 설페이트 인테그린 섬유모세포
II 섬유결합소 인테그린 연골세포
III 섬유결합소 헤파란 설페이트 및 헤파린 인테그린 정지 간세포, 상피; 관련된 섬유모세포
IV 라미닌 헤파란 설페이트 및 헤파린 라미닌 수용자 모든 상피세포, 내피세포, 재생 간세포
V 섬유결합소 헤파란 설페이트 및 파린 인테그린 정지 섬유모세포
VI 섬유결합소 헤파란 설페이트 인테그린 정지 섬유모세포
교원질은 동물 왕국에서 발견되는 가장 풍분한 단백질이다. 또, ECM을 구성하는 주요 단백질이다. 또한, 적어도 12종의 교원질이 있다. 타입 I, II 및 III은 가장 풍부하고, 유사한 구조의 세섬유(fibril)를 형성한다. 타입 IV 교원질은 2차원 망상구조를 형성하고, 기저판의 주성분이다. 교원질은 섬유모세포에 의해 우선적으로 합성되지만, 상피세포도 이들 단백질을 합성한다. 교원질의 기본적인 고차 구조는 길이가 길고 얇은 직경의 막대형상 단백질이다. 타입 I 교원질은 예를 들어 대략 길이 300nm, 직경 1.5mm이고, 2개의 α1(I) 사슬과 1개의 α2(I) 사슬로 구성된 3 나선형 서브미트로 구성되어 있다. 각 사슬은 특징적은 우선성 삼중 나선으로 서로의 둘레에 감긴 1050개의 아미노산으로 구성되어 있다. 나선 1회전당 3개의 아미노산이 있고, 매 3개의 아미노산은 구아닌이다.
교원질은 또한 프롤린과 하이드록시프롤린이 풍부하다. 프롤린의 커다란 피롤리돈 고리는 삼중 나선의 바깥쪽에 위치한다. 교원질의 삼중 나선의 횡방향 교점은 대략 50 ㎚ 직경의 세섬유의 형태로 된다. 교원질의 충전은 인접하는 분자가 그들의 길이(67 ㎚)의 대략 1/4로 위치되도록 되어 있다. 이 지그재그 배열은 전자현미경에서 볼 수 있는 가로줄무늬 효과를 생성한다.
교원질은 프로콜라겐이라 불리는 긴 전구체 단백질로서 합성된다. 타입 I 프로콜라겐은 N-말단에 추가의 150개의 아미노산과 C-말단에 250 개의 아미노산을 함유한다. 이들 프로-도메인인 구형이고 다수의 쇄내 디설파이드 결합을 형성한다. 이 디설파이드는 프로프로테인이 삼중 나선부를 형성하는 것을 가능하게 하여 안정화시킨다. 교원 섬유는 세포질 세망(ER) 및 골지 복합체에 있어서 조립되기 시작한다. 시그널 서열은 제거되고 수많은 변형이 교원질 사슬에서 일어난다. 특정 프롤라인 잔기는 프롤릴 4-하이드록실라제 및 프롤릴 3-하이드록실라제에 의해 가수분해될 수 있다.
특정 리신 잔기는 또한 리실 하이드록실라제에 의해 가수분해된다. 프 롤릴 하이드록실라제는 보조인자로서 비타민 C에 의존한다. O-결합된 형태의 글리코실화도 골지 변이동안 일어난다. 프로골라겐의 처리 완료에 의해 세포외 효소가 프로-도메인을 제거한 세포외 공간내로 분비된다. 다음에, 교원질 분자는 중합되어 교원질 세섬유를 형성한다. 세섬유 형성에 수반하여, 세포외 효소인 리실 옥시다제에 의해 임의의 리신 잔기가 산화되어 반응성 알데하이드류를 형성한다. 이들 반응성 알데하이드류는 두 사슬 사이에 특정 가교를 형성하고, 이에 따라 세섬유 내의 교원질의 지그재그 배열을 안정화시킨다.
표 2 : 교원질의 종류
타입 사슬 조성물 구조적 상세 편재화
I [a1(I)] 2[α(I)] 300 nm, 67 nm 밴드 세섬유 피부, 힘줄, 뼈 등
II [α1(II)]3 300 nm, 소 67 nm 세섬유 연골, 유리체액
III [α1(III)]3 300 nm, 소 67 nm 세섬유 피부, 근육, 빈번하게 타입 I을 지님
IV [α1(IV)]2[α2(IV)] 390 nm C-말단 구상 영역, 비세섬유 모든 기저막
V [α1(V)][α2(V)][α3(V)] 390 nm N-말단 구상 영역, 소섬유 대부분 간질 조직, 타입 I과 관련됨
VI [α1(VI)][α2(VI)][α3(VI)] 150 nm, N + C 말단. 구상 영역, 미세원섬유, 100 nm 밴드 세섬유 대부분 간질 조직, 타입 I과 관련됨
VII [α1(VII)]3 450 ㎚, 이량체 상피
VIII [α1(VIII)]3 ---- 일부 상피세포
IX [α1(IX)][α2(IX)][α3(IX)] 200 nm, N-말단. 구상 영역, 결합된 폴리테오글리칸 연골, 타입 II와 관련됨
X [α1(X)]3 150 ㎚, C-말단. 구상 영역 연골 및 무기질화 연골
XI [α1(XI)][α2(XI)][α3(XI)] 300 nm, 소섬유 연골
XII α1(XII) ---- 타입 I 및 III를 지닌 상호작용
섬유결합소의 역할은 각종 세포외 기질에 세포를 부착시키는 것이다. 섬유결합소는 접착제 분자로서 라미닌을 포함하는 타입 IV를 제외한 모든 기질에 세포를 부착시킨다. 섬유결합소는 2개의 유사 펩타이드의 이량체이다. 각 사슬은 대략 길이 60 내지 70 ㎚, 두께 2 내지 3 ㎚이다. 적어도 20개의 상이한 섬유결합소 사슬은 단일의 섬유결합소 유전자로부터 일차 전사의 교대 RNA 스플라이싱에 의해 일어나는 것을 동정하였다. 섬유결합소는 헤파란 설페이트, 교원질(타입 I, II 및 III에 대한 개별의 영역), 섬유소 및 세포-표면 수용자 등의 상이한 물질에 대한 친화도가 각각 높은 적어도 6개의 치밀하게 겹친 영역을 포함한다. 세포-표면 수용자-결합 영역은 공통 아미노산 서열, RGDS를 포함한다.
모든 기저막은 단백질와 GAGs의 하나의 공통의 세트를 포함한다. 이들은 타입 IV 교원질, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴 및 라미닌이다. 기저판은 종종 타입 IV 기질로서 불린다. 기저판의 각 성분은 그것에 체류하는 세포에 의해 합성된다. 라미닌은 기저판에 세포 표면을 고정시킨다.
일실시형태에 있어서, 전술한 바와 같은 ECM 성분 또는 그 조합물의 어느 것이라도 인공 기구로서 임의로 사용될 수 있는 골격을 형성하는 데 이용될 수 있다.
ECM-유래 골격은 대안적으로는 알파 1,3 gal 녹아웃 돼지로부터의 조직의 기계적, 화학적 혹은 효소 처리에 의해 생산될 수 있으므로, 모든 세포 및 지스러기는 숙주 세포 및 조직 재생을 보충하는 데 충분히 적합한 섬유 패턴에 있어서 ECM 뒤에 남겨지도록 제거된다. 생체적합성 및 생체 흡수성 섬유로부터 제작된 골격 혹은 인공 기구는 대상의 뼈 2개 사이에 배치되어 이들을 연결하는 영역 속으로 수술적으로 이식되어, 정상의 운동성 및 강도를 제공할 수 있다(수술적 이식에 대해서는 예를 들면, 미국 특허 제 6,042,610호, 제 5,735,903호, 제 5,479,033호, 제 5,624,463호, 제 5,306,311호, 제 5,108,438호, 제 5,007,934호 및 제 4,880,429호 참조). 인공 기구는 골격의 물리적 특성이 새로운 조직의 내부증식을 독려하므로 조직의 재상하기 위한 골격으로서 작용할 수 있다. 이것은 대상 숙주 몸체 영역과 천연적인 몸체 영역과 실질적으로 동일한 생체내 외표면 윤곽을 지니는 인공 기구와의 복합체로 될 수 있다.
상기 기구는 대상의 두 뼈 사이 및/또는 이들을 연결하는 영역 내로 이식될 수 있고, 대상의 몸체 영역과 상기 기구에 의해 형성된 복합체는 처리 중인 천연적인 영역과 실질적으로 같은 생체내 외표면 윤곽을 지닐 수 있다. 상기 기구는 섬유연골세포, 섬유모세포 또는 연골세포(반달 섬유연골세포, 척추 섬유연골세포 등)의 내부 증식에 적합한 생체 적합성인 동시에 부분적으로 생체 흡수성 골격을 확립할 수 있다. 내주 증식 세포와 함께 골격은 상기 영역에 있어서 자연적인 하중력을 지지할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 생체내 소정의 형상(예를 들어 반달 연골내의 세그먼트 결함 등)을 지닌 인공 기구를 제작하는 방법이 제공된다. 이 방법은 알파-1,3-gal의 어떠한 기능적 발현도 결여한 동물의 조직으로부터 섬유기질 재료를 얻고, 이 생체적합성인 동시에 부분적으로 생체 흡수성 섬유기질을 소망의 형상을 규정하는 금형속에 놓는 것을 포함한다(이 금형은 소망의 몸체 영역을 보충하도록 상기 기구의 외표면을 규정한다). 다음에, 섬유는 해당 섬유가 금형의 형상을 가정하도록 동결시키고/시키거나 화학적 가교제와 접촉시킬 수 있다. 대안적으로는, 성형의 완료후, 금형 내에 형성된 구조 혹은 기질을 잘라내어 그의 외표면이 세그먼트 결함을 보충하도록 할 수 있다. 이 방법은 반달 연골에 있어서의 세그먼트 결함에 상보적인 외표면 윤곽을 지니는데 적합한 기질을 수득할 수 있다. 이 종류의 기질을 이식해서 반달 연골의 세그먼트 결함을 보청할 수 있고, 또는 반달 보강 기구로서, 기질은 천연적인 반달형상 하중력을 지지하기 위해 그리고 반달형상 섬유연골세포의 내부증식을 위해 생체적합성이고 적어도 부분적으로 생체흡수성 골격을 확립할 수 있다.
4. 경조직 및 연조직 이식편
본 발명의 다른 측면에 있어서, 정형외과적 수술에 유용한 뼈-힘줄-뼈 이식편이 제공된다. 뼈-힘줄-뼈 이식편은 1개 이상의 뼈 블록 및 이 뼈 블록에 부착된 힘줄을 포함할 수 있다. 뼈 블록은 고정 나사를 수용하는 데 충분한 홈을 제공하도록 절개될 수 있다. 대안적으로는, 1개 이상의 뼈 블록을 함유하는 뼈-힘줄-뼈 이식편이 제공되고, 이때, 뼈 블록은 합정 및 뼈 블록에 부착된 힘줄로 미리 성형된다. 뼈-힘줄-뼈 이식편을 얻기 위한 방법도 제공되며, 이에 따라, 여기에 힘줄 또는 인대를 부착한 제 1 뼈 플러그가 먼저 절개되고, 여기에 힘줄 또는 인대를 부착한 제 2 뼈 플러그가 절개되며, 따라서, 제 1 뼈 플러그와 제 2 뼈 플러그는 근접한 뼈 줄기로부터 유래되어, 제 1 뼈 플러그 또는 제 2 뼈 플러그의 절개는 후속해서 절개되는 뼈 플러그 내에 오목부를 형성한다.
다른 실시형태에 있어서, 하나의 힘줄과 하나의 뼈 블록을 포함하는 뼈-힘줄-뼈 이식편이 제공된다. 힘줄은 뼈 둘레에 감겨 힘줄, 뼈, 힘줄 층을 작성하고, 이것은 봉합 대신에 유지될 수 있다. 이것은 또한 이식을 확고히 하도록 고정하는 데 이용가능한 힘줄의 2개의 꼬리부를 포함할 수 있다. 이 유형의 이식편은 조직 강도를 증가시킬 수 있는 한편, 힘줄 운동과 관련된 천연의 고리식 주름의 이점을 살림으로써 조직 고장을 초래할 수도 있는 전단을 감소시켜 풀리형 방식에 있어서 대향하는 힘의 균형을 이루게 할 수 있다.
5. 피부 복원
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직을 피부 복원에 이용할 수 있다.
피부는 3개의 층, 즉, 표피, 진피 및 피하 층으로 분리될 수 있다. 또, 표피는 4개층, 즉, 상부에서부터 시작해서 하부로 기저 세포층, 유극층, 과립층 및 각질층으로 분리된다. 표피의 기저 세포층은 표피에 있어서 다른 세포로 분리되어 구별되는 기저 세포 및 피부에 그의 색을 부여하는 멜라닌을 만드는 세포인 멜라닌 세포를 포함한다. 유극층은 기저 세포층 위에 놓여 있고, 단백질 케라틴을 만드는 각질형성세포로 이루어져 있다. 케라틴은 각질층뿐만 아니라 머리카락과 손톱의 중요 성분이다. 과립층에 있어서의 세포는 평평하게 되어 있고, 방출되어 중첩하는 각질층에 있어서 함께 세포를 유지하는 "시멘트"를 제공하는 흑색 과립을 함유한다. 표피의 최상층은 실제로 피부의 주된 물리적 장벽을 형성하는 케라틴에 의해 충전된 사멸세포의 치밀 충전층으로 이루어져 있다. 각질층은 신체의 다른 부분보다 더욱 매일 마모와 찢어지는 것에 내성이 있는 손바닥이나 발바닥과 같은 영역에 있어서 더욱 두껍게 되어 있다. 표피는 또한 감염에 대한 피부의 방어의 일부로서 작용하는 랑게르한스 세포를 포함한다. 진피-표피 접합부는 표피가 진피와 만나는 부분이다. 기저막 영역은 이들 두 층 사이에서 "아교"로서 역할한다.
진피는 상부 유두상 진피와 하부 망상 진피로 나뉜다. 진피의 구조적 성분은 교원질, 탄성 섬유 및 분쇄 물질을 포함한다. 신경과 혈관은 또한 진피를 통해서 진피를 통해 횡단한다. 피부 부속물은 외분비 및 아포크린 선, 모낭, 피부기름샘 및 손톱이다. 손톱을 제외하고, 모든 피부 부속물이 진피에 위치되어 있다.
외분비선으로부터의 땀의 방출은 신체의 냉각 프로세스이다. 땀은 진피에 있어서의 나선형 세관에서 생성되어 표피를 통해 땀관에 의해 이송되어 분비된다. 전체 신체 표면은 약 2백만 내지 3백만개의 외분비 땀샘을 지니고, 하루당 10 ℓ까지 땀을 생성할 수 있다.
사람에게 있어, 아포크린 선은 알려진 기능은 없고, 우리의 조상들에게 아마도 유용하던 흔적 선으로서 여겨진다. 이들은 주로 겨드랑이 밑 및 생식기관 영역에 있어서 주로 위치되어 있다. 외분비 땀과 마찬가지로, 아포크린 땀도 진피내의 나선형 세관에서 발생되지만, 아포크린 관은 피부 표면에 도달하는 것으로부터 모낭으로 땀을 떨어드린다.
머리카락은 케라틴으로 이루어져 있고, 이 동일한 물질은 손톱 및 표피(각질층)의 상부층을 형성한다. 머리카락의 뿌리에 위치된 상이한 세포는 케라틴과 멜라닌을 만들어, 그 색을 머리에 부여한다. 인간은 2가지 종류의 머리카락, 즉, 솜털(가볍고 미세함) 및 말단부(어둡고 두꺼움)를 지닌다. 피부기름샘은 피부의 표면에 이르도록 모낭의 관 속으로 떨어지는 피지라 불리는 기름기 물질을 분비한다. 모낭과 그와 관련된 피부기름샘은 함께 털피지샘 단위라 불린다. 모낭은 손바닥과 발바닥을 제외하고, 신체상의 어느 곳에나 분포되어 있다. 사람에 있어, 머리카락은 상당히 장식적이지만, 보호 기능도 한다. 눈썹 및 속눈썹은 먼지와 태양으로부터 눈을 보호하는 한편, 코털은 사람들의 코로부터 이물을 차단하는 역할을 한다. 두피 헤어는 일부의 온도 절연을 제공한다.
피부기름샘은 피지라 불리는 기름기 물질을 생성한다. 이들은 두피, 얼굴, 그리고 상부 몸통의 피부에서 가장 두드러지고, 손바닥 및 발바닥으로부터는 없다. 털피지샘 단위의 일부로서, 피부기름샘은 난포관 속으로, 궁극적으로는 피부의 표면상에 배출되는 피지를 분비한다. 피부기름샘은 청년기 동안 호르몬, 특히 안드로겐의 레벨의 증대에 응해서 크기가 증대하여 더욱 많은 피지를 생성한다. 이들은 여드름의 발생에 중요한 역할을 한다.
피하 층은 진피와 근육을 덮고 있는 하부의 근막 사이에 위치한다. 이 층은 섬유 중격막에 의해 분리되어 있는 지방세포(adipocytes: fat cell)의 군으로 이루어져 있다. 이것은 , 즉, 신체를 차가운 것으로 단절하는 것, 외상 및 충격을 더 깊은 조직에 흡수하는 것 및 신체비축연료를 위한 저장소로서 작용하는 것의 3개의 주된 기능을 담당한다.
손톱은 진피에 위치하지 않고 대신에 손가락 및 발가락 말단에 위치하는 유일한 피부 부속물이다. 손톱판은 약 0.3 내지 0.65 mm 두께의 경질 보호구조체를 형성하는 사멸 케라틴으로 이루어져 있다. 케라틴은 표피 세포를 분할함으로써 손톱 기질내에 형성된다. 손발톱 바닥은 손톱판의 하부에 단단히 부착된 상피층이다. 손발톱 바닥의 혈관은 손톱에 그들의 핑크색을 제공한다. 인접한 손톱 주름 혹은 각피는 감염-유발 유기체로부터 손톱의 기저를 보호한다. 손톱은 1일당 0.1 mm의 평균속도로 자라고, 발톱은 손톱보다 느리게 자란다.
또 다른 실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 피부 복원에 사용될 수 있다. 이러한 동물로부터 유래된 어떠한 피부 성분 혹은 이들의 배합도 이용될 수 있고, 그 예로서는 표피 조직, 기저 세포층, 유극층, 과립층, 각질층, 진피 조직, 상부 유듀상 진피 조직, 하부 망상 진피 조직, 교원질, 탄성 섬유, 분쇄 물질, 외분비 선, 아포크린 선, 모낭, 피부기름샘, 손톱, 머리카락 및 피하 조직을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 조직은 인간 피부를 대체하는 데, 예를 들어, 피부의 심한 조직 화상을 복원하는 데 이용될 수 있다.
피부 조직은 진피 또는 표피 조직 또는 이들의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 피부 밑에는 지방질 피하 조직이 있다. 일실시형태에 있어서, 피부 이종이식편은 표피를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 피부 이종이식편은 표피 및 진피를 포함할 수 있다. 진피는 예를 들어, 1, 5, 10 또는 20 mm 등의 각종 두께로 제공될 수 있다. 또한, 표피, 진피 및 피하 조직을 함유하는 피부 이식편이 제공된다. 일실시형태에 있어서, 표피, 진피 및 피하 조직을 함유하는 피부 이식편은 뼈대 영역 혹은 힘줄을 덮는 피부를 대체하는 데 이용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 피부 조직은 그의 자연적인 형태 혹은 탈세포화된 형태로, 회전 근개의 복원 혹은 대체용의 골격으로서, 내복벽 복원, 부인과 혹은 비뇨기과 조직 복원, 인대 혹은 힘줄을 복원 혹은 교체하기 위한 프로세스의 일부로서, 또는 기타 연조직 적용(예를 들어, 표 6에 기재된 바와 같음)에 이용될 수 있다. 피부 조직 이종이식편은 영구 대체물일 수 있거나, 혹은 환자에게 새로운 피부가 재증식될 때까지의 일시적인 대체물로서 사용될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 피부이식편은 일시적인 치환물로서 이용될 수 있다. 일시적인 피부 치환물은 부분층 화상을 치유하고, 상처 치유를 촉진하고 감염을 방지할 수 있고, 또한 재건 수술을 행하기에 충분하게 건강하지 않은 환자일 경우 이용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 영구 피부 이식편이 제공된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상이한 유형의 피부 이종이식편이 제공된다. 일실시형태에 있어서, 이 이식편은 부분층 이식편이다. 부분층 이식편은 표피의 일부만을 지닌 진피를 함유하고, 화상 또는 커다란 상처에 걸쳐 사용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 이식편은 전층 이식편이다. 전층 이식편은 표피 및 진피를 포함하고, 작은 영역을 커버하는 데 이용될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 이식편은 유경 피부판 혹은 이식편일 수 있다. 유경 피부판 또는 이식편은 표피, 진피 및 피하 조직을 포함할 수 있다. 유경 피부판 또는 이식편은 뼈, 힘줄 또는 신경 손상을 복원하기 위해 추가의 수술을 필요로 할 수 있는 상처 혹은 기타 영역을 커버하는 데 이용될 수 있다.
