JP5329502B2 - 機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタ動物 - Google Patents
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Description
本発明は、ブタ動物、ブタ組織、およびブタ器官、ならびにそのような動物、組織、および器官に由来する細胞および細胞株であって、これらは、機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,3GT)のいかなる発現をも欠く。そのような動物、組織、器官、および細胞は、研究および医学的治療(異種移植を含む)において使用され得る。
末期臓器不全の患者は、生存のために器官移植を必要とする。臨床的移植における主要な限定要因は、適切なヒトドナーの不足である。過去10年間にわたり、臓器を待つ患者のリストの大きさは、1991年の約30,000人から、2001年の約80,000人へと劇的に増加した(情報源:New York Organ Donor Network;Association of Organ Procurement Organization’s Death Record Review Study from 1997 to 1999(30個の臓器斡旋組織により提供される))。過去10年間にわたるこの需要増加にも関わらず、臓器提供の数は、不活発なままである(1年間当たり約20,000件)。
米国において、すべての人種および民族のバックグラウンドの男性、女性および子供が、毎日平均17人、寄与される器官の欠如が原因で死んでおり、従って、毎年、6,200人を越えるアメリカ人が、器官移植を待って死んでいる。より信頼できかつ無限の器官供給源についての需要により、他の動物からの器官の移植(異種移植とも呼ばれる)の可能性について調査が引き起こされた。
本発明は、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる機能的発現をも欠く最初の生存ブタの産生である。本発明の主題は、2003年にScinece magazineにおいて完全な論説として報道され(Phelpsら(Science 299:411−414(2003))、異種移植における躍進として報道において広範に報告された。
・本発明はさらに、以下を提供し得る:
・(項目1)
機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠く、ブタ。
・(項目2)
機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタの、器官。
・(項目3)
腎臓である、項目2に記載の器官。
・(項目4)
肝臓である、項目2に記載の器官。
・(項目5)
心臓である、項目2に記載の器官。
・(項目6)
肺である、項目2に記載の器官。
・(項目7)
膵臓である、項目2に記載の器官。
・(項目8)
機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタの、組織。
・(項目9)
軟骨である、項目8に記載の組織。
・(項目10)
骨である、項目8に記載の組織。
・(項目11)
脂肪である、項目8に記載の組織。
・(項目12)
筋肉である、項目8に記載の組織。
・(項目13)
機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタに由来する、細胞または細胞株。
・(項目14)
膵臓に由来する、項目13に記載の細胞。
・(項目15)
ランゲルハンス島細胞である、項目14に記載の細胞。
・(項目16)
インスリン分泌細胞である、項目14に記載の細胞。
・(項目17)
機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタの産生のための方法であって、
α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてヘテロ接合性である雄のブタを、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてヘテロ接合性である雌のブタと交配させる工程;
を包含する、方法。
・(項目18)
項目17に記載の方法であって、一方または両方のブタは、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の一方の対立遺伝子の発現を防止するように当該一方の対立遺伝子が遺伝子改変されていることに起因して、ヘテロ接合性である、方法。
・(項目19)
項目17に記載の方法であって、一方または両方のブタは、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の対立遺伝子における点変異の存在に起因して、ヘテロ接合性である、方法。
・(項目20)
項目19に記載の方法であって、上記点変異は、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン9の2番目の塩基におけるT→G点変異である、方法。
・(項目21)
項目17に記載の方法であって、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン9の2番目の塩基においてT→G点変異を含む雄のブタが、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン9の2番目の塩基においてT→G点変異を含む雌のブタと交配される、方法。
・(項目22)
α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損性非ヒト動物を産生するための方法であって、
(a)細胞集団を、Clostridium difficile毒素Aに対して曝露する工程;
(b)表面マトリックスから盛り上がる細胞は、当該毒素Aのレセプター媒介性細胞毒性に起因して当該毒素Aにより有害に影響されるので、当該細胞を除去する工程;
