CN112352050A - 新颖腺相关病毒（aav）载体、具有降低的衣壳脱酰胺化的aav载体及其用途 - Google Patents

Abstract

一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包括AAV衣壳，所述AAV衣壳具有vp1蛋白的异质群体、vp2蛋白的异质群体以及vp3蛋白的异质群体。与经过编码的VP1氨基酸序列相比，所述衣壳含有经过修饰的氨基酸，所述衣壳含有处于天冬酰胺‑甘氨酸对处的高度脱酰胺化的天冬酰胺残基，并且进一步包括多个其它较小程度脱酰胺化的天冬酰胺残基以及任选地谷氨酰胺残基。提供了降低rAAV的AAV衣壳中的脱酰胺化的方法。

Description

新颖腺相关病毒（AAV）载体、具有降低的衣壳脱酰胺化的AAV 载体及其用途

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院美国国家心脏、肺和血液学研究所授予的授权号 P01HL059407下由政府支持进行的。政府享有本发明的一定权利。

背景技术

腺相关病毒(AAV)衣壳的结构为二十面体，并且包含比率为1:1:10的60个病毒蛋白(VP)单体(VP1、VP2和VP3)(Xie Q等人,《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad SciUSA)》2002；99(16):10405-10)。VP1和VP2两者的C端内均含有整个VP3蛋白序列(519aa)，并且共享的VP3序列主要负责总体衣壳结构。由于VP1/VP2独特区的结构柔性以及组装衣壳中VP1和VP2单体相对于VP3单体的低呈现，因此VP3是可通过x射线晶体学分辨的唯一衣壳蛋白(Nam HJ等人,《病毒学杂志(J Virol)》2007； 81(22):12260-71)。VP3含有作为AAV血清型之间序列变异的主要来源的九个高变区 (HVR)(Govindasamy L等人,《病毒学杂志》2013；87(20):11187-99)。考虑到其在衣壳表面上的柔性和位置，HVR主要负责与靶细胞以及免疫系统相互作用(Huang LY等人, 《病毒学杂志》2016；90(11):5219-30；Raupp C等人,《病毒学杂志》2012； 86(17):9396-408)。虽然公开了分别用于AAV2、AAVrh.8、AAV6、AAV9、AAV3B、AAV8 和AAV4的结构条目的多种血清型的结构(来自结构生物信息学研究合作实验室(RCSB) 数据库的蛋白质数据库(PDB)ID 1LP3、4RSO，4V86、3UX1、3KIC、2QA0、2G8G)，但文献中关于这些衣壳的表面上的修饰的信息很少。研究表明衣壳的细胞内磷酸化在特定酪氨酸残基处发生(Zhong L等人,《病毒学(Virology)》2008；381(2):194-202)。尽管初级VP3序列中存在推定的糖基化位点，但尚未在AAV2中鉴定出糖基化事件(Murray S等人,《病毒学杂志》2006；80(12):6171-6；Jin X等人,《人类基因疗法方法(Hum Gene TherMethods)》2017；28(5):255-267)；其它AAV血清型尚未针对衣壳糖基化进行评估。

AAV基因疗法载体经历较少的分子水平审查，所述分子水平审查通常伴随重组蛋白治疗剂的开发和制造。AAV衣壳转译后修饰(PTM)很大程度上尚未被开发，因此，对关于其影响功能的潜力或关于控制制造的AAV疗法中PTM水平的策略知之甚少。

非基因疗法蛋白治疗剂的转译后修饰的变化使得其开发作为药物变得复杂。Jenkins, N、Murphy,L和Tyther,R(2008),“重组蛋白的转译后修饰：对于生物制药的意义(Post-translational modifications of recombinant proteins:significance forbiopharmaceuticals)”《分子生物技术(Mol Biotechnol)》39:113-118；Houde,D、Peng,Y、Berkowitz,SA和Engen,JR(2010),“转译后修饰差异地影响IgG1构象和受体结合 (Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation andreceptor binding)”《分子细胞蛋白质组学(Mol Cell Proteomics)》9:1716-1728。例如，所选氨基酸的脱酰胺化调节了基于重组保护性抗原的炭疽疫苗的稳定性和免疫应答。(Powell BS 等人,《蛋白质(Proteins)》2007；68(2):45879；VermaA等人,《临床与疫苗免疫学(Clin Vaccine Immunol)》2016；23(5):396-402)。在一些情况下，此过程通过病毒或细菌脱酰胺酶进行催化，以调节宿主细胞信号传导途径或先天免疫应答(Zhao J等人,《病毒学杂志》2016；90(9):4262-8；Zhao J等人,《细胞宿主微生物(Cell Host Microbe)》2016；20(6):770-84)。更常见的是，内源性脱酰胺化是一种不依赖酶的自发过程。尽管尚未完全阐明自发脱酰胺化的目的，但先前的研究已经表明此事件用作分子时钟以指示蛋白质的相对年龄并调节其转换(Robinson NE和RobinsonAB,《美国国家科学院院刊》2001； 98(3):944-9)。

脱酰胺化在天冬酰胺或更不常见的谷氨酰胺的酰胺基经历来自相邻氮原子的亲核攻击并且酰胺基丢失时发生。此过程产生琥珀酰亚胺基中间体(Yang H和Zubarev RA,《电泳(Electrophoresis)》2010；31(11):1764-72)，所述琥珀酰亚胺基中间体通过水解分解为天冬氨酸和异天冬氨酸(或谷氨酸和异谷氨酸)的混合物(Catak S等人,《物理化学杂志A(JPhys Chem A)》2009；113(6):1111-20)。短合成肽的研究估计，这种水解会产生比例为3:1的异天冬氨酸与天冬氨酸混合物(Geiger T.和Clarke S,《生物化学杂志 (JBiolChem)》1987；262(2):785-94。

仍然需要包括基于AAV的构建体的组合物以递送具有稳定的受体结合和/或稳定的衣壳的异源分子，从而避免中和抗体和/或在储存时保持纯度。

发明内容

在一个实施例中，提供了一种组合物，其包括重组腺相关病毒(rAAV)的混合群体，所述rAAV中的每个rAAV包括：(a)AAV衣壳，所述AAV衣壳包括约60个衣壳vp1 蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白，其中所述vp1蛋白、所述vp2蛋白和所述vp3蛋白为：vp1 蛋白的异质群体，所述vp1蛋白由对所选AAV vp1氨基酸序列进行编码的核酸序列产生； vp2蛋白的异质群体，所述vp2蛋白由对所选AAV vp2氨基酸序列进行编码的核酸序列产生；vp3蛋白的异质群体，所述vp3蛋白由对所选AAV vp3氨基酸序列进行编码的核酸序列产生，其中所述vp1蛋白、所述vp2蛋白和所述vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括AAV衣壳中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化引起氨基酸变化；以及(b)所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括核酸分子，所述核酸分子包括AAV反向末端重复序列和对产物进行编码的非 AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列可操作地连接到引导所述产物在宿主细胞中的表达的序列。rAAV的混合群体由使用单一类型的AAV衣壳核酸序列的产生系统产生，所述AAV衣壳核酸序列对一种AAV类型的预测的AAV VP1氨基酸序列进行编码。然而，产生和制造过程提供了上文所描述的衣壳蛋白的异质群体。在某些实施例中，所述组合物如本段中所描述的，条件是所述rAAV不是AAVhu68。在某些实施例中，所述组合物如本段中所描述的，条件是所述rAAV不是AAV2。

在某些实施例中，所述脱酰胺化的天冬酰胺被脱酰胺化为天冬氨酸、异天冬氨酸、相互转化的天冬氨酸/异天冬氨酸对或其组合。在某些实施例中，所述衣壳进一步包括一种或多种脱酰胺化的谷氨酰胺，所述一种或多种脱酰胺化的谷氨酰胺被脱酰胺化为(α)- 谷氨酸、γ-谷氨酸、相互转化的(α)-谷氨酸/γ-谷氨酸对或其组合。

在某些实施例中，提供了一种用于降低AAV衣壳的脱酰胺化的方法。这种方法包括由含有经过修饰的AAV vp密码子的核酸序列产生AAV衣壳，相对于参考AAV vp1 序列，所述核酸序列包括处于天冬酰胺-甘氨酸对中的一到三个天冬酰胺-甘氨酸对处的独立地经过修饰的甘氨酸密码子，使得所述经过修饰的密码子对除甘氨酸之外的其它氨基酸进行编码。

在其它实施例中，提供了一种用于降低AAV衣壳的脱酰胺化的方法。这种方法包括由含有经过修饰的AAV vp密码子的核酸序列产生AAV衣壳，相对于参考AAV vp1 序列，所述核酸序列包括至少一个天冬酰胺-甘氨酸对的独立地经过修饰的天冬酰胺密码子，使得所述经过修饰的密码子对除天冬酰胺之外的其它氨基酸进行编码。

提供了一种用于增加AAV的效价、效力和/或转导效率的方法。所述方法包括由含有至少一个AAV vp密码子的核酸序列产生AAV衣壳，所述至少一个AAV vp密码子被修饰成将所述衣壳中的至少一个天冬酰胺-甘氨酸对的天冬酰胺或甘氨酸变成不同的氨基酸。在某些实施例中，所述一个或多个经过修饰的密码子在v2和/或vp3区中。在某些实施例中，vp1独特区中的天冬酰胺-甘氨酸对保留在经过修饰的rAAV中。在某些实施例中，提供了对这些突变AAV衣壳进行编码的核酸分子序列。

在某些实施例中，在除以下位置之外的位置处修饰脱酰胺化位点(例如，天冬酰胺-甘氨酸对或Gln)：(a)对于AAV8衣壳，具有起始M的SEQ ID NO:6(经过编码的 AAV8 vp1)的基于所述AAV8 vp1的编号的N57、N263、N385、N514和/或N540；(b) 对于AAV9衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:7(经过编码的AAV9 vp1)的编号的 N57、N329、N452和/或N512；或者(c)对于AAVrh10衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:112(经过编码的AAVrh10 vp1)的编号的N263、N385和/或N514。在某些实施例中，经过修饰的脱酰胺化位点选自表F或表G上的位点。在某些实施例中，所述经过修饰的脱酰胺化位点选自表F或表G上的位点，不包含上文(a)-(c)中的位置。在某些实施例中，在除以下位置之外的位置处修饰脱酰胺化位点(例如，天冬酰胺-甘氨酸对或Gln(Q))：(a)对于AAV1衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、基于SEQ ID NO:1的编号的N57、N383、N512和/或N718；(b)对于AAV3B衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:2的编号的N57、 N382、N512和/或N718；(c)对于AAV5衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:3的编号的N56、N347、N347和/或N509；(d)对于AAV7 衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:4的编号的 N41、N57、N384和/或N514；(e)对于AAVrh32.33衣壳，基于具有起始M的预测的 vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:5的编号的N57、N264、N292和/或N318；或者(f)对于AAV4衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:111的编号的N56、N264、N318和/或N546。在某些实施例中，经过修饰的脱酰胺化位点选自表A、表B、表C、表D、表E、表F或表G上的位点。在某些实施例中，所述经过修饰的脱酰胺化位点不包含上文列举的(a)-(f)中的位置。

在某些实施例中，所述方法涉及产生具有所选突变AAV8衣壳的重组AAV，所述所选突变AAV8衣壳具有基于AAV8的编号或在基于所选序列与AAV8的比对的另一个 AAV中的以下的突变：AAV8 G264A/G515A(SEQ ID NO:21)；AAV8G264A/G541A(SEQ ID NO:23)；AAV8G515A/G541A(SEQ ID NO:25)或AAV8 G264A/G515A/G541A(SEQ ID NO:27)；AAV8G264A/G541A/N499Q(SEQ ID NO:115)；(c)AAV8 G264A/G541A/N459Q(SEQ ID NO:116)；(d)AAV8 G264A/G541A/N305Q/N459Q(SEQ ID NO:117)；(e)AAV8 G264A/G541A/N305Q/N499Q(SEQ ID NO:118)；AAV8 G264A/G541A/N459Q/N499Q(SEQ ID NO:119)；或AAV8G264A/G541A/N305Q/N459Q/N499Q(SEQ ID NO:120)。在某些实施例中，所述方法涉及产生具有突变AAV9衣壳的rAAV，所述突变AAV9衣壳选自以下：AAV9 G330/G453A (SEQ ID NO:29)、AAV9G330A/G513A(SEQ ID NO:31)、AAV9G453A/G513A(SEQ ID NO:33)和/或AAV9G330/G453A/G513A(SEQ ID NO:35)。

在某些实施例中，提供了对这些突变AAV衣壳进行编码的核酸分子序列。在某些实施例中，在以下中提供核酸序列：例如SEQ ID NO:20(AAV8 G264A/G515A)、SEQ ID NO:22(AAV8G264A/G541A)、SEQ ID NO:24(AAV8G515A/G541A)或SEQ ID NO: 26(AAV8 G264A/G515A/G541A)。在某些实施例中，在以下中提供核酸序列：例如SEQ ID NO:28(9G330AG453A)、SEQ ID NO:30(9G330AG513A)、SEQ ID NO:32 (9G453AG513A)、SEQ ID NO:34(9G330AG453AG513A)。在某些实施例中，基于与 AAV9的比对，可以将其它AAV突变为在这些或对应NG对中具有这种改变。

提供了一种组合物，所述组合物包括具有增加的效价、效力或转导的rAAV的群体。在某些实施例中，所述组合物包括具有衣壳的rAAV，与具有含有根据以下中的任一项的衣壳脱酰胺化模式的脱酰胺化模式的rAAV相比，所述衣壳被修饰成具有降低的总脱酰胺化：表A(AAV1)、表B(AAV3B)、表C(AAV5)、表D(AAV7)、表E(AAVrh32.33)、表F(AAV8)、表G(AAV9)或表H(AAVhu37)。在某些实施例中，rAAV在本文中鉴定的高度脱酰胺化的位置处是未经修饰的。

通过以下对本发明的详细描述，本发明的这些和其它方面将变得显而易见。

附图说明

图1A-图1G：AAV8 VP同种型的电泳分析。(图1A)图展示了天冬酰胺残基通过相邻氮原子经历亲核攻击从而形成琥珀酰亚胺基中间体的机制。然后此中间体经历水解，从而分解为天冬氨酸和异天冬氨酸的混合物。如此标记β碳。图是在BIOVIA Draw 2018中产生的。(图1B)在变性的一维SDS-PAGE上运行1μg的AAV8载体。(图1C) 示出了碳酸酐酶pI标志物点的等电点。(图1D)通过二维凝胶电泳分析5μg的AAV8 载体，并用考马斯蓝对其进行染色。点1-20是氨基甲酰化的碳酸酐酶pI标志物。加框区如下：a＝VP1，b＝VP2，c＝VP3，d＝内部原肌球蛋白标志物(箭头：原肌球蛋白点的MW＝33kDa，pI＝5.2)。在4-8的pI范围内进行等电聚焦。(图1E-图1G)在4-8 的pI范围内进行的等电聚焦的结果。通过2D凝胶电泳分析1e11 GC的wtAAV8载体(图 1E)或突变载体(图1F和图1G)，并用Sypro Ruby对其进行染色。蛋白质标记：A＝VP1； B＝VP2；C＝VP3，D＝鸡蛋清伴清蛋白标记物，E＝turbouclease标记物。在6-10的 pI范围内进行等电聚焦。初级VP1/2/3同种型点被圈出，并且标志物的主要点的迁移距离由竖直线指示(turbonuclease＝虚线，伴清蛋白＝实线)。

图2A-图2E：AAV8衣壳蛋白中的天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺化的分析。(图2A- 图2B)示出了电喷雾电离(ESI)质谱以及含有Asn-94(图2A)和Asp-94(图2B)的3+肽(93-103)的理论和观察到的质量。(图2C-图2D)示出了ESI质谱以及含有Asn-254 (图2C)和Asp-254(图2D)的3+肽(247-259)的理论和观察到的质量。Asn-94和Asn-254 的观察到的质量偏移分别为0.982Da和0.986Da，而理论质量偏移为0.984Da。(图2E) 示出了通过不同方法纯化的AAV8胰蛋白酶肽在所关注的特异性天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基处的脱酰胺化百分比。用交叉阴影线标记指示具有N+1个甘氨酸的天冬酰胺残基处的脱酰胺化的条。包含在所分析的至少一种制剂中确定为至少2％脱酰胺化的残基。数据表示为平均值±标准偏差。

图3A-图3E：AAV8 VP3单体的结构建模和脱酰胺化的位点的分析。(图3A)以圆圈表示形式示出了AAV8 VP3单体(PDB标识符：3RA8)。带的颜色指示相对柔性程度 (蓝色＝最高刚性/正常温度系数，红色＝最高柔性/高温系数)。球体指示所关注的残基。展开图是所关注残基及其周围残基的球状和棒状表示，以展示局部蛋白质结构(蓝色＝氮，红色＝氧)。带下划线的残基是NG基序中的残基。图3B-图3E：示出了具有N+1个甘氨酸的脱酰胺化的天冬酰胺的异天冬氨酸模型。与(图3C)N263、(图3D) N514和(图3E)N540的异天冬氨酸模型相比，用(图3B)N410的天冬酰胺模型从 AAV8晶体结构(PDB ID：3RA8)的细化产生2FoFc电子密度图(1σ水平)。电子密度图以洋红色网格示出。如此标记β碳。箭头指示与所关注的残基的R基团对应的电子密度。

图4A-图4D：影响AAV8衣壳脱酰胺化的因素的确定。将AAV8制剂(图4A)在 70℃下温育三天或七天，(图4B)暴露于pH 2或pH 10持续七天，或使用D₂O代替H₂O 来制备(图4C)以用于质谱，以确定对AAV衣壳形成而言不是固有的脱酰胺化的可能来源。(图4D)使用B1抗体(与变性的衣壳反应)和AAV8构象特异性抗体(与完整衣壳反应)如图4A那样处理载体的斑点印迹以评估衣壳结构完整性。

图5A-图5B：非AAV蛋白中的脱酰胺化频率。为了与AAV脱酰胺化百分比进行比较，示出了两种含有可能被脱酰胺化的NG基序的非AAV重组蛋白(人碳酸酐酶(图 5A)和大鼠苯丙氨酸-羟化酶(图5B))的脱酰胺化百分比。

图6：使用来自两个机构的数据分析流水线计算的AAV8脱酰胺化百分比的比较。示出了在两个不同机构处评估的AAV8胰蛋白酶肽在所关注的特异性天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基处的脱酰胺化百分比。

图7A-图7C展示了在批次之间具有高变异性的非NG位点处的功能性天冬酰胺取代。(图7A)通过在293个细胞中的小规模三重转染产生wtAAV8载体和突变载体的效价，如通过定量PCR(qPCR)测量的。报告了相对于wtAAV8对照物的效价。如图8B 中所描述的测量转导效率。使效价和转导效率相对于wtAAV8对照物的值归一化。(图 7B)示出了接受wtAAV8.CB7.ffluc和N499Q衣壳突变载体的小鼠在注射后第14天的代表性荧光素酶图像。(图7C)在研究期间的第14天，通过荧光素酶成像测量来自用 wtAAV8载体或突变载体(n＝3或4)静脉内注射的C57BL/6小鼠的荧光素酶表达，并以总通量单位报告。所有数据表示为平均值+标准偏差。

图8A和图8B示出了基因脱酰胺化对载体性能的影响的体外分析结果。(图8A)通过在293个细胞中的小规模三重转染产生wtAAV8载体和基因脱酰胺化突变载体的效价，如通过定量PCR(qPCR)测量的。报告了相对于wtAAV8对照物的效价。用wtAAV8 和阴性对照物呈现高脱酰胺化的NG位点(图案化条)、低脱酰胺化的位点(白条)和高度可变的位点(黑条)。(图8B)相对于wtAAV8对照物报告的产生萤火虫荧光素酶的突变AAV8载体的转导效率。转导效率以添加到HUH7细胞中的每个GC产生的发光单位来测量，并通过在多个稀释度下用粗载体进行转导来确定。使转导效率数据相对于野生型(wt)参考归一化。所有数据表示为平均值±标准偏差。

图9A-图9D展示了随着时间的推移，载体活性丧失与进行性脱酰胺化有关。(图9A)持续三重转染的HEK 293细胞的时程的载体产生(DNAseI抗性基因组拷贝，GC)产生包装荧光素酶报告基因的AAV8载体。使GC水平相对于最大观察值归一化。(图8B) 使用经过纯化的时程载体转导Huh7细胞。使用多个稀释度的经过纯化的时程载体样品如图8B中那样测量转导效率(以添加到靶细胞的每个GC的发光单位)。误差条表示对于每个采样时间进行至少10次技术重复的标准偏差。转染后1天、2天和5天收集的载体的AAV8 NG位点(图9C)和非NG位点(图9D)的脱酰胺化。

图10A-图10D展示了稳定天冬酰胺对载体性能的影响。图10A示出了通过在293 个细胞中的小规模三重转染产生wtAAV8载体和+1位置突变载体的效价，如通过定量 PCR(qPCR)测量的。报告了相对于wtAAV8对照物的效价。图10B示出了相对于wtAAV8 对照物报告的产生萤火虫荧光素酶的突变AAV8载体的转导效率。使用粗载体材料如图 8B中那样测量转导效率。运行双样品t测试(^*p<0.005)以确定wtAAV8与G264A/G515A 和G264A/G541A的突变转导效率之间的显著性。图10C示出了在研究期间的第14天，通过荧光素酶成像测量的来自用wtAAV8载体或突变载体(n＝3到5)静脉内注射的 C57BL/6小鼠的肝脏区中的荧光素酶表达，并以总通量单位报告。图10D示出了相对于 wtAAV8对照物报告的产生萤火虫荧光素酶的多位点AAV8突变载体的效价和转导效率。所有数据表示为平均值±标准偏差。

图11A-图11C：AAV9衣壳蛋白中的天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺化的分析。(图11A)通过2D凝胶电泳分析1e11 GC的wtAAV9，并用Sypro Ruby对其进行染色。蛋白质标记：A＝VP1；B＝VP2；C＝VP3，D＝鸡蛋清伴清蛋白标记物，E＝turbouclease标记物。在6-10的pI范围内进行等电聚焦。(图11B)示出了通过不同方法纯化的AAV9胰蛋白酶肽在所关注的特异性天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基处的脱酰胺化百分比。用交叉阴影线标记指示具有N+1个甘氨酸的天冬酰胺残基处的脱酰胺化的条。包含在所分析的至少一种制剂中确定为至少2％脱酰胺化的残基。数据表示为平均值±标准偏差。(图 11C)在由AAV9晶体结构(PDB ID：3UX1)的未偏置细化产生的2FoFc电子密度图中示出了N512的异天冬氨酸模型。箭头指示与残基N512的R基团对应的电子密度。

图11D-图11F：影响AAV9衣壳脱酰胺化的因素的确定。(图11D)将两种AAV9 制剂在70℃下温育三天或七天，或(图11F)暴露于pH 2或pH 10持续七天，以确定对AAV衣壳形成而言不是固有的脱酰胺化的可能来源。数据表示为平均值±标准偏差。 (图11F)使用B1抗体(与变性的衣壳反应)如图11D那样处理载体的斑点印迹以评估衣壳结构完整性。

图11G和图11H展示了AAV9的基因脱酰胺化对载体性能的影响的体外分析。(图11G)通过在293个细胞中的小规模三重转染产生wtAAV9载体和基因脱酰胺化突变载体的效价，如通过定量PCR(qPCR)测量的。报告了相对于wtAAV9对照物的效价。用wtAAV8和阴性对照物呈现高脱酰胺化的NG位点(图案化条)、低脱酰胺化的位点 (白条)和高度可变的位点(黑条)。(图11H)相对于wtAAV9对照物，报告了产生萤火虫荧光素酶的突变AAV9载体的转导效率。所有数据表示为平均值±标准偏差。

图11I-图11K示出了随着时间的推移的AAV9载体体外效力。(图11I)持续三重转染的HEK 293细胞的时程的载体产生(DNAseI抗性基因组拷贝，GC)产生包装荧光素酶报告基因的AAV9载体。使GC水平相对于最大观察值归一化。(图11J)使用粗时程载体转导Huh7细胞。(图11K)示出了针对粗载体样品和经过纯化的载体样品的转染后 1天对转染后5天收集的载体的转导效率。转导效率表达为荧光素酶活性/GC，相对于第1天的值归一化。

图12A-图12B：PAV9.1单克隆抗体的表征和基于PAV9.1表位的诱变策略。图12A：基于具有天然或变性的衣壳蛋白的捕获ELISA的各种AAV血清型的PAV9.1识别。图 12B：AAVVP1氨基酸序列的比对(SEQ ID NO:10-19，从上到下)；PAV9.1的表位所关注的残基在黑框内。

图13A-图13D：与PAV9.1 Fab复合的AAV9的Cryo-EM重构。图13A：描绘了在以

分辨率重构的三重轴突出处与PAV9.1 Fab(蓝色)结合的AAV9衣壳(紫红色) 的分子表面。对3,022个颗粒加框，并使用Auto3dEM进行电子显微镜重构。图13B：描绘了AAV9-PAV9.1复合物的横截面。图13C：内置到如从冷冻重构获得的密度中的 AAV9-PAV9.1三聚体的伪原子模型。VP3单体以绿色、灰色和青色示出。球体表示结合的残基。已经展示了单个PAV9.1Fab，其中重链呈靛蓝色，并且轻链呈红色。图13D：涉及PAV9.1结合的残基的二维“路线图”。

图14A-图14E：表位突变对AAV9的PAV9.1 mAb的EC50的影响。使用针对AAV9 的衣壳捕获ELISA来分析和产生PAV9.1的结合曲线。图14A-图14E展示了以下：586-590 交换突变体(图14A)；494-498突变体(图14B)；586-590点突变体(图14C)； AAV9.TQAAA和AAV9.SAQAN单一和组合突变体(图14D)；AAV9.TQAAA和 AAV9.SAQAA单一和组合突变体(图14E)。使吸光度相对于每个衣壳的最大吸光度归一化。使用Prism中的剂量响应函数确定了最佳拟合线和EC50。

图15A-图15K：表征PAV9.1表位突变对体外载体转导和有效的PAV9.1 mAb中和效价的影响。图15A：PAV9.1衣壳突变体相对于AAV9.WT在HEK293细胞中的转导效率。通过使用双侧单样品t测试确定了显著性，并将每种突变体的转导百分比与 AAV9.WT的转导百分比(定义为100％)进行比较。P值指示如下：p^*<0.05，p^***<0.001。图15B-图15K：当用以下转导HEK293细胞时，确定PAV9.1的中和效价： AAV9.WT.CMV.LacZ(图15B)；AAV9.AAQAA(图15C)；AAV9.QQNAA(图15D)； AAV9.SSNTA(图15E)；AAV9.RGNRQ(图15F)；AAV9.RGHRE(图15G)；AAV9.TQAAA (图15H)；AAV9.AANNN(图15I)；AAV9.SAQAN(图15J)；或AAV9.SAQAA(图15K)。将中和效价定义为在可以实现没有mAb的载体的转导水平的50％或更高的时间点之前的稀释度(水平以相对光单位测量)。所有数据都报告为平均值±SD。

图16：PAV9.1 EC50与一组AAV9突变体的中和效价之间的相关性。计算了相对于针对AAV9.WT的PAV9.1中和效价，针对每种突变体的PAV9.1中和效价的降低倍数。在线性标度(半对数绘图)上绘制了相对于的AAV9.WT的PAV9.1 EC50，针对每种突变体的PAV9.1 EC50的增加倍数在对数标度上的数据。使用GraphPad Prism来确定最佳拟合的半对数线；R²＝0.8474。