6. 내부 조직 복원
본 발명의 다른 측면에 있어서, 기능성 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 경조직 및 연조직은 탈장 복원, 굴곡 힘줄, 활주면, 혈관 접합, 심장판막 복원 혹은 교체 및 경질막 복원 등의 내부 조직 복원에 사용될 수 있다. 내부 조직은 심장막 조직, 심장판막 및 점막밑 조직을 포함한다. 일실시형태에 있어서, 점막밑 조직은 결합 조직을 복원하거나 교체하는 데 이용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 이종이식 조직은 동물 기관의 점막밑, 바람직하게는 알파 1,3 GT 녹아웃 돼지로부터의 기관 점막밑으로부터 유래된 박리된 세그먼트로부터 제조된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 점막밑은 동물의 장 조직으로부터 유래된다. 세그먼트는 점막내 근육 및 조밀층을 포함하는 점막밑 층 및 점막의 기저 조직을 포함할 수 있다. 점막밑 층 및 기저점막 조직은 장 조직의 점막의 장강 부분 및 근육층으로부터 박리될 수 있다. 이 처리는 관형상의 매우 강인한 섬유질의 교원질 재료인 3층 장 조직 세그먼트를 초래할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 4,902,508호 및 제 4,956,178호 공보 참조). 다른 실시형태에 있어서, 이 조직은 예를 들어 400 내지 600 lbs의 체중을 보이는 암퇘지 등의 성숙 동물로부터 추출된다. 3층 장 세그먼트는 이종이식을 형성하는 데 이용될 수 있거나, 또는 이들은 길이방향으로 긴 조직 세그먼트를 형성하도록 길이방향 혹은 가로방향으로 절단될 수 있다. 어느 형태에 있어서나, 이러한 세그먼트는 수술상 허용가능한 수법을 이용해서 에 기존의 생리적 구조체에 수술 부착부를 형성할 수 있는 중간부분과 양쪽 대향 말단 위치 및 양쪽 가쪽 부분을 지닌다(미국 특허 제 5,372,821호 참조). 관련된 실시형태에 있어서, 연조직은 진피 혹은 피부 조직으로부터 유래되고, 또한 이것은 기존의 생리적 구조체에 수술 부착부를 위해 형성되거나 절단되거나 사용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 연조직 이물이식물을 인간 속으로 제작 혹은 처리하는 방법을 제공한다. 조직의 무손상 부분은 동물의 어떠한 조직으로부터 제거될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 무손상 심장은 동물로부터 제거될 수 있고, 이어서 심장판막 조직을 잘라내거나, 심낭막을 수확할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 상피 조직, 결합 조직, 혈액 조직, 뼈 조직, 연골 조직, 근육 조직, 신경 조직, 아데노이드 조직, 지방 조직, 윤문상 조직, 뼈, 갈색지방 조직, 해면체 조직, 근육, 연골, 해면 조직, 연골모양 조직, 친크롬 조직, 다토익(dartoic) 조직, 탄성 조직, 상피 조직, 지방(fatty) 조직, 상동 연골 조직, 연골(cartilage) 조직, 섬유질 조직, 감기(Gamgee)조직, 젤라틴 조직, 과립(granulation) 조직, 창자관련 림프조직, Haller의 혈관 조직, 경질 조혈 조직, 무관 조직, 사이질 조직, 피복조직, 섬형상 조직, 림프 조직, 림프구 조직, 중간엽 조직, 중간콩팥조직, 점액 결합조직, 다방성 지방 조직, 골수 조직, 비근점(코뿌리점) 조직, 연조직, 콩팥발생조직, 결절조직, 뼈조직, 뼈형성 조직, 뼈모양 조직, 치주단 조직, 세망 조직, 망상조직, 고무조직, 골격근, 평활근 및 피하 조직을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일실시형태에 있어서, 조직은 새롭게 사망한 동물로부터 회수될 수 있다. 대안적으로는, 조직은 살아있는 동물로부터 수술적으로 제거될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 제거 후, 조직은 적절한 멸균 등장성 또는 기타 조직 보존 용액 중에 놓을 수 있다. 동물의 도축후의 조직의 수확은 도축 후 가능한 한 신속하게 수행될 수 있고, 또한 저온에서, 예를 들어, 약 5℃ 내지 약 20℃, 약 0℃ 내지 약 20℃, 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 0℃ 내지 약 25℃에서 수행될 수 있다. 수확한 조직 및 판막은 조직을 연합하는 일없이 절제될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 조직 또는 심장판막 혹은 그 일부분은 조직연합, 플라그, 석회화 등이 없이 절제할 수 있다. 대안적으로는, 조직 또는 판막은 주위 조직의 일부와 함께 절제될 수 있다.
하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 우심실 판막은 별개의 첨판으로서 잘래낼 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 우심실 판막은 방실 오리피스(theauriculo-ventricular orifice) 둘레의 섬유 고리 및 힘줄 끈을 포함하는 무손상 판막으로서 추출될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 판막의 절제 후, 판막 또는 판막 부분은 부목, 고리 등에 의해 지지될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 복막 또는 심낭막은 심장판막 이종이식편 또는 당업자에게 공지된 절차에 다른 기질 재료를 형성하기 위해 수확될 수 있다(예를 들어, Lauren에 의한 미국 특허 제 4,755,593호 참조).
연조직 이종이식편은 표 6에 표시된 것과 같은 인체 부분의 복원 혹은 재구축을 위한 각종 용도에 이용될 수 있다.
심장 판막
일실시형태에 있어서, 심장판막은 알파-1,3-Gal의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 추출된다. 소, 양 또는 돼지 심장, 구체적으로는, 알파-1,3-Gal의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터의 돼지 심장은 심장판막의 공급원으로서 기능할 수 있다. 심장판막은 섬유연골세포와, 교질 및 탄성 섬유의 세포외 기질, 그외 각종 프로테오글리칸으로 이루어져 있다. 심장판막의 종류로는 승모판막, 심방 판막, 대동맥판막, 우심실 판막, 폐동맥 판막, 폐동맥 패치, 하강 가슴 대동맥, 대동맥 비판막도관(대동맥 non-valve conduit), LPA 및 RPA를 지닌 폐동맥 비판막도관(pulmonic non-valve conduit), 무손상 첨점을 지닌 혹은 지니지 않은 좌우절반 폐동맥, 대복재정맥, 대동맥-장골동맥(aortoiliac), 넙다리 정맥, 넙다리 동맥 및/또는 반달 판막을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 소정의 실시형태에 있어서, 공구(tool)가 심장 판막 인공삽입물을 대동맥 벽에 고정하는 데 사용될 수 있다. 공구는 패스너(fastener) 및/또는 강화물(reinforcement)일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 심장판막 인공삽입물은 가요성 첨판을 지닐 수 있다. 일실시형태에 있어서, 심장 판막 인공삽입물은 조직 등의 천연 재료, 폴리머 또는 그의 조합물 등의 합성 재료로부터 구서어될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 판막 인공삽입물은 조직 판막일 수 있고, 부가적으로 부목을 포함할 수 있거나 부목을 포함하지 않을 수도 있고, 또는 돼지, 소, 또는 기타 동물 조직 공급원일 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 심장판막 이종이식편은 천연의 심장판막 이종이식편의 일반적인 외형을 지닐 수 있다. 심장판막 이종이식도 개별의 첨판 등의 판막 세그먼트를 지닐 수 있고, 각 첨판은 수용자 심장 속으로 이식될 수 있다. 대안적으로는, 돼지 심낭막은 본 발명의 심장판막 이종이식편을 형성하는 데 이용될 수 있다.
심장은 율동적으로 수축함으로써 동물의 신체를 통해 혈액을 순환시키는 중공의 근육 기관이다. 포유 동물에 있어서, 심장은 우심방 및 우심실이 좌심방 및 좌심방과 완전히 격리되도록 위치된 4개의 실을 지니고 있다. 통상, 혈액은 체 정맥으로부터 우심방으로 흐르고, 이어서, 폐동맥을 통해 폐로 구동되는 우심실로 흐른다. 폐로부터 귀환시에는, 혈액은 좌심방으로 들어가고 나서, 체 동맥 안으로 구동되는 좌심실로 흐른다.
4개의 주된 심장판막은 율동 수축 동안 혈액의 역류를 방지한다: 삼천판, 폐, 승모판, 및 대동맥판막. 우심실 판막은 우심방과 우심실을 분리하고, 폐동맥 판막은 우심방과 폐 동맥을 분리하고, 승모판막은 좌심방과 좌심실을 분리하고, 대동맥판막은 좌심실과 대동맥을 분리한다. 일반적으로, 심장판막의 이상을 지닌 환자는 판막 심장 질환을 지닌 것으로 특징된다.
심장판막은 적절하게 개방되지 않거나(협착), 혹은 누설(역류)함으로써 오작동될 수 있다. 예를 들어, 대동맥판막의 오작동을 지닌 환자는 대동맥판막 협착 또는 대동맥판막 역류로 진단될 수 있다. 어떠한 경우에도, 수술적 수단에 의한 판막 대체물이 가능한 처치이다. 대체 판막은 자가이식편, 동종이식편 또는 이종이식뿐만 아니라, 기계적 판막 혹은 돼지 판막으로부터 부분적으로 형성된 기계적 판막일 수 있다.
흥미롭게도, 동결보존된 동종이식편은 이식 후 수년 동안 수용자 환자 내에 생존하여 유지된다. 불행히도, 대체 판막은 변성, 혈전증 및 석회화 등의 문제를 일으키기 쉽다.
본 발명의 심장판막 이종이식편, 또는 그의 세그먼트는 공지의 수술기법을 이용해서 예를 들어, 개복심장 수술 또는 내시경코곁굴수술 및 경혈관 이식 등의 최소 침식 기법에 의해 당업자가 손상된 인간 또는 동물 심장으로 이식될 수 있다. 이러한 수술 기법을 수행하는 구체적인 기구는 당업자에게 공지되어 있고, 이것은 심장판막 이식 위치를 정확하고 재현성 있게 확보하게 해준다.
특정 실시형태에 있어서, 인공삽입물로서의 심장판막은 심장 및/또는 판막에 대한 각종 형태의 질환을 지닌 환자에게 사용될 수 있다. 돼지 심장은 시판의 계체된 돼지(예를 들어, 120kg 이상의 돼지)로부터 획득될 수 있다. 멸균 인산염 완충 식염수에 헹군 후, 심장은 부위별로 해부하여(심장끝을 제거함), 멸균 PBS 중 4℃에서 선적될 수 있다. 모든 심장은 동물 도축자에 의해서 24시간 이내에 처리센터에 도달될 수 있다. 대동맥 및 폐동맥 판막은 뿌리로서 해부될 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 이들 조직은 항생제와 항진균제의 혼합물 중에서 대략 48℃에서 대략 48시간 인큐베이션하는 생체부담감소 공정이 수행될 수 있다. 소독된 조직은 동결보존되거나(예를 들어, 10%(v/v) DMSO 및 10% (v/v) 태아소 혈청 중, -1℃ /분), 또는 저장 매질에 의한 처리 후 데옥시리보뉴클레아제 I 및 리보뉴클레아제 A의 혼합물에 의한 소화를 포함하는 절차에 의해 탈세포화될 수 있다. 12일 후, 탈세포화된 판막은 동결보존되거나, 예를 들어, 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 중 2 mmHg에서 0.35% (w/v) 글루타르알데하이드 속에서 총 7일간 화학적으로 고정될 수 있다(저압 고정화는 교원 기질의 천연 주름의 유지를 확실하게 한다). 일실시형태에 있어서, 고정화된 조직은 동결보존되지 않고, 글루타르알데하이드 용액(0.35% 글루타르알데하이드 등) 등의 가교고착 용액 중에 보존될 수도 있다.
조직-계 판막 인공삽입물은 그의 천연의 형태로부터 첨판 등의 구조 요소를 유지할 수 있고/있거나, 이들 구조 요소는 조직의 별개의 조각들의 조립체로부터 인공삽입물 속으로 편입된다. 예를 들어, 판막 인공삽입물은 돼지 심장판막으로부터, 소 심낭막으로부터 또는 이들의 조합으로부터 조립될 수 있다. 돼지 조직 판막, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 공구를 이용해서 환자에게 이식될 수 있다. St. Jude Medical, Inc. St. Paul, Minn.에 의해 시판되고 있는 TorontoSPERM 판막은, 본 명세서에 기재된 공구를 이용해서 이식될 수 있다. Toronto SPV. RTM. 밸브는 대동맥 심장판막 위치에서 이식하기 위해 지정되고, 예를 들어, David 등의 J. Heart Valve Dis. 1: 244-248 (1992)에 개시되어 있다. 본 발명의 공구는 환자에게 이식하기 위해 적합한 소정의 판막, 특히 조직 판막 인공 삽입물에 적용가능하다
심장 판막 인공삽입물은 가교된 돼지 판막 등의 수확한 조직 판막을 포함한다. 인공삽입물은 재봉 커버를 또 포함할 수 있다. 판막은 3개의 첨판을 포함하며, 이들은 통상의 원통형 기재와, 또한 첨판을 지지하는 3개의 경계부를 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 패스너는 대동맥판막 등의 심장 판막, 인공삽입물을 혈관벽에 고정시키기 위해 사용될 수 있다. 패스너는 심장 판막 인공삽입물의 이식 절차 동안 일반적으로 혈관벽에 고정될 수 있다. 패스너는 해당 패스너가 대안적으로 날카로운 선단을 복수개 지닐 수 있다고 하더라도, 바늘이나 손톱과 유사한 형상을 지닐 수 있다. 또, 패스너는 선단 단부를 지닌 길이가 긴 부분을 포함할 수 있다. 패스너는 또한 선단 단부와 대향하는 단부에 임의의 선두부를 지닐 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 선단 단부에 혹은 그 근방에는 갈고리가 위치되어 있을 수 있다. 패스너는 해당 패스너의 동일 쪽 또는 상이한 쪽으로부터 뻗어 있는 2개 이상의 갈고리를 포함할 수 있다. 패스너는 생체적합성 재료로 형성될 수 있다. 패스너용의 바람직한 생체 적합성 재료는 예를 들어, 내구성, 기계적 강도 및 가요성/강성에 대해서 바람직한 기계적 특성을 얻는다. 패스너는 의사가 압력을 가해서 패스너를 삽입할 경우 그들의 형상을 유지하도록 충분한 강성을 지닐 수 있다. 충분한 강성을 지니지 않은 패스너는 삽입을 위해 압력을 가할 경우 휠 수 있다. 일부의 휨은 패스너가 재료를 관통할 수 있는 한 허용가능할 수 있다. 충분한 강성을 지니지 않은 패스너는 적절하게 삽입할 수 없고, 따라서, 인공삽입물 손상, 대동맥 벽 손상, 인공삽입물의 부적합한 부착 및/또는 증가된 크로스-클램프 횟수의 경향을 증대시킨다. 이식 후, 패스너는 생체 흡수성 재료가 패스너에 사용된 경우, 인공삽입물의 수명을 위해 또는 적어도 치유 프로세스가 세포화 성장을 통해 혈관에 판막을 고정할 때까지 판막 인공삽입물을 고정하기 위해 환자에게 남아있을 수 있다. 패스너는 예를 들어, 금속, 세라믹, 폴리머 또는 그의 조합물로 이루어질 수 있다. 적절한 금속으로서는 예를 들어, 티탄 및 스테인레스 강 등을 포함한다. 적절한 세라믹으로서는, 예를 들어, 뼈 단편 등의 수산화 인회석, 흑연 등의 탄소 재료, 그리고 알루미나 등을 들 수 있다. 적절한 중합체로서는 폴리에테르에테르케톤 (PEEK) 등의 충분한 강성이 중합체를 들 수 있다. 또, 패스너는 전술한 바와 같이 생체흡수성 고분자로 형성될 수 있으므로, 시간 경과에 따라 패스너는 해당 패스너 없이도 판막 인공삽입물을 고정하기 위해 충분한 조직이 생성된 후에 흡수된다.
패스너의 길이는 약 2 mm 내지 약 8 mm, 예를 들어, 약 4 mm 내지 약 7 mm일 수 있다. 일실시형태에 있어서, 패스너의 신장된 부분의 직경은 약 2 m 미만, 예를 들어 약 0.2 mm 내지 약 1.5 mm, 또는 약 0.2 mm 내지 약 1 mm일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 심장 판막 인공삽입물을 혈관벽에 부착시키는 방법은 전술한 패스너 및 강화물을 기준으로 해서 수행될 수 있다. 강화물 자체는 패스너 혹은 기타 기구에 고착될 수 있다. 패스너는 모든 소자를 동시에 고착시키기 위해 배치될 수 있고, 또는 1개 이상의 성분이 서로 또는 패스너의 최종 배치 이전에 서로 관련될 수 있거나 판막 인공삽입물과 관련될 수 있다.
일실시형태에 있어서, 심장판막은 예를 들어, 개복 심장 절차 동안 심장 속으로 삽입될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 프로세스는 인간 환자 또는 영장류 또는 양 등의 기타 큰 동물 모델과 같은 대상을 적절한 수명 지지대상에 놓고, 흉부 공동을 개복해서 심장에 접근가능하게 함으로써 개시될 수 있다. 다음에, 횡 대동맥절개술을 행하여 대동맥 등의 혈관을 통해 천연 판막에 접근할 수 있게 된다. 일실시형태에 있어서, 혈관은 대동맥이고, 대동맥을 개방하기 위한 장소는 인공삽입물의 정확한 구조물에 의존할 수 있다. 전형적인 인공삽입물에 관해서는, 대동맥은 일반적으로 동관 연결부로부터 약 1 cm 절개될 수 있다. 손상된 또는 병걸린 천연 판막은 바람직하게는 모든 칼슘 및 석회화 지스러기를 따라 제거된다. 대동맥 판막 인공삽입물은 대동맥이 심장과 연합하는 약간 좁아지는 대동맥 고리와, 대동맥이 관상동맥으로부터 바로 하류의 대동맥의 약간 좁아지는 동관 연결부 사이에 위치될 수 있다. 그러나, 인공삽입물은 대동맥 고리 및/또는 동관 연결부를 넘어 뻗을 수도 있다. 대동맥 고리에서의 위치에 대해서는, 인공삽입물은 절단된 대동맥 아래로 낙하될 수 있다.
부가의 실시형태에 있어서, 심장 판막 인공삽입물은 적절한 혈관계, 예를 들어, 대동맥에 인접한 삽입물의 부위에 위치결정될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 판막의 유입 가장자리는, 해당 유입 가장자리가 유출 가장자리 후에 봉합될 수 있다고 하더라도, 봉합될 수 있거나, 그렇지 않으면 여기에 개시된 패스너에 의해 유출 가장자리를 봉합하기 전에 봉합될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 패스너의 적용전에 대신에 경계부를 고정시키는 것이 바람직하다. 특정 실시형태에 있어서, 패스너, 강화물, 만약 있다면, 인공삽입물은 이식 절차를의 개시시 분리될 수 있다. 대안적으로는, 요소들은 미리 조립될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 일단 인공삽입물이 적절하게 정렬되어 있다면, 강화물은 제 위치에 위치될 수 있고, 패스너는 인공삽입물을 통해, 그리고 대동맥 벽을 통해 강화물 내의 개구 속으로 순차 삽입될 수 있다. 패스너가 모두 하나의 강화물을 통해 삽입된 경우, 소정의 추가의 강화물도 패스너에 의해 마찬가지로 고정된다. 패스너는 지압, 겸자, 푸셔 공구, 해머 등을 이용해서 삽입될 수 있다. 패스너의 선두와 특이적으로 접속되는 특정 겸자를 이용할 수 있다. 강화물이 없다면, 패스너는 소망의 위치에 놓고, 마찬가지로 인공삽입물 및 대동맥 벽을 통해 삽입된다.
일부의 실시형태에 있어서, 패스너는 이식 절차의 개시 전에 강화물에 삽입될 수 있다. 강화물은 해당 강화물내의 개구를 통해 혹은 그 일부를 통해서 패스너를 삽입한 상태에서 외과 의사에게 공급될 수 있다. 이들 실시형태에 있어서, 패스너의 선두 또는 둔단(blunt end)은 강화물의 표면으로부터 돌출될 수 있다. 따라서, 절차는 성분 모두가 절차의 개시 전에 별개인 절차에 비해서 다소 단순화될 수 있다. 이들 실시형태에 있어서, 일단 인공삽입물이 혈관내에 정확하게 위치결정되면, 패스너를 지닌 강화물은 소망의 위치에 정렬될 수 있고, 이 패스너는 해당 패스너를 인공삽입물을 통해 그리고 대동맥의 벽을 통해 밀어넣음으로써 바로 배치될 수 있다. 따라서, 패스너가 차례로 삽입될 수 있고, 복수의 강화물이 이 접근법에 있어서 고착될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 1개 이상의 강화물은 이식 절차의 개시 전에 인공삽입물에 부착될 수 있다. 강화물은 제조자에 의해 인공삽입물에 고착시킬 수 있다. 강화물을 인공삽입물에 고착시키는 데는 봉합 생체 적합성 접착체 또는 기타 적절한 패스너를 이용해서 행할 수 있다. 적절한 생체 적합성 접착제로서는, 예를 들어, 섬유소 접착제 및 기타 수술용 접착제를 들 수 있다. 일단 인공삽입물이 정확하게 위치결정되면, 패스너는 강화물의 구멍 및 대동맥의 벽 내에 순차로 혹은 동시에 삽입될 수 있다.
