CN103397019A - 干扰rna在生产转基因动物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供细胞和动物以及生产细胞和动物的方法，所述细胞和动物表达至少一种干扰RNA分子以调节具体基因或基因家族的表达。本发明进一步提供新型iRNA分子，以及产生iRNA分子的DNA模板。

Description

干扰RNA在生产转基因动物中的用途
本申请为分案申请，原申请的申请日为2004年11月22日，申请号为200480040601.X，发明名称为“干扰RNA在生产转基因动物中的用途”。
本专利申请要求2003年11月21日提交的U.S.S.N.60/523,938的优先权，其内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明提供细胞和动物以及生产细胞和动物的方法，所述细胞和动物表达至少一种干扰RNA(interfering RNA)分子以调节特定基因或基因家族的表达。本发明进一步提供新型iRNA分子以及生产iRNA分子的DNA模板。
发明背景
为开发转基因细胞和动物在研究和治疗应用中的潜力，必须有实用的技术来控制外源和内源基因转录物的表达，且能适用于生产其中内源或外源基因功能被可遗传地消除的动物。现行技术其满足这些要求的能力有限。
目前，基因功能的定向(targeted)破坏通过外源抑制性核酸的微注射或转染、诱变和同源重组等技术来实现。传统上，选定的基因通过与靶向(targeting)载体重组或通过用整合载体随机破坏而在细胞中被破坏。其中目的基因被破坏的细胞可通过使用例如插入到基因组中的选择性标记，或者通过对目的基因进行功能测试来确认。一旦确认了细胞中的破坏，可通过进行体细胞核转移克隆，或者从胚胎干细胞产生子代，来产生杂合动物。有时可繁殖杂合动物，以产生其中所需的基因破坏存在于每个等位基因，从而使全基因互补物(full genecomplement)丧失功能的纯合动物。杂合动物也可进行进一步的遗传靶向或诱变处理。(Shastry等，Mol.Cellul.Biochem.136：171-182(1994)和Galli-Taliadoros等，(1995)J.Immunol.Meth.181：1-15(1995))。
传统技术虽然具有潜在价值，但要求耗时费力的生产和筛选程序，且成功率非常低。此外，常用的技术限于已知能接受遗传操作的生物体(其中已证明存在例如选择性标记基因、控制遗传分离的能力或有性生殖)。这些技术由于成功率低，也只限于其中可牺牲大量细胞或生物体以分离所需表型的应用情况。此外，已知的技术不容易应用于调节外源基因，如通过病毒感染引入到细胞中的外源基因，也不容易应用于具有不会导致出现不同可评估表型的丰余功能的基因。同样，因为必须将基因破坏保持在纯合状态以获得所需的表型，这种技术由于需要进行近交而不能被广泛采纳。受益于遗传多样性的任何应用情况都不能采用现行的方法。
最近出现了另一种破坏基因表达的技术。RNA干扰(RNAinterference，iRNA)最初在模式生物秀丽线虫(C.elegans)中得到描述(Fire等，Nature391：806-811(1998)；Fire等的美国专利第6,506,559号)。主要从对低等真核生物研究获得的遗传学和生物化学数据揭示了RNA干扰的可能机制。小的非编码RNA分子介导转录后基因沉默机制，该机制通过抑制靶mRNA的翻译来调节发育基因的表达。这种机制常见于植物、真菌和动物，这些微小RNA(miRNA，也称小抑制RNA或siRNA)的产生涉及一系列连续步骤，其中初级RNA转录物(pri-miRNA)在核中被切割成更小的pre-miRNA。RNase III如Drosha是一种核酸酶，其在核中执行miRNA加工的起始步骤(Lee等(2003年9月25日)Nature425，415-419)。Drosha切割pri-miRNA释放出pre-miRNA。后者被运输到胞质，在那里切酶(Dicer，RNase III核酸酶家族成员)进一步将其加工，产生成熟的miRNA。miRNA与实现靶mRNA分子沉默的多组分核糖核蛋白复合体或RISC结合(Holding，C.“Modeling miRNA mechanisms”，The Scientist，2003年9月25日)。RISC只结合双链miRNA分子的一条链。另一条链被细胞降解。
在植物、昆虫和线虫中，RNA干扰是产生定向敲除(KO)表型的唯一实用方法。但是，RNA干扰技术直到最近才看来适用于哺乳动物系统。在哺乳动物中，dsRNA使dsRNA激活蛋白激酶(PKR)激活，导致细胞凋亡级联和细胞死亡(Der等(1997)Proc Natl Acad Sci U S A.4月1日；94(7)：3279-83.)。因此，RNA干扰似乎限于低等真核生物的遗传调节。但是Elbashir及其同事在2001年发现，PKR激活需要长度超过30个碱基对的dsRNA。因此，可将短RNA序列引入到哺乳动物细胞中而不引发细胞凋亡级联。基于在线虫中建立的数据，发现21-23个碱基对的siRNA序列可有效抑制基因表达。因此，通过提供分离的这些序列，有可能靶向减低的基因表达，同时绕过细胞的自然防卫机制(Elbashir等，(2001)Nature411：494-498)。Elbashir等的文章发表后3个月内，有多种长度均小于30个碱基对的siRNA分子显示有效减少哺乳动物细胞中的基因表达(Caplen等，(2001)Proc Natl Acad Sci98(17)：9742-9747)。这些双链siRNA分子包含有义链和反义链。在这些发现之后，有几个研究小组鉴定出另外的一些策略，来稳定双链干扰RNA分子以及创建不同类型的iRNA分子，以便将它们引入到细胞中。
Fire等的美国专利第6,506,559号要求保护通过将RNA以足够量引入到细胞中以抑制靶基因的表达，从而在体外抑制细胞中的靶基因的方法，其中RNA是双链分子，其第一链基本由对应于靶基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列组成，第二链基本由与靶基因核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列组成，其中第一和第二核糖核苷酸链是单独的互补链，它们互相杂交形成所述双链分子，而双链分子抑制靶基因的表达。
Caplen等的PCT出版物WO03/012052公开了合成的小双链RNA分子，其长度为15至40个核苷酸，每条链上有长约0-5个核苷酸的3′或5′突出端，其中所述双链RNA的序列与靶基因的mRNA或转录物的一部分基本相同。该出版物还公开了可用以检测基因“沉默”对细胞功能的作用的siRNA阵列。
Brown等的美国出版物2003/0166282公开了高效价siRNA分子。该出版物描述了siRNA分子的合成方法(如酶法)以及修饰核苷酸类似物在siRNA分子中的应用。
小双链RNA分子向细胞中的传递并不适合体内应用，部分原因在于分子传递的低效率和不确定性，而且还因为它只导致iRNA的瞬时表达。iRNA技术的下一进展是在细胞中从DNA模板产生iRNA，以在细胞中获得iRNA分子的稳定表达。
Benitec Australia Ltd.的美国专利第6,573,099号和PCT出版物WO99/49029要求保护分离的遗传构建物，所述遗传构建物含有至少两个拷贝的结构基因序列，能够延迟、抑制或以其它方式减少转染了该遗传构建物的动物细胞中靶基因的表达。结构基因序列可以说是与靶基因的至少一个区基本相同的核苷酸序列，且至少有两个拷贝的结构基因序列被有效置于单一启动子序列的控制之下，从而至少有一个拷贝的结构基因序列以有义方向有效置于启动子序列的控制之下。
在2002年，Brummelkamp等(Science(2002)296：550-553)报告了在哺乳动物细胞中表达siRNA的稳定载体系统。所述载体含有RNA聚合酶III H1启动子，接着是siRNA序列和poly-T尾(pSUPER)。所述siRNA含有有义链，五、七或九个核苷酸的环序列，以及反义序列。同样在2002年，Brummerlkamp等(Cancer Cell(2002年8月22日在网上发表))报告了使用反转录病毒载体(pRETRO-SUPER)来表达siRNA。
美国麻塞诸塞大学(University of Massachusetts)的PCT出版物WO03/006477公开了增加dsRNA稳定性的RNA发夹结构。所述发夹由与靶标(target)互补的茎和与其互补的第二个茎及连接两个茎的环部分构成，推定其在细胞内部被切割，以提供双链体mRNA。这种dsRNA分子是上述切酶的底物。该出版物还公开了外源启动子如Pol II或PolIII控制之下的含有编码这种siRNA分子的DNA的表达构建物。
Tuschl等的美国出版物2003/0108923描述了长约21至约23个核苷酸的分离RNA，其介导对其所对应的mRNA的RNA干扰，还描述了编码所述分离RNA的分离DNA。
美国加州理工学院(California Institute of Technology)的PCT出版物WO03/023015公开了使用反转录病毒载体系统在细胞中表达siRNA的方法。此外，该出版物还指出，siRNA表达可用于通过干扰病毒基因组或宿主细胞基因中病毒复制所需的靶核酸，抑制病原体生命周期的各个方面，来治疗或预防感染。该出版物具体说明人类病毒感染的治疗。所公开的构建物包含至少一个RNA Pol III启动子、RNA有义区、RNA反义区和隔开方向不同的有义区和反义区的环区。
Engelke等的美国专利申请第2003/0148519号描述了供在细胞中表达的发夹RNA结构。该申请描述了供在细胞中表达siRNA和RNA发夹的表达盒，其由外源启动子元件如U6RNA聚合酶启动子驱动。
Cancer Research Technology，Ltd的PCT出版物WO03/056012描述了供在细胞中稳定表达siRNA的系统。该系统包括RNA聚合酶III(Pol III)启动子、编码siRNA的区域和包含五个连续胸腺嘧啶残基的转录终止元件。该出版物公开说可以使用多个siRNA序列，但它建议说如果使用多个siRNA序列，则它们应被表达成分开的转录物。
iRNA技术发展的下一进展是创建能够从DNA模板产生iRNA分子并将他们传递给后代的转基因动物。提供iRNA分子的可遗传表达成为主要的研究目标。其中基因功能被有效消除的细胞和动物的产生，不但提供有价值的研究工具，而且对于使异种移植、治疗用克隆和遗传改进农业(genetically enhanced agriculture)的潜力成为现实，其价值也是无法衡量的。
2002年，Hasuwa等(FEBS Letters532：227-230)报告了基于转基因的RNAi系统，所述系统在小鼠和大鼠中使用由PolII启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)siRNA。具体的说，所用的启动子是H1启动子，siRNA区含有有义序列、连接序列和eGFP的反义序列。该构建物允许DNA随机整合到动物基因组中，以得到普遍表达。
2003年，Carmell等(Nature Structural Biology10(2)91-92)报告了通过随机插入含有外源启动子和siRNA序列的转基因，在小鼠中进行RNAi的种系传递。同样在2003年，Kunath等(Nature Biotechnology(2003年5月)21：559-561)报告了用转基因短发夹RNA(shRNA)通过随机整合产生弱化(knockdown)鼠胚胎干(ES)细胞系。将含有H1RNA聚合酶启动子、接着是shRNA序列(被七碱基对间隔区隔开的有义和反义序列)、再接着是五个终止转录的胸苷的线性化转基因通过电穿孔引入到ES细胞中，以实现构建物的随机整合，导致靶基因的遗传无效表型。Kunath等讨论了通过siRNA技术不必进行基因寻靶即可测试体内基因功能的好处。
Tranzyme，Inc.和Ozgene Pty.，Ltd.的PCT出版物WO03/059923描述了用慢病毒载体生产基因修饰动物。具体的说，所述的载体包含由外源启动子序列驱动的选择性标记以供随机整合。该出版物描述了包含于基因转移载体中的目的核苷酸序列，所述载体包含表达能够介导RNA干扰的RNA分子的多核苷酸序列。
Oxford Biomedica，Ltd.的WO03/056022描述了用慢病毒载体随机插入基因组中来生产转基因细胞的方法。可以使用的核苷酸包括siRNA和外源启动子，如RNA聚合酶启动子。
2003年，有报告说已开发出iRNA靶向策略，以用置于外源启动子控制之下的表达载体同时靶向两个基因，供随机整合(Yu等(2003)Molecular Therapy7：228-236，Anderson等(2003)Oligonucleotides，13：303-312)。Karlas等(2004Virology325：18-23)公开了用对应于PERV基因的不同部分的iRNA分子通过iRNA来抑制猪内源反转录病毒。在外源聚合酶III启动子的控制之下，iRNA分子在体外被表达为短发夹RNA，供随机整合。
Finney和Lofquist的题为“Compositions and Methods for generatingConditional Knockouts”的美国专利出版物2004/0045043公开了通过条件性敲除策略鉴定疾病相关基因、产生疾病动物模型和确定候选药物的方法。该出版物公开了采用同源重组将siRNA靶标(不是siRNA分子)工程转入内源基因中。
虽然已开发出用以提供具有可遗传转基因的动物的初始策略，但还需要更多的改进来进一步控制蛋白质表达，使对宿主细胞或生物体的不利影响减至最低。
因此，本发明的一个目标是提供抑制细胞和动物中蛋白质表达的改进方法。
还有，本发明的一个目标是提供细胞和动物，其抑制靶蛋白在细胞和动物中表达的能力提高，且任选其它正常过程受破坏最少。
本发明的另一个目标是提供新的工具，以实现对蛋白质的有效抑制。
本发明的还一个目标是将抑制蛋白质的新技术应用于长期存在需求的具体领域。
发明概述
本发明提供用以抑制细胞和动物中蛋白质表达的改进技术。在一个实施方案中，本发明提供抑制蛋白质表达的新方法和材料，所述方法包括应用对细胞或动物稳态影响最低的定向插入型载体。具体的说，提供编码抑制靶蛋白的iRNA的DNA模板，所述DNA模板(i)使用细胞的内源调节元件，如内源启动子，(ii)靶向到基因的内含子序列中，和/或(iii)不破坏细胞的稳态。在第二个实施方案中，提供新的iRNA分子及其编码DNA序列，以及产生它们方法。在一个实例中，提供其中两条链均与待抑制蛋白质的靶mRNA互补的iRNA分子(本文中称为“cTarget”)，其可以为发夹的形式。在第三个实施方案中，提供调节共有共同同源序列的特定基因或基因家族的表达的iRNA分子，使得基因的表达被功能性消除。
在本发明的一个方面，提供在预定位置表达iRNA分子的转基因细胞和动物的产生方法，还提供据此产生的细胞和动物。在一个实施方案中，将产生iRNA分子、含有靶向基因组中特定位置的序列的DNA模板或构建物引入到细胞中，以使DNA模板置于细胞的内源调节元件如启动子和/或其它基因调节元件的控制之下。在另一个实施方案中，可如此靶向DNA模板，使得可以实现iRNA分子的表达而不破坏内源基因功能。在一个实施方案中，DNA模板可以为载体的形式。所述载体可直接引入到细胞中，或者线性化后再引入到细胞中。在另一个实施方案中，DNA模板可被合成为寡核苷酸并引入到细胞中。在一个实施方案中，DNA模板可通过定向整合而整合到细胞的基因组中。定向整合可通过同源重组来进行。DNA模板可含有与靶基因同源的5′和3′靶向序列，以允许定向插入。DNA模板可通过同源重组插入到例如看家基因中，使得iRNA分子的表达置于看家基因的相关启动子控制之下。或者，DNA模板可通过同源重组插入到只在特定细胞或器官中表达的基因中，使得iRNA分子的表达置于细胞或器官特异性基因的相关启动子控制之下。这种模板可引入到哺乳动物细胞如人、猪、绵羊或牛细胞，细菌细胞如大肠杆菌细胞和/或酵母细胞中。
在其它实施方案中，可设计用以产生iRNA分子的DNA模板/构建物，以便整合到靶基因的外显子中。在另一个实施方案中，可设计用以产生iRNA分子的DNA模板，以便整合到靶基因的内含子中，如整合到内源内含子的非必需位置中。可如此靶向DNA模板，使得靶基因的内源启动子指导外源DNA模板的转录。在又一个实施方案中，可将用以产生iRNA分子的DNA模板埋置于工程(engineered)内含子中，以整合到靶基因的内含子或外显子中。这些工程内含子可从任何内源内含子衍生。在一个实施方案中，内源内含子可简化为其最小功能元件。在另一个实施方案中，可将限制位点添加到工程内含子中。在一个实施方案中，限制酶切位点允许将DNA模板放置于工程内含子中。在又一个实施方案中，可将合成内含子插入到内源外显子或内含子中，而不破坏内源基因的功能。
在另一个实施方案中，提供其中表达干扰RNA分子以调节靶基因表达的细胞和动物的生产方法。本发明这个方面的方法可包括：(i)鉴定至少一个与靶mRNA互补的iRNA序列；(ii)制备编码iRNA序列的DNA构建物；(iii)鉴定细胞中的靶内源核酸序列；(iv)将DNA构建物引入到细胞中，其中DNA构建物还含有与内源靶基因同源的侧翼序列；和/或(v)在使得iRNA分子结合靶mRNA序列，从而调节一种或多种靶mRNA的表达的条件下，在细胞中表达DNA构建物。在一个实施方案中，本发明提供生产非人转基因动物的方法，该转基因动物可遗传地表达调节一种或多种靶基因表达的iRNA分子。在一个实施方案中，所述动物可通过体细胞核转移来产生。可通过本文描述的任何技术对体细胞进行工程改造，以表达iRNA分子。
在本发明的另一个方面，提供其中的两条链均与mRNA靶序列互补的ds iRNA分子(在本文中称为“cTarget”)。由于双链iRNA(ds iRNA)分子在胞内被加工，其两条链中只有一条实际发挥抑制靶mRNA的功能。本发明提供新型ds iRNA分子，其中两条链均具有功能，即均可结合靶RNA序列。在此发现之前，iRNA分子的设计使得iRNA分子只有一条链具有功能(即通常一条链与靶序列基本相同，或称“有义”链，而另一条链是与靶序列互补的功能链，或称“反义”链)，因此如果非功能链在体内被加工，不会产生抑制作用。
在一个实施方案中，ds iRNA分子可含有第一cTarget核苷酸链，其与第二cTarget链序列杂交。在一个实施方案中，cTarget链可含有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。为获得这种iRNA分子，必须对cTarget序列各区段进行评估，以确定可杂交形成ds iRNA分子的部分。在一个实施方案中，可分析长度至少是100、200或300个核苷酸的cTarget序列各区段，以确定自杂交的区域。在一个实施方案中，可将这些序列输入到检测自杂交区域的计算机程序中，例如在一个具体的实施方案中为如M.Zuker Mfold网络服务器中所述的用于核酸折叠和杂交预测的MFold软件。Nucleic AcidsRes.31(13)3406-15，(2003)，[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi]。在一个实施方案中，cTarget序列可与相同的靶序列互补。在另一个实施方案中，cTarget序列可与不同的靶序列互补。在又一个实施方案中，ds iRNA分子可以是回文cTarget序列，其中的两条链相同或功能上相同。在一个实施方案中，可分析cTarget序列，以鉴定回文序列，例如通过使用计算机程序如DNAStrider来分析。
在其它实施方案中，提供产生为cTarget序列两条链的ds iRNA分子的DNA模板。在一个实施方案中，提供产生iRNA前体的DNA模板。在一个实施方案中，间隔区核苷酸序列可隔开两个cTarget序列。在另一个实施方案中，提供含有与靶标互补的第一链和与靶标互补的第二链(其与第一链基本杂交)及连接这两条链的间隔区序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，间隔区可形成环或发夹结构。这种发夹可在细胞内部被切割，以提供含有两个茎的双链体mRNA。在一个实施方案中，间隔区核苷酸序列长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个核苷酸。在另一个实施方案中，间隔区序列可含有形成环结构如mir30环结构的核苷酸，如Seq ID No4或本文描述的任何序列中的公开。在一个实施方案中，环结构可含有如至少2、3、4或5个核苷酸的第一核苷酸序列，接着是如至少2、3、4或5个核苷酸的第二核苷酸序列，接着是基本与第一核苷酸序列杂交的第三核苷酸序列，再接着是如至少2、3、4或5个核苷酸的第四核苷酸序列，从而形成二环结构。在一个实施方案中，这个二环结构可充当核酸酶如Drosha的底物。
在又一个实施方案中，两个cTarget链序列的侧翼可有另外的核苷酸序列。在一个实施方案中，该另外的核苷酸序列离cTarget链的5’和3’可至少有约3、4、5、10或15个核苷酸。在一个实施方案中，茎序列可在cTarget链序列的5’和3’。在一个实施方案中，茎序列可含有至少4、5、6或7个核苷酸。5’茎序列可含有位于第一cTarget链上游的第一、第二和第三核苷酸序列。3’茎序列可含有第四、第五和第六核苷酸序列，其中第五核苷酸序列与5’茎的第二核苷酸序列基本杂交，第四和第六核苷酸序列不与5’茎的第一和第三核苷酸序列杂交。茎序列可以是mir30茎序列，如本文描述的任何序列中所公开的序列。
在另一个实施方案中，另外的核苷酸序列可以是位于cTarget序列5’和/或3’的克隆位点。在一个实施方案中，克隆位点可以位于茎序列的5’和/或3’。克隆位点可含有工程限制酶切位点，以允许在更大序列中进行核苷酸序列的克隆和剪接。
在一个具体的实施方案中，DNA模板可产生具有至少以下所示靶标互补物A和靶标互补物B这两个成分的RNA分子，所述两个成分将被细胞加工，产生ds iRNA分子。一个非限制性说明性实施方案图示如下：
Figure BDA00003576454400111
在另一个实施方案中，可通过将单独的抑制性RNA(inhibitoryRNA)累加成阵列(array)或簇(cluster)来构建抑制性RNA。在一个实施方案中，提供一簇与或不与衔接序列串联连接的单独发夹iRNA。在一个实施方案中，这种结构可具有径向对称性(参见例如图2)。这些径向iRNA分子在序列上不具有径向对称性，但在结构上却能显示径向对称性。在另一个实施方案中，双链体RNA可与多种间隔序列连接，以产生近乎线性或弯曲的结构(参见例如图3)。可通过将一系列寡核苷酸与或不与间隔序列一起连接，然后将这些寡核苷酸的互补序列同样与或不与间隔序列一起以相反次序加入，来产生这些结构。在另外的实施方案中，可将这些结构策略进行组合，以产生复杂的结构。在其它实施方案中，径向iRNA和线性成簇iRNA可通过小干扰RNA介导mRNA的定向抑制。
在其它实施方案中，提供优化两条cTarget链或需要进行杂交的任何序列的杂交的方法。推定序列中的胞嘧啶残基可用尿嘧啶残基替代，因为非沃森-克里克碱基配对在RNA分子中是可能出现的。这些尿嘧啶残基可与鸟嘌呤或腺苷结合，从而潜在地提高链间的杂交程度。
在本发明的又一个方面，提供调节特定基因或基因家族的表达的iRNA分子，使得基因的表达被功能性消除。在一个实施方案中，提供至少两种靶向基因相同区域的iRNA分子。在另一个实施方案中，提供至少两种靶向同一基因的至少两个不同区域的iRNA分子。在又一个实施方案中，提供至少两种靶向至少两种不同基因的iRNA分子。本发明另外的实施方案提供上述基因靶向策略的组合。
在一个实施方案中，iRNA分子可以是同一序列。在另一实施方案中，iRNA分子可以是不同的序列。在另一个实施方案中，iRNA分子可以整合到同一或不同的载体或DNA模板中。在一个实施方案中，载体或DNA模板中的iRNA分子有效连接启动子序列，例如遍在表达启动子或细胞类型特异性启动子。在另一个实施方案中，载体或DNA模板中的iRNA分子不在启动子序列的控制之下。在又一个实施方案中，可将这些载体或DNA模板引入到细胞中。在一个实施方案中，载体或DNA模板可整合到细胞的基因组中。可通过随机整合或定向整合来整合到细胞中。定向整合可通过同源重组来进行。
在其它实施方案中，提供至少两种iRNA分子，其中一种或多种基因的家族可通过iRNA分子的表达来调节。在另一个实施方案中，提供至少三种、四种或五种iRNA分子，其中一种或多种基因的家族可通过iRNA分子的表达来调节。iRNA分子可与一种或多种基因中的保守序列同源。用本发明这种方法调节的基因家族可以是细胞内源的、相关病毒基因家族、在某病毒属中保守的基因家族、相关真核寄生基因家族，或更具体的说是猪内源反转录病毒基因家族。在一个具体的实施方案中，至少有两种iRNA分子可靶向至少两个为同一基因家族成员的不同基因。iRNA分子可靶向基因家族中的同源区域，因此一种iRNA分子可靶向多种基因的相同区域。
iRNA分子可例如选自但不限于以下类型的iRNA：反义寡核苷酸、核糖核酸酶、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、反向重复序列、短发夹RNA(shRNA)、小短暂调节RNA和成簇抑制性RNA(ciRNA)，包括径向成簇抑制性RNA、不对称成簇抑制性RNA、线性成簇抑制性RNA和复杂或复合成簇抑制性RNA。
在另一个实施方案中，提供用以调节哺乳动物细胞系或转基因动物中靶基因的iRNA分子表达，使得靶基因的表达被功能性消除或低于可检测水平，即靶基因的表达降低至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％。
在本发明这个方面的另一个实施方案中，提供产生细胞和动物的方法，其中表达干扰RNA分子从而调节靶基因的表达。根据本发明这个方面的方法可包括例如：鉴定细胞中的一种或多种靶核酸序列；获得至少两种结合靶核酸序列的iRNA分子；将任选包装在表达载体中的iRNA分子引入到细胞中；和在细胞中使得iRNA结合靶核酸序列从而调节一种或多种靶基因表达的条件下，表达所述iRNA。在一个实施方案中，本发明提供产生非人转基因动物的方法，所述转基因动物可遗传地表达至少两种调节一种或多种靶基因表达的iRNA分子。在一个实施方案中，所述动物可通过体细胞核转移产生。体细胞可被工程改造，通过本文描述的任何技术表达iRNA分子。
在其它实施方案中，本发明还提供在细胞或转基因动物中表达至少两种iRNA分子的方法，所述iRNA靶向基因家族中的共同位置。这种方法可包括例如：鉴定细胞中为基因家族中的同源区域的一种或多种靶核酸序列；制备至少两种结合靶核酸序列的iRNA分子；将任选包装在表达载体中的iRNA分子引入到细胞中；和在细胞或动物中使得iRNA分子结合基因家族中的同源区域的条件下，表达所述iRNA。
本发明还提供通过本发明方法产生的转基因非人动物。本发明的方法可用于例如产生转基因非人动物(例如小鼠、大鼠、有蹄类动物、绵羊、山羊、牛、猪、兔、狗、马、骡、鹿、猫、猴和其它非人灵长类动物)、禽类(特别是鸡、鸭和鹅)、鱼、爬行动物、两栖动物、蠕虫(例如秀丽线虫)和昆虫(包括但不限于蚊、果蝇、粉斑夜蛾(trichoplusa)和灰翅夜蛾(spodoptera))。虽然可以产生任何种类的非人动物，但在一个实施方案中，非人动物是转基因有蹄类动物，包括猪。本发明还提供从这种非人转基因动物分离的细胞、组织和器官。
在本发明的实施方案中，可通过至少两种iRNA分子的表达进行调节的内源基因包括但不限于细胞存活或细胞复制所需的基因、病毒复制所需的基因、编码免疫球蛋白基因座例如κ轻链的基因和编码细胞表面蛋白例如血管细胞黏着分子(VCAM)的基因，以及其它对细胞、组织、器官和动物的结构和/或功能重要的其它基因。也可使用本发明的方法，通过干扰RNA的可遗传转基因表达，调节转基因细胞或转基因动物中的一种或多种非编码RNA序列的表达。这些非编码RNA序列可以是RNA病毒基因组、内源基因、真核寄生基因的序列，或者是本领域公知和普通技术人员熟悉的其它非编码RNA序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，猪内源反转录病毒(PERV)基因可通过至少两种iRNA分子的表达来调节，使得PERV病毒的表达被功能性消除或低于检测水平。PERV是反转录病毒家族，迄今已鉴定出其中的三种主要类型：PERV-A(Genbank检索号AF038601)、PERV-B(EMBL检索号PERY17013)和PERV-C(Genbank检索号AF038600)(Patience等1997，Akiyoshi等1998)。PERV-A、B和C的gag和pol基因高度同源，而env基因在PERV的不同类型(例如PERV-A、PERV-B、PERV-C)之间有显著差异。最近也已鉴定出PERV-D(参见例如美国专利第6,261,806号)。
在一个实施方案中，靶向PERV病毒的iRNA可使PERV表达降低至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％，或者低于可检测水平。为实现这个目标，本发明提供至少两种靶向PERV基因组的gag、pol或env区域中相同序列的iRNA分子。此外还提供至少两种靶向PERV基因组的gag、pol或env区域中不同序列的iRNA分子。另外还提供至少两种靶向PERV基因组的不同区域(即gag、pol或env)的iRNA分子。另外，提供组合使用这些不同靶向策略的多种iRNA分子，例如提供至少两种靶向PERV的gap区域的RNA干扰分子；至少两种靶向PERV的pol区域的RNA干扰分子；至少两种靶向PERV的env区域的RNA干扰分子，以靶向PERV基因。
本发明还提供有蹄类动物(特别是猪)，以及从非人转基因动物分离的细胞、组织和器官，其中PERV表达已通过至少两种iRNA分子的表达被功能性消除。在某些这种实施方案中，它们从表达一种或多种干扰猪内源反转录病毒基因、猪内源反转录病毒基因家族成员或猪内源反转录病毒基因家族亚群成员的干扰RNA的转基因猪获得。
本申请涉及以下实施方案：
1.一种生产转基因细胞的方法，所述方法包括将编码iRNA分子的DNA构建物插入到细胞基因组中的预定位置。
2.一种生产转基因细胞的方法，所述方法包括将编码iRNA分子的DNA构建物插入到细胞基因组中的预定位置，其中所述插入不破坏细胞的正常基因表达。
3.一种调节靶mRNA的表达的方法，所述方法包括
(i)鉴定至少一种与靶mRNA互补的iRNA序列；
(ii)鉴定细胞中的靶内源基因序列；
(iii)制备编码iRNA序列的DNA构建物和与内源靶基因同源的靶向序列；
(iv)将DNA构建物引入到细胞中；和
(v)在iRNA分子得以表达的条件下使细胞生长，从而调节靶mRNA的表达。
4.上述项3的方法，其中所述插入是插入到靶基因的外显子中。
5.上述项3的方法，其中所述插入是插入到靶基因的内含子中。
6.上述项3的方法，其中所述插入不破坏被靶向基因的功能。
7.上述项3的方法，其中所述DNA构建物含有与靶基因同源的序列，允许靶基因与DNA构建物之间发生同源重组。
8.上述项3的方法，其中所述DNA构建物包含在合成内含子中。
9.上述项8的方法，其中所述合成内含子是功能性内含子。
10.上述项9的方法，其中所述合成内含子插入到内源内含子中。
11.上述项8的方法，其中所述合成内含子插入内源外显子中。
12.上述项1或2的方法，其中所述细胞是人细胞。
13.上述项1或2的方法，其中所述细胞是非人哺乳动物细胞。
14.上述项1或2的方法，其中所述DNA构建物编码作为Drosha底物的RNA分子。
15.上述项1或2的方法，其中所述iRNA分子是siRNA分子。
16.上述项1或2的方法，其中所述DNA通过同源重组插入到基因中。
16.一种转基因细胞，所述转基因细胞根据上述项1或2生产。
17.一种转基因动物，所述转基因动物包含上述项或2的细胞。
18.一种双链iRNA分子，所述iRNA分子包含与第一靶mRNA互补的第一核苷酸序列和与第二靶mRNA互补的第二核苷酸序列，其中所述第一和第二核苷酸序列基本互相杂交，形成双链iRNA分子。
19.上述项18的iRNA分子，其中所述第一和第二靶mRNA相同。
20.上述项18的iRNA分子，其中所述第一和第二靶mRNA不同。
21.上述项18的iRNA分子，其中所述第一和第二核苷酸序列是回文序列。
22.上述项18的iRNA分子，所述iRNA分子进一步包含隔开所述第一和第二核苷酸序列的第三核苷酸序列。
23.上述项18的iRNA分子，其中所述第一和第二核苷酸序列长度在19至32个核苷酸之间。
24.上述项22的iRNA分子，其中所述第三核苷酸序列长度在4至10个核苷酸之间。
25.一种DNA构建物，所述DNA构建物编码双链iRNA分子，所述iRNA分子包含与第一靶mRNA互补的第一核苷酸序列和与第二靶mRNA互补的第二核苷酸序列，其中所述第一和第二核苷酸序列基本互相杂交，形成双链iRNA分子。
26.一种生产双链iRNA分子以调节靶mRNA表达的方法，所述方法包括：
(i)鉴定至少一种与靶mRNA互补的核苷酸序列；
(ii)分析互补序列，以鉴定所述序列可互相杂交的部分；
(iii)制备包含步骤(ii)中鉴定出的两种互补序列的iRNA分子；
其中所述生产可在细胞中进行。
27.上述项26的方法，其中所述iRNA分子由DNA构建物编码。
28.上述项26的方法，其中所述iRNA分子进一步包含隔开所述互相杂交的两种互补核苷酸序列的第三核苷酸序列。
29.上述项26的方法，其中所述互补序列长度大约为19至32个核苷酸。
30.一种iRNA单分子，所述iRNA分子调节一个基因的至少两个区域的表达，其中所述基因的表达被功能性消除。
31.一种消除靶mRNA的表达的方法，所述方法包括给予两种靶向靶mRNA的同一区域的iRNA分子。
32.一种iRNA单分子，所述iRNA分子通过靶向基因家族所有成员共有的同源区域来调节基因家族的表达。
33.一种iRNA分子，所述iRNA分子抑制猪内源反转录病毒的表达。
34.上述项33的iRNA，所述iRNA结合多种类型的猪内源反转录病毒(PERV)。
35.上述项33的iRNA，其中所述iRNA结合PERV-A和PERV-B。
36.上述项33的iRNA，其中所述iRNA结合PERV-A和PERV-C。
37.上述项33的iRNA，其中所述iRNA结合PERV-B和PERV-C。
38.上述项33的iRNA分子，所述iRNA分子靶向猪内源反转录病毒的env区域。
39.上述项38的iRNA分子，所述iRNA分子靶向猪内源反转录病毒的gag区域。
40.上述项39的iRNA分子，所述iRNA分子靶向猪内源反转录病毒的pol区域。
41.上述项39的iRNA分子，所述iRNA分子靶向以下gag序列：GTTAGATCCAGGGCTCATAAT，或者靶向与所述gag序列基本同源或杂交的序列。
42.上述项40的iRNA分子，所述iRNA分子靶向以下pol序列：GTTAGATCCAGGGCTCATAAT，或者靶向与所述pol序列基本同源或杂交的序列。
附图简述
图1说明干扰RNA可介导细胞RNA的定向破坏的机制实例。在这种模型中，包含编码RNA有义链(黑框)和反义链(灰框，为反向序列)的核酸序列的表达载体与单一启动子(白框)有效连接。该构建物转录后，有义链结合其互补反义链，导致出现双链‘发夹’RNA分子(dsRNA)。该dsRNA随后被酶(切酶，也称RNA酶III)加工，产生小干扰RNA(siRNA)。然后一个siRNA与RNA诱导沉默复合体(RISC)和与靶细胞mRNA缔合。细胞mRNA与RISC的结合诱导mRNA的切割，从而限制特定基因产物的功能表达。
图2说明成簇抑制性RNA(ciRNA)可介导细胞RNA的破坏的机制实例。在这种模型中，表达载体包含编码多条互补RNA有义链(黑框)和反向反义链(灰框)的一段(pattern)核酸序列。此段核酸序列可与单一启动子(白框)有效连接。转录后，ciRNA转录物可自动折叠，使得每条有义链均可结合互补反义链。这种折叠可导致出现径向排列的双链RNA复合体，其在每条外轴上具有发夹结构。这个复合体可被酶(切酶，也称RNA酶III)加工，产生多个小干扰RNA(siRNA)分子。所得的siRNA分子可与RNA诱导沉默复合体(RISC)和与多个靶mRNA序列缔合。细胞mRNA与RISC的结合诱导mRNA序列的切割，从而消除一种或多种特定基因产物的功能表达。
图3说明成簇抑制性RNA(ciRNA)可介导细胞RNA的定向破坏的另一可能机制。在这种模型中，表达载体包含编码多条互补RNA有义链(黑框)和反向反义链(灰框)的核酸序列，所述核酸序列与单一启动子(白框)有效连接。转录后，ciRNA转录物自动折叠，使得每条有义链均可结合互补反义链。所得的结构可以是线性双链RNA复合体，含有至少一个发夹转角。这个线性双链ciRNA复合体然后可被酶(切酶，也称RNA酶III)加工，产生多种小干扰RNA(siRNA)分子。所得的siRNA分子可与RNA诱导沉默复合体(RISC)和与多种靶mRNA序列缔合。细胞mRNA与RISC的结合诱导mRNA序列的切割，从而消除一种或多种特定基因产物的功能表达。
图4是本发明分子的示图。本发明的分子含有一“套”或多“套”iRNA序列。这几套序列可包含至少一个靶向靶基因的单一区域(第一套)、靶基因的多个区域(第二套)或多个基因的区域(第三套)的iRNA序列。本文将对实施方案作进一步的描述和例证。
图5是可用于实施本发明的代表性启动子驱动载体(上)和代表性无启动子载体的示意图。
图6是本文中描述的“启动子包载”方法(上图)和“基因包载”技术(下图)的示图。在上图中，iRNA载体包含一种或多种iRNA序列(黑框)和与所需基因的一个或多个外显子序列同源的5′和3′序列(对角条纹框)。本图显示同源序列发生重组，以提供带iRNA插入片段的最终基因。在下图中，显示出基因包载载体包含一种或多种RNA序列、与基因中的内含子区域同源的序列(条纹框)和紧接在无启动子iRNA序列插入片段上游的剪接受体(SA)位点。iRNA插入片段在内含子中的整合可导致在转录时出现带基因上游外显子的融合转录物。