(c)レセプター媒介性細胞毒性の影響を示さない細胞を増殖させて維持する工程;
(d)これらの毒素A耐性細胞を、適切なレシピエント細胞中への核移植のための核ドナーとして使用する工程;
(e)当該融合した活性化細胞を、雌代理母中に移植する工程;および
(f)galα1,3−galエピトープの欠損または完全な欠如をその細胞表面において示すクローン化動物を産生する工程;
を包含する、方法。
・(項目23)
項目22に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、相同組換えによる一方の対立遺伝子の標的化ノックアウトを介して、上記galα1,3対立遺伝子に関してヘテロ接合性にされている、方法。
・(項目24)
項目22に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、相同組換えによる両方の対立遺伝子の標的化ノックアウトを介して、上記galα1,3対立遺伝子に関してヘテロ接合性にされている、方法。
・(項目25)
項目22に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を無能にする単一のgalα1,3対立遺伝子の自然変異を介して、上記galα1,3対立遺伝子に関してヘテロ接合性にされている、方法。
・(項目26)
項目22に記載の方法であって、選択されるべき細胞は、相同組換えによる一方の対立遺伝子の標的化ノックアウトと第2の対立遺伝子の自然変異とにより作製された、α1,3galダブルノックアウトを保有する、方法。
・(項目27)
項目22に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、上記galα1,3対立遺伝子に関してホモ接合性にされており、これは、両方のgalα1,3対立遺伝子の自然変異を介して達成されており、当該自然変異により、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が無能にされている、方法。
・(項目28)
項目22に記載の方法であって、選択されるべき細胞は、相同組換えによる一方の対立遺伝子の標的化ノックアウトと、α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を無能にする第2の対立遺伝子の自然変異とにより作製された、α1,3galダブルノックアウトを保有する、方法。
・(項目29)
項目22に記載の方法であって、選択されるべき細胞は、α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を無能にする両方の対立遺伝子の誘導性変異を介して、galα1,3対立遺伝子に関してホモ接合性にされている、方法。
・(項目30)
項目22に記載の方法であって、選択のために使用される上記Clostridium difficile毒素Aは、精製毒素の形態である、方法。
・(項目31)
項目22に記載の方法であって、選択のために使用される上記Clostridium difficile毒素Aは、培養上清液の形態である、方法。
・(項目32)
項目22に記載の方法であって、上記精製毒素は、分散した細胞に適用され、当該分散した細胞は、その後、細胞接着のために適切な容器中でインビトロにて培養される、方法。
・(項目33)
項目22に記載の方法であって、上記精製毒素は、接着した細胞に適用される、方法。
・(項目34)
項目22に記載の方法であって、上記培養上清液は、分散した非接着細胞に適用され、その後、当該細胞は、細胞接着のために適切な容器中で培養される、方法。
・(項目35)
項目22に記載の方法であって、上記培養上清液が、適用される、方法。
・(項目36)
項目22に記載の方法であって、上記動物は、ブタである、方法。
・(項目37)
項目22に記載の方法であって、変異は、化学的変異、放射線、およびトランスポゾンからなる群より選択される変異原性因子により誘導される、方法。
・(項目38)
項目22に記載の方法であって、上記化学的変異は、EMS、ENU、マスタードガス、およびICR191からなる群より選択される、方法。
・(項目39)
項目22に記載の方法であって、上記放射線は、紫外線、α線、β線、およびγ線からなる群より選択される、方法。
・(項目40)
galα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてのホモ接合性ノックアウトを保有する細胞であって、当該ホモ接合性ノックアウトにおいて、少なくとも一方の対立遺伝子が、galα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子において自然変異または自然発生変異を含み、
当該細胞は、
(a)細胞集団を、Clostridium difficile毒素Aに対して曝露する工程;
(b)当該毒素Aのレセプター媒介性細胞毒性に起因して当該毒素Aにより有害に影響される細胞を除去する工程;および
(c)レセプター媒介性細胞毒性の影響を示さない細胞を増殖させて維持する工程;
を含む方法によって生成される、細胞。
・(項目41)
項目40に記載の細胞であって、当該細胞は、galα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてのホモ接合性ノックアウトを保有し、当該ホモ接合性ノックアウトにおいて、少なくとも一方の対立遺伝子が、当該α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基424位においてチミン→グアニンの塩基置換を含み、これにより、galα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質の142位において、チロシン→アスパラギン酸のアミノ酸置換が生じる、細胞。
・(項目42)