이것은 패스너가 모두 배치될 때까지 계속될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 인공삽입물은 제자리에 있는 강화물과 해당 강화물내에 삽입된 패스너에 의해 공급될 수 있다. 강화물은 강화물을 통해, 그리고 적어도 부분적으로는 인공삽입물을 통해 삽입된 패스너를 이용해서 인공삽입물에 고착될 수 있다. 대안적으로는, 강화물은 봉합, 접착제 또는 기타 패스너를 이용해서 인공삽입물에 고착될 수 있다. 일단 인공삽입물이 동물 또는 환자 내의 제자리에 있게 되면, 각 패스너는 혈관의 벽을 통해 밀려서 인공삽입물을 고착시킬 수 있게 된다. 다른 실시형태에 있어서, 종래의 봉합은 효과적인 동시에 간단히 패스너로서 이용될 수 있다.
7. 이종이식을 위한 추가의 적용
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 기능성 알파-1,3-GT의 발현이 결여된 동물로부터 유래된 조직산물은 인간의 신체를 재구축하는 데 이용될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 탈세포화된 또는 세포화된 진피 조직, 뼈, 인대, 힘줄, 심장판막, 속질핵(nucleus pulposa), 연골, 반달 연골, 혈관, 심낭막 또는 본 명세서에 기재된 기타 조직이 예를 들어 표 6에 표시된 바와 같이 이용될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 조직은 회전근개 복원, 인간 피부 복원 및/또는 인간 연조직 복원 등의 인간 정형외과적 재구성 혹은 복원에 이용될 수 있다. 이종이식편은 영장류 혹은 양 등의 비영장류 모델 등의 각종 동물 모델에 시험될 수 있다.
이종이식편은 조직 이식편 적용에 통상 이용되는 일반적인 수술 절차를 이용해서 적용될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 예를 들어, 비혈관 조직 이식편 적용에 이용하기 위해서, 관형상 이식편 재료는 길이방향으로 절단될 수 있고 또한 말려서 조직의 "패치"를 형성할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직 박층 절차는 세그먼트를 길이방향으로 절단하고 "언롤링(unrolling)"함으로써 제조된 장 조직의 "패치"상에서 행할 수 있고, 이것은 이식전 패치를 형성한다. 제조된 이식편 조직 패치는 예를 들어, 피부 이식 재료로서, 경질막 복원을 위해 또는 이 이식편 조성의 물리적 및 기능적 특징을 지닌 조직 이식편 패치의 수술 적용에 부여하는 기타 몸체 조직 결함의 복원을 위해 이용될 수 있다.
표 6:
기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 수확한 조직의 적용/용도
세포화된 혹은 탈세포화된 진피 조직 적용: 탈장 복벽 복원 회전근개 복원 요실금을 치료하기 위한 슬링 유방 재구축, 얼굴 결함, 입술 재구축, 눈꺼플 스페이서 이식, 함몰반흔 복원을 포함한 성형수술, 화상, 피부 대체 점막 이식 코입술 주름 구강 리서페이싱(oral resurfacing) 귀밑샘절제술 코성형술 중격천공 복원 일시적 상처 드레싱 상처 피복 고실성형 입안안뜰성형술 기타 연조직 결함 진피 조직은 이하의 추가의 재료의 어느 것과도 배합될 수 있다: 지혈을 촉진시키기 위해 배합되어서, 세포(골격)의 신속한 치유, 복원을 용이하게 하는 성장인자 항-흉터형성(섬유소원, 섬유소 1) 뼈 적용: 골절 및 소골격 결함 복원, 그리고 뼈 결함, 뼈 속의 갭, 척수 복원, 턱안면 재구축, 치아 임플란트 페이스트 뼈 플러그 뼈 이식물 칩 나사 고리(상박골, 종아리쪽, 기계가공된 쐐기) 합정(단일피질, 나선 피질 합정,) 블록(삼중피질 엉덩뼈 블록, 단일피질 블록, 이중피질 블록, 해면체 블록) 쐐기(피질 쐐기, 무릎 피질 쐐기) 성형가능 스트립 해면체 칩 분말 척추 융합 넙다리 샤프트 반넙다리 샤프트 종아리쪽 샤프트 상박골 샤프트 정강뼈 샤프트 장골 스트립 피질 해면체 피질 스트립 피질 스트립 연골을 지니거나 지니지 않은 넙다리 선두, 전체 혹은 부분 넙다리뼈, 근위 또는 원위 넙다리뼈, 근위 또는 원위 경골을 포함하는 중간 이식편 피질 해면체 칩 총 접합부 치환 광물제거된 뼈 기질 척주전만 피질 블록에의 이용 골 조직은 이하의 추가의 재료의 어느 것과도 배합될 수 있다: 불유합 골절 복원용 성장 인자 (BMP) 전달 기질로서의 돼지 젤라틴 인대/힘줄 적용: ACL 복원/대체 PCL 복원/대체 뼈를 포함하는 무릎 힘줄 뒷쪽 정강근 힘줄 앞쪽 정강근 힘줄 반힘줄모양근 힘줄 두덩정강근 힘줄 심장판막 적용/유형: 복원/대체 대동맥판막 폐동맥 판막 폐동맥 패치 하강 가슴 대동맥 대동맥 비판막도관 LPA 및 RPA를 지닌 폐동맥 비판막도관 자연 그대로의 첨점을 지닌 혹은 지니지 않은 좌우절반 폐동맥 대복재정맥 Aortoiliac 넙다리 정맥 넙다리 동맥 장판막은 이하의 추가의 재료의 어느 것과도 배합될 수 있다: 수술적 삽입을 위한 고리재료의 이용 속질핵 적용: 척추간 복원/대체 연골(세포) 적용: 연골 대체 (대체물 또는 새로운 연골 성장을 촉진하기 위한 골격으로서). 연골은 이하의 추가의 재료의 어느 것과도 배합될 수 있다: 세포침윤을 촉진시키기 위한 성장인자 반달 연골 적용: 복원/대체 뼈 다리(bone bridge)를 지닌 외측 반달 연골 뼈 다리를 지닌 내측 반달 연골 반달 연골은 이하의 추가의 재료의 어느 것과도 배합될 수 있다: 이식을 용이하게 하기 위한 플라스틱 또는 금속 혈관 적용: 이식을 위해 기관과 관련되거나 일체부 혹은 전체 기관과 관련된 혈관을 베제한 혈관의 대체 /복원 목동맥대체/복원 심낭막 적용: 조직 재생을 필요로 할 경우 수술 절차에서 사용되는 패치; 수술부위에 안정화 및 보호 장벽으로서의 제작물; 기타 재료의 배합: 지혈을 촉진하기 위해 배합되어, 세포 (골격)의 신속한 치유, 보충을 용이하게 하기 위한 성장인자 항-흉터형성(섬유소원, 섬유소 1) 소장 점막밑 적용: 회전근개 복원 탈장 복벽 복원 요실금을 치료하기 위한 슬링 화상 피부 대체 유방 재구축, 얼굴 결함, 입술 재구축, 눈꺼플 스페이서 이식, 함몰반흔 복원, 점막 이식, 코입술 주름, 구강 리서페이싱,귀밑샘절제술, 중격천공 복원, 코성형술을 포함하는 성형수술 일시적 상처 드레싱, 상처 피복고실성형 입안안뜰성형술 기타 연조직 결함 정맥, 동맥 또는 모세관을 포함하는 혈관 이식 기타 연조직 외반 및 내반 부정합을 교정하기 위한 HTO 쐐기 요실금을 교정하는 데 이용되는 근막 근막 used to correct 요실금
II. 기능성 알파-1, 3갈락토실트랜스페라제의 어떠한 발현도 결여된 동물
알파-1,3갈락토실트랜스페라제의 어떠한 기능적 발현도 결여된 동물로부터의 조직이 제공된다. 일실시형태에 있어서, 동물은 돼지이다. 다른 실시형태에 있어서, 동물은 소 또는 양이다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 한쪽 대립유전자가 유전자 표적화를 통해 불활성화되는 동물이 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 유전자 표적화를 통해 불활성화되는 동물이 제공된다. 일실시형태에 있어서, 유전자는 상동 재조합을 통해 표적화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 유전자는 파괴될 수 있고, 즉, 유전부호의 일부가 변경될 수 있고, 이에 따라 그 유전자의 세그먼트의 전사 및/또는 번역이 수행된다. 예를 들어, 유전자의 파괴는 치환, 결손 ("녹아웃") 또는 삽입 ("녹인") 기술을 통해서 일어날 수 있다. 기존의 서열의 전사를 조절하는 소망의 단백질 또는 조절 서열을 위한 추가의 유전자가 삽입될 수 있다.
구세계 원숭이 및 인간을 제외한 동물, 예를 들어 알파-1,3-GT 유전자의 2개의 불활성화 대립유전자를 지니는 돼지 등은 자연적으로 발생되지 않는다. 알파-1,3-GT 유전자의 제 2 대립유전자의 유전자 표적화를 통해 녹아웃을 시도하면서, 점 돌연변이를 동정해서 제 2 대립유전자에 불활성화를 부여하는 것을 발견한 것은 놀라운 것이었다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자는 적어도 하나의 점 돌연변이를 통해서 불활성될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 한쪽의 대립유전자는 적어도 하나의 점 돌연변이를 통해 불활성화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자는 적어도 하나의 점 돌연변이를 통해서 불활성화될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 이 점 돌연변이는 유전자 표적화를 통해 일어날 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 이 점 돌연변이는 자연적으로 발생할 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이일 수 있다. 알파- 1,3-GT 유전자에 있어서 자연적으로 일어나는 점 돌연변이를 보유한 돼지는 항생제-내성 유전자가 없는 알파 l,3GT-결핍 돼지의 생산을 가능하게 하고, 따라서 인간 용도를 위해 보다 안전하게 생산되기 위한 잠재성을 지닌다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10 또는 적어도 20개의 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자에 불활성을 부여하도록 존재할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 기능성 알파 l,3GT의 어떠한 발현도 방지하는 점 돌연변이를 포함하는 돼지가 제공된다. 특정 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자에 있어서 엑손 9의 제 2염기에 T → G 돌연변이를 보유하는 돼지가 제공된다.
본 발명의 다른 측면은 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 불활성화되고, 이에 따라 한쪽의 대립유전자는 유전자 표적화를 통해 불활성화되고, 다른 쪽 대립유전자는 자연적으로 일어나는 점 돌연변이를 통해서 불활성화된 동물을 제공한다. 일실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 불활성화되고, 이에 따라 한쪽의 대립유전자는 유전자 표적화를 통해 불활성화되고, 다른 쪽 대립유전자는 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 점 돌연변이의 존재에 의해 불활성화된 돼지 동물이 제공된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 불활성화되고, 이에 따라 한쪽의 대립유전자는 엑손 9에 지향하는 표적화 구축물을 통해 불활성화되고, 다른 쪽 대립유전자는 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 점 돌연변이의 존재에 의해 불활성화된 돼지 동물이 제공된다.
알파-1,3- GT 유전자의 유전자 표적화
유전자 변형될 수 있는 동물 세포는 피부, 중간엽, 폐, 췌장, 심장, 창자, 위, 방광, 혈관, 신장, 요도, 재생 기관, 및 배아, 태아, 또는 성체 동물의 전부 혹은 일부의 분해 제제 등의 각종 상이한 기관 및 조직으로부터 얻어질 수 있고, 이들 기관이나 조직은 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시형태에 있어서, 세포는 상피세포, 섬유모세포 세포, 신경 세포, 각질형성세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 림프구(B 및 T), 대식세포, 단핵세포, 단핵 세포, 심근 세포, 기타 근육 세포, 과립층세포, 난구 세포, 표피 세포, 내피 세포, 랑게르한스섬 세포, 혈액 세포, 혈액 전구체 세포, 뼈 세포, 뼈 전구체 세포, 신경 줄기 세포, 원시 줄기 세포, 간세포, 각질형성세포, 배꼽 정맥 내피 세포, 대동맥 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 섬유모세포, 간 별(liver stellate) 세포, 대동맥 평활 근육 세포, 심장근육 세포, 뉴런, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 평활근 세포, 신경집 세포(Schwann cell) 및 상피세포, 적혈구, 혈소판, 호중구, 림프구, 단핵세포, 호산구, 호염기구세포, 지방세포(adipocytes), 연골세포s, 이자섬 세포, 갑상선 세포, 부갑상선 세포, 귀밑 세포, 종양 세포, 아교 세포, 성상세포, 적혈구 세포, 백혈구 세포, 대식세포, 상피세포, 체세포 세포, 뇌하수체 세포, 부신 세포, 털 세포, 방광 세포, 신장 세포, 망막 세포, 막대 세포, 원뿔 세포, 심장 세포, 박동조율기 세포, 비장 세포, 항원제시 세포, 메모리 세포, T 세포, B 세포, 형질 세포, 근육 세포, 난소 세포, 자궁 세포, 전립선 세포, 질 상피세포, 정자 세포, 고환 세포, 생식 세포, 달걀 세포, 레이디히 세포, 혈관주위 세포, 버팀 세포, 황체 세포, 목 세포, 자궁내막 세포, 유방 세포, 난포 세포, 점액 세포, 섬모 세포, 비케라틴화 상피세포, 케라틴화 상피세포, 폐 세포, 술잔 세포, 원주상피세포, 편평 상피세포, 골세포, 골모세포 및 파골세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
하나의 또 다른 실시형태에 있어서, 배아 줄기 세포가 사용될 수 있다. 배아 줄기 세포주가 사용될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포는 돼지 동물 등의 숙주로부터 새로이 얻어질 수 있다. 이 세포는 적절한 섬유모세포-피더 층상에서 증식되거나 혹은 LIF(leukemia inhibiting factor)의 존재하에 증식될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 세포는 섬유모세포일 수 있고; 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 세포는 태아 섬유모세포일 수 있다.
섬유모세포 세포는 바람직한 체세포 타입이며, 그 이유는 이들이 발생된 태아 및 성체 동물로부터 다량으로 얻어질 수 있기 때문이다. 이들 세포는 신속한 이중 시간으로 시험관내에서 용이하게 전파될 수 있고, 또한, 유전자 표적화 절차에 이용하기 위해 클론화 방식으로 전파될 수 있다.
표적화 구축물
상동 재조합
상동 재조합은 내인성 유전자에 있어서 부위 특이적인 변형을 가능하게 하고, 따라서, 새로운 변화가 유전체 속에 공학적으로 만들어질 수 있다. 상동 재조합에 있어서, 들어오는 DNA는 실질적으로 상동성 DNA 서열을 포함하는 유전자 부위와 상호작용해서 그 부위 속으로 통합된다. 비-상동성("랜덤" 또는 "불법(illicit)") 통합에 있어서, 이 들어오는 DNA는 그 유전체 속의 상동성 서열에서 발견되지 않지만, 다수의 가능한 위치중 1개에 있어서 어디서나 통합된다. 일반적으로, 고등진행 세포를 이용한 연구에 의해, 상동 재조합의 빈도는 랜덤 통합화의 빈도보다 훨씬 적은 것으로 판명되었다. 이들 빈도의 비율은 "유전자 표적화"에 대해서는 직접적 관계를 지니고, 이것은 상동 재조합 (즉, 외인성 "표적화 DNA"와 유전체 중의 대응하는 "표적 DNA"와의 사이의 재조합)을 통한 통합에 의존한다.
다수의 논문이 포유 동물 세포에 있어서의 상동 재조합의 사용을 기재하고 있다. 이들 논문의 예시는 Kucherlapati 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3153- 3157, 1984 ; Kucherlapati 등, Mol. Cell. Bio. 5: 714-720, 1985 ; Smithies et al, Nature 317: 230-234, 1985 ; Wake 등, Mol. Cell. Bio. 8: 2080-2089, 1985 ; Ayares 등, Genetics 111: 375-388, 1985 ; Ayares 등, Mol. Cell. Bio. 7: 1656-1662, 1986 ; Song 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824, 1987 ; Thomas 등, Cell 44: 419-428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell 51: 503-512, 1987 ; Nandi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3845-3849, 1988; 및 Mansour 등, Nature 336: 348-352, 1988; Evans 및 Kaufman, Nature 294: 146-154, 1981; Doetschman 등, Nature 330: 576-578, 1987; Thoma 및 Capecchi, Cell 51: 503-512, 4987; Thompson 등, Cell 56: 316-321, 1989 등을 들 수 있다.
본 발명의 일측면은 세포, 즉, 전술한 세포에 있어서의 알파-1,3-GT 유전자를 불활성화하기 위해 상동 재조합을 이용한다. 이 DNA는 천연의 유전자(들)의 적어도 하나의 카피, 필요에 따라 양쪽의 카피 속에 기능적 알파 l,3GT의 발현을 방지하도록 변화가 도입된 상기 유전자의 적어도 일부를 특정의 유전자 자리에 포함시킬 수 있다. 이 변화는 삽입, 결손, 치환 또는 이들의 조합일 수 있다. 이 변화가 불활성화되어 있는 유전자의 1개의 카피에만 도입된 경우, 표적 유전자의 단일의 비변이 카피를 지닌 세포가 증폭되어, 제 2 표적화 공정에 제공될 수 있고, 이 제 2표적화 공정에 있어서, 사익 변화는 제 1 변화와 동일해도 상이해도 되고, 통상은 다르며, 결실 또는 치환이 관여하는 경우에는, 원래 도입된 변화의 적어도 일부와 중복될 수 있다. 이 제 2표적화 공정에 있어서, 동일한 상보성 아암을 지니거나 다른 포유동물선택 표지자를 포함하는 표적화 벡터가 사용될 수 있다. 얻어진 형질전환체는 기능적 표적 항원의 비존재하에서 스크리닝되고, 그리고 그 세포의 DNA는 야생형 유전자가 존재하지 않는 것을 확인하기 위해 더욱 스크리닝될 수 있다. 혹은 표현형에 관한 동종 접합성이 상기 변이에 대해서 이동 접합성인 숙주를 교배함으로써 달성될 수 있다.
표적화 벡터
세포의 표적화된 유전자 자리의 변형은 그 세포 속에 DNA를 도입함으로써 제작될 수 있고, 그 DNA는 표적 유전자 자리(target locus)에 대한 상동성을 지니고, 표지 유전자를 포함하며, 이것에 의해 조합된 구축물을 포함하는 세포의 선택이 가능해진다. 이 표적 벡터 중의 상동성 DNA는 표적 유전자 자리에 있어서 염색체 DNA와 재조합된다. 이 표지자유전자는 양쪽에서 상동성 DNA 서열, 3'재조합 아암 및 5'재조합 아암과 인접할 수 있다. 표적화 벡터의 구성 방법은 당업자에게 있어서 공지되어 있으며, 예를 들면, Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002 ; WO 00/51424를 참조하면 된다.
각종 구축물은 표적 유전자 자리에서 상동 재조합을 위해 제조될 수 있다.
구축물은 표적 유전자 자리에 의해 적어도 50 bp, 100bp, 500 bp, lkbp, 2 kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp, 또는 50 kbp의 서열 상동성을 포함할 수 있다. 서열은 돼지 알파-1,3-GT 유전자의 임의의 연속 서열을 더 포함할 수 있다(예를 들어, GenBank 등록번호 L36152, The University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education에 의한 W0 01/30992; Alexion,Inc.사에 의한 WO 01/123541 참조).
각종 고려 사항이 표적 DNA 서열의 상동성의 정도를 결정할 때에 관여할 수 있고, 그것은 예를 들어, 표적 유전자 자리의 크기, 서열의 이용가능성, 표적 유전자 자리에 있어서의 더블 크로스오버의 상대적 효율 및 다른 서열과 그 표적 서열과의 유사성이다.
표적화 DNA는 원하는 서열 변형을 포함하는 실질적으로 동일계인 DNA가 개변되어야 할 유전체 중의 대응 표적 서열과 인접하고 있는 서열을 포함할 수 있다. 그 실질적으로 동일 계의 서열은 대응 표적 서열을 적어도 약 95%, 97 내지 98%, 99.0 내지 99.5%, 99.6 내지 99.9% 또는 100% 동일할 수 있다(바람직한 서열 변형을 제외함). 표적화 DNA와 표적 DNA는 100% 동일한 적어도 약 75 염기쌍, 150 염기쌍 혹은 500 염기쌍의 DNA 스트레치(stretch)를 공유할 수 있다. 따라서, 표적화 DNA는 표저고하되는 세포주와 가까운 세포에 유래할 수 있거나; 또는 표적화 DNA는 표적화되는 세포와 동일한 세포주 또는 동물의 세포에 유래할 수 있다.
이 DNA 구축물은 내인성의 표적 알파 1,3GT를 변형시키도록 설계될 수 있다. 그 구축물의 표적화를 위한 상동 서열은 1개 이상의 결손, 삽입, 치환 또는 그의 조합을 지닐 수 있다. 그 변화는 표적 유전자의 상류 서열과 판독 프레임에서 융합한 선택 표지자 유전자의 삽입일 수 있다.