图7是四种基因的等位基因分析示意图。基因1显示具有三个等位基因。基因2、3和4显示各自具有四个等位基因。区域中图案相同的框表示同一序列。区域中图案不同的框表示该区域中的不同序列。区域1除基因1的等位基因A和B外，所有基因和等位基因的序列互不相同。区域2在所有家族成员中均保守。区域3中只发现两种序列。同样，区域4中只发现两种序列。区域5中发现七种序列。区域6在任何家族成员中均不保守。对区域2的有效靶向能使所有家族成员均被抑制。对见于区域3的两种序列中的一种的有效靶向指明一个基因亚群。可将多套靶向转基因装配在一起，以抑制等位基因或基因亚群。
图8显示对一部分PERV env基因的分析。跨越碱基6364-6384的区域在所示全部家族成员中同源。碱基6400和6401处的二核苷酸显示两种多态性。当靶向包含此二核苷酸的区域时，需要两个转基因来有效抑制所示的基因。跨越碱基6408-6431的区域代表三种多态性。同样，包含碱基6385的区域代表三种多态性。靶向三多态区中三种多态性之一的单一转基因区分所示序列的亚群。需要一套三种转基因——每种转基因靶向三多态区中的不同多态性——来靶向全部所示序列。
图9说明代表性的抑制性RNA靶标。第一行显示PERV半保守区域的86碱基共有序列。随后各行显示此序列中抑制性RNA的68个可能的19碱基靶标。靶标的长度可在17至35个碱基之间。这种方法可重复应用于17至35个碱基的靶标，且可应用于包含在任何完全或部分PERV基因组中的任何蛋白编码和非编码区域。所有的PERV序列均是可能靶标。第1行，PERV序列；第2-69行，可能靶标。
图10说明与非靶向基因共有显著同源性的可能靶标的鉴定。对靶基因的RNA序列与非靶向RNA的同源性进行筛选。未知的猪表达序列(Genbank检索号BI305054)的一个19碱基区域与半保守PERV序列的某个区域显著同源(以粗体显示)。虽然与非靶向RNA有显著同源性的可能靶标区域可证明是有用的，但在初始靶标筛选中排除这种靶标区域，以减少严重下调非预期基因产物的风险。第1行，PERV序列；第2-69行，可能靶标；第70行，未知表达的猪序列；第36-56行，被排除的靶标。
图11表示为图9首先列出的可能靶序列(图3第2行)设计的抑制性RNA的构型。其中“N”指任何核苷酸，“Y”指大于或等于0的任何整数。非指定序列(NY)的各部分可以是均聚体，或者可由非相同碱基组成。此外，非指定序列(NY)的任何连续序列段(stretch)可提供另外的功能，例如但不限于编码蛋白质，为稳定性和半寿期提高提供信号，增加回文序列的长度，为剪接或折叠成特定结构提供信号和功能。
图12表示靶向PERV gag共有序列的径向成簇抑制性RNA、不对称泡状(bubble)ciRNA、线性ciRNA和复杂ciRNA的示例性序列。
图13表示将基因各部分插入载体中的克隆策略的示意图。
发明详述
本发明提供用以抑制细胞中蛋白质表达的改进技术。在一个实施方案中，本发明提供抑制蛋白质表达的新方法和材料，所述方法包括应用对细胞稳态影响最低的定向插入型载体。具体的说，提供编码抑制靶蛋白的iRNA的DNA模板，所述DNA模板(i)使用细胞的内源调节元件，如内源启动子，(ii)靶向到基因的内含子序列中，和/或(iii)不破坏细胞的稳态。在第二个实施方案中，提供新的iRNA分子及其编码DNA序列，以及产生它们方法。在一个实例中，提供其中两条链均与待抑制蛋白质的靶mRNA互补的iRNA分子(cTarget)，其可以为发夹的形式。在第三个实施方案中，提供调节共有共同同源序列的特定基因或基因家族的表达的iRNA分子，使得基因的表达被功能性消除。
与基因敲除技术不同的是，RNA干扰(RNAi)是一种遗传显性现象，也就是说，不必使转基因成为纯合基因。此外，RNA干扰可靶向可能存在或不存在于基因组中的基因。
在本发明的一个方面，提供在预定位置表达iRNA分子的转基因细胞和动物的产生方法，还提供据此产生的细胞和动物。在一个实施方案中，将产生iRNA分子、含有靶向基因组中特定位置的序列的DNA模板引入到细胞中，以使DNA模板置于细胞的内源调节元件如启动子和/或其它基因调节元件的控制之下。在另一个实施方案中，可靶向DNA模板，使得可以实现iRNA分子的表达而不破坏内源基因功能。在一个实施方案中，DNA模板可以为载体的形式。所述载体可直接引入到细胞中，或者线性化后再引入到细胞中。在另一个实施方案中，DNA模板可被合成为寡核苷酸并引入到细胞中。在一个实施方案中，DNA模板可通过定向整合而整合到细胞的基因组中。定向整合可通过同源重组来进行。DNA模板可含有与靶基因同源的5’和3’靶向序列，以允许定向插入。DNA模板可通过同源重组插入到例如看家基因中，使得iRNA分子的表达置于看家基因的相关启动子控制之下。或者，DNA模板可通过同源重组插入到只在特定细胞或器官中表达的基因中，使得iRNA分子的表达置于细胞或器官特异性基因的相关启动子控制之下。这种模板可引入到哺乳动物细胞如人、猪、绵羊或牛细胞，细菌细胞如大肠杆菌细胞和/或酵母细胞中。
在本发明的另一个方面，提供其中的两条链均与mRNA靶序列互补的ds iRNA分子(cTarget)。由于双链iRNA(ds iRNA)分子在胞内被加工，其两条链中只有一条实际发挥抑制靶mRNA的功能。本发明提供新型ds iRNA分子，其中的两条链均具有功能，即均可结合靶RNA序列。在此发现之前，iRNA分子的设计使得iRNA分子只有一条链具有功能(即通常一条链与靶序列基本相同，或称“有义”链，而另一条链是与靶序列互补的功能链，或称“反义”链)，因此如果非功能链在体内被加工，不会产生抑制作用。
在本发明的又一个方面，提供调节特定基因或基因家族的表达的iRNA分子，使得基因的表达被功能性消除。在一个实施方案中，提供至少两种靶向基因的相同区域的iRNA分子。在另一个实施方案中，提供至少两种靶向同一基因的至少两个不同区域的iRNA分子。在又一个实施方案中，提供至少两种靶向至少两种不同基因的iRNA分子。本发明另外的实施方案提供上述基因靶向策略的组合。
在本发明的一个示例性实施方案中，猪内源反转录病毒(PERV)基因可通过至少两种iRNA分子的表达来调节，使得PERV病毒的表达被功能性消除或低于检测水平。PERV是反转录病毒家族，迄今已鉴定出其中的三种主要类型：PERV-A(Genbank检索号AF038601)、PERV-B(EMBL检索号PERY17013)和PERV-C(Genbank检索号AF038600)(Patience等1997，Akiyoshi等1998)。PERV-A、B和C的gag和pol基因高度同源，而env基因在PERV的不同类型(例如PERV-A、PERV-B，、PERV-C)之间有显著差异。最近也已鉴定出PERV-D(参见例如美国专利第6,261,806号)。
I.定义
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
本文所用术语“动物”是指包括任何动物，包括但不限于非人哺乳动物(包括但不限于猪、绵羊、山羊、牛、鹿、骡、马、猴和其它非人灵长类动物、狗、猫、大鼠、小鼠、兔)、禽类(包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅)、爬行动物、鱼、两栖动物、蠕虫(例如秀丽线虫)、昆虫(包括但不限于果蝇、粉斑夜蛾和灰翅夜蛾)。“转基因动物”是含有一个或多个细胞的任何动物，该细胞携带直接或间接通过亚细胞水平有意遗传操作获得的遗传信息。“转基因细胞”是携带直接或间接通过亚细胞水平有意遗传操作获得的遗传信息的任何细胞。
术语“有蹄类动物”指有蹄的哺乳动物。偶蹄动物(artiodactyl)是偶蹄(分趾蹄)有蹄类动物，包括羚羊、骆驼、牛、鹿、山羊、猪和绵羊。奇蹄动物(perissodactyl)是奇蹄有蹄类动物，包括马、斑马、犀牛和貘。
本文所用术语“猪”、“猪动物”是通用术语，指同一类型动物，不论其性别、大小或品种。
本文所用术语“可遗传的”，特别是用于“可遗传基因”、“可遗传性状”、“可遗传特征”、“可遗传iRNA”的上下文时，是指个体单位(unit)如基因、性状、特征、iRNA等能够被遗传或能够通过遗传传递。
本文所用术语“基因表达的调节”指控制基因转录的能力、时间选择、水平、方式或细胞类型的行动。如本文所述，调节可导致基因表达增加、基因表达下降或基因表达的保持。
II.iRNA分子
A.iRNA设计
在本发明的一个方面，提供其中的两条链均与靶序列互补的dsiRNA分子(cTarget)。由于双链iRNA(ds iRNA)分子在胞内被加工，其两条链中只有一条实际发挥抑制靶mRNA的功能。本发明提供新型dsiRNA分子，其中的两条链均具有功能，即均可结合靶RNA序列。在此发现之前，iRNA分子的设计使得iRNA分子只有一条链具有功能(即通常一条链与靶序列基本相同，或称“有义”链，而另一条链是与靶序列互补的功能链，或称“反义”链)，因此如果非功能链在体内被加工，不会产生抑制作用。
内源iRNA加工
微小RNA(miRNA)是涉及基因的转录后调节的小内源RNA。一种这样的miRNA(mir30)被转录成大转录物(primir30)，后者通过Drosha被加工成较小的发夹结构(pre-mir30)而转运出细胞核。在细胞质中，pre-mir30被切酶进一步加工产生成熟mir30。这个过程是本领域公知的(参见例如Zeng Y，Cullen BR.Structural requirements forpre-microRNA binding and nuclear export by Exportin5.Nucleic AcidsRes.2004年9月8日；32(16)：4776-85；Zeng Y，Cullen BR.Sequencerequirements for micro RNA processing and function in human cells.RNA.2003年1月；9(1)：112-23)。一部分pri-mir30的MFold(用于核酸折叠与杂交预测的M.Zuker.Mfold网络服务器.Nucleic Acids Res.31(13)，3406-15，(2003)[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi])推定预测结构如下所示：
Figure BDA00003576454400241
Pre-mir30Drosha切割产物的MFold推定预测结构如下所示：
Figure BDA00003576454400242
以上序列的核苷酸序列是
UGUAAACAUCCUCGACUGGAA GCUGUGAAGCCACAGAUGGGCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC(Seq ID No1).
已描述了供体外切割的最小pri-mir30Drosha底物(Lee Y，Ahn C，Han J，Choi H，Kim J，Yim J，Lee J，Provost P，Radmark O，Kim S，KimVN.The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing.Nature.2003年9月25日；425(6956)：415-9)。此底物的推定预测结构如下所示：
Figure BDA00003576454400251
以上序列的核苷酸序列是
UGCUGUUGACAGUGAGCGACUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCUGUGAAGCCACAGAUGGGCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGCUGCCUACUGCCUCGGACUUCAAGGG(Seq ID No2).
也已描述了在无关mRNA情景下供体内切割的最小pri-mir30Drosha底物(Zeng Y，Wagner EJ，Cullen BR.Both natural and designedmicro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressedin human cells.Mol Cell.2002年6月；9(6)：1327-33；Zeng Y，Cullen BR.Sequence requirements for micro RNAs processing and function in humancells.RNA.2003年1月；9(1)：112-23)。此底物的推定预测结构如下所示：
Figure BDA00003576454400252
以上序列的核苷酸序列是
GCGACUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCUGUGAAGCCACAGAUGGGCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGCUGC(Seq ID No3).
另外，已显示miRNA的活性部分可被替代以产生具有siRNA活性的新型发夹(Zeng Y，Wagner EJ，Cullen BR.Both natural and designedmicro RNAs can inhibit the expression of cognate mRRNAs when expressedin human cells.Mol Cell.2002年6月；9(6)：1327-33；；Boden D，Pusch O，Silbermann R，Lee F，Tucker L，Ramratnarn B.Enhanced gene silencing ofHIV-1specific siRNA using microRNA designed hairpins.Nucleic AcidsRes.2004年2月13日；32(3)：1154-8)。
iRNA分子
在一个实施方案中，ds iRNA分子可含有第一cTarget核苷酸链，其与第二cTarget链序列杂交。cTarget链可含有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸，特别是长度为19-32个核苷酸，或者21-23个核苷酸。
也提供获得为第一cTarget核苷酸链的iRNA分子的方法，所述第一cTarget链与第二cTarget链序列杂交。首先测定靶序列的互补序列(cTarget)，然后可评估cTarget序列的各区段，以确定将互相杂交形成ds iRNA分子的各部分。在一个实施方案中，可分析长度至少是25、50、100、200、300、400或500个核苷酸的cTarget序列各区段，以确定自杂交的区域。在一个实施方案中，可将这些序列输入到检测自杂交区域的计算机程序中，例如在一个具体的实施方案中为如M.Zuker Mfold网络服务器中所述的用于核酸折叠和杂交预测的MFold软件。Nucleic Acids Res.31(13)3406-15，(2003)，[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi]。
在其它实施方案中，提供产生为cTarget序列两条链的ds iRNA分子的DNA模板。在一个实施方案中，提供产生iRNA前体的DNA模板。在一个实施方案中，间隔区核苷酸序列可隔开两个cTarget序列。在另一个实施方案中，提供含有与靶标互补的第一链和与靶标互补的第二链(其与第一链基本杂交)及连接这两条链的间隔区序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，间隔区可形成环或发夹结构。这种发夹可在细胞内部被切割，以提供含有两个茎的双链体mRNA。在一个实施方案中，间隔区核苷酸序列长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40或50个核苷酸。在另一个实施方案中，间隔区序列可含有形成环结构如mir30环结构的核苷酸。mir30环结构可含有至少以下序列：GUGAAGCCACAGAUG(Seq ID No4)或本文所列任何序列中所说明的序列。在一个实施方案中，环结构可含有如至少2、3、4或5个核苷酸的第一核苷酸序列，接着是如至少2、3、4或5个核苷酸的第二核苷酸序列，接着是基本与第一核苷酸序列杂交的第三核苷酸序列，再接着是如至少2、3、4或5个核苷酸的第四核苷酸序列，从而形成二环结构。在一个实施方案中，这个二环结构可充当核酸酶如Drosha的底物。
在又一个实施方案中，两个cTarget链序列的侧翼可有另外的核苷酸序列。该另外的核苷酸序列离cTarget链的5’和3’可至少有约3、4、5、10或15个核苷酸。在一个实施方案中，茎序列可在cTarget链序列的5’和3’。该茎序列可含有至少4、5、6或7个核苷酸。5’茎序列可含有位于第一cTarget链上游的第一、第二和第三核苷酸序列。3’茎序列可含有第四、第五和第六核苷酸序列，其中第五核苷酸序列与5’茎的第二核苷酸序列基本杂交，第四和第六核苷酸序列不与5’茎的第一和第三核苷酸序列杂交。茎序列可以是mir30茎序列，如本文所列任何序列中所公开的序列，如Seq ID No5。
在另一个实施方案中，另外的核苷酸序列可以是位于cTarget序列5’和/或3’的克隆位点。在一个实施方案中，克隆位点可以位于茎序列的5’和/或3’。克隆位点可含有工程限制酶切位点，以允许在更大序列中进行核苷酸序列的克隆和剪接。
在一个具体的实施方案中，DNA模板可产生具有至少以下所示靶标互补物A和靶标互补物B这两个成分的RNA分子，所述两个成分将由细胞加工以形成ds iRNA分子：
Figure BDA00003576454400271
以上序列的核苷酸序列是
GAUCUGCGCUGACUGUAUAUCUUGAUCAGGCUGUGAAGCCACAGAUGAGCUUGGGGAGAAUAUAGUCGAUGCUGAUC(Seq ID No5).
在一个实施方案中，DNA模板可产生Drosha底物，后者被加工成功能性iRNA分子。
在一个实施方案中，cTarget序列可与相同的靶序列互补。在另一个实施方案中，cTarget序列可与不同的靶序列互补。在又一个实施方案中，ds iRNA分子可以是回文cTarget序列，其中的两条链相同或功能上相同。在一个实施方案中，可分析cTarget序列，以鉴定回文序列，例如通过使用计算机程序如DNA Strider来分析。
在其它实施方案中，提供优化两条cTarget链或期望杂交的任何序列的杂交的方法。推定序列中的胞嘧啶残基可用尿嘧啶残基替代，因为非沃森-克里克碱基配对在RNA分子中是可能出现的。这些尿嘧啶残基可与鸟嘌呤或腺苷结合，从而潜在地提高链间的杂交程度。
同时靶向mRNA的两个位点
在一个实施方案中，cTarget序列可与相同的靶序列互补。通过使用与mRNA互补的序列，可以设计iRNA分子如发夹，其中茎的两条链均与靶mRNA互补。在一个实施方案中，这种发夹可充当Drosha底物，所得结构可被切割产生两条链，各链均能发挥对靶mRNA的抑制作用。
首先测定靶序列的互补序列(cTarget)，然后可评估cTarget序列的各区段，以确定将互相杂交形成ds iRNA分子的各部分。在一个实施方案中，可分析长度至少是25、50、100、200、300、400或500个核苷酸的cTarget序列各区段，以确定自杂交的区域。在一个实施方案中，可将这些序列输入到检测自杂交区域的计算机程序中，例如在一个具体的实施方案中为如M.Zuker Mfold网络服务器中所述的用于核酸折叠和杂交预测的MFold软件。Nucleic Acids Res.31(13)3406-15，(2003)，[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi]。然后可鉴定自杂交区域并测试其在细胞中的作用。
同时靶向两种mRNA
除上述策略外，还可将两种mRNA的反义链部分组合，产生潜在地靶向两种mRNA的单一iRNA分子，如发夹iRNA分子。可首先测定每种靶序列的互补序列(cTarget)，然后可将每种cTarget序列的各区段剪接在一起。例如，第一靶标的cTarget(cTarget1)的至少25、50、100、200、300、400或500个核苷酸可与第二靶标的cTarget(cTarget2)的至少25、50、100、200、300、400或500个核苷酸连接。可评估此核苷酸序列，以确定其将互相杂交形成ds iRNA分子的各部分。在一个实施方案中，可将这些序列输入到检测自杂交区域的计算机程序中，例如在一个具体的实施方案中为如M.Zuker Mfold网络服务器中所述的用于核酸折叠和杂交预测的MFold软件。Nucleic Acids Res.31(13)3406-15，(2003)，[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi]。然后可鉴定cTarget1与cTarget2之间的杂交区域，并测试其在细胞中对靶mRNA抑制的作用。
回文序列
在又一个实施方案中，ds iRNA分子可以是回文cTarget序列，其中的两条链相同或功能上相同。在一个实施方案中，可分析cTarget序列，以鉴定回文序列，例如通过使用计算机程序如DNA Strider来分析。在一个实施方案中，提供鉴定回文序列的方法，其中首先确定靶mRNA的互补序列。然后可分析此序列，确定是否存在长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸，特别是19-32个核苷酸或21-23个核苷酸的回文序列。在另一实施方案中，可用计算机程序如DNA Strider软件评估这种序列。这种回文iRNA分子基本消除iRNA加工中内源链选择的作用。
可优化发夹形成
在其它实施方案中，提供优化两条cTarget链或期望杂交的任何序列的杂交的方法。推定序列中的胞嘧啶残基可用尿嘧啶残基替代，因为非沃森-克里克碱基配对在RNA分子中是可能出现的。这些尿嘧啶残基可与鸟嘌呤或腺苷结合，从而潜在地提高链间的杂交程度。在一个实施方案中，可用这种策略修饰Drosha底物，同时RNAi靶向没有发生显著改变。
成簇抑制性RNA(ciRNA)：径向和线性
另外，可通过将单独的抑制性RNA累加成阵列或簇，来构建抑制性RNA。可使用各种结构模体。一种这样的模体是一簇与或不与衔接序列串联连接的单独发夹iRNA。这种结构在结构上可具有径向对称性(参见例如图2)，但在序列上不具有径向对称性，也就是说是径向iRNA分子。或者，双链体RNA可与各种间隔序列连接，以产生近乎线性或弯曲的结构(参见例如图3)。可通过将一系列寡核苷酸与或不与间隔序列一起连接，然后将这些寡核苷酸的互补序列同样与或不与间隔序列一起以相反次序加入，来产生这些结构。此外，可将各种结构策略组合，以产生复杂的结构。径向成簇抑制性RNA结构和线性成簇抑制性RNA结构可通过小干扰RNA介导细胞RNA的定向破坏。
可生产成簇抑制性RNA，使得单一表达载体或DNA模板包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75或100种能够靶向mRNA序列上单一区域的siRNA分子(参见例如图4(a))。另外，可生产成簇抑制性RNA，使得单一表达载体或DNA模板包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75或100种能够靶向单一mRNA靶序列上多个区域的siRNA(参见例如图4(b))。或者，可生产成簇抑制性RNA，使得单一表达载体包含不只一种能够靶向多个mRNA靶标上多个区域的siRNA分子(参见例如图4(c))。在另一个实施方案中，可生产成簇抑制性RNA，使得单一表达载体包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75或100种能够靶向多种mRNA靶序列上同源区域的siRNA分子。
B.另外的iRNA分子
反义寡核苷酸
一般来说，反义寡核苷酸包含一种或多种在同一性、数量和大小上足以实现与预选择核酸序列发生特异性杂交的核苷酸序列。依照本发明使用的反义寡核苷酸通常具有经选择与靶核酸序列(适宜为靶细胞或生物体中的mRNA)充分互补的序列，使得反义寡核苷酸优选在生理条件下与mRNA形成稳定杂交体，抑制mRNA序列的翻译。反义寡核苷酸可与靶基因序列的一部分100％互补。反义寡核苷酸也可与靶核酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补。
可依照本发明使用的反义寡核苷酸可按本领域公知和普通技术人员熟悉的方法合成和使用。有关反义寡核苷酸的合成、设计、选择和使用的代表性教导包括但不限于例如美国专利第5,789,573号、美国专利第6,197,584号和Ellington，“Current Protocols in Molecular Biology，”第2版，Ausubel等编辑，Wiley Interscience，New York(1992)。
核酶
可用于本发明的核酸分子还包括核酶。一般来说，核酶是具有酶活性的RNA分子，通常涉及其结合的核酸序列的切割、剪接或连接。核酶的典型底物包括RNA分子，尽管核酶也可催化DNA分子充当底物的反应。在核酶中可鉴定出两个独特区域：通过与特定核酸序列杂交赋予核酶特异性的结合区域和赋予核酶切割、连接或剪接活性的催化区域。在胞内有活性的核酶以顺式方式工作，只催化单次转化反应，且通常在反应过程中发生自修饰。但是，可将核酶工程改造成以反式方式即真正的催化方式起作用，其转化次数大于一，且不发生自修饰。由于核酶的催化性质，单个核酶分子可切割许多靶核酸分子，因此实现治疗活性的浓度比反义治疗中所需的相对较低(参见例如WO96/23569)。
可依照本发明使用的核酶可按本领域公知和普通技术人员熟悉的方法合成和使用。有关核酶的合成、设计、选择和使用的代表性教导包括但不限于例如美国专利第4,987,071号和美国专利第5,877,021号。
小干扰RNA(siRNA)
RNA干扰通过与其“靶标”核酸序列具有序列特异性同源性的双链RNA(dsRNA)分子来介导(Caplen，N.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：9742-9747(2001))。在果蝇无细胞裂解液中进行的生化研究表明，在本发明的某些实施方案中，依赖于RNA的基因沉默的介质是21-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。因此，siRNA分子适合用于本发明的方法中。siRNA分子衍生自叫做切酶的RNA酶对dsRNA的加工(Bernstein，E.等，Nature409：363-366(2001))。siRNA双链体产物被募集到叫做RISC(RNA诱导沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。尽管不想受任何具体理论的约束，但认为RISC然后被引导到靶核酸(适宜为mRNA)，在那里siRNA双链体以序列特异性方式发生相互作用，从而以催化方式介导切割作用(Bernstein，E.等，Nature409：363-366(2001)；Boutla，A.等，Curr.Biol.11：1776-1780(2001))。
可依照本发明使用的小干扰RNA可按本领域公知和普通技术人员熟悉的方法合成和使用。用于本发明方法的小干扰RNA宜包含约0至约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包含约5至约40nt，约5至约30nt，约10至约30nt，约15至约25nt，或者约20-25个核苷酸。
反向重复序列
反向重复序列包含单链核酸分子，其含有相互至少部分互补的两个区域，它们的方向以一个区域相对于另一个区域来说是反向的。这种方向允许两条互补序列相互间发生碱基配对，从而形成发夹结构。反向重复序列的两个拷贝不必是邻近的。在发夹形成序列之间可有“n”个另外的核苷酸，其中“n”是任何数目核苷酸。例如，n可以是至少1、5、10、25、50或100个核苷酸或更多，且可以是落入这些离散数值范围当中的任何数目核苷酸。
可依照本发明使用的反向重复序列可按本领域公知和普通技术人员熟悉的方法合成和使用。有关用于RNA干扰的反向重复序列的生产和使用见于但不限于例如Kirby，K等，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A99：16162-16167(2002)，Adelman，Z.N.等，J.Virol.76：12925-12933(2002)，Yi，C.E.等，J.Biol.Chem.278：934-939(2003)，Yang，S.等，Mol.Cell Biol.21：7807-7816(2001)，Svoboda，P.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.287：1099-1104(2001)及Martinek，S.和Young，M.W.Genetics156：171-1725(2000)。
短发夹RNA(shRNA)
Paddison，P.J.等，Genes&Dev.16：948-958(2002)已使用折叠成发夹的小RNA分子作为实现RNA干扰的手段。这种短发夹RNA(shRNA)分子也可有利地用于本发明方法中。功能性shRNA虽然在功能上与本文所述的反向重复序列相同，但其茎和环的长度使其与反向重复序列区别开来。在一个实施方案中，茎长度可以是至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸，环大小可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40或50个核苷酸。尽管不想受任何具体理论的约束，但认为这些shRNA与切酶RNA酶)的dsRNA产物相似，且无论如何都具有抑制特定基因表达的相同能力。发夹RNA结构可通过小干扰RNA介导细胞RNA的定向破坏(参见例如图1)。
shRNA的转录可由聚合酶III(pol III)启动子引发，且被认为在4-5-胸腺嘧啶转录终止位点的2位终止。认为shRNA在表达时折叠成带3’UU突出端的茎-环结构。随后，这些shRNA的末端被加工，使shRNA转化成～21nt的siRNA样分子。
可依照本发明使用的短发夹RNA可按本领域公知和普通技术人员熟悉的方法合成和使用。有关用于RNA干扰的反向重复序列的生产和使用见于但不限于Paddison，P.J.等，Genes&Dev.16：948-958(2002)，Yu，J-Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：6047-6052(2002)和Paul，C.P等，Nature Biotechnol.20：505-508(2002)。
小短暂调节RNA(stRNA)
另一组可以使用的小RNA是小短暂调节RNA(stRNA)。一般来说，stRNA包含约20至约30nt(banerjee和Slack，Bioessays24：119-129(2002))，尽管也可依照本发明使用任何大小的stRNA。与siRNA不同的是，stRNA在翻译引发后下调靶mRNA的表达，而没有降解mRNA。
III.iRNA分子的表达
A.构建物设计
本发明提供新型的构建物和DNA模板来表达iRNA分子，还提供制造这种构建物的方法。
在本发明的一个方面，提供在预定位置表达iRNA分子的转基因细胞和动物的产生方法，还提供据此产生的细胞和动物。将产生iRNA分子、含有靶向基因组中特定位置的序列的DNA模板引入到细胞中。在一个实施方案中，可靶向DNA模板，使得可以实现iRNA分子的表达而不破坏内源基因功能。在一个实施方案中，DNA模板可以为载体的形式。所述载体可直接引入到细胞中，或者线性化后再引入到细胞中。在另一个实施方案中，DNA模板可被合成为寡核苷酸并引入到细胞中。在一个实施方案中，DNA模板可通过定向整合而整合到细胞的基因组中。定向整合可通过同源重组来进行。DNA模板可通过同源重组插入到例如看家基因中，使得iRNA分子的表达置于看家基因的相关启动子控制之下。或者，DNA模板可通过同源重组插入到只在特定细胞或器官中表达的基因中，使得iRNA分子的表达置于细胞或器官特异性基因的相关启动子控制之下。
在其它实施方案中，用以产生iRNA分子的DNA模板可整合到靶基因的外显子中。在另一个实施方案中，用以产生iRNA分子的DNA模板可整合到靶基因的内含子中，如整合到内源内含子的非必需位置中。可靶向DNA模板，使得靶基因的内源启动子指导这种外源DNA模板的转录。在又一个实施方案中，可将用以产生iRNA分子的DNA模板埋置于工程(或合成)内含子中，以整合到靶基因的内含子或外显子中。这些工程内含子可从任何内源内含子衍生。在一个实施方案中，内源内含子可简化为其最小功能元件。在另一个实施方案中，可将限制位点工程转入到合成内含子中。在一个实施方案中，限制酶切位点允许将DNA模板放置于合成内含子中。在又一个实施方案中，可将合成内含子插入到内源外显子或内含子中，而不破坏内源基因的功能。
在另一个实施方案中，提供其中表达干扰RNA分子以调节靶基因表达的细胞和动物的生产方法。本发明这个方面的方法可包括例如：鉴定细胞中的一种或多种靶核酸序列；将产生结合靶基因且含有侧翼序列(同源重组用)的iRNA分子的DNA模板引入到细胞中；和在使得iRNA分子结合靶核酸序列，从而调节一种或多种靶基因表达的条件下，在细胞中表达DNA构建物。在一个实施方案中，本发明提供可遗传地表达调节一种或多种靶基因表达的iRNA分子的非人转基因动物的生产方法。在一个实施方案中，所述动物可通过体细胞核转移来产生。可通过本文描述的任何技术对体细胞进行工程改造，以表达iRNA分子。
工程(合成)内含子
在更多的实施方案中，可将用以产生iRNA分子的DNA模板埋置于工程(或合成)内含子中，以整合到靶基因的内含子或外显子中。这些工程内含子可从任何内源内含子衍生。在一个实施方案中，内源内含子可简化为其最小功能元件。在另一个实施方案中，可将限制位点工程转入到合成内含子中。在一个实施方案中，限制酶切位点允许将DNA模板放置于合成内含子中。在又一个实施方案中，可将合成内含子插入到内源外显子或内含子中，而不破坏内源基因的功能。
为获得内源基因的表达模式、水平和时间选择，可以使用同源重组来收集(trap)内源基因的所有调节元件。但是对许多应用来说，破坏内源基因是不可接受的。为在已被表征的基因中采用这个策略，可以将siRNA插入到靶基因内源内含子中的非必需位置。或者，可以将待插入的外源内含子装配到靶基因外显子中。外源内含子可以是天然的或者人工设计的(Kriegler M.Assembly of enhancers，promoters，andsplice信号s to control expression of transferred genes.Methods Enzymol.1990；185：512-27；Choi T，Huang M，Gorman C，Jaenisch R.A genericintron increases gene expression in transgenic mice.Mol Cell Biol.1991年6月；(6)：3070-4；Palmiter RD，Sandgren EP，Avarbock MR，Allen DD，Brinster RL.Heterologous introns can enhance expression of transgenes inmice.Proc Natl Acad Sci U S A.1991年1月15日；88(2)：478-82；Petitclerc D，Attal J，Theron MC，Bearzotti M，Bolifraud P，Kann G，Stinnakre MG，Pointu H，Puissant C，Houdebine LM.The effect of variousintrons and transcription terminators on the efficiency of expression vectorsin various cultured cell lines and in the mammary gland of transgenic mice.1995年6月21日；40(3)：169-78)。
在内源基因的外显子中插入工程(或合成)内含子使得转录可由该基因控制。另外，一旦发生剪接，可使所得的内源基因mRNA返回到其正常状态。然后被剪接内含子可供细胞成分进一步加工，以产生有效的抑制性RNA。
合成内含子装配
可根据任何已知内含子设计合成内含子。在一个实施方案中，已知的内含子在本领域中已被很好表征，因此可将产生iRNA分子的DNA模板插入到内含子中已知不实现内含子功能的位点。简单的说，可将限制酶切位点工程转入到内含子中，然后可将DNA模板插入到内含子中内含子功能的非必需位置。另外，可将限制酶切位点添加到内含子5’和3’的序列中，以允许合成内含子定向插入到靶外显子或内含子中。在一个具体的实施方案中，合成内含子可至少包含位于5’末端的限制酶切位点、内含子剪接供体位点、产生至少一种iRNA分子的DNA模板、内含子分支位点、内含子剪接受体位点和位于3’末端的限制酶切位点，参见例如以下示意图：
Figure BDA00003576454400371
在其它实施方案中，可从任何已知基因如细胞或组织特异性基因构建工程内含子。在一个实施方案中，如果内含子未被表征，则以下非限制性方法可鉴定DNA模板的适宜插入点，所述插入点不实现内含子功能。首先，对内含子进行测序。然后，通过例如将所述基因与报告基因连接建立报告验定法，以测试内含子的功能作用。其次，将限制酶切位点工程转入到内含子中的某个位置，接着将DNA模板序列克隆到内含子中。最后，用报告验定法测试合成构建物，确定DNA模板的插入是否干扰所述基因的功能作用。鉴定了对于DNA模板插入的内含子非必需位置后即可结束这个方法。此外，这个方法也可包括使内含子序列依次缺失，直到鉴定出最小功能内含子。