图17A-图17G：AAV9 PAV9.1突变载体的体内分析。C57BL/6小鼠接受静脉内注射每只小鼠1e11 GC(图17A-图17C)或每只小鼠1e12 GC(图17D-图17F)AAV9.CMV.LacZ (WT或突变体；n＝3)。在第14天处死小鼠并采集组织以使用Taqman qPCR进行生物分布分析(图17A和图17D)。值报告为平均值±SD。还采集了肝脏(图17B和图17E)、心脏(图17C和图17F)和肌肉(图17G)以用于β-gal组织化学以确定酶活性。示出了代表性10X图像；比例尺＝200μm。

图18A-图18D：表位突变对AAV9的注射的小鼠血浆的EC50的影响。使用衣壳捕获ELISA，分析了接受静脉内注射用于AAV9.WT或AAV9 PAV9.1突变体结合的7.5e8 GC/小鼠(图18A)或7.5e9 GC/小鼠(图18B)wtAAV9.LSP.hFIX的小鼠的56天血浆。使吸光度相对于针对每个衣壳实现的最大吸光度归一化。使用Prism中的剂量响应函数确定了最佳拟合线和EC50。每个图对应于单个动物。汇编了7.5e8 GC/小鼠(图18C) 或7.5e9 GC/小鼠(图18D)的EC50值以确定每种突变体的平均值。使用双侧单样品t 测试来确定每种突变体的血浆的EC50相对于AAV9.WT的血浆的EC50(定义为1)之间是否存在显著差异。将Bonferroni校正应用于控制1型误差。P值表示如下：^**＝p< 0.05，^**＝p<0.01，^***＝p<0.001。EC50数据报告为平均值±SD。

图19A-图19D：表位突变对AAV9的NHP多克隆血清的EC50的影响。使用衣壳捕获ELISA，分析了来自用AAV9.WT或hu68.WT载体处理的(图19A)NHP的血清；或作为用于AAV9.WT或AAV9 PAV9.1突变体结合的AAV9 NAb(+)的(图19B)未经处理的NHP的血清。使吸光度相对于针对每个衣壳实现的最大吸光度归一化。使用 Prism中的剂量响应函数来确定最佳拟合线和EC50。每个图对应于单个动物。汇编了载体处理的NHP(图19C)；和未经处理的NAb(+)NHP的EC50值以确定每种突变体的平均值(图19D)。使用双侧单样品t测试来确定每种突变体的血浆的EC50相对于 AAV9.WT的血浆的EC50(定义为1)之间是否存在显著差异。将Bonferroni校正应用于控制1型误差。EC50数据报告为平均值±SD。

图20A-图20B：表位突变对AAV9的人供体多克隆血清的EC50的影响。图20A：使用衣壳捕获ELISA分析了来自作为用于AAV9.WT或AAV9 PAV9.1突变体结合的 AAV9 NAb(+)的未经处理的人供体的血清。使用Prism中的剂量响应函数确定了最佳拟合线和EC50。每个图对应于单个供体。图20B：汇编了NAb(+)人供体血清的EC50 值以确定每种突变体的平均值。通过使用双侧单样品t测试确定了显著性，并将每种突变体的血浆的EC50相对于AAV9.WT的血浆的EC50(定义为1)进行比较。将Bonferroni 校正应用于控制1型误差。EC50数据报告为平均值±SD。

图21A-图21B示出了来自6孔板规模实验的AAV8体外效价和转导数据，所述规模实验包含AAV8的N57Q、N263Q、N385Q、N514Q、N540Q、N94Q和N410Q突变体。

图22A-图22B示出了来自6孔板规模实验的AAV9体外效价和转导数据，所述规模实验包含AAV9的N57Q、N329Q、N452Q、N270Q、N409Q、N668Q、N94Q、N253Q、N663Q和N704Q突变体。

图23A-图23B提供了在第14天测试小鼠肝脏表达的小鼠中分别针对AAV8和AAV9的体内转导数据(荧光素酶成像)。图23A展示了与野生型AAV8相比的AAV8突变体 N57Q、N263Q和N385Q。图23B展示了与野生型AAV9相比的AAV9突变体N57Q、 G58A、G330A。

图24A-图24B展示了AAV9双重和三重突变体G330/G453A、G330A/G513A、 G453A/G513A和G330/G453A/G513A的相对效价(GC)和转导效率。图24A比较了突变体相对于AAV9wt的相对效价，并且图24B比较了突变体相对于AAV9wt的相对转导效率(荧光素酶/GC)。

具体实施方式

本文提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)以及含有其的组合物，在重组AAV的衣壳内存在的三个衣壳蛋白群体VP1、VP2和VP3中的每个衣壳蛋白群体中均具有序列和电荷异质性。本文提供了新颖rAAV以及用于降低脱酰胺化的方法和任选地其它衣壳单体修饰。本文进一步提供了具有减少的修饰的经过修饰的rAAV，所述减少的修饰可用于提供具有保持更大的稳定性、效力和/或纯度的衣壳的rAAV。在某些实施例中，rAAV 不是AAVhu68。在某些实施例中，rAAV不是AAV2。

在一个实施例中，提供了一种组合物，其包括重组腺相关病毒(rAAV)的混合群体，所述rAAV中的每个rAAV包括：(a)AAV衣壳，所述AAV衣壳包括约60个衣壳vp1 蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白，其中所述vp1蛋白、所述vp2蛋白和所述vp3蛋白为：vp1 蛋白的异质群体，所述vp1蛋白由对所选AAV vp1氨基酸序列进行编码的核酸序列产生； vp2蛋白的异质群体，所述vp2蛋白由对所选AAV vp2氨基酸序列进行编码的核酸序列产生；vp3蛋白的异质群体，所述vp3蛋白由对所选AAV vp3氨基酸序列进行编码的核酸序列产生，其中所述vp1蛋白、所述vp2蛋白和所述vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括AAV衣壳中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化引起氨基酸变化；以及(b)所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括核酸分子，所述核酸分子包括AAV反向末端重复序列和对产物进行编码的非 AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列可操作地连接到引导所述产物在宿主细胞中的表达的序列。在某些实施例中，所述组合物如本段中所描述的，条件是所述rAAV不是 AAVhu68。如本文所使用的，AAVhu68如WO 2018/160582中所定义的。AAVhu68 VP1的预测的氨基酸序列在SEQ ID NO:114中重现，并且天然核酸序列在SEQ ID NO:113 中提供。在某些实施例中，所述组合物如本段中所描述的，条件是所述rAAV不是AAV2。

在某些实施例中，混合的rAAV群体由使用单个AAV衣壳核酸序列的生产系统产生，所述核酸序列对一种AAV类型的预测的AAV VP1氨基酸序列进行编码。然而，产生和制造过程提供了上文所描述的衣壳蛋白的异质群体。

在某些实施例中，提供了产生具有突变AAV8衣壳的重组AAV，相对于未经修饰的AAV8衣壳，所述突变AAV8衣壳具有一种或多种改善的性质。与AAV8相比，这种改善的性质可以包含例如增加的效价和/或增加的相对转导效率。在某些实施例中，突变体可以包含AAV8G264A/G515A(SEQ ID NO:21)、AAV8G264A/G541A(SEQ ID NO:23)、 AAV8G515A/G541A(SEQID NO:25)或AAV8 G264A/G515A/G541A(SEQ ID NO:27)。在某些实施例中，提供了对这些突变AAV8衣壳进行编码的核酸序列。在某些实施例中，在以下中提供核酸序列：例如SEQ IDNO:20(AAV8 G264A/G515A)、SEQ ID NO:22 (AAV8G264A/G541A)、SEQ ID NO:24(AAV8G515A/G541A)或SEQ ID NO:26(AAV8 G264A/G515A/G541A)。在某些实施例中，AAV8突变体可以是N499Q、N459Q、 N305Q/N459Q、N305QN499Q、N459Q、N305Q/N459Q、N305q/N499Q或N205Q、N459Q 或N305Q/N459Q、N499Q。在某些实施例中，这些突变与G264A/G541A突变组合。在某些实施例中，突变是AAV8 G264A/G541A/N499Q(SEQ ID NO:115)、AAV8 G264A/G541A/N459Q(SEQ ID NO:116)、AAV8 G264A/G541A/N305Q/N459Q(SEQ ID NO:117)、AAV8 G264A/G541A/N305Q/N499Q(SEQ ID NO:118)、 G264A/G541A/N459Q/N499Q(SEQ ID NO:119)或AAV8 G264A/G541A/N305Q/N459Q/ N499Q(SEQ ID NO:120)。在其它实施例中，可以选择单个突变体，如AAV8N263A、 AAV8N514A、AAV8N540A。在某些实施例中，基于与AAV8的比对，可以将其它AAV 突变为在这些或对应NG对中具有改变。这种AAV可以是进化枝E AAV。参见例如实例2(SEQ ID NO:9)中所描述的AAV8突变体。

在某些实施例中，AAV8突变体避免改变位置N57、N94、N263、N305、G386、Q467、N479和/或N653处的NG对。在某些实施例中，其它AAV避免了在使用AAV8编号作为参考如基于与AAV8的比对所确定的对应N位置处的突变。

在某些实施例中，提供了产生具有突变AAV9衣壳的重组AAV，相对于未经修饰的AAV9衣壳，所述突变AAV9衣壳具有一种或多种改善的性质。与AAV9相比，这种改善的性质可以包含例如增加的效价和/或增加的相对转导效率。在某些实施例中，突变 AAV9衣壳可以包含例如AAV9 G330/G453A(SEQ ID NO:29)、AAV9G330A/G513A(SEQ ID NO:31)、AAV9G453A/G513A(SEQ ID NO:33)和/或AAV9 G330/G453A/G513A(SEQ ID NO:35)。在某些实施例中，提供了对这些突变AAV9衣壳进行编码的核酸序列。在某些实施例中，在以下中提供核酸序列：例如SEQ ID NO:28(9G330AG453A)、SEQ ID NO:30(9G330AG513A)、SEQ ID NO:32(9G453AG513A)、SEQ ID NO:34 (9G330AG453AG513A)。在某些实施例中，基于与AAV9的比对，可以将其它AAV突变为在这些或对应NG对中具有这种改变。这种AAV可以是进化枝FAAV。

在某些实施例中，具有进化枝A、进化枝B、进化枝C或进化枝D的突变AAV衣壳的rAAV可以被工程化成具有与上文针对进化枝E和进化枝F鉴定的NG对相对应的 NG对的氨基酸修饰。在某些实施例中，进化枝A(例如，AAV)突变体可以包含在参考SEQ ID NO:1(AAV1)的编号的位置N303、N497或N303/N497处的突变。在某些实施例中，突变体是N497Q。在某些实施例中，AAV3B突变体可以包含在参考SEQ ID NO:2的编号的位置N302、N497或N302/N497处的突变。在某些实施例中，突变体是 N497Q。在某些实施例中，AAV5突变体可以包含在参考SEQ ID NO:3的编号的位置 N302、N497或N302/N497处的突变。在某些实施例中，突变体是N497Q。

在不希望受理论束缚的情况下，质谱揭示了衣壳上的许多位置处的天冬酰胺的脱酰胺化，作为存在多种VP同种型的解释，先前没有针对AAV进行描述。另外地，脱酰胺化的分布和程度在多种载体纯化方法中是一致的，这表明此现象独立于载体处理而发生。通过将一些天冬酰胺分别突变为天冬氨酸来探索这些脱酰胺化的功能显著性。这些突变的子集不仅影响颗粒组装的效率，而且还影响载体在体外和体内两者转导靶细胞的能力。将这些脱酰胺化的残基从头建模到AAV8结构中也揭示了存在这些脱酰胺化事件的结构证据，并为AAV8衣壳为什么能耐受氨基酸同一性和性质的这些变化提供了计算解释。使用AAV9和各种另外的AAV可以看到几乎相同的脱氨基化发现。因此，通过先前未知的AAV衣壳结构异质性表征rAAV。

在本文报告的研究中，发现广泛的天冬酰胺和偶发的谷氨酰胺脱酰胺化有17个残基受影响。控制AAV8脱酰胺化的因素(主要是初级序列和3D结构约束)在整个AAV 种系发生中很可能是保守的，因为迄今为止分析的所有血清型都表现出惊人地类似的修饰图案。因此，脱酰胺化是所有未来AAV治疗剂开发中的潜在地关键因素。

有了这一发现，就有动力去探索AAV脱酰胺化的功能影响。AAV载体衣壳的多聚体性质、经过修饰的衣壳残基的程度和数量以及在载体颗粒组合物中所产生的镶嵌的多样性对此分析提出了一些特殊挑战。可能在较简单的蛋白质环境中充分参数化转译后修饰(PTM)影响的实验库不直接应用于AAV衣壳分析。例如，将不可能纯化或甚至富集用于特定脱酰胺化的载体物种的制剂以直接和单独地测试其功能。

天冬氨酸的基因取代是试图在给定位点处强制修饰的近似的一种方法。除先前指出的具有内源性(镶嵌的)脱酰胺化对基因(完整的)脱酰胺化的衣壳组装上的位置特异性修饰的分布之间的差异之外，数据还指出了用于解释此数据的另外的考虑因素。例如，观察到N263D突变体相对于wtAAV8的转导损失>50倍(图8B)。考虑到基因转化后在此位置处的天冬氨酸含量变化将微不足道，这令人惊讶；N263在wtAAV8中被99％脱酰胺化。这种差异的一种解释是，经过基因编码的天冬氨酸和天冬酰胺脱酰胺化产物的分子是不同的(L-天冬氨酸对推定的L/D-异天冬氨酸:L/D-天冬氨酸的3:1混合物)。因此，基因近似在一些位置处可能不足。另一个残基(即高度保守的N57)也不耐受天冬氨酸的取代，尽管其在AAV8和AAV9中被分别平均80％和97％脱酰胺化(图8B和 11)。在此，残留的完整酰胺可以通过镶嵌效应缓冲wt制剂的活性，尽管还检测了与其它天冬酰胺发生串扰的可能性，从而混淆了N57的分析；当位置57酰胺被诱变保存时，相邻N66变得显著脱酰胺化(对于AAV8为N57Q、G58A和G58S；对于AAV9为N57Q 和G58A；数据未示出)。这是根据突变体的质谱分析检测到的唯一明显串扰的情况，但这突出显示了解释功能丧失诱变数据的另一种复杂情况。

鉴于这些警告，通过时程和功能获得诱变实验开发了脱酰胺化的影响的证据。数据与NG位点的子集在与非常早的时间点脱酰胺化相关的功能丧失中的作用一致。据知，先前没有报告过这种现象。实际上，通过对很短的半衰期载体NG脱酰胺化的新颖观察获知了用于鉴定这种衰变的特定实验程序；考虑到观察到的自发脱酰胺化的速度，将早期样品在冰箱中保存甚至一天将很可能减少其与较晚时间点样品的区别。在实验室和其它制造组中常规进行将处理后几天或几周内载体制剂的活性进行比较的储存稳定性实验，但是这些比较几乎总是使用至少7天龄的载体材料进行的，此时大部分或全部活性衰减(以及NG位点脱酰胺化)完成。数据突出显示了过程干预或N稳定诱变方法产生改善的衣壳的机会。从更广泛的角度来看，考虑“脱酰胺化时钟”在AAV的自然生态中的作用也是所关注的，在这种情况下，这种现象将可能有利于来自用于下一轮感染的感染细胞的最新转译的病毒颗粒。

尽管存在一些突出的可能性，但并未探索NG脱酰胺化诱导的功能丧失的机制基础。在表面HVR环中找到AAV8和AAV9 VP3中的所有NG基序。在AAV8中，已知由于与细胞受体的相互作用而在转导中起着重要作用的NG 514和540定位在3重轴附近的区域中。虽然没有完全询问AAV8受体结合位点，但LamR受体与AAV8转导有关。这些研究鉴定出aa491-557对于这些相互作用很重要。与针对AAV8的受体结合相比，更好地表征了针对AAV9的受体结合，因为对衣壳的功能询问鉴定了AAV9半乳糖结合结构域中的残基。在这些残基中，发现单个天冬酰胺N515会以低水平(3％)进行脱酰胺化，而发现此结构域中的其它两个天冬酰胺N272和N470没有进行脱酰胺化。因此，尽管脱酰胺化可能影响半乳糖结合，但很可能仅在很小的程度上。

总之，鉴定出AAV载体脱酰胺化可能影响转导效率，并展示了稳定酰胺和改善载体性能的策略。未来的关键目标是将这些发现扩展到适当的动物模型系统，并开始考虑在更复杂的功能环境下的脱酰胺化的影响以及稳定化的变体的性能。组织向性和衣壳与免疫系统的相互作用可能受影响，并且必须仔细地评估。因为对于衣壳中的每个脱酰胺化的残基来说，这些复杂效应将可能很难最终确定，所以谨慎的做法是通过诱变靶向脱酰胺化中具有高批次间变异性的有限数量的残基以进行稳定化，因为成功地证明了可变 AAV8天冬酰胺459和499。另外地，使用质谱工作流程对载体制剂进行脱酰胺化分析可以证明有益于在制造的AAV基因疗法药物批次中实现功能一致性。

“重组AAV”或“rAAV”是含有两个元件的抗DNAse的病毒颗粒、AAV衣壳和至少含有包装在AAV衣壳内的非AAV编码序列的载体基因组。除非另有说明，否则此术语可以与短语“rAAV载体”互换使用。rAAV是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，因为其缺少任何功能性AAVrep基因或功能性AAV cap基因并且不能产生后代。在某些实施例中，仅AAV序列是AAV反向末端重复序列(ITR)，通常定位在载体基因组的5' 和3'最末端处，以允许定位在ITR之间的基因和调节序列包装在AAV衣壳内。

如本文所使用的，“载体基因组”是指包装在形成病毒颗粒的rAAV衣壳内部的核酸序列。这种核酸序列含有AAV反向末端重复序列(ITR)。在本文的实例中，载体基因组至少含有从5'到3'的AAV 5'ITR、一个或多个编码序列和AAV 3'ITR。可以选择来自 AAV2的ITR、不同于衣壳来源或除全长ITR之外的AAV。在某些实施例中，ITR来自与在产生或反式补充AAV期间提供rep功能的AAV来源相同的AAV。进一步地，可以使用其它ITR。进一步地，载体基因组含有引导基因产物表达的调节序列。在本文中更详细地讨论载体基因组的合适组分。

rAAV由AAV衣壳和载体基因组构成。AAV衣壳是vp1的异质群体、vp2的异质群体和vp3蛋白的异质群体的组装。如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异源”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有含有不同的经过修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白)。

如本文所使用的，与vp1、vp2和vp3蛋白(可替代地被称为同种型)结合使用的术语“异质的”是指衣壳内的vp1、vp2和vp3蛋白的氨基酸序列中的差异。AAV衣壳含有具有来自预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群体包括天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺化的天冬酰胺 (N)位置，并且任选地进一步包括其它脱酰胺化的氨基酸，其中脱酰胺化引起氨基酸变化和其它任选的修饰。

如本文所使用的，除非另有说明，否则vp蛋白的“亚群体”是指一组vp蛋白，所述一组vp蛋白具有至少一个限定的共同特性，并且由至少一个组成员到少于参考组的所有成员组成。例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群体”是至少一种(1)vp1 蛋白，并且少于组装的AAV衣壳中的所有vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群体”可以是一种(1)vp3蛋白到少于组装的AAV衣壳中的所有vp3蛋白。例如， vp1蛋白可以是vp蛋白的亚群体；vp2蛋白可以是vp蛋白的不同单独的亚群体，并且 vp3是组装的AAV衣壳中的vp蛋白的又另外的亚群体。在另一个实例中，vp1、vp2和 vp3蛋白可以含有具有不同修饰的亚群体，所述修饰例如至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺化的天冬酰胺，例如在天冬酰胺-甘氨酸对处。

除非另有说明，否则高度脱酰胺化的是指与在参考氨基酸位置处的预测的氨基酸序列相比，在参考的氨基酸位置处被至少45％脱酰胺化的、至少50％脱酰胺化的、至少60％脱酰胺化的、至少65％脱酰胺化的、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少97％、至少99％或高达约100％脱酰胺化的(例如，在基于SEQ ID NO:1[AAV1]、2[AAV3B]、4[AAV7]、5[AAVrh32.33]、6[AAV8]、7[AAV9]、9[AAV8 三重]或111[AAVhu37]的编号的氨基酸57处或在基于SEQ ID NO:3[AAV5]的编号的氨基酸56处的天冬酰胺的至少80％可以基于总vp1蛋白脱酰胺化或可以基于总vp1、vp2 和vp3蛋白脱酰胺化)。此类百分比可以使用2D凝胶、质谱技术或其它合适的技术来确定。

如本文所使用的，“脱酰胺化的”AAV是氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基已经被衍生为与在对应核酸序列中对其进行编码的残基不同的残基的AAV。

在不希望受理论束缚的情况下，AAV衣壳中的vp蛋白中的至少高度脱酰胺化的残基的脱酰胺化被认为本质上主要是非酶促的，这是由衣壳蛋白内的功能基团引起的，所述功能基团使所选天冬酰胺脱酰胺化，并在较小程度上使谷氨酰胺残基脱酰胺化。大多数脱酰胺化vp1蛋白的有效衣壳组装表明这些事件在衣壳组装之后发生，或者单独单体 (vp1、vp2或vp3)中的脱酰胺化在结构上具有良好的耐受性，并且在很大程度上不会影响组装动力学。VP1独特(VP1-u)区(约aa 1-137)中的广泛脱酰胺化通常被认为在细胞进入之前定位在内部，这表明VP脱酰胺化可以在衣壳组装之前发生。N的脱酰胺化可以通过其C端残基的骨架氮原子对Asn的侧链酰胺基碳原子进行亲核攻击而发生。据信形成了中间闭环的琥珀酰亚胺残基。然后，琥珀酰亚胺残基进行快速水解以产生最终产物天冬氨酸(Asp)或异天冬氨酸(IsoAsp)。因此，在某些实施例中，天冬酰胺(N 或Asn)的脱酰胺化产生Asp或IsoAsp，其可以通过琥珀酰亚胺中间体相互转化，例如如下文所展示的。

如本文所提供的，VP1、VP2或VP3中的每个脱酰胺化的N可以独立地是天冬氨酸(Asp)、异天冬氨酸(isoAsp)、天冬氨酸和/或Asp和isoAsp的互相转化的共混物或其组合。可以存在任何合适比率的α-和异天冬氨酸。例如，在某些实施例中，比率可以为 10:1到1:10天冬氨酸:异天冬氨酸、约50:50天冬氨酸:异天冬氨酸或约1:3天冬氨酸:异天冬氨酸或另一所选比率。

在某些实施例中，可以将一种或多种谷氨酰胺(Q)衍生(脱酰胺化)为谷氨酸(Glu)，即α-谷氨酸、γ-谷氨酸(Glu)或α-和γ-谷氨酸的共混物，其可以通过共同的戊二酰亚胺(glutarinimide)中间体相互转化。可以存在任何合适比率的α-和γ-谷氨酸。例如，在某些实施例中，比率可以为10:1到1:10α:γ、约50:50α:γ或约1:3α:γ或另一所选比率。

因此，rAAV包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的rAAV衣壳内具有脱酰胺化的氨基酸的亚群体，至少包含至少一种包括至少一个高度脱酰胺化的天冬酰胺的亚群体。另外，其它修饰可以包含异构化，特别是在所选天冬氨酸(D或Asp)残基位置处。在仍其它实施例中，修饰可以包含在Asp位置处的酰胺化。

在某些实施例中，AAV衣壳含有具有至少4个到至少约25个脱酰胺化的氨基酸残基位置的vp1、vp2和vp3的亚群体，与vp蛋白的经过编码的氨基酸序列相比，所述氨基酸残基位置中的至少1％到10％被脱酰胺化。这些中的大多数可以是N残基。然而， Q残基也可以被脱酰胺化。

在某些实施例中，rAAV具有含有vp1、vp2和vp3蛋白的AAV衣壳，所述蛋白具有包括在实例中提供的表中列出的位置处的两个、三个、四个或更多个脱酰胺化的残基的组合的亚群体，并通过引用并入本文中。rAAV中的脱酰胺化可以使用2D凝胶电泳和 /或质谱和/或蛋白质建模技术来确定。在线色谱可以使用Acclaim PepMap柱和与Q Exactive HF和NanoFlex源(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))联接的 ThermoUltiMate 3000RSLC系统(赛默飞世尔科技公司)执行。MS数据是使用用于Q Exactive HF的数据依赖性前20种方法获取的，所述方法从调查扫描(200-2000m/z) 中动态选择最丰富的尚未测序的前体离子。测序通过高能碰撞解离片段进行，其中通过预测性自动增益控制确定的靶值为1e5离子，并且以4m/z的窗口进行前体分离。以m/z 200以120,000的分辨率获取调查扫描。HCD光谱的分辨率可以在m/z 200下设置为 30,000，其中最大离子注入时间为50毫秒，并且归一化碰撞能量为30。S-透镜RF水平可以设置为50，以使消化肽所占据的m/z区达到最佳传输。可以从片段选择中排除具有单个、未分配或六个和更高电荷状态的前体离子。BioPharma Finder 1.0软件(赛默飞世尔科技公司)可以用于分析所获取的数据。对于肽作图，使用单进入蛋白FASTA数据库进行搜索，其中脲基甲基化设置为固定的修饰；并将氧化、脱酰胺化和磷酸化设置为可变修饰、10ppm质量准确度、高蛋白酶特异性和置信水平为0.8的MS/MS光谱。合适的蛋白酶的实例可以包含例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。脱酰胺化的肽的质谱鉴定相对简单，因为脱酰胺化向完整分子的质量添加了+0.984Da(-OH基团与-NH₂基团之间的质量差)。特定肽的脱酰胺化百分比通过将脱酰胺化的肽的质量面积除以脱酰胺化的和天然的肽的面积之和来确定。考虑到可能的脱酰胺化位点的数量，在不同位点处被脱酰胺化的同量异位物种可以在单个峰中共迁移。因此，源自具有多个潜在的脱酰胺化位点的肽的片段离子可以用于定位或区分多个脱酰胺化位点。在这些情况下，观察到的同位素图案内的相对强度可以用于特异性确定不同的脱酰胺化的肽异构体的相对丰度。此方法假设所有异构物种的片段化效率是相同的，并且在脱酰胺化位点上是独立的。本领域的技术人员将理解的是，可以使用这些说明性方法的多种变型。例如，合适的质谱仪可以包含例如四极杆飞行时间质谱仪(QTOF)，如Waters Xevo或Agilent 6530，或 Orbitrap仪器，如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(赛默飞世尔科技公司)。合适的液相色谱系统包含例如来自沃特世(Waters)的Acquity UPLC系统或Agilent系统(1100或 1200系列)。合适的数据分析软件可以包含例如MassLynx(沃特世)、Pinpoint和Petfinder (赛默飞世尔科技公司)、Mascot(矩阵科学公司(Matrix Science))、Peaks DB(生物信息学解决方案公司(Bioinformatics Solutions))。可以在例如X.Jin等人,于2017年6 月16日在线公开的《人类基因疗法方法》,第28卷,第5期,第255-267页中描述仍其它技术。

