CN115011601B - 一种干扰JUND表达的shRNA、重组腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

一种干扰JUND表达的shRNA、重组腺相关病毒载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种干扰JUND表达的shRNA、重组腺相关病毒载体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将靶向干扰JUND表达的shRNA序列导入腺相关病毒载体中，最终获得重组腺相关病毒，并成功将其应用于胰岛β细胞中JUND的研究，其中，shRNA至少包括shRNA1、shRNA2和shRNA3，所述shRNA1‑3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示。经试验验证，包含上述shRNA的重组腺相关病毒其能明显改善受试者糖耐量，因此本发明具有良好的实际应用之价值。

Description

一种干扰JUND表达的shRNA、重组腺相关病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种干扰JUND表达的shRNA、重组腺相关病毒载体及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
JunD是一种属于多功能激活剂蛋白-1(activating protein-1，AP-1)家族的转录因子，可以激活或抑制多种靶基因的表达。在生长发育过程中，在各种细胞类型中都呈现出组成性表达。近20年的临床数据及分子生物学研究表明，JunD蛋白的功能受多个复杂过程调控，包括转录控制、转录后调节、蛋白质翻译后修饰及蛋白-蛋白相互作用等。JunD基因表达的精细调控及JunD蛋白与其它蛋白之间的相互作用可调节细胞增殖、分化和凋亡等过程。JunD蛋白活性异常会导致肿瘤、代谢及病毒类疾病的发生。JunD蛋白的转录激活及抑制受复杂调控网络调控，在这个网络调节下，JunD蛋白在细胞的生长调控过程中发挥重要作用。
现有研究指出，在II型糖尿病(T2D)中，氧化应激导致胰腺β细胞功能障碍和丧失。而JUND是胰岛β细胞中的应激反应因子，导致氧化还原失衡，并导致氧化还原失衡和生理病理相关应激期间的细胞凋亡。因此通过干扰JUND的表达可以深入探究JUND在胰岛β细胞中发挥的功能，为研究以JUND作为糖尿病治疗靶点提供技术支持。而目前尚缺乏便捷、有效的干扰胰岛β细胞中JUND的表达技术。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供一种干扰JUND表达的shRNA、重组腺相关病毒载体和应用。本发明通过将靶向干扰JUND表达的shRNA序列导入腺相关病毒载体中，最终获得重组腺相关病毒，并成功将其应用于胰岛β细胞中JUND的研究，具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种干扰JUND表达的shRNA，所述shRNA至少包括shRNA1、shRNA2和shRNA3。
其中，所述shRNA1的核苷酸序列为：
GAGAAAGTCAAGACCCTCAAATTCAAGAGATTTGAGGGTCTTGACTTTCTCTTTTT(SEQ IDNO.1)；
所述shRNA2的核苷酸序列为：
GCCGGATCTTGGGCTGCTCAATTCAAGAGATTGAGCAGCCCAAGATCCGGCTTTTTT(SEQ IDNO.2)；
所述shRNA3的核苷酸序列为：
GTTCGCCGAAGGCTTCGTCAATTCAAGAGATTGACGAAGCCTTCGGCGAACTTTTTT(SEQ IDNO.3)。
本发明的第二个方面，提供一种靶向干扰JUND表达的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体其包含上述shRNA。
本发明的第三个方面，提供上述重组腺相关病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
本发明的第四个方面，提供一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒通过将上述重组腺相关病毒载体侵染真核细胞后获得。所述重组腺相关病毒包含所述靶向干扰JUND表达的shRNA。
本发明的第五个方面，提供上述重组腺相关病毒的包装方法，包括：
将上述重组腺相关病毒载体转染真核细胞，收集病毒即得。
本发明的第六个方面，提供上述shRNA、所述重组腺相关病毒载体或所述重组腺相关病毒在制备改善受试者糖耐量产品中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过将靶向干扰JUND表达的shRNA序列导入腺相关病毒载体中，最终获得重组腺相关病毒，并成功将其应用于胰岛β细胞中JUND的研究，其能够有效改善受试者糖耐量，因此具有良好的实际应用之价值。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中的载体图谱；
图2为本发明实施例中Jund PCR扩增曲线；
图3为本发明实施例中Jund扩增产物熔解曲线；
图4为本发明实施例中Actin扩增产物熔解曲线；
图5为本发明实施例中敲除JUND后对小鼠普通饮食下的糖耐量的影响；
图6为本发明实施例中敲除JUND后对高脂饮食诱导14周的肥胖C57小鼠的糖耐量的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒，其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。AAV载体不需要腺病毒辅助，不插入宿主的基因组，而是游离于宿主细胞基因之外，呈卫星状稳定表达。并且腺相关病毒载体(AAV)体内的感染效率极高。本发明中，使用的是AAV8。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种干扰JUND表达的shRNA，所述shRNA至少包括shRNA1、shRNA2和shRNA3。
其中，所述shRNA1的核苷酸序列为：
GAGAAAGTCAAGACCCTCAAATTCAAGAGATTTGAGGGTCTTGACTTTCTCTTTTT(SEQ IDNO.1)；
所述shRNA2的核苷酸序列为：
GCCGGATCTTGGGCTGCTCAATTCAAGAGATTGAGCAGCCCAAGATCCGGCTTTTTT(SEQ IDNO.2)；
所述shRNA3的核苷酸序列为：
GTTCGCCGAAGGCTTCGTCAATTCAAGAGATTGACGAAGCCTTCGGCGAACTTTTTT(SEQ IDNO.3)。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种靶向干扰JUND表达的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体其包含上述shRNA；
本发明的又一具体实施方式中，所述shRNA中shRNA1、shRNA2和shRNA3分别插入腺相关病毒载体的多克隆位点处。
具体的，所述重组腺相关病毒载体其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其为包含shRNA1的重组腺相关病毒载体。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒通过将上述重组腺相关病毒载体侵染真核细胞后获得。所述重组腺相关病毒包含所述靶向干扰JUND表达的shRNA。
其中，所述真核细胞可以为人胚肾细胞，具体为HEK 293T细胞。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述重组腺相关病毒的包装方法，包括：