B.克隆策略
在本发明的实施方案中，可将DNA剪接在一起，形成特定核苷酸序列。在一个实施方案中，提供的DNA模板至少包含用于同源重组的5’靶向臂、第一核苷酸序列、任选的衔接序列、与第一核苷酸序列基本杂交的第二核苷酸序列和用于同源重组3’靶向臂。任选这些DNA模板还可克隆到合成内含子中。在一个实施方案中，可为DNA模板和/或合成内含子的每种成分合成寡核苷酸序列，并用限制酶克隆在一起。在另一个实施方案中，可将每种成分工程转入到表达载体中。在一个实施方案中，可将载体引入到细胞中，实现细胞的遗传修饰。在另一个实施方案中，载体可先线性化，然后再插入到细胞中。
在本发明的其它实施方案中，在细胞中可至少表达两种iRNA分子。在一个实施方案中，在细胞中表达成簇iRNA分子。在一个实施方案中，为将一系列iRNA寡核苷酸克隆到表达载体中，可采用以下策略。首先，可获得具有两个非相容性单一限制位点的载体，然后有方向性地将第一寡核苷酸克隆到这些位点中。第一寡核苷酸可设计成在克隆时破坏一个限制位点，并在相对的一端提供功能性限制位点。通过这个策略，在新构建物中存在两种初始限制酶的切割位点，下一寡核苷酸可克隆到这些位点中。可重复所述循环，直到所需数量的寡核苷酸已被克隆和转基因已被装配。作为采用BclI(tgatca)和MluI(acgcgt)的限制位点的实例，可使用以下组成：
Figure BDA00003576454400381
在另一个实施方案中，为了装配例如成簇干扰RNA的寡核苷酸，可遵循以下策略。可用衔接序列防止形成非预期的结构。可使用非相容性限制位点，例如Bcl I或Mlu I位点。可有方向性地克隆这些位点，可将上游位点破坏并在下游区域中重新供应给新载体，以为下一发夹寡核苷酸作准备。
可将本文公开的DNA构建物、模板和/或载体插入到外源基因的外显子或内含子中。在一个具体的实施方案中，所述插入并不改变靶内含子或外显子的功能。这种靶向策略起到保持靶向基因的功能完整性的作用，同时利用其内源调节能力以在细胞中表达iRNA分子。基因(包括内含子和外显子)功能可用功能验定法来测试，以确定基因功能是否已受插入损害。
载体
在一个实施方案中，可将至少约2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50或100个iRNA分子克隆到载体中。可将包含iRNA分子的载体进一步引入或插入到原核或真核细胞中，优选导致iRNA分子表达。在一个实施方案中，可将iRNA分子与载体中的启动子有效连接。启动子可以是外源或内源启动子。在另一实施方案中，可将iRNA分子克隆到无启动子载体中，然后插入到真核细胞的基因组中，其中无启动子载体置于内源基因的启动子和/或其它调节元件的控制之下。在一个具体的实施方案中，这种无启动子载体不破坏细胞稳态或内源基因的功能作用。
本文所用术语“载体”指给所插入的核酸提供有用的生物或生化特性的核酸分子(优选DNA)。本发明所述的“表达载体”包括转化到细胞中时能够增强已插入或克隆到载体中的一种或多种iRNA分子的表达的载体。术语“载体”和“质粒”在本文中可互换使用。载体的实例包括噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒和其它能够在体外或在细胞中复制或被复制，或者将所需核酸区段搬运到动物细胞中的所需位置的载体。可用于本发明的表达载体包括染色体载体、附加型载体和病毒衍生载体如衍自细菌质粒或噬菌体的载体，以及从它们的组合衍生的载体，如黏粒和噬粒。载体可具有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点，序列可在这些位点以可确定方式被切割，而不丧失载体的基本生物功能，而且可将核酸片段剪接到这些位点中，致使所述核酸片段发生复制和克隆。载体可进一步提供引物位点(例如供进行PCR)、转录和/或翻译起始和/或调节位点、重组信号、复制子、选择性标记等。显然，也可应用不需要使用同源重组、转座或限制酶来插入所需核酸片段的方法(例如但不限于PCR片段的UDG克隆(美国专利第5,334,575号)、TA
Figure BDA00003576454400391
牌PCR克隆(Invitrogen Corp.，Carlsbad，美国加州))，将核酸克隆到待依照本发明使用的载体中。载体可进一步包含一种或多种选择性标记，以鉴定载体转化的细胞，如本文所述的选择性标记和报告基因。此外，含iRNA的表达载体被装配成包含克隆区域和依赖于聚尿苷酸的PolIII转录终止子。
根据本发明，可使用任何载体来构建本发明的含iRNA表达载体。此外，根据本发明，本领域公知的和市售的载体(以及它们的变体或衍生物)可进行工程改造，以包含一个或多个供用于本发明方法的重组位点。这种载体可例如从Vector Laboratories Inc.、Invitrogen、Promega、Novagen、NEB、Clontech、Boehringer Mannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenes Technologies Inc.、Stratagene、PerkinElmer、Pharmingen和Research Genetics获得。特别令人感兴趣的一般类别载体包括真核和/或原核克隆载体、表达载体、融合载体、双杂交或反向双杂交载体、用于不同宿主的穿梭载体、诱变载体、转录载体、用于接受大插入片段的载体。
其它令人感兴趣的载体包括病毒来源载体(M13载体、细菌λ噬菌体载体、腺病毒载体和反转录病毒载体)，高拷贝、低拷贝和可调拷贝数的载体，具有相容性复制子以供在单一宿主中组合使用的载体(pACYC184和pBR322)和真核附加型复制载体(pCDM8)。
令人感兴趣的载体包括原核表达载体如pcDNA II、pSL301、pSE280、pSE380、pSE420、pTrcHisA，B和C、pRSET A，B和C(Invitrogen，Corp.)、pGEMEX-1和pGEMEX-2(Promega，Inc.)、pET载体(Novagen，Inc.)、pTrc99A、pKK223-3、pGEX载体、pEZZ18、pRIT2T和pMC1871(Pharmacia Inc.)、pKK233-2和pKK388-1(Clontech，Inc.)和pProEx-HT(Invitrogen，Corp.)以及它们的变体和衍生物。其它令人感兴趣的载体包括真核表达载体如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice(Invitrogen)、pEUK-Cl、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNA和pYACneo(Clontech)，pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110和pKK232-8(Pharmacia Inc.)、p3’SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMClneo和pOG44(Stratagene Inc.)和pYES2、pAC360、pBlueBacHis A，B和C、pVL1392、pBlueBacIII、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3、pREP4、pCEP4和pEBVHis(Invitrogen，Corp.)以及它们的变体和衍生物。
其它可以使用的载体包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、黏粒、噬粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、P1(大肠杆菌噬菌体)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS载体、PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pcDNA3(Invitrogen)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSV-SPORT1(Invitrogen)以及它们的变体和衍生物。也可使用病毒载体，如慢病毒载体(参见例如WO03/059923；Tiscornia等，PNAS100：1844-1848(2003))。
另外的令人感兴趣的载体包括pTrxFux、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBacHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pBlueBac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pZErO-1.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-Uni和pCRBac(来自Invitrogen)；λExCell、λgt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL180、pNEO和pUC4K(来自Pharmacia)；pSCREEN-1b(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32LIC、pET-30LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2LIC、pT7Blue-2、λSCREEN-1、λBlueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、pET-12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、plg、信号plg、pYX、Selecta Vecta-Neo、Selecta Vecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt(来自Novagen)；pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-N、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuV、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Contral、pSEAP2-启动子、pSEAP2-增强子、pβgal-Basic、pβgal-Control、pβgal-启动子、pβgal-增强子、pCMV、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTrip1Ex、λgt10、λgt11、pWE15和Trip1Ex(来自Clontech)；Lambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS+/-、1pBluescript II SK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、LambdaDASH、Lambda EMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS+/-、pBC KS+/-、pBC SK+/-、Phagescript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-11abcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pMC1neo Poly A、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415和pRS416(来自Stratagene)。
令人感兴趣的双杂交和反向双杂交载体包括pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp以及它们的变体和衍生物。
(1)启动子控制下的载体
真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，所述DNA序列与涉及转录的细胞蛋白发生特异性相互作用(Maniatis等，Science236：1237[1987])。已从各种真核来源，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞中的基因分离出启动子和增强子元件(在原核生物中也发现类似的控制元件即启动子)。具体启动子和增强子的选择取决于将用什么细胞类型来表达目的蛋白。有些真核启动子和增强子的宿主范围广，而其它的只在有限的细胞类型亚群中具有功能(有关综述参见Voss等，TrendsBiochem.Sci.，11：287[1986]；和Maniatis等，出处同上)。例如，SV40早期基因增强子在许多哺乳动物物种的多种细胞类型中都十分活跃，其已被广泛用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质(Dijkema等，EMBO J.4：761[1985])。在多种哺乳动物细胞类型中活跃的启动子/增强子元件的另外两个实例是来自人延伸因子1α基因的启动子/增强子元件(Uetsuki等，J.Biol.Chem.，264：5791[1989]；Kim等，Gene91：217[1990]；及Mizushima和Nagata，Nuc.Acids.Res.，18：5322[1990])以及劳斯肉瘤病毒(Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：6777[1982])和人巨细胞病毒(Boshart等，Cell41：521[1985])的长末端重复序列。
本文所用术语“启动子”表示含有能够提供启动子功能(即由启动子元件提供的功能)的序列的DNA区段。例如，反转录病毒的长末端重复序列含有启动子功能。启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源”启动子是与基因组中的特定基因有关的启动子。“外源”或“异源”启动子是这样的启动子，其通过遗传操作手段(即分子生物学技术如克隆和重组)而被置于与基因并列，使得该基因的转录受所连接启动子的指导。启动子也可含有增强子活性。
a.内源启动子
在一个实施方案中，含iRNA分子的载体的有效连接启动子是内源启动子。在这个实施方案的一个方面，内源启动子可以是允许其相关基因连续转录的任何不受调节启动子。
在另一个方面，启动子可以是组成型活性启动子。更具体的说，内源启动子与看家基因有关。其启动子可与iRNA有效连接的看家基因的非限制性实例包括以下人看家基因的保守跨种类似物：线粒体16S rRNA、核糖体蛋白L29(RPL29)、H3组蛋白3B家族(H3.3B)(H3F3B)、聚腺苷酸结合蛋白、胞质1(PABPC1)、HLA-B相关转录物-1(D6S81E)、surfeit1(SURF1)、核糖体蛋白L8(RPL8)、核糖体蛋白L38(RPL38)、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、核糖体蛋白S7(RPS7)、热激27kD蛋白1(HSPB1)、真核翻译延伸因子1δ(鸟嘌呤核苷酸交换蛋白)(EEF1D)、波形蛋白(VIM)、核糖体蛋白L41(RPL41)、羧酸酯酶2(肠、肝)(CES2)、核输出蛋白1(CRM1，酵母，同系物)(XPO1)、ubiquinol-细胞色素c还原酶铰链蛋白(UQCRH)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、核糖体结合蛋白II(RPN2)、普列克底物蛋白和Sec7结构域蛋白(PSD)、人心肌钙蛋白T、蛋白酶体(前体(prosome)、macropain)亚单位，β型，5(PSMB5)、肌动蛋白丝切蛋白1(非肌肉)(CFL1)、丝氨酰-tRNA合成酶(SARS)、联蛋白(钙黏着蛋白相关蛋白质)，β1(88kD)(CTNNB1)、Duffy血型(FY)、红细胞膜蛋白7.2条带(stomatin)(EPB72)、Fas/Apo-1、LIM和SH3蛋白1(LASP1)、辅助蛋白BAP31/BAP29(DXS1357E)、新生多肽相关复合体α多肽(NACA)、核糖体蛋白L18a(RPL18A)、TNF受体相关因子4(TRAF4)、MLN51蛋白(MLN51)、核糖体蛋白L11(RPL11)、Poly(rC)结合蛋白2(PCBP2)、硫氧还蛋白(TXN)、谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(QARS)、睾丸增强基因转录物(TEGT)、前列腺结合蛋白(PBP)、信号序列受体，β(易位子相关蛋白β)(SSR2)、核糖体蛋白L3(RPL3)、中心粒蛋白，EF手蛋白，2(CETN2)、核内不均一核糖核蛋白K(HNRPK)、谷胱甘肽过氧化物酶4(磷脂氢过氧化物酶)(GPX4)，融合体，衍自t(12；16)恶性脂质肉瘤(FUS)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位c(亚单位9)，同种型2(ATP5G2)、核糖体蛋白S26(RPS26)、核糖体蛋白L6(RPL6)、核糖体蛋白S18(RPS18)、丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，分化单位A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员3(SERPINA3)、双特异性磷酸酶1(DUSP1)、过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)、附睾分泌性蛋白(19.5kD)(HE1)、核糖体蛋白S8(RPS8)、易位启动区(活化MET癌基因)(TPR)、核糖体蛋白L13(RPL13)、SON DNA结合蛋白(SON)、核糖体蛋白L19(RPL19)，核糖体蛋白(与酵母S24同源)、CD63抗原(黑素瘤1抗原)(CD63)、蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体6型(PTPN6)、真核翻译延伸因子1β2(EEF1B2)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位b，同种型1(ATP5F1)、溶质载体25家族(线粒体载体；磷酸盐载体)、成员3(SLC25A3)、色氨酰-tRNA合成酶(WARS)、谷氨酸-氨连接酶(谷氨酰胺合酶)(GLUL)、核糖体蛋白L7(RPL7)、干扰素诱导跨膜蛋白质2(1-8D)(IFITM2)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，β多肽(YWHAB)、酪蛋白激酶2，β多肽(CSNK2B)、遍在蛋白A-52残基核糖体蛋白融合产物1(UBA52)、核糖体蛋白L13a(RPL13A)、主要组织相容性复合体，I类，E(HLA-E)、jun D原癌基因(JUND)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，θ多肽(YWHAQ)、核糖体蛋白L23(RPL23)、核糖体蛋白S3(RPS3)、核糖体蛋白L17(RPL17)、细丝蛋白A，α(肌动蛋白结合蛋白-280)(FLNA)、基质Gla蛋白(MGP)、核糖体蛋白L35a(RPL35A)、肽基脯氨酸异构酶A(亲环蛋白A)(PPIA)、绒毛蛋白2(埃兹蛋白)(VIL2)、真核翻译延伸因子2(EEF2)、jun B原癌基因(JUNB)、核糖体蛋白S2(RPS2)、细胞色素c氧化酶VIIc亚单位(COX7C)、核内不均一核糖核蛋白L(HNRPL)、肿瘤蛋白，翻译控制1(TPT1)、核糖体蛋白L31(RPL31)、细胞色素c氧化酶VIIa亚单位多肽2(肝)(COX7A2)、DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)盒多肽5(RNA解旋酶，68kD)(DDX5)、细胞色素c氧化酶VIa亚单位多肽1(COX6A1)、热激90kD蛋白1，α(HSPCA)、Sjogren综合征抗原B(自身抗原La)(SSB)、乳酸脱氢酶B(LDHB)、高速泳动族(非组蛋白染色体)蛋白质17(HMG17)、细胞色素c氧化酶VIc亚单位(COX6C)、核内不均一核糖核蛋白A1(HNRPA1)、醛缩酶A，果糖二磷酸(ALDOA)、整联蛋白，β1(纤连蛋白受体，β多肽，抗原CD29，包括MDF2，MSK12)(ITGB1)、核糖体蛋白S11(RPS11)、核内小核糖核蛋白70kD多肽(RN抗原)(SNRP20)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)、β多肽1(GBN1)、核内不均一核糖核蛋白A1(HNRPA1)、钙蛋白酶4，小亚单位(30K)(CAPN4)、延伸因子TU(N末端)/X03689、核糖体蛋白L32(RPL32)、主要组织相容性复合体，II类，DPα1(HLA-DPA1)、超氧化物歧化酶1，可溶性(肌萎缩性侧索硬化1(成人))(SOD1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)、肌动蛋白，β(ACTB)、主要组织相容性复合体，II类，DPα(HLA-DPA)、微管蛋白，β多肽(TUBB)、金属硫蛋白2A(MT2A)、磷酸甘油激酶1(PGK1)、KRAB相关蛋白1(TIF1B)、真核翻译起始因子3，亚单位5(ε，47kD)(EIF3S5)、NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合体，4(9kD，MLRQ)(NDUFA4)、氯离子胞内通道1(CLIC1)、衔接头相关蛋白复合体3，δ1亚单位(AP3S1)、细胞色素c氧化酶IV亚单位(COX4)、PDZ和LIM结构域1(elfin)(PDLIM1)、谷胱甘肽-S-转移酶样；谷胱甘肽转移酶ω(GSTTLp28)、干扰素刺激基因(20kD)(ISG20)、核因子I/B(NFIB)、COX10(酵母)同系物、细胞色素c氧化酶装配蛋白(血红素A：法尼基转移酶)、骨肉瘤中扩增的保守基因(OS4)、Nε-(4-氨丁基)赖氨酸合酶(DHPS)、半乳糖苷酶，α(GLA)、微粒体谷胱甘肽S-转移酶2(MGST2)、真核翻译起始因子4γ，2(EIF4G2)、遍在蛋白载体蛋白E2-C(UBCH10)，BTG家族，成员2(BTG2)、B细胞相关蛋白(REA)、COP9亚单位6(MOV34同系物，34kD)(MOV34-24KD)、ATX1(抗氧化蛋白1，酵母)同系物1(ATOX1)、富含亮氨酸的酸性蛋白质(SSP29)、聚腺苷酸结合蛋白(PABP)启动区、硒蛋白W，1(SEPW1)、真核翻译起始因子3，亚单位6(48kD)(EIF3S6)、肉碱棕榈酰转移酶I，肌肉(CPT1B)、跨膜运输蛋白(TMP21)、四又二分之一LIM结构域1(FHL1)、核糖体蛋白S28(RPS28)、髓细胞白血病因子2(MLF2)、神经丝三联体L蛋白/U57341、加帽蛋白(肌动蛋白纤丝)肌肉Z线，α1(CAPZA1)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶1(溶血磷脂酸酰基转移酶，α)(AGPAT1)、肌醇1，3，4-三磷酸5/6激酶(ITPK1)、三联组氨酸核苷酸结合蛋白(HINT)、dynamitin(动力蛋白激活蛋白复合体50kD亚单位)(DCTN-50)、肌动蛋白相关蛋白2/3复合体，亚单位2(34kD)(ARPC2)、组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)、遍在蛋白B、几丁质酶3样2(CHI3L2)、D-多巴色素互变异构酶(DDT)、锌指蛋白220(ZNF220)、sequestosome1(SQSTM1)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白B(胱抑蛋白B)(CSTB)、真核翻译起始因子3，亚单位8(110kD)(EIF3S8)、趋化因子(C-C模体)受体9(CCR9)、遍在蛋白特异性蛋白酶11(USP11)、层粘连蛋白受体1(67kD，核糖体蛋白SA)(LAMR1)，在骨肉瘤中扩增(OS-9)、剪接因子3b，亚单位2，145kD(SF3B2)、整联蛋白联接激酶(ILK)、遍在蛋白缀合酶E2D3(与酵母UBC4/5同源)(UBE2D3)、含陪伴蛋白的TCP1，亚单位4(δ)(CCT4)、聚合酶(RNA)II(DNA指导的)多肽L(7.6kD)(POLR2L)、核受体共阻遏蛋白2(NCOR2)、辅助蛋白BAP31/BAP29(DXS1357E，SLC6A8)、13kD分化相关蛋白蛋白(LOC55967)、Tax1(人T细胞白血病病毒I型)结合蛋白1(TAX1BP1)、损伤特异性DNA结合蛋白1(127kD)(DDB1)、动力蛋白，胞质，轻多肽(PIN)、甲硫氨酸氨肽酶、eIF-2-相关p67(MNPEP)、G蛋白途径抑制蛋白2(GPS2)、核糖体蛋白L21(RPL21)、外被体蛋白复合体，α亚单位(COPA)、G蛋白途径抑制蛋白1(GPS1)、核内小核糖核蛋白D2多肽(16.5kD)(SNRPD2)、核糖体蛋白S29(RPS29)、核糖体蛋白S10(RPS10)、核糖体蛋白S9(RPS9)、核糖体蛋白S5(RPS5)、核糖体蛋白L28(RPL28)、核糖体蛋白L27a(RPL27A)、蛋白质酪氨酸磷酸酶IVA型，成员2(PTP4A2)、核糖体蛋白L36(RPL35)、核糖体蛋白L10a(RPL10A)、IgG的Fc片段，受体，转运蛋白，α(FCGRT)、母体G10转录物(G10)、核糖体蛋白L9(RPL9)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位c(亚单位9)，同种型3(ATP5G3)、信号识别颗粒(与Alu RNA-结合蛋白同源)(SRP14)、mutL(大肠杆菌)同系物1(结肠癌，非息肉2型)(MLH1)、染色体1q亚端粒序列D1S553/U06155、纤调蛋白(FMOD)、切口的氨基末端增强子(AES)、Rho GTP酶激活蛋白1(ARHGAP1)、含非POU结构域，八聚体结合(NONO)，v-raf鼠肉瘤3611病毒癌基因同系物1(ARAF1)、核内不均一核糖核蛋白A1(HNRPA1)、β2-微球蛋白(B2M)、核糖体蛋白S27a(RPS27A)，含布罗莫结构域2(BRD2)、精子缺乏症因子1(AZF1)，由1，25二羟维生素D-3(VDUP1)正调节、丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，分化单位B(卵清蛋白)，成员6(SERPINB6)、消去蛋白(肌动蛋白解聚因子)(ADF)、胸腺素β-10(TMSB10)、CD34抗原(CD34)、血影蛋白，β，非红细胞1(SPTBN1)、血管相关的游走细胞蛋白(AAMP)、主要组织相容性复合体，I类，A(HLA-A)、MYC相关锌指蛋白(嘌呤结合转录因子)(MAZ)、SET易位(骨髓白血病相关的)(SET)、配对框基因(无虹膜，角膜炎)(PAX6)、与小鼠中Zfp-36同源的锌指蛋白(ZFP36)、FK506-结合蛋白4(59kD)(FKBP4)、核小体装配蛋白1样1(NAP1L1)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，ζ多肽(YWHAZ)、核糖体蛋白S3A(RPS3A)、ADP-核糖基化因子1、核糖体蛋白S19(RPS19)、转录延伸因子A(SII)，1(TCEA1)、核糖体蛋白S6(RPS6)、ADP-核糖基化因子3(ARF3)、膜突蛋白(MSN)、B细胞抑制剂中κ轻多肽基因增强子的核因子，α(NFKBIA)、补体成分1，q亚成分结合蛋白(C1QBP)、核糖体蛋白S25(RPS25)、簇蛋白(补体裂解抑制剂，SP-40，40，硫酸化糖蛋白2，睾酮抑制前列腺信息2，载脂蛋白J)(CLU)、核仁蛋白(NCL)、核糖体蛋白S16(RPS16)、遍在蛋白激活酶E1(A1S9T和BN75温度敏感性互补)(UBE1)、凝集素，半乳糖苷结合，可溶性，3(半乳凝集素3)(LGALS3)、真核翻译延伸因子1γ(EEF1G)、pim-1癌基因(PIM1)、S100钙结合蛋白A10(膜联蛋白11配体、依钙结合蛋白I，轻多肽(p11)(S100A10)、H2A组蛋白家族，成员Z(H2AFZ)、ADP-核糖基化因子4(ARF4)(ARF4)、核糖体蛋白L7a(RPL7A)、主要组织相容性复合体，II类，DQα1(HLA-DQA1)、FK506结合蛋白1A(12kD)(FKBP1A)、CD81抗原(抗增殖抗体1的靶标)(CD81)、核糖体蛋白S15(RPS15)、X盒结合蛋白1(XBP1)、主要组织相容性复合体，II类，DNα(HLA-DNA)、核糖体蛋白S24(RPS24)、白血病相关磷蛋白p18(驿蛋白)(LAP18)、肌球蛋白，重多肽9，非肌肉(MYH9)、酪蛋白激酶2，β多肽(CSNK2B)、岩藻糖苷酶，α-L-1，组织(FUCA1)、心肌黄酶(NADH)(细胞色素b-5还原酶)(DIA1)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(血管淀粉样变性和脑出血)(CST3)、遍在蛋白C(UBC)、ubiquinol-细胞色素c还原酶结合蛋白(UQCRB)、前胸腺素α(基因序列28)(PTMA)、谷胱甘肽S-转移酶π(GSTP1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，β多肽2样1(GNB2L1)、核磷蛋白(核仁磷蛋白B23，核基质蛋白)(NPM1)、CD3E抗原，ε多肽(TiT3复合体)(CD3E)、钙蛋白酶2，(m/II)大亚单位(CAPN2)、NADH脱氢酶(泛醌)黄素蛋白2(24kD)(NDUFV2)、热激60kD蛋白1(陪伴蛋白)(HSPD1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α刺激活性多肽1(GNAS1)、网格蛋白，轻多肽(Lca)(CLTA)、ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合体，β多肽、钙调蛋白2(磷酸酶激酶，δ)(CALM2)、肌动蛋白，γ1(ACTG1)、核糖体蛋白S17(RPS17)、核糖体蛋白，大，P1(RPLP1)、核糖体蛋白，大，P0(RPLP0)、胸腺素，β4，X染色体(TMSB4X)、核内不均一核糖核蛋白C(C1/C2)(HNRPC)、核糖体蛋白L36a(RPL36A)、葡糖醛酸糖苷酶，β(GUSB)、与SRC，FGR，YES相关的FYN癌基因(FYN)、前胸腺素，α(基因序列28)(PTMA)、烯醇化酶1，(α)(ENO1)、层粘连蛋白受体1(67kD，核糖体蛋白SA)(LAMR1)、核糖体蛋白S14(RPS14)、CD74抗原(主要组织相容性复合体的不变多肽，II类抗原相关性)、酯酶D/甲酰谷胱甘肽水解酶(ESD)、H3组蛋白，3A家族(H3F3A)、铁蛋白，轻多肽(FTL)、Sec23(酿酒酵母)同系物A(SEZ23A)、肌动蛋白，β(ACTB)、早老蛋白1(阿尔茨海默氏病3)(PSEN1)、白介素-1受体相关激酶1(IRAKI)、锌指蛋白162(ZNF162)、核糖体蛋白L34(RPL34)、beclin1(卷曲螺旋，肌球蛋白样BCL2相互作用蛋白)(BECN1)、磷脂酰肌醇4-激酶，催化性，α多肽(PIK4CA)、含IQ模体的GTP酶激活蛋白1(IQGAP1)、转录3的信号转导蛋白和激活蛋白(急性期反应因子)(STAT3)、核内不均一核糖核蛋白F(HNRPF)、推定翻译起始因子蛋白(SUI1)、蛋白质易位复合体β(SEC61B)、Ras同系物基因家族，成员A(ARHA)、铁蛋白，重多肽1(FTH1)、Rho GDP解离抑制剂(GDI)β(ARHGDIB)、H2A组蛋白家族，成员O(H2AFO)、膜联蛋白A11(ANX11)、核糖体蛋白L27(RPL27)、腺苷酸环化酶相关蛋白(CAP)、锌指蛋白91(HPF7，HTF10)(ZNF91)、核糖体蛋白L18(RPL18)、法尼基转移酶，CAAX盒，α(FNTA)、钠通道，电压门控，I型，β多肽(SCN1B)、钙联接蛋白(CANX)、蛋白脂质蛋白2(结肠上皮富含)(PLP2)、淀粉样蛋白β(A4)前体(precursor)样蛋白2(APLP2)、依赖于电压的阴离子通道2、蛋白酶体(前体，macropain)激活蛋白亚单位1(PA28α)(PSME1)、核糖体蛋白L12(RPL12)、核糖体蛋白L37a(RPL37A)、核糖体蛋白S21(RPS21)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，ATP酶，1(PSMC1)、主要组织相容性复合体，II类，DQβ1(HLA-DQB1)、复制蛋白A2(32kD)(RPA2)、热激90kD蛋白1，β(HSPCB)、细胞色素c氧化酶亚单位VIII(COX8)、真核翻译延伸因子1α1(EEF1A1)、SNRPN上游阅读框(SNURF)、凝集素，半乳糖苷结合，可溶性，1(半乳凝集素1)(LGALS1)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)、磷酸甘油变位酶1(大脑)(PGAM1)、干扰素诱导跨膜蛋白质1(9-27)(IFITM1)、核酸酶敏感元件结合蛋白1(NSEP1)、溶质载体家族25(线粒体载体；腺嘌呤核苷酸易位蛋白)，成员6(SLC25A6)、ADP-核糖基转移酶(NAD+；聚(ADP-核糖)聚合酶)(ADPRT)、白三烯A4水解酶(LTA4H)、抑制蛋白1(PFN1)、前皂化蛋白(高歇尔氏病变体和异染性脑白质营养不良变体)(PSAP)、溶质载体家族25(线粒体载体；腺嘌呤核苷酸易位蛋白)，成员5(SLC25A5)、β-2微球蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白7、核糖体蛋白S13、EB病毒小RNA相关蛋白、主要组织相容性复合体，I类，C X58536)、核糖体蛋白S12、核糖体蛋白L10、转化相关蛋白、核糖体蛋白L5、转录辅激活蛋白Pc4、组织蛋白酶B、核糖体蛋白L26、“主要组织相容性复合体，I类X12432”、Wilm S肿瘤相关蛋白、原肌球蛋白Tm30nm细胞骨架、脂质体蛋白S4，X连锁、核糖体蛋白L37、金属泛刺激素(Metallopanstimulin)1、核糖体蛋白L30、核不均一核糖核蛋白K、主要组织相容性复合体，I类，E M21533、主要组织相容性复合体，I类，E M20022、核糖体蛋白L30同系物、热激蛋白70Kda、“肌球蛋白，轻链/U02629”、“肌球蛋白，轻链/U02629”、钙周期蛋白、单链DNA结合蛋白Mssp-1、丙糖磷酸异构酶、核有丝分裂器蛋白1、蛋白激酶Ht31，Camp依赖性、微管蛋白，β2、钙调蛋白I型、核糖体蛋白S20、转录因子Btf3b、珠蛋白，β、核内小核糖核蛋白多肽CAlt.剪接2、核苷二磷酸激酶Nm23-H2s、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物，激活转录因子4(tax应答增强子元件B67)(ATF4)、prefoldin(PFDN5)，N-myc下游调节(NDRG1)、核糖体蛋白L14(RPL14)、呆蛋白(KIAA0253)、蛋白酶，丝氨酸，11(IGF结合)(PRSS11)、KIAA0220蛋白(KIAA0220)、蓬乱蛋白(dishevelled)3(与果蝇dsh同源)(DVL3)、不发育(nudimentary)果蝇同系物增强子(ERH)、带多重剪接的RNA结合蛋白基因(RBPMS)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环化水解酶(ATIC)、KIAA基因产物(KIAA0164)、核糖体蛋白L39(RPL39)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，η多肽(YWHAB)、鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，非ATP酶，2(PSMD2)、冷诱导的RNA结合蛋白(CIRBP)、神经前体细胞表达，发育下调5(NEDD5)、高速泳动族非组蛋白染色体蛋白质1(HMG1)、苹果酸脱氢酶1NAD(可溶性)(MDH1)、细胞周期蛋白I(CCNI)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，非ATP酶，7(Mov34同系物)(PSMD7)、主要组织相容性复合体，I类，B(HLA-B)、ATP酶，液泡，14kD(ATP6S14)、转录因子样1(TCFL1)、KIAA0084蛋白(KIAA0084)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，非ATP酶，8(PSMD8)、主要组织相容性复合体，I类，A(HIA-A)、丙氨酰-tRNA合成酶(AARS)、赖氨酰-tRNA合成酶(KARS)、ADP-核糖基化因子样6相互作用蛋白(ARL6IP)、KIAA0063基因产物(KIAA0063)、肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM)、DAZ相关蛋白2(DAZAP2)、真核翻译起始因子4A，同种型2(EIF4A2)、CD151抗原(CD151)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型6(PSMB6)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型4(PSMB4)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型2(PSMB2)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型3(PSMB3)、Williams-Beuren综合征染色体部位1(WBSCR1)、古遍在蛋白1(AUP1)、KIAA0864蛋白(KIAA0864)、神经前体细胞表达，发育下调8(NEDD8)、核糖体蛋白L4(RPL4)、KIAA0111基因产物(KIAA0111)、转凝蛋白2(TAGLN2)、网格蛋白重多肽(Hc)(CLTC，CLTCL2)、ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合体，γ多肽1(ATP5C1)、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)、MORF相关基因X(KIA0026)、ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合体，α亚单位，同种型1，心肌(ATP5A1)、磷脂酰丝氨酸合酶1(PTDSS1)、抗氧化蛋白2(非硒谷胱甘肽过氧化物酶，酸性钙依赖性磷酸酯酶A2)(KIAA0106)、KIAA0102基因产物(KIAA0102)、核糖体蛋白S23(RPS23)、CD164抗原，唾液粘蛋白(CD164)、GDP解离抑制剂2(GDI2)、烯酰辅酶A水合酶，短链，1，线粒体(ECHS1)、真核翻译起始因子4A，同种型1(EIF4A1)、细胞周期蛋白D2(CCND2)、核内不均一核糖核蛋白U(支架附着因子A)(HNRPU)、APEX核酸酶(多功能DNA修复酶)(APEX)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位c(亚单位9)，同种型1(ATP5G1)、豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS，80K-L)(MACS)、膜联蛋白A2(ANXA2)，与酿酒酵母RER1类似(RER1)、透明质酸氨基葡糖苷酶2(HYAL2)、尿斑蛋白(uroplakin)1A(UPK1A)、核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)、核周蛋白α4(输入蛋白α3)(KPNA4)、以及在4p16.3上的HD基因座附近具有多重剪接变体的基因(RES4-22)。