적절한 선택가능한 표지자 유전자로서는 특정 배지기질에 있어서 증식하는 능력을 부여하는 유전자, 예를 들어, tk 유전자(티미딘 키나제) 또는 hprt 유전자(히포크산틴 포스포리보실트랜스페라제)(이것은 HAT 배지(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘)에 있어서 증식하는 능력을 부여함); 세균 gpt 유전자(구아닌/크산틴 포스포리보실트랜스페라제)(이것은 MAX 배지(미코페놀산, 아데닌 및 크산틴)에 있어서 증식을 가능하게 함)를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, Song, K-Y., 등의 Proc. Nat'1 Acad. Sci. U. S. A. 84 : 6820-6824 (1987); Sambrook, J., 등의 Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Chapter 16 등을 참조하면 된다. 선택가능한 표지자의 다른 예로서는 항생제 등이 화합물에 대한 내성을 부여하는 유전자; 선택된 기질에서 증식하는 능력을 부여하는 유전자; 검출가능한 시그널(예를 들어, 발광)을 생성하는 단백질(예를 들어, 녹색 형광단백질, 증강형 녹색 형광단백질(eGFP))을 부호화하는 유전자를 들 수 있다. 광범위한 이러한 표지자는 공지되어 있고 입수가능하다. 그들로서는 예를 들면 네오마이신 내성유전자(neo) 등의 항생제 내성 유전자 (Southern, P. 및 P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341 (1982)); 및 하이그로마이신 내성 유전자(hyg)(Nucleic Acids Research 11:6895-6911 (1983), 및 Te Riele, H. 등의 Nature 348:649-651 (1990)) 등을 들 수 있다. 기타 선택가능한 표지자 유전자로서는 아세톡시하이드록시애시드 신타제(AHAS), 알칼리성 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루코로니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT), 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광단백질(RFP), 황색 형광단백질(YFP), 청색 형광단백질(CFP), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 루시페라제(Luc), 노팔린 신타제(NOS), 옥토핀 신타제(OCS) 및 이들의 유도체를 들 수 있다. 또, 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신 및 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하는 다수의 선택가능한 표지자를 이용할 수 있다.
항생제 내성 유전자 및 음성 선택 인자를 조합하는 방법은 당업자에게 친숙할 것이다(예를 들어, WO 99/15650; 미국 특허 제 6,080,576호; 미국 특허 제 6,136,566호; Niwa 등의 J. Biochem. 113:343-349 (1993); 및 Yoshida 등의 Transgenic Research 4:277-287 (1995)).
선택가능한 표지자의 조합도 사용가능하다. 예를 들어, 표적 알파1,3GT, neo 유전자(전술한 바와 같이 그 자체의 프로모터를 포함하거나 포함하지 않음)가 알파-1,3-GT 유전자에 대해서 상동성인 DNA 서열 중에 클론화 될 수 있다. 표지자의 조합을 사용하기 위해, HSV-tk 유전자는, 이 유전자가 표적화 DNA의 외측에 있도록 클론화될 수 있다(다른 선택가능한 표지자는 바람직한 경우에, 반대쪽에 배치될 수도 있다). 표적화 되어야 할 세포중에 그 DNA 구축물을 도입한 후, 그 세포는 적절한항생제 상에서 선택될 수 있다. 이 특정한 경우에 있어서, G418 및 간시클로비르(gancyclovir)에 대해서 내성이 있는 세포가 neo 유전자가 알파-1,3-GT 유전자 중에 재조합되었거나 tk 유전자가 잃어버린 상동 조합에 의해 생긴 가능성이 가장 높다. 왜나하면, tk 유전자는 이 더블 크로스오버의 영역의 바깥쪽에 위치하였기 때문이다.
결실은 적어도 약 50 bp에서 얻을 수 있고, 더욱 통상은 적어도 약 100 bp, 통상적으로는 약 20 kbp 이하에서 얻을 수 있고, 그 결실은 통상 1개의 엑손의 일부, 1개 이상의 인트론의 일부를 포함하는, 부호화 영역의 적어도 일부를 포함하고, 그리고 인접하는 비부호화 영역(특히, 5' 비부호화 영역(전사조절영역))을 포함해도 포함하지 않아도 된다. 따라서, 그 상동성 영역은 상기 부호화 영역을 넘어서 5' 비부호화 영역 혹은 3'비부호화 영역 중에까지 넓게 얻을 수 있다. 삽입은 일반적으로는 10 kbp를 초과하지 않고, 통상은 5 kbp를 초과하지 않고, 일반적으로는 적어도 50 bp, 더욱 통상은 적어도 200 bp일 수 있다.
상동성의 영역(들)은 돌연변이를 포함할 수 있고, 그 돌연변이는 표적 유전자를 더욱 불활성화시켜, 프레임 시프트를 제공하거나 혹은 중요한 아미노산을 변화시킬 수 있거나, 또는 그 돌연변이는 기능부전 대립 유전자를 교정할 수 있다. 그 돌연변이는 상동성 인접 서열의 미묘한 변화(약 5%를 초과하지 않음)일 수 있다. 유전자의 돌연변이가 요구될 경우, 그 표지자 유전자는 인트론 또는 엑손 중에 삽입될 수 있다.
그 구축물은 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 각종 단편이 함께 취해져서, 적절한 벡터 중에 도입되어, 클론화되고, 분석되고, 그 후, 원하는 구축물이 달성될 때까지 더욱 조작할 수 있다. 각종 변형이 그 서열에 행해져서, 제한분석, 적출, 프로브의 동정 등이 가능하게 될 수 있다. 사일런트 돌연변이가 원할 경우 도입될 수 있다. 각종 단계에 있어서, 제한 분석, 서열 결정, 폴리메라제 연쇄반응에 의한 증폭, 프라이머 복원, 시험관내 변이유발 등이 사용될 수 있다.
그 구축물은 원형생물복제계, 예를 들어 대장균(E. coli)에 의해 인식가능한 기점을 포함하는 세균 벡터를 이용해서 제작될 수 있고, 각 단계에서, 그 구축물은 클론화되어 분석될 수 있다. 삽입을 위해 이용되는 표지자와 동일 또는 상이한 표지자가 사용될 수 있고, 이 표지자는 표적 세포 속에 도입되기 전에 제거될 수 있다. 일단 그 구축물을 포함하는 벡터가 완성되면, 이 벡터는 예를 들어 세균 서열의 결실, 선상화, 상동성 서열 중에서의 짧은 결실의 도입에 의해서 더욱 조작될 수 있다. 최종 조작후, 이 구조물은 세포 속에 도입될 수 있다.
본 발명은 또한 알파-1,3-GT 유전자의 서열을 포함하는 재조합 구축물을 더 포함한다. 이 구축물은 본 발명의 서열이 순방향으로 혹은 역방향으로 삽입되어 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터 등의 벡터를 포함한다. 이 구축물은 또한, 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 다수의 적절한 벡터 및 프로모터는 당업자아ㅔ게 공지되어 있고, 또한 시판되고 있다. 이하의 벡터가 예로서 제공된다. 세균: pBs, pQE-9(Qiagen), phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a(Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia). Eukaryotic: pWLneo, pSv2cat, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPv, pMSG, pSVL(Pharmiacia), 바이러스 기원 벡터(13 벡터, 세균 파지 1 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터), 고, 저 및 조절가능한 카피수의 벡터, 단일 숙주에 있어서 조합시켜 사용하기 위해 적합성 레플리콘을 지닌 벡터(pACYC184 및 pBR322) 및 진핵생물 에피솜 복제 벡터(pCDM8). 기타 벡터로서는 pcDNA II, pSL301, pSE280, pSE380, pSE420, pTrcHisA, B 및 C, pRSET A, B 및 C(Invitrogen, Corp.), pGEMEX-1, 및 pGEMEX-2(Promega, Inc.), the pET vectors(Novagen, Inc.), pTrc99A, pKK223-3, pGEX 벡터, pEZZ18, pRIT2T 및 pMC1871(Pharmacia, Inc.), pKK233-2 및 pKK388-1(Clontech, Inc.), 및 pProEx-HT(Invitrogen, Corp.) 등의 원핵생물발현벡터 및 그들의 변이체 및 유도체 등을 들 수 있다. 기타 벡터로서는 pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL, pSFV 및 pTet-Splice (Invitrogen), pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pBI121, pDR2, pCMVEBNA, and pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, and pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3′SS, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, and pOG44(Stratagene, Inc.), 및 pYES2, pAC360, pBlueBacHis A, B 및 C, pVL1392, pBlueBacIII, pCDM8, pcDNA1, pZeoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4 및 pEBVHis(Invitrogen, Corp.) 등의 진핵생물발현벡터 및 그들의 변이체 및 유도체 등을 들 수 있다. 사용가능한 추가의 벡터로서는 pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, cosmids, phagemids, YAC's(yeast artificial chromosomes), BAC's(bacterial artificial chromosomes), P1(Escherichia coliphage), pQE70, pQE60, pQE9(quagan), pBS 벡터, PhageScript 벡터, BlueScript 벡터, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pcDNA3 (Invitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia), pSPORT1, pSPORT2, pCMVSPORT2.0 및 pSV-SPORT1(Invitrogen), pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBacHis2, pcDNA3.1/His, pcDNA3.1(-)/Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pPICZ, pPICZ□, pGAPZ, pGAPZ□, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SP1), pVgRXR, pcDNA2.1, pYES2, pZErO1.1, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP 10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR3.1-Uni, 및 pCRBac(이상 Invitrogen사 제품); □ ExCell, □ gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1□T, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO, and pUC4K from Pharmacia; pSCREEN-1b(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32LIC, pET-30LIC, pBAC-2cp LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, □SCREEN-1, □BlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET-32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg, and Selecta Vecta-Gpt from Novagen; pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGAD10, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2-Promoter, pSEAP2-Enhancer, p□gal-Basic, p□gal-Control, p□gal-Promoter, p□gal-Enhancer, pCMV□, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRES1neo, pIRES1hyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, □gt10, □gt11, pWE15, and □TriplEx from Clontech; Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-11abcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pMC1neo Poly A, pOG44, pOG45, pFRT□GAL, pNEO□GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415 및 pRS4169(이상 Stratagene사 제품) 및 그들의 변이체 및 유도체 등을 들 수 있다. 예를 들어, pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGAD1-3, pGAD10, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp 및 그들의 변이체 및 유도체 등의 투-하이브리드(Two-hybrid) 및 역 투-하이브리드 벡터도 사용할 수 있다. 기타 임의의 플라스미드 및 벡터가 숙주에 있어서 복제가능하고 또 생존가능한 한에 있어서 사용할 수 있다.
상기 DNA 구축물이 숙주 세포 중에 들어가는 것을 가능하게 하기 위하여 사용가능한 기술로서는, 인산 칼슘/DNA 공침, 핵 속에의 DNA의 현미주입, 전기천공, 고유의 세포의 세균 프로포플라스트 융합, 트랜스펙션, 또는 당업자에게 공지된 다른 임의의 기술을 들 수 있다. 이 DNA는 1본쇄이어도 2본쇄이어도 선상이어도 환상이어도, 이완형이어도 슈퍼코일형상이어도 된다. 포유 동물 세포를 트랜스펙트하기 위한 각종 기술에 대해서는 예를 들어, Keown 등의 Methods in Enzymology Vol. 185, pp. 527-537 (1990)을 참조하면 된다.
하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 이형접합성 녹아웃 세포가 동계의 DNA로부터 단리한 알파-1,3-GT 서열을 포함하는 녹아웃 벡터를 이용해서, 초기의 태아 섬유모세포의 트랜스펙션에 의해 생산될 수 있다. Dai 등(Nature Biotchnology, 20:451-455)에 기재된 바와 같이, 5′아암은 4.9 kb일 수 있고, 인트론 8의 큰 단편과, 엑손 9의 5'말단으로 구성될 수 있다. 3′아암은 엑손 9 서열로 구성될 수 있다. 벡터는 프로머터 포착 전략, 예를 들어 IRES(internal ribosome entry site)를 사용해서 편입시켜, Neor 유전자의 번역을 개시할 수 있다.
상동성 재결합 세포의 선택
다음에, 상기 세포는 적절한 통합체(integration)를 제공하는 세포를 동정하기 위하여, 적절하게 선택된 배지 중에서 증식시킬 수 있다. 알파-1,3-GT 유전자 중에 삽입된 선택 표지자 유전자의 존재는 숙주 아암 유전자 중에의 상기 표적 구축물의 통합을 확립한다. 그 후, 소망하는 표현형을 나타내는 세포가, 상동성 재조합 또는 비상동성 재조합이 생기는 지의 여부를 확립하기 위하여, 제한분석, 전기 영동, 서던 분석, 폴리메라제 연쇄 반응 등에 의해 더욱 분석될 수 있다. 이것은 상기 삽입물의 프로브를 사용하는 것, 그 후, 그 삽입물에 인접하는 5' 영역 및 3' 영역을 상기 구축물의 인접 영역을 초과해서 확대되는 알파-1,3-GT 유전자의 존재에 대해서 서열결정하는 것, 또는 그와 같은 결실이 도입된 경우에는 결실의 존재를 동정함으로써, 결정될 수 있다. 상기 구축물 내의 서열과 상보적이고 또 상기 구축물의 외측 및 표적 유전자 자리에 있는 서열과 상보적인 프라이머도 또 사용될 수 있다. 이와 같이 해서, 상동 재조합이 일어난 경우에는 상보쇄 중에 존재하는 프라미어의 양쪽을 지니는 DNA 2중쇄만을 획득할 수 있다. 상기 프라이머 서열 또는 예측되는 크기의 서열의 존재를 입증함으로써, 상동 재조합의 발생이 지지된다.
상동 재조합 사상을 스크리닝하기 위해 사용되는 폴리메라제 연쇄반응은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Kim and Smithies, Nucleic Acids Res. 16: 8887-8903, 1988 ; 및 Joyner 등, Nature 338 : 153-156, 1989를 참조하면 된다. 변이체 폴리오마 인헨서(mutant polyoma enhancer)와, 네오마이신 유전자를 구동하기 위한 티민 키나제 프로모터와의 특이적 조합은 배아줄기세포 및 EC 세포의 양쪽에 대해서 활성인 것이 Thomas 및 Capecchi, 상기와 동일, 1987; Nicholas 및 Berg (1983) in Teratocarcinoma Stem Cell, Siver, Martin 및 Strikland 편집(Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, N. Y. (pp. 469-497); 및 Linney 및 Donerly, Cell 35: 693-699, 1983에 개시되어 있다.
제 1회의 표적화로부터 얻어지는 세포주는 표적화 대립 유전자에 대해서 이종접합성일 가능성이 있다. 양쪽의 대립 유전자가 변형되어 있는 동종 접합성은 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 1개의 접근법은 1 카피가 변형되어 있는 다수의 세포를 증식시키는 것, 그 후, 이들 세포를 또 1회 상이한 선택가능한 표지자를 사용하는 표적화에 제공하는 것이다. 혹은 동종 접합성은 변형된 대립 유전자에 대해서 이종 접합성인 동물을 전통적 멘델 유전학에 따라서 교배함으로써 획득할 수 있다. 몇가지 상황에 있어서, 2개의 다른 변형 대립 유전자를 지니는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 연속적 혹은 유전자 표적화에 의하거나, 또는 이종 접합체(그 각각이 망하는 변형 대립 유전자중 한쪽을 보유함)를 교배함으로써, 달성될 수 있다.
알파 1,3 GT 유전자 자리에서의 유기된 돌연변이
소정의 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 돌연변이원을 통한 돌연변이의 의도적 도입을 포함한다. 당업계에 있어서 공지되고 본 발명에 있어서 사용하기에 적합한 돌연변이원은 화학적 돌연변이유도물질(예를 들어, N-에틸-N-니트로소우레아(ENU), 에틸렌메탄설포네이트(EMS), 머스타드 가스, ICRl91 등의 DNA-삽입 혹은 DNA-결합용 화학물질; 예를 들어, E. C. Friedberg, G. C. Walker, W. Siede, DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington DC (1995)), 물리적 돌연변이유도물질(예를 들어, UV 방사선, 방사선, x-선), 생화학적 돌연변이유도물질(예를 들어, 제한 효소, DNA 복원 돌연변이원, DNA 복원 저해제, 및 오류빈발 DNA 폴리메라제 및 복제 단백질)뿐만 아니라 전위유전단위 삽입물 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 의하면, 배양시의 세포는 이들 물질중의 하나에 폭로될 수 있고, 세포 포면상의 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스의 결핍에 의해 초래된 소정의 돌연변이가 예를 들어, 독소 A(Toxin A)에의 폭로를 통해 선택될 수 있다.
세포에 있어서의 돌연변이를 유도하기 위한 화학적 돌연변이유도물질의 바람직한 용량은 당업계에 공지되어 있거나, 당업계에 공지된 돌연변이유발의 에세이를 이용해서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 시험관내 세포의 화학적 돌연변이유발은 각종 용량의 돌연변이원에 의해 세포를 처리하고/하거나 상기 물질에의 폭로시간을 조절함으로써 성취될 수 있다. 돌연변이원 폭로 및/또는 용량을 적정함으로써, 의도한 목적을 위해서 최적인 정도의 변이유발을 실행하고, 이것에 의해서 각 표적 세포에 있어서 바람직한 수의 유전자를 변이시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 유용한 ENU 용량은 약 1 내지 2시간에 0.1 내지 0.4 mg/㎖일 수 있다. 다른 예에 있어서, 유용한 EMS 용량은 약 10 내지 30시간에 대해 0.1 내지 1 mg/㎖일 수 있다. 또, 보다 저용량 및 고용량, 및 보다 긴 폭로시간 및 짧은 폭로시간도 바람직한 돌연변이 빈도를 달성하기 위헤 이용될 수 있다.
기능성 알파-1,3- GT 를 발현하지 않는 세포의 동정
일실시형태에 있어서, 선택절차는 기능성 알파 l,3GT의 발현이 결여된 세포를 선택하기 위해, 세균 독소에 의거해서 행할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 세균 독소, 즉 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)에 의해 생성된 독소 A는 그러한 세포 표면 에피토프 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스를 결여한 세포에 대해서 선택하는 데 이용될 수 있다. 클로스트리듐 디피실리 독소에 대한 폭로에 의해서, 이 에포토프를 그 표면상에 발현하는 세포의 구체화(rounding)가 생기고, 플레이트 매트릭스로부터 이들 세포가 유리된다. 효소기능 또는 효소발현을 무능하게 하는 표적화 유전자 녹아웃 및 돌연변이의 양쪽이 이 선택방법을 사용해서 검출될 수 있다. 갈락토오스 알파 1,3-갈락토오스 에피토프의 세포 표면발현을 결여한 세포, 기재되어 있는 독소 A 매개성 선택을 사용해서 동정되는 세포, 또는 유전자 불활성화의 표준적 방법(유전자 표적화를 포함함)을 사용해서 생성되는 세포는, 그 후, 알파 1,3의 유전자의 대립 유전자의 양쪽이 불활성화되는 동물을 생산하는 데 사용될 수 있다.
일실시형태에 있어서, 상기 선택방법은 상동 재조합에 의한 알파 1,3GT 유전자의 표적화 녹아웃에 기인하는지, 비기능적 효소 혹은 비발현 효소를 생기게 하는 유전자 돌연변이에 기인하는지에 따라 알파 1,3GT 에피토프의 결여를 직접 검출할 수 있다. 항생제 내성을 통한 선택은 스크리닝을 위해 가장 일반적으로 이용되고 있다(상기 설명 참조). 이 방법은 표적화 벡터 상에서의 상기 내성 유전자의 존재를 검출하는지의 여부 또는 통합이 표적화 조합사상 또는 랜덤 조합이냐의 여부는 직접적으로 나타나지 않는다. 폴리 A 및 프로모터 포획 기술 등의 특정 기술은 표적화 사상의 확률을 증가시키지만, 이것은 재차 원하는 표현형(세포 표면상의 gal 알파 1,3 gal 에피토프가 결손되어 있는 세포)가 달성된다고 하는 직접의 증거는 제공하지 않는다. 또, 음성 형태의 선택은, 표적화 통합에 대해서 선택하는 데 사용될 수 있고, 이들 경우, 그 세포에 대해서 치사성 인자에 대한 유전자가 유일 표적화 사상만이 그 세포의 죽음을 회피시키는 방식으로 삽입된다. 그 후, 이들 방법에 의해 선택된 세포가 유전자 피괴, 벡터 통합, 그리고 최종적으로는 알파 1,3Gal 에피토프 결여에 대해서 에세이될 수 있다. 이들 경우, 그 선택은 표적화 벡터 통합이 검출되는 것, 및 변화한 표현형은 검출되지 않는 것에 의거해서, 점 돌연변이가 아닌 유일한 표적화 녹아웃, 유전자의 재배치 혹은 유전자 단축, 또는 그외 그러한 변형이 검출될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 선택 수순은 보체 인자와 gal 알파 1,3gal 에피토프에 대한 자연 항체를 포함하는 혈청을 사용해서 수행될 수 있다(예를 들어, Koike 등의 Xenotransplantation 4: 147-153, 1997 참조). 항-Gal 항체를 포함하는 인간 또는 비인간 영장류로부터의 혈청에 대해서 폭로하면, 특이적 항체결합 및 gal 알파 1,3 gal 에피토프를 발현하는 세포에 있어서의 보체 활성화에 의거해서 세포용해가 일어날 수 있다. 따라서, 알파-1,3-GT가 결여된 세포는 산채로 유지되므로 선택될 수 있다.
기능성 알파-1,3-GT의 발현이 결여된 것으로 여겨지는 동물세포는 더욱 특징부여될 수 있다. 이러한 특징부여는 PCR 분석, 서던 블롯(Southern blot) 분석, 노던 블롯(Northern blot) 분석, 특이적 렉틴 결합 에세이 및/또는 서열결정 분석 등을 포함하는(단, 이들로 한정되지 않음) 기술에 의해서 달성될 수 있다.
당해 기술 분야에서 기재되어 있는 바와 같은 PCR 분석(예를 들어, Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 431-455 참조)이 표적화 벡터의 통합을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 증폭 인자(amplimers)는 항생제 내성 유전자를 기원으로서 얻을 수 있고, 그리고, 그 벡터 서열의 바깥쪽에 있는 영역으로 확대될 수 있다. 서던 분석(예를 들어, Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 431-455 참조)도 유전자 자리 중에서의 커다란 변형, 예를 들어, 알파 1,3GT 유전자 자리 속으로의 표적화 벡터의 통합 등을 특징 부여하는 데 이용될 수 있다. 이에 대해서, 노던 분석은 대립유전자의 각각으로부터 생성된 전사물을 특징부여하는 데 이용될 수 있다.