将上述重组腺相关病毒载体转染真核细胞，收集病毒即得。
其中，所述真核细胞可以为人胚肾细胞，具体为HEK 293T细胞。
本发明的又一具体实施方式中，提供所述shRNA、所述重组腺相关病毒载体或所述重组腺相关病毒在制备改善受试者糖耐量产品中的应用。
其中，所述产品可以为药物。
所述药物还可以包含其他非药物活性成分，所述非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。例如药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质、药理上无害的盐例如氯化钠、调味剂、维生素例如维生素A或维生素E、生育酚或维生素原、抗氧化剂，例如抗坏血酸，以及用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂，和其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂，以及它们的混合物。
所述药物可以单位剂量形式给药。该处常规剂型比如液体剂型、固体剂型、外用制剂、喷剂等等，比如下列剂型：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。
下面结合实施例对本发明进一步说明。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性前提下，任何对本发明的变化都归属本发明的保护范围。同时，在本发明实施例中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
实施例
一种携带shJund质粒病毒的制备方法，包括：
将重组腺相关病毒载体侵染HEK 293T细胞后获得，具体包括：
1.准备HEK 293T细胞：提前一天分HEK 293T细胞，包装时细胞密度85％-90％且细胞分布均匀，状态良好。
2.包装病毒
(1)转染前一到两个小时给细胞换液，换为无血清的DMEM培养基(1％HEPES和1％P/S)。
(2)制备包含重组腺相关病毒载体的转染转染试剂，室温静置30min。
(3)将上述静置后的液体加到HEK293T细胞中，摇晃混匀。
(4)将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h后收集病毒。
3.收毒，观察细胞状态并拍照：
(1)将细胞吹起，与培养基一并收到50ml离心管中。离心分离细胞沉淀及上清。
(2)将培养基上清转移到新管中，PGE8000沉淀2h，3500g、4℃离心30min，去掉上清，用PBS+0.001％PF68重悬。
(3)将细胞沉淀用PBS+0.001％PF68重悬，冻融一次后加入5M NaCl，涡旋混匀。
(4)将(2)的重悬液与(3)的重悬液混合，振荡混匀后超声至不粘稠。
(5)将超声后的液体3500g离心30min，收集上清。
4.纯化：碘克沙醇密度梯度离心。
(1)配置不同浓度的碘克沙醇。
(2)取一个超离管，逐层加入不同浓度的碘克沙醇。
(3)将处理好的病毒液加入到最上层。
(4)超速离心纯化病毒。
其中，所述重组腺相关病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
1、载体酶切
将pAV-insulin-GFP-mirRNA155载体(维真生物提供)进行酶切，酶切体系如下：
加样混匀后置于37℃酶切2h，然后载体去磷酸化，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切，并用胶回收试剂盒回收载体。
2、退火
收到引物后先瞬时离心，将引物干粉中加入(nmol数*10)μL H2O，稀释成100μM的母液。
退火反应体系如下：
其中，
Primer_F:AGGCTGTATGCTGAGAGAAAGTCAA(SEQ ID NO.5)；
Primer_R:GCCTTGTGTCCTGCGGAGAAAGTCA(SEQ ID NO.6)
反应程序RAMP
步骤 温度/℃ 时间
1 37 30min
2 98 3min
3 98ramp 25 0.1℃/s
4 25 20min
5 End
4、连接
将退火产物稀释100倍，与酶切好的载体连接，连接体系如下：
5、转化
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于相应抗性的LB平板上进行筛选；
转化的具体步骤：
(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中。
(2)待DH5a感受态细胞融化后，取1μL连接产物于20μL DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟。
(3)将离心管放入42℃水浴锅中40秒(期间不要摇动离心管)，然后快速移至冰浴中，静置2分钟。
(4)向离心管中加入200μL的无菌的LB培养基(不加抗生素)，混匀后置于摇床中37℃，200rpm，振摇1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
(5)涂布到相应抗性的固体培养基平皿中。
(6)37℃培养箱中培养过夜。
6、测序
挑取单菌落培养后提取质粒测序验证。
其中，干扰JUND表达的shRNA包括shRNA1、shRNA2和shRNA3，其序列如SEQ IDNO.1-3所示。
将携带shJund质粒病毒和对照病毒以大约1×1012滴度/只，经胆总管注射Ins2-cre/tdTomato小鼠。在病毒注射两周后，处死小鼠并通过如先前研究采用胶原酶V(Sigma)灌注和消化胰腺来分离胰岛。采用流式分选带有红光的胰岛β细胞，使用SYBR Green PCRMaster Mix(Vazyme,中国)试剂盒，罗氏实时PCR系统进行分析JUND在胰岛β细胞的表达情况。
引物序列
RNA提取质量检测
Sample ID Sample Type A260/280 Concentration
shRNA1 RNA 1.95 520
shRNA2 RNA 1.96 510
shRNA3 RNA 1.98 560
shNC RNA 1.99 570
注：OD值测定A260/A280在1.9～2.1之间，说明提取过程中没有蛋白污染；
由图2-图4的扩增产物熔解曲线的结果显示：图中没有出现明显的杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。
细胞总RNA进行RT-qPCR检测。qPCR上机时分别做3个复孔。定量数值及分析(采用2-ΔΔCt分析法)
Real-time PCR检测结果显示：
与经对照病毒感染的胰岛组织相比，
经小鼠JUND基因shRNA1载体感染的小鼠胰岛β细胞中Jund基因在mRNA水平表达水平是阴性对照组的27％，即敲低了73％；
经小鼠JUND基因shRNA2载体转染的细胞中Jund基因在mRNA水平表达水平是阴性对照组的21％，即敲低了79％；
经小鼠JUND基因shRNA3载体转染的细胞中Jund基因在mRNA水平表达水平是阴性对照组的24％，即敲低了76％。
同时，如图5-6所示，采用含shRNA1的载体获得的病毒颗粒注射普通饮食下的C57小鼠，与对照组相比，其能明显改善C57小鼠普通饮食下的糖耐量以及高脂饮食诱导14周的肥胖C57小鼠的糖耐量。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> 一种干扰JUND表达的shRNA、重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagaaagtca agaccctcaa attcaagaga tttgagggtc ttgactttct cttttt 56