此外，内源启动子可以是与组织特异性或生理特异性基因如热激基因的表达有关的启动子。这样，iRNA分子的表达可被严格调节。
b.外源启动子
在另一个实施方案中，启动子可以是外源启动子，例如遍在表达的启动子，如RNA聚合物启动子，如H1或U6；或者是组成型活性病毒启动子。启动子的非限制性实例包括RSV LTR、SV40早期启动子、CMV IE启动子、腺病毒主要晚期启动子、Srα-启动子(一种非常强的杂合启动子，由融合到HTLV-ILTR的R/U5序列的SV40早期启动子组成)和乙肝启动子。
B.靶标易感性的确证
根据序列保守性设计引物，用来扩增靶基因的编码区域。首先，用各基因的最高度表达编码区域建立模型控制基因，尽管也可使用任何编码或非编码区域。通过将各控制区域插入到报告基因编码区域及其聚腺苷酸信号之间，来装配各控制基因。这些质粒产生在基因上游部分具有报告基因和在3’非编码区域具有潜在iRNA靶标的mRNA。单个iRNA的有效性通过抑制报告基因来测试。可用于本发明方法中的报告基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HR)、荧光素酶(Luc)、胭脂氨酸合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)和它们的衍生物。可获得赋予对以下具有抗性的多重选择性标记：氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨喋呤、膦丝菌素、嘌呤霉素和四环素。报告基因抑制的确定方法是本领域公知的，包括但不限于荧光测定法(例如荧光光谱学、荧光激活细胞分选术(FACS)、荧光显微镜检术)、抗生素抗性测定法。
虽然生物基因组信息和模型基因对于潜在iRNA的高通量筛选是非常有价值的，但最终必须通过实验在表达靶核酸的细胞中证实对靶核酸的干扰活性。
为确证iRNA序列的干扰能力，将含iRNA载体转染到表达该靶核酸的适当细胞系中。检测每种所选iRNA构建物减少靶核酸的稳态mRNA的能力。此外，对“幸免于”第一轮测试的任何靶mRNA进行反转录酶-PCR扩增并测序(参见例如Sambrook，J.等，“MolecularCloning：A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，New York(1989))。分析这些序列，以确定让mRNA逃脱iRNA当前文库的个别多态性。该信息用于进一步修饰iRNA构建物，以再靶向更稀见的多态性。
C.表达模式
iRNA的瞬时表达
在本发明的一个实施方案中，iRNA在细胞中的表达是瞬时的。瞬时表达可来自不插入到细胞基因组中的表达载体。或者，瞬时表达可来自iRNA分子直接插入到细胞中。
可用多种本领域公知的方法体外合成任何类型的介导RNA干扰的核酸，并直接插入到细胞中。此外，可从商业供应商如RibopharmaAG(Kulmach，德国)、Eurogentec(Seraing，比利时)、Sequitur(Natick，美国麻萨诸塞州)和Invitrogen(Carlsbad，美国加州)，获得介导RNA干扰的dsRNA和其它分子。Eurogentec供应已用荧光团(例如HEX/TET；5’-荧光素，6-FAM；3’-荧光素，6-FAM；内部荧光素dT；5’TAMRA，罗丹明；3’TAMRA，罗丹明)标记的dsRNA，其也可在本发明中使用。iRNA分子可通过公知的固相合成技术来制备。有几个厂商出售用于这种合成的设备，包括例如Applied Biosystems(Foster City，美国加州)。另外还可采用本领域公知的用于这种合成的其它方法。使用类似技术制备寡核苷酸如硫代磷酸寡核苷酸及烷基化衍生物是众所周知的。通过非限制性示例的方式，参见例如美国专利第4,517,338号和第4,458,066号；Lyer RP等，Curr.Opin.Mol Ther.1：344-358(1999)；及Verma S.和Eckstein F.，Annual Rev.Biochem.67：99-134(1998)。
直接插入到细胞中的iRNA可包含对磷酸-糖主链或核苷的修饰。例如，可修饰天然RNA的磷酸二酯键，以使包含至少氮或硫杂原子之一。干扰RNA可通过酶法产生，或者通过部分/完全有机合成来产生。可通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如T3、T7、SP6)来合成这种构建物。如果RNA通过化学法合成或通过体外酶合成法合成，则可先纯化再引入到细胞或动物中。例如，可通过用本领域公知的溶剂或树脂抽提、沉淀、电泳、色谱或它们的组合，从混合物中纯化RNA。或者，干扰RNA构建物可不经纯化或经过极少的纯化就使用，以避免样品处理造成的损失。iRNA构建物可干燥保藏或溶于含水溶液中。所述溶液可含有缓冲剂或盐，以促进双链体各链的退火和/或稳定。可用于本发明的缓冲剂或盐的实例包括但不限于盐水、PBS、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)
Figure BDA00003576454400541
3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、2-双(2-羟基亚乙基)氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇
Figure BDA00003576454400542
磷酸钾(KP)、磷酸钠(NaP)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢钾钠(NaKHPO4)、硫酸镁(Mg3(PO4)2·4H2O)、乙酸钾(CH3COOH)、D(+)-α-甘油磷酸钠(HOCH2CH(OH)CH2OPO3Na2)和本领域技术人员公知的其它生理缓冲剂。用于本发明的另外的缓冲剂包括溶于水溶液中的M-X盐及其缔合或解离产物，其中M是碱金属(例如Li+、Na+、K+、Rb+)，宜为钠或钾，其中X是选自磷酸根、乙酸根、碳酸氢根、硫酸根、丙酮酸根及有机一磷酸酯根、葡萄糖6-磷酸根或DL-α-甘油磷酸根的阴离子。
iRNA的稳定表达
1.随机插入
可用任何本领域公知的方法将含iRNA载体插入基因组中。在一个实施方案中，用基于病毒的载体将所述载体随机插入到基因组中。基于病毒的载体的插入发生在随机位点，这符合病毒的行为(参见例如Daley等(1990)，Science247：824-830；Guild等(1988)，J Virol62：3795-3801；Miller(1992)Curr Topics MicroBiol Immunol158：1-24；Samarut等(1995)，Methods Enzymol254：206-228)。基于病毒的载体的非限制性实例包括Moloney鼠白血病反转录病毒、鼠干细胞病毒、痘苗病毒载体，基于新培斯病毒、Semliki森林α病毒、EBV、ONYX-15、腺病毒或慢病毒的载体(参见例如Hemann MT等(2003)Nature Genet.33：396-400；Paddison&Hannon(2002)Cancer Cell2：17-23；Brummelkamp TR等(2002)Cancer Cell2：243-247；Stewart SA等(2003)RNA9：493-501；Rubinson DA等，(2003)Nature Genen.33：401-406；QinX等(2003)PNAS USA100：183-188；Lois C等(2002)Science295：868-872)。
在另一个实施方案中，转基因从载体中切割出来，或者不与载体一起保持。载体除去对于本领域先前描述的某些转基因构型(Kjer-Nielsen L，Holmberg K，Perera JD，McCluskey J.Impairedexpression of chimaeric major histocompatibility complex transgeneassociated with plasmid sequences.Transgenic Res.1992年7月；1(4)：182-7.)来说是重要的。“无载体”转基因可用任何本领域公知方法随机插入到基因组中。
2.定向插入
在另一个实施方案中，通过同源重组使插入定向于具体基因座。同源重组为将确定的修饰靶向到活细胞基因组中提供精确的机制(参见例如Vasquez KM等(2001)PNAS USA98(15)：8403-8410)。同源重组的第一步是DNA链交换，其涉及DNA双链体与至少一条含互补序列的DNA链配对，形成含异源双链体DNA的中间体重组结构(参见例如Radding，C.M.(1982)Ann.Rev.Genet.16：405；美国专利第4,888,274号)。异源双链体DNA可具有几种形式，包括含三条DNA链的三链体形式，其中一条单一互补链侵入DNA双链体(参见例如Hsieh等(1990)Genes and Development4：1951；Rao等(1991)PNAS88：2984))，当两条互补DNA链与DNA双链体配对时，可形成典型的Holliday重组连结体或χ结构(Holliday，R.(1964)Genet.Res.5：282)或双D环(“DiagnosticApplications of Double-D Loop Formation”美国专利第5,273,881号)。异源双链体结构形成后，可通过链断裂和交换来拆分，使得所有或一部分的侵入DNA链被剪接到接受DNA双链体中，而添加或替代接受DNA双链体的一个区段。或者，异源双链体结构可导致基因转换，其中侵入链的序列通过用侵入链为模板进行错配碱基的修复而被转移到接受DNA双链体中(参见例如Genes，第3版.(1987)Lewin，B.，JohnWiley，New York，N.Y.；Lopez等(1987)Nucleic Acids Res.15：5643)。不论是采取断裂和再结合的机制，还是采取基因转换的机制，在同源配对的连结体处形成异源双链体可用于将遗传序列信息从一个DNA分子中转移到另一个。
有许多文章描述了同源重组在哺乳动物细胞中的应用。这些文章的例证有Kucherlapati等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3153-3157；Kucherlapati等(1985)Mol.Cell.Bio.5：714-720；Smithies等(1985)Nature317：230-234；Wake等(1985)Mol.Cell.Bio.8：2080-2089；Ayares等(1985)，Genetics111：375-388；Ayares等(1986)Mol.Cell.Bio.7：1656-1662；Song等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：6820-6824；Thomas等(1986)Cell44：419-428；Thomas和Capecchi(1987)Cell51：503-512；Nandi等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：3845-3849；及Mansour等(1988)Nature336：348-352；Evans和Kaufman(1981)Nature294：146-154；Doetschman等(1987)Nature330：576-578；Thoma和Capecchi(1987)Cell51：503-512；Thompson等(1989)Cell56：316-321。
可用于同源重组的细胞举例说包括上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核的细胞(mononuclear cell)、成纤维细胞、心肌细胞和其它肌细胞等。
含iRNA模板的载体构建物可包含被定向插入的基因的一个或多个外显子和/或内含子的完全或部分序列，被定向插入的基因的完全或部分启动子序列，或者它们的组合。在本发明的一个实施方案中，含iRNA构建物的核酸序列包含与被定向插入的基因的第一核酸序列区域同源的第一核酸序列区域，和与被定向插入的基因的第二核酸序列同源的第二核酸序列区域。载体构建物的方向应使得第一核酸序列位于第二核酸序列的上游，iRNA模板应在它们之间。
可选择核酸序列区域，使得含iRNA模板的载体构建物序列和目的基因之间具有同源性。优选构建物序列相对于靶序列是等基因序列。构建物的核酸序列区域可与基因的任何区域相关，条件是它与所述基因同源。如果所述基因与核酸序列有至少约90％的同一性，优选至少约95％同一性或最优选约98％同一性，则核酸序列可认为是“同源的”。此外，位于选择性标记侧翼的5’和3’核酸序列应足够大，以便当构建物被引入到靶细胞的基因组DNA中时，可为杂交提供互补序列。例如，位于选择性标记基因侧翼的同源核酸序列，其长度应为至少约500bp，优选至少约1千碱基(kb)，更优选约2-4kb，最优选约3-4kb。在一个实施方案中，位于构建物的选择性标记基因侧翼的两个同源核酸序列，其长度都应为至少约500bp，优选至少约1kb，更优选约2-4kb，最优选约3-4kb。
另一种类型的DNA序列可以是cDNA序列，条件是所述cDNA足够大。用以制备构建物的每个侧翼核酸序列优选与一个或多个外显子和/或内含子区域同源，和/或与启动子区域同源。
这些序列的每一个互不相同，但可与同一外显子和/或内含子中的区域同源。或者，这些序列可与基因的不同外显子和/或内含子中的区域同源。优选构建物的两个侧翼核酸序列与目的基因的同一或不同内含子的两个序列区域同源。此外，可使用等基因DNA制备本发明的构建物。因此，所获得的用以制备构建物的核酸序列优选获自与用作靶细胞的细胞系相同的细胞系。
或者，可使用其中存在单一同源区域的靶向构建物。在这种构建物中，单一同源交换事件在同源区域中产生插入。这种构建物可以环状形式供应，或者为线性形式，在细胞中通过自然过程自发环化(HastyP，Rivera-Perez J，Chang C，Bradley A.Target frequency and integrationpattern for insertion and replacement vectors in embryonic stem cells.MolCell Biol.1991年9月；11(9)：4509-17)。
在本发明的一个实施方案中，可采用同源重组将与启动子有效连接的含iRNA表达载体插入到细胞如成纤维细胞的基因组中。随着表达载体被引入到优选至少一个、任选两个拷贝的被靶向基因中，所述DNA可在具体基因座包含至少一部分基因。
或者，可将没有启动子的含iRNA表达载体插入到内源基因中。这种插入让无启动子载体的表达由内源基因的相关启动子驱动。在一个实施方案中，载体被插入到基因的3’非编码区域。在本发明的一个具体方面，载体被插入到组织特异性或生理特异性基因中。例如，通过靶向在每个肝细胞中以所需的水平和时间模式表达的内源基因，可提供肝细胞特异性表达。
在另一个实施方案中，装配靶向载体，使得iRNA载体被插入到看家基因的单一等位基因中。被靶向看家基因的非限制性实例包括以下人看家基因的保守跨种类似物：线粒体16S rRNA、核糖体蛋白L29(RPL29)、H3组蛋白3B家族(H3.3B)(H3F3B)、聚腺苷酸结合蛋白、胞质1(PABPC1)、HLA-B相关转录物-1(D6S81E)、surfeit1(SURF1)、核糖体蛋白L8(RPL8)、核糖体蛋白L38(RPL38)、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、核糖体蛋白S7(RPS7)、热激27kD蛋白1(HSPB1)、真核翻译延伸因子1δ(鸟嘌呤核苷酸交换蛋白)(EEF1D)、波形蛋白(VIM)、核糖体蛋白L41(RPL41)、羧酸酯酶2(肠、肝)(CES2)、核输出蛋白1(CRM1，酵母，同系物)(XPO1)、ubiquinol-细胞色素c还原酶铰链蛋白(UQCRH)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、核糖体结合蛋白II(RPN2)、普列克底物蛋白和Sec7结构域蛋白(PSD)、人心肌钙蛋白T、蛋白酶体(前体(prosome)、macropain)亚单位，β型type，5(PSMB5)、肌动蛋白丝切蛋白1(非肌肉)(CFL1)、丝氨酰-tRNA合成酶(SARS)、联蛋白(钙黏着蛋白相关蛋白质)，β1(88kD)(CTNNB1)、Duffy血型(FY)、红细胞膜蛋白7.2条带(stomatin)(EPB72)、Fas/Apo-1、LIM和SH3蛋白1(LASP1)、辅助蛋白BAP31/BAP29(DXS1357E)、新生多肽相关复合体α多肽(NACA)、核糖体蛋白L18a(RPL18A)、TNF受体相关因子4(TRAF4)、MLN51蛋白(MLN51)、核糖体蛋白L11(RPL11)、Poly(rC)结合蛋白2(PCBP2)、硫氧还蛋白(TXN)、谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(QARS)、睾丸增强基因转录物(TEGT)、前列腺结合蛋白(PBP)、信号序列受体，β(易位子相关蛋白β)(SSR2)、核糖体蛋白L3(RPL3)、中心粒蛋白，EF手蛋白，2(CETN2)、核内不均一核糖核蛋白K(HNRPK)、谷胱甘肽过氧化物酶4(磷脂氢过氧化物酶)(GPX4)，融合体，衍自t(12；16)恶性脂质肉瘤(FUS)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位c(亚单位9)，同种型2(ATP5G2)、核糖体蛋白S26(RPS26)、核糖体蛋白L6(RPL6)、核糖体蛋白S18(RPS18)、丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，分化单位A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员3(SERPINA3)、双特异性磷酸酶1(DUSP1)、过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)、附睾分泌性蛋白(19.5kD)(HE1)、核糖体蛋白S8(RPS8)、易位启动区(活化MET癌基因)(TPR)、核糖体蛋白L13(RPL13)、SONDNA结合蛋白(SON)、核糖体蛋白L19(RPL19)，核糖体蛋白(与酵母S24同源)、CD63抗原(黑素瘤1抗原)(CD63)、蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体6型(PTPN6)、真核翻译延伸因子1β2(EEF1B2)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位b，同种型1(ATP5F1)、溶质载体25家族(线粒体载体；磷酸盐载体)、成员3(SLC25A3)、色氨酰-tRNA合成酶(WARS)、谷氨酸-氨连接酶(谷氨酰胺合酶)(GLUL)、核糖体蛋白L7(RPL7)、干扰素诱导跨膜蛋白质2(1-8D)(IFITM2)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，β多肽(YWHAB)、酪蛋白激酶2，β多肽(CSNK2B)、遍在蛋白A-52残基核糖体蛋白融合产物1(UBA52)、核糖体蛋白L13a(RPL13A)、主要组织相容性复合体，I类，E(HLA-E)、jun D原癌基因(JUND)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，θ多肽(YWHAQ)、核糖体蛋白L23(RPL23)、核糖体蛋白S3(RPS3)、核糖体蛋白L17(RPL17)、细丝蛋白A，α(肌动蛋白结合蛋白-280)(FLNA)、基质Gla蛋白(MGP)、核糖体蛋白L35a(RPL35A)、肽基脯氨酸异构酶A(亲环蛋白A)(PPIA)、绒毛蛋白2(埃兹蛋白)(VIL2)、真核翻译延伸因子2(EEF2)、jun B原癌基因(JUNB)、核糖体蛋白S2(RPS2)、细胞色素c氧化酶VIIc亚单位(COX7C)、核内不均一核糖核蛋白L(HNRPL)、肿瘤蛋白，翻译控制1(TPT1)、核糖体蛋白L31(RPL31)、细胞色素c氧化酶VIIa亚单位多肽2(肝)(COX7A2)、DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)盒多肽5(RNA解旋酶，68kD)(DDX5)、细胞色素c氧化酶VIa亚单位多肽1(COX6A1)、热激90kD蛋白1，α(HSPCA)、Sjogren综合征抗原B(自身抗原La)(SSB)、乳酸脱氢酶B(LDHB)、高速泳动族(非组蛋白染色体)蛋白质17(HMG17)、细胞色素c氧化酶VIc亚单位(COX6C)、核内不均一核糖核蛋白A1(HNRPA1)、醛缩酶A，果糖二磷酸(ALDOA)、整联蛋白，β1(纤连蛋白受体，β多肽，抗原CD29，包括MDF2，MSK12)(ITGB1)、核糖体蛋白S11(RPS11)、核内小核糖核蛋白70kD多肽(RN抗原)(SNRP20)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)、β多肽1(GBN1)、核内不均一核糖核蛋白A1(HNRPA1)、钙蛋白酶4，小亚单位(30K)(CAPN4)、延伸因子TU(N末端)/X03689、核糖体蛋白L32(RPL32)、主要组织相容性复合体，II类，DPα1(HLA-DPA1)、超氧化物歧化酶1，可溶性(肌萎缩性侧索硬化1(成人))(SOD1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)、肌动蛋白，β(ACTB)、主要组织相容性复合体，II类，DPα(HLA-DPA)、微管蛋白，β多肽(TUBB)、金属硫蛋白2A(MT2A)、磷酸甘油激酶1(PGK1)、KRAB相关蛋白1(TIF1B)、真核翻译起始因子3，亚单位5(ε，47kD)(EIF3S5)、NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合体，4(9kD，MLRQ)(NDUFA4)、氯离子胞内通道1(CLIC1)、衔接头相关蛋白复合体3，δ1亚单位(AP3S1)、细胞色素c氧化酶IV亚单位(COX4)、PDZ和LIM结构域1(elfin)(PDLIM1)、谷胱甘肽-S-转移酶样；谷胱甘肽转移酶ω(GSTTLp28)、干扰素刺激基因(20kD)(ISG20)、核因子I/B(NFIB)、COX10(酵母)同系物、细胞色素c氧化酶装配蛋白(血红素A：法尼基转移酶)、骨肉瘤中扩增的保守基因(OS4)、Nε-(4-氨丁基)赖氨酸合酶(DHPS)、半乳糖苷酶，α(GLA)、微粒体谷胱甘肽S-转移酶2(MGST2)、真核翻译起始因子4γ，2(EIF4G2)、遍在蛋白载体蛋白E2-C(UBCH10)，BTG家族，成员2(BTG2)、B细胞相关蛋白(REA)、COP9亚单位6(MOV34同系物，34kD)(MOV34-24KD)、ATX1(抗氧化蛋白1，酵母)同系物1(ATOX1)、富含亮氨酸的酸性蛋白质(SSP29)、聚腺苷酸结合蛋白(PABP)启动区、硒蛋白W，1(SEPW1)、真核翻译起始因子3，亚单位6(48kD)(EIF3S6)、肉碱棕榈酰转移酶I，肌肉(CPT1B)、跨膜运输蛋白(TMP21)、四又二分之一LIM结构域1(FHL1)、核糖体蛋白S28(RPS28)、髓细胞白血病因子2(MLF2)、神经丝三联体L蛋白/U57341、加帽蛋白(肌动蛋白纤丝)肌肉Z线，α1(CAPZA1)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶1(溶血磷脂酸酰基转移酶，α)(AGPAT1)、肌醇1，3，4-三磷酸5/6激酶(ITPK1)、三联组氨酸核苷酸结合蛋白(HINT)、dynamitin(动力蛋白激活蛋白复合体50kD亚单位)(DCTN-50)、肌动蛋白相关蛋白2/3复合体，亚单位2(34kD)(ARPC2)、组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)、遍在蛋白B、几丁质酶3样2(CHI3L2)、D-多巴色素互变异构酶(DDT)、锌指蛋白220(ZNF220)、sequestosome1(SQSTM1)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白B(胱抑蛋白B)(CSTB)、真核翻译起始因子3，亚单位8(110kD)(EIF3S8)、趋化因子(C-C模体)受体9(CCR9)、遍在蛋白特异性蛋白酶11(USP11)、层粘连蛋白受体1(67kD，核糖体蛋白SA)(LAMR1)，在骨肉瘤中扩增(OS-9)、剪接因子3b，亚单位2，145kD(SF3B2)、整联蛋白联接激酶(ILK)、遍在蛋白缀合酶E2D3(与酵母UBC4/5同源)(UBE2D3)、含陪伴蛋白的TCP1，亚单位4(δ)(CCT4)、聚合酶(RNA)II(DNA指导的)多肽L(7.6kD)(POLR2L)、核受体共阻遏蛋白2(NCOR2)、辅助蛋白BAP31/BAP29(DXS1357E，SLC6A8)、13kD分化相关蛋白蛋白(LOC55967)、Tax1(人T细胞白血病病毒I型)结合蛋白1(TAX1BP1)、损伤特异性DNA结合蛋白1(127kD)(DDB1)、动力蛋白，胞质，轻多肽(PIN)、甲硫氨酸氨肽酶、eIF-2-相关p67(MNPEP)、G蛋白途径抑制蛋白2(GPS2)、核糖体蛋白L21(RPL21)、外被体蛋白复合体，α亚单位(COPA)、G蛋白途径抑制蛋白1(GPS1)、核内小核糖核蛋白D2多肽(16.5kD)(SNRPD2)、核糖体蛋白S29(RPS29)、核糖体蛋白S10(RPS10)、核糖体蛋白S9(RPS9)、核糖体蛋白S5(RPS5)、核糖体蛋白L28(RPL28)、核糖体蛋白L27a(RPL27A)、蛋白质酪氨酸磷酸酶IVA型，成员2(PTP4A2)、核糖体蛋白L36(RPL35)、核糖体蛋白L10a(RPL10A)、IgG的Fc片段，受体，转运蛋白，α(FCGRT)、母体G10转录物(G10)、核糖体蛋白L9(RPL9)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位c(亚单位9)，同种型3(ATP5G3)、信号识别颗粒(与Alu RNA-结合蛋白同源)(SRP14)、mutL(大肠杆菌)同系物1(结肠癌，非息肉2型)(MLH1)、染色体1q亚端粒序列D1S553/U06155、纤调蛋白(FMOD)、切口的氨基末端增强子(AES)、Rho GTP酶激活蛋白1(ARHGAP1)、含非POU结构域，八聚体结合(NONO)，v-raf鼠肉瘤3611病毒癌基因同系物1(ARAF1)、核内不均一核糖核蛋白A1(HNRPA1)、β2-微球蛋白(B2M)、核糖体蛋白S27a(RPS27A)，含布罗莫结构域2(BRD2)、精子缺乏症因子1(AZF1)，由1，25二羟维生素D-3(VDUP1)正调节、丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，分化单位B(卵清蛋白)，成员6(SERPINB6)、消去蛋白(肌动蛋白解聚因子)(ADF)、胸腺素β-10(TMSB10)、CD34抗原(CD34)、血影蛋白，β，非红细胞1(SPTBN1)、血管相关的游走细胞蛋白(AAMP)、主要组织相容性复合体，I类，A(HLA-A)、MYC相关锌指蛋白(嘌呤结合转录因子)(MAZ)、SET易位(骨髓白血病相关的)(SET)、配对框基因(无虹膜，角膜炎)(PAX6)、与小鼠中Zfp-36同源的锌指蛋白(ZFP36)、FK506-结合蛋白4(59kD)(FKBP4)、核小体装配蛋白1样1(NAP1L1)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，ζ多肽(YWHAZ)、核糖体蛋白S3A(RPS3A)、ADP-核糖基化因子1、核糖体蛋白S19(RPS19)、转录延伸因子A(SII)，1(TCEA1)、核糖体蛋白S6(RPS6)、ADP-核糖基化因子3(ARF3)、膜突蛋白(MSN)、B细胞抑制剂中κ轻多肽基因增强子的核因子，α(NFKBIA)、补体成分1，q亚成分结合蛋白(C1QBP)、核糖体蛋白S25(RPS25)、簇蛋白(补体裂解抑制剂，SP-40，40，硫酸化糖蛋白2，睾酮抑制前列腺信息2，载脂蛋白J)(CLU)、核仁蛋白(NCL)、核糖体蛋白S16(RPS16)、遍在蛋白激活酶E1(A1S9T和BN75温度敏感性互补)(UBE1)、凝集素，半乳糖苷结合，可溶性，3(半乳凝集素3)(LGALS3)、真核翻译延伸因子1γ(EEF1G)、pim-1癌基因(PIM1)、S100钙结合蛋白A10(膜联蛋白11配体、依钙结合蛋白I，轻多肽(p11)(S100A10)、H2A组蛋白家族，成员Z(H2AFZ)、ADP-核糖基化因子4(ARF4)(ARF4)、核糖体蛋白L7a(RPL7A)、主要组织相容性复合体，II类，DQα1(HLA-DQA1)、FK506结合蛋白1A(12kD)(FKBP1A)、CD81抗原(抗增殖抗体1的靶标)(CD81)、核糖体蛋白S15(RPS15)、X盒结合蛋白1(XBP1)、主要组织相容性复合体，II类，DNα(HLA-DNA)、核糖体蛋白S24(RPS24)、白血病相关磷蛋白p18(驿蛋白)(LAP18)、肌球蛋白，重多肽9，非肌肉(MYH9)、酪蛋白激酶2，β多肽(CSNK2B)、岩藻糖苷酶，α-L-1，组织(FUCA1)、心肌黄酶(NADH)(细胞色素b-5还原酶)(DIA1)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(血管淀粉样变性和脑出血)(CST3)、遍在蛋白C(UBC)、ubiquinol-细胞色素c还原酶结合蛋白(UQCRB)、前胸腺素α(基因序列28)(PTMA)、谷胱甘肽S-转移酶π(GSTP1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，β多肽2样1(GNB2L1)、核磷蛋白(核仁磷蛋白B23，核基质蛋白)(NPM1)、CD3E抗原，ε多肽(TiT3复合体)(CD3E)、钙蛋白酶2，(m/II)大亚单位(CAPN2)、NADH脱氢酶(泛醌)黄素蛋白2(24kD)(NDUFV2)、热激60kD蛋白1(陪伴蛋白)(HSPD1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α刺激活性多肽1(GNAS1)、网格蛋白，轻多肽(Lca)(CLTA)、ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合体，β多肽、钙调蛋白2(磷酸酶激酶，δ)(CALM2)、肌动蛋白，γ1(ACTG1)、核糖体蛋白S17(RPS17)、核糖体蛋白，大，P1(RPLP1)、核糖体蛋白，大，P0(RPLP0)、胸腺素，β4，X染色体(TMSB4X)、核内不均一核糖核蛋白C(C1/C2)(HNRPC)、核糖体蛋白L36a(RPL36A)、葡糖醛酸糖苷酶，β(GUSB)、与SRC，FGR，YES相关的FYN癌基因(FYN)、前胸腺素，α(基因序列28)(PTMA)、烯醇化酶1，(α)(ENO1)、层粘连蛋白受体1(67kD，核糖体蛋白SA)(LAMR1)、核糖体蛋白S14(RPS14)、CD74抗原(主要组织相容性复合体的不变多肽，II类抗原相关性)、酯酶D/甲酰谷胱甘肽水解酶(ESD)、H3组蛋白，3A家族(H3F3A)、铁蛋白，轻多肽(FTL)、Sec23(酿酒酵母)同系物A(SEZ23A)、肌动蛋白，β(ACTB)、早老蛋白1(阿尔茨海默氏病3)(PSEN1)、白介素-1受体相关激酶1(IRAKI)、锌指蛋白162(ZNF162)、核糖体蛋白L34(RPL34)、beclin1(卷曲螺旋，肌球蛋白样BCL2相互作用蛋白)(BECN1)、磷脂酰肌醇4-激酶，催化性，α多肽(PIK4CA)、含IQ模体的GTP酶激活蛋白1(IQGAP1)、转录3的信号转导蛋白和激活蛋白(急性期反应因子)(STAT3)、核内不均一核糖核蛋白F(HNRPF)、推定翻译起始因子蛋白(SUI1)、蛋白质易位复合体β(SEC61B)、Ras同系物基因家族，成员A(ARHA)、铁蛋白，重多肽1(FTH1)、Rho GDP解离抑制剂(GDI)β(ARHGDIB)、H2A组蛋白家族，成员O(H2AFO)、膜联蛋白A11(ANX11)、核糖体蛋白L27(RPL27)、腺苷酸环化酶相关蛋白(CAP)、锌指蛋白91(HPF7，HTF10)(ZNF91)、核糖体蛋白L18(RPL18)、法尼基转移酶，CAAX盒，α(FNTA)、钠通道，电压门控，I型，β多肽(SCN1B)、钙联接蛋白(CANX)、蛋白脂质蛋白2(结肠上皮富含)(PLP2)、淀粉样蛋白β(A4)前体(precursor)样蛋白2(APLP2)、依赖于电压的阴离子通道2、蛋白酶体(前体，macropain)激活蛋白亚单位1(PA28α)(PSME1)、核糖体蛋白L12(RPL12)、核糖体蛋白L37a(RPL37A)、核糖体蛋白S21(RPS21)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，ATP酶，1(PSMC1)、主要组织相容性复合体，II类，DQβ1(HLA-DQB1)、复制蛋白A2(32kD)(RPA2)、热激90kD蛋白1，β(HSPCB)、细胞色素c氧化酶亚单位VIII(COX8)、真核翻译延伸因子1α1(EEF1A1)、SNRPN上游阅读框(SNURF)、凝集素，半乳糖苷结合，可溶性，1(半乳凝集素1)(LGALS1)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)、磷酸甘油变位酶1(大脑)(PGAM1)、干扰素诱导跨膜蛋白质1(9-27)(IFITM1)、核酸酶敏感元件结合蛋白1(NSEP1)、溶质载体家族25(线粒体载体；腺嘌呤核苷酸易位蛋白)，成员6(SLC25A6)、ADP-核糖基转移酶(NAD+；聚(ADP-核糖)聚合酶)(ADPRT)、白三烯A4水解酶(LTA4H)、抑制蛋白1(PFN1)、前皂化蛋白(高歇尔氏病变体和异染性脑白质营养不良变体)(PSAP)、溶质载体家族25(线粒体载体；腺嘌呤核苷酸易位蛋白)，成员5(SLC25A5)、β-2微球蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白7、核糖体蛋白S13、EB病毒小RNA相关蛋白、主要组织相容性复合体，I类，C X58536)、核糖体蛋白S12、核糖体蛋白L10、转化相关蛋白、核糖体蛋白L5、转录辅激活蛋白Pc4、组织蛋白酶B、核糖体蛋白L26、“主要组织相容性复合体，I类X12432”、Wilm S肿瘤相关蛋白、原肌球蛋白Tm30nm细胞骨架、脂质体蛋白S4，X连锁、核糖体蛋白L37、金属泛刺激素(Metallopanstimulin)1、核糖体蛋白L30、核不均一核糖核蛋白K、主要组织相容性复合体，I类，E M21533、主要组织相容性复合体，I类，E M20022、核糖体蛋白L30同系物、热激蛋白70Kda、“肌球蛋白，轻链/U02629”、“肌球蛋白，轻链/U02629”、钙周期蛋白、单链DNA结合蛋白Mssp-1、丙糖磷酸异构酶、核有丝分裂器蛋白1、蛋白激酶Ht31，Camp依赖性、微管蛋白，β2、钙调蛋白I型、核糖体蛋白S20、转录因子Btf3b、珠蛋白，β、核内小核糖核蛋白多肽CAlt.