특이적 렉틴 결합은 Griffonia(Bandeiraea) simplicifolia(Vector Labs)으로부터의 GSL IB4 렉틴(이 렉틴은 탄수화물 부분 gal 알파 1,3 gal에 특이적으로 결합함) 및 결합의 FACS(fluorescent antibody cell sorting) 분석에 의해서 알파 1,3 gal 에피토프가 세포 상에 존재하는지의 여부를 결정할 수 있다. 이런 유형의 분석은 그 세포에의 형광 표지된 GSL-IB4 렉틴의 첨가, 그리고 그 후의 세포 선별을 포함한다.
또한, 상기 RNA 전사물로부터 생성되는 cDNA의 서열결정분석도 알파 1,3GT 대립유전자에 있어서의 소정의 돌연변이의 정확한 위치를 결정하는 데 이용될 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽의 대립 유전자가 불활성화된 돼지 등의 살아 있는 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 일실시형태에 있어서, 그 동물은 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽의 대립유전자가 불활성화되어 있는 세포로부터의 제공자 핵을 이용해서 클론화함으로써 생산될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자는 유전자 표적화를 통해 불활성화된다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자는 점 돌연변이의 존재에 의해 불활성화된다. 다른 실시형태에 있어서, 한쪽의 대립유전자는 유전자 표적화에 의해 불활성화되고, 다른 쪽의 대립유전자는 점 돌연변이를 통해 불활성화된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 한쪽의 대립유전자는 유전자 표적화에 의해 불활성화되고 다른 쪽의 대립유전자는 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 점 돌연변이의 존재에 의해 불활성화된다. 특정 실시형태에 있어서, 한쪽 대립유전자는 엑손 9로 지향하는 표적화 구축물을 통해 불활성화되고, 다른 쪽 대립유전자는 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 점 돌연변이의 존재에 의해 불활성화된다. 다른 실시형태에 있어서, 이러한 동물, 예를 들어, 돼지를 클론화하는 방법은 난모세포를 제핵(핵 적출)하고, 그 난모세포를 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립 유전자가 불활화된 세포로부터의 제공자 핵을 융합시키고, 핵 이입(nuclear transfer)에 의해 유래된 배아를 대리모에 이식하는 것을 포함한다.
대안적으로는, 이어서 자손을 생산하는 데 사용될 수 있는 줄기 세포에 있어서의 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립 유전자를 불활화시킴으로써 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여된 살아있는 동물을 생산하기 위한 방법이 제공된다.
유전자 변환된 동물은 직접 접합자를 변환시킴으로써 만들어질 수 있다. 포유 동물에 관해서는, 그 변화된 접합자는 이어서 그 동물을 임신시킬 수 있는 유사임신 암컷의 자궁 속에 도입될 수 있다. 예를 들어, 알파-1,3-GT 유전자를 결여한 완전한 동물을 원할 경우, 그 동물로부터 유래하는 배아줄기세포는 포적화될 수 있고, 이어서 변환된 세포를 키메라 동물 속에 성장시키기 위해 포배에 도입시킬 수 있다. 배아 줄기 세포에 관해서는, 배아 줄기 세포주 또는 새로이 얻어진 줄기 세포가 사용될 수 있다.
본 발명의 적절한 실시형태에 있어서, 분화전능성 세포(totipotent cell)는 배아 줄기(ES) 세포이다. 포배로부터의 ES 세포의 단리, ES 세포주의 확립 및 그들의 후속 배양은 예를 들어, Doetchmann 등의 J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-45 (1985); Li 등, Cell 69: 915-926 (1992); Robertson, E. J."Tetracarcinomas and Embryonic Stem Cells: APractical Approach" E. J. Robertson 편집, IRL Press, Oxford, England (1987); Wurst and Joyner, "Gene 표적화: A Practical Approach" A. L. Joyner 편집, IRL Press, Oxford, England (1993); Hogen 등, "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual" Hogan, Beddington, Costantini 및 Lacy 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1994); 및 Wang 등의 Nature 336: 741-744 (1992)에 기재된 바와 같은 종래의 방법에 의해서 행해진다. 본 발명의 다른 적절한 실시형태에 있어서, 분화전능성 세포는 are 배아 생식(EG) 세포이다. 배아 생식 세포는 ES 세포에 대해서 기능적으로 동등한(즉, 이들은 시험관내에서 배양 및 트랜스펙트될 수 있고, 이어서, 키메라의 체세포게열 및 생식세포게열에 기여함) 미분화 세포이다.(Stewart 등, Dev. Biol. 161: 626-628 (1994)). EG 세포는 증식 인자 : 백혈병저해인자, 스틸 팩터(steel factor) 및 염기성 섬유모세포 증식 인자를 조합시킨 원시 생식 세포, 그 배우자의 선조의 배양에 의해서 유도된다(Matsui 등의 Cell 70: 841-847 (1992); Resnick 등의 Nature 359: 550-551 (1992)). EG 세포의 배양은 Donovan 등의 문헌 "Transgenic Animals, Generation and Use" L. M. Houdebine 편집, Harwood Academic Publishers (1997) 및 그 안에 인용되어 있는 본래의 문헌에 있어서 기재된 방법을 사용해서 실행될 수 있다.
본 발명에 있어서 사용하기 위한 네배수체 포배는 천연의 배우자 생성 및 발생에 의해서, 또는 2개 세포 배아의 전기 융합에 의해서 얻어진 후, 예를 들어, James 등의 Genet. Res. Camb. 60: 185-194 (1992); Nagy and Rossant, "Gene targetting: A Practical Approach, "ed. A. L. Joyner, IRL Press, Oxford, England (1993); Kubiak 및 Tarkowski의 Exp. Cell Res. 157: 561- 566 (1985)에 기재된 바와 같이 배양될 수 있다.
포배에의 ES 세포 또는 EG 세포의 도입은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해서 행할 수 있다. 본 발명의 목적에 적합한 방법은 Wang 등의 EMBO J. 10: 2437-2450 (1991)에 기재된 현미주사법이다.
대안적으로는, 변형된 배아 줄기 세포에 의해서 트랜스제닉 동물이 생산될 수 있다. 그 유전자 변형 배아 줄기 세포는 포배 내에 주입될 수 있고, 이어서, 통상의 기술에 따라 암컷 숙주 포유 동물에 임신된다.
이종 접합형 자손은 이어서 PCR 또는 서던 블롯팅과 같은 기술을 사용해서, 표적 유전자 자리의 부위에 있어서의 변화의 존재에 대해서 스크리닝될 수 있다. 마찬가지 종의 야생형 숙주와 교배한 후에, 얻어진 키메라 자손을 이어서 동종 접합성 숙주를 달성하기 위해 교변시킬 수 있다.
배아 줄기 세포를 표적화 벡터로 형질전환해서, 알파-1,3-GT 유전자를 변화시킨 후에, 그 세포를 적절한 배지, 예를 들어, 태아 소 혈청으로 강화한 DMEM 중의 피더층 상에 배치할 수 있다. 그 구축물을 함유하는 세포를 선택 배지를 사용함으로써 콜로니가 증식하기에 충분한 시간 후에 검출할 수 있고, 콜로니는 추출해서 상동 재조합의 존재에 대해서 분석될 수 있다. 구축물 서열 내 및 구출물 서열 외이지만 표적 유전자 자리에 있는 프라이머를 이용해서 폴리메라제 연쇄반응을 사용할 수 있다. 상동 재조합을 보이는 이들 콜로니를 이어서 배아 조작 및 포배 주입을 위해 사용할 수 있다. 포배는 과잉배란된 암컷으로부터 얻을 수 있다. 배아 줄기 세포는 이어서 트립신처리될 수 있고, 그 변형된 세포를, 포배를 함유하는 소적으로 첨가해서 얻을 수 있다. 변형된 배아 줄기 세포 중의 적어도 하나는 포배의 포배강에 주입될 수 있다. 주입 후, 적어도 하나의 포배를 의사임신 암컷의 각각의 자궁뿔에 복귀시킬 수 있다. 이어서, 이 암컷을 출산까지 경과시켜, 얻어진 새끼를, 그 구축물을 지닌 돌연변이 세포에 대해서 스크리닝한다. 포배는 형질 전환된 ES 세포와는 다른 혈통에 대해서 선택된다. 포배 및 ES 세포의 상이한 표현형을 제공함으로써, 키메라 자손을 용이하게 검출할 수 있고, 이어서, 유전자형 결정을 행하여 변형된 알파-1,3-GT 유전자의 존재에 대해서 프로브할 수 있다.
클로닝된 트랜스제닉 자손을 생산하기 위한 체세포 핵 이입
본 발명은 체세포 핵 이입을 통해 기능성 알파-1,3-GT 유전자를 결여한 돼지 등의 동물을 클로닝하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 동물은 이하의 공정을 포함하는 핵 이입 프로세스에 의해 생산될 수 있다: 제공자 핵의 공급원으로서 사용될 소망의 분화된 세포를 얻는 공정; 이 동물로부터 난모세포를 얻는 공정; 상기 난모세포를 제핵하는 공정; 그 소망의 분화한 세포 또는 세포핵을 예를 들어, 융합 또는 주입에 의해서 그 제핵한 난모세포에 이입해서 NT 단위를 형성하는 공정; 얻어진 NT 단위를 활성화시키는 공정; 및 상기 배양된 NT 단위를 숙주 동물에 이입시킴으로써, 그 NT 단위를 태아에 발생시키는 공정.
핵 이입 기술 또는 핵 번역 기술은 당업게에 있어서 공지되어 있다(Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 251-255; Polejaeva 등의 Nature 407: 86-90 (2000); Campbell 등의 Theriogenology, 43: 181 (1995); Collas 등의 Mol. Report Dev. , 38: 264-267 (1994); Keefer 등의 Biol. Reprod. , 50: 935-939 (1994); Sims 등의 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274 및 WO 90/03432, 미국 특허 제 4, 944,384호 및 제 5,057,420호 공보 참조).
알파-1,3-GT 유전자를 변화시키기 위해 변형된 제공자 세포핵은 수용자 난모세포로 이동된다. 이 방법의 사용은 특정 제공자 세포형에 제한되지 않는다. 제공자 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 얻을 수 있고, 예를 들어, Wilmut 등의 Nature 385810 (1997); Campbell 등의 Nature 380 64-66 (1996); Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002 ; 또는 Cibelli 등의 Science 280 1256-1258 (1998)를 참조하면 된다. 핵 이입에 있어서 성공적으로 사용될 수 있는 배아, 태아 및 성체 체세포를 포함하는 정상 핵형의 세포는 모두 이용가능하다. 태아 섬유모세포는 제공자 세포의 특히 유용한 부류이다. 일반적으로 핵 이입의 적절한 방법은 Campbell 등의 Theriogenology 43 181 (1995), Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 251-255, Polejaeva 등의 Nature 407:86-90 (2000), Collas 등의 Mol. Reprod. Dev. 38 264-267 (1994), Keefer 등의 Biol. Reprod. 50 935-939 (1994), Sims 등의Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 90 6143-6147 (1993), WO-A-9426884, WO-A-9424274, WO-A-9807841, WO-A-9003432, 미국 특허 제 4,994,384호 및 미국 특허 제 5,057,420호에 기재되어 있다. 분화된 또는 적어도 부분적으로 분화된 제공자 세포도 사용될 수 있다. 제공자 세포 배양될 수 있지만, 반드시 배양되지 않아도 되고, 휴지형일 수도 있다. 휴지기에 있는 핵 제공자 세포는 휴지기에 들어가도록 유도될 수 있거나 또는 생체내에서 휴지상태로 존재하는 세포이다. 종래 기술의 방법은 또한 클로닝 수순에 있어서 배아 세포를 사용하였다(Campbell 등의 (Nature, 380: 64-68, 1996) 및 Stice 등의 (Biol. Reprod., 20 54: 100-110, 1996).
체세포 핵 제공자 세포는 피부, 중간엽, 폐, 췌장, 심장, 창자, 위, 방광, 혈관, 신장, 자궁, 생식 기관 등의 각종 기관 및 조직(단, 이들로 한정되지 않음), 및 배아, 태아 혹은 성체 동물의 전부 또는 일부의 분해제조물로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 적합한 실시형태에 있어서, 핵 제공자 세포는 상피 세포, 섬유모세포, 신경 세포, 각질형성세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 림프구(B 및 T), 대식세포, 단핵세포, 단핵 세포, 심근세포, 기타 근육 세포, 과립층세포, 난구 세포, 표피 세포 또는 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에 있어서, 핵 제공자 세포는 배아 줄기 세포이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 섬유모세포는 제공자 세포로서 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 핵 제공자 세포는 동물의 생식 세포이다. 배아, 태아, 또는 성체 단계에 있어서의 동물종의 임의의 생식세포가 핵 제공자 세포로서 사용될 수 있다. 적절한 실시형태에 있어서, 핵 제공자 세포는 배아 생식 세포이다.
핵 제공자 세포는 억셉터 세포와의 협조를 확실하게 하기 위하여, 세포주기G0, G1, G2, S, M)의 어느 상에 있어서 정지될 수 있다. 당해 기술분야에서 공지된 어느 방법이라도, 그 세포주기단계를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 세포주기단계를 제어하는 방법으로서는, 배양 세포의 접촉저해에 의해서 유도되는 GO 휴지, 혈청 또는 다른 필수 영양소의 제거에 의해서 유도되는 GO 휴지, 노화에 의해서 유도되는 GO 휴지, 특정의 증식인자의 첨가에 의해서 유도되는 GO 휴지; 물리적 또는 화학적 수단(예를 들어, 열충격, 고비중압(hyperbaric pressure), 또는 기타 화학물질, 호르몬, 증식인자 혹은 다른 물질의 위치에 의해서 유도되는 GO 또는 G1 휴지; 복제 수순의 소정의 점을 방해하는 화학약제에 의한 처치를 통한 S기 제어; 형광 활성 세포 선별, 유계분열시키는 것(mitotic shake off), 미소관 파괴제 또는 유계분열의 진행을 혼란시키는 임의의 화학물질에서의 처리(Freshney, R. I, ."Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, "Alan R. Liss, Inc, New York (1983)도 참조)를 사용하는 선택을 통해서 M기 제어를 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
난모세포의 단리 방법은 당업계에 있어서 충분히 공지되어 있다. 중요하게는, 이것은 동물의 난소 혹은 재생성 관으로부터 난모세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 난모세포의 용이하게 입수가능한 공급원은 도축장 재료이다. 유전공학, 핵 이입 및 클로닝 등의 기술을 조합하기 위해, 난모세포는 일반적으로 이들 세포가 핵 이입을 위한 수용자로서 사용될 수 있기 전, 그리고 이들이 정자 세포에 의해 수정되어 배아로 발전될 수 있기 전에 시험관 내에서 성숙되어야만 한다. 이 과정은 일반적으로 포유 동물 난소, 예를 들어, 도축장에서 얻어진 소 난소로부터 미숙아 (I차 전기) 난모세포를 회수하고, 수정 전의 변이 배지에서 난모세포를 숙성시키거나, 난모세포가 중기 II 단계에 도달할 때까지 제핵을 행하는 것을 필요로 하고, 이것은 소 난모세포의 경우, 일반적으로 흡인 후 약 18 내지 24 시간에 일어난다. 이 기간은 "돌연변이기간"으로서 알려져 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 난모세포는 처녀 암퇘지(gilt)로부터 얻어진다. "처녀 암퇘지"는 자손을 가져본 적이 없는 암퇘지이다. 다른 실시형태에 있어서, 난모세포는 성숙한 암퇘지로부터 얻어진다. "성숙한 암퇘지"란 이미 자손을 생산해본 암퇘지이다.
중기 II 단계의 난모세포는 수용자 난모세포일 수 있고, 이 단계에서, 난모세포는 정자가 그대로 수정되도록 도입된 핵을 처리하기 위해 충분히 "활성화"되어 있거나 되어있을 수 있다. 생체내에서 성숙되어 있는 중기 II 단계의 난모세포는, 핵 이입 기술에 있어서 성공적으로 사용되어왔다. 중요하게는, 성숙한 중기 II 단계의 난모세포는 발정기의 개시 혹은 인간 융모생식샘자극호르몬(hCG) 또는 유사한 호르몬의 주입 후 35 내지 48 시간, 혹은 39 내지 41 시간에 비과잉배란된 또는 과잉 배란된 동물로부터 수술기법으로 회수할 수 있다. 난모세포는 히알루로다제 용액 등의 적절한 매질 중에 놓일 수 있다.
약 10 내지 40 시간, 약 16 내지 18 시간, 약 40 내지 42시간 또는 약 39 내지 41시간의 일정 시간의 성숙 기간 후에, 난모세포는 제핵될 수 있다. 제핵 전에, 난모세포는 제거되어, 난구 세포의 제거 전에 히알루오니다제 1mm당 1 ㎎을 함유하는 HECM 등의 적절한 매질에 놓일 수 있다. 이어서, 박리된 난모세포는 극체(polar body)에 대해 스크리닝을 실시할 수 있고, 다음에, 극체의 존재에 의해 결정된 바와 같은 선택된 중기 II 단계의 난모세포는 핵 이입에 이용될 수 있다. 제핵은 다음과 같이 행한다.
제핵은 미국 특허 제 4,994,384호 공보에 기재된 바와 같은 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 중기 II 단계의 난모세포는 즉석의 제핵을 위해서 사이토칼라신 B 1 mm당 7.5 ㎎을 임의로 함유하는 HECM에 놓일 수 있거나, 또는, 적절한 배지, 예를 들어 CRlaa 등의 배아 배양 배지 + 10% 발정기 소 혈청에 놓일 수 있고, 이어서, 바람직하게는 24시간 이내에 더욱 바람직하게는 16 내지 18 시간 후에 적출될 수 있다.
제핵은 극체 및 인접한 세포질을 제거하기 위해 마이크로피펫을 이용해서 미소수술방식으로 수행될 수 있다. 이어서, 난모세포는 성공적으로 제핵된 것을 동정하기 위해 스크리닝할 수 있다. 난모세포를 스크리닝하는 한가지 방법은 HECM 중 33342 Hoechst 색소 1 ㎖당 1 ㎎에 의해 난모세포를 염색하고, 이어서, 10초 이내에 자외선 조사하에 난모세포를 관찰하는 것이다. 성공적으로 제핵된 난모세포는 이어서 적절한 배양 배지, 예를 들어, CRlaa + 10% 혈청 중에 놓일 수 있다.
이어서, 제핵 난모세포와 동종의 단일 포유 동물 세포는 NT 단위를 생산하는 데 사용되는 제핵 난모세포의 난황 주위공간 속으로 이식될 수 있다.
포유 동물 세포 및 제핵 난모세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 NT 유닛을 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 세포는 전기 융합에 의해 융합될 수 있다.
전기 융합은 원형질막의 과도 파괴를 일으키는 데 충분한 전기 펄스를 제공함으로써 달성된다. 이 원형질막의 파괴는 해당 막이 신속하게 재생되기 때문에 매우 짧다. 따라서, 인접한 두 막이 파괴되면, 재생시 지질 이중층이 사이에 혼입되어, 작은 통로가 이들 두 세포 사이에 개구될 수 있다. 이러한 작은 개구의 열역학적 불안정성으로 인해, 두 세포가 하나로 될 때까지 확대된다. 이것은 예를 들어, Prather 등에 의한 미국 특허 제 4,997,384호를 참조하면 된다. 각종 전기 융합 매질은 예를 들어, 슈크로오스, 만니톨, 소르비톨 및 인산 완충 용액을 포함하는 것을 사용할 수 있다. 융합은 또한 융합 생성제로서 센다이 바이러스를 이용해서 달성될 수 있다(Graham, Wister Inot. Symp. Monogr., 9,19, 1969). 또, 핵은 전기 천공 융합을 이용하는 것보다는 오히려 난모세포에 직접 주입할 수 있다. 이것은 예를 들어, Collas and Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38: 264-267 (1994)를 참조하면 된다. 융합후, 얻어진 융합 NT 단위를 활성화될 때까지 적절한 배지, 예를 들어, CRlaa 배지에 둔다. 전형적으로 활성화는 그후 짧은 시간, 예를 들어 24 시간 미만 후, 약 4 내지 9시간 후, 또는 최적으로는 1 내지 2시간 융합후 행할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 활성화는 융합전 적어도 1시간, 변이후 40 내지 41시간에 일어난다.
NT 단위는 공지의 방법에 의해 활성화될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 하고, 차가운, 또는 실제로는 냉온 충격을 NT 단위에 가함으로써 서브-생리적 온도에서 NT 단위를 배양하는 것을 포함한다. 이것은 배아가 정상적으로 폭로되는 생리적 온도 조건에 대해서 차가운 실온에서 NT 단위를 배양함으로써 가장 편리하게 행할 수 있다. 대안적으로는, 활성화는 공지의 활성화제의 적용에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 수정 동안 정자에 의한 난모 세포의 침투는 프로퓨젼 난모세포를 활성화시켜 핵 이입 후 더욱 많은 수의 생존가능한 임신개체 및 다수의 유전적으로 동일한 장딴지를 얻는 것을 나타내었다.