除脱酰胺化之外，可能发生不会导致一个氨基酸转化为不同的氨基酸残基的其它修饰。这种修饰可以包含乙酰化残基、异构化、磷酸化或氧化。

脱酰胺化的调节：在某些实施例中，AAV被修饰成改变天冬酰胺-甘氨酸对中的甘氨酸，以降低脱酰胺化。在其它实施例中，将天冬酰胺改变为不同的氨基酸，例如以较慢速率进行脱酰胺化的谷氨酰胺；或改变为缺乏酰胺基的氨基酸(例如，含有酰胺基的谷氨酰胺和天冬酰胺)；和/或改变为缺乏酰胺基的氨基酸(例如，含有胺基的赖氨酸、精氨酸和组氨酸)。如本文所使用的，缺乏酰胺或胺侧基的氨基酸是指例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸和/或脯氨酸。如所描述的修饰可以在经过编码的AAV氨基酸序列中存在的天冬酰胺-甘氨酸对中的一个、两个或三个天冬酰胺-甘氨酸对中。在某些实施例中，在所有四个天冬酰胺-甘氨酸对中没有进行此类修饰。本文提供了一种用于降低具有较低脱酰胺化速率的AAV和/或工程化AAV变体的脱酰胺化的方法。另外地或可替代地，可以将一种或多种其它酰胺氨基酸改变为非酰胺氨基酸以降低AAV的脱酰胺化。在某些实施例中，本文所描述的突变AAV衣壳含有天冬酰胺-甘氨酸对中的突变，使得甘氨酸变为丙氨酸或丝氨酸。突变AAV衣壳可以含有一个、两个或三个突变体，其中参考AAV天然地含有四个NG对。在某些实施例中，AAV衣壳可以含有一个、两个、三个或四个此类突变体，其中参考AAV天然地含有五个NG对。在某些实施例中，突变AAV衣壳含有NG 对中的仅单个突变。在某些实施例中，突变AAV衣壳含有两个不同的NG对中的突变。在某些实施例中，突变AAV衣壳含有定位在AAV衣壳中的结构上分开的位置中的两个不同的NG对中的突变。在某些实施例中，突变不在VP1独特区中。在某些实施例中，突变中的一个突变不在VP1独特区中。任选地，突变AAV衣壳不含有NG对中的修饰，但是含有突变以最小化或消除定位在NG对的外部的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺中的脱酰胺化。

在某些实施例中，提供了一种增加rAAV载体的效力的方法，所述方法包括使AAV衣壳工程化，这消除了野生型AAV衣壳中的NG中的一个或多个NG。在某些实施例中，“NG”的“G”的编码序列被工程为对另一种氨基酸进行编码。在下文的某些实例中，“S”或“A”被取代。然而，可以选择其它合适的氨基酸编码序列。参见例如下表，其中基于AAV8的编号，修饰针对以下位置中的至少一个位置的编码序列：N57+1、N263+1、 N385+1、N514+1、N540+1。在某些实施例中，AAV8突变体避免改变位置N57、N94、 N263、N305、Q467、N479和/或N653处的NG对。在某些实施例中，其它AAV避免了在使用AAV8编号作为参考如基于与AAV8的比对所确定的对应N位置处的突变。

这些氨基酸修饰可以通过常规的基因工程技术进行。例如，可以产生含有经过修饰的AAV vp密码子的核酸序列，其中修饰天冬酰胺-甘氨酸对中对甘氨酸进行编码的密码子中的一到三个密码子以对除甘氨酸之外的氨基酸进行编码。在某些实施例中，含有经过修饰的天冬酰胺密码子的核酸序列可以在天冬酰胺-甘氨酸对中的一到三个天冬酰胺- 甘氨酸对处被工程化，使得经过修饰的密码子对除天冬酰胺之外的氨基酸进行编码。每个经过修饰的密码子可以对不同的氨基酸进行编码。可替代地，改变的密码子中的一个或多个密码子可以对相同的氨基酸进行编码。在某些实施例中，这些经过修饰的AAV 核酸序列可以用于产生具有比天然衣壳脱酰胺化程度更低的衣壳的突变rAAV。此类突变rAAV可以具有降低的免疫原性和/或增加储存时的稳定性，特别是以悬浮液形式储存时的稳定性。

本文还提供了对具有降低的脱酰胺化的AAV衣壳进行编码的核酸序列。设计对此AAV衣壳进行编码的核酸序列在本领域的技术范围内，包含DNA(基因组或cDNA) 或RNA(例如，mRNA)。可以通过各种方法设计可以被密码子优化以在所选系统(即，细胞类型)中进行表达的此类核酸序列。可以使用在线可用的方法(例如，GeneArt)、公开的方法或提供密码子优化服务的公司(例如，DNA2.0)(加利福尼亚州门洛帕克市) 来执行此优化。例如，在美国国际专利公开第WO 2015/012924号中描述了一种密码子优化方法，其通过引用整体并入本文中。还参见例如美国专利公开第2014/0032186号和美国专利公开第2006/0136184号。适合的是，修饰产物的开放阅读框(ORF)的全长。然而，在一些实施例中，仅ORF的片段可以被改变。通过使用这些方法中的一种方法，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生对多肽进行编码的经过密码子优化的编码区的核酸片段。许多选项可用于对密码子进行实际改变或者可用于合成如在此所述地设计的密码子优化的编码区。此类改变或合成可以使用本领域普通技术人员已熟知的标准和常规分子生物学操作来进行。在一种方法中，通过标准方法合成各自长度为80-90 个核苷酸且跨越希望的序列的长度的一系列互补寡核苷酸对。这些寡核苷酸对被合成为使得在退火时它们形成80-90个碱基对的双链片段，这些双链片段含有黏性末端，例如在该对中的各寡核苷酸被合成来延伸超过与该对中另一寡核苷酸互补的区域3个、4个、 5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个碱基。每对寡核苷酸的单链末端被设计为用另一对寡核苷酸的单链末端退火。允许这些寡核苷酸对退火，并且然后允许约五至六个这些双链片段经由粘性单链末端一起退火，并且随后它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可获自加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(InvitrogenCorporation, Carlsbad,Calif)的

载体。然后通过标准方法对该构建体测序。制备由连接在一起的80到90个碱基对片段的5到6个片段(即约500个碱基对的片段)组成的这些构建体中的若干构建体，以使得整个希望的序列以一系列质粒构建体表示。然后用适当的限制性酶切割这些质粒的插入物并且将其连接在一起以形成最终构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中，并进行测序。另外的方法对于技术人员而言将立即是清楚的。另外，基因合成易于商购获得。

在某些实施例中，提供了AAV衣壳，所述AAV衣壳具有含有多个高度脱酰胺化的“NG”位置的AAV衣壳同种型(即，VP1、VP2、VP3)的异质群体。在某些实施例中，高度脱酰胺化的位置在下文参考预测的全长VP1氨基酸序列鉴定的位置中。在其它实施例中，衣壳基因被修饰成使得参考的“NG”被消融，并且突变体“NG”被工程化到另一个位置中。

在某些实施例中，AAV1由VP同种型的异质群体的衣壳组合物表征，基于如使用质谱所测定的衣壳中的VP蛋白的总量，所述VP同种型如下表所定义的被脱酰胺化。

在某些实施例中，在下文提供的如使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置处修饰AAV衣壳。合适的修饰包含上文的段落中描述的标记为脱酰胺化调节的修饰，其并入本文中。

在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。在某些实施例中，构建了AAV1突变体，其中保存了位置57、383、512和/或718 处的N之后的甘氨酸(即，保持未经修饰的)。在某些实施例中，在前一句中鉴定的四个位置处的NG与天然序列一起保存。残基编号基于公开的AAV1 VP1，在SEQ ID NO: 1中重现。

在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。

残基编号基于公开的AAV1序列，在SEQ ID NO:1中重现。

在某些实施例中，AAV3B由VP同种型的异质群体的衣壳组合物表征，基于如使用质谱所测定的衣壳中的VP蛋白的总量，所述VP同种型如下表所定义的被脱酰胺化。在某些实施例中，在下文提供的如使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置处修饰AAV衣壳。合适的修饰包含上文的段落中描述的标记为脱酰胺化调节的修饰，其并入本文中。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。在某些实施例中，构建了AAV3突变体，其中保存了位置57、 383、512和/或718处的N之后的甘氨酸(即，保持未经修饰的)。在某些实施例中，在前一句中鉴定的四个位置处的NG与天然序列一起保存。残基编号基于公开的AAV3B VP1，在SEQ ID NO:2中重现。在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。在某些实施例中，衣壳被修饰成在除“NG”对之外的位置处减少“N”或“Q”。残基编号基于公开的AAV3B序列，在SEQ ID NO:2中重现。

在某些实施例中，AAV5由VP同种型的异质群体的衣壳组合物表征，基于如使用质谱所测定的衣壳中的VP蛋白的总量，所述VP同种型如下表所定义的被脱酰胺化。在某些实施例中，在下文提供的如使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置处修饰AAV衣壳。合适的修饰包含上文的段落中描述的标记为脱酰胺化调节的修饰，其并入本文中。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。在某些实施例中，衣壳被修饰成在除“NG”对之外的位置处减少“N”或“Q”。残基编号基于公开的AAV5序列，在SEQ ID NO:3中重现。

在某些实施例中，AAV7由VP同种型的异质群体的衣壳组合物表征，基于如使用质谱所测定的衣壳中的VP蛋白的总量，所述VP同种型如下表所定义的被脱酰胺化。在某些实施例中，在下文提供的如使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置处修饰AAV衣壳。合适的修饰包含上文的段落中描述的标记为脱酰胺化调节的修饰，其并入本文中。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。在某些实施例中，衣壳被修饰成在除“NG”对之外的位置处减少“N”或“Q”。残基编号基于公开的AAV7序列，在SEQ ID NO:4中重现。

在某些实施例中，AAVrh32.33由VP同种型的异质群体的衣壳组合物表征，基于如使用质谱所测定的衣壳中的VP蛋白的总量，所述VP同种型如下表所定义的被脱酰胺化。在某些实施例中，在下文提供的如使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置处修饰AAV衣壳。合适的修饰包含上文的段落中描述的标记为脱酰胺化调节的修饰，其并入本文中。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。在某些实施例中，衣壳被修饰成在除“NG”对之外的位置处减少“N”或“Q”。残基编号基于公开的AAVrh32.33序列，在SEQ ID NO:5中重现。

在某些实施例中，AAV8由VP同种型的异质群体的衣壳组合物表征，基于如使用质谱所测定的衣壳中的VP蛋白的总量，所述VP同种型如下表所定义的被脱酰胺化。合适的修饰包含上文的段落中描述的标记为脱酰胺化调节的修饰，其并入本文中。在某些实施例中，在下文提供的如使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置处修饰AAV衣壳。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。例如，在某些实施例中，G可以例如在位置58、67、95、216、264、386、411、 460、500、515或541处被修饰为S或A。当NG57/58改变为NS57/58或NA57/58时，观察到脱酰胺化显著降低。然而，在某些实施例中，当NG改变为NS或NA时，观察到脱酰胺化增加。在某些实施例中，NG对的N被修饰为Q，同时保留G。在某些实施例中，NG对的两个氨基酸均被修饰。在某些实施例中，N385Q引起所述位置中的脱酰胺化显著降低。在某些实施例中，N499Q引起所述位置中的脱酰胺化显著增加。在某些实施例中，在定位在N263(例如，到N263A)处的对处进行NG突变。在某些实施例中，在定位在N514(例如，到N514A)处的对处进行NG突变。在某些实施例中，在定位在N540(例如，N540A)处的对处进行NG突变。在某些实施例中，含有多个突变和这些位置处的突变中的至少一个突变的AAV突变体被工程化。在某些实施例中，不在位置N57处进行突变。在某些实施例中，不在位置N94处进行突变。在某些实施例中，不在位置N305处进行突变。在某些实施例中，不在位置G386处进行突变。在某些实施例中，不在位置Q467处进行突变。在某些实施例中，不在位置N479处进行突变。在某些实施例中，不在位置N653处进行突变。在某些实施例中，衣壳被修饰成在除“NG”对之外的位置处减少“N”或“Q”。残基编号基于公开的AAV8序列，在SEQ IDNO:6中重现。

在某些实施例中，突变体可以包含AAV8 G264A/G515A(SEQ ID NO:21)、AAV8G264A/G541A(SEQ ID NO:23)、AAV8G515A/G541A(SEQ ID NO:25)或AAV8 G264A/G515A/G541A(SEQ ID NO:27)。在某些实施例中，提供了对这些突变AAV8 衣壳进行编码的核酸序列。在某些实施例中，在以下中提供核酸序列：例如SEQ ID NO: 20(AAV8 G264A/G515A)、SEQ ID NO:22(AAV8G264A/G541A)、SEQ ID NO:24 (AAV8G515A/G541A)或SEQ IDNO:26(AAV8 G264A/G515A/G541A)。在某些实施例中，AAV8突变体可以是N499Q、N459Q、N305Q/N459Q、N305QN499Q、N459Q、 N305Q/N459Q、N305q/N499Q或N205Q、N459Q或N305Q/N459Q、N499Q。在某些实施例中，这些突变与G264A/G541A突变组合。在某些实施例中，突变是AAV8 G264A/G541A/N499Q(SEQ ID NO:115)、AAV8 G264A/G541A/N459Q(SEQ ID NO:116)、AAV8 G264A/G541A/N305Q/N459Q(SEQ ID NO:117)、AAV8 G264A/G541A/N305Q/N499Q(SEQ ID NO:118)、G264A/G541A/N459Q/N499Q(SEQ ID NO:119)或AAV8 G264A/G541A/N305Q/N459Q/N499Q(SEQ ID NO:120)。还涵盖对这些AAV8突变体进行编码的核酸序列。

在某些实施例中，AAV9由VP同种型的异质群体的衣壳组合物表征，基于如使用质谱所测定的衣壳中的VP蛋白的总量，所述VP同种型如下表所定义的被脱酰胺化。在某些实施例中，在下文提供的如使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置处修饰AAV衣壳。合适的修饰包含上文的段落中描述的标记为脱酰胺化调节的修饰，其并入本文中。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。在某些实施例中，将AAV9衣壳编码位置N214/G215修饰为 N214Q，观察到其具有显著增加的脱酰胺化。在某些实施例中，在定位在N452(例如，到N452A)处的对处进行NG突变。在某些实施例中，不在位置N57处进行突变。在某些实施例中，含有多个突变和这些位置处的突变中的至少一个突变的AAV突变体被工程化。在某些实施例中，将人工NG引入到与下文所鉴定的位置之一不同的位置中。在某些实施例中，衣壳被修饰成在除“NG”对之外的位置处减少“N”或“Q”。残基编号基于公开的AAV9序列，在SEQ ID NO:7中重现。

另外地或可替代地，AAVhu37衣壳包括：vp1蛋白的异质群体，所述vp1蛋白作为对SEQ ID NO:36的氨基酸序列进行编码的核酸序列的产物；vp2蛋白的异质群体，所述vp2蛋白作为对SEQ ID NO:36的至少约氨基酸138到738的氨基酸序列进行编码的核酸序列的产物；以及vp3蛋白的异质群体，所述vp3蛋白作为对SEQ ID NO:36的至少氨基酸204到738进行编码的核酸序列的产物，其中：所述vp1蛋白、所述vp2蛋白和所述vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括SEQ ID NO:36中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化引起氨基酸变化。AAVhu37由例如在基于AAVhu37 VP1(SEQ ID NO:36)的编号的位置N57、N263、N385和/或N514 处具有高度脱酰胺化的残基表征。

如下表和实例中所示，在其它残基中也观察到脱酰胺化。在某些实施例中，在下文提供的如使用胰蛋白酶使用质谱所测定的范围内，在以下位置中的一个或多个位置中修饰AAVhu37衣壳。在某些实施例中，如本文所描述的修饰以下位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。例如，在某些实施例中，G可以例如在位置58、264、386或515 处被修饰为S或A。在一个实施例中，AAVhu37衣壳在位置N57/G58处修饰为N57Q 或G58A，以提供在此位置处具有降低的脱酰胺化的衣壳。在另一个实施例中，N57/G58 改变为NS57/58或NA57/58。然而，在某些实施例中，当NG改变为NS或NA时，观察到脱酰胺化增加。在某些实施例中，NG对的N被修饰为Q，同时保留G。在某些实施例中，NG对的两个氨基酸均被修饰。在某些实施例中，N385Q引起所述位置中的脱酰胺化显著降低。在某些实施例中，N499Q引起所述位置中的脱酰胺化显著增加。

在某些实施例中，AAVhu37可以具有这些或其它脱酰胺化的残基，例如通常小于10％和/或可以具有其它修饰，所述其它修饰包含甲基化(例如，约R487)(通常小于5％，在给定残基处更通常小于1％)、异构化(例如，在D97处)(通常小于5％，在给定残基处更通常小于1％)、磷酸化(例如，在存在的情况下，范围为约10％到约60％、或约 10％到约30％、或约20％到约60％)(例如，在S149、约S153、约S474、约T570、约 S665中的一个或多个处)或氧化(例如，在W248、W307、W307、M405、M437、M473、 W480、W480、W505、M526、M544、M561、W621、M637和/或W697中的一个或多个处)。任选地，W可以氧化成犬尿氨酸。

其它位置可以具有此类这些或其它修饰(例如，乙酰化或另外的脱酰胺化)。在某些实施例中，SEQ ID NO:37中提供了对AAVhu37 vp1衣壳蛋白进行编码的核酸序列。在其它实施例中，可以选择与SEQ ID NO:37具有70％到99.9％同一性的核酸序列以表达AAVhu37衣壳蛋白。在某些其它实施例中，核酸序列与SEQ ID NO:37至少约75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同或至少99％到99.9％相同。然而，可以选择对SEQ ID NO:36的氨基酸序列进行编码的其它核酸序列用于产生rAAVhu37衣壳。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:37 的核酸序列或与对SEQ ID NO:36进行编码的SEQ ID NO:37至少70％到99％相同、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:37的核酸序列或与对SEQ ID NO:36 的vp2衣壳蛋白(约aa 138到738)进行编码的SEQ ID NO:37的约nt 412到约nt 2214 至少70％到99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:37的约nt 610到约 nt 2214的核酸序列或与对SEQ ID NO:36的vp3衣壳蛋白(约aa 204到738)进行编码的nt SEQ ID NO:37至少70％到99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。参见其中的EP 2345731B1和SEQ ID NO: 88，其通过引用并入本文中。

如本文所使用的，“经过编码的氨基酸序列”是指基于被转译成氨基酸的参考的核酸序列的已知DNA密码子的转译而预测的氨基酸。下表展示了DNA密码子和二十种常见氨基酸，分别示出了单字母代码(SLC)和三个字母代码(3LC)。

rAAV载体

如上文所指示的，新颖AAV序列和蛋白可用于产生rAAV，并且还可用于重组AAV 载体，所述重组AAV载体可以是反义递送载体、基因疗法载体或疫苗载体。另外，本文描述的经过工程化的AAV衣壳可以用于工程化rAAV载体，以将多种合适的核酸分子递送到靶细胞和组织。

包装到AAV衣壳中并递送到宿主细胞的基因组序列通常至少由转基因及其调节序列和AAV反向末端重复序列(ITR)构成。单链AAV和自身互补(sc)AAV两者都涵盖在rAAV内。转基因是与载体序列异源的核酸编码序列，所述核酸编码序列对多肽、蛋白质、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制剂)或其它所关注的基因产物进行编码。核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录、转译和/或表达的方式与调节组分可操作地连接。

载体的AAV序列通常包括顺式作用的5'和3'反向末端重复序列(参见例如B.J.Carter,《细小病毒手册(Handbook of Parvoviruses)》,P.Tijsser编辑,CRC出版社,第155到168页(1990))。ITR序列的长度为约145bp。优选地，分子中使用了对ITR进行编码的基本上整个序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些ITR 序列的能力在本领域的技术范围内。(参见例如文本，如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning.A Laboratory Manual)》,第2版,冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory),纽约(1989)；以及K.Fisher等人,《病毒学杂志》,70:520532(1996))。在本发明中采用的这种分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关的调节元件侧接5'和3'AAV ITR序列。在一个实施例中，ITR来自与供应衣壳的AAV不同的AAV。在一个实施例中，ITR来自AAV2。已经描述了被称为ΔITR的5'ITR的缩短版本，其中缺失了D序列和末端解析位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5'和3'ITR。然而，可以选择来自其它AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得载体可以被称为假型的。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。

除重组AAV载体的上文鉴定的主要元件外，AAV载体还包含必需的常规控制元件，所述常规控制元件以允许其在用质粒载体转染或用由本发明产生的病毒感染的细胞中转录、转译和/或表达的方式与转基因可操作地连接。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与所关注的基因邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制所关注的基因的表达控制序列。

调节控制元件通常含有作为表达控制序列的一部分的启动子序列，例如定位在所选 5'ITR序列与编码序列之间。可以在本文所描述的载体中使用组成型启动子、可调节启动子[参见例如WO 2011/126808和WO 2013/04943]、组织特异性启动子或对生理学线索有应答的启动子。一种或多种启动子可以选自不同的来源，例如人巨细胞病毒(CMV) 立即早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)或神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏期相关启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素浓缩激素(MCH) 启动子、CBA、基质金属蛋白启动子(MPP)和鸡β-肌动蛋白启动子。除启动子之外，载体还可以含有一个或多个其它合适的转录起始、终止、增强子序列、有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定胞质mRNA的序列，例如，WPRE；增强转译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在期望时，增强经过编码的产物的分泌的序列。合适的增强子的实例是CMV增强子。其它合适的增强子包含适合于所期望的靶组织适应症的增强子。在一个实施例中，表达盒包括一种或多种表达增强子。在一个实施例中，表达盒含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以相同或彼此不同。例如，增强子可以包含CMV立即早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列分开。在仍另一个实施例中，表达盒进一步含有内含子，例如，鸡β-肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包含本领域已知的内含子，例如，如WO 2011/126808中描述的内含子。合适的polyA序列的实例包含例如SV40、SV50、牛生长激素(bGH)、人生长激素和合成polyA。任选地，可以选择一个或多个序列来稳定mRNA。这种序列的实例是经过修饰的WPRE序列，其可以在polyA序列的上游和编码序列的下游被工程化[参见例如MA Zanta-Boussif等人,《基因疗法(GeneTherapy)》(2009)16:605-619]。

这些rAAV特别适合于用于治疗目的和用于免疫的基因递送，包含诱导保护性免疫。进一步地，本发明的组合物还可以用于体外产生所期望的基因产物。对于体外产生，可以在用含有对所期望的产物进行编码的分子的rAAV转染宿主细胞并在允许表达的条件下培养细胞培养物之后从所期望的培养物中获得所期望的产物(例如，蛋白质)。然后可以根据需要纯化和分离所表达的产物。用于转染、细胞培养、纯化和分离的合适的技术是本领域的技术人员已知的。

治疗性转基因

由转基因编码的有用产物包含各种基因产物，所述基因产物替代缺陷型或有缺陷的基因，使失活或“敲除”、或“敲低”或减少以不期望的高水平表达或递送具有所期望的治疗效果的基因产物的基因的表达。在大多数实施例中，疗法将是“体细胞基因疗法”，即，将基因转移到不产生精子或卵子的人体细胞。在某些实施例中，转基因表达蛋白具有天然人序列的序列。然而，在其它实施例中，表达合成蛋白。此类蛋白质可以用于治疗人，或者在其它实施例中，被设计成用于治疗动物，包含如犬科或猫科群体等伴侣动物，或用于治疗与人群体接触的牲畜或其它动物。

合适的基因产物的实例可以包含与家族性高胆固醇血症、肌营养不良、囊性纤维化以及罕见疾或孤儿病相关的基因产物。此类罕见病的实例可以包含脊髓性肌萎缩症(SMA)、亨廷顿氏病(Huntingdon's Disease)、雷特综合征(Rett Syndrome)(例如，甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)；UniProtKB-P51608)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、杜兴型肌营养不良(Duchenne Type Muscular dystrophy)、弗里德里希共济失调(Friedrichs Ataxia)(例如，共济蛋白)、颗粒蛋白前体(PRGN)(与非阿尔茨海默氏病的大脑变性相关，包含额颞叶痴呆(FTD)、进行性非流利性失语症(PNFA)和语义性痴呆)等等。参见例如www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php；rarediseases.info.nih.gov/ diseases。

合适的基因的实例可以包含例如激素以及生长和分化因子，包含但不限于胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP1)、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞产生素(EPO)(包含例如人、犬或猫epo)、结缔组织生长因子 (CTGF)、神经营养因子包含例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子α超家族(包含TGFα、激活素、抑制素)中的任一种、或骨形态发生蛋白(BMP)BMP 1-15中的任一种、生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白、集聚蛋白中的任一种、信号素/脑衰蛋白、纺锤蛋白-1和纺锤蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶的家族中的任一种。

其它有用的转基因产物包含调节免疫系统的蛋白质，包含但不限于细胞因子和淋巴因子，如血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1到IL-36(包含例如人白细胞介素IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-11、IL-12、IL-13、 IL-18、IL-31、IL-35)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体。由免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些包含但不限于免疫球蛋白IgG、 IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T 细胞受体、单链T细胞受体、MHC I类和II类分子以及经过工程化的免疫球蛋白和MHC 分子。例如，在某些实施例中，可以将rAAV抗体设计成递送犬或猫抗体，例如抗IgE、抗IL31、抗CD20、抗NGF、抗GnRH。有用的基因产物还包含补体调节蛋白，如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2、CD59和C1酯酶抑制剂(C1-INH)。

仍其它有用的基因产物包含用于激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体中的任一种。本发明涵盖用于胆固醇调节和/或脂质调节的受体，包含低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL) 受体和清除剂受体。本发明还涵盖基因产物，如类固醇激素受体超家族的成员，包含糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其它核受体。另外，有用的基因产物包含转录因子，如jun、fos、max、mad、血清响应因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD 和肌生成素、含ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、 CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、威尔姆斯肿瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白(例如，GATA-3)和带翼螺旋蛋白的叉头家族。

其它有用的基因产物包含氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨酸琥珀酸合成酶、用于治疗精氨琥珀酸裂解酶缺乏症的精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、恒河猴甲胎蛋白(AFP)、恒河猴绒毛膜促性腺激素(CG)、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚β合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调节子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白基因产物[例如，迷你或微小肌营养不良蛋白]。仍其它有用的基因产物还包含如可以用于酶替代疗法的酶，所述酶替代疗法可用于由于酶活性不足而导致的多种病状。例如，可以将含有甘露糖-6-磷酸的酶用于溶酶体贮积病的疗法中(例如，合适的基因包含对β-葡糖醛酸酶(GUSB)进行编码的基因)。

在某些实施例中，可以在基因编辑系统中使用rAAV，所述系统可以涉及一种rAAV或多种rAAV原液的共同施用。例如，rAAV可以被工程化以递送SpCas9、SaCas9、 ARCUS、Cpf1和其它合适的基因编辑构建体。

仍其它有用的基因产物包含用于治疗血友病的基因产物，所述血友病包含血友病B (包含因子IX)和血友病A(包含因子VIII及其变体，如异二聚体和B缺失结构域的轻链和重链；美国专利第6,200,560号和美国专利第6,221,349号)。在一些实施例中，迷你基因包括因子VIII重链的前57个碱基对，所述重链对10个氨基酸信号序列以及人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列进行编码。在替代性实施例中，迷你基因进一步包括A1 和A2结构域以及来自B结构域的N端的5个氨基酸和/或B结构域的C端的85个氨基酸以及A3、C1和C2结构域。在又其它实施例中，在单个迷你基因中提供了对因子VIII 重链和轻链进行编码的核酸，所述单个迷你基因由对B结构域的14个氨基酸进行编码的42个核酸分开[美国专利第6,200,560号]。

其它有用的基因产物包含非天然存在的多肽，如具有含有插入、缺失或氨基酸取代的非天然存在的氨基酸序列的嵌合或杂合多肽。例如，单链工程化的免疫球蛋白可能在某些免疫受损的患者中有用。其它类型的非天然存在的基因序列包含反义分子和催化核酸，如核酶，其可以用于减少靶标的过度表达。

减少和/或调节基因表达对于治疗由细胞过度增殖表征的过度增殖性病状(如癌症和牛皮癣)是特别期望的。靶多肽包含与正常细胞相比在过度增殖性细胞中专门产生或以更高水平产生的那些多肽。靶抗原包含由癌基因如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的多肽。除作为靶抗原的癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护方案的靶多肽包含由B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施例中，所述可变区还被用作自身免疫疾病的靶抗原。其它肿瘤相关多肽也可以用作靶多肽，如在肿瘤细胞中以较高水平存在的多肽，包含由单克隆抗体17-1A识别的多肽和叶酸结合多肽。

