JP2007512027A - トランスジェニック動物の産生における干渉rnaの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するために少なくとも1つの干渉RNA分子を発現する細胞及び動物、及び細胞及び動物を産生する方法に関する。本発明はさらに、新規なiRNA分子、及びiRNA分子を産生するためのDNAテンプレートに関する。
トランスジェニック細胞及び動物の潜在能力を調査用途及び治療用途の両方に利用するために、外因性及び内因性の遺伝子転写物の発現を制御するための実用的な技術が存在しなければならず、内因性又は外因性のいずれかの遺伝子機能が遺伝的に排除されている動物を産生するためにこれを適用することができる。現在の技術は、それらがこれらの必要条件を満たすという能力において制限されている。
細胞及び動物中のタンパク質の発現を抑制するための改良された技術が提供される。一実施形態では、本発明は、細胞又は動物のホメオスタシスに最小限の効果を有する標的化された挿入ベクターの使用を含む、タンパク質の発現を抑制するための新規方法及び材料を提供する。特に、標的タンパク質を抑制するためのiRNAをコードするDNAテンプレートは、(i)細胞の内因性制御要素(例えば、内因性プロモーター)を使用すること、(ii)遺伝子のイントロン配列内に標的化されること、及び/又は(iii)細胞のホメオスタシスを破壊しないこと、が提供される。第2の実施形態では、新規iRNA分子及びそれらをコードするDNA配列、及びそれらを産生するための方法が提供される。一例において、両方の鎖が抑制されるタンパク質の標的mRNAに対して相補性であり、ヘアピンの形態であり得るiRNA分子(本明細書中「cTarget」と称される)が提供される。第3の実施形態では、共通の相同性配列を有し、遺伝子の発現を機能的に排除可能な特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するiRNA分子が提供される。
細胞におけるタンパク質発現の抑制のための改良された技術が提供される。一実施形態では、本発明は、細胞のホメオスタシスに最小限の効果を有する標的化挿入ベクターの使用を含む、タンパク質発現の抑制のための新規方法及び物質を提供する。特に、iRNAをコードして標的タンパク質を抑制するDNAテンプレートは、(i)細胞の内因性制御要素(例えば、内因性プロモーター)を使用すること、(ii)遺伝子のイントロン配列内に標的化されること、及び/又は(iii)細胞のホメオスタシスを破壊しないこと、が提供される。第2の実施形態では、新規iRNA分子及びそれらをコードするDNA配列、及びそれらを産生するための方法が提供される。一例において、両方の鎖が抑制されるタンパク質の標的mRNAに対して相補性であり、ヘアピンの形態であり得るiRNA分子(本明細書中「cTarget」と称される)が提供される。第3の実施形態では、共通の相同性配列を有し、遺伝子の発現を機能的に排除可能な特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するiRNA分子が提供される。
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語及び専門的用語は、当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
(A.iRNA設計)
本発明の1つの局面では、両方の鎖が標的配列に対して相補的なds iRNA分子(cTarget)が提供される。二本鎖iRNA(ds iRNA)分子の細胞内処理に起因して、分子の2つの鎖の1つのみが、標的mRNAを阻害するように実際に機能する。本発明は、両方の鎖が機能性であり得る(すなわち、標的RNA配列と結合可能な)新規ds iRNA分子を提供する。この発見の前に、iRNA分子は、iRNA分子の1つの鎖のみが機能性(すなわち、典型的には、1つの鎖が標的配列と実質的に同一(すなわち「センス」配列)であり、他の鎖が標的配列と相補性(すなわち「アンチセンス」配列)であるように設計され、機能的でない鎖がインビボで加工される場合、阻害効果は生じなかった。
マイクロ−RNA(miRNA)は、遺伝子の転写後調節に関与する小さな内因性RNAである。このようなmiRNAの1つ(mir30)は、Droshaを介して、核から出されるさらに小さなヘアピン構造(pre−mir30)へと処理される大きな転写物(primir30)として記載される。細胞原形質では、pre−mir30は、Dicerによってさらに処理され、成熟mir30を生じる。このプロセスは当該技術分野で知られている(例えば、Zeng Y,Cullen BR.Structural requirements for pre−microRNA binding and nuclear export by Exportin 5.Nucleic Acids Res.2004 Sep 08;32(16):4776−85;Zeng Y,Cullen BR.Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells.RNA.2003 Jan;9(1):112−23を参照)。pri−mir30の一部分のMFold(M.Zuker.Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.Nucleic Acids Res.31(13),3406−15,(2003)[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi])による推定予測構造を以下に示す。
一実施形態では、ds iRNA分子は、第2のcTarget鎖配列に対してハイブリダイズするヌクレオチドの第1のcTarget鎖を含有することができる。cTarget鎖は、少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50のヌクレオチドを含有することができ、特に、19〜32ヌクレオチド、又は21〜23ヌクレオチド長を含有することができる。
一実施形態では、cTarget配列は、同じ標的配列に対して相補性であることができる。mRNAに対して相補的な配列を用いることによって、ステムの両方の鎖が標的mRNAに対して相補性であるiRNA分子(例えばヘアピン)を設計することができる。一実施形態では、このようなヘアピンはDrosha基質として役立つことができ、得られた構造は開裂して2つの鎖を産生することができ、これらの鎖のそれぞれは標的mRNAに対して阻害効果を発揮することができる。
上に記載されるストラテジーに加えて、2つのmRNAの一部分のアンチセンス鎖を組み合わせて、2つのmRNAを潜在的に標的化する1個のiRNA分子(例えばヘアピンiRNA分子)を作成することができる。標的配列のそれぞれに対して相補的な配列(cTarget)が最初に決定され、次いで、各cTarget配列のセグメントを共にスプライシングすることができる。例えば、第1の標的に対する少なくとも25、50、100、200、300、400又は500ヌクレオチド長(cTarget1)は、第2の標的に対する少なくとも25、50、100、200、300、400又は500ヌクレオチドのcTarget(cTarget2)と結合することができる。ヌクレオチドのこの配列を、共にハイブリダイズしてds iRNA分子を形成する部分を決定するための評価することができる。一実施形態では、これらの配列は、自己ハイブリダイゼーションの領域を決定するコンピュータープログラム、例えば、1つの特定の実施形態では、M.Zuker Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.Nucleic Acids Res.31(13)3406−15, (2003),[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi]に記載されるようなMFoldソフトウェアに入力することができる。次いで、cTarget1とcTarget2間のハイブリダイゼーションの領域を同定し、細胞における標的mRNAの抑制についてを試験することができる。
さらなる実施形態では、ds iRNA分子は、両方の鎖が同一であるか又は機能的に同一である回帰性cTarget配列であることができる。一実施形態では、cTarget配列が分析され、例えば、コンピュータープログラム(例えばDNA Strider)を経て回帰性配列を同定することができる。一実施形態では、標的mRNAに対して相補的な配列が最初に決定される、回帰性配列を同定するための方法が提供される。次いで、この配列を少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50のヌクレオチド、特に、19〜32ヌクレオチド、又は21〜23ヌクレオチド長の回帰性配列の存在について分析することができる。代替の実施形態では、このような配列を、例えば、コンピュータープログラム(例えばDNA Striderソフトウェア)を用いて分析することができる。このような回帰性iRNA分子は、iRNA加工において内因性鎖選択の効果を本質的に排除する。
他の実施形態では、2つのcTarget鎖、又はハイブリダイゼーションが望ましい任意の配列のハイブリダイゼーションを最適化するための方法が提供される。非ワトソン−クリック塩基対がRNA分子中で可能なため、推定配列中のシトシン残基はウラシル残基と交換することができる。これらのウラシル残基は、グアニン又はアデノシンのいずれかに潜在的に結合し、両鎖間のハイブリダイゼーション度が潜在的に増加する。一実施形態では、Drosha基質は、このストラテジーを用いてRNAi標的化における顕著な変更なく改変することができる。
さらに、阻害RNAは、個々の阻害RNAをアレイ又はクラスターに付加することによって構築することができる。種々の構造モチ−フを使用することができる。1つのこのようなモチ−フは、リンカー配列を有して又は有さずにタンデムに結合した個々のヘアピンRNAのクラスターである。このような構造は、配列において放射相称(すなわち、放射状iRNA分子)を有さずに構造において放射相称を示すことができる(例えば、図2参照)。あるいは、二本鎖RNAは、一連のスペーサー配列と結合して、ほぼ線形又は湾曲した構造を作り出すことができる(例えば、図3参照)。これらの構造は、スペーサー配列を用いて又は用いずに種々のオリゴヌクレオチドを結合し、次いでリンカー配列を用いて又は用いずにこれらのオリゴヌクレオチドの相補性配列を逆順に付加するすることによって作り出すことができる。それに加えて、種々の構造ストラテジーを組み合わせて複雑な構造を作り出すことができる。放射及びクラスター状阻害iRNA及び線形クラスター状阻害iRNA構造は両方とも、小さな干渉RNAを介して細胞mRNAの標的化阻害を媒介することができる。
(アンチセンスオリゴヌクレオチド)
一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、あらかじめ選択された核酸配列を用いた特異的なハイブリダイゼーションを成し遂げるために、同一性、数及びサイズにおいて十分な1つ以上のヌクレオチド配列を含む。本発明に従って使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、好ましくは生理学的条件下でアンチセンスオリゴヌクレオチドがmRNAと安定なハイブリッドを形成し、mRNA配列の翻訳を阻害するように、標的核酸配列(適切には、標的細胞又は有機体中のmRNA)に対して十分に相補性であるように選択される配列を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子配列の一部分に対して100%相補性であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、標的核酸配列に対して少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%相補性であることができる。