또한, 전기 및 화학적 충견 등의 처리는 융합 후의 NT 배아를 활성화하는 데 이용될 수 있다. 이것에 대해서는, 예를 들어, Susko-Parrish 등에 의한 미국 특허 제 5,496,720호를 참조하면 된다. 융합 및 활성화는 각각 ECM2001 Electrocell Manipulato(BTX Inc., San Diego, CA)를 이용해서 5V의 AC 펄스를 5초간 인가 후 1.5 kV/cm의 두 DC 펄스를 60 μs 인가해서 유도할 수 있다. 또한, 활성화는 난모세포에 있어서의 2가 양이온의 레벨을 증가시키고 난모세포에 있어서의 세포형 단백질의 인산화를 환원함으로써 동시에 혹은 차례로 수행될 수 있다. 이것은 일반적으로는 난모세포 세포질에 2가의 양이온, 예를 들어, 마그네슘, 스트론튬, 바륨 혹은 칼슘을 예를 들어, 이온운반체의 형태로 도입함으로써 수행될 수 있다. 2가 이온 레벨을 증가시키는 다른 방법은 전기 충격, 에탄올에 의한 처리 및 케이지화된 킬레이트제에 의한 처리르 포함한다. 인산화는 공지의 방법, 예를 들어, 예를 들어, 6-디메틸-아미노퓨린, 디메틸-아미노퓨린, 스타우로스포린, 2-아미노퓨린 및 스피고신 등의 세린-트레오닌 키나제 저해제와 같은 키나제 저해제의 첨가에 의해 환원될 수 있다. 대안적으로는, 세포형 단백질의 인산화는 예를 들어, 포스파타제 2A 및 포스파타제 2B 등의 포스파타제를 난모세포 속에 도입함으로써 저해될 수 있다.
다음에, 활성화된 NT 단위 또는 "융합된 배아"는 세포 콜로니의 생성때까지 적절한 시험관내 배지에서 배양될 수 있다. 배아의 배양 및 변이에 적합한 배양 배지는 당업계에 공지되어 있다. 배아 배양 및 유지에 이용될 수 있는 공지의 배지의 예로서는, Ham's F-10 + 10% 소태아혈청(FCS), 조직 배양배지(CultureMedium0-199(TCM-199) + 10% 소태아혈청, 티로데스-알부민-락테이트-피루베이트(TALP), Dulbecco's 인산염 완충 식염수(PBS), Eagle's 및 Whitten's 배지 등을 포함하고, 구체적인 에에 있어서, 활성화된 NT 단위는 5% C02의 습윤 분위기 중, 대략 38.6 ℃에서 약 1 내지 4시간 NCSU-23 배지에서 배양될 수 있다.
그 후, 배양된 NT 단위 또는 단위들은 세정되고, 이어서, 바람직하게는, 적절한 융합성 피더층(confluent feeder layer)을 포함하는 웰 플레이트에 수용된 적절한 배지에 놓일 수 있다.
적절한 피더 층은 예를 들면 섬유모세포 및 상피세포를 포함한다. NT 단위는 해당 NT 단위가 용자인 암컷에 대해 전이되기 위해 또는 세포 콜로니를 생산하는 데 이용될 수 있는 세포를 얻기 위해 적절한 크기에 이를 때까지 피더 층상에서 배양된다.
바람직하게는, 이들T 단위는 적어도 약 2 내지 400개의 세포, 약 4 내지 128개의 세포 또는 적어도 약 50개의 세포가 될 때까지 배양될 수 있다.
다음에 활성화된 NT 단위는 암컷 돼지의 난관에 이식(배아 이식)될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 암컷 돼지는 발정기-동기화된 수용자인 젊은 암퇘지일 수 있다. 교차번식된 젊은 암퇘지(large white/Duroc/Landrace)(280-400 lbs)가 이용될 수 있다. 젊은 암퇘지는 급식에 혼합된 18-20 mg Regu-Mate(Altrenogest, Hoechst, Warren, NJ)의 경구 투여에 의해 수용자 동물과 동기화될 수 있다. Regu-Mate는 14일간 연속적으로 공급될 수 있다. 다음에, 일천 단위의 인간 융모생식샘자극호르몬(hCG,Intervet America, Millsboro, DE)은 최종 Regu-Mate 처리 이후 약 105시간 후에 근육내(i.m.) 투여될 수 있다. 이어서, 배아이식은 hCG 주입 이후 약 22 내지 26시간 후에 수행될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 임신은 기간을 유지하여 살아 있는 자손의 탄생을 초래할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 임신은 초기에 종결될 수 있고, 배아 세포는 수확될 수 있다.
소망의 동종 접합성 녹아웃 동물의 교배
다른 측면에 있어서, 본 발명은 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여된 생존가능한 동물이 알파-1,3-GT 유전자에 대한 수컷 이종 접합형을 알파-1,3-GT 유전자에 대한 암컷 이종 접합형과 교배함으로써 생산되는 방법을 제공한다. 일실시형태에 있어서, 동물들은 알파-1,3-GT 유전자의 한쪽 대립유전자의 발현을 방지하도록 그 대립 유전자의 유전자 변형에 의한 이종 접합형이다. 다른 실시형태에 있어서, 동물은 알파-1,3-GT 유전자의 한쪽 대립 유전자에 있어서 점 돌연변이에 의한 이종 접합형이다. 다른 실시형태에 있어서, 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자의 엑소 9의 제 2염기에서의 T → G 점 돌연변이일 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 기능성 알파-1,3-GT의 어떠한 발현도 결여된 동물을 생산하는 방법은, 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이를 포함하는 수컷 돼지를 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 점 돌연변이를 포함하는 암컷 돼지와 교배하는 것을 제공한다.
한쪽의 대립유전자는 엑손 9에 대한 표적화 구축물을 통해 불활성화되어 있고, 다른 쪽 대립유전자가 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이의 존재에 의해 불활성화되어 있는 동물로부터의 조직이 제공된다
일실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 우전자에 있어서의 더블 녹아웃을 보유한 제공자 세포로부터의 핵 이입에 의해 생산된 성적으로 성숙된 동물은 교배될 수 있고, 그들의 자손은 동종 접합성 녹아웃에 대해 시험될 수 있다. 이들 동종 접합성 녹아웃 동물은 이어서 더욱 동물을 생산하기 위해 교배될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 성적으로 성숙한 더블 녹아웃 동물로부터의 난모세포는 두 종의 유전적으로 분화된 돼지 라인으로부터 야생형 정자를 이용해서 수정시키고, 배아는 적절한 대용체 속으로 이식될 수 있다. 이들 교배로부터의 자손들은 녹아웃의 존재에 대해 시험될 수 있고, 예를 들어, 이들은 cDNA 서열결정, PCR, 독소 A 감수성 및/또는 렉틴 결합에 의해 시험될 수 있다. 이어서, 성적 성숙기에, 각 이들 새끼로부터의 동물이 교배될 수 있다.
본 발명의 이 측면에 의한 소정의 방법에 있어서, 임신은 초기에 종결될 수 있어, 섬유모세포는 단리되어, 더욱 표현형적으로 및/또는 유전자형적으로 특정화될 수 있다. 다음에, 알파-1,3-GT 유전자의 발현을 결여한 섬유모세포는 본 명세서에 기재된 방법(Dai 등의 문헌도 참조)에 따라 핵 이입에 사용되어, 다중 임신 개체 및 소망의 더블 녹아웃을 보유한 자손을 생산할 수 있다.
III. 유전자 변형 동물의 종류/추가의 유전자 변형
본 발명의 일측면에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립유전자가 유전자 표적화 사상을 통해서 불활성화되어 있는 동물이 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립유전자가 유전자 표적화 사상을 통해서 불활성화되어 있는 돼지동물이 제공된다. 일실시형태에 있어서, 유전자는 상동 재조합을 통해서 표적화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 유전자는 파괴될 수 있고, 즉, 유전 부호의 일부가 변화됨으로써, 유전자의 그 세그먼트의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유전자의 파괴는 치환, 결손("녹아웃") 또는 삽입("녹인") 기술을 통해서 일어날 수 있다. 기존 서열의 전사를 조절하는 소망의 단백질 또는 조절 서열의 추가의 유전자가 삽입될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자는 적어도 하나의 점 돌연변이를 통해 불활성화될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립유전자는 적어도 하나의 점 돌연변이를 통해 불활성화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자는 적어도 하나의 점 돌연변이를 통해 불활성화될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 이 점 돌연변이는 유전자 표적화를 통해 일어날 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 이 점 돌연변이는 자연적으로 일어날 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이일 수 있다(도 1). 알파-1,3-GT 유전자에서의 자연적으로 일어나는 점 돌연변이를 보유한 돼지는 항생제-내성 유전자가 없는 알파 1,3GT-결핍 돼지의 생산을 허용하고, 이에 따라, 사람에게 이용하기 위한 안전한 제품을 만들 수 있는 잠재성을 지닌다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10 또는 적어도 20개의 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자에 불활성화를 부여하도록 존재할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 기능성 알파 l,3GT의 어떠한 발현도 방지하는 점 돌연변이를 함유하는 돼지가 제공된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 돼지는 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자에 있어서의 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 돌연변이(도 1)를 포함하는 돼지가 제공된다.
본 발명의 다른 측면은 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 모두 불활성화되고, 이에 따라 한쪽의 대립유전자는 유전자 표적화에 의해 불활성화되고, 다른 쪽의 대립유전자는 자연적으로 일어나는 점 돌연변이를 통해 불활성화되어 있는 동물을 제공한다. 일실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 모두 불활성화되고, 이에 따라 한쪽의 대립유전자는 유전자 표적화에 의해 불활성화되고, 다른 쪽의 대립유전자는 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 점 돌연변이의 존재에 의해 불활성화되어 있는 돼지동물이 제공된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 알파-1,3-GT 유전자의 양쪽 대립유전자가 모두 불활성화되고, 이에 따라 한쪽의 대립유전자는 엑손 9에 대한 표적화 구축(도 6)을 통해 불활성화되고, 다른 쪽의 대립유전자는 엑손 9의 제 2 염기에서의 T → G 점 돌연변이의 존재에 의해 불활성화되어 있는 돼지동물이 제공된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 조직은 추가의 유전 변형을 포함할 수 있는 알파-1,3-GT 유전자의 어떠한 기능적 발현도 결여된 동물로부터 얻어질 수 있다. 이러한 유전자 변형은 거부를 방지하고, 상처치유를 촉진하고/하거나, 원치 않는 병원체(프리온 또는 레트로바이러스 등)를 최소화하거나 제거하도록 다른 유전자의 부가 및/또는 결손을 포함할 수 있다.
PERV란 주된 3 부류가 날짜로 식별되어 있는 레트로바이러스과(family)를 의미한다: PERV-A(Genbank 등록 번호 AF038601), PERV-B (EMBL 등록 번호 PERY17013) 및 PERV-C (Genbank 등록 번호 AF038600)(Patience 등 1997, Akiyoshi 등 1998). PERV-A, B 및 C의 gag 및 pol 유전자는 고도로 상동성이고, 이것은 상이한 종류의 PERV(예를 들어, PERV-A, PERV-B, PERV-C) 간에 다른 env 유전자이다. PERV-D는 또한 최근 동정되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,261,806호 참조).
본 발명의 하나에 있어서, 돼지 내인성 레트로바이러스레트로바이러스(PERV) 유전자는 발현 간섭 RNA 분자(iRNA)에 의해 조정될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2개의 iRNA 분자가 PERV 바이러스의 발현이 결손 레벨 이하 또는 기능적으로 제거되도록 사용될 수 있다(예를 들어, USSN 60/523,938 참조). 또 다른 실시형태에 있어서, 이것으로 제한되지는 않지만 PRRS(pig respiratory and reproductive syndrome) 바이러스를 포함하는 기타 바이러스는 상동 재조합을 개재하거나, 또는 저해성 RNA(RNAi) 접근법을 이용해서 불활성화 또는 하향 조절된다. RNAi를 이용한 하향 조절의 경우에 있어서, 작은 저해성 RNA를 부호화하는 유전자 서열은 트랜스젠(transgene)으로서 발현되어, 미세 주입, ICSI, 핵 이입을 통하거나 또는 정자 매개 유전자 이식을 이용해서 돼지 속으로 도입된다.
다른 실시형태에 있어서, 이종이식편 거부를 담당하는 부가의 유전자의 발현은 제거 또는 감소될 수 있다. 이러한 유전자는 CMP-NEUAc 히드록실라제 유전자, 이소글로보사이드 3 신타제 유전자 및 Forssman 신타제 유전자 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 보체 매개 용해의 억제를 담당하는 보체 관련 단백질을 부호화하는 유전자 또는 cDNA도 본 발명의 동물 및 조직에 있어서 발현될 수 있다. 이러한 유전자는 CD59, DAF, MCP 및 CD46을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(예를 들어, WO 99/53042; CD59/DAF 트랜스젠을 발현하는 돼지를 개시한 Chen 등의 Xenotransplantation, Volume 6 Issue 3 Page 194-August 1999; 인간 CD59 및 H-트랜스페라제를 발현하는 트랜스제닉 돼지를 개시한 Costa C 등의 Xenotransplantation. 2002 Jan; 9 (1): 45-57; 인간 CD46 트랜스제닉 돼지를 개시한 Zhao L 등; Diamond LE 등, Transplantation. 2001 Jan 15; 71 (1): 132-42).
부가의 변형은 "Anticoagulant fusion protein anchored to cell membrane"라는 명칭하에 WO 98/42850 및 미국 특허 제 6,423,316호에 개시된 바와 같은 조직 인자경로 저해제(TFPI). 헤파린, 항트롬빈, 히루딘, TFPI, 두꺼운 항응고성 펩타이드, 또는 뱀 독 인자; 또는 "Suppression of xenograft rejection by down regulation of a cell adhesion molecules"라는 명칭하에 WO 00/31126에 기재된 바와 같은 세포에 의해 세포 부착 분자의 발현을 하향 조절하는 항체 등의 화합물 및 예를 들어, "Immunosuppression by blocking T cell co-stimulation signal 2 (B7/CD28 interaction)"라는 명칭하에 출원된 국제 특허 공개공보 WO 99/57266호에 기재된 바와 같이 이종발생성 제공자 유기체로부터의 CTLA-4의 가용 형태의 기관 수용자에게 투여하는 것과 같이 시그널 3에 의한 공자극이 방지되는 화합물 등을 포함할 수 있다.
도 1은 태아 680B1-4로부터의 세포에 대한 보체의 상대적 용해 효과를 표시한 그래프.
도 2는 독소 A에 의해 선택된 점 돌연변이가 발생하는 알파-1,3-GT 유전자 (GenBank 등록 번호 L36152 참조)의 부호화 영역의 짧은 분절을 도시한 도면으로, 위쪽 서열은 야생형에서 나타나고; 아래쪽 서열은 제 2 대립유전자에 있어서의 점 돌연변이에 기인한 변화를 나타냄.
도 3은 소의 알파 1,3GT의 UDP 결합 부위의 3차원 모델의 제시로, 티로신 잔기(전면, 백색)의 방향고리는 UDP의 우라실 염기(그레이스케일) 근방에서 관찰될 수 있음.
도 4는 2002년 7월 25일에 태어난 본 발명의 방법에 의해 생산된 동종 접합성, 알파-1,3-GT 결손형 콜론 돼지(피그)의 사진.
도 5는 알파-1,3-GT KO 마우스 중의 ICC(새끼 돼지(piglet) 돼지 형상 세포 클러스터(islet-like cell clusters))의 주입 전후의 항-알파-1,3-gal IgM 레벨을 표시한 그래프임. 각 마우스에 4일간에 걸쳐 복강내 주사(1회 주사당 200-500 ICC) 를 통해서 3회 연속 ICC 주사를 부여하였다. 야생형 (WT) 새끼 돼지 ICC의 모두 3회의 수용자는 항-알파1,3Gal IgM 역가의 유의한 상승과, 그 후의 ICC 이식 이래로 4주후의 베리스라인에의 회복을 나타내었다. 알파-1,3-GT DKO 새끼 돼지 ICC를 주사한 3마리 모두의 마우스로부터의 혈청은 35 일간의 관찰 시간 동안 항-알파-1,3-gal IgM 역가의 낮은 베이스라인값을 유지하였다(Phelps 등, Science 299: 411-414,2003, 도 S4).
도 6은 알파-1,3-GT 녹아웃 벡터에 있어서의 5' 아암 및 3' 아암으로서 사용될 수 있는 알파-1,3- GT 유전자 서열에 대응하는 돼지 알파-1,3-GT 유전자 자리 및 상동 재조합 후의 표적화된 유전자 자리의 구조를 표시한 도면. 3'PCR 및 원거리(long-range) PCR에 사용되는 프라이머의 각 명칭 및 위치가 짧은 화살표로 표시되고, 짧은 바는 알파-1,3-GT 서던 블롯 분석에 사용되는 프로브를 나타낸다. 내인성 알파-1,3-GT 유전자 자리 및 알파-1,3-GT 표적화된 유전자 자리의 양쪽에 대해서 BstEII 소화한 서던 밴드(Southern band)의 추정 크기도 표시된다.
도 7은 무릎의 해부학적 개요를 제공하기 위한 것으로 굽힘 위치에서의 오른쪽 무릎의 전면도.
본 발명의 일부 측면에 대해 이하의 비제한적인 실시예에 있어서 더욱 상세 히 설명한다.
실시예 1:
알파-1,3- GT 유전자에 대해 이종 접합성(이종 접합형)인 돼지 세포의 생산
원발성 돼지 태아 섬유모세포의 단리 및 트랜스펙션
태아 섬유모세포(PCFF4-1 내지 PCFF4-10)를 임신 33일째에 동일한 임신의 10마리의 태아로부터 단리하였다. 머리 및 내장을 제거한 후, 태아를 행크스 평형염 용액(Hanks'balanced salt solution)(HBSS; Gibco-BRL, Rockville, MD)으로 세정하고, 20 ㎖의 HBSS 속에 배치하고, 작은 수술용 가위로 주사위 모양으로 썰었다. 조직을 펠릿화하고, 50 ㎖ 튜브에 태아당 40 ㎖의 DMEM 및 100 U/㎖의 콜라게나제(Gibco-BRL) 중에 재현탁시켰다. 튜브를 진탕수욕 중에서 37℃에서 40분간 인큐베이션(incubation)하였다. 소화된 조직을 3 내지 4분간 침강시키고, 세포가 풍부한 상청액을 새로운 50 ㎖ 튜브로 옮기고 펠릿화하였다. 이어서, 세포를 10% 소태아혈청(FCS), 1X 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 2 ng/㎖ bFGF를 함유하는 DMEM 40 ㎖에 재현탁시키고, 10 cm 접시에 접종하였다. 모든 세포를 융합(confluence)에 도달한 때에 동결보존하였다. SLA-1 내지 SLA-10 세포를 임신 28일째의 10마리의 태아로부터 단리하였다. 태아는 과잉의 열을 생성시키지 않도록 만곡한 수술용 겸자를 천천히 이용해서 60메시의 금속 스크린을 통해서 으깨었다. 이어서 세포 현탁액을 펠릿화하고, 10% FCS, 1X 비필수 아미노산, 2 ng/㎖ bFGF 및 10pg/㎖ 젠타마이신을 함유하는 DMEM 30 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 세포를 10-cm 접시에 접종하고, 1 내지 3일간 배양하고, 동결보존하였다. 트랜스펙션(transfection)을 위해서, 10 ㎍의 선형화 벡터 DNA를 전기 천공에 의해 2백만 세포 속에 도입하였다. 트랜스펙션 이래로 48시간 후, 트랜스팩트된 세포를 48-웰 플레이트에 웰당 2,000개의 세포의 밀도로 접종하고, 250 ㎍/㎖의 G418에 의해서 선택하였다.
녹아웃 벡터 구축
2개의 알파-1,3-GT 녹아웃 벡터인 pPL654 및 pPL657을, 2개의 원발성 돼지 태아 섬유모세포인 SLA1-10 및 PCFF4-2 세포의 유사 유전자 DNA로부터 구축하였다. 인트론 8 및 엑손 9의 대부분을 포함하는 6.8-kb 알파-1,3-GT 유전자 단편을, SLA1-10 세포 및 PCFF4-2 세포의 정제 DNA로부터 각각 PCR에 의해 생성하였다. 엑손 9의 5'말단에 있는 특유의 EcoRV 부위를 SalI 부위로 전환하고, 1.8-kb IRES-neo-폴리 A 단편을 상기 SalI 부위에 삽입하였다. IRES(internal ribosome entry site: 내부 리포솜 입구 부위)는 neo 단백질의 번역개시부위로서 기능한다. 따라서 두 벡터는 4.9-kb 5'재조합 아암 및 1.9-kb 3'재조합 아암을 지니고 있다(도 6).
3' PCR 및 원거리 PCR
대략 1,000개의 세포를 were resuspended in 5 ㎕의 배아 용해 완충액(ELB)(40 mM Tris, pH 8.9, 0.9% Triton X-100, 0.9% NP 40, 0.4 mg/㎖ 프로테아제 K) 중에 재현탁하고, 65℃에서 15분간 인큐베이트하여 이들 세포를 용해시키고, 95℃에서 10분간 가열하여 프로테아제 K를 불활성화하였다. 3'PCR 분석을 위해 서, 단편을, 이하의 파라미터에 의해서 반응체적 25 ㎕ 중에서 Expand High Fidelity PCR system(Roche Molecular Biochemicals)을 사용해서 증폭하였다: 94 ℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간을 35 사이클. LR-PCR을 위해서, 단편을, 이하의 파라미터에 의해서 반응체적 25 ㎕ 중에서 TAKARA LA system(Panvera/Takara)을 사용해서 증폭하였다: 30 cycles of 10 s at 94℃에서 10초, 65℃에서 30초, 68℃에서 10분간(1사이클마다 20초씩 증분)을 30 사이클한 후에, 68℃에서 10분간의 최후의 1회 사이클. for 정제한 DNA에 대한 3'PCR 및 LR-PCR 조건은, 1 ㎕의 정제 DNA(30 ㎍/㎖)를 혼합한 이외에는 세포마다 동일하였다.