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccggatctt gggctgctca attcaagaga ttgagcagcc caagatccgg ctttttt 57
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttcgccgaa ggcttcgtca attcaagaga ttgacgaagc cttcggcgaa ctttttt 57
<210> 4
<211> 5822
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgtcctgc aggcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg cgtcgggcga 60
cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120
tcactagggg ttcctgcggc cgcacgcgtg tgtagattct acagcacatg tagacgcggc 180
taatagtgcc aggtgtgaga tcccaggtcg cgattccgag agaccctaac ctagccaaca 240
gtcattgccc ttgggcgtcc ctctctgttt cttccaggtg cttcaccacg gtacgtccgg 300
agattccagg tggaagactg gctcagaagt cctttagaaa atcttacaaa aatgtagatc 360
tccctaccag ggcctctcac ccagacaccg acatccagct gcctcccggg ggtcgccttt 420
acctgttggg tgagagctag caggtcaccc gcgtcccctc cgccccagcg cccccaccct 480
ctcggggctc tgcagccgca gtgcaccccc cctctcactg ccccctccct cactcctgcg 540
tcttccccag atccccccct cccgttttcc cagactcccc tcctgctttc cggtagccac 600
ccaaacaagc ctgccctccc gccgcgggga ttcctacggg ccgggggcgc tctgggtggc 660
acgggcgtgg gagacacagc gccccgggct ctgccggcca cgcaggggcg ctgcccgagc 720
gctgcagcaa agggccagcg cgggcgcctc tgcggcacgg ccagggggtg gagaggggcg 780
ggcgtggggc gggctcggcc cggaatgtag agcgagcagg gagagggaga gagacccggg 840
ctggagcctc ccggcggcgg ccaggctgct gagcgcagag gctccgtcac gtgttttgct 900
cctctggagt gagacggcgg cgcggtctga agagggccag cgcgcggtgc cagccgccgc 960
agccgccgct tgttttggtt ggggctctcg gcaactctcc gaggaggagg aaggaggagg 1020
gaggaatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 1080
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 1140
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 1200
ccaccctcgt gaccaccttc acctacggcg tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca 1260
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 1320
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 1380
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1440
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaaggtcta tatcaccgcc gacaagcaga 1500
agaacggcat caaggtgaac ttcaagaccc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1560
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 1620
accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 1680
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 1740
agtaagctaa gcacttcgtg gccgtcgatc gtttaaaggg aggtagtgag tcgaccagtg 1800
gatcctggag gcttgctgaa ggctgtatgc tgagagaaag tcaagaccct caaatagtga 1860
agccacagat gtatttgagg gtcttgactt tctccgcagg acacaaggcc tgttactagc 1920
actcacatgg aacaaatggc caagcttatc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt 1980
gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 2040
ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 2100
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 2160
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 2220
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 2280
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 2340
tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctatg ttgccacctg gattctgcgc 2400
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 2460
ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 2520
tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgagcgctgc tcgagagatc tacgggtggc 2580
atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca 2640
ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata 2700
atattatggg gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag acaacctgta 2760