本発明において使用可能な核酸分子はさらに、リボザイムを含む。一般的に、リボザイムは、リボザイムが結合した核酸配列の開裂、スプライシング、又は結合に通常は関連する酵素活性を有するRNA分子である。リボザイムについての典型的な構造はRNA分子を含むが、リボザイムはさらに、DNA分子が基質として役立つ反応を触媒することができる。以下の2個の別個の領域をリボザイムにおいて同定することができる:特定の核酸配列に対するハイブリダイゼーションの際にリボザイムに特異性を与える結合領域、及び開裂、結合又はスプライシングの活性をリボザイムに与える触媒領域。細胞内で活性なリボザイムはcisで作用し、1回のターンオーバー反応のみを触媒し、反応中に通常は自己改変される。しかし、リボザイムはtransで作用するように設計することもでき、真実の触媒様式では、1回よりも多いターンオーバーを有し自己改変も起こらない。リボザイムの触媒的性質によれば、1個のリボザイム分子は多くの標的核酸を開裂させ、アンチセンス処理に必要な濃度よりも比較的低い濃度で治療活性が達成される(例えば、Wo96/23569を参照)。
RNA干渉は、それらの「標的」核酸配列に対して配列特異的な相同性を有する二本鎖RNA(dsRNA)分子によって媒介される(Caplen.,N.J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9742−9747(2001))。Drosophila細胞フリ−溶菌液における生化学研究は、本発明の特定の実施形態では、RNA依存性遺伝子サイレンシングのメディエ−タ−が21〜25ヌクレオチドの「小さな干渉」RNA二本鎖(siRNA)であることを示す。従って、siRNA分子は、適切には本発明の方法において使用される。siRNAは、Dicerとして知られるRNase酵素によるdsRNAの処理から誘導される(Bernstein,E.,et al.,Nature 409:363−366(2001))。siRNA二本鎖産物は、マルチ−タンパク質siRNA複合体(RISC(RNAにより誘発されるサイレンシング複合体)と呼ばれる)に補充される。特定の理論によって束縛されることを望むものではなく、RISCは標的核酸(適切にはmRNA)へ導かれ、siRNA二本鎖は配列特異的な様式で触媒様式における開裂を媒介することに相関関係にあると考えられている(Bernstein,E.,et al.,Nature 409:363−366(2001);Bourla,A.,et al.,Curr.Biol.11:1776−1780(2001))。
逆位反復は、互いに少なくとも部分的に相補性であり、1つの領域が他の領域に対して相対的に逆なように配向している2つの領域を含有する一本鎖核酸分子を含む。この配向は、互いに塩基対について2つの相補的な配列を可能にし、それによってヘアピン構造を形成する。この逆位反復の2つの複製物は連続的である必要はない。ヘアピンを形成する配列間に「n」個のさらなるヌクレオチドが存在することができ、ここで、「n」は任意のヌクレオチド数である。例えば、nは少なくとも1、5、10、25、50、又は100ヌクレオチド、又はそれ以上であることができ、これらの別個の値内の任意のヌクレオチド数であることができる。
Paddison,P.J.,et al.,Genes & Dev.16:948−958(2002)は、RNA干渉に影響を与えるための手段としてヘアピンに折りたたまれた小さなRNA分子を使用した。このようなショートヘアピンRNA(shRNA)分子はさらに、本発明の方法において有利に使用される。本明細書中に記載される逆位反復に対して機能的に同一な、機能性shRNAのステム及びループの長さは逆位反復からそれらを区別する。一実施形態では、ステム長さは、少なくとも21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50ヌクレオチド長であることができ、ループサイズは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40又は50ヌクレオチド長であることができる。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、これらのshRNAはDicer RNaseのdsRNA産物に似ており、任意の事象では、特定の遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有すると考えられている。ヘアピンRNA構造は、小さな干渉RNAを経て細胞RNAの標的化破壊を媒介することができる(例えば、図1参照)。
使用可能な小さなRNAの別のグループは、小さな一時制御されたRNA(stRNA)である。一般的に、stRNAは、約20〜約30ntを含む(Banerjee and Slack,Bioessays 24:119−129(2002))が、任意のサイズのstRNAをさらに本発明に従って使用することができる。siRNAとは異なり、stRNAは、mRNAを分解することなく翻訳を開始した後、標的mRNAの発現を下方修正する。
(A.構築物の設計)
本発明は、iRNA分子を発現するための新規構築物及びDNAテンプレート、及びこのような構築物を作成するための方法を提供する。
さらなる実施形態では、iRNA分子を産生するために使用されるDNAテンプレートは、標的遺伝子のイントロン又はエキソン内に組み込むために設計された(合成)イントロン中に埋め込むことができる。これらの設計されたイントロンは、任意の内因性イントロンに由来することができる。一実施形態において、内因性イントロンは、その最小機能成分に減らすことができる。別の実施形態では、制限部位は、合成イントロン内で設計することができる。一実施形態では、制限酵素部位は、DNAテンプレートを合成イントロンの中に配置することを可能にする。さらなる実施形態では、合成イントロンは、内因性遺伝子の機能を破壊することなく、内因性エキソン又はイントロンに挿入することができる。
合成イントロンを任意の既知のイントロンに基づいて設計することができる。一実施形態では、既知のイントロンは当該技術分野で十分に特性決定されており、iRNA分子を産生するDNAテンプレートは、イントロンの機能に影響を与えないことが知られているイントロン内の部位に挿入することができる。簡単に言うと、制限酵素部位はイントロン内に設計することができ、DNAテンプレートはある位置(イントロン機能に必須ではない位置)でイントロン内に挿入することができる。さらに、制限酵素部位は、標的エキソン又はイントロン内に合成イントロンを標的化挿入可能にするためにイントロンの配列5’又は3’に付加することができる。1つの特定の実施形態では、合成イントロンは5’末端に少なくとも1つの制限酵素部位、イントロンスプライスドナー部位、少なくとも1つのiRNA分子を産生可能なDNAテンプレート、イントロンブランチ部位、イントロンスプライスアクセプター部位、及び3’末端に制限酵素部位を含有することができ、例えば、以下の図を参照:
本発明の実施形態では、DNAが共にスプライシングされ、特定のヌクレオチド配列を形成することができる。一実施形態では、相同組換えのために少なくとも5’標的化ア−ム、第1のヌクレオチド配列、場合により、リンカー配列、第1のヌクレオチド配列に実質的にハイブリダイズする第2のヌクレオチド配列、及び相同組換えのための3’標的化ア−ムを含有するDNAテンプレートが提供される。場合により、これらのDNAテンプレートはさらに合成イントロンへクローニングすることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、DNAテンプレート及び/又は合成イントロンの各成分のために合成することができ、制限酵素を用いて共にクローン化することができる。別の実施形態では、各成分は発現ベクター中で設計することができる。一実施形態では、ベクターは細胞内に導入され、それらの細胞の遺伝的改変を達成することができる。別の実施形態では、ベクターは線形であることができ、細胞に挿入することができる。
一実施形態では、約少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、又は100のiRNA分子をベクターにクローン化することができる。iRNA分子を含有するベクターは、さらに原核生物又は真核細胞細胞に導入し、又は挿入することができ、好ましくはiRNA分子の発現を生じる。一実施形態では、iRNA分子は、ベクター中のプロモーターに使用可能に結合することができる。プロモーターは外因性又は内因性プロモーターであることができる。代替の実施形態では、iRNA分子はプロモーターを含まないベクターにクローン化され、真核細胞のゲノムに挿入され、ここで、プロモーターを含まないベクターは、内因性遺伝子と関連するプロモーター及び/又は他の調節要素の制御下にある。特定の実施形態では、このようなプロモーターを含まないベクターは、細胞ホメオスタシス又は内因性遺伝子の機能を破壊しない。
真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」及び「エンハンサ−」要素を含む。プロモーター及びエンハンサ−は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するDNA配列のショートアレイからなる(Maniatis et al.,Science 236:1237[1987])。プロモーター及びエンハンサ−要素は、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、及びウイルス中の遺伝子を含む種々の真核生物源から単離された(類似した制御要素、すなわちプロモーターは、原核生物においても見出される)。特定のプロモーター及びエンハンサ−の選択は、どの細胞種を目的のタンパク質を発現するために使用するのかに依存する。いくつかの真核生物プロモーター及びエンハンサ−は、他のものが限定された細胞種のサブセットにおいて機能性であるのに反し、広範囲の宿主範囲を有する(総説として、Voss et al.,Trends Biochem.Sci.,11:287[1986];及びManiatis et al.(前出)を参照)。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサ−は、多くの哺乳動物種由来の広範囲の細胞種において非常に活性であり、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現のために広く使用される(Dijkema et al.,EMBO J.4:761[1985])。広範囲の哺乳動物細胞種において活性なプロモーター/エンハンサ−要素の2つの他の例は、ヒト延長因子1α遺伝子由来のもの(Uetsuki et al.,J.Biol.Chem.,264:5791[1989];Kim et al.,Gene 91:217[1990];及びMizushima and Nagata,Nuc.Acids.Res.,18:5322[1990]);及びニワトリ肉腫ウイルス機能(Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777[1982])及びヒトサイトメガロウイルス(Boshart et al.,Cell 41:521[1985])の長い末端繰り返しである。
一実施形態では、iRNA分子を含有するベクターの使用可能に結合したプロモーターは内因性プロモーターである。本実施形態の1つの局面では、内因性プロモーターは、その関連する遺伝子の連続的な転写を可能にする任意の非調節プロモーターであることができる。