세포 샘플의 서던 블롯 분석
대략 106개의 세포를 용해 완충액 (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0.5% (w/v) 사르코실, 1 mg/㎖ 프로테아제 K)중 60℃에서 하룻밤 용해시키고, 그 DNA를 에탄올에 의해 침전시켰다. 이어서, 상기 DNA를 BstEII에 의해 소화시키고, 1% 한천 겔상에서 분리하였다. 전기 영동 후에, DNA를 was transferred to a 나일론 멤브레인에 옮기고, 3'-말단 디곡시게닌-표지화된 프로브에 의해서 검사하였다. 화학발광시스템(Roche Molecular Biochemicals)을 이용해서 밴드를 검출하였다.
결과
항생제(G418) 내성 콜로니를 순방향 및 역방향 프라이머로서의 neo442S 및 aGTE9A2를 사용해서 3'PCR에 의해 스크리닝하였다. Neo442S는 neo 유전자의 3' 말단에 있고, aGTE9A2는 3'재조합 아암의 바깥쪽에 위치된 서열 중의 엑손 9의 3' 말단에 있다(도 6). 따라서, 1,3 GT 유전자 자리에서의 성공적인 표적화만을 통해서 예측된 2.4 kb PCR 산물을 취득하였다. 4개의 다른 세포주에 있어서의 총 7개의 트랜스펙션으로부터, 1105 G418 내성 콜로니가 정선되어, 그중 100개(9%)가 그 최초의 3'PCR 스크린(2.5 내지 12% 범위)에 있어서의 α 1,3 GT 유전자 파괴에 대해서 양성이었다. 콜로니들 657A-A8, 657A-I6 및 657A-I11은 예측된 2.4 kb 밴드에서 나타난 반면, 대조군의 PCFF4-6 세포 및 다른 G418 내성 콜로니인 657A-P6은 음성이었다. A portion of 각 3'PCR 양성 콜로니의 일부분은 NT 실험에 있어서의 장래의 사용을 위해 수개의 적은 부분들로 직접 동결하는 한편, 나머지 세포들은 원거리 PCR (LR-PCR) 및 서던 분석을 위해서 증식시켰다.
재조합 접합부를 검출하기 위한 PCR 분석 또는 mRNA 분석(RT-PCR)은 의사 양성 결과를 발생할 수 있으므로, 표적화된 영역 전체를 포함하는 원거리 PCR을 실시하였다. LR-PCR은 엑손 8로부터 엑손 9의 말단까지의 7.4 kb α 1,3 GT 유전자서열을 커버하고, 이들 양쪽 모두의 프라이머(aGTE8S 및 aGTE9A2)는 재조합 영역의 바깥쪽에 위치된다(도 2). 대조군의 PCFF4-6 세포 및 3' PCR-음성 콜로니인 657A-P6은 야생형 α 1,3 GT 유전자 자리로부터의 내인성 7.4 kb 밴드만을 보였다. 이에 대해서, 3개의 3'PCR 양성 콜로니인 657A-A8, 657A-I6 및 657A-Il 1은 7.4 kb 내인성 밴드 및 새로운 9.2 kb 밴드의 양쪽을 보였고, 그 크기는 α 1,3 GT 유전자 자리에 대한 1.8 kb IRES-neo 카세트의 표적 삽입에 대해 예측되었다.
LR-PCR 양성 콜로니의 대략 절반(17/30)은 서던 분석을 위해 충분한 세포 수(1 x 106개의 세포)를 얻도록 성공적으로 증식되었다. 이들 콜로니가 α 1,3 GT 유전자 자리에서의 녹아웃에 대한 이종 접합성이었으므로, 이들은 α 1,3 GT 유전자의 1개의 정상의 변형된 유전자 카피 및 1개의 파괴된 카피를 지니고 있는 것으로 이해되었다. BstEII 소화에 의하면, α 1,3 GT 녹아웃 세포는 이하의 2개의 밴드를 표시한다: 내인성 α 1,3 GT 대립유전자에 대해서 예측되는 크기의 1개의 7 kb 밴드, 그리고 α 1,3 GT 유전자 자리에서의 IRES-neo 서열의 삽입 특성인 9 kb 밴드(도 2). 17개의 모든 LR-PCR 양성 콜로니는 그 녹아웃에 대한 서던 분석에 의해 확인되었다. 동일한 멤브레인을 neo에 대해서 특이적인 서열을 이용해서 재차 조사하고, 9 kb 밴드가 neo 프로브에 의해서 검출되었고, 따라서, 파괴된 α 1,3 GT 유전자 자리에 있어서의 IRES-neo 카세트의 표적화된 삽입을 확인하였다.
실시예 2:
알파-1,3- GT 유전자에 대한 동종 접합성인 돼지 세포의 생산
이종 접합성의 알파-1,3-GT 녹아웃 태아 섬유모세포(657A-I11 1-6) 세포를 전술한 바와 같이 임신 32일째에 단리하였다(Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 451 (2002) 참조). 머리 및 내장을 제거한 후, 일부의 태아를 행크스 평형염 용액(HBSS; Gibco-BRL, Rockville, MD)으로 세정하고, 20 ㎖의 HBSS 속에 배치하고, 작은 수술용 가위로 주사위 모양으로 썰었다. 이 조직을 펠릿화하고, 50 ㎖ 튜브에 태아당 40 ㎖의 DMEM 및 100 U/㎖의 콜라게나제(Gibco-BRL) 중에 재현탁시켰다. 튜브를 진탕수욕 중에서 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 소화된 조직 을 3 내지 4분간 침강시키고, 세포가 풍부한 상청액을 새로운 50 ㎖ 튜브로 옮기고 펠릿화하였다. 이어서, 세포를 10% 소태아혈청(FCS), 1X 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 2 ng/㎖ bFGF를 함유하는 DMEM 40 ㎖에 재현탁시키고, 10 cm 접시에 접종하였다. 모든 세포를 융합에 도달한 때에 동결보존하였다. 머리 및 내장을 제거한 후, 일부의 태아를 행크스 평형염 용액(HBSS; Gibco-BRL, Rockville, MD)으로 세정하고, 20 ㎖의 HBSS 속에 배치하고, 작은 수술용 가위로 주사위 모양으로 썰었다. 태아는 과잉의 열을 생성시키지 않도록 만곡한 수술용 겸자를 천천히 이용해서 60메시의 금속 스크린을 통해서 으깨었다. 이어서 세포 현탁액을 펠릿화하고, 10% FCS, 1X 비필수 아미노산, 2 ng/㎖ bFGF 및 10pg/㎖ 젠타마이신을 함유하는 DMEM 30 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 세포를 10-cm 접시에 접종하고, 1 내지 3일간 배양하고, 동결보존하였다. 트랜스펙션을 위해서, 10 ㎍의 선형화 벡터 DNA를 전기 천공에 의해 2백만 세포 속에 도입하였다. 트랜스펙션 이래로 48시간 후, 트랜스팩트된 세포를 48-웰 플레이트에 웰당 2,000개의 세포의 밀도로 접종하고, 250 ㎍/㎖의 G418에 의해서 선택하였다. neo 유전자도 함유하는 ATG(개시코돈)-표적화 알파-1,3-GT 녹아웃 벡터를 알파-1,3-GT 유전자의 제 2 대립유전자를 녹아웃시키도록 구축하였다(pPL680). 이들 세포를, pPL680을 이용해서 전기 천공에 의해 트랜스팩트하고, 정제한 C. 디피실리(difficile) 독소 A(전술함)를 지닌 알파 1,3Gal 음성 표현형에 대해서 선택하였다.
실시예 3:
알파-1,3- GT 유전자에 대해서 동종 접합성인 돼지 세포에 대해서 C. 디피실리 독소 A를 이용한 선택
독소 A 세포독성 곡선
돼지 세포(PCFF4-6)를 10배의 연속희석한 독소 A(0.00001 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖)에 폭로하였다. 세포를 24웰 플레이트에 배양하고, 37℃에서 1시간 혹은 하룻밤 인큐베이트하였다. 이 폭로의 결과를 표 2에 상세히 표시하였다. 명백히 1 ㎍/㎖를 상회하는 독소 A에 대한 1시간의 폭로에 의해서 90%를 넘는 세포에 대해서 세포독성효과를 나타내었다. 따라서, 10 ㎍/㎖에서 혹은 그보다 약간 높은 농도의 독소 A를, 유전적으로 변경된 세포의 선택에 대해서 선정하였다.
표 2. 1시간 및 하룻밤 폭로에서의 독소 A 독성
[독소 A] ㎍/㎖ 1시간 인큐베이션 하룻밤 인큐베이션
0 100% 융합 100% 융합
.00001 100% 융합 100% 융합
.0001 100% 융합 100% 융합
.001 100% 융합 100% 융합
.01 100% 융합 50% 융합, 50% 말려올라감
.1 90% 융합 10 ㎍/㎖과 같음
1 >90%가 말려올라감 10 ㎍/㎖과 같음
10 모든 세포가 말려올라감 모든 세포가 말려올라가고 몇개는 박리됨
gal 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립 유전자에 있어서의 이전에 동정된 표적화 녹아웃을 포함하는 돼지 배아(I-11: 1-6)로부터의 탈응집된(disaggregated) 세포(Dai 등)를, 전기 천공에 의해 l0 ㎍의 선형화 벡터 DNA(프로모터 트랩)을 이용해서 트랜스펙션하였다. 48시간 후, 세포를 1웰당 2000개의 세포의 밀도로 48 웰 플레이트에 접종하고, 250 ㎍/㎖ G418에 의해 선택하였다. 트랜스펙션 이래로 5일 후에, 배지를 웰로부터 인출하고, 배양 배지( 2.8 ng/㎖ bFGF 및 20% FCS를 지닌 DMEM 하이 글루코오스) 중 2 ㎍/㎖ 독소 A로 대체하였다. 세포를 37℃에서 2시간 독소 A의 선택적 효과에 대해서 폭로하였다. 이 독소 A 함유 배지를, 플레이트 표면으로부터 방출된 감염세포의 어느 것과 함께, 인출하고, 그리고 독소 A를 함유하지 않는 새로운 배지로 치환하였다. 10일후에, 세포를 37 ℃에서 2시간 배지 중에서 1.3 ㎍/㎖ 의 독소 A에 재차 폭로하였다. 이 배지, 독소 A 및 용액 중의 어떠한 세포를 제거하고, 남아 있는 세포를 세정하고, 배지를 교체하였다.
트랜스펙션 이래로 16일 후에, 독소 A 비감수성을 나타내는 680B1로 표시되는 단일의 콜로니를 회수하고, DNA 분석 및 렉틴 염색을 위해 일부분을 보냈다. DNA 분석에 의하면, 그 독소 A 비감수성은 제 2의 표적 벡터의 통합에 의한 것은 아닌 것을 나타냈지만; 하지만, 이들 세포는 GSL IB-4 렉틴에 의해서 염색되지 않아, 유전자 자리의 기능적 녹아웃이 생기고 있는 것을 나타내었다. 680B1 더블 녹아웃 세포를 다섯 수용자에게 핵 이입을 위해 사용하여, 그중 3개가 임신되었다. 이들 임신 개체 중 2개는 1개월째에 자연유산되었고; 나머지 임신개체로부터 4개의 태아를 39일째에 회수하여, 이들 세포를 탈응집시키고, 조직 배지에 접종하였다. 이들 태아 세포(680B1-1, 680B1-2, 680B1-3, 680B1-4)를, 37℃에서 1시간 l ㎍/㎖의 독소 A에 폭로하고, 그 후, 배지를 제거하고, 세포를 세정하고, 독소 A가 없는 배치로 치환하였다. 태아 1, 2 및 4는 독소 A에 영향받지 않은 반면, 태아 3으로부터의 세포의 대부분은 말려 올라가, 이 배아는 독소 A의 세포독성 효과에 대해서 감수성이 있는 것을 나타내었다.
태아 1, 2 및 4는 FACS 분석(표 3 참조)에 의하면, GS IB4 렉틴에 결합하지 않은 반면, 태아 3은 렉틴에 결합한 것을 나타내었다. 이것에 의하면, 태아 1, 2 및 4는 이 특정 렉틴에 의해서 특이적인 에피토프 알파 1,3 gal을 보유하고 있지 않은 것을 암시한다.
표 3. GS - IB4 렉틴을 이용한 680B1-1 내지 680B1-4 세포의 FACS 결과
GS IB4 렉틴 양성 세포 (%)
세포 미염색 IB4렉틴 50 ㎍/㎖ IB4렉틴 100 ㎍/㎖
Hela세포(음성 CTL) 1% 2% 2.8%
PCFF4-6세포(양상 CTL) 0.2% 76% 91%
PCFF4세포(양상 CTL) 1.5% 82% 94%
680B1-1세포 0.6% 0.8% 0.9%
680B1-2세포 1.2% 1.2% 1.1%
680B1-3세포 8% 35% 62%
680B1-4세포 0.6% 0.8% 0.9%
보체 고정 에세이를 4개체의 태아 모두에 유래하는 세포에 대해서 실행하였다. 보체 용해 에세이를 알파 gal 발현의 결여에 대한 바이오에세이로서 전개시켰다. 인간 혈청은 알파 gal에 대한 높은 레벨의 미리 형성된 항체 및 보체 조절 단백질(C3 경로)의 완전한 포트폴리오를 포함한다. 세포 표면상의 알파 gal은 항-알파 gal 항체가 결합한 경우에, 보체 캐스케이드를 활성화하고, 그 결과 보체 매개성 세포 용해를 일으킨다. 알파-gal 음성 세포는 보체 매개 용해에 대해서 내성이 있다. 이들 3개의 개별의 시험에 있어서, B1 및 대조군 돼지 세포를 인간 혈청 + 보체에 폭로하고, 에세이를 알파-gal-개시된, 보체 매개성 세포 용해에 대한 감수성 혹은 내성을 평가하기 위해 수행하였다. 이 에세이를 Bl-l, B1-2 및 Bl-4 세포뿐만 아니라, 이종 접합성 GT KO 세포(B1-3, gal 양성)를 이용해서 그리고 대조군으로서 야생형 알파-gal (+) PCFF4-6 돼지 세포를 이용해서 실시하였다. 세포를 3개의 처리중 1개에 대해서 폭로하였다; 2개의 음성 대조군인 소 혈청 알부민(BSA) 및 열불활성화 사람 혈청(HIA-HS)은 어떠한 기능성 보체 단백질도 함유하지 않았으므로, 어떠한 유의한 세포용해를 일으키는 것은 예측되지 않았고; 제 3의 처리는 비열불활성 사람 혈청(NHS)이 기능성 사람 보체뿐만 아니라 항-gal 특이 항체를 포함하므로, 그들의 세포 표면상에 갈락토오스 알파 1,3 갈락토오스를 지니는 세포의 용해가 예측되었다.
도 1에 표시된 결과는 Bl-1, B-2 및 B1-4 세포가 인간 보체-매개성 용해에 대해서 내성이 있는 한편, αl,3 Gal 양성인 B1-3 세포는 여전히 야생형 PCFF4-6 세포에서처럼 인간 혈장에 대해서 감수성인 것을 명백히 입증하였다.
모든 태아로부터의 cDNA의 서열 분석결과는 태아 1, 2 및 4가 기능부전 효소를 수득할 수 있는 변화인 제 2 알파 1,3 GT 대립유전자에 있어서의 점 돌연변이를 포함하는 것을 나타내었다(도 2 참조). 이 돌연변이는 부호화 영역의 bp424에서, 구체적으로는 티민의 구아닌 잔기로의 전환으로서의 알파-1,3-GT(GGTA1) 유전자(GenBank 등록 번호 L36152)의 엑손 9의 제 2 염기쌍에서 일어나서, 142에서의 티로신이 아스파르트산으로 아미노산 치환을 초래하였다.
이것은 티로신으로서 유의한 전환이며, 친수성 아미노산은 알파 1,3GT의 UDP 결합 부위의 임계 성분이다(도 3 참조). 소 알파-1,3-GT 단백질의 결정 구조의 분석 결과, 이 티로신이 효소의 촉매 영역의 중심이고, UDP-Gal 결합에 내포된 것 을 나타내었다(Gastinel 등, EMBO Journal 20 (4): 638-649, 2001). 따라서, 티로신(소수성 아미노산)으로부터 아스파르트산(친수성 아미노산)으로의 변화는 GT 작용의 파괴를 초래할 것(관찰된 바와 같이)으로 예상되었다.
돌연변이된 cDNA가 기능성 aGT 단백질을 만들지 않을 것을 확인하기 위해, the s from the second of all 4 세포 모두의 제 2 대립유전자로부터의 cDNA들을 발현 벡터속으로 클론화하고, 이 GT 발현 벡터를 인간 섬유모세포(HeLa 세포) 속뿐만 아니라 into 원발성 레서스 원숭이(primary Rhesus monkey) 세포 속으로 트랜스펙트하였다. 인간 및 구세계 원숭이가 기능성 알파 1,3 GT 유전자를 결여하고 있으므로, HeLa 세포는 그들의 세포 표면상에 알파 1,3 갈락토오스를 지니지 않았다(렉틴 결합 실험에 의한 분석 결과임). 이 결과는, HeLa 및 원숭이 세포는 Bl-1, B1-2 및 B1-4 세포로부터 얻어진 cDNA에 의해 트랜스펙트된 경우, IB4-렉틴 염색에 의해서 여전히 α 1,3 Gal이 음성인 반면, B1-3으로부터의 cDNA에 의해 트랜스펙트된 Hela 및 레서스 원숭이는 기능성 알파 1,3 GT를 전사하게 만들었고, 이어서, α 1,3 Gal이 양성인 것을 나타내었다. 명백히, 아스파르테이트 돌연변이(티로신 대신)를 지닌 세포는 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스펙션스페라제를 만들 수 없다.
실시예 4 :
핵 제공자로서 동종 접합성 알파 1,3 GT -결손 태아 섬유모세포를 사용하여 클론화된 돼지의 생산
핵 이입을 위한 세포의 제조
제공자 세포를 상기 일반적으로 기재한 바와 같이 알파 1,3 GT 결손성에 대해서 동종 접합성의 세포를 생산하기 위해 유전자 조작하였다. 핵 이입을 당업계에 충분히 공지된 방법에 의해 수행하였다(예를 들어, Dai 등의 Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002 ; 및 Polejaeva 등의 Nature 407: 86-90, 2000 참조).
소 혈청 알부민(BSA; 4gl-1)을 함유하는 예열한 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(PBS)를 이용해서 난관의 역류에 의한 hCG 주입 이래로 46 내지 54시간 후 난모세포를 회수하였다(Polejaeva, I. A 등(Nature 407, 86-90(2000)에 기재된 바와 마찬가지임). 시험관내 성숙한 난모세포의 제핵(BioMed, Madison, WI)은 Polejaeva, I. A. 등(Nature 407, 86-90 (2000))에 기재된 바와 같이 성숙후 40 내지 42시간 사이에 시작하였다. 재회수한 난모세포를 4 gℓ-l BSA를 함유하는 PBS에 의해 38℃에서 세정하고, 38℃에서 칼슘 무첨가 인산 버퍼 NCSU-23 배지로 옮겨 실험실로 이송하였다. 제핵을 위해서, 본 발명자들은 5 ㎍ ㎖-l 사이토할라신(cytochalasin) B(Sigma) 및 7.5 pg ㎖-l Hoechst 33342(Sigma)를 함유하는 칼슘 무첨가 인산 버퍼 NCSU-23 배지에서 38℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 다음에, 제 1 극체 바로 밑에서부터 소량의 세포질을 18 μM 유리 피펫(Humagen, Charlottesville, Virginia)을 이용해서 흡인하였다. 본 발명자들은 흡인한 세포핵을 자외광에 폭로시켜 메타페이즈 플레이트(metaphase plate)의 존재를 확인하였 다.
핵 이입을 위해서, 단일의 섬유모세포 세포를 각각의 제핵난모세포와 접촉시켜 투명대 밑에 놓았다. 각각 ECM2001 Electrocell Manipulator(BTX Inc. , San Diego, CA)를 이용해서 5V의 AC 펄스를 5초간 인가 후 1.5 kV/cm의 두 DC 펄스를 60 μs 인가해서 용합 및 활성화를 유도하였다. 융합된 배아를 5% C02의 습윤 분위기하에 NCSU-23 배지 중 38.6 ℃에서 1 내지 4시간 배양하고, 이어서, 발정-동기화된 수용자 젊은 암퇘지(recipient gilt)의 난관에 이입하였다. 교차번식된 젊은 암퇘지(largewhite/Duroc/landrace)(280-400 lbs)를 그들의 먹이에 혼합된 Regu-Mate(Altrenogest, Hoechst, Warren, NJ) 18-20 mg의 경구 투여에 의해 수용자로서 동기화시켰다. Regu-Mate는 14일간 연속 공급하였다. 최종 Regu-Mate 처치 이래로 150시간 후에 근육 내에 사람 융모성 성선자극호르몬(hCG, 1,000 단위; Intervet America, Millsboro, DE)을 투여하였다. hCG 주입 이래로 22 내지 26시간 후 배아이식을 행하였다.