項目40に記載の細胞であって、当該細胞は、galα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてのホモ接合性ノックアウトを保有し、当該ホモ接合性ノックアウトにおいて、少なくとも一方の対立遺伝子が、当該galα−1,3−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子において誘導性変異を含む、細胞。
・(項目43)
項目22に記載の方法に従って産生された、動物。
・(項目44)
項目40に記載の細胞を核ドナーとして使用する核移入クローニングによって産生された、動物。
・(項目45)
項目41に記載の細胞を核ドナーとして使用する核移入クローニングによって産生された、動物。
・(項目46)
項目42に記載の細胞を核ドナーとして使用する核移入クローニングによって産生された、動物。
・(項目47)
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目42に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
・(項目48)
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目43に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
・(項目49)
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目44に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
・(項目50)
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目45に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
本発明者らは、機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠く生存可能なブタ動物が、産生され得ることを、ここに証明した。本発明は、ブタにおけるα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方の対立遺伝子の完全な不活化を提供し、それにより、この長期にわたる障害物を克服し、異種移植を現実的にする。この遺伝子の発現を排除すると、細胞表面上でのガラクトースα−1,3−ガラクトースエピトープが欠如する。これは、ブタからヒトへの異種移植治療における超急性拒絶を排除する際の、最初の主要な段階を示す。本発明はまた、そのようなブタ動物に由来する器官、組織、および細胞を提供し、これらは、異種移植のために有用である。
・一局面において、本発明は、機能的α−1,3−GTのいかなる発現をも欠くブタから得られる、ブタの器官、組織および/または精製された細胞もしくは細胞株もしくは実質的な純粋な細胞もしくは細胞株を提供する。別の実施形態において、本発明は、異種移植のために有用な器官または組織を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、異種移植のために有用な細胞または細胞株を提供する。
本明細書中で使用される場合、用語「動物」(遺伝子改変(または遺伝子変化)動物におけるような)は、任意の非ヒト動物、特に任意の非ヒト哺乳動物(ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ(cattle)(ウシ(bovine))、シカ、ラバ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚類および昆虫が挙げられるが、これらに限定されない)を包含する。本発明の一実施形態において、遺伝子改変ブタおよびその産生方法が、提供される。
本発明の一局面において、α−1,3−GT遺伝子の一方の対立遺伝子が、遺伝子標的化を介して不活化されている、ブタ動物が提供される。本発明の別の局面において、α−1,3−GT遺伝子の両方の対立遺伝子が、遺伝子標的化を介して不活化されている、ブタ動物が提供される。一実施形態において、上記遺伝子は、相同組換えを介して標的化され得る。他の実施形態において、上記遺伝子は、破壊され得る。すなわち、その遺伝コードの一部が変化され得、それにより、その遺伝子のその部分の転写および/または翻訳に影響が与えられ得る。例えば、遺伝子の破壊は、置換技術、欠失(「ノックアウト」)技術、または挿入(「ノックイン」)技術を介して、生じ得る。望ましいタンパク質のさらなる遺伝子、または既存の配列の転写を調節する調節配列が、挿入され得る。
遺伝子改変され得るブタ細胞は、種々の異なる器官および組織から得られ得る。その器官および組織は、例えば、以下であるが、これらに限定されない:皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器官、ならびに胚、胎児もしくは成体動物の全体もしくは一部の分解(disaggregated)調製物。本発明の一実施形態において、ブタ細胞は、以下からなる群(これらに限定されない)より選択され得る:上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球(BおよびT)、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、その他の筋細胞、肉芽腫細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、血球、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆体細胞、神経幹細胞、始原幹細胞,肝細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、毛細血管内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クップファー細胞、平滑筋細胞、シュヴァン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵臓島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球細胞、白血球細胞、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、T細胞、B細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディヒ細胞、管周細胞、セルトーリ細胞、黄体細胞、子宮頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、卵胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞。