其它合适的治疗性多肽和蛋白质包含可以用于通过为针对与自身免疫相关的靶标赋予广泛基础的保护性免疫应答而治疗患有自身免疫性疾病和病症的个体的多肽和蛋白质，所述靶标包含细胞受体和产生“自身”定向抗体的细胞。T细胞介导的自身免疫性疾病包含类风湿关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、干燥综合征(

syndrome)、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、牛皮癣、韦格纳氏肉芽肿病(Wegner's granulomatosis)、克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎。这些疾病中的每种疾病由与内源性抗原结合并引发与自身免疫性疾病相关的炎性级联的T细胞受体(TCR) 表征。

可以通过rAAV递送的另外的说明性基因包含但不限于与糖原贮积病或1A型缺乏症(GSD1)相关的葡萄糖-6-磷酸酶；与PEPCK缺乏症相关的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)；细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5)，也被称为与癫痫发作和严重的神经发育障碍相关的丝氨酸/苏氨酸激酶9(STK9)；与半乳糖血症相关的半乳糖-1磷酸尿嘧啶转移酶；与苯丙酮尿症(PKU)相关的苯丙氨酸羟化酶；与枫糖尿病相关的支链α- 酮酸脱氢酶；与1型酪氨酸血症相关的延胡索酰乙酰乙酸水解酶；与甲基丙二酸血症相关的甲基丙二酰辅酶A变位酶；与中链乙酰辅酶A缺乏症相关的中链酰基辅酶A脱氢酶；与鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症相关的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；与瓜氨酸血症相关的精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)；卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)缺乏症；甲基丙二酸血症(MMA)；尼曼-皮克病(Niemann-Pickdisease)(C1型)；丙酸血症(PA)；与家族性高胆固醇血症(FH)相关的低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白；与克里格勒-纳贾尔病(Crigler-Najjar disease)相关的UDP-葡萄糖醛糖基转移酶；与严重联合免疫缺陷病相关的腺苷脱氨酶；与痛风和莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)相关的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；与生物素酶缺乏症相关的生物素酶；与法布里病(Fabry disease)相关的α-半乳糖苷酶A(α-GalA)；与威尔逊氏病(Wilson's Disease)相关的 ATP7B；与戈谢病(Gaucher disease)2和3型相关的β-葡糖脑苷脂酶；与泽尔韦格氏综合征(Zellweger syndrome)相关的过氧化物酶体膜蛋白70kDa；与异染性脑白质营养不良相关的芳基硫酸酯酶A(ARSA)；与克拉伯病(Krabbe disease)相关的半乳糖脑苷脂酶(GALC)酶；与庞贝病(Pompe disease)相关的α-葡糖苷酶(GAA)；与尼曼-皮克病(Nieman Pick disease)A型相关的鞘磷脂酶(SMPD1)基因；与成人发作II型瓜氨酸血症(CTLN2)相关的精氨琥珀酸合酶；与脲循环病症相关的氨基甲酰磷酸合酶1 (CPS1)；与脊髓性肌萎缩症相关的存活运动神经元(SMN)蛋白；与法伯脂肪肉芽肿病(Farberlipogranulomatosis)相关的神经酰胺酶；与GM2神经节苷脂病和泰伊-萨克斯二氏病和山霍夫氏病(Tay-Sachs and Sandhoff diseases)相关的b-己糖胺酶；与天冬氨酰葡糖尿症相关的天冬氨酰葡糖胺酶；与岩藻糖苷贮积症相关的岩藻糖苷酶；与α- 甘露糖苷贮积症相关的α-甘露糖苷酶；与急性间歇性卟啉症(AIP)相关的胆色素原脱氨酶；用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症(肺气肿)的α-1抗胰蛋白酶；用于治疗因地中海贫血或肾衰竭引起的贫血的促红细胞生成素；用于治疗缺血性疾病的血管内皮生长因子、血管生成素-1和成纤维细胞生长因子；用于治疗如例如在动脉粥样硬化、血栓形成或栓塞中所看见的阻塞的血管的血栓调节蛋白和组织因子途径抑制剂；用于治疗帕金森氏病(Parkinson's disease)的芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和酪氨酸羟化酶(TH)；与受磷蛋白、肌浆(内质)网腺苷三磷酸酶2(SERCA2)呈反义或为其突变体形式的β肾上腺素能受体；用于治疗充血性心力衰竭的心脏腺苷酸环化酶；用于治疗各种癌症的肿瘤抑制基因，如p53；用于治疗炎症和免疫病症以及癌症的细胞因子，如各种白细胞介素之一；用于治疗肌营养不良的肌营养不良蛋白或迷你肌营养不良蛋白以及肌萎缩相关蛋白或迷你肌萎缩相关蛋白；以及用于治疗糖尿病的胰岛素或GLP-1。

在某些实施例中，本文所描述的rAAV可以用于治疗黏多糖贮积症(MPS)病症。这种rAAV可以含有携带对用于治疗MPS I(贺勒、贺勒-施艾氏和施艾氏综合征(Hurler,Hurler-Scheie and Scheie syndromes))的α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPS II(亨特氏综合征(Hunter syndrome))的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPSIII A、B、C和D(沙费利波综合征(Sanfilipposyndrome))的磺酰胺酶(SGSH)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPS IV A和B(莫基奥综合征(Morquio syndrome))的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶(GALNS)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPS VI(马罗托-拉米氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome))的芳基硫酸酯酶B(ARSB)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPSI IX(透明质酸酶缺乏症)的透明质酸酶进行编码的核酸序列；以及对用于治疗MPS VII(斯赖综合征(Sly syndrome))的β-葡糖醛酸苷酶进行编码的核酸序列。

免疫原性转基因

在一些实施例中，通过向患有癌症的受试者施用含有rAAV载体的rAAV，包括对与癌症相关的基因产物(例如，肿瘤抑制因子)进行编码的核酸的rAAV载体可以用于治疗癌症。在一些实施例中，通过向患有癌症的受试者施用含有rAAV载体的rAAV，包括对抑制与癌症相关的基因产物(例如，致癌基因)的表达的小干扰核酸(例如， shRNA、miRNA)进行编码的核酸的rAAV载体可以用于治疗癌症。在一些实施例中，包括对与癌症相关的基因产物(或抑制与癌症相关的基因表达的功能性RNA)进行编码的核酸的rAAV载体可以用于研究目的，例如研究癌症或鉴定治疗癌症的治疗剂。以下是已知与癌症的发展相关的示例性基因(例如，癌基因和肿瘤抑制因子)的非限制性列表：AARS、ABCB1、ABCC4、ABI2、ABL1、ABL2、ACK1、ACP2、ACY1、ADSL、 AK1、AKR1C2、AKT1、ALB、ANPEP、ANXA5、ANXA7、AP2M1、APC、ARHGAP5、ARHGEF5、ARID4A、ASNS、ATF4、ATM、ATP5B、ATP5O、AXL、BARD1、BAX、 BCL2、BHLHB2、BLMH、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTK、CANX、CAP1、CAPN1、 CAPNS1、CAV1、CBFB、CBLB、CCL2、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCT5、 CCYR61、CD24、CD44、CD59、CDC20、CDC25、CDC25A、CDC25B、CDC2L5、CDK10、 CDK4、CDK5、CDK9、CDKL1、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、 CDKN2D、CEBPG、CENPC1、CGRRF1、CHAF1A、CIB1、CKMT1、CLK1、CLK2、 CLK3、CLNS1A、CLTC、COL1A1、COL6A3、COX6C、COX7A2、CRAT、CRHR1、 CSF1R、CSK、CSNK1G2、CTNNA1、CTNNB1、CTPS、CTSC、CTSD、CUL1、CYR61、 DCC、DCN、DDX10、DEK、DHCR7、DHRS2、DHX8、DLG3、DVL1、DVL3、E2F1、 E2F3、E2F5、EGFR、EGR1、EIF5、EPHA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC3、ETV1、ETV3、ETV6、F2R、FASTK、FBN1、FBN2、FES、FGFR1、FGR、FKBP8、FN1、FOS、 FOSL1、FOSL2、FOXG1A、FOXO1A、FRAP1、FRZB、FTL、FZD2、FZD5、FZD9、 G22P1、GAS6、GCN5L2、GDF15、GNA13、GNAS、GNB2、GNB2L1、GPR39、GRB2、GSK3A、GSPT1、GTF2I、HDAC1、HDGF、HMMR、HPRT1、HRB、HSPA4、HSPA5、 HSPA8、HSPB1、HSPH1、HYAL1、HYOU1、ICAM1、ID1、ID2、IDUA、IER3、IFITM1、 IGF1R、IGF2R、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5、IL1B、ILK、ING1、IRF3、ITGA3、ITGA6、 ITGB4、JAK1、JARID1A、JUN、JUNB、JUND、K-α-1、KIT、KITLG、KLK10、KPNA2、 KRAS2、KRT18、KRT2A、KRT9、LAMB1、LAMP2、LCK、LCN2、LEP、LITAF、LRPAP1、 LTF、LYN、LZTR1、MADH1、MAP2K2、MAP3K8、MAPK12、MAPK13、MAPKAPK3、 MAPRE1、MARS、MAS1、MCC、MCM2、MCM4、MDM2、MDM4、MET、MGST1、 MICB、MLLT3、MME、MMP1、MMP14、MMP17、MMP2、MNDA、MSH2、MSH6、 MT3、MYB、MYBL1、MYBL2、MYC、MYCL1、MYCN、MYD88、MYL9、MYLK、NEO1、NF1、NF2、NFKB1、NFKB2、NFSF7、NID、NINE、NMBR、NME1、NME2、NME3、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH4、NPM1、NQO1、NR1D1、NR2F1、NR2F6、 NRAS、NRG1、NSEP1、OSM、PA2G4、PABPC1、PCNA、PCTK1、PCTK2、PCTK3、 PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDPK1、PEA15、PFDN4、PFDN5、PGAM1、PHB、PIK3CA、 PIK3CB、PIK3CG、PIM1、PKM2、PKMYT1、PLK2、PPARD、PPARG、PPIH、PPP1CA、 PPP2R5A、PRDX2、PRDX4、PRKAR1A、PRKCBP1、PRNP、PRSS15、PSMA1、PTCH、 PTEN、PTGS1、PTMA、PTN、PTPRN、RAB5A、RAC1、RAD50、RAF1、RALBP1、 RAP1A、RARA、RARB、RASGRF1、RB1、RBBP4、RBL2、REA、REL、RELA、RELB、 RET、RFC2、RGS19、RHOA、RHOB、RHOC、RHOD、RIPK1、RPN2、RPS6 KB1、RRM1、SARS、SELENBP1、SEMA3C、SEMA4D、SEPP1、SERPINH1、SFN、SFPQ、 SFRS7、SHB、SHH、SIAH2、SIVA、SIVA TP53、SKI、SKIL、SLC16A1、SLC1A4、 SLC20A1、SMO、鞘磷脂磷酸二酯酶1(SMPD1)、SNAI2、SND1、SNRPB2、SOCS1、 SOCS3、SOD1、SORT1、SPINT2、SPRY2、SRC、SRPX、STAT1、STAT2、STAT3、 STAT5B、STC1、TAF1、TBL3、TBRG4、TCF1、TCF7L2、TFAP2C、TFDP1、TFDP2、 TGFA、TGFB1、TGFBI、TGFBR2、TGFBR3、THBS1、TIE、TIMP1、TIMP3、TJP1、 TK1、TLE1、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF6、 TNFSF7、TNK1、TOB1、TP53、TP53BP2、TP5313、TP73、TPBG、TPT1、TRADD、 TRAM1、TRRAP、TSG101、TUFM、TXNRD1、TYRO3、UBC、UBE2L6、UCHL1、 USP7、VDAC1、VEGF、VHL、VIL2、WEE1、WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WT1、XRCC1、YES1、YWHAB、YWHAZ、ZAP70和ZNF9。

rAAV载体可以包括对调节细胞凋亡的蛋白质或功能性RNA进行编码的作为转基因的核酸。以下是与细胞凋亡相关的基因的非限制性列表，并且对这些基因的产物及其同源物进行编码的以及对抑制这些基因及其同源物的表达的小干扰核酸(例如，shRNA、 miRNA)进行编码的核酸在本发明的某些实施例中用作转基因：RPS27A、ABL1、AKT1、 APAF1、BAD、BAG1、BAG3、BAG4、BAK1、BAX、BCL10、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、 BCL2L10、BCL2L11、BCL2L12、BCL2L13、BCL2L2、BCLAF1、BFAR、BID、BIK、 NAIP、BIRC2、BIRC3、XIAP、BIRC5、BIRC6、BIRC7、BIRC8、BNIP1、BNIP2、BNIP3、 BNIP3L、BOK、BRAF、CARD10、CARD11、NLRC4、CARD14、NOD2、NOD1、CARD6、 CARDS、CARDS、CASP1、CASP10、CASP14、CASP2、CASP3、CASP4、CASP5、 CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CFLAR、CIDEA、CIDEB、CRADD、DAPK1、DAPK2、 DFFA、DFFB、FADD、GADD45A、GDNF、HRK、IGF1R、LTA、LTBR、MCL1、NOL3、 PYCARD、RIPK1、RIPK2、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF14、TNFRSF19、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、 TNFRSF25、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、TNFRSF9、TNFSF10、TNFSF14、TNFSF18、 CD40LG、FASLG、CD70、TNFSF8、TNFSF9、TP53、TP53BP2、TP73、TP63、TRADD、 TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4和TRAF5。

有用的转基因产物还包含miRNA。miRNA和其它小干扰核酸通过靶信使RNA (mRNA)的靶RNA转录物裂解/降解或转译抑制来调节基因表达。miRNA是天然表达的，通常作为最终的19-25种非转译的RNA产物。miRNA通过与靶mRNA的3'非转译区(UTR)的序列特异性相互作用展现出其活性。这些内源表达的miRNA形成发夹前体，所述发夹前体随后被加工成miRNA双链体，并且被进一步加工成“成熟的”单链 miRNA分子。这种成熟的miRNA引导多蛋白复合物miRISC，所述多蛋白复合物基于与成熟的miRNA的互补性来鉴定靶mRNA的靶位点，例如在3'UTR区中。

在方法的某些实施例中，以下miRNA基因及其同源物的非限制性列表可用作转基因或由转基因编码的小干扰核酸(例如，miRNA海绵体、反义寡核苷酸、TuD RNA) 的靶标：hsa-let-7a、hsa-let-7a^*、hsa-let-7b、hsa-let-7b^*、hsa-let-7c、hsa-let-7c^*、hsa-let-7d、 hsa-let-7d^*、hsa-let-7e、hsa-let-7e^*、hsa-let-7f、hsa-let-7f-1^*、hsa-let-7f-2^*、hsa-let-7g、 hsa-let-7g^*、hsa-let-71、hsa-let-71^*、hsa-miR-1、hsa-miR-100、hsa-miR-100^*、hsa-miR-101、 hsa-miR-101^*、hsa-miR-103、hsa-miR-105、hsa-miR-105^*、hsa-miR-106a、hsa-miR-106a^*、 hsa-miR-106b、hsa-miR-106b^*、hsa-miR-107、hsa-miR-10a、hsa-miR-10a^*、hsa-miR-10b、 hsa-miR-10b^*、hsa-miR-1178、hsa-miR-1179、hsa-miR-1180、hsa-miR-1181、hsa-miR-1182、 hsa-miR-1183、hsa-miR-1184、hsa-miR-1185、hsa-miR-1197、hsa-miR-1200、hsa-miR-1201、 hsa-miR-1202、hsa-miR-1203、hsa-miR-1204、hsa-miR-1205、hsa-miR-1206、 hsa-miR-1207-3p、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1208、hsa-miR-122、hsa-miR-122^*、 hsa-miR-1224-3p、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-1225-3p、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1226、 hsa-miR-1226^*、hsa-miR-1227、hsa-miR-1228、hsa-miR-1228^*、hsa-miR-1229、 hsa-miR-1231、hsa-miR-1233、hsa-miR-1234、hsa-miR-1236、hsa-miR-1237、hsa-miR-1238、 hsa-miR-124、hsa-miR-124^*、hsa-miR-1243、hsa-miR-1244、hsa-miR-1245、hsa-miR-1246、 hsa-miR-1247、hsa-miR-1248、hsa-miR-1249、hsa-miR-1250、hsa-miR-1251、hsa-miR-1252、 hsa-miR-1253、hsa-miR-1254、hsa-miR-1255a、hsa-miR-1255b、hsa-miR-1256、 hsa-miR-1257、hsa-miR-1258、hsa-miR-1259、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、 hsa-miR-125b、hsa-miR-125b-1^*、hsa-miR-125b-2^*、hsa-miR-126、hsa-miR-126^*、 hsa-miR-1260、hsa-miR-1261、hsa-miR-1262、hsa-miR-1263、hsa-miR-1264、hsa-miR-1265、hsa-miR-1266、hsa-miR-1267、hsa-miR-1268、hsa-miR-1269、hsa-miR-1270、hsa-miR-1271、 hsa-miR-1272、hsa-miR-1273、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-1274a、hsa-miR-1274b、 hsa-miR-1275、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-1276、hsa-miR-1277、hsa-miR-1278、hsa-miR-1279、hsa-miR-128、hsa-miR-1280、hsa-miR-1281、hsa-miR-1282、hsa-miR-1283、hsa-miR-1284、hsa-miR-1285、hsa-miR-1286、hsa-miR-1287、hsa-miR-1288、hsa-miR-1289、 hsa-miR-129^*、hsa-miR-1290、hsa-miR-1291、hsa-miR-1292、hsa-miR-1293、 hsa-miR-129-3p、hsa-miR-1294、hsa-miR-1295、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-1296、 hsa-miR-1297、hsa-miR-1298、hsa-miR-1299、hsa-miR-1300、hsa-miR-1301、hsa-miR-1302、 hsa-miR-1303、hsa-miR-1304、hsa-miR-1305、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307、hsa-miR-1308、hsa-miR-130a、hsa-miR-130a^*、hsa-miR-130b、hsa-miR-130b^*、hsa-miR-132、hsa-miR-132^*、 hsa-miR-1321、hsa-miR-1322、hsa-miR-1323、hsa-miR-1324、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、 hsa-miR-134、hsa-miR-135a、hsa-miR-135a^*、hsa-miR-135b、hsa-miR-135b^*、hsa-miR-136、 hsa-miR-136^*、hsa-miR-137、hsa-miR-138、hsa-miR-138-1^*、hsa-miR-138-2^*、 hsa-miR-139-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-141、hsa-miR-141^*、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-143^*、hsa-miR-144、 hsa-miR-144^*、hsa-miR-145、hsa-miR-145^*、hsa-miR-146a、hsa-miR-146a^*、 hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-147、hsa-miR-147b、hsa-miR-148a、 hsa-miR-148a^*、hsa-miR-148b、hsa-miR-148b^*、hsa-miR-149、hsa-miR-149^*、hsa-miR-150、 hsa-miR-150^*、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-152、hsa-miR-153、hsa-miR-154、hsa-miR-154^*、hsa-miR-155、hsa-miR-155^*、hsa-miR-15a、hsa-miR-15a^*、hsa-miR-15b、hsa-miR-15b^*、hsa-miR-16、hsa-miR-16-1^*、hsa-miR-16-2^*、hsa-miR-17、hsa-miR-17^*、hsa-miR-181a、hsa-miR-181a^*、hsa-miR-181a-2^*、hsa-miR-181b、hsa-miR-181c、hsa-miR-181c^*、hsa-miR-181d、hsa-miR-182、hsa-miR-182^*、hsa-miR-1825、hsa-miR-1826、 hsa-miR-1827、hsa-miR-183、hsa-miR-183^*、hsa-miR-184、hsa-miR-185、hsa-miR-185^*、 hsa-miR-186、hsa-miR-186^*、hsa-miR-187、hsa-miR-187^*、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-18a、hsa-miR-18a^*、hsa-miR-18b、hsa-miR-18b^*、hsa-miR-190、hsa-miR-190b、hsa-miR-191、hsa-miR-191^*、hsa-miR-192、hsa-miR-192^*、hsa-miR-193a-3p、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193b、hsa-miR-193b^*、hsa-miR-194、hsa-miR-194^*、hsa-miR-195、 hsa-miR-195^*、hsa-miR-196a、hsa-miR-196a^*、hsa-miR-196b、hsa-miR-197、hsa-miR-198、 hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-19a、hsa-miR-19a^*、 hsa-miR-19b、hsa-miR-19b-1^*、hsa-miR-19b-2^*、hsa-miR-200a、hsa-miR-200a^*、hsa-miR-200b、hsa-miR-200b^*、hsa-miR-200c、hsa-miR-200c^*、hsa-miR-202、hsa-miR-202^*、 hsa-miR-203、hsa-miR-204、hsa-miR-205、hsa-miR-206、hsa-miR-208a、hsa-miR-208b、 hsa-miR-20a、hsa-miR-20a^*、hsa-miR-20b、hsa-miR-20b^*、hsa-miR-21、hsa-miR-21^*、 hsa-miR-210、hsa-miR-211、hsa-miR-212、hsa-miR-214、hsa-miR-214^*、hsa-miR-215、 hsa-miR-216a、hsa-miR-216b、hsa-miR-217、hsa-miR-218、hsa-miR-218-1^*、hsa-miR-218-2^*、 hsa-miR-219-1-3p、hsa-miR-219-2-3p、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-22^*、 hsa-miR-220a、hsa-miR-220b、hsa-miR-220c、hsa-miR-221、hsa-miR-221^*、hsa-miR-222、 hsa-miR-222^*、hsa-miR-223、hsa-miR-223^*、hsa-miR-224、hsa-miR-23a、hsa-miR-23a^*、 hsa-miR-23b、hsa-miR-23b^*、hsa-miR-24、hsa-miR-24-1^*、hsa-miR-24-2^*、hsa-miR-25、 hsa-miR-25^*、hsa-miR-26a、hsa-miR-26a-1^*、hsa-miR-26a-2^*、hsa-miR-26b、hsa-miR-26b^*、 hsa-miR-27a、hsa-miR-27a^*、hsa-miR-27b、hsa-miR-27b^*、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-297、hsa-miR-298、hsa-miR-299-3p、 hsa-miR-299-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29a^*、hsa-miR-29b、hsa-miR-296-1^*、 hsa-miR-296-2^*、hsa-miR-29c、hsa-miR-29c^*、hsa-miR-300、hsa-miR-301a、hsa-miR-301b、 hsa-miR-302a、hsa-miR-302a^*、hsa-miR-302b、hsa-miR-302b^*、hsa-miR-302c、 hsa-miR-302c^*、hsa-miR-302d、hsa-miR-302d^*、hsa-miR-302e、hsa-miR-302f、hsa-miR-30a、 hsa-miR-30a^*、hsa-miR-30b、hsa-miR-30b^*、hsa-miR-30c、hsa-miR-30c-1^*、hsa-miR-30c-2^*、 hsa-miR-30d、hsa-miR-30d^*、hsa-miR-30e、hsa-miR-30e^*、hsa-miR-31、hsa-miR-31^*、 hsa-miR-32、hsa-miR-32^*、hsa-miR-320a、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-320d、 hsa-miR-323-3p、hsa-miR-323-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-325、 hsa-miR-326、hsa-miR-328、hsa-miR-329、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-330-5p、 hsa-miR-331-3p、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-335、hsa-miR-335^*、hsa-miR-337-3p、 hsa-miR-337-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-339-5p、 hsa-miR-33a、hsa-miR-33a^*、hsa-miR-33b、hsa-miR-33b^*、hsa-miR-340、hsa-miR-340^*、 hsa-miR-342-3p、hsa-miR-342-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-346、hsa-miR-34a、hsa-miR-34a^*、 hsa-miR-34b、hsa-miR-34b^*、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-361-3p、 hsa-miR-361-5p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-363、hsa-miR-363^*、 hsa-miR-365、hsa-miR-367、hsa-miR-367^*、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-370、 hsa-miR-371-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373、hsa-miR-373^*、hsa-miR-374a、 hsa-miR-374a^*、hsa-miR-374b、hsa-miR-374b^*、hsa-miR-375、hsa-miR-376a、hsa-miR-376a^*、 hsa-miR-376b、hsa-miR-376c、hsa-miR-377、hsa-miR-377^*、hsa-miR-378、hsa-miR-378^*、hsa-miR-379、hsa-miR-379^*、hsa-miR-380、hsa-miR-380^*、hsa-miR-381、hsa-miR-382、 hsa-miR-383、hsa-miR-384、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-410、hsa-miR-411、 hsa-miR-411^*、hsa-miR-412、hsa-miR-421、hsa-miR-422a、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-424、hsa-miR-424^*、hsa-miR-425、hsa-miR-425^*、hsa-miR-429、hsa-miR-431、 hsa-miR-431^*、hsa-miR-432、hsa-miR-432^*、hsa-miR-433、hsa-miR-448、hsa-miR-449a、 hsa-miR-449b、hsa-miR-450a、hsa-miR-450b-3p、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-451、 hsa-miR-452、hsa-miR-452^*、hsa-miR-453、hsa-miR-454、hsa-miR-454^*、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-484、hsa-miR-485-3p、 hsa-miR-485-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-487a、hsa-miR-487b、 hsa-miR-488、hsa-miR-488^*、hsa-miR-489、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-490-5p、 hsa-miR-491-3p、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-492、hsa-miR-493、hsa-miR-493^*、hsa-miR-494、 hsa-miR-495、hsa-miR-496、hsa-miR-497、hsa-miR-497^*、hsa-miR-498、hsa-miR-499-3p、 hsa-miR-499-5p、hsa-miR-500、hsa-miR-500^*、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-501-5p、 hsa-miR-502-3p、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-503、hsa-miR-504、hsa-miR-505、hsa-miR-505^*、 hsa-miR-506、hsa-miR-507、hsa-miR-508-3p、hsa-miR-508-5p、hsa-miR-509-3-5p、 hsa-miR-509-3p、hsa-miR-509-5p、hsa-miR-510、hsa-miR-511、hsa-miR-512-3p、 hsa-miR-512-5p、hsa-miR-513a-3p、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-513b、hsa-miR-513c、 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miRNA抑制其靶向的mRNA的功能，并且因此抑制由mRNA编码的多肽的表达。因此，(部分地或全部地)阻断miRNA的活性(例如，沉默miRNA)可以有效地诱导或恢复表达被抑制的多肽的表达(使多肽去抑制)。在一个实施例中，通过多种方法中的任一种抑制细胞中的miRNA活性来实现对由miRNA的mRNA靶标编码的多肽的去抑制。例如，可以通过与和miRNA互补或基本上互补的小干扰核酸(例如，反义寡核苷酸、miRNA海绵体、TuD RNA)杂交来实现阻断miRNA的活性，由此阻断miRNA 与其靶mRNA的相互作用。如本文所使用的，与miRNA基本上互补的小干扰核酸是能够与miRNA杂交并阻断miRNA活性的小干扰核酸。在一些实施例中，与miRNA基本上互补的小干扰核酸是除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、 11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个碱基之外完全与miRNA互补的小干扰核酸。“miRNA抑制剂”是阻断miRNA功能、表达和/或加工的药剂。例如，这些分子包含但不限于抑制miRNA与Drosha复合物相互作用的微小RNA特异性反义分子、微小RNA海绵体、强诱饵RNA(TuD RNA)和微小RNA寡核苷酸(双链、发夹、短寡核苷酸)。

仍其它有用的转基因可以包含对赋予病原体被动免疫的免疫球蛋白进行编码的转基因。“免疫球蛋白分子”是含有共价偶联在一起并且能够与抗原特异性组合的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的免疫活性部分的蛋白质。免疫球蛋白分子可以是任何类型 (例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1和IgA2)或子类。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。

“免疫球蛋白重链”是含有免疫球蛋白的抗原结合结构域的至少一部分和免疫球蛋白重链的可变区的至少一部分或免疫球蛋白重链的恒定区的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白源性重链与免疫球蛋白基因超家族的成员具有显著的氨基酸序列同源性区。例如，Fab片段中的重链是免疫球蛋白源性重链。