剪接2、核苷二磷酸激酶Nm23-H2s、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物，激活转录因子4(tax应答增强子元件B67)(ATF4)、prefoldin(PFDN5)，N-myc下游调节(NDRG1)、核糖体蛋白L14(RPL14)、呆蛋白(KIAA0253)、蛋白酶，丝氨酸，11(IGF结合)(PRSS11)、KIAA0220蛋白(KIAA0220)、蓬乱蛋白3(与果蝇dsh同源)(DVL3)、不发育(rudimentary)果蝇同系物增强子(ERH)、带多重剪接的RNA结合蛋白基因(RBPMS)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环化水解酶(ATIC)、KIAA基因产物(KIAA0164)、核糖体蛋白L39(RPL39)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，η多肽(YWHAB)、鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，非ATP酶，2(PSMD2)、冷诱导的RNA结合蛋白(CIRBP)、神经前体细胞表达，发育下调5(NEDD5)、高速泳动族非组蛋白染色体蛋白质1(HMG1)、苹果酸脱氢酶1NAD(可溶性)(MDH1)、细胞周期蛋白I(CCNI)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，非ATP酶，7(Mov34同系物)(PSMD7)、主要组织相容性复合体，I类，B(HLA-B)、ATP酶，液泡，14kD(ATP6S14)、转录因子样1(TCFL1)、KIAA0084蛋白(KIAA0084)、蛋白酶体(前体，macropain)26S亚单位，非ATP酶，8(PSMD8)、主要组织相容性复合体，I类，A(HIA-A)、丙氨酰-tRNA合成酶(AARS)、赖氨酰-tRNA合成酶(KARS)、ADP-核糖基化因子样6相互作用蛋白(ARL6IP)、KIAA0063基因产物(KIAA0063)、肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM)、DAZ相关蛋白2(DAZAP2)、真核翻译起始因子4A，同种型2(EIF4A2)、CD151抗原(CD151)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型6(PSMB6)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型4(PSMB4)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型2(PSMB2)、蛋白酶体(前体，macropain)亚单位，β型3(PSMB3)、Williams-Beuren综合征染色体部位1(WBSCR1)、古遍在蛋白1(AUP1)、KIAA0864蛋白(KIAA0864)、神经前体细胞表达，发育下调8(NEDD8)、核糖体蛋白L4(RPL4)、KIAA0111基因产物(KIAA0111)、转凝蛋白2(TAGLN2)、网格蛋白重多肽(Hc)(CLTC，CLTCL2)、ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合体，γ多肽1(ATP5C1)、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)、MORF相关基因X(KIA0026)、ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合体，α亚单位，同种型1，心肌(ATP5A1)、磷脂酰丝氨酸合酶1(PTDSS1)、抗氧化蛋白2(非硒谷胱甘肽过氧化物酶，酸性钙依赖性磷酸酯酶A2)(KIAA0106)、KIAA0102基因产物(KIAA0102)、核糖体蛋白S23(RPS23)、CD164抗原，唾液粘蛋白(CD164)、GDP解离抑制剂2(GDI2)、烯酰辅酶A水合酶，短链，1，线粒体(ECHS1)、真核翻译起始因子4A，同种型1(EIF4A1)、细胞周期蛋白D2(CCND2)、核内不均一核糖核蛋白U(支架附着因子A)(HNRPU)、APEX核酸酶(多功能DNA修复酶)(APEX)、ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合体，亚单位c(亚单位9)，同种型1(ATP5G1)、豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS，80K-L)(MACS)、膜联蛋白A2(ANXA2)，与酿酒酵母RER1类似(RER1)、透明质酸氨基葡糖苷酶2(HYAL2)、尿斑蛋白(uroplakin)1A(UPK1A)、核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)、核周蛋白α4(输入蛋白α3)(KPNA4)、以及在4p16.3上的HD基因座附近具有多重剪接变体的基因(RES4-22)。
在一个实施方案中，将含iRNA模板的载体插入到靶看家基因内含子中的被靶向看家基因中。在一个次实施方案中，通过将在其3’末端含有多个终止密码子的无启动子工程iRNA模板插入到靶看家基因的内含子当中，来防止靶基因被翻译。使用这种“启动子包载”策略，iRNA构建物可被剪接到染色体中，可能与包含靶基因的外显子的上游同框。这导致iRNA模板比被靶向的看家基因先表达。在某些实施方案中，由于iRNA模板下游存在多个终止密码子，iRNA模板的表达同时抑制看家基因的表达。此外，iRNA模板的表达在内源看家基因启动子的控制之下。对于这种“启动子包载”策略，设计看家基因靶向构建物，其含有与靶看家基因的内含子序列有同源性的序列，包含AG二核苷酸剪接受体位点的下游内含子剪接受体信号序列，被工程改造成在iRNA模板下游含有多个终止密码子的无启动子iRNA模板，包含GT二核苷酸剪接供体位点的内含子剪接供体信号序列以供将工程iRNA模板剪接到直接下游外显子，以及与靶基因的内含子序列有同源性、帮助与靶基因退火的其它序列。
在另一个实施方案中，使用“启动子包载”策略，通过用含有符合读框的无启动子iRNA模板的载体取代内源看家基因外显子，来将含iRNA模板的载体插入到靶看家基因中。含iRNA模板的载体被剪接到染色体中，导致iRNA模板表达，并伴随全长靶看家基因表达的抑制。此外，iRNA模板在看家基因的相关启动子控制之下。
这种“启动子包载”基因靶向构建物可设计成含有与靶看家基因起始密码子上游的3’内含子序列有同源性的序列，包含AG二核苷酸剪接受体位点的上游内含子剪接受体信号序列，Kozak共有序列、含无启动子iRNA模板的载体(含有例如聚腺苷酸终止序列)，包含来自起始密码子下游内含子区域的GT二核苷酸剪接供体位点的剪接供体序列，以及与下游内含子有5’序列同源性的序列。应当理解，所述方法可用来靶向被靶向看家基因中的任何外显子。
在一个实施方案中，DNA被随机插入到染色体中，并被设计成通过激活报告基因来显示其存在，这既模拟内源基因的表达，又可能使基因座发生突变。通过在细胞培养物中选出其中报告基因已被激活的细胞，可以比常规基因突变法更快地生产出动物，因为没有必要单独靶向每种基因。
在另一个实施方案中，iRNA涉及含有iRNA的载体通过使用EB病毒(EBV)小染色体载体的转基因表达，所述iRNA与启动子有效连接。有许多文章讨论了使用EBV小染色体进行载体的转基因表达(参加例如Saeki Y等(1998)Human Gene Therapy10：2787-2794；Saeki Y等(1998)Gene Therapy5：1031-1037)。
在本发明的实施方案中，提供含有5’和3’重组臂及编码iRNA的DNA模板的线性化载体或合成寡核苷酸。在一个实施方案中，可将这些靶向构建物插入到内源基因的外显子或内含子中，而不破坏内源基因的表达。在另一个实施方案中，将siRNA模板内嵌于能够发挥内含子功能的自给(self-contained)序列中。然后将含siRNA的内含子插入到内源基因的外显子中，以使所得的重组让siRNA表达置于内源基因调节元件的控制之下，同时又不阻碍同一内源基因的表达和翻译。
在另一个实施方案中，可将靶向构建物插入到基因中，使得该基因失活，即“敲除”该基因。在本发明的具体实施方案中，按照本文描述的方法产生的靶向构建物可敲除异种抗原基因，如α-1，3-半乳糖基转移酶(例如描述于Phelps等，Science，299；第411-414页(2003)或WO2004/028243)。被认为是异种移植的潜在障碍并因此可被靶向的其它基因包括：猪iGb3合酶基因(参见例如USSN60/517,524)、CMP-Neu5Ac羟化酶基因(参见例如USSN10/863,116)和/或Forssman合酶基因(参见例如美国专利申请第60/568,922号)。在具体的实施方案中，本文描述的靶向构建物可含有与编码一种或多种这些异种抗原的基因序列同源的5’和3’靶向臂。在其它实施方案中，可产生杂合和/或纯合敲除。在一个具体的实施方案中，按照本文描述的方法产生的靶向构建物可产生抑制PERV I猪细胞的表达并敲除至少一种异种抗原的iRNA分子。
在其它实施方案中，编码iRNA分子的载体或合成寡核苷酸构建物也可包含选择性标记基因。选择性标记基因可与靶基因的上游序列在读框内融合。在其它实施方案中，可对细胞进行功能测试，以确定是否已发生成功的靶向。在其它的实施方案中，可通过限制性分析、电泳、Southern分析、聚合酶链反应、测序或本领域公知的另外技术分析细胞，以确定编码iRNA分子的DNA是否已发生适当的整合。
合适的选择性标记基因包括但不限于：赋予在某些培养基底物上生长的能力的基因，如赋予在HAT培养基(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)上生长的能力的tk基因(胸苷激酶)或hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)；允许在MAX培养基(霉酚酸、腺嘌呤和黄嘌呤)上生长的细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)。参见Song等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：6820-6824(1987)。另参见Sambrook等，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harber，N.Y.(1989)，见第16章。选择性标记的其它实例包括：赋予对化合物如抗生素抗性的基因、赋予在选定底物上生长的能力的基因、编码产生可检测信号如荧光的蛋白质(如绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白(eGFP))的基因。有多种这样的标记公知且可获得，包括例如抗生素抗性基因如新霉素抗性基因(neo)，Southern，P.和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341(1982)；以及潮霉素抗性基因(hyg)，Nucleic Acids Research11：6895-6911(1983)，和Te Riele等，Nature348：649-651(1990)。其它选择性标记基因包括：乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂氨酸合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)和它们的衍生物。可获得多种赋予对以下抗性的选择性标记：氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨喋呤、膦丝菌素、嘌呤霉素和四环素。
掺入抗生素抗性基因和负选择因子的方法是本领域普通技术人员所熟悉的(参见例如WO99/15650；美国专利第6,080,576号；美国专利第6.136,566号；Niwa等，J.Biochem.113：343-349(1993)；和Yoshida等，Transgenic Research，4：277-287(1995))。
可用于本发明的其它选择性标记基因例如描述于以下美国专利：6,319,669；6,316,181；6,303,373；6,291,177；6,284,519；6,284,496；6,280,934；6,274,354；6,270,958；6,268,201；6,265,548；6,261,760；6,255,558；6,255,071；6,251,677；6,251,602；6,251,582；6,251,384；6,248,558；6,248,550；6,248,543；6,232,107；6,228,639；6,225,082；6,221,612；6,218,185；6,214,567；6,214,563；6,210,922；6,210,910；6,203,986；6,197,928；6,180,343；6,172,188；6,153,409；6,150,176；6,146,826；6,140,132；6,136,539；6,136,538；6,133,429；6,130,313；6,124,128；6,110,711；6,096,865；6,096,717；6,093,808；6,090,919；6,083,690；6,077,707；6,066,476；6,060,247；6,054,321；6,037,133；6,027,881；6,025,192；6,020,192；6,013,447；6,001,557；5,994,077；5,994,071；5,993,778；5,989,808；5,985,577；5,968,773；5,968,738；5,958,713；5,952,236；5,948,889；5,948,681；5,942,387；5,932,435；5,922,576；5,919,445和5,914,233。也可使用选择性标记的组合。
然后，可使已同源重组而将编码iRNA分子的DNA引入到基因组中的细胞在适当选择的培养基中生长，以鉴定出获得适当整合的细胞。然后可通过限制性分析、电泳、Southern分析、聚合酶链反应或本领域公知的另外技术分析细胞，对显示所需表型的细胞作进一步的分析。通过鉴定在靶基因位点显示适当插入的片段，可鉴定出其中已发生同源重组的细胞。
基于iRNA分子的表达显示所需表型的细胞然后可通过用于分析DNA的限制性分析、电泳、Southern分析、聚合酶链反应等作进一步的分析，以确定发生了同源重组还是非同源重组。这可如下进行确定：采用针对插入序列的探针，然后对插入序列侧翼的5’和3’区域进行测序，确定在构建物(插入序列)侧翼区以外延伸的、编码iRNA分子的DNA模板的存在。也可使用与构建物中序列互补的引物和与构建物外靶基因座上的序列互补的引物。这样，如果已发生同源重组，则只能获得其互补链上同时存在两个引物的DNA双链体。通过证明存在引物序列或预期大小序列，可以证实发生同源重组。
用于筛选同源重组事件的聚合酶链反应描述于Kim和Smithies，Nucleic Acids Res.16：8887-8903，1988；及Joyner等，Nature338：153-156，1989中。Thomas和Capecchi，出处同上，1987；Nicholas和Berg(1983)Teratocarcinoma Stem Cell，Siver，Martin和Strikland(编辑)(Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，N.Y.(第469-497页)；及Linney和Donerly，Cell35：693-699，(1983)已证明，突变多瘤增强子和驱动新霉素基因的胸苷激酶启动子的组合在胚胎干细胞和EC细胞中均有活性。
从第一轮靶向获得的细胞系其被靶向等位基因可能是杂合的。其中两个等位基因均被修饰的纯合性可通过多种方式来实现。一种方式是，培养许多其中有一个拷贝已被修饰的细胞，然后使用不同的选择性标记，使这些细胞进行另一轮靶向。或者可按照传统的孟德尔遗传学，通过培育其被修饰等位基因为杂合的动物，获得纯合子。在某些情况下，可期望具有两个不同的修饰等位基因。这可通过连续几轮的基因靶向或通过培育杂合子(各杂合子携带所需被修饰等位基因中的一个)来实现。
IV.被iRNA分子调节/靶向的基因
在本发明的又一个方面，提供调节具体基因或基因家族的表达的iRNA分子，使得基因的表达被功能性消除。在一个实施方案中，提供至少两种靶向基因的相同区域的iRNA分子。在另一个实施方案中，提供至少两种靶向同一基因的至少两个不同区域的iRNA分子。在又一个实施方案中，提供至少两种靶向至少两种不同基因的iRNA分子。本发明另外的实施方案提供上述基因靶向策略的组合。
在一个实施方案中，iRNA分子可以是同一序列。在另一实施方案中，iRNA分子可以是不同的序列。在另一个实施方案中，iRNA分子可以整合到同一或不同的载体或DNA模板中。在一个实施方案中，载体或DNA模板中的iRNA分子有效连接启动子序列，例如遍在表达的启动子或细胞类型特异性启动子。在另一个实施方案中，载体或DNA模板中的iRNA分子不在启动子序列的控制之下。在又一个实施方案中，可将这些载体或DNA模板引入到细胞中。在一个实施方案中，载体或DNA模板可整合到细胞的基因组中。可通过随机整合或定向整合来整合到细胞中。定向整合可通过同源重组来进行。
在其它实施方案中，提供至少两种iRNA分子，其中一种或多种基因的家族可通过iRNA分子的表达来调节。在另一个实施方案中，提供至少三种、四种或五种iRNA分子，其中一种或多种基因的家族可通过iRNA分子的表达来调节。iRNA分子可与一种或多种基因中的保守序列同源。用本发明的这种方法调节的基因家族可以是细胞内源的、相关病毒基因家族、在病毒属中保守的基因家族、相关真核寄生基因，或更具体的说猪内源反转录病毒基因家族。在一个具体的实施方案中，至少有两种iRNA分子可靶向至少两种属于同一基因家族成员的不同基因。iRNA分子可靶向基因家族中的同源区域，因此一种iRNA分子可靶向多种基因的相同区域。
iRNA分子可选自但不限于以下类型的iRNA：反义寡核苷酸、核酶、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、反向重复序列、短发夹RNA(shRNA)、小短暂调节RNA和成簇抑制性RNA(ciRNA)，包括径向成簇抑制性RNA、不对称成簇抑制性RNA、线性成簇抑制性RNA和复杂或复合成簇抑制性RNA。
在另一个实施方案中，提供用以调节哺乳动物细胞系或转基因动物中的靶基因的iRNA分子表达，使得靶基因的表达被功能性消除或低于可检测水平，即靶基因的表达降低至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％。
在本发明这个方面的另一个实施方案中，提供产生细胞和动物的方法，干扰RNA分子在所述细胞和动物中得到表达，从而调节靶基因的表达。本发明这个方面的方法可包括例如：鉴定细胞中的一种或多种靶核酸序列；获得至少两种结合靶核酸序列的iRNA分子；将任选包装在表达载体中的iRNA分子引入到细胞中；和在细胞中使得iRNA结合靶核酸序列从而调节一种或多种靶基因表达的条件下，表达所述iRNA。在一个实施方案中，本发明提供产生非人转基因动物的方法，所述转基因动物可遗传地表达至少两种调节一种或多种靶基因表达的iRNA分子。在一个实施方案中，所述动物可通过体细胞核转移产生。体细胞可被工程改造，以通过本文描述的任何技术表达iRNA分子。
在其它实施方案中，本发明还提供在细胞或转基因动物中表达至少两种iRNA分子的方法，所述iRNA靶向基因家族中的共同位置。这种方法可包括例如：鉴定细胞中为基因家族中的同源区域的一种或多种靶核酸序列；制备至少两种结合靶核酸序列的iRNA分子；将任选包装在表达载体中的iRNA分子引入到细胞中；和在细胞或动物中使得iRNA分子结合基因家族中的同源区域的条件下，表达所述iRNA。
本发明还提供通过本发明方法产生的转基因非人动物。本发明的方法用于产生转基因非人动物(例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、牛、猪、兔、狗、马、骡、鹿、猫、猴和其它非人灵长类动物)、禽类(特别是鸡、鸭和鹅)、鱼、爬行动物、两栖动物、蠕虫(例如秀丽线虫)和昆虫(包括但不限于蚊、果蝇、粉斑夜蛾和灰翅夜蛾)。虽然可以产生任何种类的非人动物，但在一个实施方案中，非人动物是转基因猪。本发明还提供从这种非人转基因动物分离的细胞、组织和器官。
在本发明的实施方案中，可通过至少两种iRNA分子的表达进行调节的内源基因包括但不限于细胞存活或细胞复制所需的基因、病毒复制所需的基因、编码免疫球蛋白基因座例如κ轻链的基因和编码细胞表面蛋白例如血管细胞黏着分子(VCAM)的基因，以及对细胞、组织、器官和动物的结构和/或功能重要的其它基因。也可使用本发明的方法，通过干扰RNA的可遗传转基因表达，调节转基因细胞或转基因动物中的一种或多种非编码RNA序列的表达。这些非编码RNA序列可以是RNA病毒基因组、内源基因、真核寄生基因的序列，或者是本领域公知和普通技术人员熟悉的其它非编码RNA序列。
根据本发明的各方面在细胞或动物中表达的iRNA分子可降低、增加或保持一种或多种靶基因的表达。为鉴定其中一种或多种基因、基因家族、所需基因亚群或基因的等位基因的表达待调节的具体靶核酸区域，可获取每种靶基因的代表性序列样品。可对各序列进行比较，找出相似和不相似的区域。这种分析可确定所有家族成员之间和家族成员亚群(即基因家族中的各类群)中的同一性区域。此外，这种分析可确定各家族成员的等位基因之间的同一性区域。通过评价家族成员的等位基因之间、家族成员的亚群之间和整个家族范围的同一性区域，可鉴定出标识整个家族、家族成员的亚群、单个家族成员、单个家族成员的等位基因亚群或家族成员的单个等位基因的靶区域。
表达的调节可降低一种或多种靶基因的表达。表达降低导致靶基因的转录后下调，最终导致靶基因最终产物蛋白的下调。对于下调，鉴定出靶核酸序列，使得iRNA与该序列的结合导致靶基因表达降低。基因表达降低是指相对于没有引入iRNA的情况，得自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物不存在，或者水平有可观察或可检测的降低。采用本发明的方法，靶基因被完全抑制/抑制或被部分抑制表达是有可能的。“部分抑制表达”是指以靶基因的完全抑制为100％，靶基因被抑制(即靶基因的表达减少)约10％至约90％。例如，可以抑制一种或多种基因的基因表达约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。或者，表达被抑制或抑制至低于可检测阈限。
在本发明的其它实施方案中，表达的调节可增加一种或多种基因的表达。当干扰RNA靶向用作一种或多种目的基因抑制物的核酸序列时，可导致目的基因表达增加。在本发明的这个实施方案中，靶核酸和目的基因可以是不同的序列。基因表达增加是指相对于没有引入iRNA的情况，得自一种或多种靶基因的蛋白质和/或mRNA产物存在，或者水平有可观察的增加。所谓基因表达增加，是指相对于没有引入iRNA的情况，被表达的靶基因的可测定量有任何数量上的增加。例如，基因表达水平可比没有干扰RNA的情况增加至约2倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1000倍或约2000倍。
在本发明的再其它方面中，当一种或多种基因被置于通常导致所述一种或多种基因表达降低或增加的环境条件下，对表达的调节可保持一种或多种基因的表达。在通常会增加或降低基因表达的环境条件下可以使一种或多种基因的表达得以保持，造成基因表达的稳态水平(即表达没有随时间增加或降低)，所述稳态水平与存在会增加或降低基因表达的环境条件前的表达水平相应。可增加基因表达的环境条件实例包括但不限于存在生长因子、葡萄糖生产增加、升温和细胞周期改变。可降低基因表达的环境条件实例包括但不限于缺氧、降温、缺乏生长因子和葡萄糖耗尽。
基因表达的定量可以确定含有一种或多种iRNA分子的细胞或动物中基因表达的抑制(或增强)程度。注射较低剂量的物质和iRNA给予或整合后经过较长时间，可导致在较少部分的细胞或动物(例如至少10％、20％、50％、75％、90％或者95％的被靶向细胞或动物)中出现基因抑制或增强情况。细胞或动物中基因表达的定量可显示在靶mRNA积累或靶蛋白质翻译水平上相似量的抑制或增强情况。抑制或增强的效率可通过用本领域公知的任何方法估算细胞或动物中基因产物的数量来确定。例如，mRNA可用杂交探针来检测，所述探针具有在用于干扰RNA的区域之外的核苷酸序列，而已翻译的多肽可用针对所述区域多肽序列的抗体来检测。用以定量mRNA和多肽的方法是本领域公知的，参见例如Sambrook，J.等，“Molecular Cloning：A LaboratoryManual，”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork(1989)。
本发明还涉及基因家族的表达调节。术语“基因家族”指具有相似功能、序列或表型的一种或多种基因。基因家族可含有保守序列，即在基因家族所有成员当中相同或高度同源的核苷酸序列。在某些实施方案中，iRNA序列可与基因家族的这个保守区域杂交，从而一种iRNA序列可靶向基因家族中不止一个成员。
在一个实施方案中，靶基因或靶基因家族是内源病毒如猪内源反转录病毒的基因。在本发明的另一个实施方案中，靶基因或靶基因家族是外源病毒的基因。外源病毒的实例包括但不限于人兽互传病毒(如西尼罗病毒、汉坦病毒、疱疹病毒、细小病毒、肠道病毒、狂犬病病毒、线状病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒和Napah病毒)、家畜病毒(如牛瘟病毒、口蹄疫病毒和马立克病病毒)、人工病毒和地方性病毒。任何不可作为物种基因组(染色体或染色体外)的内在(integral)元件而遗传的病毒基因，都可被认为是外源病毒，可通过本发明方法进行调节。在一个这样的实施方案中，被调节的一种或多种外源病毒基因家族可以是相关病毒基因的家族。相关病毒基因的实例包括但不限于gag基因、env基因和pol基因，它们作为反转录病毒基因家族而相关。
本发明方法也可用来调节进化相关基因家族中的基因的表达。进化相关基因是已偏离共同先祖遗传序列的基因，所述先祖遗传序列本身可能曾是或不是编码一种或多种mRNA的序列。在此进化相关家族中可存在基因亚群，而在此亚群中可存在保守核苷酸序列。本发明还提供用以通过使iRNA分子靶向此保守核苷酸序列来调节此基因亚群的表达的方法。可通过本发明方法调节的进化相关基因可以是细胞或动物的外源或内源基因，且可以是病毒基因家族的成员。此外，可通过本发明方法调节的病毒基因家族可具有细胞或动物内源的家族成员。
在本发明的另一个实施方案中，本发明方法可用来调节病毒的生活周期。在本发明的一个这样的方面，这种调节可导致病毒生活周期被截断或缩短。所谓生活周期的截断或缩短是指比起未被调节的相同病毒，病毒存活更短的时间。更短的时间涵括短于未被调节的相同病毒的生活周期的任何时间长度。例如，病毒可以存活的时间长度比未被调节的相同病毒短约1％、约5％、约10％、约33％、约50％、约67％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。所谓生活周期被100％截断的病毒，表示用iRNA处理病毒或包藏病毒的宿主细胞后不能存活任何时间的病毒。
在另一方面，iRNA诱导的调节可导致病毒生活周期扩展或延长。所谓生活周期扩展或延长，是指比起未被调节的相同病毒，病毒存活更长的时间。更长的时间涵括长于未被调节的相同病毒的生活周期的任何时间长度。例如，病毒可以存活的时间长度比未被调节的相同病毒长至约2倍、约5倍、约10倍、约倍、约50倍、约70倍、约100倍、约500倍、约1000倍或约2000倍等。
在本发明的另外其它方面，当病毒被置于通常导致其生活周期扩展或截断的环境条件下时，对表达的调节可保持病毒的生活周期。在通常会扩展或截断此生活周期的环境条件下保持病毒的生活周期，造成稳态(即没有扩展或截断)生活周期，所述稳态生活周期与存在会扩展或截断病毒生活周期的环境条件下的病毒生活周期相应。可扩展病毒生活周期的环境条件实例包括但不限于存在生长因子、葡萄糖生产增加、升温和细胞周期改变。可截断病毒的生活周期的环境条件实例包括但不限于缺氧、降温、缺乏生长因子和葡萄糖耗尽。
对病毒生活周期的调节可由病毒生活周期所需的内源基因或内源基因家族的调节造成。干扰RNA也可靶向病毒基因或病毒基因家族，从而调节病毒的生活周期。
在其它实施方案中，本发明方法可用来调节细胞或动物的内源基因或基因家族的表达。内源基因是可作为动物物种基因组的内在元件而遗传的任何基因。通过本发明方法调节内源基因，可提供用以抑制或增强细胞或动物的表型或生物状态的方法。可调节的表型或生物状态的实例包括但不限于病毒的释放和传播、饲养效率、生长速率、适口性、多产性、第二性征、畜体产量、畜体脂肪含量、毛质量、毛产量、疾病抵抗力、产后存活力和生育力。还可通过本发明方法调节的其它内源基因包括但不限于细胞存活所需的内源基因、细胞复制所需的内源基因、病毒复制所需的内源基因、编码免疫球蛋白基因座的内源基因和编码细胞表面蛋白的内源基因。更多的内源基因实例包括发育基因(例如黏着分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Writ家族成员、Pax家族成员、翼状螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子和它们的受体、生长/分化因子和它们的受体、神经递质和它们的受体)、肿瘤抑制基因(例如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WTI)和酶基因(例如ACC合酶和氧化酶、ACP去饱和酶和羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、查耳酮合酶、几丁质酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、颗粒包封(granule-bound)淀粉合酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、菊粉酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、溶菌酶、胭脂氨酸合酶、章鱼碱合酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、植酸酶、植物生长调节剂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支链淀粉酶、重组酶、反转录酶、RUBISCO、拓扑异构酶和木聚糖酶)。
在本发明的一个实施方案中，被调节的基因或基因家族是整合内源病毒的基因。整合内源病毒基因的实例包括但不限于：猪内源反转录病毒(PERV)基因、癌基因(例如ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3和YES)、生长因子受体基因、B病毒基因和猿猴T淋巴营养病毒基因。作为物种基因组的元件遗传的任何病毒基因可认为是内源病毒基因，并可通过本发明方法进行调节。在一个实施方案中，受到调节的一种或多种基因的家族可以是相关病毒基因的家族。
本发明方法也可用来调节具体等位基因的表达。等位基因是基因的多态性变体，其占据相同的染色体基因座。本发明方法允许调节基因或基因家族的一种或多种具体等位基因。在这个实施方案中，可制备iRNA序列，使得基因或基因家族的一种或多种具体等位基因受到调节，而同一基因或基因家族的其它另外等位基因不受调节。
在本发明的另一个实施方案中，被调节基因或基因家族是真核寄生虫基因。真核寄生虫的实例包括但不限于蠕虫、原生动物和节肢动物。
在又一个实施方案中，本发明方法允许调节非编码RNA序列的表达。非编码RNA序列是不转录活性蛋白质的序列。这些非编码RNA序列可以是内源或外源病毒基因组的序列，它们可以是细胞或动物的内源序列，或者它们可以是真核寄生虫的序列。
在更多的实施方案中，本发明方法允许强化同源重组事件。如果siRNA转基因位于同源靶向臂的“外部”，则siRNA转基因不被保留在其中已发生重组的细胞的基因组中。但是，如果靶向载体在随机位置上整合，从而不代表同源重组事件，则siRNA转基因将存在于这种细胞的基因组中。当siRNA转基因靶向所需的基因(产生选择性表型的基因)或者原始靶向载体中含有选择性标记时，则随机整合可与靶向事件相区别。在这种情况下，可相对于非靶向整合事件，对靶向事件进行强化。
A.PERV
在本发明的一个示例性实施方案中，被调节的基因或基因家族是整合内源病毒的基因。内源病毒的原型是PERV(猪内源反转录病毒)。
在本发明的一个示例性实施方案中，猪内源反转录病毒(PERV)基因可通过至少两种iRNA分子的表达来调节，使得PERV病毒的表达被功能性消除或低于检测水平。PERV是反转录病毒的家族，迄今已鉴定出其中的三种主要类型：PERV-A(Genbank检索号AF038601)、PERV-B(EMBL检索号PERY17013)和PERV-C(Genbank检索号AF038600)(Patience等1997，Akiyoshi等，1998)。PERV-A、B和C的gag和pol基因高度同源，而env基因在PERV的不同类型(例如PERV-A、PERV-B、PERV-C)之间有显著差异。最近也已鉴定出PERV-D(参见例如美国专利第6,261,806号)。
在一个实施方案中，靶向PERV病毒的iRNA可使PERV表达降低至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％，或者低于可检测水平。为实现这个目标，本发明提供至少两种靶向PERV基因组的gag、pol或env区域中相同序列的iRNA分子。此外还提供至少两种靶向PERV基因组的gag、pol或env区域中不同序列的iRNA分子。另外还提供至少两种各自靶向PERV基因组的不同区域(即gag、pol或env)的iRNA分子。另外，提供组合使用这些不同靶向策略的多种iRNA分子，例如提供：至少两种靶向PERV的gap区域的RNA干扰分子；至少两种靶向PERV的pol区域的RNA干扰分子；至少两种靶向PERV的env区域的RNA干扰分子，以靶向PERV基因。
本发明还提供猪动物以及从非人转基因动物分离的细胞、组织和器官，其中PERV表达已通过至少两种iRNA分子的表达被降低或功能性消除。在某些这种实施方案中，它们从表达一种或多种干扰RNA的转基因猪获得，该干扰RNA干扰猪内源反转录病毒基因、猪内源反转录病毒基因家族成员或猪内源反转录病毒基因家族亚群成员。
随着最近在猪克隆(Polejaeva等，2000；Onishi等，2000)和敲除猪α1，3-半乳糖基转移酶(α1，3GT)基因(Dai等，2002；Lai等，2002)中的成功，异种移植离成为现实更进了一步。从猪器官和组织中完全除去α1，3gal表位这种主要的异种抗原，会显著降低对猪异种移植物的超急性排斥。猪向人异种移植的一个潜在风险是人感染猪内源反转录病毒(PERV)的潜在可能。PERV是C型家族反转录病毒，普遍存在于所有的猪细胞、组织或器官中。PERV是猪基因组的内在部分，每个细胞中PERV原病毒拷贝数高达50个(Le Tissier等，1997)。大多数原病毒是缺损的，只有非常少数的原病毒具有复制能力(Herring等，2001)。至少已鉴定出三种不同的PERV序列(PERV-A、-B和-C)，它们根据三种不同的env基因亚家族当中的相对同源性来分类(Takeuchi Y等，1998；Blusch2002)。PERV-A和PERV-B相互之间显示92％的氨基酸同一性，与长臂猿白血病病毒、猫白血病病毒和Friend鼠白血病病毒显示63-66％的同一性。已从PK-15(猪肾衍生的)细胞、活化外周血单核细胞(PBMC)、猪胰岛和猪主动脉内皮细胞检测出具有复制能力的PERV-A和PERV-B(Martin等，1998；Takeuchi等，1998；Wilson等，1998)。PERV-A和PERV-B都能够感染人和猪细胞，而PERV-C为嗜亲性反转录病毒，尚未显示能够感染正常人细胞。感染和假型包装实验已证明，PERV-A、-B和-C使用不同的细胞受体。对用活猪器官、组织或细胞处理的人进行的研究，迄今为止尚未发现任何PERV感染证据(Heneine1998；Paradis1999；Patience1998)。但是，在这些研究中，只对人PBMC细胞进行筛选，大多数患者并没有受到免疫抑制。在异种移植背景下，来自猪的器官或细胞可直接暴露于患者的血流，而且因为这些患者通常被免疫抑制，PERV感染的风险可能会增加。此外，随着α1，3gal阴性猪的研制，另一种针对病毒如PERV的天然防御可能被抑制。通常，所有人体中存在的预先形成的高滴度抗αgal抗体，常常充当抵御其包膜饰有α-gal表位的病毒的第一道防线。但是，如果内源原病毒由α1，3gal阴性猪产生，它们也会缺乏α-gal，因此可能避开这种第一免疫防御作用。这样，存在来自α1，3gal阴性猪的PERV可有更多机会感染患者的潜在可能。