(相同組換え)
相同組換えにより、内因性遺伝子の部位特異的改変が可能になり、従って、新規な変化が、ゲノム中に操作され得る。相同組換えにおいて、入って来るDNAが、実質的に相同なDNA配列を含むゲノム部位と相互作用してその部位中に組み込む。非相同(「ランダム」または「不法(illicit)」組み込みにおいて、この入って来るDNAは、そのゲノム中の相同性配列においては見出されないが、多数の可能な位置のうちの1つにおいて、どこででも組み込む。一般に、高等真核細胞を用いる研究により、相同組換えの頻度は、ランダム組み込みの頻度より遥かに小さいことが、明らかになっている。これらの頻度の比率は、「遺伝子標的化」についての直接的関係を有し、これは、相同組換え(すなわち、内因性「標的化DNA」と、ゲノム中の対応する「標的DNA」との間の組換え)を介する組み込みに依存する。
細胞の標的化遺伝子座の改変は、その細胞中にDNAを導入することによって作製され得、そのDNAは、標的遺伝子座に対する相同性を有し、マーカー遺伝子を含み、これにより、組み込まれた構築物を含む細胞の選択が可能になる。この標的ベクター中の相同性DNAは、標的遺伝子座において染色体DNAと組換わる。そのマーカー遺伝子は、両側で、相同性DNA配列、3’組換えアーム、および5’組換えアームと隣接し得る。標的化ベクターを構築するための方法は、当該分野で、例えば、Daiら、Nature Biotechnology 20:251−255,2002;WO 00/51424の図6において記載されている。
択マーカー遺伝子の挿入であり得る。
選択マーカーの組み合わせもまた、使用され得る。例えば、標的α−1,3−GTに、neo遺伝子(上記で考察されるように、それ自体のプロモーターを含むかまたは含まない)が、α−1,3−GTに対して相同性であるDNA配列中にクローン化され得る。マーカーの組み合わせを使用するために、HSV−tk遺伝子が、この遺伝子が標的化DNAの外側にあるようにクローン化され得る(別の選択マーカーが、望ましい場合には、反対側に配置され得る)。標的化されるべき細胞中にそのDNA構築物を導入した後、その細胞は、適切な抗生物質上で選択され得る。この特定の場合において、G418およびガンシクロビルに対して耐性である細胞が、neo遺伝子がα−1,3−GT遺伝子中に組み換えられたがtk遺伝子が失われた相同組換えにより生じた可能性が最も高い。なぜなら、tk遺伝子は、このダブルクロスオーバーの領域の外側に位置したからである。
その後、上記細胞は、適切な組換え体を提供する細胞を同定するために、適切に選択された培地中で増殖され得る。α−1,3−GT遺伝子中に挿入された選択マーカー遺伝子の存在は、宿主ゲノム中への上記標的構築物の組み込みを確立する。その後、望ましい表現型を示す細胞が、相同組み換えまたは非相同組み換えが生じたか否かを確立するために、DNAを分析するための制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによりさらに分析され得る。これは、上記挿入物のプローブを使用すること、その後、その挿入物に隣接する5’領域および3’領域を、上記構築物の隣接領域を越えて広がるα−1,3−GT遺伝子の存在について配列決定すること、または欠失の存在(そのような欠失が導入された場合には)を同定することによって、決定され得る。上記構築物内の配列と相補的でありかつ上記構築物の外側および標的遺伝子座にある配列と相補的である、プライマーもまた使用され得る。この様式で、相同組み換えが生じた場合には、相補鎖中に存在するプライマーの両方を有するDNA二重鎖のみを獲得し得る。上記プライマー配列または予測されるサイズの配列の存在を示すことによって、相同組み換えの発生が、支持される。
他の特定の実施形態において、本発明の方法は、変異原性因子を介する変異の意図的導入を包含する。当該分野で公知であり、本発明における使用のために適切な、変異原性因子の例としては、化学的変異原(例えば、DNAインターカレート剤、またはDNA結合化学物質(例えば、N−エチル−N−ニトロソウレア(ENU)、エチルメタンスルホネート(EMS)、マスタードガス、ICR191など))(例えば、E.C.Friedberg,G.C.Walker,W.Siede,DNA Repair and Mutagenesis,ASM Press,Washington DC(1995)参照)、物理的変異原(例えば、紫外線、放射線、X線)、生化学的変異原(例えば、制限酵素、DNA修復変異原、DNA修復インヒビター、およびエラープローンDNAポリメラーゼおよび複製タンパク質)、ならびにトランスポゾン挿入が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法に従って、培養中の細胞が、これらの因子のうちの1つに曝露され得、細胞表面上でのガラクトシダーゼα−1,3−ガラクトースの除去をもたらす任意の変異が、例えば、毒素Aに対する曝露を介して、選択され得る。
本発明の別の局面において、ブタ細胞が機能的α−1,3−GTの発現を欠くか否かを決定するための選択方法が、提供される。