“免疫球蛋白轻链”是含有免疫球蛋白的抗原结合结构域的至少一部分和免疫球蛋白轻链的可变区的至少一部分或恒定区的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白源性轻链与免疫球蛋白基因超家族的成员具有显著的氨基酸同源性区。

“免疫粘附素”是嵌合的抗体样分子，所述分子将结合蛋白(通常是受体、配体或细胞粘附分子)的功能结构域与免疫球蛋白恒定结构域组合，所述免疫球蛋白恒定结构域通常包含铰链和Fc区。

“片段抗原结合(Fab)片段”是与抗原结合的抗体上的区。其由重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。

基于寻求针对其进行保护的疾病的病原体(causative agent/pathogen)选择抗病原体构建体。这些病原体可以是病毒、细菌或真菌来源的，并且可以用于预防人感染人类疾病，或用于非人哺乳动物或其它动物以预防兽医疾病。

rAAV可以包含对抗体以及具体地针对病毒病原体的中和抗体进行编码的基因。这种抗病毒抗体可以包含针对甲型流感、乙型流感和丙型流感中的一种或多种的抗流感抗体。A型病毒是最具毒性的人类病原体。与流行病相关的甲型流感的血清型包含：H1N1，其引起1918年的西班牙流感和2009年的猪流感；H2N2，其引起1957年的亚洲流感； H3N2，其引起1968年的香港流感；H5N1，其引起2004年的禽流感；H7N7；H1N2； H9N2；H7N2；H7N3；以及H10N7。其它靶病原性病毒包含：沙粒病毒(包含funin、马丘波病毒(machupo)和拉沙热病毒(Lassa))、丝状病毒(包含马尔堡病毒(Marburg) 和埃博拉病毒(Ebola))、汉坦病毒、小核糖核酸病毒(picornoviridae)(包含鼻病毒、艾柯病毒)、冠状病毒、副粘病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、囊膜病毒、柯萨奇病毒、JC病毒、细小病毒B19、副流感病毒、腺病毒、呼吸道肠道病毒、来自痘病毒家族的天花病毒(variola)(大天花(天花(Smallpox))和牛痘(Vaccinia/Cowpox)以及水痘-带状疱疹病毒(伪狂犬病)。病毒性出血热是由沙粒病毒家族(拉沙热)(此家族也与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)相关)、丝状病毒(埃博拉病毒)和汉坦病毒(普马拉病毒(puremala))的成员引起的。小核糖核酸病毒(鼻病毒的亚家族)的成员与人普通感冒相关。冠状病毒家族包含多种非人类病毒，如传染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠炎病毒(猪)、猪血凝素脑脊髓炎病毒(猪)、猫传染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(狗)。已经推定人呼吸道冠状病毒与普通感冒、非甲型、乙型或丙型肝炎以及突发性急性呼吸综合症(SARS)相关。副粘病毒家族包含副流感病毒1型、副流感病毒3型、牛副流感病毒3型、腮腺炎病毒属(腮腺炎病毒)、副流感病毒2型、副流感病毒4型、新城疫病毒(鸡)、牛瘟、麻疹病毒(包含麻疹和犬瘟热)和肺炎病毒(包含呼吸道合胞病毒(RSV)。细小病毒家族包含猫细小病毒(猫肠炎)、猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒和猪细小病毒。腺病毒家族包含引起呼吸道疾病的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。因此，在某些实施例中，本文所描述的rAAV 载体可以被工程化以表达抗埃博拉抗体(例如，2G4、4G7、13C6)、抗流感抗体(例如， FI6、CR8033)和抗RSV抗体(例如，帕利珠单抗(palivizumab)、莫维珠单抗 (motavizumab))。

也可以选择针对细菌病原体的中和抗体构建体用于本发明中。在一个实施例中，中和抗体构建体针对细菌本身。在另一个实施例中，中和抗体构建体针对由细菌产生的毒素。空气传播的细菌病原体的实例包含例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(脑膜炎)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)(肺炎)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(肺炎)、伪鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei)(肺炎)、鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei)(肺炎)、不动杆菌(肺炎)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、腔隙莫拉菌(Moraxella lacunata)、产碱杆菌属(Alkaligenes)、心杆菌属(Cardiobacterium)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(流感)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)(百日咳)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(肺炎/发烧)、肺炎军团菌(Legionellapneumonia) (军团病)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(肺炎)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)(肺炎)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(肺结核(TB))、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)(TB)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)(肺炎)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)(肺炎)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)(炭疽)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(肺炎)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(猩红热)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎)、白喉棒状杆菌 (Corynebacteria diphtheria)(白喉)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)(肺炎)。

rAAV可以包含对抗体以及具体地针对细菌病原体(如炭疽的病原体，即由炭疽杆菌产生的毒素)的中和抗体进行编码的基因。已经描述了针对形成类毒素的三种肽之一的保护剂(PA)的中和抗体。其它两种多肽由致死因子(LF)和水肿因子(EF)组成。抗PA中和抗体已经被描述为有效针对炭疽进行被动地免疫。参见例如美国专利第 7,442,373号；R.Sawada-Hirai等人,《基于免疫的疫苗疗法杂志(J Immune Based Ther Vaccines)》2004；2:5.(2004年5月12日在线)。已经描述和/或可以产生仍其它抗炭疽毒素中和抗体。类似地，针对其它细菌和/或细菌毒素的中和抗体可以用于产生如本文所描述的AAV递送性抗病原体构建体。

针对传染病的抗体可以由寄生虫或真菌引起，所述真菌包含例如曲霉菌(Aspergillus species)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、匍枝根霉(Rhixpusstolonifer)、密丛毛霉 (Mucorplumbeaus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasm capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、青霉菌(Penicillium species)、干草小多孢菌(Micropolyspora faeni)、普通高温放线菌 (Thermoactinomyces vulgaris)、互隔交链孢霉(Alternaria alternate)、枝孢菌 (Cladosporium species)、长蠕孢属(Helminthosporium)和葡萄穗霉(Stachybotrys species)。

rAAV可以包含对抗体以及具体地针对以下疾病的致病因子的中和抗体进行编码的基因：如阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、GBA相关的帕金森氏病(GBA-PD)、类风湿关节炎(RA)、肠易激综合症(IBS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、癌症、肿瘤、全身性硬化症、哮喘和其它疾病。此类抗体可以是但不限于例如α-突触核蛋白、抗血管内皮生长因子(VEGF)(抗VEGF)、抗VEGFA、抗PD-1、抗PDL1、抗CTLA-4、抗 TNF-α、抗IL-17、抗IL-23、抗IL-21、抗IL-6、抗IL-6受体、抗IL-5、抗IL-7、抗XII 因子、抗IL-2、抗HIV、抗IgE、抗肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、抗-notch 2/3、抗-notch 1、抗OX40、抗erb-b2受体酪氨酸激酶3(ErbB3)、抗ErbB2、抗β细胞成熟抗原、抗 B淋巴细胞刺激剂、抗CD20、抗HER2、抗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、抗制瘤素M (OSM)、抗淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白、抗CCL20、抗血清淀粉样蛋白P组分 (SAP)、抗脯氨酰羟化酶抑制剂、抗CD38、抗糖蛋白IIb/IIIa、抗CD52、抗-CD30、抗IL-1β、抗表皮生长因子受体、抗CD25、抗RANK配体、抗补体系统蛋白C5、抗CD11a、抗CD3受体、抗α-4(α4)整联蛋白、抗RSV F蛋白和抗整联蛋白α₄β₇。对于本领域的技术人员来说，仍其它病原体和疾病将是显而易见的。其它合适的抗体可以包含可用于治疗阿尔茨海默氏病的抗体，例如抗β淀粉样蛋白(例如，克雷内珠单抗(crenezumab)、索拉珠单抗(solanezumab)、阿杜卡尼单抗(aducanumab))、抗β淀粉样蛋白原纤维、抗β淀粉样蛋白斑块、抗τ、巴匹珠单抗(bapineuzamab)以及其它抗体。用于治疗多种适应症的其它合适的抗体包含描述于例如于2016年10月27日提交的 PCT/US2016/058968中公开为WO 2017/075119A1的抗体。

rAAV载体产生

供产生AAV病毒载体(例如，重组(r)AAV)之用，表达盒可以携带在递送到包装宿主细胞的任何合适的载体(例如，质粒)上。可在本发明使用的质粒可以被工程化，使得其适合于在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及其它细胞中进行体外复制和包装。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可以由本领域的技术人员容易地设计。

用于产生和分离适合于用作载体的AAV的方法是本领域已知的。通常参见例如Grieger和Samulski,2005,“腺相关病毒作为基因疗法载体：载体开发、产生和临床应用(Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vector development,production and clinical applications)”,《生化工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin/Biotechnol)》99: 119-145；Buning等人,2008,“腺相关病毒载体技术的最新开发(Recent developments in adeno-associated virus vectortechnology),”《基因医学杂志(J.Gene Med)》10:717-733；以及下文引用的参考文献，这些参考文献中的每个参考文献通过引用整体并入本文中。为了将转基因包装到病毒粒子中，ITR是在与含有表达盒的核酸分子相同的构建体中需要的顺式的唯一AAV组分。cap和rep基因可以反式供应。

在一个实施例中，本文所描述的表达盒被工程化到基因元件(例如，穿梭质粒)，所述基因元件将其上携带的免疫球蛋白构建体序列转移到包装宿主细胞中以产生病毒载体。在一个实施例中，所选基因元件可以通过任何合适的方法递送到AAV包装细胞，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的粒料、病毒感染和原生质体融合。也可以制备稳定的AAV包装细胞。可替代地，表达盒可以用于产生除AAV之外的病毒载体，或用于在体外产生抗体的混合物。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如《分子克隆：实验室手册》,由Green和Sambrook编辑,冷泉港实验室出版社, 冷泉港,纽约(2012)。

术语“AAV中间体”或“AAV载体中间体”是指缺少包装在其中的所期望的基因组序列的组装的rAAV衣壳。这些也可以被称为“空”衣壳。此类衣壳可以不含有表达盒的可检测基因组序列，或者含有不足以实现基因产物的表达的仅部分包装的基因组序列。这些空衣壳是无功能的以将所关注的基因转移到宿主细胞。

可以使用已知的技术产生本文所描述的重组腺相关病毒(AAV)。参见例如WO2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此类方法涉及培养含有对AAV衣壳蛋白进行编码的核酸序列的宿主细胞；功能性rep基因；至少由AAV 反向末端重复序列(ITR)和转基因构成的表达盒；以及足够的辅助功能以允许将表达盒包装到AAV衣壳蛋白中。已经描述了产生衣壳的方法、其编码序列以及产生rAAV病毒载体的方法。参见例如Gao等人,《美国国家科学院院刊》100(10):6081-6086(2003) 和US 2013/0045186A1。

在一个实施例中，提供了一种可用于产生重组AAV的产生细胞培养物。这种细胞培养物含有在宿主细胞中表达AAV衣壳蛋白的核酸；适合于包装到AAV衣壳中的核酸分子，例如含有AAV ITR和对基因产物进行编码的非AAV核酸序列的载体基因组，所述非AAV核酸序列可操作地连接到引导产物在宿主细胞中的表达的序列；以及足够的 AAV rep功能和腺病毒辅助功能，以允许将核酸分子包装到重组AAV衣壳中。在一个实施例中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如，人胚肾293细胞以及其它细胞)或昆虫细胞(例如，杆状病毒)构成。

任选地，rep功能由除提供衣壳的AAV之外的AAV提供。例如，rep可以是但不限于AAV1 rep蛋白、AAV2 rep蛋白、AAV3 rep蛋白、AAV4 rep蛋白、AAV5 rep蛋白、 AAV6 rep蛋白、AAV7 rep蛋白、AAV8 rep蛋白；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78 和rep40/52；或其片段；或另一种来源。任选地，rep和cap序列在细胞培养物中位于同一基因元件上。rep序列与cap基因之间可以存在间隔子。这些AAV或突变AAV衣壳序列中的任一种都可以在引导其在宿主细胞中表达的外源性调节控制序列的控制下。

在一个实施例中，在合适的细胞培养物(例如，HEK 293)细胞中制造细胞。用于制造本文所描述的基因疗法载体的方法包含本领域众所周知的方法，如产生用于产生基因疗法载体的质粒DNA、产生载体以及纯化载体。在一些实施例中，基因疗法载体是 AAV载体，并且所产生的质粒是对AAV基因组和所关注的基因进行编码的AAV顺式质粒、含有AAV rep和cap基因的AAV反式质粒以及腺病毒辅助质粒。载体产生过程可以包含方法步骤，如开始细胞培养、进行细胞传代、接种细胞、用质粒DNA转染细胞、将转染后培养基交换为无血清培养基以及采集含载体的细胞和培养基。所采集的含载体的细胞和培养基在本文中被称为粗细胞采集物。在又另一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染来将基因疗法载体引入到昆虫细胞中。关于这些产生系统的综述，通常参见例如Zhang等人,2009,“用于大规模重组腺相关病毒产生的腺病毒-腺相关病毒杂合体(Adenovirus-adeno-associated virushybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production)”，《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》20:922-929，这些参考文献中的每个参考文献的内容通过引用整体并入本文中。在以下美国专利中也描述了制备和使用这些及其它AAV产生系统的方法，这些美国专利中的每个美国专利的内容通过引用整体并入本文中：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213； 6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。

此后，粗细胞采集物可以是本主题的方法步骤，如浓缩载体采集物、渗滤载体采集物、微流化载体采集物、核酸酶消化载体采集物、过滤经过微流化的中间体、通过色谱粗纯化、通过超速离心法粗纯化、通过切向流过滤进行缓冲液交换和/或调配和过滤以制备大量载体。

在高盐浓度下进行两步亲和色谱纯化，然后使用阴离子交换树脂色谱来纯化载体药物产物并去除空衣壳。这些方法在于2016年12月9日提交的国际专利申请第 PCT/US2016/065970号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第 62/322,071号以及于2015年12月11日提交并题为“AAV9的可分级纯化方法(Scalable PurificationMethod for AAV9)”的第62/226,357号中更详细地描述，这些申请通过引用并入本文中。关于AAV8的纯化方法，参见于2016年12月9日提交的国际专利申请第 PCT/US2016/065976号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第 62/322,098号以及于2015年12月11日提交的第62/266,341号，并且关于rh10的纯化方法，参见于2016年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US16/66013号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,055号和还于2015年12月11 日提交的题为“AAVrh10的可分级纯化方法(Scalable Purification Method for AAVrh10)”的第62/266,347号，并且关于AAV1的纯化方法，参见于2016年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US2016/065974号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,083号和于2015年12月11日提交的题为“AAV1的可分级纯化方法 (Scalable Purification Method for AAV1)”的第62/26,351号，这些申请通过引用全部并入本文中。

为了计算空颗粒和完整颗粒的含量，将所选样品(例如，在本文的实例中经过碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化的制剂，其中GC#＝颗粒#)的VP3带体积相对于加载的 GC颗粒进行作图。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试品峰的带状体积中的颗粒的数量。然后将加载的每20μL颗粒数量(pt)乘以50，以得到颗粒(pt)/mL。将Pt/mL 除以GC/mL得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL得到空pt/mL。空 pt/mL除以pt/mL并且×100得到空颗粒的百分比。

通常，用于测定具有包装的基因组的空衣壳和AAV载体颗粒的方法是本领域已知的。参见例如Grimm等人,《基因疗法》(1999)6:1322-1330；Sommer等人,《分子疗法(Molec.Ther.)》(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，所述方法包含使经过处理的 AAV原液经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如在缓冲液中含有3-8％三乙酸盐的梯度凝胶)，然后运行凝胶直到分离出样品材料，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地是尼龙)上。然后，将抗AAV衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选地 B1抗AAV2单克隆抗体(Wobus等人,《病毒学杂志》(2000)74:9281-9293)。然后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合并且含有一种用于检测与初级抗体的结合的装置，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗IgG抗体，最优选地是与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地是化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以从柱级分中提取样品并在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE上样缓冲液中加热，并且在预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上解析衣壳蛋白。可以根据制造商的说明使用SilverXpress(加利福尼亚州英杰公司)或其它合适的染色方法(即SYPRO红宝石色或考马斯染色)进行银染色。在一个实施例中，可以通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中的AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用DNase I(或另一种合适的核酸酶)消化以去除外源性DNA。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的DNA序列具有特异性的TaqMan^TM荧光探针进一步稀释和扩增样品。在Applied BiosystemsPrism 7700序列检测系统上测量每种样品达到定义的荧光水平所需的周期的数量(阈值周期，Ct)。含有与AAV载体中所含序列相同的序列的质粒DNA用于在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品获得的周期阈值(Ct)的值用于通过相对于质粒标准曲线的Ct 值对其进行归一化来确定载体基因组效价。也可以使用基于数字PCR的端点测定。

一方面，使用了经过优化的q-PCR方法，所述方法利用了广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可从凯杰公司(Qiagen)商购获得)。更具体地，经过优化的qPCR基因组效价测定与标准测定类似，不同之处在于在DNase I消化之后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，然后进行热失活。合适地，以等于样品大小的量用蛋白酶K 缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可以浓缩2倍或更多倍。通常，蛋白酶K处理为约 0.2mg/mL，但是可以在0.1g/mL到约1mg/mL之间变化。处理步骤通常在约55℃下进行持续约15分钟，但是可以在较低温度(例如，约37℃到约50℃)下进行持续较长的时间段(例如，约20分钟到约30分钟)，或者在较高的温度(例如，最高约60℃)下进行持续较短的时间段(例如，约5到10分钟)。类似地，热失活通常在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如，约70℃到约90℃)并且时间延长(例如，约20 分钟到约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并如标准测定中所描述的进行 TaqMan分析。

另外地或可替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了用于通过ddPCR确定单链和自身互补AAV载体基因组效价的方法。参见例如M.Lock等人,《人类基因疗法方法》2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.电子出版2014 年2月14日。

简而言之，用于从基因组缺陷型AAV中间体中分离具有包装的基因组序列的rAAV颗粒的方法涉及使包括重组AAV病毒颗粒和AAV衣壳蛋白中间体的悬浮液经受高效液相色谱，其中AAV病毒颗粒和AAV中间体与在高pH下平衡的强阴离子交换树脂结合，并经受盐梯度，同时监测洗脱液在约260和约280下的紫外线吸光度。可以基于所选 AAV调整pH。参见例如WO2017/160360(AAV9)、WO2017/100704(AAVrh10)、WO 2017/100676(例如，AAV8)和WO2017/100674(AAV1)，这些通过引用并入本文中。在此方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱的级分中收集AAV完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可以将经过渗滤的产物应用于有效捕获AAV2血清型的Capture Select^TM Poros-AAV2/9亲和树脂(生命科技公司(Life Technologies))上。在这些离子条件下，显著百分比的残留的细胞DNA和蛋白质流过柱，而AAV颗粒则被有效捕获。

组合物和用途

本文提供了一种组合物，所述组合物含有至少一种rAAV原液(例如，rAAV原液或突变rAAV原液)和任选的载剂、赋形剂和/或防腐剂。rAAV原液是指多个rAAV载体，所述多个rAAV载体的量与例如在下文关于浓度和剂量单位的讨论中描述的量相同。

如本文所使用的，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物等。这种介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。补充性活性成分也可以并入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。递送媒剂(如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可以用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以被调配用于递送，所述转基因被包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。

在一个实施例中，组合物包含适合于递送到受试者的最终调配物，所述组合物是例如缓冲到生理上相容的pH和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，调配物中存在一种或多种表面活性剂。在另一个实施例中，可以将组合物作为稀释以施用于受试者的浓缩物运输。在其它实施例中，可以在施用时将组合物冻干并重构。

可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如

F68[BASF]，也被称为泊洛沙姆(Poloxamer)188，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆) 命名，后跟三个数字：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。

以足够的量施用载体以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以便提供治疗益处，而不会产生过度的副作用或具有医学上可接受的生理作用，这可以由医学领域的技术人员确定。常规和药学上可接受的施用途径包含但不限于直接递送到所期望的器官(例如，肝脏(任选地通过肝动脉)、肺、心脏、眼睛、肾脏)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其它亲本施用途径。如果需要的话，可以组合施用途径。

病毒载体的剂量将主要取决于如所治疗的病状、患者的年龄、体重和健康状况等因素，并且因此在患者之间可能有所不同。例如，病毒载体的治疗有效人剂量通常在约25到约1000微升到约100mL溶液范围内，所述溶液含有浓度为约1×10⁹到1×10¹⁶基因组病毒载体。将调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这种剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。可以监测转基因的表达水平以确定所得病毒载体的剂量频率，优选地含有迷你基因的AAV载体。任选地，与出于治疗目的描述的剂量方案类似的剂量方案可以用于使用本发明的组合物进行免疫。

可以以剂量单位调配复制缺陷型病毒组合物，以使含有的复制缺陷型病毒的量在约 1.0×10⁹GC到约1.0×10¹⁶GC的范围内(以治疗平均体重70kg的受试者)，包含所述范围内的所有整数或分数量，并且对于人类患者而言，优选地为1.0×10¹²GC到1.0× 10¹⁴GC。在一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、 4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹或9×10⁹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁰、2×10¹⁰、3× 10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹¹、2× 10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹或9×10¹¹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³或9× 10¹³GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁴、2×10¹⁴、3×10¹⁴、4×10¹⁴、5×10¹⁴、6×10¹⁴、7×10¹⁴、8×10¹⁴或9×10¹⁴GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁵、2×10¹⁵、3×10¹⁵、4×10¹⁵、5×10¹⁵、6×10¹⁵、7×10¹⁵、 8×10¹⁵或9×10¹⁵GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每剂量1×10¹⁰到约1×10¹²GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。

这些上述剂量可以以各种体积的载剂、赋形剂或缓冲剂调配物施用，范围为约25到约1000微升或更大的体积，包含所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的大小、所使用的病毒效价、施用途径以及所述方法的所期望的效果。在一个实施例中，载剂、赋形剂或缓冲剂的体积为至少约25μL。在一个实施例中，体积为约50μL。在另一个实施例中，体积为约75μL。在另一个实施例中，体积为约100μL。在另一个实施例中，体积为约125μL。在另一个实施例中，体积为约150μL。在另一个实施例中，体积为约175μL。在又另一个实施例中，体积为约200μL。在另一个实施例中，体积为约 225μL。在又另一个实施例中，体积为约250μL。在又另一个实施例中，体积为约275μL。在又另一个实施例中，体积为约300μL。在又另一个实施例中，体积为约325μL。在另一个实施例中，体积为约350μL。在另一个实施例中，体积为约375μL。在另一个实施例中，体积为约400μL。在另一个实施例中，体积为约450μL。在另一个实施例中，体积为约500μL。在另一个实施例中，体积为约550μL。在另一个实施例中，体积为约 600μL。在另一个实施例中，体积为约650μL。在另一个实施例中，体积为约700μL。在另一个实施例中，体积介于约700与约1000μL之间。

在某些实施例中，剂量可以在约1×10⁹GC/g脑质量到约1×10¹²GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约3×10¹⁰GC/g脑质量到约3×10¹¹GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约5×10¹⁰GC/g脑质量到约1.85×10¹¹GC/g脑质量的范围内。

在一个实施例中，病毒构建体可以以至少约1×10⁹GC到约1×10¹⁵或约1×10¹¹到5×10¹³GC的剂量递送。可以由本领域的技术人员确定用于递送这些剂量和浓度的合适的体积。例如，可以选择约1μL到150mL的体积，其中对于成人而言，选择更大的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5mL到约10mL，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5mL到约15mL。对于幼儿，可以选择约0.5mL到约20mL的体积。对于儿童，可以选择最大约30mL的体积。对于青春期前的少年和青少年，可以选择最大约50mL的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用的体积选择为约5mL 到约15mL或约7.5mL到约10mL。可以确定其它合适的体积和剂量。将调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这种剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。

可以根据所公开的方法将上文描述的重组载体递送到宿主细胞。可以将优选地悬浮于生理上相容的载剂中的rAAV施用于人或非人哺乳动物患者。在某些实施例中，为了施用于人类患者，将rAAV适当地悬浮于含有盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物的水溶液中。合适地，将调配物调整到生理上可接受的pH，例如，在pH 6到 9、或pH 6.5到7.5、pH 7.0到7.7或pH 7.2到7.8的范围内。由于脑脊液的pH为约7.28 到约7.32，对于鞘内递送，可能期望在此范围内的pH；而对于静脉内递送，可能期望约6.8到约7.2的pH。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它pH用于其它递送途径。

在另一个实施例中，组合物包含载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。鉴于转移病毒所针对的适应症，本领域的技术人员可以容易地选择合适的载剂。例如，一种合适的载剂包含盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起调配。其它示例性载剂包含无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲液/载剂应包含防止rAAV粘附到输液管上但不干扰rAAV体内结合活性的组分。可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如

F68 [BASF]，也被称为泊洛沙姆(Poloxamer)188，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆) 命名，后跟三个数字：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。在一个实例中，调配物可以含有例如缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括水中的氯化钠、碳酸氢钠、葡聚糖、硫酸镁(例如，硫酸镁·7H₂O)、氯化钾、氯化钙(例如，氯化钙·2H₂O)、磷酸氢二钠及其混合物中的一种或多种。合适地，对于鞘内递送，同渗浓摩在与脑脊液相容的范围内(例如，约275到约290)；参见例如emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。任选地，对于鞘内递送，可以将可商购获得的稀释剂用作悬浮剂，或与另一种悬浮剂和其它任选的赋形剂组合。参见例如Elliotts

解决方案[Lukare Medical]。在其它实施例中，调配物可以含有一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可以包含例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。

任选地，本发明的组合物除rAAV和一种或多种载剂之外还可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。

根据本发明的组合物可以包括药学上可接受的载剂，如上文所定义的。合适地，本文所描述的组合物包括有效量的一种或多种AAV，所述一种或多种AAV悬浮于药学上合适的载剂中和/或与合适的赋形剂混合，所述合适的赋形剂被设计成通过注射、渗透泵、鞘内导管递送到受试者或通过另一种装置或途径递送。在一个实例中，组合物被调配用于鞘内递送。

如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中以便其到达脑脊液(CSF)的药物施用途径。鞘内递送可以包含腰椎穿刺、心室内(包含脑室内(ICV))、枕骨下/脑池内和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池(cisternamagna)中注射。

如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入到小脑延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池(cisterna magna)中或通过永久定位的管的施用途径。

一方面，本文所提供的载体可以通过所述方法和/或装置鞘内施用。参见例如WO2017/181113，其通过引用并入本文中。可替代地，可以选择其它装置和方法。所述方法包括以下步骤：使脊髓针前进到患者的小脑延髓池(cisterna magna)中；将一定长度的柔性管连接到脊髓针的近侧毂，并且将阀的输出端口连接到柔性管的近端，并且在进行了所述前进和连接步骤之后，并在允许管将使用患者的脑脊液进行自身引物后，将含有一定量等渗溶液的第一容器连接到阀的冲洗入口，并且然后将含有一定量的药物组合物的第二容器连接到阀的载体入口。在将第一血管和第二血管连接到阀之后，在阀的载体入口与出口之间打开流体流动路径，并将药物组合物通过脊髓针注射到患者中，并且在注射药物组合物之后，通过阀的冲洗入口和出口打开流体流动路径，并将等渗溶液注射到脊髓针中以将药物组合物冲洗到患者中。

此方法和此装置可以各自任选地用于鞘内递送本文所提供的组合物。可替代地，其它方法和装置可以用于此类鞘内递送。

应注意的是，术语“一个(a)”或“一个(an)”是指一个或多个。如此，术语“一个(a或an)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被解释为是包含性而非排他性的。词语“由……组成(consist)”、“由……组成(consisting)”及其变体将被解释为是排他性的而非包含性。虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在其它情况下，也意图使用“由……组成”或“基本上由……构成”的语言来解释和描述相关的实施例。