ッサー2(GPS2)、リボソームタンパク質L21(RPL21)、コートマータンパク質複合体、サブユニットα(COPA)、Gタンパク質経路サプレッサー1(GPS1)、低分子リボ核タンパク質D2ポリペプチド(16.5kD)(SNRPD2)、リボソームタンパク質S29(RPS29)、リボソームタンパク質S10(RPS10)、リボソームタンパク質S9(RPS9)、リボソームタンパク質S5(RPS5)、リボソームタンパク質L28(RPL28)、リボソームタンパク質L27a(RPL27A)、タンパク質チロシンホスファターゼタイプIVA、メンバー2(PTP4A2)、リボソームプロットL36(RPL35)、リボソームタンパク質L10a(RPL10A)、IgGのFcフラグメント、レセプター、トランスポーター、α(FCGRT)、妊婦G10転写物(G10)、リボソームタンパク質L9(RPL9)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F0複合体、サブユニットc(サブユニット9)イソ型3(ATP5G3)、シグナル認識粒子14kD(相同性AluRNA−結合タンパク質)(SRP14)、mutL(大腸菌)ホモログ1(大腸癌、非ポリ−プ性2型)(MLH1)、染色体Iqサブテロマー配列D1S553./U06155、フィブロモジュリン(FMOD)、スピリットのアミノ末端エンハンサ−(AES)、Rho GTPase活性タンパク質(ARHGAP1)、非−POUドメイン含有、オクタマ−結合(NONO)、v−rafマウス肉腫3611ウイルス発癌遺伝子ホモログ1(ARAF1)、異種核リボ核タンパク質A1(HNRPA1)、β2−ミクログロブリン(B2M)、リボソームタンパク質S27a(RPS27A)、ブロモドメイン含有2(BRD2)、無精子症1因子(AZF1)、1,25ジヒドロキシビタミンD−3によって上方調節される(VDUP1)、セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター、クレードB(オボアルブミン)、メンバー6(SERPINB6)、デストリン(アクチン解重合因子)(ADF)、サイモシンβ−10(TMSB10)、CD34抗原(CD34)、スペクトリン、β、非赤血球1(SPTBN1)、血管関連の、遊走性の細胞タンパク質(AAMP)、主組織適合性複合体、クラスI、A(HLA−A)、MYC関連のZnフィンガータンパク質(プリン結合性転写因子)(MAZ)、SETトランスロケ−ション(骨髄性白血病関連の)(SET)、ペアードボックス遺伝子(無虹彩、角膜炎)(PAX6)、マウスにおいてZfp−36に対して相同性な亜鉛フィンガータンパク質(ZFP36)、FK506−結合タンパク質4(59kD)(FKBP4)、ヌクレオソーム組立てタンパク質1−様1(NAP1L1)、チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド(YWHAZ)、リボソームタンパク質S3A(RPS3A)、ADPリボシル化因子1、リボソームタンパク質S19(RPS19)、転写伸長因子A(SII)、1(TCEA1)、リボソームタンパク質S6(RPS6)、ADPリボシル化第3因子(ARF3)、モエシン(MSN)、B細胞インヒビターにおけるカッパ軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子、α(NFKBIA)、相補成分1、q亜成分結合タンパク質(C1QBP)、リボソームタンパク質S25(RPS25)、クラステリン(細胞溶解インヒビター、SP−40,40、硫酸化グリコプロテイン2、テストステロンを抑制された前立腺のメッセ−ジ2、アポリポーターンパクJ)(CLU)、ヌクレオリン(NCL)、リボソームタンパク質S16(RPS16)、ユビキチン−活性化酵素El(A1S9T及びBN75温度感受性相補性)(UBE1)、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶性、3(ガレクチン3)(LGALS3)、真核生物翻訳伸長1因子γ(EEF1G)、pim−1オンコジーン(PIM1)、S100カルシウム結合タンパク質A10、アネキシンIIリガンド、カルパクチンI(軽ポリペプチド(p11))、H2Aヒストンファミリー、メンバーZ(H2AFZ)、ADPリボシル化第4因子(ARF4)(ARF4)、リボソームタンパク質L7a(RPL7A)、主組織適合性複合体、クラスII、DQα1(HLA−DQA1)、FK506−結合タンパク質1A(12kD)(FKBP1A)、CD81抗原(抗増殖性抗体1の標的)(CD81)、リボソームタンパク質S15(RPS15)、X−ボックス結合タンパク質1(XBP1)、主組織適合性複合体、クラスII、DNα(HLA−DNA)、リボソームタンパク質S24(RPS24)、白血病関連リンタンパク質p8(スタスミン)(LAP18)、ミオシン、重ポリペプチド9、非筋肉(MYH9)、カゼインキナーゼ2、βポリペプチド(CSNK2B)、フコシダーゼ、α−L−1、組織(FUCA1)、ジアホラーゼ(NADH)(チトクロムb−5レダクターゼ)(DIA1)、シスタチンC(アミロイド脈管障害及び脳溢血)(CST3)、ユビキチンC(UBC)、ユビキノール−チトクロムcレダクターゼ結合タンパク質(UQCRB)、プロチモシン、α(遺伝子配列28)(PTMA)、グルタチオンS−トランスフェラーゼπ(GSTP1)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、βポリペプチド2−様1(GNB2L1)、ヌクレオホスミン(核小体リンタンパク質B23、ヌマトリン)(NPM1)、CD3E抗原、イプシロンポリペプチド(TiT3複合体)(CD3E)、カルパイン2、(m/II)大サブユニット(CAPN2)、NADHデヒドロゲナーゼ(ユビキノン)フラボタンパク質2(24kD)(NDUFV2)、熱ショック60kDタンパク質1(シャペロニン)(HSPD1)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、αを刺激する活性ポリペプチド1(GNAS1)、クラトリン、軽ポリペプチド(Lca)(CLTA)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、ミトコンドリアFl複合体、βポリペプチド、カルモジュリン2(ホスホリラ−ゼキナーゼ、δ)(CALM2)、アクチン、γ1(ACTG1)、リボソームタンパク質S17(RPS17)、リボソームタンパク質、大きい、P1(RPLP1)、リボソームタンパク質、大きい、P0(RPLPO)、サイモシン、β4、X染色体(TMSB4X)、異種核リボ核タンパク質C(C1/C2)(HNRPC)、リボソームタンパク質L36a(RPL36A)、グルクロニダーゼ、β(GUSB)、SRC、FGR、YESに関連したFYNオンコジーン(FYN)、プロチモシン、α(遺伝子配列28)(PTMA)、エノラ−ゼ1、(α)(ENO1)、ラミニンレセプター1(67kD、リボソームタンパク質SA)(LAMR1)、リボソームタンパク質S14(RPS14)、CD74抗原(主要組織適合性複合体の不変のポリペプチド、クラスII抗原関連)、エステラ−ゼD/ホルミルグルタチオンヒドロラ−ゼ(ESD)、H3ヒストン、ファミリー3A(H3F3A)、フェリチン、軽ポリペプチド(FTL)、Sec23(S.cerevisiae)ホモログA(SEZ23A)、アクチン、β(ACTB)、プレセニリン1(Alzheimer病3)(PSEN1)、インターロイキン1レセプター関連キナーゼ1(IRAK1)、Znフィンガータンパク質162(ZNF162)、リボソームタンパク質L34(RPL34)、ベクリン1(コイル状コイル、ミオシン−様BCL2−相互作用タンパク質)(BECN1)(ホスファチジルイノシトール4−キナーゼ、触媒的)αポリペプチド(PIK4CA)、IQのGTPアーゼ活性化タンパク質1(IQGAP1)、シグナルトランスデューサー、及び、転写3のアクティベーター(急性段階応答因子)(STAT3)、異種核リボ核タンパク質F(HNRPF)、推定翻訳開始因子(SUI1)、タンパク質転座複合体β(SEC61B)、ラス推定ホモログ遺伝子ファミリー、メンバーA(ARHA)、フェリチン、重ポリペプチド1(FTH1)、Rho GDP解離インヒビター(GDI)β(ARHGDIB)、H2Aヒストンファミリー、メンバーO(H2AFO)、アネキシンA11(ANXA11)、リボソームタンパク質L27(RPL27)、アデニリルシクラーゼ関連タンパク質(CAP)、フィンガータンパク質91(HPF7、HTF10)(ZNF91)、リボソームタンパク質L18(RPL18)、ファルネシルトランスフェラーゼ、CAAXボックス、α(FNTA)、ナトリウムチャネル、電位作動型、I形、βポリペプチド(SCN1B)、カルネキシン(CANX)、プロテオリピドタンパク質2(結腸上皮に豊富な)(PLP2)、アミロイドβ(A4)前駆体−様タンパク質2(APLP2)、膜電位依存性陰イオンチャネル2、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)アクティベーターサブユニット1(PA28α)(PSME1)、リボソームプロットL12(RPL12)、リボソームタンパク質L37a(RPL37A)、リボソームタンパク質S21(RPS21)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sサブユニット、ATPアーゼ、1(PSMC1)、主組織適合性複合体、クラスII、DQβ1(HLA−DQB1)、複製タンパク質A2(32kD)(RPA2)、熱ショック90kDタンパク質1、β(HSPCB)、チトクロムcオキシダーゼサブユニットVUI(COX8)、真核生物翻訳伸長1因子α1(EEF1A1)、SNRPN上流のリーディングフレーム(SNURF)、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶性、1(ガレクチン1)(LGALS1)、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)、ホスホグリセレートムターゼ1(脳)(PGAM1)、インターフェロンによって誘発された膜貫通タンパク質1(9−27)(ZFITM1)、ヌクレアーゼゲージ受感部結合タンパク質1(NSEP1)、溶質キャリア族25(ミトコンドリアキャリア;アデニンヌクレオチドトランスロケ−タ)、メンバー6(SLC25A6)、ADPリボシルトランスフェラーゼ(NAD+;ポリ(ADPリボ−ス)ポリメラーゼ)(ADPRT)ロイコトリエンA4ヒドロラ−ゼ(LTA4H)、プロフィリン1(PFN1)、プロサポシン(異型Gaucher病及び異型異染性ロイコジストロフィ−)(PSAP)、溶質キャリアファミリー25(糸粒体キャリア;アデニンヌクレオチドトランスロケーター)、メンバー5(SLC25A5)、β−2ミクログロブリン、IGF結合タンパク質7、リボソームプロットS13、Epstein−Barr Virus Small Rna−関連プロット、主組織適合性複合体、クラスI、CX58536)、リボソームプロットS12、リボソームプロットL10、形質転換関連プロット、リボソームプロットL5、転写コアクチベーターPc4、カテプシンB、リボソームプロットL26、「主組織適合性複合体、クラスI X12432」、Wilm S Tumor−Relatedプロット、トロポミオシンTm30nmCytoskeletal、リポソームタンパク質S4、X−結合した、リボソームプロットL37、Metallopanstimulin1、リボソームプロットL30、異種核リボ核タンパク質K、主組織適合性複合体、クラスI、EM21533、主組織適合性複合体、クラスI、EM20022、リボソームタンパク質L30ホモログ、熱ショックプロット70Kda、「ミオシン(軽鎖/U02629)」、「ミオシン(軽鎖/U02629)」、カルサイクリン、一本鎖Dna−結合プロットMssp−1、トリセホスフェートイソメラーゼ、NuMAプロット1、プロットキナーゼHt31Camp−依存性、チュービュリン、β2、カルモジュリンI型、リボソームプロットS20、転写因子Btf3b、グロビン、β、Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide CAlt.Splice2、ヌクレオシド