別の実施形態において、その選択手順は、補体因子と、galα1,3galエピトープに対する自然抗体とを含む血清を使用して、実行され得る(例えば、Koikeら、Xenotransplantation 4:147−153,1997)。抗Gal抗体を含むヒトまたは非ヒト霊長類由来の血清に対して曝露すると、galα1,3galエピトープを示す細胞における特異的抗体結合および補体活性化に起因して、細胞溶解が引き起こされ得る。従って、α−1,3−GTが欠損した細胞は、生きたままであり、従って、選択され得る。
機能的α−1,3GTの発現を欠くと考えられるブタ細胞は、さらに特徴付けられ得る。そのような特徴付けは、以下の技術(PCR分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、特異的レクチン結合アッセイ、および/または配列決定分析が挙げられるが、これらに限定されない)によって達成され得る。
なお別の局面において、本発明は、α−1,3−GT遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性にされた生きたブタを生産するための方法を提供する。一実施形態において、そのブタは、α−1,3−GT遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性にされたブタ細胞に由来するドナー核を用いてクローニングすることによって生産される。一実施形態において、α−1,3−GT遺伝子の両方の対立遺伝子は、遺伝的標的化事象を介して不活性化される。別の実施形態において、α−1,3−GT遺伝子の両方の対立遺伝子は、点変異の存在に起因して不活性化される。別の実施形態において、一方の対立遺伝子は、遺伝的標的化事象によって不活性化される一方で、他方の対立遺伝子は、点変異によって不活性化される。さらなる実施形態において、一方の対立遺伝子は、遺伝的標的化事象によって不活性化され、他方の対立遺伝子は、α−1,3−GT遺伝子のエキソン9の2番目の塩基におけるTからGへの点変異の存在に起因して不活性化される。特定の実施形態において、一方の対立遺伝子は、エキソン9に指向される標的化構築物を介して不活性化され(図6)、他方の対立遺伝子は、α−1,3−GT遺伝子のエキソン9の2番目の塩基におけるTからGへの点変異の存在に起因して不活性化される。別の実施形態において、このようなブタをクローニングする方法は、以下の工程を包含する:卵母細胞から除核する工程、その卵母細胞と、α−1,3−GT遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されたブタ細胞に由来するドナー核とを融合する工程、およびその核移入によって得られた胚を、代理母に移植する工程。
本発明は、体細胞核移入を介して、機能的α−1,3−GT遺伝子を欠くブタをクローニングするための方法を提供する。一般に、そのブタは、以下の工程を包含する核移入プロセスによって生産され得る:ドナー核の供給源として使用される所望の分化したブタ細胞を得る工程;ブタから卵母細胞を得る工程;その卵母細胞から除核する工程;その所望の分化した細胞または細胞核を、その除核した卵母細胞に移入して(例えば、融合または注入によって)、NTユニットを形成する工程;得られたNTユニットを活性化させる工程;およびその培養NTユニットを宿主ブタに移入して、よって、そのNTユニットを、胎仔へと発生させる工程。
別の局面において、本発明は、機能的α−1,3−GTのあらゆる発現を欠いた生きたブタ(このブタは、α−1,3−GT遺伝子についてヘテロ接合性の雄ブタと、α−1,3−GT遺伝子についてヘテロ接合性の雌ブタとを交配することによって提供される)を生産するための方法を提供する。一実施形態において、そのブタは、α−1,3−GT遺伝子の一方の対立遺伝子の、その対立遺伝子の発現を防止するような遺伝的改変に起因して、ヘテロ接合性である。別の実施形態において、そのブタは、α−1,3−GT遺伝子の一方の対立遺伝子における点変異の存在に起因して、ヘテロ接合性である。別の実施形態において、その点変異は、α−1,3−GT遺伝子のエキソン9の2番目の塩基におけるT→Gの点変異であり得る。1つの具体的実施形態において、機能的α−1,3−GTのあらゆる発現を欠くブタ動物を生成する方法が提供され、ここでα−1,3−GT遺伝子のエキソン9の2番目の塩基においてT→Gの点変異を含む雄ブタが、α−1,3−GT遺伝子のエキソン9の2番目の塩基においてT→Gの点変異を含む雌ブタと交配される。
本発明の一局面において、α−1,3−GT遺伝子の一方の対立遺伝子が、遺伝子標的化事象を介して不活性化されるブタ動物が、提供される。本発明の別の局面において、α−1,3−GT遺伝子の両方の対立遺伝子が遺伝子標的化事象を介して不活性化されているブタ動物が提供される。一実施形態において、その遺伝子は、相同組換えを介して標的化され得る。他の実施形態において、その遺伝子は破壊され得る。すなわち、遺伝コードの一部が変化され得、それによって、その遺伝子のそのセグメントの転写および/または翻訳が影響を受け得る。例えば、遺伝子の破壊は、置換、欠失(「ノックアウト」)または挿入(「ノックイン」)の技術を通じて起こり得る。望ましいタンパク質のためのさらなる遺伝子または存在する配列の転写を調節する調節配列が、挿入され得る。
本発明は、α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている生存ブタを最初に提供する。本発明はまた、異物移植のために有用である、このようなブタ由来の器官、組織、および細胞を提供する。