如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“约”意指相对于给定参考的10％(±10％) 的变化性。

如本文所使用的，“疾病”、“病症”和“病状”可互换地用于指示受试者的异常状态。

除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员和参照公开文本所通常理解的相同含义，这为本领域的技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。

术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括RNA或RNA和蛋白质的产生。关于RNA，术语“表达”或“转译”尤其涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是暂时的或可以是稳定的。

如本文所使用的，术语“NAb效价”是产生多少中和抗体(例如，抗AAV Nab)的量度，所述中和抗体中和其靶向的表位(例如，AAV)的生理作用。抗AAV NAb效价可以如在Calcedo,R等人,“针对腺相关病毒的中和抗体的世界范围的流行病 (WorldwideEpidemiology ofNeutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses)”《传染病杂志(Journal of Infectious Diseases)》,2009.199(3):第381-390页中所描述的那样进行测量，其通过引用并入本文中。

如本文所使用的，“表达盒”是指包括编码序列、启动子并可以包含其的其它调节序列的核酸分子，所述盒可以通过基因元件(例如，质粒)递送到包装宿主细胞，并包装到病毒载体(例如，病毒颗粒)的衣壳中。通常，用于产生病毒载体的这种表达盒含有本文所描述的基因产物的编码序列，所述编码序列侧接病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列，如本文描述的序列。

缩写“sc”是指自身互补的。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链DNA模板的构建体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见例如D M McCarty等人,“自身互补重组腺相关病毒(scAAV) 载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNAsynthesis)”, 《基因疗法》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自身互补AAV在例如美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；第7,456,683号中描述，这些美国专利中的每个美国专利通过引用整体并入本文中。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指与所关注的基因邻接的表达控制序列以及以反式或在远处起作用以控制所关注的基因的表达控制序列两者。

术语“异源性”当结合蛋白质或核酸使用时表明蛋白质或核酸包含在自然界中未发现彼此间的相同关系的两个或更多个序列或子序列。例如，核酸通常是重组地产生的，具有来自不相关基因的布置成产生新的功能性核酸的两个或更多个序列。例如，在一个实施例中，核酸具有来自一种基因的布置成引导编码序列从不同基因表达的启动子。因此，关于编码序列，启动子是异源的。

“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒粒子，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有所关注的转基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。

在许多情况下，rAAV颗粒被称为DNase抗性的。然而，除此核酸内切酶(DNase) 之外，其它核酸内切酶和核酸外切酶也可以用于本文所描述的纯化步骤中，以去除污染性核酸。可以选择此类核酸酶以降解单链DNA和/或双链DNA以及RNA。此类步骤可以含有单个核酸酶或针对不同靶标的核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。

术语“抗核酸酶”表示AAV衣壳已经在表达盒周围完全组装，所述表达盒被设计成将转基因递送到宿主细胞并保护这些包装的基因组序列在被设计成去除产生过程中可能存在的污染性核酸的核酸酶温育步骤期间免于降解(消化)。

在本发明的上下文中，术语“转译”涉及核糖体的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的组装以产生蛋白质或肽。

如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语“包括”和“包含”包含其它组分、元件、整数、步骤等。相反，术语“由……组成”及其变体不包含其它组分、元件、整数、步骤等。

如上文所描述的，除非另有说明，否则术语“约”在用于修改数值时意指±10％的变化。

以下实例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明。

实例

以下实例报告了AAV8和7另外的不同AAV血清型的广泛脱酰胺化以及来自结构、生物化学和质谱方法的支持证据。每个位点处的脱酰胺化程度取决于载体的年龄以及多个主要序列和3D结构因素，但在很大程度上不受载体回收和纯化的条件制约。证明脱酰胺化可能影响载体转导活性，并使载体活性的早期时间点丧失与在若干种AAV8天冬酰胺处快速进展的自发脱酰胺化相关。探索了稳定侧链酰胺的突变策略，从而改善载体转导并减少批次间分子变异性，所述批次间分子变异性是生物制备中的关键问题。这项研究展示了AAV衣壳异质性的先前未知的方面，并突出显示了其在开发这些用于基因疗法的载体中的重要性。

下文实例1通过一维和二维凝胶电泳、质谱和从头结构建模提供了对AAV8载体衣壳的转译后修饰的表征。在衣壳表面上鉴定了多个推定的脱酰胺化位点之后，评估了其在体内和体外两者对衣壳结构和功能的影响。实例1进一步将此分析扩展到AAV9，以确定此现象是否适用于除AAV8之外的血清型，从而证实了AAV衣壳的脱酰胺化不是血清型特异性的。实例2和3展示了另外的AAV中的脱酰胺化。

实例4涉及映射在AAV9衣壳上的新颖表位。

实例1：腺相关病毒衣壳的表面上的氨基酸的脱酰胺化

A.材料与方法

1.1D和2D凝胶电泳

为了进行1D SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，首先在存在十二烷基硫酸锂和还原剂的情况下在80℃下使AAV载体变性持续20分钟。然后，在200V下在 4-12％Bis-Tris凝胶上将其运行90分钟，并用考马斯兰染色。对于图1A-图1D中的数据，肯德里克实验室有限公司(Kendrick Laboratories,Inc.)(威斯康星州麦迪逊)进行了2D凝胶电泳。对于后续实验，在内部进行了2D SDS-PAGE。为此，将3×10¹¹GC 的AAV载体与500Uturbonuclease标志物(加利福尼亚州圣地亚哥安诺伦公司 (Accelagen,San Diego,CA))在150μL含35mM NaCl和1mM MgCl₂的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中组合在一起，并在37℃下温育持续十分钟。接下来，添加九个体积的无水乙醇，将样品涡旋，并且然后在-80℃下将其温育持续至少两小时，然后在冰上温育持续五分钟，并且然后在15℃下以最大速度离心持续30分钟。倒出上清液并风干沉淀物，然后将所述沉淀物重新悬浮于重悬浮缓冲液#1[含0.15％SDS，50mM二硫苏糖醇 (DTT)、10mM Tris pH 7.5和1μL pH 6-9两性电解质(赛默飞世尔科技公司ZM0023) 的ddH₂O，每天添加一次]中，并在室温下不受干扰地温育。在30分钟之后，轻弹样品管以将其混合，添加1μg鸡伴清蛋白标志物(密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司 (Sigma Aldrich,St.Louis,MO))，并在37℃下温育样品持续30分钟，轻弹以混合15分钟。然后将样品转移到50℃下持续15-20分钟，进行涡旋，在95℃下温育持续2.5分钟，并且在以最大速度离心一分钟之前允许其冷却，并且进行短暂涡旋。然后将10μL每种样品与140μL重悬浮缓冲液#2(含9.7M脲，2％CHAPS，0.002％溴酚蓝和0.05％两性电解质的ddH₂O，如上文所述的，每天添加一次)混合并在室温下温育持续十分钟。然后，将混合物应用于固定在pH 6-10的pH梯度(IPG)条带(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)，并根据制造商的说明在ZOOM IPGRunner系统上运行。使用了以下等电聚焦参数：在100-1,000V下持续120分钟，在1,000-2,000V下持续120分钟，在2,000V下持续120分钟，每个条带运行的极限为0.1W和0.05mA。然后，将IPG条带还原并在单孔4-12％Bis-Tris凝胶中上样，并如上文所描述的运行1D。通过将内部对照蛋白turbonuclease(安诺伦公司，27kDa)与鸡蛋清伴清蛋白(西格玛奥德里奇公司， 76kDa，pI 6.0-6.6)进行比较，确定了AAV VP的相对迁移。

2.载体产生

宾夕法尼亚大学的载体核心公司(Vector Core)生产了用于1D和2D凝胶电泳和质谱实验的重组AAV载体，并如先前所描述的通过氯化铯或碘克沙醇梯度对其进行纯化。(Lock M等人,《人类基因疗法》2010；21(10):1259-71；Gao GP等人,《美国国家科学院院刊》2002；99(18):11854-9)。产生了经过亲和力纯化的载体，如下：使HEK293细胞在十个36层超堆叠容器(康宁公司(Corning))中生长，用载体基因组质粒(pAAV-LSP-IVS2.hFIXco-WPRE-bGH)、含有AAV2 rep和AAV8 cap基因的反式质粒和腺病毒辅助质粒的混合物对其进行共转染。使用PEIpro(PolyPlus)作为转染试剂。转染后五天，采集上清液，通过Sartoguard PESMidicap过滤器(赛多利斯斯泰帝公司 (Sartorius Stedim))进行澄清，并用苯并酶(benzonase)(密理博公司(Millipore))处理，然后添加盐以使其达到0.6M。通过切向流过滤(TFF)将澄清的块状采集材料浓缩十倍，并且然后针对四个体积的亲和柱上样缓冲液进行渗滤。在POROS CaptureSelect (赛默飞世尔科技公司)亲和柱上捕获载体，并在低pH下将载体峰直接洗脱到中和缓冲液中。将中和的洗脱液稀释到高pH的结合缓冲液中，并且将其上样到阴离子交换精制柱(Cimultus QA-8；Bia分离)上，其中制剂富集了含基因组的(完整)颗粒。用浅盐洗脱梯度洗脱完整的载体颗粒，并立即进行中和。最后，使载体经受第二轮TFF，以进行最终浓缩，并将缓冲液交换成调配物缓冲液(PBS+0.001％普朗尼克(pluronic)F-68)。

通过六孔板中的HEK293细胞的小规模三重转染产生用于体外测定的突变载体。将5.6μL 1mg/mL聚乙烯亚胺溶液在90μL无血清培养基中与质粒DNA(在90μL无血清培养基中，0.091μg顺式质粒，0.91μg反式质粒，1.82μgδF6 Ad-辅助质粒)混合，将其在室温下温育持续15分钟，并且将其添加到细胞中以及另外0.8mL新鲜的无血清培养基中。第二天，用完全血清培养基代替0.5mL的顶部培养基。转染后三天，通过三个冷冻/融化循环采集载体，然后离心以去除细胞碎片并收集上清液。顺式质粒含有转基因盒，所述转基因盒在鸡β-肌动蛋白(CB7)启动子以及普洛麦格(Promega)嵌合内含子和兔β-珠蛋白(RBG)聚腺苷酸化信号的控制下对萤火虫荧光素酶转基因进行编码。反式质粒对wtAAV8 cap基因进行编码；为了产生突变AAV8 cap变体，使用了Quikchange Lightning Mutagenesis试剂盒(特拉华州威明顿市安捷伦科技公司(Agilent Technologies, Wilmington,DE)。如先前所描述的滴定载体。(Lock M等人,《人类基因疗法》2010； 21(10):1259-71)。

对于时程载体产生实验，通过HEK293细胞在15cm组织培养皿中的中等规模的三重转染产生载体。对于每个板，将36μL 1mg/mL聚乙烯亚胺溶液在2mL无血清的培养基中与质粒DNA(0.6μg顺式质粒，5.8μg反式质粒，11.6μgδF6 Ad-辅助质粒)混合，在室温下温育持续15分钟，并且在用14ml无血清培养基更新的板上将其以约60％汇合度添加到细胞中。接下来的一天，用新鲜的全血清培养基替代8ml的顶部培养基。通过收集所有顶部培养基，从培养皿中刮下细胞并将其冷冻在-80℃下来采集载体。通过应用3次冷冻/融化循环并通过离心澄清裂解物，从上清液/细胞混合物中回收粗载体。通过向澄清的裂解物中添加苯并酶、1M Tris pH 7.5和5M NaCl来纯化和浓缩用于质谱分析的载体，使其最终浓度为20mM Tris和360mM NaCl。在1ml POROS CaptureSelect 亲和柱上捕获载体，并在低pH下将载体峰直接洗脱到中和缓冲液中。通过在280nm处的吸光度分析级分，并且使最浓缩的级分经受质谱分析。

对于体内实验，产生了如先前所描述的具有wtAAV8衣壳或具有6个脱酰胺化突变体之一的载体；转基因盒包含CB7启动子、PI内含子、萤火虫荧光素酶转基因和RBG 聚腺苷酸化信号(Lock M等人,《人类基因疗法》2010；21(10):1259-71)。

3.质谱运行/消化/分析

材料：从西格玛公司(密苏里州圣路易斯市)购买了碳酸氢铵、DTT、碘乙酰胺(IAM)和富集18O的水(纯度为97.1％)；并且从赛默飞世尔科技公司(伊利诺伊州罗克福德市)购买了乙腈、甲酸、三氟乙酸(TFA)、8M盐酸胍(GndHCl)和胰蛋白酶。

胰蛋白酶消化：制备了1M DTT和1.0M碘乙酰胺的储备溶液。使衣壳蛋白变性，并在存在10mM DTT和2M GndHCl的情况下在90℃下还原十分钟。允许样品冷却到室温，并且然后在黑暗中在室温下用30mM IAM使其烷基化30分钟。通过添加1mL DTT淬灭烷基化反应。将20mM碳酸氢铵(pH 7.5-8)以将最终的GndHCl浓度稀释到 200mM的一定体积添加到变性的蛋白质溶液中。添加胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶与蛋白质的比率达到1:20，并在37℃下温育过夜。在消化之后，将TFA添加到最终浓度0.5％，以淬灭消化反应。

对于18O水实验，首先使用Zeba旋转脱盐柱(伊利诺伊州罗克福德市赛默飞世尔科技公司)将衣壳样品缓冲液交换成在18O水中制备的100mM碳酸氢铵。为了确保完全去除样品中的水，进行了两次缓冲液交换。在18O水中制备了1M DTT和1M IAM 的储备溶液。使用18O水试剂和缓冲液进行与上述相同的变性、烷基化和消化步骤。

液相色谱串联-质谱：使用Acclaim PepMap柱(长15cm，内径300μm)和与具有NanoFlex源的Q Exactive HF(赛默飞世尔科技公司)联接的Thermo UltiMate 3000RSLC系统(赛默飞世尔科技公司)进行在线色谱。在线分析期间，柱温保持在35℃下。用流动相A(含0.1％甲酸的MilliQ水)和流动相B(含0.1％甲酸的乙腈)的梯度分离肽。梯度在15分钟内从4％B运行到6％B，在25分钟内运行到10％B(共40分钟)，并且然后在46分钟内运行到30％B(共86分钟)。将样品直接上样到柱上。柱尺寸为75cm ×15um I.D.，并装有2微米的C18培养基(Acclaim PepMap)。由于上样、导入和洗涤步骤，每个液相色谱串联-质谱的总时间为约两小时。

在Q Exactive HF质谱仪上使用数据依赖性前20种方法获取质谱数据，所述质谱仪从调查扫描(200-2000m/z)中动态选择最丰富的尚未测序的前体离子。通过高能碰撞解离片段化进行测序，其中通过预测性自动增益控制确定的靶值为1e5离子；并且以4 m/z的窗口进行前体分离。在200m/z下以120,000的分辨率获取调查扫描。HCD光谱的分辨率在m/z200下设置为30,000，其中最大离子注入时间为50毫秒，并且归一化碰撞能量为30。S-透镜RF水平设置为50，以使来自消化的肽所占据的m/z区达到最佳传输。从片段化选择中排除具有单个、未分配或六个和更高电荷状态的前体离子。

数据处理：使用BioPharma Finder 1.0软件(赛默飞世尔科技公司)分析所获取的所有数据。对于肽作图，使用单进入蛋白FASTA数据库进行搜索，其中脲基甲基化设置为固定的修饰，并将氧化、脱酰胺化和磷酸化设置为可变修饰。对于串联质谱，使用了10ppm的质量准确度、高蛋白酶特异性和0.8的置信水平。脱酰胺化的肽的质谱鉴定相对简单，因为脱酰胺化向完整分子的质量添加了+0.984Da(-OH基团与-NH2基团之间的质量差)。通过将脱酰胺化的肽的质量面积除以脱酰胺化的和天然的肽的面积之和来确定特定肽的脱酰胺化百分比。考虑到可能的脱酰胺化位点的数量，在不同位点处被脱酰胺化的同量异位物种可以在单个峰处共迁移。因此，源自具有多个潜在的脱酰胺化位点的肽的片段离子可以用于定位或区分多个脱酰胺化位点。在这些情况下，观察到的同位素图案内的相对强度可以用于特异性确定不同的脱酰胺化的肽异构体的相对丰度。此方法假设所有异构物种的片段化效率是相同的，并且脱酰胺化位点是独立的。此方法允许定义脱酰胺化涉及的特定位点以及脱酰胺化涉及的潜在组合。

次级数据处理：使用以下方法在马里兰州巴尔的摩市的大学进行了原始质谱的次级分析。所有质谱分析均使用Peaks Studio v5.3软件(生物信息学解决方案有限公司)。使用以下参数对原始数据文件进行数据细化：前体的m/z公差≤10ppm，并且前体电荷状态最小为2，最大为4。使用峰算法对输入光谱进行从头测序，其中前体离子误差公差为10ppm，并且产物离子误差公差为0.1Da。将消化酶设置为胰蛋白酶，可变修饰设置为氧化、磷酸化和脱酰胺化，并且固定修饰设置为半胱氨酸的脲基甲基化。

4.AAV衣壳的结构分析

从RCSB蛋白质数据库(PDB ID:3RA8)获得了AAV8原子坐标、结构因子和相关的衣壳模型。进行了结构细化，并产生了独立于AAV8 VP3的初级氨基酸序列的电子密度，以用于衣壳的三维(3D)结构分析。执行此分析以观察AAV8衣壳中的不受预期的 AAV8 VP3的初级序列偏置的异天冬氨酸电子密度。使用所得结构，用N+1个甘氨酸作为异天冬氨酸对AAV8VP3初级序列中的四个天冬酰胺进行建模，并且然后使用 Crystallography和NMR系统(CNS)软件通过使用标准细化方案严格施加二十面体非结晶矩阵来细化AAV8衣壳结构(Brunger AT等人,《晶体学学报D区—生物晶体学(Acta CrystallogrD BiolCrystallogr)》1998；54(Pt 5):905-21)。从HIC-UP数据库中获得异天冬氨酸的结构模型，然后在PRODRG中生成分子词典以进行结构细化(Kleywegt GJ,《晶体学学报D区—生物晶体学》2007；63(Pt 1):94-100)。然后，计算AAV8衣壳的平均电子密度图(也在CNS中)，并使用COOT软件使其可视化，然后对所得模型进行较小的调整，以将建模的异天冬氨酸残基拟合到电子密度图中(Emsley P和Cowtan K,《晶体学学报D区—生物晶体学》2004；60(Pt 12Pt1):2126-32)。重复此方案，以使用N+1 个甘氨酸(PDB ID:3UX1)在AAV9 VP3初级序列中另外对N512进行建模。使用COOT、 PyMol和UCSF Chimera生成了所有图(Emsley P和Cowtan K等人,《晶体学学报D区—生物晶体学》2004；60(Pt 12Pt 1):2126-32；DeLano WL PyMOL:开源分子图形工具 (DeLano WL PyMOL:An Open-Source Molecular Graphics Tool)第40卷,2002:82-92； Pettersen EF等人,《计算化学杂志(J Comput Chem)》2004；25(13):1605-12)。获得了多种先前鉴定的脱酰胺化的蛋白质(PDB ID:1DY5、4E7G、1RTU、1W9V、4E7D和 1C9D)的结构，以用于将其脱酰胺化的异天冬氨酸残基的电子密度图与来自AAV8和AAV9的建模的异天冬氨酸残基进行比较(Rao FV等人,《化学生物(Chem Biol)》2005； 12(1):65-76；Noguchi S等人,《生物化学》1995；34(47):15583-91；Elliott等人,《分子医学杂志(JMol Biol)》2000；297(3):713-32)。

通过求AAV8或AAV9晶体结构原子坐标(PDB ID:3RA8、3UX1)中报告的每个天冬酰胺残基的每个原子的温度系数的平均值来确定脱酰胺化的残基的温度系数。

5.动物研究

宾夕法尼亚大学的机构动物护理和使用委员会批准了所有动物程序。为了评估载体性能，通过尾静脉注射向八周龄的C57BL/6小鼠静脉内注射3e10 GC wtAAV8或衣壳突变载体，体积为100μL。在第14天处死所有小鼠。为了体内评估荧光素酶表达，将小鼠(约20g)麻醉并腹膜内注射200μL或15mg/mL萤光素底物(马萨诸塞州沃尔瑟姆市珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham,MA))。在萤光素施用之后五分钟对小鼠进行成像，并通过IVISXenogen体内成像系统进行成像。使用Living Image 3.0软件对所描述的所关注的区中的信号进行定量。在第7天和第14天进行测量。

6.评估突变载体效价和体外转导效率

通过抗DNAseI基因组的qPCR确定载体效价。使qPCR引物与包装的转基因的聚腺苷酸化序列粘接。为了通过荧光素酶表达体外评估载体转导效率，将0.9e5 Huh7细胞 /孔接种在完整DMEM(10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素)中的黑壁96孔板中。第二天，去除培养基，并用在完全培养基中稀释的50μL粗制或经过纯化的载体将其替代。对于每种粗载体样品，以3倍稀释系列测试4种稀释液。在48小时之后，以0.3μg/μL 在完全培养基中制备荧光素(威斯康星州麦迪逊市普洛麦格公司)，并以50μL的体积将其添加到经过转导的细胞中。在Biotek Clarity光度计上读取结果。发现添加到靶细胞的荧光素酶活性/GC在宽GC范围内是恒定的，但在高MOI时可能变得饱和。因此，检查了针对线性度的稀释系列数据(发光单位对GC)，如果饱和度明显，则排除最高点，并针对每种变体的每个测定的线性范围中的值计算平均荧光素酶/GC。这产生转导效率值。通过将wt对照物的值设置为1，对数据进行归一化以简化比较。

7.生物分布

使用QIAamp DNA迷你试剂盒(德国希尔登凯杰公司)从肝脏样品中提取DNA，并且然后使用针对转基因盒的RBG聚腺苷酸化信号设计的引物/探针组如先前所描述的通过实时PCR分析用于载体GC的DNA(Chen SJ等人,《人类基因疗法临床开发(Hum Gene Ther ClinDev)》2013；24(4):154-60)。

B.结果

AAV8示出其衣壳蛋白中的大量电荷异质性

为了定量评估可能影响载体性能的AAV8载体衣壳上的转译后修饰的存在，通过1D和2D凝胶电泳两者分析了通过碘克沙醇梯度纯化的AAV8总衣壳蛋白。在1D还原十二烷基硫酸钠SDS凝胶中，VP1、VP2和VP3以单个带的形式在合适的分子量下解析(图 1B)(Rose JA等人,《病毒学杂志》1971；8(5):766-70)。当通过基于电荷分离蛋白质(图 1C)的2D凝胶电泳进一步评估时，取决于VP同种型，衣壳蛋白中的每种衣壳蛋白另外解析为一系列具有不同等电点(pI)的不同点，其范围从pH 6.3到>7.0(图1D)。每个VP上的单独点通过如所测量的作为相对于碳酸酐酶同种型内部等电点标准的迁移的 0.1pI单位的离散间隔分开，这表明单个残基电荷发生变化。这些同种型的存在表明每个VP都有可能经历许多修饰，由此导致其在等电聚焦下不同地迁移。

其中一部分(通常为天冬酰胺)侧链酰胺基团转化为羧酸的脱酰胺化(图1A)是蛋白质制剂中电荷异质性的常见来源。为了确定脱酰胺化是否可能负责VP电荷同种型的不同群体，将两个AAV8天冬酰胺残基分别突变为天冬氨酸。这些衣壳突变应使电荷偏移，其偏移量等于使单个另外的天冬酰胺残基完全脱酰胺化的量。突变体的2D凝胶分析表明，与野生型(wt)AAV8中的等效点相比，VP1、VP2和VP3的主要点偏移更酸性的一个点位置(0.1pH单位)(图1E-图1G)。此偏移的幅度等于wt VP电荷同种型之间观察到的间隔。因此，AAV衣壳蛋白的2D凝胶图案化与多位点脱酰胺化一致。

在AAV8载体衣壳上发生自发脱酰胺化

为了鉴定负责每个衣壳蛋白的离散点样图案的修饰，通过质谱分析一组AAV8载体。 AAV8衣壳蛋白的平均覆盖>总VP1序列的95％(数据未示出)。通过质谱检测到天冬酰胺和谷氨酰胺残基的子集的广泛脱酰胺化，这示出与基于由DNA编码序列的预测值相比，观察到的单独肽质量增加了约1Da；在AAV8载体的所有制剂中都观察到脱酰胺化的此模式(图2A-图2D)。

为了评估常用纯化方法之间脱酰胺化的总体异质性并检查VP1和VP2独特区中的脱酰胺化，选择了通过三重转染在293个细胞中产生的九批AAV8，并通过氯化铯梯度、碘克沙醇梯度或亲和色谱对其进行纯化。载体在启动子和转基因盒方面也不同。为了确定载体基因组的存在是否对脱酰胺化有影响，还评估了在不存在顺式质粒(仅产生空衣壳)的情况下通过三重转染在293个细胞中产生的AAV8制剂，并通过碘克沙醇梯度进行纯化。

跨AAV8衣壳的天冬酰胺和谷氨酰胺残基存在广泛范围的脱酰胺化，范围从不可检测到超过99％的被脱酰胺化的单独氨基酸(图2E)。在天冬酰胺残基处发生最高水平的脱酰胺化(>75％)，其中N+1残基为甘氨酸(即，NG对)(表1)。在N+1不是甘氨酸的另外的天冬酰胺残基处检测到较低水平的脱酰胺化(即，最高17％)。制剂之间的天冬酰胺的平均脱酰胺化在很大程度上一致。还检测到在谷氨酰胺残基处的脱酰胺化，但频率比在天冬酰胺处的频率低；在Q467处观察到的最高百分比<2％(图7)。此观察结果在所有制剂中均不一致(数据未示出)。在残基N499(N+1残基是天冬酰胺)处观察到最大的制备间差异，其值范围为<1％到50％以上的脱酰胺化。无论如何，在载体制剂之间的脱酰胺化中观察到的变化似乎与纯化方法、转基因同一性或载体基因组的存在不相关，这表明这些因素不会影响脱酰胺化率。

表1：所关注的AAV8脱酰胺化的残基的特性。星号表示所选的用于进一步分析的残基。

接下来，进行了一系列实验，以确定样品处理是否有助于AAV8中的观察到的脱酰胺化水平。极端温度(70℃持续7天)或pH(pH 2或pH 10持续7天)没有显著诱导 AAV8衣壳中的另外的脱酰胺化(图4A和图4B)。考虑到这种抗性，认为观察到的脱酰胺化不太可能仅发生在相对较短且较温和的纯化阶段。试图对未经纯化的载体进行质谱分析，以确定纯化前后的脱酰胺化程度，但均未成功。同样，重水对照物表明特定于质谱工作流程的处理不会有助于另外的脱酰胺化事件(图4C)。

为了验证质谱工作流程，检查了两种先前已经评估脱酰胺化的重组蛋白；所述发现 (图5A和图5B)与已经公开的结果一致[Henderson,LE、Henriksson,D和Nyman,PO(1976),“人碳酸酐酶C的初级结构(Primary structure of human carbonic anhydraseC)”《生物化学杂志》251:5457-5463以及Carvalho,RN、Solstad,T、Bjorgo,E、Barroso,JF和Flatmark,T(2003),重组人苯丙氨酸羟化酶中的脱酰胺化(Deamidations inrecombinant human phenylalanine hydroxylase)不稳定的天冬酰胺残基的鉴定和Asn-->Asp突变体形式的功能表征(Identification oflabile asparagine residues andfunctional characterization of Asn-->Asp mutant forms)《生物化学杂志》278:15142-1515]。另外，雇用了次级机构来评估来自AAV8的原始数据。此独立分析鉴定了与被脱酰胺化的位点相同的位点，其中在每个位点处的修饰程度变化最小，这归因于峰检测和面积计算中软件间的变化(图6)。