ジホスフェートキナーゼNm23−H2s、Ras関連C3ボツリウム毒素基質、活性化転写第4因子(タックス応答性エンハンサー要素B67)(ATF4)、プレフォジュリン(PFDN5)、N−myc下方修正(NDRG1)、リボソームタンパク質L14(RPL14)、ニカストリン(KIAA0253)、プロテアーゼ、セリン、11(IGF結合)(PRSS11)、KIAA0220タンパク質(KIAA0220)、撹乱3(Drosophila dshに対して相同)(DVL3)、基本のDrosophilaホモログのエンハンサー(ERH)、複数のスプライシングを有するRNA結合タンパク質遺伝子(RBPMS)、5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼ(ATIC)、KIAA0164遺伝子産物(KIAA0164)、リボソームタンパク質L39(RPL39)、チロシン3モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、イータポリペプチド(YWHAH)、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素1(OAZ1)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sのサブユニット、非−ATPase、2(PSMD2)、冷誘導性RNA−結合タンパク質(CIRBP)、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された5(NEDD5)、高泳動性群非ヒストン染色体タンパク質1(HMG1)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ1、NAD(可溶性)(MDH1)、サイクリンI(CCNI)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sサブユニット、非−ATPase、7(Mov34ホモログ)(PSMD7)、主組織適合性複合体、クラスI、B(HLA−B)、ATPアーゼ、空胞状、14kD(ATP6S14)、転写因子−様1(TCFL1)、KIAA0084タンパク質(KIAA0084)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sサブユニット、非−ATPアーゼ、8(PSMD8)、主組織適合性複合体、クラスI、A(HIA−A)、アラニル−tKNAシンセターゼ(AARS)、リシル−tRNAシンセターゼ(KARS)、ADPリボシル化因子−様6相互作用タンパク質(ARL6IP)、KIAA0063遺伝子産物(KIAA0063)、アクチン結合LIMタンパク質1(ABLIM)、DAZ関連タンパク質2(DAZAP2)、真核生物翻訳開始第4A因子、イソ型2(EIF4A2)、CD151抗原(CD151)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、6(PSMB6)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、4(PSMB4)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、2(PSMB2)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、3(PSMB3)、Williams−Beuren症候群染色体部位1(WBSCR1)、古代遍在タンパク質1(AUP1)、KIAA0864タンパク質(KIAA0864)、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された8(NEDD8)、リボソームタンパク質L4(RPL4)、KIAA0111遺伝子産物(KIAA0111)、トランスジェリン2(TAGLN2)、クラスリン、重ポリペプチド(Hc)(CLTC、CLTCL2)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F1複合体、γポリペプチド1(ATP5C1)、カルパスタチン(CAST)、MORF関連遺伝子X(KIA0026)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F1複合体、αサブユニット、イソ型1、心筋(ATP5A1)、ホスファチジルセリンシンターゼ1(PTDSS1)、抗酸化剤タンパク質2(非−セレニウムグルタチオンペルオキシダーゼ、酸性カルシウム非依存性ホスホリパーゼA2)(KIAA0106)、KIAA0102遺伝子産物(KIAA0102)、リボソームタンパク質S23(RPS23)、CD164抗原、シアロムチン(CD164)、GDP解離インヒビター2(GDI2)、エノイル補酵素Aヒドラターゼ、短鎖、1、糸粒体(ECHS1)、真核生物翻訳4A開始因子、イソ型1(EIF4A1)サイクリンD2モデル(CCND2)、異種核リボ核タンパク質U(骨格結合A因子)(HNRPU)、APEXヌクレアーゼ(多機能DNA修復酵素)(APEX)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F0複合体、サブユニットc(サブユニット9)、イソ型1(ATP5G1)、ミリストイル化アラニン豊富プロテインキナーゼC基質(MARCKS、80K−L)(MACS)、Sと同様で、アネキシンA2(ANXA2)、S.cerevisiaeRER1に類似(RER1)、ヒアルロノグルコサミニダーゼ2(HYAL2)、ウロプラキン1A(UPK1A)、核孔複合体相互作用タンパク質(NPIP)、カリョフェリンα4(インポーチンα3)(KPNA4)、及び4p16.3でHD遺伝子座の近くの複数のスプライス改変体を有する遺伝子(RES4−22)。
別の実施形態では、プロモーターは、外因性プロモーター、例えば偏在して発現するプロモーター、例えばRNaポリメラーゼプロモーター、例えば、H1又はU6;又は構成的に活性なウイルスプロモーターであることができる。プロモーターの非限定例としては、RSV LTR、SV40初期プロモーター、CMV IEプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、Srα−プロモーター(HTLV−I LTR由来のR/U5配列に融合したSV40初期プロモーターで構成される非常に強いハイブリッドプロモーター)、及びHepatitis Bプロモーターが挙げられる。
配列保存に基づいて、プライマ−が設計され、標的遺伝子のコード領域を増幅するために使用される。最初に、各遺伝子由来の最も高度に発現されたコード領域は、モデル制御遺伝子を作成するために使用されるが、任意のコード領域又は非コード領域を使用することができる。各制御遺伝子は、リポーターコード領域及びそのポリ(A)シグナル間の各コード領域に挿入することによって組み入れられる。これらのプラスミドは、遺伝子の上流部位にリポーター遺伝子を有し、3’非コード領域に潜在的なiRNA標的を有するmRNAを産生する。個々のiRNAの効果は、リポーター遺伝子の抑制によってアッセイされる。本発明の方法において有用なリポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルコロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン色蛍光タンパク質(CFP)、ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリンシンターゼ(NOS)、オクトピンシンターゼ(OCS)、及びそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコ−ル、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサ−ト、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーが利用可能である。リポーター遺伝子の抑制を決定するための方法は当該技術分野で周知であり、限定されないが、蛍光定量的方法(例えば蛍光分光学法、蛍光励起細胞分離捕集装置(FACS)、蛍光鏡検法)、抗生物質抵抗性の決定が挙げられる。
(iRNAの一時的な発現)
本発明の一実施形態では、細胞におけるiRNAの発現は一時的である。一時的な発現は、細胞のゲノムに挿入されない発現ベクターから生じることができる。あるいは、一時的な発現は、細胞内へのiRNA分子の直接挿入から生じることができる。
(iRNAの安定な発現)
(1.ランダム挿入)
iRNAを含有するベクターのゲノム挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて達成することができる。一実施形態では、ベクターは、ウイルス系ベクターを用いてランダムにゲノムに挿入される。ウイルス系ベクターの挿入は、ウイルス挙動と整合するランダム部位で起こる(例えば、Daley et al.(1990)Science 247:824−830;Guild et al.(1988)J Virol 62:3795−3801;Miller(1992)Curr Topics MicroBiol Immunol 158:1−24;Samarut et al.(1995)Methods Enzymol 254:206−228を参照)。ウイルス系ベクターの非限定的な例としては、Moloneyマウス白血病レトロウィルス、マウス幹細胞ウイルス、ワクシニアウィルスベクター、Sindbisウィルス、Semliki Forestアルファウイルス、EBV、ONYX−15、アデノウィルス、又はレンチウイルス系ベクターが挙げられる(例えば、Hemann MT et al.(2003)Nature Genet 33:396−400;Paddison & Harmon(2002)Cancer Cell 2:17−23;Brummelkamp TR et al.(2002)Cancer Cell 2:243−247;Stewart SA et al.(2003)RNA 9:493−501;Rubinson DA et al.(2003)Nature Genen.33:401−406;Qin X et al.(2003)PNAS USA 100:183−188;Lois C et al.(2002)Science 295:868−872を参照)。
別の実施形態では、挿入は、相同組換えを介する特定の遺伝子座に標的化される。相同組換えは、生存細胞中のゲノムに対する規定の改変を標的化するための正確な機構を提供する(例えば、Vasquez KM et al.(2001)PNAS USA 98(15):8403−8410を参照)。相同組み換えにおける主要なステップは、DNA鎖交換であり、このステップは、相補的な配列を含有する少なくとも1つのDNA鎖を有するDNA二本鎖を対にして、ヘテロ二本鎖DNAを含有する中間的な組換え構造を形成する工程を含む(例えば、Radding,C.M.(1982)Ann.Rev.Genet.16:405;米国特許第4,888,274号を参照)。ヘテロ二本鎖DNAは、三本鎖形態を含有する3つのDNAの鎖を含む、いくつかの形態をなすことができ、ここで、1個の相補的な鎖がDNA二本鎖に侵入しており(例えば、Hsieh et al.(1990)Genes and Development 4:1951;Rao et al.,(1991)PNAS 88:2984)を参照)、2つの相補的なDNA鎖がDNA二本鎖と対になる場合、伝統的なHolliday組換え接合部又はchi構造(Holliday,R.(1964)Genet.Res.5:282)を形成することができるか、又は二重D−ループを形成することができる(「Diagnostic Applications of Double−D Loop Formation」米国特許第5,273,881号)。一旦形成されると、ヘテロ二本鎖構造は、鎖破壊及び交換によって分解することができ、その結果、侵入されたDNA鎖の全て又は一部分は、受容DNA二本鎖内に挿入され、受容DNA二本鎖のセグメントを付加するか、又は交換する。あるいは、ヘテロ二本鎖構造は、遺伝子変化を生じることができ、ここで、侵入する鎖の配列は、テンプレートとして侵入する鎖を用いてミスマッチの対を再対形成することによって受容DNA二本鎖に移される(例えば、Genes,3rd Ed.(1987)Lewin,B.,Join Wiley,New York,N.Y.;Lopez et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:5643を参照)。破壊又は組換えの機構によるか、又は遺伝子変換の機構によるか否かにかかわらず、相同性に対になった結合点でのヘテロ二本鎖DNAの形成は、1つのDNA遺伝子から別のDNA遺伝子へ遺伝配列情報を移動するのに役立ち得る。