細胞は、広範な方法で順番に宿主に投与され得る。好ましい投与様式は、坐薬経由、経皮経由、鼻腔スプレー経由、外科的移植片経由、内部外科的塗擦経由、輸液ポンプ経由、またはカテーテル経由を含む、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮内投与、硬膜外投与、脊髄内投与、胸骨内投与、関節内投与、滑液包内投与、くも膜下(intrathecal)投与、動脈内投与、心臓内投与、筋内投与、鼻腔内投与、皮下投与、眼窩内投与、嚢内投与、局所投与、経皮貼布投与、直腸経由投与、膣投与または尿道投与である。1つの実施形態では、薬剤およびキャリアは、徐放処方物(直接的な組織注射、またはボーラス、移植物、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子もしくはナノスフェア)で投与される。
(初代ブタ胎児線維芽細胞の単離およびトランスフェクション)
胎児線維芽細胞(PCFF4−1〜PCFF4−10)を、妊娠の33日目に同じ妊娠の10の胎児から単離した。頭および内臓を除去した後、胎児をハンクス平衡塩溶液(HBSS;Gibco−BRL、Rockville、MD)で洗浄し、20mlのHBSS中に配置し、そして小手術用ハサミで刻んだ。組織をペレット化し、そして50mlのチューブに、胎児あたり40mlのDMEMおよび100U/mlのコラゲナーゼ(Gibco−BRL)中に再懸濁した。チューブを、振盪水浴中、37℃で40分間インキュベートした。消化された組織を、3〜4分間沈降させ、そして細胞が豊富な上清液を、新たな50mlチューブに移し、そしてペレット化した。細胞を、次いで、10%ウシ胎児血清(FCS)、1×非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウムおよび2ng/ml bFGFを含むDMEMの40ml中に再懸濁し、10cmディッシュ中に播種した。すべての細胞を、集密に到達する際に凍結保存した。SLA−1細胞〜SLA−10細胞を、妊娠28日の10の胎児から単離した。胎児は、過剰の熱を生成しないように湾曲した手術用鉗子をゆっくりと用い、60メッシュの金属スクリーンを通してすりつぶした。細胞懸濁液を、次いで、ペレット化し、そして10%FCS、1×非必須アミノ酸、2ng/ml bFGF、および10μg/mlゲンタマイシンを含むDMEMの30ml中に再懸濁した。細胞を、10cmディッシュ中に接種し、1〜3日培養し、そして凍結保存した。トランスフェクションには、10μgの線状化ベクターDNAを、エレクトロポーレーションにより、2百万の細胞中に導入した。トランスフェクションの48時間後、トランスフェクトされた細胞を、48ウェルプレート中に、ウェルあたり2,000細胞の密度で接種し、そして250μg/mlのG418で選択した。
2つのα−1,3−GTノックアウトベクターpRL654およびpPL657を、2つの初代ブタ胎児線維芽細胞SLA1−10細胞およびPCFF4−2細胞の同系DNAから構築した。イントロン8およびエキソン9の大部分を含む6.8kbのα−1,3−GTゲノムフラグメントを、SLA1−10細胞およびPCFF4−2細胞の精製DNAから、それぞれ、PCRによって生成した。エキソン9の5’末端にある唯一のEcoRV部位を、SalI部位に変換し、そして1.8kbのIRES−neo−ポリAフラグメントをこのSalI部位中に挿入した。IRES(内部リボソーム侵入部位)は、neoタンパク質の翻訳開始部位として機能する。従って、両ベクターは、4.9kbの5’組換えアーム、および1.9kb 3’組換えアームを有している(図6)。
およそ1,000の細胞を、5μlの胚性溶解緩衝液中(ELB)(40 mM Tris、pH 8.9、0.9% Triton X−100、0.9% NP40、0.4mg/ml プロテイナーゼK)中に懸濁して、15分間に亘って65℃に亘ってインキュベートし、それら細胞を溶解して、10分間に亘って95℃で加熱して、プロテイナーゼKを不活性化した。3’PCR分析のために、フラグメントを、反応体積25μl中で、以下のパラメータを用いてExpand High Fidelity PCR system(Roche Molecular Biochemicals)を使用して増幅した:94℃で1分間、60℃で1分間、および72℃で2分間を35サイクル。LR−PCRのために、フラグメントを、反応体積50μl中で以下のパラメータを用いてTAKARA LA system(Panvera/Takara)を使用して増幅した:94℃で10秒間、65℃で30秒間、68℃で10分間(1サイクルごとに+20秒間)を30サイクルした後に、68℃で7分間の最終1サイクル。精製したDNAについて3’PCRおよびLR−PCRの条件は、同じであるが、但し、1μlの精製DNA(30μg/ml)を、4μl ELBと混合した。
およそ106細胞を、溶解緩衝液(10mM Tris、pH7.5、10mM EDTA、10mM NaCl、0.5%(w/v)Sarcosyl、1mg/mlのプロテイナーゼK)中で一晩、60℃で溶解し、そのDNAをエタノールで沈殿させた。次いで、このDNAを、BstEIIで消化して、1%アガロースゲル上で分離した。電気泳動の後で、そのDNAを、ナイロンメンブレンに移して、3’末端ジゴキシゲニン標識プローブで調べた。化学発光基質システム(Roche Molecular Biochemicals)を用いてバンドを検出した。
抗生物質(G418)耐性コロニーを、neo442SおよびαGTE9A2と順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用する3’PCRによってスクリーニングした。Neo442Sは、neo遺伝子の3’末端に存在しており、そして、αGTE9A2は、3’組換えアームの外側に位置づけられる配列中のエキソン9の3’末端に存在する(図6)。したがって、α1,3GT遺伝子座における首尾良い標的化を介してのみ、予測された2.4kb PCR産物を取得された。4つの異なる細胞株における総数にして7つのトランスフェクションから、1105個のG418耐性コロニーが精選され、そのうちの100(9%)が、その最初の3’PCRスクリーン(範囲2.5〜12%)におけるα1,3GT遺伝子破壊についてポジティブであった。以下のコロニー、657A−A8、657A−I6、および657A−I11は、予測された2.4kbのバンド示し、他方、コントロールのPCFF4−6および別のG418耐性コロニーである657A−P6は、ネガティブであった。3’PCRポジティブコロニーの各々の一部分を、NT実験におけるその後の使用のために、数個の小さなアリコートで、直ぐに凍結し、他方、残りの細胞を、ロングレンジPCR(LR−PCR)およびサザンブロット分析のために増殖させた。