当前减少猪内源反转录病毒(PERV)传播的策略涉及通过传统育种手段降低PERV拷贝数。由于不同猪之间的PERV拷贝数和整合位点不同，所以有可能使用选择性育种来降低猪基因组中的PERV数量。但这种策略不但从所需时间的观点来看是不切实际的，而且它还假定PERV仅仅通过孟德尔式遗传来传播。由于C型反转录病毒可整合形成新的原病毒，这种假定是错误的(Mang，等，2001)。一种类似的策略是大量的猪个体和猪品种，以期发现具有少量PERV和/或基本上缺损PERV的遗传背景。再次假定PERV数量和整合位点是稳定的。此外，还因为可能只针对极少数有功能或亲人类的PERV选择这种猪而造成人为的安慰。但是，大多数已被表征的人传染性PERV由新型mRNA重组引起，产生不在原始基因组中的新PERV(Oldmixon等，2002)。
在本发明的一个方面，可以调节PERV基因家族。相关的PERV病毒包括例如PERV A、PERV B、PERV C和PERV D。相关PERV基因的实例包括但不限于gag基因、env基因和pol基因。
代表性的gag序列可通过以下Genbank检索号找到：AF038599、AF038600、AF147808、AF163266、AF417210、AF417211、AF417212、AF417213、AF417214、AF417215、AF417216、AF417217、AF417218、AF417219、AF417220、AF417221、AF435967、AW231947、AW308385、AW358862、AY056035、AY099323、AY099324、AY265811、BF441465、BF441466、BF441468、BF441469、BF443400、BI181099、BI183356、BI186129、BI398794、BI399234、CB468878、CB468924、CB479915或EMBL；AJ133816、AJ133817、AJ133818、AJ279056、AJ279057、AJ293656、AJ293657、Y17013。代表性的pol序列可通过以下Genbank检索号找到：AF000572、AF033259、AF033260、AF038599、AF038600、AF147808、AF163265、AF163268、AF274705、AF402661、AF402662、AF402663、AF435966、AF435967、AF511088、AF511089、AF511090、AF511091、AF511092、AF511093、AF511094、AF511095、AF511096、AF511097、AF511098、AF511099、AW416859、AW435835、AW447645、AY056035、AY099323、AY099324、BE013835、BF709087、BF709087、BI119493、BI183551、BI183551、BI304652、BI336152、CB287225、CF178916、CF178929、CF180285、CF180296、CF181622、CF181673、CF360188、CF360268、U77599、U77600或EMBL；AJ005399、AJ005400、AJ005401、AJ005402、AJ005403、AJ005404、AJ005405、AJ005406、AJ005407、AJ005408、AJ005409、AJ005410、AJ005411、AJ005412、AJ133816、AJ133817、AJ133818、AJ279056、AJ279057、AJ293656、AJ293657、Y12238、Y12239、Y17013、Y18744、Y18745、Y18746、Y18747、Y18748、Y18749、X99933。
代表性的env-A序列可通过以下Genbank检索号找到：AF130444、AF163264、AF163267、AF163269、AF296168、AF318386、AF318387、AF318389、AF417222、AF417223、AF417224、AF417225、AF417226、AF417230、AF417231、AF417232、AF426917、AF426918、AF426919、AF426920、AF426921、AF426922、AF426923、AF426924、AF426925、AF426926、AF426927、AF426928、AF426929、AF426930、AF426931、AF426934、AF426941、AF426942、AF426943、AF426944、AF426945、AF507940、BI119493、BI185465、BI185535、BI304699、BI336152、CB287431、CF178929或EMBL；AJ288584、AJ288585、Y12238。
代表性的env-B序列可通过以下Genbank检索号找到：AF014162、AF426916、AF426932、AF426933、AF426935、AF426936、AF426937、AF426938、AF426939、AF426940、AF426946、AW657531、AY056024、AY056025、AY056026、AY056027、AY056028、AY056029、AY056030、AY056031、AY056032、AY056033、AY056034、BI118348、BI244560、CF180296、CF181717或EMBL；AJ288586、AJ288587、AJ288588、AJ288589、AJ288590、AJ288591、AJ288592、Y12239。
代表性的env-C序列可通过以下Genbank检索号找到：AF318383、AF318384、AF318385、AF318388、AF402660、AF417227、AF417228、AF417229、BM336316、BM190587。
代表性的env-D序列可通过以下Genbank检索号找到：AF402661、AF402662、AF402663，或在美国专利第6,261,806号中找到。
在一个实施方案中，PERV-A、PERV-B和PERV-C基因家族可被至少两种iRNA分子同时靶向。在另一个实施方案中，病毒是猪内源反转录病毒家族亚群。
在另一个实施方案中，含有调节PERV的iRNA分子的猪细胞、组织和器官可用于异种移植。
细胞类型
本文描述的构建物、模板和载体可通过本领域公知的任何技术引入宿主细胞中，所述技术包括但不限于微注射、转染、转化和/或电穿孔。宿主细胞可以是哺乳动物、植物、酵母或细菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核生物如细菌(包括埃希氏菌属和假单胞菌属)的细胞，在另一个实施方案中，宿主细胞是真核生物细胞，例如昆虫细胞，包括但不限于来自灰翅夜蛾、粉斑夜蛾、果蝇或顶灯蛾(Estigmene)的细胞，或者哺乳动物细胞，包括但不限于人细胞、鼠细胞、猪细胞、牛细胞、绵羊细胞、啮齿动物细胞、仓鼠细胞、猴细胞、灵长类动物细胞或人细胞。哺乳动物细胞可以是获自各种不同器官和组织的细胞，所述器官和组织包括但不限于皮肤、间充质、肺、胰、心脏、肠、胃、膀胱、血管、肾、尿道、生殖器官和全部或部分胚胎、胎儿或成体动物的解集制品(disaggregated preparation)；或者上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核的细胞(mononuclear cell)、心肌细胞、其它肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞或内皮细胞。宿主细胞可以是HEK细胞、COS细胞或其它常用于细胞培养的细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是植物细胞，包括但不限于烟草细胞、玉米细胞、拟南芥细胞、马铃薯细胞或水稻细胞。
V.基因修饰动物的生产
本发明还包括生产可遗传地表达一种或多种干扰RNA的非人转基因动物的方法。任何非人转基因动物可通过任一种本发明方法来生产，所述非人转基因动物包括但不限于非人哺乳动物(包括但不限于猪、绵羊、山羊、牛、鹿、骡、马、猴和其它非人灵长类动物、狗、猫、大鼠、小鼠、兔)、禽类(包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅等)、爬行动物、鱼、两栖动物、蠕虫(例如秀丽线虫)、昆虫(包括但不限于果蝇、粉斑夜蛾和灰翅夜蛾)。
本发明还提供其基因组中插入了至少两种iRNA序列的非人转基因动物。在一个实施方案中，所述动物能够在其大多数细胞中表达iRNA分子。在另一个实施方案中，所述动物能够在其几乎所有的细胞中表达iRNA分子。由于序列被掺入到动物的基因组中，iRNA分子将由随后各代遗传，从而使这些各代动物也在其细胞中产生iRNA。
在本发明的一个方面，非人转基因动物通过核转移方法产生。在另一方面，本发明提供通过全能胚胎细胞的遗传修饰产生非人转基因动物的方法。
核转移/克隆
在本发明的一个实施方案中，非人转基因动物通过核转移方法生产。在一个实施方案中，核供体细胞可由本文描述的用以产生iRNA分子的靶向构建物进行遗传修饰。通过核转移生产表达一种或多种干扰RNA的非人转基因动物包括：(a)鉴定动物中的一种或多种靶核酸序列；(b)制备一种或多种干扰RNA，其中所述干扰RNA结合靶核酸序列；(c)制备一种或多种含有一种或多种干扰RNA的表达载体；(d)将所述一种或多种干扰RNA表达载体插入到核供体细胞的基因组中；(e)将核供体细胞的遗传物质转移到接纳体(acceptor)细胞中；(f)将接纳体细胞转移到接受(recipient)雌性动物中；和(g)让被转移的接纳体细胞在雌性动物中发育至分娩期。任何动物均可通过核转移生产，包括但不限于：猪、牛、绵羊、马、啮齿动物(包括小鼠和大鼠)、兔。
核转移技术或核移植技术是本领域公知的(Campbell等，Theriogenology43：181(1995)；Collas等，Mol.Report.Dev.，38：264-267(1994)；Keefer等，Biol.Reprod.，50：935-939(1994)；Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：6143-6147(1993)；WO94/26884；WO94/24274和WO90/03432，美国专利第4,944,384号和第5,057,420号)。在一个非限制性实施例中，提供如在Collas等的美国专利出版物2003/0046722中所描述的方法，所述出版物描述了允许供体染色体或供体细胞在插入去核卵母细胞中之前先被重编程序的哺乳动物克隆方法。该发明还描述了将染色体、核或细胞插入或者融合至卵母细胞的方法。
供体细胞核可被转移到受体猪卵母细胞中。这种方法的应用并不限于具体供体细胞类型。供体细胞可以是如Wilmut等，Nature385810(1997)；Campbell等，Nature38064-66(1996)；或Cibelli等，Science2801256-1258(1998)中所描述的细胞。原则上，可采用正常核型的所有细胞，包括胚胎细胞、胎儿细胞和成体体细胞，只要其能成功应用于核转移中。胎儿成纤维细胞是特别有用的一类供体细胞。合适的核转移方法主要描述于Campbell等，Theriogenology43：181(1995)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38：264-267(1994)；Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994)；Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，906143-6147(1993)；WO-A-9426884，WO-A-9424274，WO-A-9807841，WO-A-9003432，美国专利第4,944,384号和第5,057,420号。也可使用分化的或至少部分分化的供体细胞。供体细胞也可以但不必须是正在培养中的细胞，同时可以是静止细胞。静止的核供体细胞是可被诱导进入静止期或在体内以静止状态存在的细胞。现有方法也曾将胚胎细胞类型用于克隆程序中(Campbell等，(Nature，380：64-68，1996)和Stice等(Biol.Reprod.，2054：100-110，1996)。
核供体体细胞可从多种不同器官和组织获得，所述器官和组织包括但不限于皮肤、间充质、肺、胰、心脏、肠、胃、膀胱、血管、肾、尿道、生殖器官和全部或部分胚胎、胎儿或成体动物的解集制品。在本发明的一个合适的实施方案中，核供体细胞选自上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核的细胞(mononuclear cell)、心肌细胞、其它肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞或内皮细胞。在另一个实施方案中，核细胞是胚胎干细胞。在一个优选的实施方案中，成纤维细胞可用作供体细胞。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的核供体细胞是动物的生殖细胞。动物物种在胚胎、胎儿或成体阶段的任何生殖细胞均可用作核供体细胞。在一个合适的实施方案中，核供体细胞是胚胎生殖细胞。
核供体细胞可停止在细胞周期(GO、GI、G2、S、M)中的任一期。可用本领域公知的任何方法操纵细胞周期各期。控制细胞周期各期的方法包括但不限于通过对培养细胞进行接触抑制诱导GO静止期；通过除去血清或其它必需营养物诱导GO静止期；通过衰老诱导GO静止期；通过添加特定生长因子诱导GO静止期；通过物理或化学方法如热激、高压或用化学药品、激素、生长因子或其它物质进行的其它处理诱导GO或GI静止期；通过用干扰复制过程的任何时刻的化学药剂进行处理控制S期；通过用荧光激活细胞分选法、有丝分裂摇落法进行选择，用微管破坏剂或任何破坏有丝分裂进展的化学药品处理，控制M期(另参见Freshney，R.I.，“Culture of Animal Cells：A Manual ofBasic Technique，”Alan R.Liss，Inc，New York(1993))。
分离卵母细胞的方法是本领域公知的。例如，可从动物的卵巢或生殖道分离卵母细胞。动物卵母细胞的现成来源是屠宰场。对于遗传工程、核转移和克隆等技术的组合，通常必须先使卵母细胞在体外成熟，然后再用作核转移的接受细胞，然后再用精细胞受精而发育成胚胎。这种方法通常需要从在屠宰场获得的哺乳动物卵巢如牛卵巢中收集未成熟(前期I)卵母细胞，在受精或去核前使卵母细胞在成熟培养基中成熟，直到卵母细胞达到中期II阶段，这在牛卵母细胞的情况下通常发生于吸出后(post-aspiration)约18-24小时。该时间段通常称为“成熟期”。
中期II阶段卵母细胞可以是接受卵母细胞，可认为卵母细胞在此阶段可被或已充分“活化”，可象它处理精子那样处理引入的细胞核。在体内成熟的中期II阶段卵母细胞，已被成功用于核转移技术中。实际上，可在猪动情期开始后或在注射了人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素后35-48或39-41小时后，从非超排卵或超排卵猪中通过外科手术收集成熟的中期II阶段卵母细胞。
在固定时间的成熟期之后(约10-40小时，优选约16-18小时)，可将卵母细胞去核。进行去核前，可先移取卵母细胞，置于适当的培养基如含1mg/ml透明质酸酶的HECM中，然后除去卵丘细胞。然后可对被剥离(stripped)卵母细胞筛选极体，选出的中期II卵母细胞(通过极体的存在确定)之后用于核转移。如下进行去核。
可按公知的方法，如美国专利第4,994,384号描述的方法进行去核。例如，可将中期II卵母细胞置于任选含7.5μg/ml松胞菌素B的HECM中(用于立即去核)，或者可置于合适的培养基例如胚胎培养基(如CR1aa加10％动情期牛血清)中，之后进行去核，优选不超过24小时后，更优选16-18小时后去核。可用微量吸管通过显微外科手术法除去极体和附近的细胞质完成去核。然后可筛选卵母细胞，鉴定出已成功去核的卵母细胞。筛选卵母细胞的一种方法是用1μg/ml33342Hoechst染料(于HECM中)使卵母细胞染色，然后在紫外照射下观察卵母细胞不超过10秒钟。随后可将已成功去核的卵母细胞置于合适的培养基(如CR1aa加10％血清)中。
然后，可将与去核卵母细胞同物种的单个哺乳动物细胞转移到用以产生NT单位的去核卵母细胞的卵周隙中。可按本领域公知的方法，用所述哺乳动物细胞和去核卵母细胞产生NT单位。例如，细胞可通过电融合来融合。电融合通过提供足以造成质膜瞬时击穿的电脉冲来实现。质膜的这种击穿非常短暂，因为膜可快速再形成。因此，如果两块相邻的膜被诱导击穿，发生再形成时脂质双层搀和在一起，从而两个细胞之间可有小通道张开。这种小开口由于其热力学不稳定性会扩大，直到两个细胞成为一体。参见例如Prather等的美国专利第4,997,384号。有多种电融合介质可供使用，包括例如蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸缓冲溶液。也可使用仙台病毒作为融合剂实现融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，1969年9月19日)。此外，可将细胞核直接注射到卵母细胞中，而不是使用电穿孔融合。参见例如Collas和Barnes，Mol.Repord.Dev.，38：264-267(1994)。融合后，可将所得的融合NT单位置于合适的培养基(如CR1aa培养基)中，直到活化。通常不久即实现活化，例如在不到24小时后，或者约4-9小时后实现活化。
NT单位可用能实现所需效果的任何方法来活化。这种方法包括例如在亚生理温度下，实际上是向NT单位施加寒冷或事实的低温刺激，培养NT单位。最方便的做法是在室温下培养NT单位，室温相对于胚胎通常所暴露在的生理温度条件来说是寒冷的。或者，可通过应用已知的活化剂来实现活化。例如，已证明精子在受精过程中穿入卵母细胞活化灌流卵母细胞，在核转移后产生更多的存活妊娠和多个遗传上相同的动物(如猪)。此外，可使用电休克或化学休克等处理来活化融合后的NT胚胎。参见例如Susko-Parrish等的美国专利第5,496,720号。另外，可通过同时或依次提高卵母细胞中的二价阳离子水平，并降低卵母细胞中细胞蛋白质的磷酸化，来实现活化。这通常是通过将二价阳离子如镁、锶、钡或钙等以离子载体形式引入到卵母细胞质中来实现。增加二价阳离子水平的其它方法包括使用电休克，用乙醇处理和用笼蔽螯合剂处理。可通过已知方法，例如通过添加激酶抑制剂，例如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂(如6-二甲氨基嘌呤、星孢素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇)，来减少磷酸化。或者，可通过将磷酸酶(例如磷酸酶2A和磷酸酶2B)引入卵母细胞中，抑制细胞蛋白质的磷酸化。
然后，可将活化NT单位在合适的体外培养基中培养至产生细胞集落。适合于胚胎的培养和成熟的培养基是本领域公知的。可用于胚胎培养和维持的公知培养基的实例包括Ham′s F-10+10％胎牛血清(FCS)、组织培养基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、蒂罗德-清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS)、Eagle′s和Whitten′s培养基。
之后，可将培养出的NT单位(一个或多个)洗涤，然后置于装在孔板中的合适培养基中，所述板优选还含有合适的铺满饲养层。合适的饲养层举例说包括成纤维细胞和上皮细胞。将NT单位在饲养层上培养，直到NT单位的大小达到适合转移到雌性接受体中，或者适合获得可用来产生细胞集落的细胞。优选这些NT单位可培养至至少约2-400个细胞，更优选约4-128个细胞，最优选至少约50个细胞。
然后可将活化NT单位转移(胚胎转移)到雌性动物的输卵管中。在一个实施方案中，雌性动物可以是动情期同步的接受体小母猪。可使用杂种小母猪(England大白猪/杜洛克猪/兰德瑞斯猪)(280-400磅)。可通过口服给予混合在饲料中的18-20mg ReguMate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)，使小母猪同步成接受体动物。Regu-Mate可连续给予14天。然后在最后一次Regu-Mate处理后约105小时，可肌内给予一千单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG，Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后约22-26小时，则可进行胚胎转移。在一个实施方案中，妊娠可进行到分娩期，生出活子代。在另一个实施方案中，妊娠可提前5天结束，收获胚胎细胞。
本发明中胚胎转移和接受体动物管理方法是胚胎转移工业所用的标准方法。同步转移对于本发明的成功是重要的，也就是说，NT胚胎的阶段与雌性接受体的动情周期同步。参见例如Siedel，G.E，Jr.“Critical review of embryo transfer procedures with cattle”，Fertilizationand Embryonic Development in Vitro(1981)L.Mastroianni，Jr.和J.D.Biggers(编辑)，Plenum Press，New York，N.Y.，第323页。
生产遗传修饰动物的其它方法
在本发明的另外的实施方案中，转基因动物可通过本领域公知的任何方法生产，包括但不限于以下方法：DNA微注射到卵母细胞、合子或植入前卵裂球(如2细胞、4细胞或8细胞卵裂球)中、胚胎干细胞的转染、精子介导的DNA送递和通过血流体内转染胚胎。
在一个实施方案中，本发明提供通过全能胚胎细胞的遗传修饰生产表达至少两种干扰RNA的非人转基因动物的方法。在一个实施方案中，所述动物可通过以下步骤生产：(a)鉴定动物中的一种或多种靶核酸序列；(b)制备一种或多种干扰RNA，其中所述干扰RNA结合靶核酸序列；(c)制备一种或多种含有一种或多种干扰RNA的表达载体；(d)将所述一种或多种干扰RNA表达载体插入到动物物种的多个全能细胞的基因组中，从而产生多个转基因全能细胞；(e)获得所述动物物种的四倍体胚细胞；(f)将所述多个全能细胞插入到四倍体胚细胞中，从而产生转基因胚胎；(g)将胚胎转移到受体雌性动物中；和(h)让胚胎在雌性动物中发育至分娩期。本文描述的生产转基因动物(如小鼠)的方法在美国专利第6,492,575号中有进一步的描述。
在另一个实施方案中，全能细胞可以是胚胎干(ES)细胞。从胚细胞分离ES细胞、建立ES细胞系和它们随后的培养都按例如由以下文献描述的常规方法进行：Doetchmann等，J.Embroyl.Exp.Morph.87：27-45(1985)；Li等，Cell69：915-926(1992)；Robertson E.J.“Tetracarcinomas and Embroyonic Stem Cells：A Practical Approach，”E.J.Robertson(编辑)，IRL Press，Oxford，England(1987)；Wurst和Joyner“Gene Targeting：A Practical Approach，”A.L.Joyner(编辑)，IRL Press，Oxford，England(1993)；Hogen等，“Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual，”Hogan，Beddington和Lacy(编辑)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1994)；及Wang等，Nature336：741-744(1992)。
在本发明的又一个实施方案中，全能细胞可以是胚胎生殖(EG)细胞。胚胎生殖细胞是功能上与ES细胞等价的未分化细胞，也就是说，它们可以在体外培养和转染，然后促成嵌合体的体细胞和生殖细胞谱系(Stewart等，Dev.Biol.161：626-628(1994).EG cells are derived byculture of primordial germ cells，the progenitors of the gametes，with acombination of growth factors：leukemia inhibitory factor，steel factor andbasic fibroblast growth factor(Matsui等，Cell70：841-847(1992)；Resnick等，Nature359：550-551(1992))。EG细胞的培养可用本领域技术人员公知的方法来进行，所述方法例如描述于Donovan等，“TransgenicAnimals，Generation and Use，”L.M.Houdebine(编辑)，HarwoodAcademic Publishers(1997)。
用于本发明的四倍体胚细胞可通过自然合子生产和发育来获得，或者通过公知方法，由二细胞胚胎电融合后进行培养来获得，所述公知方法例如由以下文献描述：James等，Genet.Res.Camb.60：185-194(1992)；Nagy和Rossant，“Gene Targeting：A Practical Approach，：A.L.Joyner(编辑)，IRL Press，Oxford，England(1993)；或者Kubiak和Tarkowski，Exp.Cell Res.157：561-566(1985)。
ES细胞或EG细胞引入到胚细胞中可通过本领域公知的任何方法来进行，例如Wang等，EMBO J.10：2437-2450(1991)描述的方法。
“多个”全能细胞可涵括大于1的任何细胞数目。例如，用于本发明的全能细胞数目可以是约2至约30个细胞，约5至约20个细胞，或者约5至约10个细胞，在一个实施方案中，在显微操作装置中将取自单细胞悬液的约5-10个ES细胞注射到用支持(holding)移液管固定的胚细胞中。然后将胚胎孵育至少3小时，或者过夜，然后再通过本领域公知的方法引入到雌性接受体动物中(参见例如Robertson，E.J.“Teratocarcinomas and Embronic Stem Cells：A Practical Approach”IRLPress，Oxford，England)。然后可让胚胎在雌性动物中发育至分娩期。
在本发明的一个实施方案中，生产转基因动物的方法，无论是采用核转移、胚胎产生或本领域公知的其它方法，均产生转基因动物，其所包含的基因组不含有用以转移iRNA分子的表达载体的明显片段。本文所用的术语表达载体的“明显片段”表示表达载体的量，所述量占表达载体的总原始核酸序列的约10％至约100％。这排除了被转移到转基因动物基因组中的iRNA插入部分。因此，例如，不含有用以转移iRNA的表达载体的明显片段的转基因动物基因组，其在含有iRNA的序列之外可不含有表达载体片段。类似地，不含有用以转移iRNA的表达载体的明显片段的转基因动物基因组，在含有iRNA的序列之外可含有约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的表达载体。允许iRNA序列转移到基因组中，同时也将被转移的表达载体量限制为不明显片段的任何方法，均可用于本发明的方法中。
本发明允许iRNA序列转移到基因组中，同时又将也被转移的表达载体量限制为不明显片段的一个实施方案，是重组克隆方法，参见例如美国专利第5,888,732号和第6,277,608号。
重组克隆(参见例如美国专利第5,888,732号和第6,277,608号)描述用至少一个重组位点和至少一种重组蛋白质移动或交换核酸区段，以提供嵌合DNA分子的方法。一种可用于本发明方法以产生iRNA表达载体的这些嵌合分子的生产方法包括在体外或体内组合：(a)一种或多种包含一种或多种本发明iRNA序列的核酸分子，iRNA序列侧翼为第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一和第二重组位点基本上不互相发生重组；(b)一种或多种包含第三重组位点和第四重组位点的表达载体分子，其中所述第三和第四重组位点基本上不互相发生重组；和(c)一种或多种能够使第一和第三重组位点和/或第二和第四重组位点发生重组的位点特异性重组蛋白质，从而使重组得以发生，以便生产出至少一种包含一种或多种iRNA序列的共整合核酸分子。
用于本发明方法的重组位点和重组蛋白质包括但不限于美国专利第5,888,732号和第6,277,608号所描述的，例如Cre/loxP、整合酶(λInt、Xis、IHF和FIS)/att位点(attB、attP、attL和attR)及FLP/FRT。位点特异性重组酶的第二个家族-解离酶家族的成员(例如gd、Tn3解离酶、Hin、Gin和Cin)也是公知的，可用于本发明方法中。重组酶的这种高度相关家族的成员通常限制于分子内反应(例如倒位和移除)，可能需要宿主编码的因子。已分离出解除对宿主因子的某些要求(Maeser和Kahnmann Mol.Gen.Genet.230：170-176(1991))以及分子内重组的某些限制的突变体。
可用本领域公知和普通技术人员熟悉的类似于λInt和类似于P1Cre的其它位点特异性重组酶取代Int和Cre。在许多情况下，这种其它的重组酶的纯化在本领域中已有描述。如果它们是未知的，则可使用细胞提取物，或者可用针对Cre和Int描述的方法将酶部分纯化。
转座酶这一酶家族也已被用来在复制子之间转移遗传信息，且可用于本发明方法中来转移iRNA。转座子结构易变，虽有简单转座子或复合转座子之分，但通常都编码其侧翼为以相反方向组织起来的DNA序列的重组酶基因。转座子的整合可以是随机的，或者是高度特异的。代表性转座子如高度位点特异性的Tn7已被应用于在体内复制子之间移动DNA(Lucklow等，J.Virol.67：4566-4579(1993))。例如，Devine和Boeke(Nucl.Acids Res.22：3765-3772(1994))公开了人工转座子的构建，以在体外将DNA区段插入到接受DNA分子中。这个系统利用了酵母TY1病毒样颗粒的整合酶。目的核酸区段用标准方法克隆在转座子样元件TY1两端之间。在TY1整合酶存在下，所得元件随机整合到第二靶DNA分子中。
另外的重组位点和重组蛋白质以及它们的突变体、变体和衍生物，例如美国专利第5,888,732号、第6,277,608号和第6,143,557中所述，也可用于本发明方法中。
生产出含有其侧翼为重组蛋白质的一种或多种iRNA的表达载体后，可通过重组克隆将所述iRNA核酸序列转移到靶细胞的基因组中。在这个实施方案中，iRNA侧翼的重组蛋白质能够与靶细胞基因组中的一种或多种重组蛋白质发生重组。通过与一种或多种能够与重组位点发生重组的位点特异性重组蛋白质组合，iRNA序列被转移到靶细胞的基因组中，同时并没有将相当数量的剩余表达载体转移到靶细胞的基因组中。靶细胞基因组中的重组位点可自然发生，或者所述重组位点可通过本领域公知的任何方法引入到基因组中。在任一情况下，表达载体中一种或多种iRNA序列侧翼的重组位点必须与靶细胞基因组中的重组位点互补，以允许重组克隆。
本发明的另一个实施方案涉及生产非人转基因动物或嵌合动物的方法，所述方法包括使通过任一种本发明方法生产的雄性和雌性非人转基因动物杂交，以产生另外的转基因或嵌合动物后代。通过将均在其基因组中含有一种或多种iRNA的转基因雄性和雌性动物杂交，由这种杂交产生的后代在其基因组中也含有iRNA序列。这种杂交模式可按需重复多次。
在另一个实施方案中，通过本发明方法生产出的雄性或雌性非人转基因动物可分别与雌性或雄性动物杂交，其中参与杂交的第二雌性或雄性动物不是通过本发明方法生产出的非人转基因动物。由于iRNA本质上是显性的，因此这些杂交获得的后代也可表达其基因组中的iRNA序列。其中至少一种动物是本发明非人转基因动物的杂交可产生在其基因组中具有iRNA序列的后代。在另一个实施方案中，可用来自用本发明方法生产出的雄性非人转基因动物的精液使雌性动物受精，产生在其基因组中具有iRNA序列的后代。
VI.治疗用途和药物组合物
A.治疗用途
本发明的非人转基因动物也可用作由转基因表达的治疗性蛋白质的来源。
在一个实施方案中，本发明方法可用来减少动物所表达的一种或多种内源蛋白质的量。可将转基因表达靶向具体组织或细胞类型，以使这种蛋白质被区室化隔离。例如，通过由乳腺特异性启动子驱动蛋白质表达，可将蛋白质集中在转基因动物的乳汁中。此外，可在具体细胞类型中选择性表达转基因，以便特异性加工。例如，可用人免疫球蛋白基因座指导人多克隆抗体在牲畜B细胞中的重组、表达和加工。目前采用转基因动物作为治疗性蛋白质来源的一个问题是，动物内源的蛋白质可污染为纯化和最终在治疗环境中使用而收集的物质(即肽、蛋白质和核酸)。虽然污染性蛋白质在进化上与所需的产物可能不相关，但它们会与所需产物一起纯化出来。或者，污染性蛋白质可能是转基因产物的内源对等物。在任一情况下，从经济和治疗观点来看，减少内源基因的表达是有利的。本发明的一个实施方案是减少内源免疫球蛋白基因，使得可以在转基因动物中生产非嵌合、不受污染的人多克隆抗体。
在另一个方面，本发明通过敲除/抑制内源免疫球蛋白(Ig)基因座位的整个所有成分(repertoire)，将动物Ig基因用其人对等物替换，提供非人转基因动物中的iRNA介导的基因调节。因此，用这种策略生产的遗传修饰动物当用特定病原体或免疫原攻击时，能够在其血中和乳汁中产生完全人抗体。这种技术在一般保健领域具有众多的应用，包括：传染性疾病的预防、抗生素抗性感染的治疗、对无免疫应答患者的被动免疫、移植后预防肝炎和CMV病毒的免疫球蛋白、HIV治疗、抗丙肝免疫、抗蛇毒素、作为多克隆抗癌药物、癌症诊断、自身免疫病(多发性硬化，Kawasaki′s)的治疗和用于Rh阴性母亲的抗-D的生产。
此外，生产人多克隆抗体的非人转基因动物在生物战对策中具有重要的应用，由此非人转基因动物用任何已知传染性疾病的病原体或其产物免疫，产生特异性人抗体(优选IgG)，可用作治疗药物，或者可对军队人员进行被动免疫。衍自动物的人多克隆抗体的应用是广谱的，并不限于一种或几种病原生物。可用任何免疫原来免疫这些动物，以诱导产生抗体，用于预防多种病原生物，包括但不限于炭疽、葡萄球菌、革兰氏阴性细菌、依波拉病毒和汉坦病毒。另外的免疫原包括但不限于毒液和细菌毒素。取决于是从血液还是从乳汁中分离，每年每头动物可获得2-5公斤的特异性抗体(特别是就使用猪、绵羊或牛来说时)，在动物中生产人抗体具有规模优势，这样少数动物即可容易地满足数千患者的需求。抵抗许多这些病原体的抗体由于稀缺的缘故，目前尚不能在常规发育人群中大量提供，而且由于毒力/毒性的缘故，它们不能以任何形式在人体中用作免疫原。另外，因为这些抗体是完全人抗体，所以它们在特异性、亲和力和效价上远胜于目前在马和山羊中生产的抗血清。这种应用已首先在小鼠中使用小鼠ES细胞技术完成。Mendez等(Nature Genet.15：146-156，(1997))证明了兆碱基人免疫球蛋白基因座向Ig缺损的敲除小鼠的功能性移植，并观察到这些小鼠中进行的与人体中极为相似的人抗体生产。
在一个实施方案中，本发明方法提供了在转基因牛、绵羊和猪中生产人多克隆抗体。可以生产出表达人免疫球蛋白的牛，但由于抗体嵌合性和内源抗体的污染，这些牛的实用性有限。从生产和纯化的观点来看，非常需要使牛基因失活的方法。通过本发明方法应用RNA干扰，可以只用相对较少的抑制性RNA，而不需要克隆出大段未经表征的基因组DNA，就可以灭活/抑制高度重复的牲畜Ig基因。表达人Ig基因而不表达牲畜Ig基因的克隆动物，其生产的人多克隆抗体容易纯化，不存在污染动物内源Ig的问题。从本发明非人转基因动物分离的抗体的纯化方法是本领域公知的(参见例如Sambrook J.等，“MolecularCloning：A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，New York(1989))。
在一个实施方案中，本发明提供从表达iRNA分子的动物获得的器官、组织和/或纯化或基本纯化的细胞或细胞系。
在一个实施方案中，本发明提供器官，可使用任何器官，包括但不限于：脑、心、肺、腺体、脑、眼、胃、脾、胰、肾、肝、肠、子宫、膀胱、皮肤、毛发、指(趾)甲、耳、鼻、嘴、唇、牙龈、牙齿、舌、唾液腺、扁桃体、咽、食管、大肠、小肠、直肠、肛门、幽门、甲状腺、胸腺、肾上腺(suprarenal capsula)、骨、软骨、腱、韧带、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、肾上腺(adrenal gland)、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、精囊、阴茎、淋巴、淋巴结和淋巴管。