N+1氨基酸的结构拓扑、温度系数和同一性有助于脱酰胺化频率

由于AAV8的结构已经解决并公开(PDB标识符：2QA0)(Nam HJ等人,《病毒学杂志》2011；85(22):11791-99)，接下来检查AAV8衣壳结构，以为非酶促脱酰胺化的有利条件提供证据，并使脱酰胺化百分比与已建立的结构特征相关(Nam HJ等人,《病毒学杂志》2007；81(22):12260-71)。仅关注天冬酰胺残基，因为影响天冬酰胺脱酰胺化的因素在文献中被更好地表征，并且天冬酰胺脱酰胺化事件远比谷氨酰胺脱酰胺化事件更为常见(Robinson,NE和Robinson,AB(2001),“分子时钟(Molecular clocks)”《美国国家科学院院刊》98:944-949)。还确定了来自AAV8晶体结构的这些残基中的每个残基的温度(或B)系数；温度系数是对原子从其平均位置开始的位移的量度，值越大表示位移越大、热振动越大，并且因此柔性越高(Parthasarathy S和Murphy MR,《蛋白质科学：蛋白质协会的出版物(ProteinScience:A Publication ofthe Protein Society)》1997； 6:2561-7))。大多数所关注的天冬酰胺都定位在表面暴露的HVR中或其附近(表1)，这在结构上有利于脱酰胺化，并提供了溶剂暴露的环境(Govindasamy L等人,《病毒学杂志》2013；87(20):11187-99)。发现平均而言定位在这些柔性环区中的残基比如β链和α螺旋等柔性较差的区中的残基更频繁地被脱酰胺。例如，在位置N263处的NG残基是HVR I的一部分，具有高温系数，并且平均被脱酰胺化>98％(图7A和图6，表1)。在所述时间内被脱酰胺化约85％的N514(图3和图6，表1)也存在于具有N+1甘氨酸的HVR(HVR V)中；然而，局部温度系数与N263的温度系数相比相对低，这是由于其与在三重轴处的其它VP单体上的残基相互作用。不利的+1残基和较低的局部温度系数与较低的脱酰胺化相关，即使对于HVR残基也是如此。例如，N517平均仅4％脱酰胺化(表1)；此残基具有与高度脱酰胺化的N514相当的温度系数，但其N+1残基为丝氨酸，这降低了由于空间位阻而引起的脱酰胺化事件的可能性。这表明，尽管+1 残基的同一性显然是最有影响力的因素，但许多因素会累积地确定在给定衣壳位置处的脱酰胺化程度。

为了测试+1残基在天冬酰胺脱酰胺化中的作用，产生了突变载体，其中AAV8 NG位点在+1位置处分别突变为丙氨酸或丝氨酸。模型肽研究表明，NG肽的脱酰胺化半衰期短至1天，而NA肽或NS肽的脱酰胺化通常分别慢25倍或16倍(Robinson NE和 Robinson AB,《美国国家科学院院刊》2001；98(8):4367-72)。载体突变体的质谱分析证实了+1位点在确定载体脱酰胺化程度中起着核心作用。当+1位点变为丙氨酸(<5％脱酰胺化)或丝氨酸(<14％脱酰胺化)时，此集合中的NG位点(>80％脱酰胺化，在 wt中)示出相邻天冬酰胺的选择性稳定(表2)。

表2：在wt中五个AAV8 NG位点和六个+1位点突变体处的脱酰胺化程度(％)。

与定位在更有利的环境中的残基相比，在完整的完全组装的AAV8衣壳中，至少部分被掩埋且不易暴露于溶剂和/或定位在局部柔性低的区中的残基的脱酰胺化频率更低(表1)。尽管如此，在不利条件下的少数残基仍被脱酰胺化。例如，N630被至少部分掩埋，但仍具有可检测的脱酰胺化程度。对于此残基，苯丙氨酸作为N+1残基存在表明此区可能是AAV8 VP3蛋白内的非酶促自蛋白水解裂解的新颖位点。

AAV8 VP3的结构建模证实了脱酰胺化事件

为了提供在组装的衣壳的背景下的脱酰胺化的直接证据，评估了AAV8的晶体结构(Nam H-J等人,《病毒学杂志》2011；85(22):11791-9)。此血清型的可用晶体结构(即，

)的分辨率不足以鉴定R基团中的末端原子，并且因此不足以在天冬酰胺残基、天冬氨酸残基与异天冬氨酸残基之间进行直接区分。在这些条件下形成的天冬氨酸的异构体的结构的其它方面提供了从

结构确定脱酰胺化的机会。此分析基于两个假设： 1)天冬酰胺的自发脱酰胺化的主要产物是异天冬氨酸而不是天冬氨酸，其以3:1的比率产生(Geiger T和Clarke S,《生物化学杂志》1987；262(2):785-94)；以及2)由于对应于异天冬氨酸的R基团的电子密度图长度较短，因此可以将天冬酰胺或天冬氨酸与异天冬氨酸区分开。在脱酰胺化反应期间解析琥珀酰亚胺基中间体之后，当将来自异天冬氨酸的R基团的β碳并入到AAV8 VP3衣壳蛋白骨架的主链中而丢失时，这会产生较短的 R基团。

首先细化了AAV8结构本身，从而产生不受已知AAV8 VP3序列偏置的AAV8衣壳电子密度。然后，基于与异天冬氨酸相关的较短的R基团的存在，检查了经过细化的 AAV8晶体结构以证明脱酰胺化(图3A-图3E)。电子密度图证实，与在410处通过质谱没有检测到脱酰胺化的天冬酰胺相比(图3B)，在位置263处(图3C)、385处(未示出)、514处(图3D)和540处(图3E)高度脱酰胺化的N+1甘氨酸残基的R基团更短。因此，由电子密度图指示的脱酰胺化与通过质谱在这些位点处进行的>75％脱酰胺化的数据一致。所得异天冬氨酸模型与在其它已知的脱酰胺化的蛋白质的晶体结构中观察到的异天冬氨酸残基相当，这支持AAV8的分析的有效性(Rao FV等人,《化学生物》2005；12(1):65-76；Noguchi S等人,《生物化学》1995；34(47):15583-91；Elliott等人,《分子医学杂志》2000；297(3):713-32)。此结构分析用作对通过质谱分析AAV8衣壳时观察到的脱酰胺化现象的独立证实。

AAV衣壳的脱酰胺化不是血清型特异性的

调查了AAV8以外的血清型，以证明衣壳脱酰胺化。使用2D凝胶电泳(图11A) 和质谱(图11B)检查AAV9载体制剂，包含针对潜在载体处理效果的对照物(图11D- 图11F)。AAV9脱酰胺化的模式和程度与AAV8脱酰胺化的模式和程度类似。所有四个 AAV9 NG位点>85％脱酰胺化；13个非NG位点的脱酰胺化程度较小，其中少数位点示出的脱酰胺化％的批次间变异性很大。接下来，应用了结构分析工作流程，并对现有的 AAV9晶体学数据进行了重新拟合(图11C，表3)。与AAV8一样，异天冬氨酸更好地拟合到AAV9晶体结构中若干个NG位点的电子密度。将2D凝胶分析(数据未示出) 和质谱(总结在表4中)扩展到了五种另外的进化上不同的血清型(rh32.33、AAV7、 AAV5、AAV4、AAV3B和AAV1)。所有检查的衣壳均含有类似的脱酰胺化模式和程度，这表明此修饰在临床上相关的AAV载体中是广泛的，并由类似的基础初级序列和结构因素确定。

脱酰胺化事件可能影响衣壳组装和转导效率

测试脱酰胺化的功能影响的一种方法是通过基因突变用天冬氨酸取代天冬酰胺。通过对293个细胞进行小规模三重转染为每个脱酰胺化的AAV8天冬酰胺产生对荧光素酶报告基因进行编码的天冬氨酸突变载体，并通过抗DNAseI基因组拷贝的qPCR对载体进行滴定(图8A)。相对于wtAAV8，突变极少影响衣壳组装，并且影响仅限于wt载体中总体上具有低脱酰胺化的大部分掩埋的非NG位点。接下来，评估人肝源性Huh7细胞的突变组体外转导效率(图8B)。若干个突变体示出受损的转导效率，其中位置N57、 N94、N263、N305、Q467、N479和N653表现出>10倍的转导损失。观察到类似数量的AAV9的敏感位点(图11G和图11H)。通常，在给定位置处只有一部分残基是内源性脱酰胺化的，因此此方法可能会高估蛋白质(如衣壳)的功能丧失，其中功能单元是同单体组装；在一个衣壳位点处的内源性修饰可以被具有完整残基的相邻亚基补偿。尽管如此，认为所述方法可以帮助脱酰胺化的残基进行优先级排序，以便在制备或突变稳定期间进行进一步监测。将需要来自内源性脱酰胺化载体的群体的功能数据，以将这种功能丧失诱变数据置于适当的背景下。

随着时间的推移的载体活性丧失与进行性脱酰胺化相关

考虑到NG脱酰胺化的半衰期很短，认为年龄相差仅1天的载体样品可能示出不同的脱酰胺化谱，从而提供使内源性脱酰胺化与功能相关的机会。大规模载体制备方案要求对293个细胞进行三重转染，然后温育5天以产生载体，并需要1-2天进行载体纯化。为了近似此过程，用wt AAV8制备293个细胞的中等规模三重转染(每个细胞培养皿 10×15cm)。以1天的间隔收集载体(2×15cm细胞培养皿/天)持续5天，从而通过将载体冷冻在-80℃下保存到5天结束的时间点。接下来，如上文所描述的评估粗载体效价和体外转导效率。如所期望的，组装的抗DNAseI基因组拷贝的数量随时间推移而增加(图9A)。然后，通过亲和纯化快速处理早期(第1天和第2天)和晚期(第5天) 时间点的粗载体，并测量huh7细胞的体外转导效率。载体的相对转导效率随时间推移而逐渐降低(图9B)。就添加到靶细胞的每个GC的转基因表达而言，第5天的载体的效率为第1天的材料的效率的仅40％。也观察到粗材料的此活性下降，这表明纯化前分子组合物的变化(图)。观察到5天内AAV9的活性丧失趋势类似，其中载体效力降低了约40％(图11I-11K)。

接下来，通过质谱测量时程样品的脱酰胺化。NG位点脱酰胺化基本上在每个间隔内进行，其中在第1天平均25％脱酰胺化，并且到第5天转化的位点>60％(图9C)。非NG位点脱酰胺化通常在5天内进行，尽管在第2天与第5天之间的水平要低得多并且一致性较低(图9D)。数据使内源性载体脱酰胺化与特异性活性的早期时间点衰减相关，并通过缩短生产周期或寻找稳定天冬酰胺的衣壳突变突出显示捕获更多活性载体的潜在机会。

应注意的是，图2A-图2E中的用于质谱分析的材料是转染后至少7天的，这是由于另外2天用于纯化。这些样品中的较高NG位点脱酰胺化(>80％)表明，脱酰胺化可能会在表达时间段之后以及在回收和纯化过程期间以约相同的速率继续进行，直到 NG位点被完全脱酰胺化或载体样品被冷冻。因此，脱酰胺化很大程度上由载体的年龄确定，而不是回收和纯化过程所独有或引起的过程。第1天的材料相对于第5天的材料 (均经过亲和纯化)的低得多的脱酰胺化值说明了这一点。

稳定NG天冬酰胺可以改善载体性能

考虑到载体NG脱酰胺化与转导效率损失之间的相关性，认为通过+1位点诱变稳定NG酰胺可以改善载体功能。以小规模为AAV8 NG位点突变体产生载体，其中每个+ 1残基分别转化为丙氨酸或丝氨酸。就载体组装(图10A)和转导效率(图10B)而言，单个+1突变体具有良好的耐受性。定位在衣壳表面上的先前定义的“死区”附近的G386 取代(Aydemir F等人,《病毒学杂志》2016年7月；90(16):7196-204)存在体外转导缺陷。G386突变体的功能丧失可能表明对在N385处的脱酰胺化的天冬酰胺的偏好。可替代地，+1位置处的另外的侧链本体可能对独立于酰胺基团稳定化的功能具有负面影响。尽管其相邻的天冬酰胺具有显著的稳定性，但单个位点突变体没有显著改善体外转导 (表2)。因为体外和体内的转导活性可能不一致，所以在C57BL/6小鼠中测试了用于肝脏转导的单个位点+1突变体的子集。进行静脉内尾静脉注射(n＝3到5)，并通过持续 2周的每周成像来检查荧光素酶表达(图10C)。体内和体外转导数据与每个测定的相关误差范围相一致(即，在误差范围内)。G386取代在转导方面是有缺陷的，而在其它位置处的+1位点突变在很大程度上被耐受，从而以等于但不超过wtAAV8的水平转导肝脏。

由于在任何一个NG位点处稳定酰胺可能是必要的，但不足以恢复功能，因此接下来评估了具有+1位点丙氨酸取代的组合的载体变体。重组+1丙氨酸功能强大的所有3 个AAV8 NG位点(N263、N514和N540)。一些包含三重突变体G264A/G515A/G541A 的组合组装不佳，并且对转导而言具有功能障碍。然而，涉及N263的两种成对组合 (G246A/G515A和G264A/G541A)均改善了体外转导效率(分别是wtAAV8的2.0倍和 2.6倍)，而没有效价损失(图10D)。因为这些突变会引入至少两种变化(N-酰胺稳定化和+1残基侧链取代)，所以这些数据不能最终将NG脱酰胺化与功能丧失联系起来。然而，数据与在时程研究中建立的模型一致，在所述模型中，NG位点脱酰胺化可能影响体外转导效率。

功能性天冬酰胺取代改进了载体制备中的批次间的重现性

报告的载体脱酰胺化谱的另一个潜在问题方面是在一些位置处的脱酰胺化具有高批次间变异性。对于wtAAV8，此变异性对于N459(观察到的脱酰胺化范围为0％到31％)和N499(观察到的脱酰胺化范围为0％到53％)最为显著。通常在生物制剂开发期间实际上要避免转译后修饰中的变异性，这通过完全避免表现出此变异性的克隆，仔细监测和控制生产菌株和条件，或者对受影响的候选物进行蛋白质工程化。

由于无法确定导致N459和N499脱酰胺化变异性的生产或加工因素(图2E)，因此寻求在这些位置处进行功能性氨基酸取代。首先评估了小规模载体制剂在各个位置处分别被谷氨酰胺保守取代的可能性。N459Q和N499Q两者都高效地组装到载体中，并且与wtAAV8的体外转导效率参考相当(图7A)。接下来，大规模产生突变体并进行质谱。与对极为罕见的谷氨酰胺脱酰胺化的观察一致，观察到这些突变体中在位置459或499 处的谷氨酰胺具有选择性和完全的稳定性(数据未示出)。如上所述在C57BL/6小鼠的尾静脉注射后体内评估了这些突变体批次的肝脏转导(图7B和图7C)。在此实验中用作对照物的wtAAV8载体批次在N499处脱酰胺化16.8％，但是在N459处未检测到脱酰胺化(数据未示出)。两个突变体在第14天的肝脏转导等同于wtAAV8的肝脏转导。此数据证明了蛋白质工程化方法解决制备的AAV载体中与脱酰胺化相关的分子变异性的潜力。

C.讨论

分别通过2D凝胶电泳、质谱、从头蛋白质建模以及体外和体内两者的功能研究来鉴定和评估AAV8衣壳上天冬酰胺和谷氨酰胺残基的非酶促脱酰胺化。已经示出脱酰胺化发生在广泛多种蛋白质中，并显著影响生物制剂的活性，包含基于抗体的治疗剂 (Nebija D等人,《国际分子科学学报(Int JMol Sci)》2014；15(4):6399-411)和基于肽的疫苗(VermaA等人,《临床与疫苗免疫学》2016；23(5):396-402)。已经通过质谱示出其它病毒蛋白(如轮状病毒的VP6蛋白)会经历脱酰胺化事件(Emslie KR等人,《功能与整合基因组学(FunctIntegr Genomics)》2000；1(1):12-24)。

在AAV8中发生这些脱酰胺化的情况表明它们是自发的非酶促事件的结果。已知天冬酰胺残基比谷氨酰胺残基更广泛地被脱酰胺化；天冬酰胺下游的氨基酸基本上影响脱酰胺化的速率，其中N+1甘氨酸(即，NG)被最高效地脱酰胺化。观察到N+1氨基酸在AAV衣壳的脱酰胺化中的作用得到明显证实，因为VP1中存在的每个NG均以> 75％的水平被脱酰胺化，而衣壳中的其它天冬酰胺或谷氨酰胺中的任一种的脱酰胺化始终从未>20％。实际上，AAV8和AAV9衣壳(即，7/9)中的所有NG基序也存在于与构象柔性和热振动的高速率相关的HVR区中含有的衣壳的表面上。这与其它蛋白质的 NG基序的先前报告是一致的，所述其它蛋白质定位在可能需要柔性来实现适当蛋白质功能的区中，而不是在更有序的结构中，如α螺旋或β折叠(Yan BX和Sun YQ,《生物化学杂志》1997；272(6):3190-4)。通过提供溶剂可及性和构象柔性，对表面暴露的HVR 中NG基序的偏好进一步增强了脱酰胺化速率，由此促进了琥珀酰亚胺基中间体的形成。如所预期的，不利的环境导致脱酰胺化速率低得多。

关于AAV的生物学及其作为载体的用途的重要问题是这些脱酰胺化的功能后果。将天冬酰胺转化为天冬氨酸的衣壳DNA的诱变允许评估衣壳，其中在特定位点处的所有氨基酸均表示为天冬氨酸。然而，除潜在地突变N+1残基之外，不存在使用诱变防止脱酰胺化的任何容易的策略，这与第二位点突变的直接后果相混淆。研究了有限数量的变体，其中通过诱变将天冬酰胺残基转化为天冬氨酸。功能分析包含衣壳组装以及体外和体内转导。诱变对载体功能的最基本影响是涉及在基线处没有被完全地脱酰胺化并且没有暴露的表面的天冬酰胺的影响。然而，令人惊讶的是，在514处将高度脱酰胺化的天冬酰胺诱变为天冬氨酸确实对功能有一些影响。此结果表明对应酰胺的残留量的存在可能影响功能。这可能部分地由于另一三倍相关的VP3单体(在wtAAV8晶体结构中鉴定)的N514与D531之间存在氢键相互作用，所述氢键相互作用在脱酰胺化之后此残基转化为天冬氨酸时失去。

在评估这些脱酰胺化对新颖治疗剂开发的影响时，更好地了解影响AAV载体中脱酰胺化程度的因素很重要。在极端条件(已知能显著加速脱酰胺化动力学)下温育载体几乎没有影响。结合同位素并入研究，此结果表明脱酰胺化发生在衣壳组装期间，并且不是载体处理或质谱分析的伪像。在NG位点处的脱酰胺化不太可能对载体性能具有实质性影响，因为在评估的每个样品中，反应实际上都已经完成。然而，最初的功能研究表明未脱酰胺化的天冬酰胺的残留量可以有助于功能。更加关注其中脱酰胺化不完全的位点，在大多数情况下，这也与样品间的差异相关。实例是在位置499处的天冬酰胺示出的脱酰胺化范围为0％到53％，平均为17％。载体产生条件的细微差异可能会导致这种异质性。AAV8和AAV9中脱酰胺化的惊人相似性表明这是这种整个病毒家族的性质。

总之，在AAV8和AAV9衣壳蛋白的初级氨基酸结构中发现了大量异质性。这些研究可能以若干种方式影响作为载体的AAV的发展。首先，VP蛋白的实际氨基酸序列不是由对应DNA序列所预测的。其次，生产方法的各个方面可能导致脱酰胺化的差异以及载体功能的对应变化。直到掌握影响在非NG位点处的脱酰胺化速率的因素并更好地了解其功能后果之前，可能有必要在临床级AAV载体的表征中包含脱酰胺化。2D凝胶电泳可以提供净脱酰胺化的总体评估，尽管质谱对于评估在特定残基处的脱酰胺化是必不可少的。

实例2：脱酰胺化AAV8三重突变体(进化枝E)

AAV8三重突变体衣壳用于产生rAAV载体。此衣壳的VP1蛋白的预测的氨基酸序列在本文的SEQ ID NO:9中提供，并且对衣壳进行编码的核酸序列在SEQ ID NO:8中提供。还参见PCT申请PCT/US17/27392，公开为WO 2017/180854。

如实例1中针对AAV8所描述的，评估AAV8三重突变载体的脱酰胺化。在N57、 N384、N498、N513、N539处看到高度脱酰胺化的残基。在N94、N254、N255、N304、 N409、N516处观察到脱酰胺化10％到40％。

实例3：另外的脱酰胺化研究

如实例1中针对AAV8和AAV9所描述的，评估说明性载体的脱酰胺化。AAV1落入进化枝A内，AAV7落入进化枝D内，而AAV3B、AAV5、AAVrh32/33和AAV4在进化枝A-F中的任一种之外。

A.AAV1脱酰胺化

如实例1中针对AAV8和AAV9所描述的，评估AAV1载体的脱酰胺化。结果示出，基于SEQ ID NO:1中重现的AAV1 VP1的初级序列的编号，载体含有高度脱酰胺化的四个氨基酸(N57、N383、N512和N718)。

B.AAV3B脱酰胺化

如实例1中针对AAV8和AAV9所描述的，评估AAV3B载体的脱酰胺化。在参考 AAV3B的编号的四个天冬酰胺残基N57、N382、N512和N718处观察到高水平的脱酰胺化。这些编号基于在SEQ ID NO:2中重现的AAV3B VP1。

C.AAV5脱酰胺化

如实例1中针对AAV8和AAV9所描述的，评估AAV5载体的脱酰胺化。在残基 N56、N347、N347和N509处观察到高水平的脱酰胺化。观察到以下位置的脱酰胺化为约1％到约35％：N34、N112、N213、N243、N292、N325、N400、Q421、N442、N459 和N691。这些编号基于在SEQ ID NO:3中重现的AAV5 VP1。

AAV5修饰
								酶		胰蛋白酶	胰蛋白酶	胰蛋白酶	胰蛋白酶	胰蛋白酶	胰蛋白酶
覆盖％	N+1	88.7	89.2	81.4	88.8	91.7	82.9
								N34+脱酰胺化	Q	7.6
N56+脱酰胺化	G	99.9	87.3	84.9	88.3	82.8	87.9
								约N79+脱酰胺化	E				0.3
约N93+脱酰胺化	H		6.3	5.8	5.5	7.7	2.9
								N112+脱酰胺化	L	2.3
约N213+脱酰胺化	A	16.5
								约N243+脱酰胺化	N	32.8				24.8
约N259+脱酰胺化	A					2.7
								约N292+脱酰胺化	N	27.6				27.0
N325+脱酰胺化	N	9.9
								N347+脱酰胺化	G	81.1	94.2	91.7	87.2	88.1	85.7
约N400+脱酰胺化	N	5.4	3.3	2.4	4.8	3.3	3.3
								约Q421+脱酰胺化	N	7.0
约N442+脱酰胺化	N	24.1
								约N459+脱酰胺化	T	12.5
约N509+脱酰胺化	G	85.1	92.6	89.9	98.0	92.0	94.0
								约N572+脱酰胺化	N		0.9	4.1	2.5	0.1	2.3
约N691+脱酰胺化	N	23.1		13.3	4.2	0.4	0.5

D.AAV7脱酰胺化

如实例1中针对AAV8和AAV9所描述的，评估AAV7载体的脱酰胺化。在N41、 N57、N384和N514处观察到高水平的脱酰胺化。在N66、N224、N228、N304、N499、 N517、N705和N736处观察到以1％到25％的速率进行脱酰胺化。这些编号基于在SEQ ID NO:4中重现的AAV7VP1。

E.AAVrh32.33脱酰胺化

如实例1中针对AAV8和AAV9所描述的，评估AAVrh32.33载体的脱酰胺化。在位置N57、N264、N292、N318处观察到高水平的脱酰胺化。在位置N14、N113、Q210、N247、Q310、N383、N400、N470、N510和N701处观察到脱酰胺化介于1％到45％。

这些编号基于在SEQ ID NO:5中重现的rh32.33 AAV VP1。

AAVrh32.33修饰	WL1408S
		酶	胰蛋白酶
覆盖％	100
		N14+脱酰胺化	3.0
N57+脱酰胺化	100.0
		N113+脱酰胺化	1.1
Q210+脱酰胺化	14.8
		N247+脱酰胺化	31.1
约N264+脱酰胺化	100.0
		约N292+脱酰胺化	50.2
Q310+脱酰胺化	5.4
		约N318+脱酰胺化	92.2
N383+脱酰胺化	2.1
		约N400+脱酰胺化	39.7
约Q449+脱酰胺化	2.9
		N470+脱酰胺化	2.6
N498+脱酰胺化	0.6
		约N510+脱酰胺化	27.3
约N701+脱酰胺化	6.2
		N731+脱酰胺化	40.2

F.AAV4脱酰胺化

如先前所描述地评估AAV4。在位置56和264处观察到高水平的脱酰胺化。具有高水平的脱酰胺化的其它位置可以包含位置318和546。

AAV4修饰	CS1227L	CS1227L	CS1227L
				酶	胰蛋白酶	胰凝乳蛋白酶	组合的<sup>*</sup>
覆盖％	84.3	85.1
				约Q35+脱酰胺化		0.3	0.3
约N56+脱酰胺化	97.2	96.9	97.0
				N112+脱酰胺化	11.6	9.8	10.7
约N247+脱酰胺化	28.3	29.4	28.9
				约N264+脱酰胺化	97.0	97.3	97.1
约N292+脱酰胺化	27.5	丢失<sup>2</sup>	27.5
				N318+脱酰胺化	丢失<sup>1</sup>	97.0	97.0
N358+脱酰胺化	丢失<sup>1</sup>	2.1	2.1
				约N375+脱酰胺化	丢失<sup>1</sup>	12.4	12.4
约N401+脱酰胺化	34.9	29.5	32.2
				N464+脱酰胺化	34.6	32.2	33.4
约N467+脱酰胺化	7.2	8.7	7.9
				N471+脱酰胺化	5.9	7.7	6.8
约Q481+脱酰胺化	3.7		3.7
				Q489+脱酰胺化	1.4	0.8	1.1
N535+脱酰胺化	38.2	丢失<sup>2</sup>	38.2
				约N546+脱酰胺化	丢失<sup>1</sup>	93.6	93.6
约N585+脱酰胺化	丢失<sup>1</sup>	23.9	23.9
				Q606+脱酰胺化		0.8	0.8

¹不由胰蛋白酶覆盖

²不由胰凝乳蛋白酶覆盖

^*如果在两种制剂中均观察到残基，则取平均值。如果残基在一种制剂中，则仅使用此制剂。

分别报告了胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶制剂。然而，基于所获得的序列和肽，胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶会丢失某些残基。在两种制剂中都观察到残基的情况下，脱酰胺化是一致的，因此平均值不应相差太多。

实例4：映射腺相关病毒9特异性中和表位

在这项研究中，试图鉴定尚未通过此表位作图方法进行评估的AAV9上的中和表位。重要的是，AAV9目前正临床上通过静脉内施用用于多种心脏、肌肉骨骼和中枢神经系统适应症(Bish LT等人,《人类基因疗法》2008；19(12):1359-68；Foust KD等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》2009；27(1):59-65；Kornegay JN等人,《分子疗法》 2010；18(8):1501-8)，最值得注意的是脊髓性肌萎缩症(Mendell JR等人,《新英格兰医学杂志(NEngl JMed)》2017；377(18):1713-22)。此处，报告了迄今为止重构的最高分辨率的AAV-Ab复合物：AAV9的