gggcctgcgg ggtctattgg gaaccaagct ggagtgcagt ggcacaatct tggctcactg 2820
caatctccgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag ttgttgggat 2880
tccaggcatg catgaccagg ctcagctaat ttttgttttt ttggtagaga cggggtttca 2940
ccatattggc caggctggtc tccaactcct aatctcaggt gatctaccca ccttggcctc 3000
ccaaattgct gggattacag gcgtgaacca ctgctccctt ccctgtcctt ctgattttgt 3060
aggtaaccac gtgcggaccg agcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 3120
ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 3180
ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat 3240
gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca 3300
tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 3360
accgctacac ttgccagcgc cttagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 3420
gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 3480
tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt 3540
gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 3600
agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaactcta tctcgggcta ttcttttgat 3660
ttataaggga ttttgccgat ttcggtctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 3720
tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca 3780
atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 3840
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 3900
agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 3960
gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 4020
ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 4080
aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 4140
aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 4200
cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 4260
ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 4320
cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 4380
ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 4440
gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 4500
gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 4560
acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 4620
cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 4680
acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 4740
ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 4800
ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 4860
gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 4920
atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 4980
ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 5040
attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 5100
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 5160
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 5220
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 5280
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 5340
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 5400
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 5460
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 5520
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 5580
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 5640
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 5700
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 5760
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 5820
ca 5822