、コートマータンパク質複合体、サブユニットα(COPA)、Gタンパク質経路サプレッサー1(GPS1)、低分子リボ核タンパク質D2ポリペプチド(16.5kD)(SNRPD2)、リボソームタンパク質S29(RPS29)、リボソームタンパク質S10(RPS10)、リボソームタンパク質S9(RPS9)、リボソームタンパク質S5(RPS5)、リボソームタンパク質L28(RPL28)、リボソームタンパク質L27a(RPL27A)、タンパク質チロシンホスファターゼタイプIVA、メンバー2(PTP4A2)、リボソームプロットL36(RPL35)、リボソームタンパク質L10a(RPL10A)、IgGのFcフラグメント、レセプター、トランスポーター、α(FCGRT)、妊婦G10転写物(G10)、リボソームタンパク質L9(RPL9)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F0複合体、サブユニットc(サブユニット9)イソ型3(ATP5G3)、シグナル認識粒子14kD(相同性AluRNA−結合タンパク質)(SRP14)、mutL(大腸菌)ホモログ1(大腸癌、非ポリ−プ性2型)(MLH1)、染色体Iqサブテロマー配列D1S553./U06155、フィブロモジュリン(FMOD)、スピリットのアミノ末端エンハンサ−(AES)、Rho GTPase活性タンパク質(ARHGAP1)、非−POUドメイン含有、オクタマ−結合(NONO)、v−rafマウス肉腫3611ウイルス発癌遺伝子ホモログ1(ARAF1)、異種核リボ核タンパク質A1(HNRPA1)、β2−ミクログロブリン(B2M)、リボソームタンパク質S27a(RPS27A)、ブロモドメイン含有2(BRD2)、無精子症1因子(AZF1)、1,25ジヒドロキシビタミンD−3によって上方調節される(VDUP1)、セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター、クレードB(オボアルブミン)、メンバー6(SERPINB6)、デストリン(アクチン解重合因子)(ADF)、サイモシンβ−10(TMSB10)、CD34抗原(CD34)、スペクトリン、β、非赤血球1(SPTBN1)、血管関連の、遊走性の細胞タンパク質(AAMP)、主組織適合性複合体、クラスI、A(HLA−A)、MYC関連のZnフィンガータンパク質(プリン結合性転写因子)(MAZ)、SETトランスロケ−ション(骨髄性白血病関連の)(SET)、ペアードボックス遺伝子(無虹彩、角膜炎)(PAX6)、マウスにおいてZfp−36に対して相同性な亜鉛フィンガータンパク質(ZFP36)、FK506−結合タンパク質4(59kD)(FKBP4)、ヌクレオソーム組立てタンパク質1−様1(NAP1L1)、チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド(YWHAZ)、リボソームタンパク質S3A(RPS3A)、ADPリボシル化因子1、リボソームタンパク質S19(RPS19)、転写伸長因子A(SII)、1(TCEA1)、リボソームタンパク質S6(RPS6)、ADPリボシル化第3因子(ARF3)、モエシン(MSN)、B細胞インヒビターにおけるカッパ軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子、α(NFKBIA)、相補成分1、q亜成分結合タンパク質(C1QBP)、リボソームタンパク質S25(RPS25)、クラステリン(細胞溶解インヒビター、SP−40,40、硫酸化グリコプロテイン2、テストステロンを抑制された前立腺のメッセ−ジ2、アポリポーターンパクJ)(CLU)、ヌクレオリン(NCL)、リボソームタンパク質S16(RPS16)、ユビキチン−活性化酵素El(A1S9T及びBN75温度感受性相補性)(UBE1)、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶性、3(ガレクチン3)(LGALS3)、真核生物翻訳伸長1因子γ(EEF1G)、pim−1オンコジーン(PIM1)、S100カルシウム結合タンパク質A10、アネキシンIIリガンド、カルパクチンI(軽ポリペプチド(p11))、H2Aヒストンファミリー、メンバーZ(H2AFZ)、ADPリボシル化第4因子(ARF4)(ARF4)、リボソームタンパク質L7a(RPL7A)、主組織適合性複合体、クラスII、DQα1(HLA−DQA1)、FK506−結合タンパク質1A(12kD)(FKBP1A)、CD81抗原(抗増殖性抗体1の標的)(CD81)、リボソームタンパク質S15(RPS15)、X−ボックス結合タンパク質1(XBP1)、主組織適合性複合体、クラスII、DNα(HLA−DNA)、リボソームタンパク質S24(RPS24)、白血病関連リンタンパク質p8(スタスミン)(LAP18)、ミオシン、重ポリペプチド9、非筋肉(MYH9)、カゼインキナーゼ2、βポリペプチド(CSNK2B)、フコシダーゼ、α−L−1、組織(FUCA1)、ジアホラーゼ(NADH)(チトクロムb−5レダクターゼ)(DIA1)、シスタチンC(アミロイド脈管障害及び脳溢血)(CST3)、ユビキチンC(UBC)、ユビキノール−チトクロムcレダクターゼ結合タンパク質(UQCRB)、プロチモシン、α(遺伝子配列28)(PTMA)、グルタチオンS−トランスフェラーゼπ(GSTP1)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、βポリペプチド2−様1(GNB2L1)、ヌクレオホスミン(核小体リンタンパク質B23、ヌマトリン)(NPM1)、CD3E抗原、イプシロンポリペプチド(TiT3複合体)(CD3E)、カルパイン2、(m/II)大サブユニット(CAPN2)、NADHデヒドロゲナーゼ(ユビキノン)フラボタンパク質2(24kD)(NDUFV2)、熱ショック60kDタンパク質1(シャペロニン)(HSPD1)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、αを刺激する活性ポリペプチド1(GNAS1)、クラトリン、軽ポリペプチド(Lca)(CLTA)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、ミトコンドリアFl複合体、βポリペプチド、カルモジュリン2(ホスホリラ−ゼキナーゼ、δ)(CALM2)、アクチン、γ1(ACTG1)、リボソームタンパク質S17(RPS17)、リボソームタンパク質、大きい、P1(RPLP1)、リボソームタンパク質、大きい、P0(RPLPO)、サイモシン、β4、X染色体(TMSB4X)、異種核リボ核タンパク質C(C1/C2)(HNRPC)、リボソームタンパク質L36a(RPL36A)、グルクロニダーゼ、β(GUSB)、SRC、FGR、YESに関連したFYNオンコジーン(FYN)、プロチモシン、α(遺伝子配列28)(PTMA)、エノラ−ゼ1、(α)(ENO1)、ラミニンレセプター1(67kD、リボソームタンパク質SA)(LAMR1)、リボソームタンパク質S14(RPS14)、CD74抗原(主要組織適合性複合体の不変のポリペプチド、クラスII抗原関連)、エステラ−ゼD/ホルミルグルタチオンヒドロラ−ゼ(ESD)、H3ヒストン、ファミリー3A(H3F3A)、フェリチン、軽ポリペプチド(FTL)、Sec23(S.cerevisiae)ホモログA(SEZ23A)、アクチン、β(ACTB)、プレセニリン1(Alzheimer病3)(PSEN1)、インターロイキン1レセプター関連キナーゼ1(IRAK1)、Znフィンガータンパク質162(ZNF162)、リボソームタンパク質L34(RPL34)、ベクリン1(コイル状コイル、ミオシン−様BCL2−相互作用タンパク質)(BECN1)(ホスファチジルイノシトール4−キナーゼ、触媒的)αポリペプチド(PIK4CA)、IQのGTPアーゼ活性化タンパク質1(IQGAP1)、シグナルトランスデューサー、及び、転写3のアクティベーター(急性段階応答因子)(STAT3)、異種核リボ核タンパク質F(HNRPF)、推定翻訳開始因子(SUI1)、タンパク質転座複合体β(SEC61B)、ラス推定ホモログ遺伝子ファミリー、メンバーA(ARHA)、フェリチン、重ポリペプチド1(FTH1)、Rho GDP解離インヒビター(GDI)β(ARHGDIB)、H2Aヒストンファミリー、メンバーO(H2AFO)、アネキシンA11(ANXA11)、リボソームタンパク質L27(RPL27)、アデニリルシクラーゼ関連タンパク質(CAP)、フィンガータンパク質91(HPF7、HTF10)(ZNF91)、リボソームタンパク質L18(RPL18)、ファルネシルトランスフェラーゼ、CAAXボックス、α(FNTA)、ナトリウムチャネル、電位作動型、I形、βポリペプチド(SCN1B)、カルネキシン(CANX)、プロテオリピドタンパク質2(結腸上皮に豊富な)(PLP2)、アミロイドβ(A4)前駆体−様タンパク質2(APLP2)、膜電位依存性陰イオンチャネル2、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)アクティベーターサブユニット1(PA28α)(PSME1)、リボソームプロットL12(RPL12)、リボソームタンパク質L37a(RPL37A)、リボソームタンパク質S21(RPS21)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sサブユニット、ATPアーゼ、1(PSMC1)、主組織適合性複合体、クラスII、DQβ1(HLA−DQB1)、複製タンパク質A2(32kD)(RPA2)、熱ショック90kDタンパク質1、β(HSPCB)、チトクロムcオキシダーゼサブユニットVUI(COX8)、真核生物翻訳伸長1因子α1(EEF1A1)、SNRPN上流のリーディングフレーム(SNURF)、レクチン、ガラクトシド−結合、可溶性、1(ガレクチン1)(LGALS1)、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)、ホスホグリセレートムターゼ1(脳)(PGAM1)、インターフェロンによって誘発された膜貫通タンパク質1(9−27)(ZFITM1)、ヌクレアーゼゲージ受感部結合タンパク質1(NSEP1)、溶質キャリア族25(ミトコンドリアキャリア;アデニンヌクレオチドトランスロケ−タ)、メンバー6(SLC25A6)、ADPリボシルトランスフェラーゼ(NAD+;ポリ(ADPリボ−ス)ポリメラーゼ)(ADPRT)ロイコトリエンA4ヒドロラ−ゼ(LTA4H)、プロフィリン1(PFN1)、プロサポシン(異型Gaucher病及び異型異染性ロイコジストロフィ−)(PSAP)、溶質キャリアファミリー25(糸粒体キャリア;アデニンヌクレオチドトランスロケーター)、メンバー5(SLC25A5)、β−2ミクログロブリン、IGF結合タンパク質7、リボソームプロットS13、Epstein−Barr Virus Small Rna−関連プロット、主組織適合性複合体、クラスI、CX58536)、リボソームプロットS12、リボソームプロットL10、形質転換関連プロット、リボソームプロットL5、転写コアクチベーターPc4、カテプシンB、リボソームプロットL26、「主組織適合性複合体、クラスI X12432」、Wilm S Tumor−Relatedプロット、トロポミオシンTm30nmCytoskeletal、リポソームタンパク質S4、X−結合した、リボソームプロットL37、Metallopanstimulin1、リボソームプロットL30、異種核リボ核タンパク質K、主組織適合性複合体、クラスI、EM21533、主組織適合性複合体、クラスI、EM20022、リボソームタンパク質L30ホモログ、熱ショックプロット70Kda、「ミオシン(軽鎖/U02629)」、「ミオシン(軽鎖/U02629)」、カルサイクリン、一本鎖Dna−結合プロットMssp−1、トリセホスフェートイソメラーゼ、NuMAプロット1、プロットキナーゼHt31Camp−依存性、チュービュリン、β2、カルモジュリンI型、リボソームプロットS20、転写因子Btf3b、グロビン、β、Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide CAlt.Splice2、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼNm23−H2s、Ras関連C3ボツリウ