(α1,3GT遺伝子についてヘテロ接合性であるブタ細胞の産生)
ヘテロ接合性のα1,3GTノックアウト胎仔線維芽細胞(657A−I11 1−6)を、上述のように妊娠32日目に単離した(Daiら. Nature Biotechnology 20: 451 (2002)を参照のこと)。ATG(開始コドン)標的化α1,3GTノックアウトベクター(このベクターはまた、neo遺伝子を含む)を、α1,3GT遺伝子の第2対立遺伝子をノックアウトするように構築した(pPL680)。これらの細胞を、pPL680を用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトして、精製したC. difficile毒素A(上述)を有するα1,3GTネガティブ表現形について選択した。
(α1,3GT遺伝子についてヘテロ接合性であるブタ細胞についてのC. difficile毒素Aを用いる選択)
(毒素A細胞毒性曲線)
ブタ細胞(PCFF4−6)を、10倍連続希釈した毒素A(0.00001μg/ml〜10μg/ml)に1時間〜一晩曝露した。細胞を、24ウェルプレート中で培養して、37℃で1時間に亘ってまたは一晩、この毒素とともにインキュベートした。この曝露の結果を、表2で詳細に示した。明らかに、1μg/mlを上回る毒素Aに対する1時間の曝露によって、90%を超える細胞に対して細胞毒性効果を生じた。したがって、1μg/mlでのまたはそれよりも僅かに濃い濃度の毒素Aを、遺伝的に改変された細胞の選択について選んだ。
gal α1,3GT遺伝子の1つの対立遺伝子における以前に同定された標的化ノックアウトを含むブタ胚(I−11:1−6)(Daiら)に由来する、ばらばらにした細胞を、エレクトロポレーションによって10μgの線形ベクターDNA(プロモーターtrap)を用いてトランスフェクションした。48時間後に、それらの細胞を、1ウェル当たり2000細胞の密度で48ウェルプレートに播種し、そして、250μg/ml G418を用いて選択した。トランスフェクションの5日後に、培地を、ウェルから取り出し、そして、培養培地(2.8ng/mlbFGFおよび20% FCSを添加したDMEM高グルコース)中の2μg/mlの毒素Aで入れ替えた。細胞を37℃で2時間に亘って毒素Aの選択効果まで曝露した。この毒素A含有培地を、プレート表面から放出された影響を受けたあらゆる細胞とともに取り出し、残りの細胞を新しい培地で洗浄し、そして、毒素Aを含まない培地で置き換えた。10日後に、細胞を、37℃で2時間に亘って培地中で1.3μg/mlの毒素Aに再度曝露した。この培地、毒素A、および溶液中のあらゆる細胞を取り除き、残った細胞を洗浄し、そして、その培地を入れ替えた。
補体固定アッセイを、4体の胎仔すべてに由来する細胞について実行した。この補体溶解アッセイを、αgal発現の欠如についてのバイオアッセイとして展開した。ヒト血清は、α−galに対する高レベルの予め形成された抗体ならびに補体調節タンパク質(C3経路)の完全なポートフォリオを含む。細胞の表面においてα−galが存在していると、抗α−gal抗体が結合する場合に、補体カスケードを活性化して、そして、補体媒介性細胞溶解を生じる。α−galネガティブ細胞は、補体媒介性溶解に対して耐性である。これらの3つの別個の試験において、B1細胞およびコントロールブタ細胞を、ヒト血清+補体に曝露し、そして、アッセイを、α−gal誘導性補体媒介性細胞溶解に対する感受性または耐性を評価するために実施した。このアッセイを、B1−1細胞、B1−2細胞およびB1−4細胞、ならびに、ヘテロ接合性GT KO(ノックアウト)細胞(B1−3、galポジティブ)を用いて、そして、コントロールとして野生型α−gal(+)PCFF4−6ブタ細胞を使用して、実施した。細胞を、3つの処置のうちの1つに対して曝露した。2つのネガティブコントロールである、ウシ血清アルブミン(BSA)、および熱不活性化ヒト血清(HIA−HS)は、いかなる機能性補体タンパク質も含まず、したがって、いかなる有意な細胞溶解をも引き起こすとは予測されなかった。第3の処置である非熱不活性化ヒト血清(NHS)は、機能性ヒト補体ならびに抗gal特異的抗体を含み、したがって、ガラクトースα1,3ガラクトースをそれらの細胞表面上に有する細胞を溶解すると予測された。
核移入のための細胞の調製。ドナー細胞を、上記に一般的に記載されるように、α1,3GT欠損性についてホモ接合性の細胞を生成するために遺伝子操作した。核移入を、核ドナー(本明細書中上記で詳細に記載されるように生成した)として毒素A(トキシンA)選択ブタ線維芽細胞を使用する、当該分野で周知の方法によって行った(Daiら、Nature Biotechnology 20:251−255,2002;およびPolejaevaら、Nature 407:86−90,2000を参照のこと)。
生きたα−1,3−GT dKO(ダブルノックアウト)ブタを核移入により生産しようとする最初の試みにおいて、合計16個の胚移入を、遺伝子操作したドナー細胞を用いて行った。9頭の最初の妊娠が樹立されたが、妊娠75日目を超えると、2頭しか残らなかった。5頭の子ブタが2002年7月25日に生まれた。1頭のブタは産まれて直ぐに死亡し、さらに4頭は、生きたまま産まれ、正常に見えた(図4)。
・(実施例5)
(ホモ接合性α1,3GTノックアウトブタの分析)