다음에, 독소 A를 이용해서 상기 설명한 바와 같이 생산된 불분명한 제공자로서의 돼지 섬유모세포를 선택하였다.
배아 이식 및 얻어진 생존 탄생.
핵 이입에 의해 살아있는 알파-1,3-GT dKO 돼지를 생산하기 위한 최초의 시도에 있어서, 총 16개의 배아 이식을 유전자 조작된 제공자 세포에 의해 행하였다. 9개의 초기의 임신이 성립되었으나, 임산 75일째를 넘어서 단지 2개체만 남았다. 5마리의 새끼 돼지가 2002년 7월 25일에 태어났다. 1 마리의 새끼 돼지는 태어난 직후 사망하였고, 또한, 다른 4마리는 살아서 태아나 정상으로 보였다(도 4).
실시예 5:
동종 접합성 알파 1,3 GT 녹아웃 돼지의 분석
모두 5마리의 더블 녹아웃 새끼 돼지로부터 꼬리부 섬유모세포 및 배꼽조직 부분을 획득하고 이미 설명한 바와 같은 GS-IB4 렉틴을 이용해서 염색하였다. 염색이 관찰되지 않았으므로, 이들 동물로부터의 조직의 표면상에 갈락토오스 알파 1,3 갈락토오스 에피토프의 완전한 결핍을 나타내었다(데이터는 표시생략함). 사망한 새끼 돼지(761-1)로부터 단리한 대동맥 내피 세포 및 근육 및 꼬리부 섬유모세포는 S-IB4 렉틴 염색에 있어 음성이었다. 새끼 돼지 761-1로부터의 근육 섬유모세포의 FACS 분석도 forGS-IB4 결합에 대해서 음성 결과를 나타내었다. 새끼 돼지 761-1로부터 얻어진 간, 신장, 비장, 피부, 창자, 근육, 뇌, 심장, 췌장, 폐, 대동맥, 혀, 배꼽 및 꼬리의 조직 단면은 GS-IB4 염색에 대해 음성이었으므로, 검출가능한 세포 표면 알파 1,3Gal 에피토프의 완전한 결여를 나타내고 있다(도 3을 포함하는 Phelps 등의 Science 299: 411-414, 2003).
본 발명자들은 알파 1,3GT-녹아웃 마우스를 이용해서 생체내 면역원성 시험을 수행하였다. 본 발명자들은 새끼 돼지 761-1의 췌장으로부터 단리한 섬형상 세포 클러스터(ICC)를 알파 1,3GT 녹아웃 마우스 속으로 복강내 주입하였다. 본 발명자들은 대조군으로서 신생아 야생형 새끼 돼지로부터의 ICC를 사용하였다. 도 5에 표시된 바와 같이, 알파 1,3Gal에 대한 면역글로부린 M(IgM)의 역가의 증가는 알파 1,3GT DKO 새끼 돼지로부터의 ICC를 주사한 후의 알파 1,3GT 녹아웃 마우스에서 관찰된 데 대해서, 야생형 새끼 돼지 ICC를 주입한 마우스에서는 유의한 IgM 역가가 관찰되었다(도 4를 포함하는 Phelps 등의 Science 299: 411-414, 2003 참조). 이 결과는 DKO 새끼 돼지 세포가 임의로 알파 1,3Gal 에피토프를 만들지 않는 것을 명확히 입증한다.
680B1-2 세포에 있어서 관찰된 바와 같은 GGTA1 유전자의 bp 424에서의 변이의 존재를 확인한 모두 5마리의 새끼 돼지로부터 얻어진 DNA 서열결정은 이들 동물을 클론화하는 데 사용하였다(도 2).
이것은 알파-GT dKO 돼지 새끼의 첫번째의 성공적인 생산이고, 핵 제공자 세포로서 dKO 태아 섬유모세포를 이용한 1개의 경우(새끼 662)에 있어서, 후속의 2마리의 dKO 새끼 돼지는 핵 이입에 의해 생산되었다. 새끼 660은 핵 제공자로서 새끼 761의 멤버로부터 유래된 꼬리부 섬유모세포 세포를 이용한 핵 이입에 의해 생산되었다. 이들 출생을 표 4에 요약하였다.
표 4: 핵 이입에 의해 생성된 알파-GT 더블 녹아웃 출생의 개요
세포주 리터수 생산된 생존 새끼 돼지수
A 8 14
B 2 2
C 1 1
합계 17
* PM = 점 돌연변이를 통한 GT 대립유전자 녹아웃; Neo = Neo 선택가능한 표지유전자의 상동 재조합 및 삽입을 통한 GT 대립유전자 녹아웃. 이 표에 나타낸 모든 돼지는 동종 접합성 GT 녹아웃이었다.
실시예 6:
더블 녹아웃 ( DKO ) 돼지의 소집단( miniherd )을 확립하기 위한 이종 접합성 알파 1,3 GT 싱글 녹아웃 ( SKO ) 수컷 및 암컷 돼지의 번식
서던 블롯에서 확인한 클론화 GT-SKO 암컷 및 수컷 클론화 돼지가 생산되었다. 수컷 및 암컷 이종 접합성(단일 유전자 알파 1,3GT 녹아웃 돼지)을 자연 번식 및 인공수정(AI)에 의해서 번식시켜, 임상전 연구 및 인간 임상 시험에 이용하기 위한 DKO 돼지의 집단을 생성하였다.
실시예 7: 더블 녹아웃 동물로부터의 진피 조직의 탈세포화
처리대상 생체 조직은 먼저 기능성 알파 1,3GT가 불활성화되어 있는 동물 제공자, 예를 들어 전술한 바와 같은 돼지로부터 생산하거나 수확하였다. 진피 조직은 적절한 수술기법을 이용해서 제공자 동물로부터 적출하였다. 조직은 삼투, 저산소, 자가용해 및 단백질 분해성 열화를 억제하거나 방지하고, 세균 오염에 대해서 보호하고, 일어날 수 있는 기계적 손상을 저감하는 안정화 운반 용액 중에 놓았다. 이 안정화 용액은 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 또는 당업자에게 공지된 적절한 완충액, 1종 이상의 산화방지제, 1종 이상의 산화 방지제, 1종 이상의 삼투제(oncotic agent), 항생제, 1종 이상의 프로테아제 저해제를 함유한다.
다음에, 조직을 처리용액 중에서 인큐베이트하여 교원 기질의 구조적 일체 성 혹은 기저막 복합체를 손상시키는 일 없이 구조 기질로부터 살아있는 항원 세포(상피 세포, 내피 세포, 평활 근육 세포 및 섬유모세포를 포함함)를 제거한다. 처리용액은 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 혹은 당업자에게 공지된 적절한 완충액, 염, 항생제, 1종 이상의 세정제, 1종 이상의 프로테아제 저해제 및/또는 1종 이상의 효소를 포함한다. 이 처리용액을 이용한 조직의 처리는, 기저막 복합체의 분해를 피하여 기질의 구조적 일체성이 교원 섬유 및 엘라스틴을 포함해서 유지되어 탈세포화된 조직을 생성하도록 소정 기간 동안 소정 농도에서 수행된다.
조직은 탈세포화된 후, 냉동 보존 용액 중에 배양된다. 이 용액은 일반적으로 동결 동안 일어날 수 있는 구조적 기질에 대한 얼음 결정 손상을 최소화하기 위한 1종 이상의 동결방지제, 및 건조 동안 구조적 손상변경을 최소화하기 위한 1종 이상의 건조-보호 성분을 포함하고, 또한, 동결 동안 수축을 일으키지 않는 유기 용매 및 물의 배합물을 포함할 수 있다. 이 동결방지 용액 중에서의 배양후, 조직은 멸균 용기 속에 포장된다. 부가적인 혹은 선택적인 방법으로서, 탈세포화된 조직 기질은 글루타르알데하이드 등의 가교제와 고착되어 이식 전에 보존된다.
실시예 8: 더블 녹아웃 동물로부터의 이종이식을 위해 획득한 인대
처리될 생물학적 조직은 먼저 본 명세서에 기재된 바와 같이 기능성 알파 1,3GT가 불활성인 동물 제공자로부터 획득하거나 수확하였다. 인대 조직은 적절한 수술기법을 이용해서 제공자 동물로부터 적출하였다. 첫번째 단계에 있어서, 무손상 인대를 비인간 동물로부터 제거하였다. 인대의 공급원으로서 기능하는 접합부는 바로 사망한 동물로부터 회수하고, 즉시 적절한 멸균성 혹은 기타 조직보존용액 중에 놓는다. 접합부의 수확은 가능한 한 차가운 온도, 즉, 약 5 ℃ 내지 약 20℃의 적절한 범위에서 동물 도축 직후에 수행하여, 인대 조직의 효소 분해를 최소하하였다. 인대는 한쪽 또는 양쪽 말단에 뼈의 블록이 부착된 채로 회수하였다. 직경이 대략 9 내지 10 mm인 원주형 플러그를 대표하는 뼈의 블록은 인대에 부착된 채로 있었다. 인대는 조심스럽게 식별해서 부착 조직이 없이 절개하였다. 다음에, 이종이식편을 약 10 체적의 멸균 냉수로 세척하여 잔류 혈액 단백질 및 수가용성 물질을 제거하였다. 다음에, 이종이식편을 실온에서 약 5분간 알코올 속에 침지하여 조직을 멸균하고 비교질 물질을 제거하였다.
알코올 침지후, 이종이식편을 무릎에 이식하였다. 대안적으로는, 이종이식은 이하의 처리 중 적어도 하나로 실시하였다: 방사선 처리, 알코올 혹은 오존처리, 1회 이상의 동결 해동, 및/또는 화학적 가교제에 의한 처리. 동결/해동 순환처리시, 이종이식편은 약 수분 동안 실온(약 25℃)에서 등장성 식염수 욕 중에 침지에 의해 해동한다. 섬유 열화를 최소화하기 위해, 외부 열 혹은 방사선원은 사용하지 않았다.
부가적으로 또는 대안적으로, 이종이식편에 세포화 파괴처리를 실시하여, 글리코시다제에 의한 이종이식편의 시험관내 소화 전에 인대의 세포를 죽였다. 표면 탄수화물 부분을 유핵 세포로부터 제거한 후, 세포외 성분인 유핵 세포, 즉, 살아있는 세포는 표면 탄수화물 부분을 재발현한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 인대 세포를 죽이기 전 혹은 후에, 이종이식편에 대해서 글리코시다제를 이용한 해당 이종이식편의 시험관내 소화를 실시하고, 항원 표면 탄수화물 부분을 효소적으로 제거하였다. 임의의 잔류하는 비-알파 gal 탄수화물 부분을 제거하기 위해, 기타 효소를 이용해도 된다.
이식 전에, 본 발명의 인대 이종이식편은 피신 또는 트립신 등의 단백질 분해효소에 의해 제한소화처리를 실시하여 조직 유연성을 증대시키거나, 또는 석회화제, 항트롬빈 코팅, 항생제, 성장 인자 또는 기타 당업계에 공지도니 약물로 피복처리하여 이종이식편의 수용자 무릎 접합부에의 편입을 증대시켰다.
부가적으로 혹은 대안적으로, 인대 이종이식편은 공지의 방법, 예를 들어, 추가의 글루타르알데하이드 또는 포름알데하이드 처리, 에틸렌옥사이드 멸균처리, 프로필렌 옥사이드 멸균처리 등을 을 이용해서 더욱 멸균처리하였다. 이종이식편은 사용을 위해 필요하게 될 때까지 동결 보존하였다.
인대 이종이식편 또는 그의 세그먼트는 공지의 관절경 수술기법을 이용해서 당업자에 의해 손상된 인간 무릎 접합부에 이식하였다. 관절경 기술을 수행하기 위한 특정 기구는 당업자에게 공지되어 있고, 이것은 인대 이식편의 정확하고 재현성 있는 위치결정을 확실하게 해준다. 또한, 무릎 접합부의 완전한 진단 관절경은 공지의 방법을 이용해서 수행하였다. 회복불가능하게 손상된 인대는 수술용 면도기에 의해 제거하였다. 인대의 해부학적 삽입 부위를 확인하여 드릴로 천공하여 뼈 플러그를 수용시켰다. The size of the 뼈 플러그의 크기는 폭이 약 9 내지 10 mm, 깊이가 약 9 내지 10 mm, 길이가 20 내지 40 mm였다. 이종발생성 인 대는 드릴 구멍을 통해 간섭 나사에 의해 고정하였다. 일반적인 봉합을 수행하였다.
실시예 9: 동종 접합성 알파 1,3 Gal 녹아웃 돼지로부터 소장 점막밑 ( SIS ) 유래의 조직 이식편
조직 이식편 재료는 알파 1,3 GT의 어떠한 기능성 발현도 결여된 돼지 등의 동물로부터 유래하며, 십이지장과 돌창자 사이에 뻗어 있는 소장의 분할부분인 빈창자 등의 소장의 세그먼트로부터 박리된 점막밑 조직 및 기저점막 조직을 포함한다.
알파 1,3 갈(gal) 결핍 돼지의 소장으로부터 얻어진 SIS 이식편은 먼저 중간선 개복 절개에 이은 자가 몸쪽 빈창자의 세그먼트를 절제함으로써 제조된다. 이어서, 빈창자의 절제된 세그먼트는 생리식염수 중에 담가 있던 수술용 스펀지에 의해 둘러싸인다. 창자 문합의 완료시, 잘라낸 장 세그먼트는 장막과 근육층의 양 층을 포함하는 외부층과, 점막의 장강 부분을 포함하는 내부층을 제거하도록 장조직을 벗겨냄으로써 제조된다.
온화한 벗기기 조건하에서, 점막은 조밀층과 고유판 사이에서 박리된다. 특히, 예를 들어, Adson-Brown 겸자 및 Metzenbaum 가위를 이용한 장 세그먼트로부터의 임의의 장간막 조직을 제거한 후에, 장막과 근육층(외부 조직층)은 스캐펠(scalpel) 핸들과 습윤 거즈를 이용해서 길이방향으로 닦는 동작을 이용한 벗기기에 의해 장 세그먼트로부터 박리된다. 장 세그먼트를 뒤집은 후에, 동일한 닦 는 동작을 이용해서 점막의 장강부를 하부의 조직으로부터 박리시켰다. 주의를 기울여, 점막밑의 천공을 방지하였다. 또한, 이식편 표면 상에 남아 있는 박리층으로부터 임의의 조직"태크(tag)"를 제거하였다. 임의로, 장 세그먼트는 먼저 뒤집고 나서, 장강층을 벗기고, 이어서 장막 및 근육층의 제거를 위해 그의 원래의 배향으로 재삽입해도 된다. 이식편 재료는 전형적으로 부착된 단층 점막내 근육 및 조밀층을 지닌 점막밑층으로 구성된 대략 두께 0.1 mm의 조직의 흰색의 투명한 관이다. 혈관 이식편 제조를 위해서는, 준비된 이식편을 그의 원래의 배향으로 뒤집어서 조밀층이 이식편의 장강면으로서 기능하도록 한다.
제조된 이식편 재료는 전형적으로 식염수로 세정하고, 10% 네오마이신 설페이트 용액 중에 대략 20분간 놓고, 그 후, 이식편 재료를 사용할 준비를 한다. 이식편은 통상 조직 이식 용도에 이용되는 일상의 수술절차를 이용해서 적용된다. 비혈관 조직 이식 작용에 이용하기 위해, 관형상 이식편 재료를 세로방향으로 절단하고 둥글게 말아서 조직의 "패치"를 형성한다. 전술한 바와 같은 전체 조직 박층 절차는 세그먼트를 길이방향으로 절단하고 "언롤링"함으로써 제조된 장 조직의 "패치"상에서 행할 수 있고, 이것은 이식전 패치를 형성한다. 제조된 이식편 조직 패치는 예를 들어, 피부 이식 재료로서, 경질막 복원을 위해 또는 이 이식편 조성의 물리적 및 기능적 특징을 지닌 조직 이식편 패치의 수술 적용에 부여하는 기타 몸체 조직 결함의 복원을 위해 이용될 수 있다. Gal KO SIS 패치 재료를 위한 기타 적용은 유방 재구축, 얼굴 결함, 입술 재구축, 눈꺼플 스페이서 이식, 함몰반흔 복원, 점막 이식, 코입술 주름, 구강 리서페이싱, 귀밑샘절제술, 중격천공 복 원, 코성형술, 일시적 상처 드레싱, 상처 피복, 고실성형, 입안안뜰성형술, 및 및 기타 연조직 결함을 포함한 성형수술, 회전근개 복원, 탈장, 복벽 복원, 요실금을 치료하기 위한 슬링, 화상, 피부 대체 등을 포함한다.
혈관 이식에 이용하기 위해서, 이식물의 직경은 수용자 혈관의 것과 대략 동일하다. 이것은 수용자의 혈관과 대략 동일한 직경을 지닌 원통형상을 규정하도록 조직 이식편을 조작하고, 상기 혈관 이식편을 형성하기 위해 이 조직 이식편을 봉합하거나 기타 확보함으로써 수행된다. 따라서, 예를 들어, 혈관 이식편은 수용자의 혈관과 외경이 동일한 멸균 유리봉을 선택해서 그 유리봉을 이식편 관내강에 도입함으로써 제조된다. 다음에, 여분의 조직을 모아서, 이식편의 길이를 따라 봉합함으로써(예를 들어, 2개의 연속한 봉합선 또는 단순한 불연속 봉합선을 이용해서) 또는 기타 당업계에서 인정된 조직 확보 수법을 이용함으로써(미국특허 제 4,956,178호 공보 참조) 소망의 관내강 직경을 얻는다.
본 명세서에 기재된 발명은 본 명세서에 구체적으로 기재되지 않은 어떠한 요소나 요소들, 제한 또는 제한들 없이도 실행될 수 있다. 이용된 용어 및 표현은 설명을 위해 사용된 것으로 제한을 위한 것은 아니며, 개시된 특징의 소정의 등가물 또는 그 일부를 배제한 이러한 용어 및 표현을 이용하는 것을 의도하는 것은 아니지만 본 발명의 특허청구범위 내에서 각종 변형이 가능한 것으로 인식하길 바란다. 따라서, 본 발명은 여기에 구체적으로 개시되어 있더라도, 여기에 개시된 임의의 특징, 변형 및 변화를 당업자가 재선별할 수 있는 것으로 이해할 필요가 있 으며, 이러한 변형과 변화는 첨부된 특허청구범위에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다. 또한, 본 발명의 특징 혹은 측면들이 마쿠시 그룹의 관점에서 기재되는 경우, 당업자라면 본 발명이 마쿠시 그룹의 개별의 부재 혹은 부재의 서브그룹의 관점에서 기재된 것임을 인식할 것이다.

Claims (28)

  1. 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 발현이 결여된 동물로부터 유래된 조직 산물을 포함하는 인공삽입물(prosthesis).
  2. 제 1항에 있어서, 조직은 경조직인 인공삽입물.
  3. 제 1항에 있어서, 조직은 연조직인 인공삽입물.
  4. 유제 동물인 제 1항의 동물.
  5. 제 4항에 있어서, 유제 동물은 돼지(porcine)인 동물.
  6. 제 2항에 있어서, 경조직은 뼈 또는 그의 단편 혹은 유도체인 인공삽입물.
  7. 제 3항에 있어서, 연조직은 피부, 진피, 점막밑, 인대, 힘줄 및 연골 또는 그의 단편 혹은 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 인공삽입물.
  8. 제 1항에 있어서, 조직은 경조직과 연조직의 조합체인 인공삽입물.
  9. 뼈-힘줄-뼈 이식편인 제 8항의 조직.
  10. 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 발현이 결여된 동물로부터 유래된 탈세포화된(de-cellularized) 조직 산물.
  11. 제 9항에 있어서, 동물은 유제 동물인 조직.
  12. 제 10항에 있어서, 동물은 돼지인 조직.
  13. 연조직인 제 9항의 탈세포화된 조직.
  14. 제 9항에 있어서, 연조직은 진피 조직인 조직.
  15. 제 9항에 있어서, 연조직은 점막밑 조직인 조직.
  16. 제 11항에 있어서, 점막밑 조직은 소장으로부터 유래된 것인 조직.
  17. 골격으로서 제 9항의 조직의 용도.
  18. 인체 부분을 재구성 혹은 복원하기 위한 알파-1,3-갈락토실트랜스페라제의 발현이 결여된 동물로부터 유래된 조직 산물의 용도.
  19. 제 18항에 있어서, 동물은 유제 동물인 조직.
  20. 제 18항에 있어서, 동물은 돼지인 조직.
  21. 제 18항에 있어서, 조직은 인간 정형외과적 재구성 혹은 복원에 이용되는 것인 용도.
  22. 제 21항에 있어서, 회전 근개 복원(rotator cuff repair)을 위한 용도.
  23. 제 21항에 있어서, 뼈, 힘줄, 인대 및 연골로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 복원 혹은 재구성을 위한 용도.
  24. 제 18항에 있어서, 조직은 뼈-힘줄-뼈 이식편인 용도.
  25. 제 18항에 있어서, 조직은 인간 피부 복원에 이용되는 것인 용도.
  26. 제 18항에 있어서, 조직은 인간 연조직 복원에 이용되는 것인 용도.
  27. 제 18항에 있어서, 조직은 탈세포화되어 있는 것인 용도.
  28. 제 27항에 있어서, 탈세포화된 조직은 인체 부분을 재구성 혹은 복원하기 위한 골격으로 사용되는 것인 용도.
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