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggctgtatg ctgagagaaa gtcaa 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gccttgtgtc ctgcggagaa agtca 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acacgcaaga acgcatcaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agctcggtgt tctggctttt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaaacgccct tctatggcga 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagcgcgtct ttcttcagc 19

Claims (5)

1.一种重组腺相关病毒，其特征在于，
所述重组腺相关病毒通过重组腺相关病毒载体侵染真核细胞后获得；
所述真核细胞为HEK293T细胞；
所述重组腺相关病毒载体包含干扰JUND表达的shRNA；
所述shRNA至少包括shRNA1、shRNA2和shRNA3；
所述重组腺相关病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
其中，所述shRNA1的核苷酸序列为：
GAGAAAGTCAAGACCCTCAAATTCAAGAGATTTGAGGGTCTTGACTTTCTCTTTTT；
所述shRNA2的核苷酸序列为：
GCCGGATCTTGGGCTGCTCAATTCAAGAGATTGAGCAGCCCAAGATCCGGCTTTTTT；
所述shRNA3的核苷酸序列为：
GTTCGCCGAAGGCTTCGTCAATTCAAGAGATTGACGAAGCCTTCGGCGAACTTTTTT；
所述shRNA中shRNA1、shRNA2和shRNA3分别插入腺相关病毒载体的多克隆位点处。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒的包装方法，其特征在于，包括：将所述重组腺相关病毒载体转染真核细胞，收集病毒即得。
3.如权利要求2所述的重组腺相关病毒的包装方法，其特征在于，所述真核细胞为HEK293T细胞。
4.如权利要求1所述的重组腺相关病毒在制备改善受试者糖耐量产品中的应用。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为药物。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1839201A (zh) * 2003-06-18 2006-09-27 吉恩勒克斯公司 修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用
WO2009053683A2 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Medical Research Council Treatment of inflammatory diseases
CN103397019A (zh) * 2003-11-21 2013-11-20 雷维维科公司 干扰rna在生产转基因动物中的用途
CN104059918A (zh) * 2014-06-25 2014-09-24 中国人民解放军第二军医大学 抑制i型糖尿病ccr5基因表达的干扰序列及其重组载体与应用
WO2020101909A2 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Center For Cancer Research & Therapeutic Development, Clark Atlanta University Identification of jund target genes for inhibition of prostate cancer cell growth
CN112225793A (zh) * 2020-10-14 2021-01-15 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用
CN112352050A (zh) * 2018-02-27 2021-02-09 宾夕法尼亚州大学信托人 新颖腺相关病毒（aav）载体、具有降低的衣壳脱酰胺化的aav载体及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101160055A (zh) * 2005-02-16 2008-04-09 莱蒂恩公司 慢病毒载体及其用途
JP2023519926A (ja) * 2020-03-23 2023-05-15 キュリジン カンパニー，リミテッド 二重特異性核酸分子を含む抗癌ウイルスの構造

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1839201A (zh) * 2003-06-18 2006-09-27 吉恩勒克斯公司 修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用
CN103397019A (zh) * 2003-11-21 2013-11-20 雷维维科公司 干扰rna在生产转基因动物中的用途
WO2009053683A2 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Medical Research Council Treatment of inflammatory diseases
CN104059918A (zh) * 2014-06-25 2014-09-24 中国人民解放军第二军医大学 抑制i型糖尿病ccr5基因表达的干扰序列及其重组载体与应用
CN112352050A (zh) * 2018-02-27 2021-02-09 宾夕法尼亚州大学信托人 新颖腺相关病毒（aav）载体、具有降低的衣壳脱酰胺化的aav载体及其用途
WO2020101909A2 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Center For Cancer Research & Therapeutic Development, Clark Atlanta University Identification of jund target genes for inhibition of prostate cancer cell growth
CN112225793A (zh) * 2020-10-14 2021-01-15 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Human T-Cell Leukemia Virus Type 1 (HTLV-1) bZIP Factor Requires Cellular Transcription Factor JunD To Upregulate HTLV-1 Antisense Transcription from the 3′ Long Terminal Repeat;Hélène Gazon等;Journal of Virology;第86卷(第17期);1-9 *
JunD/AP-1 Antagonizes the Induction of DAPK1 To Promote the Survival of v-Src-Transformed Cells;Bart M. Maślikowski等;Journal of Virology;第91卷(第1期);1-42 *
PARP-1/Reg对于年龄相关的β细胞再生能力的调控;孙宇等;中华医学会;第3卷(第2期);1-5 *
小鼠M1细胞中ctcf基因的敲降及其对c-myb基因表达的影响;李小霞等;基因组学与应用生物学;第38卷(第12期);5379-5385 *

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