尾部線維芽細胞および臍組織切片標本を、全5匹のダブルノックアウト仔ブタから得、先に記載したようにGS−IB4レクチンを用いて染色した。染色は観察されなかった。このことは、これらの動物からの組織表面におけるガラクトースα1,3ガラクトースエピトープの完全な欠失を示す(データは示さず)。死亡した仔ブタ(761−1)から単離した大動脈内皮細胞および筋肉線維芽細胞および尾部線維芽細胞は、GS−IB4レクチン染色はネガティブだった。仔ブタ761−1からの筋肉繊維芽細胞のFACS分析もまた、GS−IB4結合についてネガティブな結果を示した。肝臓、腎臓、脾臓、皮膚、小腸、筋肉、脳、心臓、膵臓、肺、大動脈、舌、臍、および尾部の組織切片を、仔ブタ761−1から取得した。これらは、全て、GS−IB4染色でネガティブであった。このことは、検出可能な細胞表面α1,3Galエピトープの完全な欠如を示している。(Phelps et al.,Science 299: 411−414,2003 including figure S3)。
(実施例6) (ダブルノックアウト(DKO)ブタの小集団(miniherd)を確立するためのヘテロ接合性α1,3GTシングルノックアウト(SKO)雄性ブタおよび雌性ブタの交配(breeding))
サザンブロットで確認したクローン化GT−SKO雌性ブタ計29匹、およびサザンブロットで確認したGT−SKO雄性ブタ計25匹が、現在まで生まれた。これらの雄性および雌性のヘテロ接合性(単一遺伝子α1、3GT ノックアウトブタ)を、自然交配および人工受精(AI)によって繁殖させ、前臨床試験およびヒト臨床試験において使用するためのDKOブタ集団を生成した。本発明者らは、13同腹仔から16匹のα,3−GT DKO 仔ブタを生成した。
・本発明は、実施形態を参照して記載されている。本明細書中に記載される一般的な発明の他の実施形態およびその改変は、当業者にとって明らかであり、そしてそれらはすべて、本発明の範囲内にあると見なされる。
Claims (11)
- 機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠くブタの産生のための方法であって、
該α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)遺伝子の不活化についてヘテロ接合性である雄のブタを、該α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)遺伝子の不活化についてヘテロ接合性である雌のブタと交配させる工程;
を包含し、
一方または両方のブタは、該α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)遺伝子の対立遺伝子における点変異の存在に起因してヘテロ接合性であり、該点変異は該α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)遺伝子の不活化を引き起こす、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠くブタ同士を交配させて、機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠くブタの集団を生成する工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記雄のブタまたは雌のブタのうちの少なくとも一方が、遺伝子標的化事象を介して不活化された少なくとも1つのα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)遺伝子対立遺伝子を含む、方法。
- 請求項3に記載の方法であって、
前記機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠くブタ同士を交配させて、機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠くブタの集団を生成する工程、
をさらに包含する、方法。 - 機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠く天然に存在しないブタであって、該α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)の少なくとも一方の対立遺伝子が点変異を介して不活性になっている、ブタ。
- 請求項5に記載のブタ同士を交配させることにより生成されたブタの集団であって、該集団におけるブタは、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠く、集団。
- 請求項5に記載のブタから得られた細胞、組織、または器官であって、該ブタは、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠く、細胞、組織、または器官。
- 請求項5に記載のブタであって、前記α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)の少なくとも一方の対立遺伝子が遺伝子標的化事象を介して不活性になっている、ブタ。
- 請求項8に記載のブタ同士を交配させることにより生成されたブタの集団であって、該集団におけるブタは、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠く、集団。
- 請求項8に記載のブタから得られた細胞、組織、または器官であって、該ブタは、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠く、細胞、組織、または器官。
- 請求項1〜4のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記機能的α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)のいかなる発現をも欠くブタは、ホモ接合性α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α−1,3−GT)ノックアウトブタである、方法。
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