ム毒素基質、活性化転写第4因子(タックス応答性エンハンサー要素B67)(ATF4)、プレフォジュリン(PFDN5)、N−myc下方修正(NDRG1)、リボソームタンパク質L14(RPL14)、ニカストリン(KIAA0253)、プロテアーゼ、セリン、11(IGF結合)(PRSS11)、KIAA0220タンパク質(KIAA0220)、撹乱3(Drosophila dshに対して相同)(DVL3)、基本のDrosophilaホモログのエンハンサー(ERH)、複数のスプライシングを有するRNA結合タンパク質遺伝子(RBPMS)、5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼ(ATIC)、KIAA0164遺伝子産物(KIAA0164)、リボソームタンパク質L39(RPL39)、チロシン3モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、イータポリペプチド(YWHAH)、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素1(OAZ1)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sのサブユニット、非−ATPase、2(PSMD2)、冷誘導性RNA−結合タンパク質(CIRBP)、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された5(NEDD5)、高泳動性群非ヒストン染色体タンパク質1(HMG1)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ1、NAD(可溶性)(MDH1)、サイクリンI(CCNI)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sサブユニット、非−ATPase、7(Mov34ホモログ)(PSMD7)、主組織適合性複合体、クラスI、B(HLA−B)、ATPアーゼ、空胞状、14kD(ATP6S14)、転写因子−様1(TCFL1)、KIAA0084タンパク質(KIAA0084)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)26Sサブユニット、非−ATPアーゼ、8(PSMD8)、主組織適合性複合体、クラスI、A(HIA−A)、アラニル−tKNAシンセターゼ(AARS)、リシル−tRNAシンセターゼ(KARS)、ADPリボシル化因子−様6相互作用タンパク質(ARL6IP)、KIAA0063遺伝子産物(KIAA0063)、アクチン結合LIMタンパク質1(ABLIM)、DAZ関連タンパク質2(DAZAP2)、真核生物翻訳開始第4A因子、イソ型2(EIF4A2)、CD151抗原(CD151)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、6(PSMB6)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、4(PSMB4)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、2(PSMB2)、プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、3(PSMB3)、Williams−Beuren症候群染色体部位1(WBSCR1)、古代遍在タンパク質1(AUP1)、KIAA0864タンパク質(KIAA0864)、発現される神経前駆細胞、発生的に下方修正された8(NEDD8)、リボソームタンパク質L4(RPL4)、KIAA0111遺伝子産物(KIAA0111)、トランスジェリン2(TAGLN2)、クラスリン、重ポリペプチド(Hc)(CLTC、CLTCL2)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F1複合体、γポリペプチド1(ATP5C1)、カルパスタチン(CAST)、MORF関連遺伝子X(KIA0026)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F1複合体、αサブユニット、イソ型1、心筋(ATP5A1)、ホスファチジルセリンシンターゼ1(PTDSS1)、抗酸化剤タンパク質2(非−セレニウムグルタチオンペルオキシダーゼ、酸性カルシウム非依存性ホスホリパーゼA2)(KIAA0106)、KIAA0102遺伝子産物(KIAA0102)、リボソームタンパク質S23(RPS23)、CD164抗原、シアロムチン(CD164)、GDP解離インヒビター2(GDI2)、エノイル補酵素Aヒドラターゼ、短鎖、1、糸粒体(ECHS1)、真核生物翻訳4A開始因子、イソ型1(EIF4A1)サイクリンD2モデル(CCND2)、異種核リボ核タンパク質U(骨格結合A因子)(HNRPU)、APEXヌクレアーゼ(多機能DNA修復酵素)(APEX)、ATPシンターゼ、H+トランスポーティング、糸粒体F0複合体、サブユニットc(サブユニット9)、イソ型1(ATP5G1)、ミリストイル化アラニン豊富プロテインキナーゼC基質(MARCKS、80K−L)(MACS)、Sと同様で、アネキシンA2(ANXA2)、S.cerevisiaeRER1に類似(RER1)、ヒアルロノグルコサミニダーゼ2(HYAL2)、ウロプラキン1A(UPK1A)、核孔複合体相互作用タンパク質(NPIP)、カリョフェリンα4(インポーチンα3)(KPNA4)、及び4p16.3でHD遺伝子座の近くの複数のスプライス改変体を有する遺伝子(RES4−22)。
本発明のさらなる局面では、遺伝子の発現を機能的に排除可能な、特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するiRNA分子が提供される。一実施形態では、遺伝子の同じ領域を標的化する少なくとも2つのiRNA分子が提供される。別の実施形態では、同じ遺伝子の少なくとも2つの異なる領域を標的化する少なくとも2つのiRNA分子が提供される。さらなる実施形態では、少なくとも2つの異なる遺伝子を標的化する少なくとも2つのiRNA分子が提供される。本発明のさらなる実施形態は、遺伝子標的化のための上述のストラテジーの組み合わせを提供する。
本発明の1つの例示的な実施形態では、調節された遺伝子、又は遺伝子のファミリーは、組み込まれた内因性ウイルスの遺伝子である。内因性ウイルスのプロトタイプはPERV(ブタ内因性レトロウイルス)である。
本明細書中で記載される構築物、テンプレート、及びベクターは、限定されないが、マイクロインジェクション、トランスフェクション、形質転換、及び/又はエレクトロポレーションを含む、当該技術分野で既知の任意の技術を経て宿主細胞へと導入することができる。宿主細胞は、任意の哺乳動物、植物、酵母又は細菌の細胞であることができる。一実施形態では、宿主細胞は、原核生物(例えば、限定されないが、Escherichia又はPseudomonas種を含む細菌細胞)である。別の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞であり、例えば、昆虫細胞(限定されないが、Spodoptera、Trichoplusia、Drosophila又はEstigmene種を含む)、又は哺乳動物細胞(限定されないが、ヒト細胞、マウス細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヒツジ細胞、げっ類細胞、ハムスター細胞、サル、霊長類又はヒトの細胞を含む)である。哺乳動物細胞は、種々の異なる臓器及び組織から得られる細胞であることができ、例えば、限定されないが、皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器、及び胚、胎児又は成体動物の全部又は一部の非骨格調製物;又は上皮細胞、繊維芽細胞細胞、神経細胞、ケラチン合成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球(B及びT)、マクロファージ、単核球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、粒状細胞、卵丘細胞、表皮細胞又は血管内皮細胞。宿主細胞は、HEK細胞、COS細胞、又は細胞培養物中で通常使用される他の細胞であることができる。別の実施形態では、宿主細胞は、植物細胞(限定されないが、タバコ細胞、トウモロコシ、Arabidopsis種由来の細胞、ジャガイモ細胞又は米細胞)である。
本発明はさらに、1つ以上の干渉iRNA分子を遺伝的に発現する非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を含む。非ヒトトランスジェニック動物は、限定されないが、非ヒト哺乳動物(ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ(ウシ科の動物)、シカ、ラバ、ウマ、サル及びその他の非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギを含むがこれに限られない)、鳥(鶏、シチメンチョウ、カモ、ガチョウを含むがこれに限られない)、爬虫類、魚、両生類、虫(例えばC.elegans)、昆虫(Drosophiola、Trichoplusa、及びSpodopteraを含むがこれに限られない)を含む、本発明の方法のいずれか1つによって産生することができる。
本発明の一実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、核移植のプロセスを経て産生される。一実施形態では、核ドナー細胞は、本明細書中に記載の構築物を標的化してiRNA分子を産生することによって遺伝的に改変することができる。核移植を経て1つ以上の干渉RNAを発現する非ヒトトランスジェニック動物の産生は、以下の工程を含む:(a)動物において1つ以上の標的核酸配列を同定する工程;(b)標的核酸配列に対して結合する1つ以上の干渉RNAを調製する工程;(c)1つ以上の干渉RNAを含有する1つ以上の発現ベクターを調製する工程;(d)1つ以上の干渉RNA発現ベクターを核ドナー細胞のゲノムに挿入する工程;(e)核ドナー細胞の遺伝物質をアクセプター細胞に移す工程;(f)アクセプター細胞を受容体のメス動物に移す工程;及び(g)移されたアクセプター細胞をメス動物中で期限どおりに成長させる工程。限定されないが、以下のものを含む任意の動物を核移植によって産生することができる:ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、及びげっ歯類(マウス及びラットを含む)、ウサギ。
本発明のさらなる実施形態では、トランスジェニック動物は、当該技術分野で任意の手段によって産生することができ、この任意の手段としては、限定されないが、以下のものが挙げられる:卵母細胞、受精卵又は未着床割球(例えば、2細胞、4細胞又は8細胞の未着床割球)へのDNAのマイクロインジェクション、胚幹細胞のトランスフェクション、精子により媒介されるDNAの移動及び血流を経るインビボでの胚のトランスフェクション。