在另一个实施方案中，本发明提供组织。可使用任何组织，包括但不限于：上皮、结缔组织、血组织、骨(bone)组织、软骨(cartilage)组织、肌组织、神经组织、腺样组织、脂肪(adipose)组织、疏松结缔组织、骨组织、棕色脂肪组织、海绵骨组织、肌、软骨(cartaginous)组织、勃起组织、软骨样组织、嗜铬组织、肉膜组织、弹性组织、上皮组织、脂肪(fatty)组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、胶质组织、肉芽组织、肠道淋巴组织、Haller血管组织、硬(hard)造血组织、未分化组织、间质组织、包埋(investing)组织、胰岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、黏液结缔组织、多泡脂肪组织、骨髓组织、鼻根点软组织、生肾组织、结组织、骨(osseous)组织、成骨组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶(rubber)组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织。
在又一个实施方案中，本发明提供来自表达iRNA分子的动物的细胞和细胞系。在一个实施方案中，这些细胞或细胞系可用于异种移植。可使用来自任何组织或器官的细胞，包括但不限于：上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核的细胞(mononuclear cell)、心肌细胞、其它肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、朗格罕氏岛细胞、胰岛素分泌细胞、胰α-2细胞、胰β细胞、胰α-1细胞、血细胞、血前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、原基干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星状细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、枯否氏细胞、平滑肌细胞、施旺细胞、上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛(pancreatic islet)细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、杆细胞、锥细胞、心细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、血浆细胞、肌细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、莱迪希细胞、管周细胞、塞托利细胞、黄体细胞、颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、滤泡细胞、黏液细胞、纤毛细胞、非角化上皮细胞、角化上皮细胞、肺细胞、杯形细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能(dopamiergic)细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、多巴胺能(dopaminergic)细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。在一个具体的实施方案中，提供来自功能性α-1，3-GT表达缺乏的猪的胰细胞，包括但不限于朗格罕氏岛细胞、胰岛素分泌细胞、胰α-2细胞、胰β细胞、胰α-1细胞。
非活(nonviable)衍生物包括通过酶法或化学法处理除去了活细胞的组织，这些组织衍生物在用于移植前可通过交联处理或其它化学处理进一步加工。在一个实施方案中，所述衍生物包括衍自各种组织的胞外基质，包括皮肤、泌尿组织、膀胱或器官粘膜下组织。另外，还提供除去了活组织的腱、关节和骨，包括心瓣膜和其它非活组织，作为医疗器械。
可通过多种方式将各种细胞按顺序给予宿主。给予方式有胃肠外、腹膜内、静脉内、皮内、硬膜外、脊髓内、胸骨内、关节内、滑液内、鞘内、动脉内、心内、肌内、鼻内、皮下、眶内、囊内、局部、透皮贴剂、通过直肠、阴道或尿道给予，包括通过栓剂、经皮、鼻腔喷雾剂、外科手术植入物、手术内部涂布(internal surgical paint)、输液泵或通过插管给予。在一个实施方案中，药物和载体在缓释制剂中给予，如直接组织注射或推注、植入物、微颗粒、微球体、纳米颗粒或纳米球体。
可通过灌注所公开的细胞进行治疗的疾病包括但不限于，由正常血细胞生产和成熟的不足或功能失常引起的疾病(即再生障碍性贫血和低增殖性干细胞疾病)；造血器官瘤性、恶性疾病(例如白血病和淋巴瘤)；非造血起源的广谱恶性实体瘤；自身免疫病和遗传失调。这种疾病包括但不限于由正常血细胞生产和成熟的不足或功能失常引起的疾病、过度增殖干细胞疾病，包括再生障碍性贫血、各类血细胞减少、粒细胞缺乏症、血小板减少、红细胞发育不全、布-戴二氏综合征，由药物、辐射或感染引起，为自发性；造血恶性肿瘤，包括急性淋巴母细胞性(淋巴细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性恶性骨髓硬化、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多、原因不明的骨髓组织变形(myelometaplasia)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤；患恶性实体瘤患者的免疫抑制，所述实体瘤包括恶性黑素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、视网膜胶质瘤、睾丸癌、成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、尤因氏肉瘤、淋巴瘤；自身免疫病，包括类风湿性关节炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮；遗传性(先天性)疾病，包括贫血、家族性发育不全、范可尼氏综合征、二氢叶酸还原酶缺乏、甲酰胺基转移酶缺乏、累-耐二氏综合征、先天性红细胞生产障碍综合征I-IV、Chwachmann-Diamond综合征、二氢叶酸还原酶缺乏、甲酰胺基转移酶缺乏、累-耐二氏综合征、先天性球形红细胞增多症、先天性椭圆形红细胞症、先天性裂红细胞症、先天性Rh缺失(null)病、阵发性夜间血红蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)变体1，2，3、丙酮酸激酶缺乏、先天性红细胞生成素敏感性缺乏、镰形细胞病和性状、α，β，γ地中海贫血、met-血红蛋白血症、先天性免疫紊乱、严重结合性免疫缺乏性疾病(SCID)、裸淋巴细胞综合征、离子载体反应性联合免疫缺陷、加帽异常的联合免疫缺陷、核苷磷酸酶缺乏、粒细胞肌动蛋白缺乏、婴儿粒细胞缺乏症、高歇尔氏病、腺苷脱氨酶缺乏、克斯特曼氏综合征、网状发育不全、先天性白细胞机能障碍综合征；以及其它疾病，如骨质疏松症、骨髓硬化、获得性溶血性贫血、获得性免疫缺陷、造成原发性或继发性免疫缺陷的传染性疾病、细菌感染(例如布鲁氏菌病、李斯忒氏菌病、结核、麻风)、寄生虫感染(例如利什曼病)、真菌感染、与因衰老造成的不相称淋巴样细胞组合(set)和免疫功能损害有关的疾病、吞噬细胞疾病、Kostmann粒细胞缺乏症、慢性肉芽肿病、切-希二氏病综合征、嗜中性粒细胞肌动蛋白缺乏、嗜中性粒细胞膜GP-80缺乏、代谢存储病、黏多糖沉积症、黏脂贮积病、与免疫机能有关的各类疾病、威-阿二氏综合征、α1-抗胰蛋白酶缺乏等。
有关疾病或病状包括神经变性病、肝变性病、肾变性病、脊髓损伤、头部创伤或外科手术、导致组织、器官或腺体变性的病毒感染。所述神经变性病包括但不限于艾滋病性痴呆综合征；脱髓鞘疾病，如多发性硬化和急性转移酶脊髓炎；锥体束外和小脑疾病，如大脑脊髓外(ecorticospinal)系统的损伤；基底神经节疾病或小脑疾病；运动机能亢进的运动疾病，如亨廷顿氏舞蹈病和老年性舞蹈病；药物引起的运动疾病，如由阻断CNS多巴胺受体的药物引起的运动疾病；运动机能减退的运动疾病，如帕金森氏病；进行性核上麻痹；小脑的结构损害；脊髓小脑变性，如脊髓性共济失调、弗里德里希氏共济失调、小脑皮层变性、多系统变性(Mencel，Thomas，Shi-Drager和Machado-Joseph)、systermioc疾病，如Rufsum病、血β-脂蛋白缺乏、共济失调、毛细血管扩张；线粒体多系统疾病；脱髓鞘核疾病，如多发性硬化、急性横贯性脊髓炎；运动单位的疾病，如神经性肌萎缩(前角细胞变性，如肌萎缩性侧索硬化、婴儿脊髓病性肌萎缩和幼年型脊髓病性肌萎缩)；阿尔茨海墨氏病；中年道氏综合征；弥漫性列维氏体病；列维氏体类型的老年性痴呆；帕金森氏病；维-科二氏综合征；慢性酒精中毒；科-雅二氏病；亚急性硬化性全脑炎；哈-斯二氏病；以及拳击员痴呆；参见例如Berkow等，(编辑)(1987)，The Merck Manual，第15版，Merckand Co.，Rahway，NJ。
本发明的非人转基因动物可用来筛选任何类型的化合物，例如抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、化疗药物、心血管药物和激素。可用本发明动物筛选的化合物可以是小分子或生物产品(例如蛋白质、肽、核酸)。可通过本领域公知的任何递药途径，例如但不限于静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、口服、舌下、皮下、吸入、鼻内、鞘内、眼内、直肠内或透皮给药，将待测化合物引入到本发明的动物中。
可通过测定动物细胞的一种或多种生物学或生理学反应，来确定一种或多种化合物的活性。例如，可将与一种或多种待筛选(即“处理”)化合物接触的细胞或动物和“对照”细胞或动物相比较，所述“对照”细胞或动物已与一种或多种无活性化合物(即安慰剂或其它对照治疗物)接触，或者在其它实施方案中，对照细胞没有与化合物接触。然后可测定细胞或动物对所述一种或多种化合物的反应，将对照样品与处理样品进行比较，以确定所述一种或多种化合物的治疗效力。
所述一种或多种化合物的活性可通过测量细胞中产生的靶mRNA或蛋白质的量来评估。分析“处理”和“对照”细胞样品允许定量比较，以确定所筛选的一种或多种化合物超过对照样品的治疗效力。或者，可测量与靶和非靶蛋白质、细胞、组织或器官结合的化合物量并加以比较，以确定对照和处理细胞或动物中的一种或多种化合物的药物动力学曲线。确定细胞中mRNA和蛋白质量的测定法是本领域公知的(参见例如Sambrook，J.等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York(1989))。测量与蛋白质、细胞、组织或器官结合的化合物量的方法也是本领域公知的(参见例如Gilman等，“Goodman and Gilman’s Theharmacological Basis of Therapeutics，”Macmillan Publishing Co.，Inc.，New York(1980)中的附录II和参考文献)。
可被测量以确定一种或多种化合物的治疗效力的细胞或动物生物反应的实例包括但不限于炎症、活性氧产生、细胞裂解、细胞死亡、免疫反应(即抗体产生)、蛋白质产生。
可被测量以确定一种或多种化合物的治疗效力的细胞或动物生理反应的实例包括但不限于温度变化、pH变化、氧浓度、葡萄糖浓度、血流、电生理特性。
生物和生理反应通过本领域公知的方法来测定，包括但不限于光谱分析、显微镜分析或用本领域公知的标记染料和探针进行的其它显色、仪器监测(即温度、pH、血压、血流、电学测量)。
术语“治疗有效的”表示化合物或组合物具有对患病细胞或动物产生积极影响和/或对病原体或寄生虫产生消极影响的活性。因此，治疗有效的化合物可在动物中造成或促进生物或生化活性，所述活性对病原体或寄生虫的生长和/或维持是有害的，或者可在具有异常生长或生化特性的动物的细胞、组织或器官(如癌细胞)中有害。或者，治疗有效的化合物可通过在细胞或动物中造成或促进对细胞或动物的生长和/或维持有益的生物或生化活性，来积极影响细胞或动物。治疗有效的化合物是否积极影响细胞或动物(或消极影响病原体或寄生虫)(或影响程度)可如下测定：使用本领域公知的检测各种生物或生化特性或功能的测定法，测定在处理细胞或动物中观察到的特定生物或生化特性或功能的水平，将该水平与在未处理对照细胞或动物中观察到的相同生物或生化特性或功能的水平进行比较。任何化合物或组合物，只要其在受处理细胞或动物中诱导受检生物或生化特性或功能的变化，其量与在对照细胞或动物中观测到的可定量区别，就可以说是“治疗有效的”。可定量区别的量是指超出与用以测定治疗效力的方法或测量相关的标准实验误差的任何量。例如，可表明受试化合物或组合物治疗有效的可定量区别的量，是处理细胞或动物中受测特性或功能相对于对照细胞或动物中受测特性或功能的水平，有约1％、约5％、约10％、约33％、约50％、约67％、约75％、约90％、约95％或约100％的差异。
在本发明一个这样的实施方案中，可从转基因动物中移取待与一种或多种待测化合物接触的转基因细胞，并在培养物中维持和检测。本发明的这个实施方案允许评估化合物治疗效力的高通量筛选方法，通过该法可在相同生物类型或动物物种的个别细胞上测试多种不同化合物。类似地，可在来自单个动物物种的许多不同细胞类型(例如肌细胞、骨细胞、皮肤细胞、神经细胞)上，或者在来自多个物种的细胞上，测试单一种化合物。在培养物中维持细胞的方法是本领域公知的(参见例如Sambrook，J.等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York(1989)和Freshney，R.I.，“Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，”Alan R.Liss，Inc，New York(1983))。
本发明的另一个实施方案是筛选一种或多种化合物对已植入到本发明非人转基因动物中的人肿瘤的治疗作用的方法，所述方法包括：
(a)将人肿瘤或人肿瘤细胞植入到转基因动物中；
(b)使人肿瘤与一种或多种待测化合物接触；
(c)测量肿瘤对所述一种或多种化合物的一种或多种生物或生理反应；
(d)确定一种或多种化合物对人肿瘤的治疗效力。
通过本发明任一方法生产的任何非人转基因动物都可用作肿瘤接受体，包括但不限于非人哺乳动物(包括但不限于猪、绵羊、山羊、牛、鹿、骡、马、猴和其它非人灵长类动物、狗、猫、大鼠、小鼠、兔等)、禽类(包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅等)、爬行动物、鱼、两栖动物等。
对于筛选目的可将任何人肿瘤或肿瘤细胞系植入到动物中。肿瘤包括但不限于乳腺癌肿瘤、子宫癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、前列腺癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、肺癌肿瘤、白血病肿瘤、淋巴肿瘤、结肠癌肿瘤、胃肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、肾癌肿瘤、骨癌肿瘤、神经癌肿瘤、头颈癌肿瘤、皮肤癌肿瘤、肉瘤、腺瘤和骨髓瘤。植入到动物中的肿瘤可以是实体瘤团块、单个肿瘤细胞或多个(即2、10、50、100、1000)肿瘤细胞的形式。肿瘤可植入到动物的任何组织或器官中，或者可递送到全身。本领域公知的任何将肿瘤和肿瘤细胞植入到动物中的方法均可用于本发明中。人肿瘤或肿瘤细胞可来自任何来源，包括但不限于确立肿瘤细胞系、切除的原发肿瘤组织和商业/政府/学术来源，包括组织库(tissue bank)等。
带植入人肿瘤的本发明非人转基因动物可用来筛选小分子或生物产品(例如蛋白质、肽、核酸)。可通过本领域公知的任何递药途径，例如但不限于静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、口服、舌下、皮下、吸入、鼻内、鞘内、眼内、直肠内或透皮给药，将待测化合物引入到本发明的动物中。
所述一种或多种化合物的活性可通过测量植入到动物中的人肿瘤的一种或多种生物或生理反应来确定。例如，化合物的活性可通过测量细胞中产生的靶mRNA或蛋白质的量来确定。或者可测量与靶和非靶蛋白质、细胞、组织或器官结合的化合物量并加以比较。确定细胞中mRNA或蛋白质的量的测试法是本领域公知的。
可被测量以确定一种或多种化合物的治疗效力的植入人肿瘤生物反应的实例包括但不限于炎症、活性氧产生、细胞裂解、免疫反应(即抗体产生)、蛋白质产生等。
可被测量以确定一种或多种化合物的治疗效力的植入人肿瘤生理反应的实例包括但不限于温度变化、pH变化、氧浓度、肿瘤生长、葡萄糖浓度、血液流动等。
在此上下文中，术语“治疗有效的”表示化合物具有对植入的人肿瘤产生消极影响的活性。因此，治疗有效的化合物可造成或促进动物中对肿瘤生长和/或维持有害的生物或生化活性。
本发明还提供用本发明任一种筛选方法鉴定的治疗有效的化合物。这些化合物可以是小分子或生物产品。在一个这样的实施方案中，化合物可包含一种或多种药物可接受载体或赋形剂。由本发明方法提供的化合物可产生任何水平的治疗效力，所述水平可与对照样品的相区别。
实施例
实施例1：靶向各基因家族
为特异性靶向基因家族、所需基因亚群或者基因或基因家族的具体等位基因，可获取代表性序列样品。可对这些序列进行比较，鉴定出相似性区域。这种比较可确定给定基因家族之间以及家族中的序列亚群中的相似性和同一性区域。此外，这种分析可确定各家族成员的等位基因之间的相似性和同一性区域。通过研究这些序列，鉴定出可用来靶向整个家族、家族成员的亚群、单个家族成员、单个家族成员的等位基因亚群或家族成员的单个等位基因的区域。
图8显示一种典型分析的结果。在此分析中，区域2可靶向给定的4基因家族的所有成员。同样，区域3的序列使基因1和2与基因3和4区分开来，而区域4可用来使基因1和4与基因2和3区分来开。区域5可用来使基因1的等位基因A和B与其它所有家族成员区分开来，而区域1或区域6可标识家族中任何基因的单个等位基因。
鉴定出潜在的靶区域后，构建包含但不必限于一种或多种潜在靶区域的“报告”构建物(载体)。所述报告构建物的表达可通过测定靶基因的产量或通过测定另一基因(如荧光报告基因)的产量(读出值)来测定。将报告基因构建物引入到细胞或细胞群体中。除报告基因构建物外，还装配编码潜在iRNA分子的iRNA构建物。所述iRNA构建物可例如通过组合包含用作转录启动子的序列的DNA片段与代表待测iRNA分子的序列(见图5)来装配。同样将试验构建物引入到上述培养细胞中。报告基因构建物的测量读出值表示iRNA分子的效力，因此如果转基因编码有效iRNA分子，则报告基因分子的读出值将改变。成功使报告基因下调的试验构建物提供单独或组合使用以产生转基因动物的iRNA序列。将iRNA分子引入到细胞中以产生转基因动物的方法包括使用内源或外源启动子的同源重组。所得动物其被靶向的基因家族、给定家族中的基因亚群、个别基因、个别基因的等位基因亚群或单个基因的个别等位基因的表达减少。
在图8所示的示例性分析中，基因或等位基因亚群可能不含有存在于每一亚群成员中的独特靶向区域。在这种情况下，使用多个构建物，使得每种iRNA分子标识所需靶基因亚群的至少一个成员，但并不标识被排除靶标的任何成员。因此，尽管该组iRNA转录物中没有一个分子能够靶向所需亚群的所有成员，但该组iRNA分子可标识靶标的独特亚群。
鉴定了影响靶标或靶标群的序列后，可研制出另外的构建物以完全减少靶标的表达。研制的构建物提供靶向具体基因、基因家族或家族中等位基因的一批iRNA分子或分子群。这些组的构建物通过组合多种试验构建物序列来研制，或者通过装配编码多个拷贝的iRNA或iRNA组靶向分子的新构建物来研制。
在图8所示的示例性分析中，对区域5中的垂直条纹所示序列、水平条纹所示序列和砖形所示序列有效的试验构建物的组合下调基因1和基因3的所有等位基因。另一方面，在这组构建物中，略去标识区域5中水平条纹所示序列的构建物，导致靶向基因1的等位基因A和B及基因3的所有等位基因。
实施例2-应用RNA干扰抑制猪内源反转录病毒
RNA干扰被用来可遗传地抑制猪中出现的不同但同源的反转录病毒的相关编码序列家族的表达。粗略地说，构建导致产生具有有义序列和反向反义序列的iRNA分子的转基因，所述序列与猪内源反转录病毒(PERV)基因组中在PERV各变体(其中至少有三种是已知的，即PERV-A、-B和-C)当中保守的区域同源。将转基因加入到猪基因组中，以产生可遗传地表达可自身杂交形成dsRNA的RNA分子的遗传系(genetic line)。所述RNA诱导表达转基因的各细胞中被表达的猪内源反转录病毒的干扰。不仅总PERV产生受到严重下调，而且被靶向变体之间的重组也不可能产生新的未被靶向变体。这种动物的细胞、组织或器官可用于异种移植，其中PERV传播的风险降低。
步骤1：
建立定量个别iRNA分子的有效性的测试法。此外，构建报告载体，以使iRNA筛选合理化，装配iRNA表达载体以有效插入个别的潜在iRNA编码序列。潜在靶标通过对靶PERV家族的序列分析来鉴定。
模型基因对照质粒：根据序列保守性，设计质粒并用来从细胞系PK-15(已知可释放传染性PERV的细胞系(Le Tissier等，1997))和胎儿成纤维细胞(包括α1，3-GT敲除成纤维细胞)中扩增gag、pol和env编码区。用各基因中最高度表达的编码区来建立模型报告基因构建物。各报告基因构建物通过将PERV编码区(gag、pol或env)插入到报告分子编码区及其聚腺苷酸信号之间来装配。这样，所得质粒产生在潜在iRNA靶标(在3’非编码区)上游具有报告基因(即β-gal、GFP)的mRNA。个别iRNA分子的有效性通过分析报告基因表达的抑制情况来测定。也可对这种方案进行修改，以分析非编码PERV序列而不是编码序列，或者除分析编码序列外还分析非编码序列。
iRNA表达质粒：将几种依赖于RNA聚合酶III(Pol III)的启动子扩增、克隆并检测其在转基因动物中的遍在表达情况。Pol III启动子无须加入末端序列(即聚腺苷酸尾)即可驱动iRNA的表达。Pol III启动子可包括来自H1RNA、snRNAU6、7SK、MRP RNA或7SL的启动子。可对Pol III启动子进行筛选，选出遍在表达的启动子。装配包含克隆区和依赖于聚尿苷酸的Pol III转录终止子的iRNA试验载体。也可在干扰RNA基因当中提供蛋白质编码区。
PERV检测：开发出针对PERV-A、-B和-C的特异性探针，以检测相应的原病毒PERV DNA序列。原病毒PERV DNA的PCR分析采用对gag、pol和env编码区以及对内部对照基因如β-球蛋白基因特异的引物。采用对猪线粒体DNA(mtDNA)或着丝粒序列有特异性的引物的实时PCR，在感染性试验中用来定量猪细胞感染(嵌合)情况。还开发出对PERV的gag区和pol区特异的PCR引物，以检测靶样品中的PERV RNA。
步骤2：
iRNA的理想靶标是在大多数PERV中保守的PERV mRNA区域。鉴定这种(区域的)序列，以用于初始构建物。在此鉴定过程中对所有已知PERV序列和其它PERV序列的分析，为合理设计iRNA载体提供了信息。所有iRNA载体在用于转基因动物生产之前，均先在细胞试验中检测其功能。
生物信息学：图9显示对所有可获得PERV env mRNA序列的分析。进行这个分析是为了确定保守序列和共有序列的区域。靶向6364bp和6384bp之间区域的有效iRNA将靶向本实施例所示的所有PERVenv基因。或者，靶向6386bp和6407bp之间两种序列的一对有效iRNA分子将靶向本实施例所示的所有PERV env基因。如要靶向包含6408bp-6431bp区域的序列，则需要三种有效iRNA分子，每种分子靶向三种所示序列中的一种。同样，靶向包含碱基6385的区域也需要三种有效iRNA分子。
由于所作序列分析限于获得的实验序列，有可能并不代表所有的PERV序列。有可能还存在未知或未被描述的变体。因此，对已鉴定iRNA再作试验，确定其对天然靶标而不是人工标记基因的有效性。将逃脱干扰的任何mRNA克隆并加入到分析中。重复整个过程，直到所有的mRNA均被抑制。
图10显示另一种选择干扰RNA的潜在靶标的方法。第一行(行1，下划线和粗体部分)显示PERV的半保守区的86碱基共有序列。随后各行(行2-69)显示此序列中抑制性RNA的68个潜在的19碱基靶标。靶标的长度在17至35个碱基之间，理想地在21至25个碱基之间。此过程可在17-35碱基靶标中重复进行，并可应用于任何完全或部分PERV基因组中所包含的任何蛋白编码或非编码区域。所有的PERV序列都是潜在靶标。在本实施例中，选择固定长度为19个核苷酸的序列作为潜在靶标。
除了图10所示的简单筛选外，还可将生物信息学用于减少非特异性靶序列。如图11所示，被靶向基因可与非被靶向基因共有同源性。在这种情况下，将与非被靶向基因共有显著同源性的潜在靶标排除出筛选过程中。筛选靶基因的RNA序列，找出其与非被靶向RNA的同源性。未知猪表达序列(Genbank检索号BI305054)中的19碱基区域与半保守PERV序列的区域(以黑粗体和下划线表示)显著同源。虽然与非被靶向RNA有显著同源性的潜在靶区域可证明是有用的，但却将这种靶区域排除出初始靶标筛选中，以减少严重下调非预期基因产物的风险。图11的行1表示PERV序列。行2-69表示通过生物信息学鉴定的被靶向PERV序列。行70表示未知表达的猪序列。行36-56表示序列分析结果，说明被排除的靶标。
图12说明被表达iRNA的建议三维构型。该iRNA为靶序列5′AATTGG AAA ACT AAC CAT C3(图10，行2)而设计。示例性的iRNA序列是5’(NY)AAU UGG AAA ACU AAC CAU C(NY)G AUG GUU AGUUUU CCA AUU(NY)3′(其中“N”指任何核苷酸，“Y”指大于或等于0的任何整数)。非指定序列(NY)的各部分可以是均聚体。这种不相同(nonidentical)序列也可由非相同碱基组成。此外，非指定序列(NY)的任何连续区段可提供另外的功能，例如但不限于编码蛋白质，为稳定性和半寿期提高提供信号，增加回文序列的长度，为剪接或折叠成特定结构提供信号和功能。
步骤3：
组织培养确认：根据步骤1和2鉴定的序列和质粒，设计、构建多个单独的iRNA表达质粒，并用步骤1描述的方案在组织培养中检测其功能。对每种iRNA质粒均检测其稳定表达情况和对含有适当靶序列的报告质粒的有效性。通过实验确定对天然PERV mRNA的干扰活性。此外，将PERV mRNA的减少与病毒颗粒产生的下降关联起来。
将每种选定iRNA构建物转染到已知会释放人传染性PERV的PK-15细胞中。检测每种选定iRNA构建物减少稳态mRNA、减少释放出的病毒颗粒数量和减少PERV对人细胞传染性的能力。此外，将第一轮检测后发现的任何PERV mRNA通过RT-PCR扩增并测序。分析这些序列，以确定让mRNA逃脱iRNA的个别多态性。用这个信息进一步修饰iRNA构建物，以再靶向更稀见的多态性。
鉴定了单独的iRNA构建物后，研制能有效消除PERV在选定细胞中表达的各组构建物。各组中所包含的具体序列用前面各步骤描述的方法来鉴定。
步骤4：
无PERV细胞的创建：使用表达补体抑制蛋白(complementinhibiting protein)的α-GT敲除猪品系，不过可用任何品系的猪获得无PERV遗传背景。将成纤维细胞用iRNA构建物进行工程改造，以便在生产动物之前可进行某种程度的功能测试。还筛选这些细胞的整合位点，以分析功能效果。使用成纤维细胞要比其他生产转基因动物的方法有利，采用其他方法时通常只能在动物生出后才可检测整合位点特异性转基因表达。
将初级α-1，3-GT敲除胎儿成纤维细胞工程改造，以表达经功能筛选的优化iRNA(在步骤1-3中设计)。选出各代表唯一整合事件的单个细胞集落。将这些集落繁殖，其中一部分保藏(冻藏)，供以后筛选基因表达和功能。所保藏的细胞也可用于提供体细胞核转移用细胞。
针对各细胞系的独特PERV，对功能进行确定。针对减少的稳态PERV mRNA，检测含整合到基因组中的iRNA的各成纤维细胞集落。将任何存活的PERV mRNA通过RT-PCR扩增并测序。分析这些被测序的序列，以确定让这些mRNA逃脱现有iRNA的个别多态性。用这个信息进一步修饰iRNA构建物，以再靶向更稀见的多态性。
步骤5：
体细胞核转移可以有效、相对便宜和相对快速地生产转基因猪。将在步骤4中创建和筛选的细胞(经工程改造以包含优化的功能性PERV抑制iRNA的α-1，3-GT敲除成纤维细胞)用作体细胞核转移中的细胞核供体。体细胞核转移技术包括除去猪卵母细胞的细胞核，然后将成纤维细胞的细胞核融合或插入到去核卵母细胞中。然后使细胞生长至胚细胞阶段，冻藏，植入大母猪中。
虽然可证明使用PK-15细胞和胎儿成纤维细胞的组织培养实验十分有用，但迄今为止尚不存在能完全模拟体内转基因功能的体外试验。此外，在iRNA功能和PERV mRNA表达两方面均可能存在某些组织特异性变化。对转基因猪的胎儿组织的分析使得可以对iRNA效用作更详尽的分析。
收集妊娠中期的胎儿。收获组织，分析iRNA表达和PERV mRNA抑制情况。选出提供有效PERV抑制的整合位点。体细胞核转移使得可以生产出与被筛选胎儿有相同整合事件的转基因猪。克隆操作使得正被繁殖、从保藏中回收的细胞，或者从妊娠中期胎儿收集的细胞可以用来生产转基因动物。经过筛选且其中已有效清除PERV的细胞在体细胞核转移中用作细胞核供体。将重构建胚胎转移到雌性接受体中，让其发育至分娩期。
PERV的完全清除在活的动物中确认。将不同成熟阶段的小猪处死，分析转基因表达和PERV mRNA抑制情况。此外，对多种组织进行检测，以确保PERV在治疗上有用的器官中被清除。
特异性PERV靶标
以下列出用以鉴定潜在siRNA靶标的PERV特异性gag、pol和env序列。各序列均是全长基因的子集。所述子集代表各基因中我们用以装配模型基因的部分。被排除在考虑之外的区域已用同聚体(ttttt...t或GGGG..G)代替。
gag
GGACAGACGGTGAAGACCCCCCTTAGTTTGACTCTCGAAAATTGGACTGAAGTTAGATCCAGGGCTCATAATTTGTCAGTTCAGGTTAAGAAGGGACCTTGGGAGATTTCCCGTGCCTCTGAATGGCAAACATTCGATGTTGGATGGCCATCAGAGGGGACTTTTAATTCTGAAATTATCCTGGCTGTTAAAGCAATCATTTTTCAGACTGGACCCGGCTCTCATCCTGATCAGGAGCCCTATATCCTTACGTGGCAAGATTTGGCAGAAGATCCTCCGCCATGGGTTAAACCATGGCTATGGGGGGGGGGGAGCCAGGCCCCCGAATCCTGGCTCTTGGAGAGAAAAACAAACACTCGGCCGAAAAAGGGGGGGGGGGTCCTCATATCTACCCCGAGATCGAGGAGCCGCCGACTTGGCCGGAACCCCAACCTGTTCCGGGGGGGGGGGTTCCAGCACAGGGTGCTGCGAGGGGACCCTCTGCCCCTCCTGGAGCTCCGGTGGTGGAGGGACCTGCTGCCGGGACTCGGAGCCGGAGAGGCGCCACCCCGGAGCGGACAGACGAGATCGCGATATTACCGCTGTGCACCTATGGCCCTCCCATGGCGGGGGGCCAATTGCAGCCCCTCCAGTATTGGCCCTTTTCTTCTGCAGATCTCTATAATTGGAAAACTAACCATCCCCCTTTCTCGGAGGATCCCAACGCCTCACGGGGTTGGTGGAGTCCCTTATGTTCTCTCACCAGCCTACTTGGGATGATTGTCAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAATTCTGTTAGAGGCTAGAAAAAATGTTCCTGGGGCCGACGGGCGACCCACGCAGTTGCAAAATGAGATTGACATGGGATTTCCCTTGACTCGCCCCGGTTGGGACTACAACACGGCTGAAGGTAGGGAGAGCTTGAAAATCTATCGCCAGGCTCTGGTGGCGGGTCTCCGGGGCGCCTCAAGACGGCCCACTAATTTGGCTAAGGTAAGAGAGGTGATGCAGGGACCGAACGAACCTCCCTCGGTATTTCTTGAGAGGCTCATGGAAGCCTTCAGGCGGTTCACCCCTTTTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCTCAGTGGCCCTGGCCTTCATTGGGCAGTCGGCTCTGGATATCAGAAAGAAACTTCAGAGACTGGAAGGGTTACAGGAGGCTGAGTTACGTGATCTAGTGAGAGAGGCAGAGAAGGTGTATTACAGAAGGGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAAAAAGGACACTGGGCAAGGAACTGCCCCAAGAAGGGAAACAAAGGACCGAATTTCCTATTTCTAGAAGAA(Seq ID No6)
pol
GGCAACGGCAGTATCCATGGACTACCCGAAGAACCGTTGACTTGGCAGTGGGACGGGTAACCCACTCGTTTCTGGTCATCCCTGAGTGCCCAGTACCCCTTCTAGGTAGAGACTTACTGACCAAGATGGGAGCTCAAATTTCTTTTGAACAAGGAAGACCAGAAGTGTCTGTGAATAACAAACCCATCACTGTGTTGACCCTCCAATTAGATGATGAATATCGACTATATTCTCCCCAAGTAAAGCCTGATCAAGATATACAGTCCTGGTTGGAGCAGTTTCCCCAAGCCTGGGCAGAAACCGCAGGGATGGGTTTGGCAAAGCAAGTTCCCCCACAGGTTATTCAACTGAAGGCCAGTGCTACACCAGTATCAGTCAGACAGTACCCCTTGAGTAGAGAGGCTCGAGAAGGAATTTGGCCGCATGTTCAAAGATTAATCCAACAGGGCATCCTAGTTCCTGTCCAATCCCCTTGGAATACTCCCCTGCTACCGGTTAGGttttttttttttttttttttttttttttttttttttttGAGAGAGGTCAATAAAAGGGTGcaggacatacacccaacggtcccgaacccttataacctcttgagcgccctcccgcctgaacggaactggtacacagtattggacttaaaagatgccttcttctgcctgagattacaccccactagccaaccgctttttgccttcgaatggagagatccaggtacgggaaGAACCGGGCAGCtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttACGAAGCCCTACACAGGGACCTGGCCAACTTCAGGATCCAACACCCCCAGTGACCCTCTCCAGTACTGGGATGACCTGCTTCTAGTGGAGCCACCAACAGGACTGCTAGAAGGTACGAAGGCACTACTACTGAATTGTCTGACCTAGGCTACGAGCCTCAGCTAAAAGGCCCAGATTGCAGAGAGAGGTAACATACTTGGGTACAGTCTGCGGGACGGGCAGTGATGGCTGACGGAGGCACGGAAGAGAACTGTAGTCCAGATACCtttttttttttttttttttCAAGTGAGAGAGTTTTGGGGGACAGCTGGATTTTGCAGACTGTGGATCCCGGGGTTTGCGACCTTAGCAGCCCCACTCTACCCGCTAACCAAAGAAAAAGGGGAGTTCTCCTGGGCTCCTGAGCACCAGAAGGCATTTGATGCTATCAAAAAGGCCCTGCTGAGCACACCTGCTCTGGCCCTCCCTGATGTAACTAAACCCTTTACTCTTTATGTGGATGAATGTAAGGGGGTAGCCCGGGGAGTTTTAACCCAATCCCTAGGACCATGGAGGAGACCTGTTGCCTACCTGTCAAAGAAGCTCGATCCTGTAGCCAGTGGTTGGCCCATATGCCTGAAGGCTATCGCAGCCGTGGCCATACTGGTCAAGGACGCTGACAAATTGACTTTGGGACAGAATATAACTGTAATAGCCCCCCATGCGTTGGAGAACATCGTCCGGCAGCCCCCAGACCGATGGATGACCAACGCCCGCATGACCCACTATCAAAGCCTGCTTCTCACAGAGAGGATCACGTTCACTCTACCAGCTGCTCTCAACCCTGCCACTCTTCTGCCTGAAGAGACTGATGAACCAGTGA(Seq ID No7)
env