(A.治療的使用)
本発明の非ヒトトランスジェニック動物はさらに、導入遺伝子から発現した治療用タンパク質のための供給源として使用することができる。
(a)ヒト腫瘍又はヒト腫瘍細胞をトランスジェニック動物に移植する工程;
(b)ヒト腫瘍と試験される一つ以上の化合物とを接触させる工程;
(c)1つ以上の化合物に対して腫瘍の1つ以上の生物学的又は生理的応答を測定する工程;及び
(d)ヒト腫瘍について1つ以上の化合物の治療的有効性を決定する工程。
遺伝子のファミリーを特異的に標的化するために、遺伝子の所望なサブセット、又は遺伝子又は遺伝子のファミリーの特定の対立遺伝子、配列の代表的なサンプルが得られる。これらの配列は、類似性の領域を同定するために比較される。この比較は、所与の遺伝子ファミリー間、及びファミリー内の配列のサブセット内の類似性及び同一性の領域を決定する。それに加えて、この分析は、ファミリーメンバーの対立遺伝子間の類似性及び同一性の領域を決定する。これらの配列を考慮することによって、ファミリー全体、ファミリーメンバーのサブセット、個々のファミリーメンバー、個々のファミリーメンバーの対立遺伝子のサブセット、又はファミリーメンバーの個々の対立遺伝子のいずれかを標的化するために使用可能な領域を同定する。
RNA干渉は、ブタにおいて見出される、異なっているがなお相同性のレトロウイルスをコードする関連配列のファミリーの発現を遺伝的に抑制するために使用される。広く、センス及び逆アンチセンス配列を有し、PERV改変体(少なくとも3つ(PERV−A、−B及び−C)が知られている)間で保存されるブタ内因性レトロウイルスゲノムの領域に対して相同性のiRNA分子の産生を生じる導入遺伝子が構築される。導入遺伝子は、ブタのゲノムに付加され、dsRNAを形成するために自己ハイブリダイズ可能なRNA分子を遺伝的に発現する遺伝株を産生する。このRNAは、導入遺伝子を発現する各細胞において発現されたブタ内因性レトロウイルスの干渉を誘発する。全PERV産生が非常に下方調節されるだけではなく、標的化改変体間の組換えは新規な非標的化改変体を産生し得ない。このような動物由来の細胞、組織、又は臓器は、PERV伝達の減少リスクを伴う異種移植のたえに使用することができる。
個々のiRNA分子の有効性を定量化するためのアッセイが開発される。それに加えて、リポーターベクターは、iRNAの能率的なスクリーニングを可能にするために構築され、iRNA発現ベクターは、個々の潜在的なiRNAをコードする配列の効率よい挿入を可能にするために組み立てられる。潜在的な標的は、標的PERVのファミリーの配列分析によって同定される。
iRNAのための理想的な標的は、ほとんどのPERVにわたって保存されるPERV mRNAの領域である。このような配列は、初期の構築物について同定される。全ての既知のPERV配列及びこの努力から生じるさらなるPERV配列の分析は、iRNAベクターの論理的な設計のための情報を提供する。全てのiRNAベクターは、トランスジェニック動物産生において使用する前に、細胞アッセイにおける機能について試験される。
組織培養確認:ステップ1及び2において同定された配列及びプラスミドに基づいて、ステップ1に記載されるプロトコルを用いて、複数の個々のiRNAを発現するプラスミドが設計され、構築され、組織培養物における機能について試験された。各iRNAプラスミドは、安定な発現及び適切な標的配列を含有するリポータープラスミドに対する有効性について試験される。天然PERV mRNAに対する干渉活性は、実験的に確立される。それに加えて、PERV mRNAの減少は、ウイルス粒子産生の減少と相関関係にある。
PERVを含まない細胞の作成:タンパク質を阻害する相補体を発現するブタのα−GTノックアウト株を使用するが、PERVを含まない遺伝的バックグラウンドは、任意のブタ株を用いて達成することができる。繊維芽細胞は、動物を作成する前に、ある程度の機能的試験を可能にするiRNA構築物を用いて設計される。これらの細胞はさらに、機能的効果を分析するために組み込み部位についてスクリーニングされる。繊維芽細胞の使用は、トランスジェニック動物を産生する他の方法よりも有利であり、通常は、動物が生まれた後に、組み込み部位に特異的な導入遺伝子の発現をアッセイすることができる。
体細胞各移植は、効果的な、比較的安価で比較的早いトランスジェニックブタの産生を可能にする。ステップ4において開発され、スクリーニングされた細胞(最適化された、機能的な、iRNAを抑制するPERVを含有するように設計されたα−1,3GTノックアウト繊維芽細胞)は、体細胞核移植において核ドナーとして使用される。体細胞核移植の技術は、ブタの卵母細胞由来の核を除去し、繊維芽細胞由来の核を摘出された卵母細胞に挿入する工程を含む。次いで、胚細胞段階まで細胞を増殖させて、次いで、凍結し、メスブタに移植される。
潜在的なsiRNA標的を同定するために使用されたPERVの特定のgag、pol、及びenv配列を以下に列挙する。核配列は、全長遺伝子のサブセットである。このサブセットは、モデル遺伝子を組み入れるために使用した各遺伝子の一部分をあらわす。考慮からはずされる領域は、ホモポリマーで交換された(ttttt・・・t又はGGGG...G)と交換された。
gag、pol、envA、envB、及びenvCの部分を増幅し、pCR−XLTOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA)にクローン化した。各挿入物を独立してXbaI/SpeIフラグメントとして、ウマベクターpPL732.8にリポーター遺伝子及びそのポリ(A)シグナルのコード領域の間に位置するXbaI部位でサブクローン化した。このストラテジーの図示は図13にある。
以下の配列(フラグメントA)は、潜在的に固有でない配列が、同じ数の下側の部分「t」と交換された、PERV polの一部分をあらわす。
siRNA効力の鎖選択の効果を減らすために、ヘアピンの両方の鎖を同一又は機能的に同一になるように設計することができる。例えば、polの相補体(フラグメントA)をDNA Striderを用いて分析し、潜在的な回帰性配列を同定した。1つのこのような分析(パラメーター:ストリンジェンシー11、ウインドウ23)では、以下の配列が同定された:TGGGCCTTTTAGCTGAGGCTCG(配列番号36)。この配列を使用してmir−30塩基及びループを有するDrosha基質を設計し、この基質のMFold予想構造は以下のようになる:
上のストラテジーを用いて不完全なヘアピンが生じる場合がある。しかし、非ワトソン/クリック塩基対形成がRNAにおいて可能なため、Drosha基質は、RNAi標的化において顕著な改変なく改変することができる。以下は、PERV env mRNAの一部分を標的化するために設計されたDrosha基質である。いくつかの「バブル」は、ヘアピンのステム部分に存在する。
クラスター状干渉RNAのためのオリゴを組み立てるために、リンカー配列は、目的でない構造が形成されることを防ぐことが考慮されなければならない。同じ制限部位が連続して使用される場合、ヘアピンの塩基での相同性は、目的でない塩基対を生じる場合がある。例えば、ベクターが、2つの非適合性制限部位を有する場合、配列はそれらの2つの部位内で直接的にクローン化することができる。このプロセスでは、上流部位が破壊される場合があり、さらに、次のヘアピンのための調製において下流領域に新しいベクターを再供給する場合がある。
BclI及びMluIを用いて切断した後のベクター末端
好酸球性関連リボヌクレアーゼAファミリー遺伝子(EarX)及び市販のベクターpCpG(InvivoGen,San Diego,CA)中に見出されるイントロンにゆるく基づくイントロンを設計した。このイントロンの設計は、イントロンの位置がエキソン配列内の任意のSbfI部位内にある制限部位の作成を含んでいた。このイントロンを含有する主要な転写物のスプライシングの際に、得られたmRNAは、その設計されていない内因性対象物と比較して改変されていない。それに加えて、少量の一連のクローニング部位は、iRNA分子/Drosha基質の後に続くクローニングを可能にするためにイントロン内に含まれていた。dsRED発現ベクター(corallimorpharianからの赤色蛍光タンパク質)のコード領域内に天然に見出されるSbfI部位にこの配列をクローン化した。哺乳動物へのトランスフェクションの際に、得られたイントロンは、適切にスプライシングされ、機能的なdsREDタンパク質を与える。SbfI部位の中心の6ヌクレオチドがPstI部位を含むため、このイントロンはさらに、PstI部位に直接クローン化することができる。
イントロン配列:
(SbfI部位は太字で示され、複数のクローニング部位はイタリックで示され、機能的イントロンは下線部分である)
この実施例では、導入遺伝子の産物の汚染を防ぐか又は減らすために、内因性タンパク質の発現が減らされる。トランスジェニック動物は、治療用タンパク質のための供給源として使用され始めている。これらのタンパク質は、導入遺伝子から発現される。導入遺伝子発現は、このようなタンパク質の区分に分けられた単離を与えるために、特定の組織又は細胞種に対して標的化することができる。例えば、タンパク質は、乳房に特異的なプロモーター由来のタンパク質の発現を開始させることによって、トランスジェニック動物のミルク中で濃縮することができる。それに加えて、導入遺伝子は、特定の処理を可能にするために、特定の細胞種中で選択的に発現させることができる。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、家畜B−細胞におけるヒトポリクローナル抗体の組換え、発現、及び処理に指向するために使用することができる。これらの場合のいずれかにおいて、内因性タンパク質は、精製のために集められた物質を汚染することができる。このタンパク質は、進化的に関連していないが、所望の産物とともに精製される。あるいは、汚染するタンパク質は、導入遺伝子産物の内因性対象物であってもよい。
(ステップ1)
実施例1に記載されるような技術を使用した。ここで、実施例1において記載されるgag遺伝子、pol遺伝子、及びenv遺伝子は、ブタ免疫グロブリン(Ig)の可変ドメインのための遺伝子と、可変又は一定のいずれかで交換される。それに加えて、Ig重鎖、Ig軽鎖カッパ、及びIg軽鎖ラムダは、本ストラテジーにおける潜在的な標的として含まれる。
実施例1に記載されるような技術を使用した。ここで、PERV標的の分析は、所与の標的に対するiRNA構築物の特異性を決定するためにIg標的の分析と交換される。ブタIg標的の試験に加えて、ヒトIg導入遺伝子と相同性を有し、動物において発現される潜在的な標的は排除される。
それぞれ選択されたiRNA構築物を、ブタB−細胞株に導入する。Ig遺伝子産物の下方修正は、実施例1に記載される方法によってアッセイされる。特に、mRNAは、RT−PCRによって評価され、表面Igは標識された抗体を経て測定される。
胎児繊維芽細胞を、上のステップで同定されるiRNA構築物と接触させる。しかし、胎児繊維芽細胞がIg遺伝子産物を発現しないため、このアッセイ中のスクリーニングにおけるそれらの有用性は制限されている。この場合では、妊娠後期胎児は、RT−PCR及びイムノアッセイによってiRNA有効性を確認するために使用される。平衡した1セットの実験では、同定された標的に対応する発現されたブタIg導入遺伝子に対して胎児繊維芽細胞を設計し、iRNA構築物を効力について試験する。ヒトIgの目的でない標的化もアッセイする。ヒトIg導入遺伝子を標的化しないiRNA構築物のみが胎児を産生するために使用される。
RNA干渉技術は、ウイルスに耐性であり、及び/又はウイルスを増殖させる能力が減らされた、動物を産生するために適用される。Marekの疾患ウイルスの1つ以上の必須領域を標的化する干渉RNAの発現を生じる導入遺伝子を構築する。次いで、導入遺伝子構築物をニワトリのゲノムに付加し、iRNAを遺伝的に発現する遺伝子株を産生する。この実施例では、ゲノム株は、ハイブリダイズして、Marek疾患ウイルスの必須領域に対して標的化される、dsRNA分子を作成する2つのRNAを遺伝的に発現する。非疾患状態では、dsRNAは機能的に不活性であるが、細胞がMarek疾患ウイルスに感染した場合には、dsRNAはウイルス遺伝子と干渉し、ウイルスの寿命を破壊する。それ故に、このようなニワトリはMarek疾患に耐性である。