CATCCCACGTTAAGCCGGCGCCACCTCCCGATTCGGGGTGGAAAGCCGAAAAGACTGAAAATCCCCTTAAGCTTCGCCTCCATCGCGTGGTTCCTTACTCTGTCAATAACCTCTCAGACTAATGGTATGCGCATAGGAGACAGCCTGAACTCCCATAAACCCTTATCTCTCACCTGGTTAATTACTGACTCCGGCACAGGTATAATATCAACAACACTCAAGGGGAGGCTCCTTTAGGAACCTGGTGGCCTGATCTATACGTTTGCCTCAGATCAGTTATTCCtttttttttttttttttttttttttttttttttttTCCATGCTCACGGATTTTATGTTTGCCCAGGACCACCAAATAATGGAAAACATTGCGGAAATCCCAGAGATTTCTTTTGTAAACAATGGAACTGTGTAACCTCTAATGATGGATATTGGAAATGGCCAACCTCTCAGCAGGATAGGGTAAGTTTTTCTTATGTCAAtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttTAGATTACCTAAAAATAAGTTTCACTGAGAAGGGAAACCAAGAAAATATCCTAAAATGGGTAAATGGTATGTCTTGGGGAATGGTATATTATGGAGGCTCGGGTAAACAACCAGGCTCCATTCTAACTATTCGtttttttttttttttttttttttttCCTCCAATGGCTATAGGACCAAATACGGTCTTGACGGGTCAAAGACCCCCAACCCAAGGACCAGGACCATCCTCTAACATAACCTCTtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttCTAGCAGCACGACTAAAATGGGGGCAAAACTTTTTAGCCTCATCCAGGGAGCTTTTCAAGCTCTTAACTCCACGACTCCAGAGGCTACCTCTTCTTGTTGGCTATGCTTAGCTTTGGGCCCACCTTACTATGAAGGAATGGCTAGAAGAGGGAAATTCAATGTGACAAAAGAACATAGAGACCAATGCACATGGGGATCCCAAAATAAGCTTACCCTTACTGAGGTTTCTGGAAAAGGCACCTGCATAGGAAAGGTTCCCCCATCCCACCAACACCTTTGttttttttttttttttttttttttttCCTCTGAGAGTCAATATCTGGTACCTGGTTATGACAGGTGGTGGGCATGTAATACTGGATTAACCCCTTGTGTTTCCACCTTGGTTTTTAACCAAACTAAAGATTTTTGCATTATGGTCCAAATTGTTCCCCGAGTGTATTACTATCCCGAAAAAGCAATCCTTGATGAATATGACTACAGAAATCATCGACAAAAGAGAGGACCCATATCTCTGACACTTGCTGTGATGCTCGGACTTGGAGTGGCAGCAGGTGTAGGAACAGGAACAGCTGCCCTGGTCACGGGACCACAGCAGCTAGAAACAGGACTTAGTAACCTACATCGAATTGTAACAGAAGATCTCCAAGCCCTAGAAAAATCTGTCAGTAACCTGGAGGAATCCCTAACCTCCTTATCTGAAGTAGTCCTACAGAATAGAAGAGGGTTAGATTTATTATTTCTAAAAGAAGGAGGATTATGTGTAGCCTTtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttGACTCCATGAACAAACTTAGAGAAAGGTTGGAGAAGCGTCGAAGGGAAAAGGAAACTACTCAAGGGTGGTTTGAGGGATGGTTCAACAGGTCTCCTTGGTTGGCTACCCTACTTTCTGCTTTAACAGGACCCTTAATAGTCCTCCTCCTGTTACTCACAGTTGGGCCATGTATTATTAACAAGTTAATTGCCTTCATTAGAGAACGAATAAGTGtttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttCTGGCCGCTAG(Seq ID No8)
以下列出衍自这些模型基因序列的特异性siRNA序列。
表1
Figure BDA00003576454401151
Figure BDA00003576454401161
Figure BDA00003576454401171
Figure BDA00003576454401181
Figure BDA00003576454401191
设计寡核苷酸，创建、退火并克隆到siRNA表达质粒中。筛选siRNA表达质粒对哺乳动物细胞中的适当模型基因(抗gag siRNA对gag模型，抗pol siRNA对pol模型等)的有效性。大多数siRNA表达质粒显示一定水平的有效性。最强效的抗gag表达质粒(g49)和最强效的抗pol表达质粒(p106)经确认对PK-15细胞转染中的PERV mRNA有效。这种作用是通过检测PERV产生的反转录酶活性和直接测量PERVmRNA来测定的。
iRNA表达质粒：
扩增gag、pol、envA、envB和envC的各部分并克隆到pCR-XLTOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。各插入片断独立作为XbaI/SpeI片断亚克隆到house载体pPL732.8中，位于报告基因编码区及其聚腺苷酸信号之间的XbaI位点处。这个策略的示意图见图13。
对每种iRNA，按照厂商建议将寡核苷酸(oligos)克隆到psiRNA-H1neo(InvivoGen，San Diego，CA)中。简单的说，将寡核苷酸退火并克隆到BbsI位点，取代LacZo肽进行蓝/白筛选。对于每种质粒，通过测序确认iRNA完整性。
为检测每种iRNA的强大功能，用GenePORTER(Gene TherapySystems，Inc.(GTS)，San Diego，CA)按照厂商建议将适当的模型基因和单一iRNA测试载体共转染到CHO或PK-15细胞中。作为对照，细胞也用报告基因和抗GFP iRNA载体共转染，或者用报告基因和非功能性阴性对照iRNA构建物共转染。每一被转染细胞的报告基因表达总水平被抑制(通过FACS测定)，或者表达报告基因的细胞比例下降(目测评价或通过FACS测定)，则认为这表明iRNA有功能。将明显对gag和pol最有效的iRNA独立转染到PK-15细胞中，不加模型报告基因。为确定病毒颗粒生产的抑制情况，用市售试剂盒(Cavidi Tech，Uppsala，Sweden)检测这些细胞的培养基中的反转录酶。另外，分离出每种iRNA的稳定细胞集落，通过定量RTPCR测量稳态mRNA的水平。另外还评估这些集落的RT活性和它们抑制瞬时转染的模型基因的能力。
另外的PERV靶向策略：Drosha底物的鉴定
以下序列(片断A)表示其中潜在非独特的序列已被等数目小写“t”代替的一部分PERV pol。
片断A：
GGCAACGGCAGTATCCATGGACTACCCGAAGAACCGTTGACTTGGCAGTGGGACGGGTAACCCACTCGTTTCTGGTCATCCCTGAGTGCCCAGTACCCCTTCTAGGTAGAGACTTACTGACCAAGATGGGAGCTCAAATTTCTTTTGAACAAGGAAGACCAGAAGTGTCT
Figure BDA00003576454401212
Figure BDA00003576454401213
AAGGCCAGTGCTACACCAGTATCAGTCAGACAGTACCCCTTGAGTAGAGAGGCTCGAGAAGGAATTTGGCCGCATGTTCAAAGATTAATCCAACAGGGCATCCTAGTTCCTGTCCAATCCCCTTGGAATACTCCCCTGCTACCGGTTAGGtttttttttttttttttttttttttttttttttttttt
Figure BDA00003576454401215
Figure BDA00003576454401216
Figure BDA00003576454401217
Figure BDA00003576454401218
Figure BDA00003576454401219
ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttACGAAGCC CTACACAGGGACCTGGCCAACTTCAGGATCCAACACCCCCAGTGACCCTC TCCAGTACTGGGATGACCTGCTTCTAGTGGAGCCACCAACAGGACTGCTA GAAGGTACGAAGGCACTACTACTGAATTGTCTGACCTAGGCTACGAGCCT CAGCTAAAAGGCCCAGATTGCAGAGAGAGGTAACATACTTGGGTACAGTC TGCGGGACGGGCAGTGATGGCTGACGGAGGCACGGAAGAGAACTGTAGTC CAGATACCtttttttttttttttttttCAAGTGAGAGAGTTTTGGGGGACAGCTGGATTTTGCAGACTGTGGATCCCGGGGTTTGCGACCTTAGCAGCCCCACTCTACCCGCTAACCAAAGAAAAAGGGGAGTTCTCCTGGGCTCCTGAGCACCAGAAGGCATTTGATGCTATCAAAAAGGCCCTGCTGAGCACACCTGCTCTGGCCCTCCCTGATGTAACTAAACCCTTTACTCTTTATGTGGATGAATGTAAGGGGGTAGCCCGGGGAGTTTTAACCCAATCCCTAGGACCATGGAGGAGACCTGTTGCCTACCTGTCAAAGAAGCTCGATCCTGTAGCCAGTGGTTGGCCCATATGCCTGAAGGCTATCGCAGCCGTGGCCATACTGGTCAAGGACGCTGACAAATTGACTTTGGGACAGAATATAACTGTAATAGCCCCCCATGCGTTGGAGAACATCGTCCGGCAGCCCCCAGACCGATGGATGACCAACGCCCGCATGACCCACTATCAAAGCCTGCTTCTCACAGAGAGGATCACGTTCACTCTACCAGCTGCTCTCAACCCTGCCACTCTTCTGCCTGAAGAGACTGATGAACCAGTGA(Seq ID No9)
以上下划线所示的pol部分已转换成以下所示的其互补片断(片断B)：
片断B：
GGTATCTGGACTACAGTTCTCTTCCGTGCCTCCGTCAGCCATCACTGCCCGTCCCGCAGACTGTACCCAAGTATGTTACCTCTCTCTGCAATCTGGGCCTTTTAGCTGAGGCTCGTAGCCTAGGTCAGACAATTCAGTAGTAGTGCCTTCGTACCTTCTAGCAGTCCTGTTGGTGGCTCCACTAGAAGCAGGTCATCCCAGTACTGGAGAGGGTCACTGGGGGTGTTGGATCCTGAAGTTGGCCAGGTCCCTGTGTAGGGCTTCGT(Seq ID No10)
用MFold(M.Zuker.Mfold web server for nucleic acid folding andhybridization prediction.Nucleic Acids Res.31(13)3406-15，(2003)，[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi])产生以下所示片断B“折叠”结构预测图。
Figure BDA00003576454401221
在以上结构中，碱基118-248形成明显的发夹结构。用碱基147-166(CTTCGTACCTTCTAGCAGTC(Seq ID No11))和碱基199-218(ACTGGAGAGGGTCACTGGGG(Seq ID No12))来设计带mir-30环和碱基的Drosha底物。该底物的MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401222
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGGCCUUCGUACCUUCUAGCAGUCGUGAAGCCACAGAUGGACUGGAGAGGGUCACUGGGGUGCUGAUC(Seq ID No13).
类似地，用碱基192-214(GTCATCCCAGTACTGGAGAGGGT(Seq ID No14))和碱基155-178(CTTCTAGCAGTCCTGTTGGTGG CT(Seq ID No15))来设计带mir-30环和碱基的Drosha底物。该底物的MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401231
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGCGUCAUCCCAGUACUGGAGAGGGUGUGAAGCCACAGAUGCCUUCUAGCAGUCCUGUUGGUGGCUUGCUGAUC(Seq ID No16).
同样，用碱基118-139(GCCTAGGTCAGACAATTCAGTA(Seq IDNo17))和碱基230-251(ATcCTGAAGTTGGCCAGGTCCC(Seq ID No18))来设计带mir-30环和碱基的Drosha底物。第二寡核苷酸第三个碱基处的小写“c”被改成“A”，以使折叠优化。该底物的MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401232
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGAGGGCCUAGGUCAGACAAUUCAGUAUGUGAAGCCACAGAUGAUACUGAAGUUGGCCAGGUCCCUGCUGAUC(Seq ID No19).
以下所示是片断C，其是上述片断A中斜体所示序列的互补序列。
片断C：
gctgcccggttcttcccgtacctggatctctccattcgaaggcaaaaagcggttggctagtggggtgtaatctcaggcagaagaaggcatcttttaagtccaatactgtgtaccagttccgttcaggcgggagggcgctcaagaggttataagggttcgggaccgttgggtgtatgtcctgcacccttttattgacctctctc(Seq ID No20)
以下所示是MFold预测的片断C折叠结构：
Figure BDA00003576454401241
在以上结构中，碱基142-200形成明显的发夹结构。用碱基141-163(AAGAGGTTATAATGGGTTCGGGAC(Seq ID No21))和碱基176-201(GTCCTGCACCCTTTTATTGACCTCTC(Seq ID No22))来设计带mir-30环和碱基的Drosha底物。该底物的MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401242
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGAAGAGGUUAUAAGGGUUCGGGACGUGAAGCCACAGAUGGUCCUGCACCCUUUUAUUGACCUCUCUGCUGAUC(Seq ID No23).
以下所示是片断D，其是上述片断A中粗体所示序列的互补序列。
片断D：
CAGTTGAATAACCTGTGGGGGAACTTGCTTTGCCAAACCCATCCCTGCGGTTTCTGCCCAGGCTTGGGGAAACTGCTCCAACCAGGACTGTATATCTTGATCAGGCTTTACTTGGGGAGAATATAGTCGATATTCATCATCTAATTGGAGGGTCAACACAGTGATGGGTTTGTTATTCAC(Seq ID No24)
以下所示是MFold预测的片断D折叠结构：
Figure BDA00003576454401251
在以上结构中，碱基35-171形成明显的发夹结构。用碱基36-61(AACCCATCCCTGCGGTTTCTGCCCAG(Seq ID No25))和碱基150-171(GGGTCAACACAGTGATGGGTTT(Seq ID No26))来设计带mir-29环和mir-30碱基的Drosha底物。选择mir-29环是因为碱基36-61片断与mir-30环之间的互补性。该底物的MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401252
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGCAACCCAUCCCUGCGGUUUCUGCCCAGUCAAUAUAAUUCUGGGUCAACACAGUGAUGGGUUUUGCUGAUC(Seq ID No27).
类似地，用碱基86-107(GACTGTATATCTTGATCAGGCT(Seq IDNo28))和碱基111-130(CTTGGGGAGAATATAGTCGA(Seq ID No29))来设计带mir-30环和碱基的Drosha底物。该底物的MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401261
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGCUGACUGUAUAUCUUGAUCAGGCUGUGAAGCCACAGAUGAGCUUGGGGAGAAUAUAGUCGAUGCUGAUC(Seq ID No30).
另外的PERV靶向策略：同时靶向两种mRNA
将两种mRNA的反义链部分组合，创建靶向两种mRNA的单一发夹。
以下序列是gag的互补序列(斜体)与pol的互补序列(下划线)的组合区域。
Figure BDA00003576454401262
Figure BDA00003576454401263
CCCTTCTGTAATACACCTTCTCTGCCTCTCTCACTagatcacgtaactcagcct cctgtAACCCTTCCAGTCTCTGAAGTTTCTTTCTGATATCCAGAG(Seq ID No31)
用MFold预测这个片断的潜在结构时，产生如下结果：
Figure BDA00003576454401264
为创建具有同时靶向gag和pol的潜力的单一发夹，用碱基100-123(agatcacgtaactcagcctcctgt(Seq ID No33))和碱基10-34(gcagctggtagagtgaacgtgatcc(Seq ID No34))来设计带mir-30碱基和环的Drosha底物，其MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401265
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGAGAUCACGUAACUCAGCCUCCUGUGUGAAGCCACAGAUGGCAGCUGGUAGAGUGAACGUGAUCCUGCUGAUC(Seq ID No32).
另外的PERV靶向策略：使用回文siRNA
为减少链选择对siRNA效力的作用，发夹的两条链可设计成相同的或功能上相同的。例如，用DNA Strider分析pol的互补序列(片断A)，以鉴定潜在的回文序列。在一个这样的分析中(参数：严紧性11，窗口23)，鉴定出以下序列：TGGGCCTTTTAGCTGAGGCTCG(Seq IDNo36)。用这个序列设计带mir-30碱基和环的Drosha底物，其MFold预测结构如下：
Figure BDA00003576454401271
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGCAUGGGCCUUUUAGCUGAGGCUCGUAGUGAAGCCACAGAUGUAUGGGCCUUUUAGCUGAGGCUCGUAUGCUGAUC(Seq ID No37).
类似地，鉴定出另一个部分回文序列CTTCTGGTGCTCAGGAGCCCAGGAG(Seq ID No38)，用来设计带mir-30碱基和环的Drosha底物，其MFold预测结构如下：
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGAUUCUGGUGCUCAGGAGCCCAGGAGGUGAAGCCACAGAUGCUUCUGGUGCUCAGGAGCCCAGGAGUGCUGAUC(Seq ID No39).
同样，鉴定出另一个部分回文序列CATCGGTCTGGGGGCTGCCGGACGATG(Seq ID No40)，用来设计带mir-30碱基和环的Drosha底物，其MFold预测结构如下：
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGAAUCGGUCUGGGGGCUGCCGGACGAUGGUGAAGCCACAGAUGCAUCGGUCUGGGGGCUGCCGGACGAUGUGCUGAUC(Seq ID No41).
另外的PERV靶向策略：发夹形成的优化
使用以上策略会造成有缺陷的发夹。但是，由于非沃森-克里克碱基配对在RNA分子中是可能出现的，可对Drosha底物进行修饰，又不在RNAi靶向上出现明显改变。以下是设计来靶向PERV env mRNA的一部分的Drosha底物。在发夹的茎部分存在几个“泡”。
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGAGAAACCACCCUUGAGUAGUUUCCGUGAAGCCACAGAUGGGAAACCACCCUUGAGUAGUUUCCUGCUGAUC(Seq ID No42).
位置15处的“C”变成“U”。“U”仍可代替“C”与靶标中的“G”发生碱基配对。但是，“U”也可与发夹中位置65处的“A”发生碱基配对。类似地，位置18处的“C”也变成“U”，以与位置62处的“A”发生碱基配对。所得预测结构的茎得到改善，如下所示。
Figure BDA00003576454401283
以上序列的核苷酸序列是：
GAUCUGCGAGAAACUACUCUUGAGUAGUUUCCGUGAAGCCACAGAUGGGAAACUACUCUUGAGUAGUUUCCUGCUGAUC(Seq ID No43).
另参见Zeng Y，Cullen BR.Structural requirements forpre-microRNA binding and nuclear export by Exportin5.Nucleic AcidsRes.2004年9月8日；32(16)：4776-85；Zeng Y，Cullen BR.Sequencerequirements for micro RNA processing and function in human cells.RNA.2003年1月；9(1)：112-23；Zeng Y，Wagner EJ，Cullen BR.Both naturaland designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAswhen expressed in human cells.Mol Cell.2002年6月；9(6)：1327-33；Boden D，Pusch O，Silbermann R，Lee F，Tucker L，Ramratnarn B.Enhanced gene silencing of HIV-1specific siRNA using microRNAdesigned hairpins.Nucleic Acids Res.2004年2月13日；32(3)：1154-8)；Lee Y，Ahn C，Han J，Choi H，Kim J，Yim J，Lee J，Provost P，Radmark O，Kim S，Kim VN.The nuclear RNase III Drosha initiates microRNAprocessing.Nature.2003年9月25日；425(6956)：415-9；M.Zuker.Mfoldweb server for nucleic acid folding and hybridization prediction.NucleicAcids Res.31(13)，3406-15，(2003)[http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi]。
实施例3：发夹寡核苷酸的依次克隆
为装配寡核苷酸用于成簇干扰RNA，必须考虑到衔接序列，以防止形成非预期结构。如果同一限制位点被连续使用，发夹碱基处的同源性会造成非预期的碱基配对。例如，如果载体设计成带两个非相容的限制性位点，序列可有方向性地克隆到这两个位点中。在这个方法中，上游位点可被破坏并再供给下游区域的新载体，以为下一发夹作准备。
载体用BclI和MluI切割后的末端：
Figure BDA00003576454401301
杂交的寡核苷酸
5′GATCtgcgcTTAGATCCAGGGCTCATAATgtgaagccacagatgATTATGAGCCCTGGATCTAATtgcTGATCActagtA3′(Seq ID No44)
3′acgcgAATCTAGGTCCCGAGTATTAcacttcggtgtctacTAATACTCGGGACCTAGATTAacgACTAGTgatcaTGCGC5′(Seq ID No45)
所得克隆：
Figure BDA00003576454401302
NTGATCtgcgcTTAGATCCAGGGCTCATAATgtgaagccacagatgATTATGAGCCCTGGATCTAATtgcTGATCActaatACGCGTNNACTAGacgcgAATCTAGGTCCCGAGTATTAcacttcggtgtctacTAATACTCGGGACCTAGATTAacgACTAGTgatcaTGCGCAN(Seq ID No46)
在这个策略中，被供给寡核苷酸的BclI位点可用于下一克隆步骤，新的寡核苷酸可继续被加到各连续载体中，条件是被引入的茎序列没有供给BclI或MluI另外的位点。
以下是使用上述策略将三个寡核苷酸系列克隆到载体系列得到的序列(载体，oligo1，oligo2，oligo3)：
NTGATCtgcgcTTAGATCCAGGGCTCATAATgtgaagccacagatgATTATGAGCCCTGGATCTAATtgcTGATCtgcgcGGTAGAGACTTACTGACCAAgtgaagccacagatgTT GGTCAGTAAGTCTCTACCTtgcTGATCtgcgcAGAACATAGAGACCAATGCAgtgaag ccacagatgTGCATTGGTCTCTATGTTCTTtgcTGATCActagtACGCGTN(Seq ID No47)
此序列的预测结构如下。预测出三个发夹的每一个均具有相同的一般结构。
使用这个策略，可再增添任何数量的另外的Drosha底物，它们各自的预测结构均没有改变。
实施例4：合成内含子装配
粗略根据见于鼠嗜酸性粒细胞相关性核糖核酸酶A家族基因(EarX)的内含子和市售载体pCpG(InvivoGen，San Diego，CA)，设计内含子。这个内含子的设计包括创建允许将内含子放置在外显子中的任何SbfI位点的限制位点。含有这个内含子的初级转录物剪接时，所得mRNA与其非工程改造的内源对等物相比不发生改变。此外，在内含子中包含一小系列克隆位点，以便随后iRNA分子/Drosha底物的克隆。将这个序列克隆到天然见于dsRED(来自corallimorpharian的红色荧光蛋白)表达载体的编码区中的SbfI位点中。转染到哺乳动物细胞中时，所得内含子被适当剪接，产生功能性dsRED蛋白。由于SbfI位点的中部六个核苷酸包含PstI位点，这个内含子也可被直接克隆到PstI位点中。
内含子序列：
(PstI位点以粗体表示，多重克隆位点以斜体表示，功能内含子以下划线表示)
Figure BDA00003576454401321
TAAGTCACTGCTGTCTATGCCTGGGAAAGGGGGGCAGGAGATGGGG CAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCG ATTGTACT AACCTTCTTCTCTTTCCTCT
Figure BDA00003576454401323
(Seq ID No48)
实施例5-用iRNA减少污染性蛋白质的表达
在本实施例中，内源蛋白质的表达被减少，以防止或减少转基因产物被污染。转基因动物正开始被用作治疗性蛋白质来源。这些蛋白质是从转基因表达的。转基因表达可靶向具体组织或细胞类型，以使这种蛋白质的收获区室化。例如，可通过由乳腺特异性启动子驱动蛋白质的表达，使所述蛋白质集中在转基因动物的乳汁中。此外，可在具体细胞类型中选择性表达转基因，以便特异性加工。例如，可用人免疫球蛋白基因座指导人多克隆抗体在牲畜B细胞中的重组、表达和加工。在任一情况下，内源蛋白质可能会污染为纯化而收集的物质。这种蛋白质在进化上与所需的产物可能不相关，但它们会与所需产物一起纯化出来。或者，污染性蛋白质可能是转基因产物的内源对等物。
为指导应用干扰RNA减少转基因牲畜中污染性蛋白质的产生，给出使用免疫球蛋白基因的以下实施例：
步骤1：
使用实施例1描述的技术，但实施例1描述的gag、pol和env基因用猪免疫球蛋白(Ig)可变结构域的基因(可变区基因或恒定区基因)代替。此外，Ig重链、Igκ轻链和Igλ轻链也作为潜在靶标包括在本策略中。
步骤2：
使用实施例1描述的技术，但PERV靶标的分析用Ig靶标的分析代替，以确定iRNA构建物对特定靶标的特异性。除了检测猪Ig靶标，不考虑与动物中所表达的人Ig转基因共有同源性的潜在靶标。
步骤3：
将各选定iRNA构建物引入到猪B细胞细胞系中，Ig基因产物的下调通过实施例1描述的方法来检测。具体的说，mRNA通过RT-PCR来测定，表面Ig通过标记抗体来测量。
步骤4和5：
将胎儿成纤维细胞与前面几个步骤中鉴定的iRNA构建物接触。但是，由于胎儿成纤维细胞并不表达Ig基因产物，它们在本测定中的筛选效用是有限的。在这个情况下，使用晚妊娠胎儿，通过RT-PCR和免疫测定来确认iRNA有效性。在一组平行实验中，将胎儿成纤维细胞工程改造，以表达对应于所鉴定靶标的猪Ig转基因，并检测iRNA构建物的效力。同时检测非预期的人Ig靶向。只有不靶向人Ig转基因的iRNA构建物才用来生产胎儿。
从晚妊娠胎儿的胸腺、脾和血液收获总mRNA。用这种RNA，通过使用对各Ig基因座特异的引物的RT-PCR，筛选内源Ig的下调情况。每个测定中包括另外的对照序列，以确保没有引入误差。
使用含人Ig转基因的细胞，通过核转移重构胚胎。这些细胞可衍自被筛选胎儿、冷冻保藏的细胞集落或用以产生这些被筛选胎儿的细胞。使用重构的胚胎生产具有所需性状的转基因后代。
内源猪Ig基因产物的下调和转基因产物(即人Ig)的表达得到确认。将动物饲养至各个成熟阶段，分析iRNA转基因表达、Ig转基因表达和内源Ig基因表达情况。还在引起各种不同免疫状态的条件下重复这个程序。
实施例6-用干扰RNA生产病毒抗性动物
应用RNA干扰技术来生产对病毒具有抗性和/或释放或传播病毒的能力下降的动物。构建转基因，所述转基因导致靶向马立克病病毒的一种或多种必需区域的干扰RNA的表达。然后将转基因构建物加入到鸡的基因组中，以产生可遗传地表达iRNA的遗传系。在本实施例中，所述遗传系可遗传地表达两种RNA，它们发生杂交，产生靶向马立克病病毒的必需区域的dsRNA分子。在非疾病状态下，dsRNA是功能惰性的，但当细胞感染马立克病病毒时，dsRNA将干扰病毒基因，从而破坏病毒的生活周期。这种鸡因此能抵抗马立克病。
为指导应用干扰RNA生产对病毒抗性提高的动物，给出以下方法：
方法：
使用实施例1描述的技术，但PERV用马立克病病毒代替。另外，用释放马立克病病毒的细胞代替PK-15细胞。此外，也可执行与所述方法稍有不同、但本领域公知的生产转基因家禽的方法。用胚胎鸡确认有效性。iRNA的适当整合位点通过在转基因动物繁殖后筛选iRNA表达来鉴定。为此目的，可获得转基因后代进一步繁殖适当的品系。
实施例7-用干扰RNA减少对异种移植器官的排斥
使用上述技术，构建转基因，以表达靶向VCAM以抑制异种移植器官中炎症的dsRNA。为指导应用干扰RNA生产器官存活力提高的异种移植猪，给出以下方法：
方法：
实施例1描述的方法用作筛选iRNA靶标的模型。在本实施例中，靶标是猪VCAM。用表达VCAM的猪细胞系代替PK-15细胞。采用如实施例1步骤2和图11所公开的类似策略，除去对VCAM家族成员具有活性的iRNA靶标。
实施例8-用干扰RNA减少内源基因的表达
用RNA干扰来以组织特异性方式抑制内源基因的表达。装配转基因，以表达靶向肌抑制素(myostatin(GDF-8))的dsRNA。在本实施例中，预定靶标的抑制是不完全的。肌抑制素的突变造成牲畜和小鼠肌肉量增加，表明经济上有利的表型可能会伴随肌抑制素功能丧失。但是，完全消除肌抑制素会产生对肉生产来说经济上不可行的表型(Yang J等(2001)Mol.Reprod.Dev.60(3)：351-61)。用干扰RNA技术来生产肌抑制素表达受抑制的动物。造成不完全抑制的iRNA分子的组织特异性表达由pol III启动子以组织特异性方式来提供。
方法：
实施例1描述的方法用作筛选iRNA靶标的范例。在本实施例中，靶标是猪GDF-8而不是PERV。用表达GDF-8的猪细胞系代替PK-15细胞。首先通过虚拟序列比对进行鉴定，然后通过体外筛选鉴定iRNA分子，如果它们在所鉴定参数范围内并不有效，则予以排除。因此，与前面的实施例不同，可将完全消除肌抑制素的iRNA分子排除在考虑之外。
实施例9-用干扰RNA提供对病毒的抗性
应用RNA干扰技术生产对病毒具有抗性的猪，该病毒危害进行异种移植的患者。在异种移植过程中，存在这样的风险，即供体器官不但是猪病毒的贮藏所，而且是人病毒的贮藏所。例如，一种对进行异种移植的患者构成危险的病毒是流感病毒。因此，构建导致干扰RNA表达的转基因，所述干扰RNA靶向对接受异种移植器官的患者构成危险的病毒的一个或多个必需区域。实施例1描述的方法用作筛选iRNA靶标的范例。在本实施例中，流感病毒及其同源病毒代替PERV作为靶标。用释放流感病毒的细胞代替PK-15细胞用于筛选。针对iRNA构建物完全抑制流感病毒mRNA以及病毒颗粒生产的能力，对iRNA构建物进行筛选。当鉴定出有用的iRNA序列时，将其连接于载体中，以提供能完全消除病毒基因产物表达的转基因构建物。再作几轮筛选，以确保鉴定出最有效的组合。筛选结束后，将构建物引入到待用于核转移程序的成纤维细胞中，从而提供对流感病毒具有抗性的转基因细胞系。
实施例10-用干扰RNA提供遗传选择
选择性标记在哺乳动物细胞中是有限的，原因在于大多数标记基因提供抗生素抗性，只有有限数量的标记已被表征。因此，提供选择性表型的siRNA转基因可充当选择性标记基因。实施例1描述的方法用作筛选iRNA靶标的范例。在该情况中，使用提供选择性表型的细胞，其中具体基因被下调。针对iRNA构建物产生选择性表型的能力，对iRNA构建物进行筛选。当鉴定出有用的iRNA序列时，将其与其他基因或其他DNA片断连接，以提供选择性表型。另外，可用这种策略来建立使同源重组事件的选择成为可能的基因组合。举例说，可使非iRNA选择性标记基因包含在两个靶向臂之间。在这些臂的外部放置抗选择性标记的iRNA转基因。用选择性标记基因作为靶基因，如同以上实施例那样鉴定iRNA转基因。随机整合时，iRNA转基因阻碍了选择性标记的功能，没有选择出整合事件。同源重组时，不存在iRNA转基因，选择性标记基因发挥作用。同样和或者，iRNA转基因另外还可靶向细胞存活所必需的基因。
本文描述的本发明可在不存在本文中没有明确公开的任何要素或限制条件下实施。已采用的术语和表达用作描述性用语而不是限制性用语，且并非意图使用这种术语和表达来排除所显示和描述的特征或其部分的任何等价物，不过应认识到，在要求保护的本发明范围内可能有各种修改方案。因此，应当理解，尽管本发明已在本文中明确地公开，本领域技术人员可采用本文公开概念的任选特征、修改或变化，并且这种修改或变化被认为落入后附权利要求书所定义的本发明范围内。此外，在本发明特征或方面以马库什组方式描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员子集的方式来描述。

Claims (10)

1.一种生产双链iRNA分子以调节靶mRNA表达的方法，所述方法包括：
(i) 鉴定至少一种与靶mRNA互补的核苷酸序列；
(ii) 分析互补序列，以鉴定所述序列可互相杂交的部分；
(iii) 制备包含步骤(ii)中鉴定出的两种互补序列的iRNA分子；
其中所述生产可在细胞中进行。
2.权利要求1的方法，其中所述iRNA分子由DNA构建物编码。
3.权利要求1的方法，其中所述iRNA分子进一步包含隔开所述互相杂交的两种互补核苷酸序列的第三核苷酸序列。
4.权利要求1的方法，其中所述互补序列长度大约为19至32个核苷酸。
5.一种iRNA单分子，所述iRNA分子调节一个基因的至少两个区域的表达，其中所述基因的表达被功能性消除。
6.一种消除靶mRNA的表达的方法，所述方法包括给予两种靶向靶mRNA的同一区域的iRNA分子。
7.一种iRNA单分子，所述iRNA分子通过靶向基因家族所有成员共有的同源区域来调节基因家族的表达。
8.一种iRNA分子，所述iRNA分子抑制猪内源反转录病毒的表达。
9.权利要求8的iRNA，所述iRNA结合多种类型的猪内源反转录病毒(PERV)。
10.一种制备包含权利要求1或8中所述的siRNA单分子的转基因动物的方法。
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