(方法)
PERVがMarek疾患ウイルスによって交換される場合、実施例1において記載されるような技術が使用される。それに加えて、Marek疾患を減らす細胞が、PK−15細胞の代わりに使用される。さらに、当該技術分野で既知である記載からわずかに改変した導入遺伝子を有する家禽の産生のための方法を行なうことができる。ニワトリの胚を効果を確認するために使用する。iRNAのための適切な組み込み部位は、それらが再生された後に、導入遺伝子を有する動物におけるiRNA発現についてスクリーニングすることによって同定される。この目的で、導入遺伝子を有する子孫は、適切な株のさららなる普及のために利用可能である。
上述の技術を使用して、導入遺伝子は、異種移植された臓器における炎症を抑制するためにVCAMを標的化するdsRNAの発現のために構築される。高められた臓器生存率を有する異種移植ブタを産生するための干渉RNAの適用におけるガイダンスを与えるために、以下のものが提供される:
(方法)
実施例1において記載される方法は、iRNA標的をスクリーニングするためのモデルとして役立つ。本実施形態では、ブタVCAMが標的である。VCAMを発現するブタ細胞株がPK−15細胞の代わりに使用される。実施例1、ステップ2及び図11に開示される同様のストラテジーを使用して、VCAMファミリーメンバーに対して活性なiRNA標的を除去する。
RNA干渉は、組織特異的な様式で内因性遺伝子の発現を抑制するために使用される。導入遺伝子は、ミオスタチン(GDF−8)を標的化するdsRNAの発現のために組みこまれる。ミオスタチンの変異は、家畜及びマウスにおいて筋肉重量の増加を与え、経済的に有利な表現型がミオスタチンの機能の欠損を伴うことを示す。しかし、ミオスタチンの完全な排除は、肉産生のために経済的に生存可能でない表現型を産生する(Yang J,et al.(2001)Mol.Reprod.Dev.60(3):351−61)。干渉RNA技術は、ミオスタチンの発現が抑制された動物を産生するために使用される。完全ではない抑制を提供するiRNA分子の組織特異的な発現は、pol IIIプロモーターに対して組織特異的な様式で提供される。
実施例1に記載される様式は、iRNA標的をスクリーニングするためのモデルとして役立つ。本実施例では、ブタGDF−8はPERVよりもよい標的である。GDF−8を発現したブタ細胞株は、PK−15細胞の代わりに使用される。最初に仮想配列組み立てによって、その後にインビトロスクリーニングによって同定されたiRNA分子は、同定されるパラメーター内で有効ではない場合には、排除される。それ故に、以前の実施例とは異なり、ミオスタチンの完全な廃止は、考慮からiRNA分子を排除する。
RNA干渉技術は、異種移植を受ける患者に対して危険なウイルスに耐性なブタを産生するために適用される。異種移植手順では、ブタ、ウイルスに加えて、ドナー臓器は病原体保有ヒトであるリスクが存在する。例えば、異種移植を受ける患者に対してリスクを有する1つのウイルスは、インフルエンザウイルスである。それ故に、異種移植された臓器を受ける患者に対するリスクが存在するウイルスの1つ以上の必須領域を標的化する干渉RNAの発現を生じる導入遺伝子が構築される。実施例1に記載されるような方法は、iRNA標的をスクリーニングするための方法として役立つ。この場合には、インフルエンザウイルス及びその相同物は、PERVの代わりに標的を提供する。PK−15細胞の代わりに、インフルエンザウイルスを減らす細胞がスクリーニングのために使用される。iRNA構築物は、インフルエンザウイルスmRNA及びウイルス粒子産生を完全に阻害する能力についてスクリーニングされる。有用なiRNA配列が同定されるばあ、それらはベクター内に結合し、ウイルス遺伝子産物の発現を完全に排除することができる導入遺伝子構築物を提供する。スクリーニングのさらなるラウンドは、最も有効な組み合わせが同定されることを確実にする。スクリーニングの後、核移植手順において使用される繊維芽細胞に構築物を導入し、インフルエンザウイルスに耐性なトランスジェニック細胞株を与える。
選択的なマーカーは、ほとんどのマーカー遺伝子が抗菌耐性を提供し、有限数が特徴付けられたという点において、哺乳動物細胞において制限されている。それ故に、選択可能な表現型を提供するsiRNA導入遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子として役立つことができる。実施例1に記載される方法は、iRNA標的をスクリーニングするためのモデルとして役立つ。この場合には、特定の遺伝子が下方修正さえる選択可能な表現型を提供する細胞が使用される。iRNA構築物は、選択可能な表現型を産生する能力についてスクリーニングされる。有用なiRNA構築物が同定される場合、それらは他の遺伝子又は他のDNAフラグメントに結合し、選択可能な表現型を与える。さらに、このストラテジーを使用して、相同組換え事象の選択を可能にする遺伝子の組み合わせを作成することができる。例として、非iRNA選択可能なマーカー遺伝子は、2つの標的化アームの間に含まれる。これらのアームの外側に、抗−選択可能なマーカーiRNA導入遺伝子が配置される。iRNA導入遺伝子は、標的遺伝子として選択可能なマーカー遺伝子を用いて上の例におけるように同定される。ランダム組み込みの際に、iRNA導入遺伝子は、選択可能なマーカーの機能を妨害し、組み込み事象は選択されない。相同組換えの際に、iRNA導入遺伝子は存在せず、選択可能な遺伝子機能は存在しない。同様に又はあるいは、iRNA導入遺伝子は、細胞製造のために必須な遺伝子に対して指向することができる。
Claims (43)
- iRNA分子をコードするDNA構築物を細胞のゲノムの所定の位置に挿入する工程を含む、トランスジェニック細胞を産生するための方法。
- iRNA分子をコードするDNA構築物を細胞のゲノムの所定の位置に挿入する工程を含み、該挿入が該細胞の正常な遺伝子発現を破壊しない、トランスジェニック細胞を産生するための方法。
- (i)標的mRNAに対して相補的な少なくとも1つのiRNA配列を同定する工程;
(ii)細胞中の標的内因性遺伝子配列を同定する工程;
(iii)iRNA配列をコードするDNA構築物及び該内因性標的配列に対して相同な標的配列を製造する工程;
(iv)該DNA構築物を該細胞に導入する工程;及び
(v)該iRNA分子が発現され、それによって該標的mRNAの発現を調節する条件下で、該細胞を増殖させる工程
を含む、標的mRNAの発現を調節するための方法。 - 前記挿入が標的遺伝子のエキソン内へのものである、請求項3に記載の方法。
- 前記挿入が標的遺伝子のイントロン内へのものである、請求項3に記載の方法。
- 前記挿入が前記標的遺伝子の機能を破壊しない、請求項3に記載の方法。
- 前記DNA構築物が、該標的遺伝子と前記DNA構築物との間の相同的組換えを可能にするために、標的遺伝子に対して相同な配列を含有する、請求項3に記載の方法。
- 前記DNA構築物が合成イントロン内に含有される、請求項3に記載の方法。
- 前記合成イントロンが機能性イントロンである、請求項8に記載の方法。
- 前記合成イントロンが内因性イントロン内に挿入される、請求項9に記載の方法。
- 前記合成イントロンが内因性エキソン内に挿入される、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記DNA構築物が、Drosha基質であるRNA分子をコードする、請求項1又は2に記載の方法。
- iRNA分子がsiRNA分子である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記DNAが相同的組換えを介して前記遺伝子内に挿入される、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1又は2に従って産生されるトランスジェニック細胞。
- 請求項1又は2に記載の細胞を含むトランスジェニック動物。
- 第1の標的mRNAに対して相補的な第1のヌクレオチド配列と、第2の標的mRNAに対して相補的な第2のヌクレオチド配列とを含み、該第1及び第2のヌクレオチド配列が実質的に共にハイブリダイズして二本鎖iRNA分子を形成する、二本鎖iRNA分子。
- 前記第1及び第2の標的mRNAが同じである、請求項18に記載のiRNA分子。
- 前記第1及び第2の標的mRNAが異なる、請求項18に記載のiRNA分子。
- 前記第1及び第2のヌクレオチド配列が反復性である、請求項18に記載のiRNA分子。
- 前記第1及び第2のヌクレオチド配列を分離する第3のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項18に記載のiRNA分子。
- 前記第1及び第2のヌクレオチド配列が19〜32ヌクレオチド長である、請求項18に記載のiRNA分子。
- 前記第3のヌクレオチド配列が4〜10ヌクレオチド長である、請求項22に記載のiRNA分子。
- 第1の標的mRNAに対して相補的な第1のヌクレオチド配列と、第2の標的mRNAに対して相補的な第2のヌクレオチドとを含み、該第1及び第2のヌクレオチド配列が実質的に共にハイブリダイズして二本鎖iRNA分子を形成する、二本鎖iRNA分子をコードするDNA構築物。
- (i)標的mRNAに対して相補的な少なくとも1つのヌクレオチド配列を同定する工程;
(ii)該相補的な配列を分析して、共にハイブリダイズ可能な配列の一部分を同定する工程;
(iii)工程(ii)で同定された2つの相補的な配列を含有するiRNA分子を製造する工程
を含み、該製造する工程を細胞中で行なうことができる、標的mRNAの発現を調節するために二本鎖iRNA分子を産生するための方法。 - 前記iRNAがDNA構築物によってコードされる、請求項26に記載の方法。
- 前記iRNA分子が、共にハイブリダイズする2個の相補的なヌクレオチド配列を分離する第3のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 前記相補的な配列が約19〜32ヌクレオチド長である、請求項26に記載の方法。
- 1つの遺伝子の少なくとも2つの領域の発現を調節し、前記遺伝子の発現が機能的に排除される、1個のiRNA分子。
- 標的mRNAの同じ領域を標的化する2つのiRNA分子を投与する工程を含む、標的mRNAの発現を排除するための方法。
- 遺伝子ファミリーの全てのメンバーに共通の相同性領域を標的化することによって、前記遺伝子ファミリーの発現を調節する1個のiRNA分子。
- ブタ内因性レトロウイルスの発現を阻害するiRNA分子。
- 複数の種類のブタ内因性レトロウイルス(PERV)に結合する、請求項33に記載のiRNA。
- 前記iRNAがPERV−A及びPERV−Bに結合する、請求項33に記載のiRNA。
- 前記iRNAがPERV−A及びPERV−Cに結合する、請求項33に記載のiRNA。
- 前記iRNAがPERV−B及びPERV−Cに結合する、請求項33に記載のiRNA。
- 前記ブタ内因性レトロウイルスのenv領域を標的化する、請求項33に記載のiRNA分子。
- 前記ブタ内因性レトロウイルスのgag領域を標的化する、請求項38に記載のiRNA分子。
- 前記ブタ内因性レトロウイルスのpol領域を標的化する、請求項39に記載のiRNA分子。
- 以下のgag配列を標的化する、請求項39に記載のiRNA分子:
GTTAGATCCAGGGCTCATAAT、又はこれに実質的に相同性を有するか、又はこれにハイブリダイズする配列。 - 以下のpol配列を標的化する、請求項40に記載のiRNA分子:
GTTAGATCCAGGGCTCATAAT、又はこれに実質的に相同性を有するか、又はこれにハイブリダイズする配列。
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