结构与有效的NAb PAV9.1复合。通过使用血清型交换、丙氨酸替代和另外的点突变体，验证了PAV9.1的表位，并证明了所得突变体显著干扰PAV9.1结合和中和的能力。然而，当针对来自各种来源的一组多克隆样品测试突变体时，对PAV9.1结合和中和能力两者的这种影响均显著降低或未观察到这种影响。此结果表明，尽管此表位在一些情况下可以在AAV转导的中和中起作用，但仍需要更大范围的中和表位的靶向突变体来对能够规避负责阻断AAV转导的NAb库的新颖衣壳进行工程化。

A.材料与方法

1.杂交瘤产生

Balb/c小鼠最多接受五次AAV9载体免疫。采集并融合了脾细胞。ProMab生物技术有限公司(加利福尼亚州里士满)根据公司的标准定制小鼠单克隆抗体杂交瘤开发方案产生了克隆上清液。三十份上清液通过ELISA筛选AAV9反应性，并通过NAb测定筛选其中和AAV9的能力。筛选后，以3mg/mL的浓度获得经过纯化的PAV9.1 mAb。

2.AAV衣壳ELISA

用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的1e9 GC/孔AAV包被康宁聚苯乙烯高结合微孔板，并在4℃下过夜。在丢弃包衣溶液之后，在室温下用含3％牛血清白蛋白(BSA) 的PBS阻断板持续2小时，然后用300μL PBS+0.05％Tween洗涤三次。然后，将杂交瘤上清液、经过纯化的mAb、血清或血浆(在含0.75％BSA的PBS中稀释)在37℃下温育持续1小时，然后用300μLPBS+0.05％Tween洗涤三次。接下来，在37℃下使用 1:10,000山羊抗小鼠IgG HRP(在含0.75％BSA的PBS中稀释；目录号31430；马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)检测小鼠样品持续1小时，然后用300μL PBS+ 0.05％Tween洗涤三次。然后，在室温下使用1:10,000(在PBS中稀释)山羊抗人IgG 生物素-SP(目录号109-065-098，宾夕法尼亚州西格罗夫杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Inc.,West Grove,PA))检测人和非人灵长类动物样品持续1小时，然后在室温下用300μL PBS+0.05％Tween和1:30,000(在PBS中稀释)未缀合的链霉亲和素(目录号016-000-084，宾夕法尼亚州西格罗夫杰克逊免疫研究实验室)洗涤三次持续1小时(然后用300μL PBS+0.05％Tween洗涤3次)。用四甲基联苯胺开发了所有 ELISA。

3.中和抗体测定

如先前所描述的，用少数修饰进行NAb测定(Calcedo R等人,《传染病杂志》2009；199(3):381-90)。将HEK293细胞以1e5个细胞/孔的密度接种在黑壁透明底聚赖氨酸包被的板上(目录号08-774-256，弗吉尼亚州汉普顿世尔科技公司(Fisher Scientific Company,Hampton,NH))。使用90wtAd5/细胞的感染复数，利用4e10 GC/mL AAV9.CMV.LacZ载体的工作溶液达到2e9 GC/孔的最终浓度。按照制造商的方案，使用 SpectraMax M3(加利福尼亚州森尼维耳市分子仪器公司(Molecular Devices,Sunnyvale, CA))测量生物发光。对于任何给定的样品，与在存在未经处理的对照物的情况下的 WT.AAV转导相比，将NAb效价定义为在存在样品的情况下AAV转导降低>50％的最后稀释度。如上文所描述的执行HEK293转导实验，但是保留中和血清。

4.Fab产生和AAV-Fab复合

根据制造商的说明，使用Pierce Fab制剂试剂盒(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)产生PAV9.1 Fab(0.211mg/mL)。接下来，在室温下将PAV9.1 Fab与AAV9 载体以600Fab:1AAV9衣壳(或10Fab:1潜在结合位点)的比率复合持续30分钟。

5.冷冻EM样品制备、数据获取和复合物重构

样品制备：将3μL的PAV9.1-AAV9复合物应用于刚洗涤过且辉光放电的多孔碳网格。在22℃下和95％相对湿度下用Whatman#1滤纸印迹3到4秒钟后，使用Vitrobot Mark IV(FEI)在液态乙烷浆中快速冷冻网格。接下来，用Whatman滤纸在22℃下在95％相对湿度下进行3到4秒的单次印迹。冷冻后，将网格储存在液氮中。然后，将网格转移到以200kV运行并配备有Gatan K2 Summit直接电子检测相机(美国普莱森顿加坦公司 (Gatan,Pleasanton,USA))的FEI Talos Arctica电子显微镜。

数据获取：使用SerialEM软件获取数据(Mastronarde DN,《结构生物学杂志(JStruct Biol)》2005；152(1):36-51)。以22,000×的标称放大率(对应于

的校准像素大小) 和2.21电子/平方埃/秒的剂量率以及1.0-2.0μm的散焦范围捕获图像(RohouA.和 Grigorieff N,《结构生物学杂志》2015；192(2):216-21)。对于每次曝光，都以超分辨率模式记录60帧剂量分级分离的影片堆叠持续总计12秒。使用IMOD软件包内的“alignframes”程序对齐电影帧(Kremer JR等人,《结构生物学杂志》1996；116(1):71-6)。

数据收集和处理：从显微照片中的每个显微照片手动提取所有颗粒图像，并使用EMAN2套件中可用的e2boxer程序对其进行处理(Tang G等人,《结构生物学杂志》2007； 157(1):38-46)。然后将加框的颗粒转移到AUTO3DEM程序中以进行冷冻重构，从而基于150个颗粒图像生成起始的低分辨率模型

(Yan X等人,《结构生物学杂志》 2007；157(1):73-82)。程序采用了随机模型生成程序，并且应用了严格的60个非晶体对称轴。此低分辨率重构模型图可用于确定颗粒起点，进行完整朝向以及使用AUTO3DEM 完善所有图像的对比度传递函数。为了提高重构图的质量，应用了温度系数校正，并在图形程序Coot和Chimera中将图可视化(Pettersen EF等人,《计算化学杂志》2004； 25(13):1605-12；Emsley P和Cowtan K,《晶体学学报D区—生物晶体学》2004；60(Pt 12 Pt 1):2126-32)。使用温度系数为150的校正图进行模型对接和解释。从1,100张显微照片中提取总共3,022个加框的颗粒，以最终生成

分辨率的重构图，其中傅里叶球壳相关性为0.15。使用VIPER数据库来生成AAV9-60mer模型，同时应用严格的二十面体对称轴(T＝1)(Carrillo-Tripp M等人,《核酸研究(NucleicAcids Res)》2009；37(数据库发行号):D436-42)。使用Chimera程序中的FIT功能，将AAV9衣壳的60-mer拷贝对接到冷冻重构的电子密度图中。这产生了0.9的相关性系数。将Coot和Chimera中对接的模型可视化并调整其准确度。使用ABodyBuilder生成抗体模型，然后使用Chimera 将其对接并手动调整到冷冻重构的密度(Leem J等人,MAbs2016；8(7):1259-1268)。然后将模型可视化以解释AAV9和抗体结合区。使用Chimera和PyMOL程序制作所有图。 RIVEM程序用于创建路线图的二维描述(DeLano WL,《PyMOL：开源分子图形工具 (PyMOL:An Open-Source Molecular Graphics Tool)》2002；第40卷:82-92)。使用RIVEM 程序创建路线图的二维描述(Xiao C和Rossmann MG,《结构生物学杂志》2007.158(2):182-7)。

6.AAV9-PAV9.1突变体反式质粒构建

使用内部反式质粒构建体pAAV2/9(AAV2 rep/AAV9 cap)进行AAV9衣壳诱变。根据制造商的说明，所有衣壳突变体均使用Quikchange Lightning Mutagenesis试剂盒(加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦公司构建。

7.载体产生

通过三重转染在HEK293细胞中产生AAV9.CMV.LacZ.bGH和AAV9突变载体，然后如先前所描述的进行碘克沙醇梯度纯化(Lock M等人,《人类基因疗法》2010； 21(10):1259-71)。如先前所描述的，宾夕法尼亚大学载体核心公司使用针对bGH polyA 的定量PCR(qPCR)对载体进行滴定(Lock M等人,《人类基因疗法》2010； 21(10):1259-71)。

8.确定PAV9.1 mAb和多克隆血清/血浆的EC50

如上文所描述的，用AAV9.WT或AAV9突变载体进行衣壳捕获ELISA。使用 GraphPadPrism计算EC50值。简而言之，将PAV9.1 mAb浓度以mg/mL的形式进行对数转换，并将其绘制在x轴上。将小鼠血浆中的IgG浓度定义为5mg/mL(Mink JG,“小鼠的血清免疫球蛋白水平和免疫球蛋白异质性(Serum immunoglobulin levels and immunoglobulin heterogeneityin the mouse)”《伊拉斯谟医疗中心论文(Diss.Erasmus MC.)》1980)，并且将在非人灵长类动物和人血清中的IgG浓度定义为10mg/mL (Gonzalez-Quintela A等人,《临床和实验免疫学(Clinical andExperimentalImmunology)》 2008；151(1):42-50)。对血浆/血清浓度(以μg/mL为单位)进行对数转换，并将其绘制在x轴上。定义了用每种突变体实现的最大吸光度，将吸光度归一化为100％，并将其绘制在y轴上。然后，使用GraphPad Prism的“log(激动剂)对归一化应答-可变斜率”函数生成剂量-应答曲线(抗体结合)。最后，计算PAV9.1mAb、多克隆血清或多克隆血浆的EC50。

9.动物研究

动物方案已经获得宾夕法尼亚大学的机构动物护理和使用委员会的批准并按照其标准执行。雄性C57BL/6小鼠(n＝3)在尾静脉中接受静脉内注射具有相同转基因盒的1e11 GC/小鼠AAV9.CMV.LacZ.bGH或AAV9突变载体。在接受载体14天后处死动物。将每只动物的器官分开，并且在干冰上速冻以用于生物分布，或将其嵌入最佳切割温度的化合物并冷冻以进行后续切片和β-gal活性染色。

10.生物分布分析

使用QIAamp DNA迷你试剂盒从所关注组织中提取DNA(德国希尔登凯杰公司)。如先前所描述的，通过针对bGH聚腺苷酸化信号的qPCR分析载体GC的组织(Chen SJ 等人,《人类基因疗法临床开发》2013；24(4):154-60)。

11.β-gal活性染色

将冷冻切片用含0.5％戊二醛的PBS在4℃下固定10分钟，并且然后对β-gal活性进行染色。在PBS中洗涤后，将1mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷) 中的切片在含20mM亚铁氰化钾、20mM铁氰化钾、2mM MgCl₂的PBS(pH为约7.3) 中温育，并将组织在37℃下放置过夜。在用核固红(载体实验室)对切片进行复染之后，使用乙醇和二甲苯对其进行脱水，然后进行载玻片。

B.结果

1.NAb PAV9.1对AAV9是有效的且有特异性的

首先旨在鉴定用于表位作图的新颖有效抗AAV9 NAb。通过针对多种血清型的酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选一组30个杂交瘤克隆的AAV反应性，并通过NAb测定筛选AAV9中和。由于其对AAV9的特异性，从此组中选择了单克隆抗体PAV9.1(图12A)。 PAV9.1通过ELISA识别仅完整的衣壳(图12A)，并且未通过蛋白质印迹识别AAV(数据未示出)，这表明PAV9.1鉴定了衣壳表面上的构象表位。这与剩余克隆相反，所述剩余克隆更广泛地结合筛选中所包含的此组AAV，并且还通过蛋白质印迹识别AAV(数据未示出)。在NAb测定中，经过纯化的PAV9.1 mAb示出1:163,840的有效的NAb效价，这表明此新颖抗AAV9抗体是AAV9的有效中和剂。再次，这与通过NAb测定筛选的不能中和AAV转导的其它克隆相反。

2.AAV9的冷冻重构与PAV9.1复合

在将AAV9与PAV9.1抗原结合片段(Fab)复合后，捕获了1,100张图像，对3,022 个颗粒进行加框，并使用AUTO3DEM产生复合物的

重构。观察到Fab密度从由 HVR IV、V和VIII构成的三重轴延伸，并且用Fab电子密度装饰垂直居中的三重突出的内表面(图13A和图13B)。此区主要包含带电荷残基，所述带电荷残基有利于三重相关VP单体之间以及与受体和mAb的强静电相互作用。单个Fab分子在每个三重轴处结合并跨三个突出中的两个突出延伸，从而由于空间位阻而阻断另外的Fab分子在这些位点处的结合(图13C)。与三重突出接触的PAV9.1 Fab互补决定区(CDR)的区的平均密度为2.5σ级，这与针对其它AAV-Fab重构报告的密度相当。观察到PAV9.1 Fab恒定区的密度为约0.8σ级，或者是PAV9.1 CDR的接触区所观察到的密度的约三分之一，这对应于每个三重轴的单个Fab占用率。PAV9.1 FabCDR与残基496-NNN-498(HVR V) 和588-QAQAQT-593(HVR VIII)直接相互作用(图13C和图13D)。PAV9.1结合另外阻塞残基G455和Q456(HVR IV)、T494、Q495和E500(HVR V)以及N583、H584、 S586和A587(HVR VIII)，所述残基不参与和PAV9.1的静电相互作用，但可以在Fab结合之后为衣壳的此区提供结构稳定性(表3)。重链的CDR与HVR V相互作用，而轻链的CDR与相同VP3单体的HVR VIII相互作用(图13C)。

表3：PAV9.1 Fab表位残基

基于PAV9.1足迹(图13D，表3)，选择了两组用于集中诱变以进行表位验证和规避突变体设计的五个残基：586-SAQAQ-590和494-TQNNN-498。选择残基 586-SAQAQ-590，因为此位点含有高度的序列多样性(图12B)。所选基序含有通过重构鉴定为直接与PAV9.1相互作用的残基，以及鉴定为阻塞的残基，从而允许查询结合残基与阻塞残基之间的连接。这些残基也与AAV1、AAV2和AAV8的中和表位有关，从而允许将AAV9表位残基与先前公开的残基进行比较(Tseng YS和Agbandje-McKenna M,《免疫学前沿(Front Immunol)》2014；5:9)。最后，将HVR VIII诱变限制到这五个残基上增加了衣壳将耐受较大突变的可能性，因为此基序与有助于衣壳结构完整性的区的相互作用更有限。尽管PAV9.1对AAV9具有特异性，但鉴定为与PAV9.1相互作用的 HVR V基序496-NNN-498在血清型之间是高度保守的(图12B)。然而，未公开的噬菌体展示工作(数据未示出)表明富含天冬酰胺的基序与PAV9.1的表位有关；因此，选择此基序进行诱变。还添加了残基494-TQ-495，以再次询问结合残基与阻塞残基之间的连接，因为它们先前与AAV-Ab相互作用有关(Tseng YS和Agbandje-McKenna M,《免疫学前沿》2014；5:9)。

3.基于表位的突变显著降低AAV9-PAV9.1结合

首先使用定点诱变产生586-SAQAQ-590血清型交换突变体。基于PAV9.1特异性识别AAV9的知识以及在此位置处的氨基酸序列和结构构象在AAV血清型之间变化很大的知识，选择与来自进化枝B(AAV2)、进化枝C(AAV3B)和进化枝D/E(AAV8/rh10) 的代表性血清型的对应残基完全交换(表4)。

表4：PAV9.1 HVR VIII表位残基的诱变策略

在这样做时，期望使高效的衣壳组装的可能性最大化，同时也使在此位置处的自然变异最大化。产生了另外两个突变体，AAV9.AAQAA(比AAV9.QQNAA更会聚)和 AAV9.RGHRE(比AAV9.RGNRQ更发散)，以确定(1)破坏PAV9.1相互作用所需的最小突变以及(2)可以引入的最大限度破坏。AAV9.AAQAA、AAV9.QQNAA和 AAV9.SSNTA突变体产生的载体的效价与AAV9.WT的载体的效价等同；然而，相对于 AAV9.WT的效价，AAV9.RGNRQ和AAV9.RGHRE的效价降低了两到三倍(数据未示出)。通过捕获ELISA，确定了与AAV9.WT相比，PAV9.1 mAb与每个突变衣壳的结合 (图14A)。相对于AAV9.WT的EC50，每种交换突变体的PAV9.1的达到半数最大结合所需的PAV9.1 mAb的EC50或浓度均显著增加(表明衣壳结合减少)。此结果证实了表位作图的结果，表明残基586-SAQAQ-590参与AAV9-PAV9.1的相互作用。EC50的增加的范围从45倍(AAV9.AAQAA)到几乎300倍(AAV9.RGHRE)(表5)；EC50的增加与来自此位置处的AAV9的序列差异程度直接相关。一个例外是AAV9.RGNRQ，其与AAV9共享Q590，这可能有助于比通过序列分析所期望的更强的PAV9.1结合。

表5：体外评估后AAV9衣壳突变体特性的总结

	Nab效价降低倍数	EC50增加倍数	WT转导百分比
				WT	1	1	100
AAQAA	16	45	27
				QQNAA	128	124	53
SSNTA	512	264	58
				RGNRQ	8	96	233
RGHRE	2048	294	60
				TQAAA	16	15	50
SAQAN	16	40	76
				SAQAA	4	20	54

由于AAV9.AAQAA中的S586A和Q590A突变足以破坏PAV9.1与AAV9的结合，因此接下来确定诱导此破坏所需的最小程度变化。通过丙氨酸替代或更保守的替代 (S->T或Q->N)，在这些位置之一处引入点突变。在S586处突变为丙氨酸或苏氨酸不会显著降低PAV9.1结合，而在Q590处单个突变为丙氨酸或天冬酰胺足以破坏通过 PAV9.1进行的衣壳识别(图14C)。此结果表明位置590对于PAV9.1识别AAV9衣壳至关重要。

接下来，使用以下相同的诱变策略对HVR V的494-TQNNN-498基序进行询问，以将其包含在PAV9.1表位中：将残基组突变为仅进化上保守的氨基酸或丙氨酸。由于 496-NNN-498在所有所测试的血清型中都是保守的，因此仅使用用于残基的此延伸段的丙氨酸替代；对于494-TQ-495，突变为AA以及GQ和TD，以表示在此位点处的天然存在的多样性。尽管PAV9.1对AAV9具有特异性并且在此位置处具有多样性，但是 AAV9.GQNNN、AAV9.TDNNN和AAV9.AANNN并未增加PAV9.1对AAV的EC50(图 14B)。这证实了来自冷冻重构图的结论，即，494-TQ-495位点不参与PAV9.1表位。然而，AAV9.TQAAA突变使PAV9.1 EC50增加了15倍，这表明尽管496-NNN-498是保守的基序，但其仍在PAV9.1的AAV9特异性结合中起重要作用。最后，从HVR V和最小 HVR VIII突变(AAV9.TQAAA/SAQAN、AAV9.TQAAA/SAQAA)产生组合突变体；这些组合突变体的PAV9.1 EC50值表明，PAV9.1表位中的改变的基序的作用是累积的(图 14D和图14E)。

4.基于表位的突变调节AAV9转导

为了评估新颖AAV9突变体规避NAb同时保持AAV9.WT的性质的能力，首先评估体外和体内转导。引起PAV9.1结合减少的大多数突变也降低了HEK293细胞中的转导效率，其中值得注意的例外是AAV9.RGNRQ，其将载体转导提高了2.3倍(图15A)。这种改善可能是由于引入了R586和R589(通过AAV2 VP1编号的R585和R588)，这两个残基负责通过AAV2识别肝素，由于包含这些肝素结合基序，所述AAV2在大多数细胞系中的体外性能显著优于AAV9((Ellis BL等人,《病毒学杂志》2013；10(1):74)。然而，与AAV9.RGNRQ共享R586和R589的AAV9.RGHRE没有表现出AAV2样转导效率，这表明其它因素的参与。AAV9.AAQAA表现出转导效率最大程度降低，这表明 S586和/或Q590是体外AAV9转导的必需残基。

5.基于表位的突变消融PAV9.1中和

接下来，检查了突变对PAV9.1中和效价的影响。不影响PAV9.1结合的突变体AAV9.AANNN不影响中和效价(图15B和图15I)。然而，所有增加PAV9.1 EC50的突变载体都会降低PAV9.1的有效中和效价。使EC50最显著增加近300倍的AAV9.RGHRE 使PAV9.1的NAb效价降低了至少2,048倍(从1:163,840降到<1:80，所测试的最低稀释度)(图15C-图15K)。较适度增加EC50的突变载体(如AAV9.SAQAN)使PAV9.1 的有效NAb效价降低的程度较小(图15L)。总之，观察到如通过EC50所测量的PAV9.1 结合的减少与有效NAb效价的降低之间有很强的相关性(图16)。值得注意的例外再次是AAV9.RGNRQ，尽管其是降低PAV9.1结合的第四个最有效突变体，但其使NAb效价降低了仅八倍(第二低的降低)。

6.PAV9.1表位对于AAV9肝向性是重要的

为了评估这些突变体作为AAV9样基因疗法载体的可行性，向C57BL/6小鼠静脉内注射1e11基因组拷贝(GC)/小鼠的AAV9.WT.CMV.LacZ或降低PAV9.1活性的AAV9 突变载体(n＝3每组)。第14天组织样品的生物分布表明所有突变体的肝脏转导降低。 AAV9.QQNAA与AAV9.WT的性能最类似，其中GC/μg DNA减少了17倍，而 AAV9.RGHRE的肝脏转导效率最低，其中GC/μg DNA减少了1,110倍(图17A)。然而，在其它器官(如心脏和脑)中，除AAV2样突变体、AAV9.RGNRQ和AAV9.RGHRE之外，大多数突变体维持在AAV9.WT的转导水平附近。尽管组织GC中的这些差异在统计学上并不显著，但观察到的趋势表明，这些残基对AAV9肝向性是重要的，但在其它组织的转导中作用较小，因为大多数突变体表现出“肝脱靶向性”表型。这些结果进一步反映在肝脏和心脏中的β-半乳糖苷酶(β-gal)的表达中；肝脏β-gal活性在接受AAV9.WT的动物中最高，而AAV9.WT与大多数突变体(除AAV2样突变体之外)之间的心脏β-gal活性类似(图17B和图17C)。

对于AAV9突变载体的代表性子集，以高十倍的剂量(1e12 GC/小鼠)重复这些实验。尽管在此剂量下转导差异没有达到显著性，但是组织向性趋势与在较低剂量下观察到的一致，特别是对于心脏和肌肉样品而言(图17D)。同样，这些结果也反映在肝脏、心脏和肌肉的组织学切片中的β-gal活性中(图17E-图17G)。

7.AAV9中的基于表位的突变不会显著影响通过多克隆血浆或血清进行的结合或中和

接下来，评估了基于PAV9.1表位的突变载体规避通过多克隆血浆或血清进行的结合和中和的能力。首先利用了来自先前用AAV9.WT静脉内注射的C57BL/6小鼠的血浆(7.5e8或7.5e9 GC/小鼠，n＝6每组)。确定了达到半数最大结合所需的血浆稀释度。来自低剂量小鼠的血浆与突变载体的结合和其与AAV9.WT的结合几乎没有区别(图18A- 图18C)。相反，相对于AAV9.WT的EC50，观察到针对突变体的子集的来自高剂量小鼠的血浆的EC50存在显著差异，最值得注意的是AAV9.RGNRQ(图18B-图18D)。尽管对于AAV9.RGNRQ，高剂量小鼠血浆的EC50平均增加了两倍，但在此突变体中，并未观察到血浆的有效NAb效价的降低(数据未示出)。

为了确定这种EC50增加趋势是否对非人灵长类动物样品也是如此，从一组六只猕猴中获得血清，所述猕猴接受了AAV9载体或与AAV9密切相关具有相同VP3序列的新颖载体(非结构VP1区的2个氨基酸差异)。确认猕猴在施用前针对AAV9的NAb效价 <1:5(定义为NAb阴性)。尽管与AAV9.WT的EC50相比，确实观察到针对突变载体每只动物的血清的EC50发生了一些变化，但基于突变体同一性，并没有出现明显的结合增加或减少的趋势(图19A和图19C)。当用预先存在的针对AAV9的NAb效价测试来自猕猴的血清(归因于先前的AAV感染)时，观察到AAV9突变体组的血清的EC50 几乎没有变化(图19B和图19D)。这与在注射的血清的EC50中看到的变化形成鲜明对比，表明在响应于AAV感染和AAV载体施用所产生的血清的相关抗AAV表位库之间存在基本差异。另外，针对AAV9.RGNRQ的注射的非人灵长类血清的EC50的增加并未降低针对AAV9.RGNRQ的血清的有效NAb效价(数据未示出)。

最后，评估了来自四个正常人类供体的NAb阳性血清样品与AAV9.WT和突变载体的结合。与未注射的NAb阳性非人灵长类动物血清样品的情况一样，针对AAV9突变体对WT载体，所有四个NAb阳性正常人类供体样品均表现出最小的EC50变化(图 20A-图20B)。如所期望的，突变载体的EC50缺乏变化转译为AAV9突变载体的血清的 NAb效价没有降低(数据未示出)。

C.讨论

此处，报告了与高效和特异性mAb PAV9.1复合的AAV9的冷冻重构。针对PAV9.1 确定的表位与从小鼠杂交瘤分离的其它AAV NAb的表位区在很大程度上重叠，即， ADK8(AAV8；586-LQQQNT-591)、E4E(AAV1；492-TKTDNNN-498)、5H7(AAV1； 496-NNNS-499、588-STDPATGD-595)和C37(AAV2；492-SADNNNS-498、 585-RGNRQ-589)(Gurda BL等人,《病毒学杂志》2012；86(15):7739-51；Gurda BL等人,《病毒学杂志》2013；87(16):9111-24；TsengYS等人,《病毒学杂志》2015； 89(3):1794-1808)。因此，尽管HVR V和VIII血清型之间存在很大程度的序列和结构差异，但此发现表明，三重突出可以是AAV9中和的重要位点，就像其它血清型一样。因此，关于针对其它AAV衣壳的NAb的库的先前发现可以适用于AAV9。尽管各种映射的中和表位显示出重叠，但是NAb的结合角和朝向显著变化。当与AAV9结合时，PAV9.1 延伸到三重对称轴的中心，在空间上限制于20个Fab颗粒的占用率；相比之下，针对其它血清型产生的mAb从三重轴在顶部或面向外结合，从而允许更高的占用率。研究已经将HVR V和VIII鉴定为跨血清型的共享抗原区，包含AAV2(与C37B复合，

)、 AAV8(与ADK8复合，

)和AAV1(与5H7复合，

)，其具有与PAV9.1对 AAV9的结合足迹的最大相似性(Gurda BL等人,《病毒学杂志》2012；86(15):7739-51； Gurda BL等人,《病毒学杂志》2013；87(16):9111-24；Tseng YS等人,《病毒学杂志》 2015；89(3):1794-1808)。因此，此处报告的结构与先前针对其它AAV血清型报告的低分辨率结构类似。

HVR VIII血清型交换为其对应突变载体赋予不同程度的结合和中和规避。用基于AAV2的RGHRE基序交换此区，所述基序是来自WT.AAV9序列的最分散突变体，在所有所测试的稀释度下均消融PAV9.1中和。因此，对衣壳中的仅五个氨基酸进行工程化可以规避单克隆Nab。实际上，显著降低PAV9.1活性所需的最小变化是单个氨基酸取代，其中甚至保守的氨基酸也导致消融结合和中和两者。HVR V中的NNN基序的突变降低了PAV9.1结合和中和AAV9的能力，尽管在血清型之间具有高度保守性，这表明其也是PAV9.1表位的整体部分。

观察到PAV9.1与给定AAV9突变体的结合减少与其在体外阻断此突变体转导的能力之间存在强相关性，这表明NAb对AAV的相对强度与NAb的中和能力相关。然而，来自所述实验室和其它实验室的数据表明，针对AAV的结合抗体效价并不总是个体的 NAb效价的良好预测，因为一些个体针对AAV具有中等结合效价，但是NAb阴性的 (Falese L等人,《基因疗法》2017；24(12):768-78；Huttner NA等人,《基因疗法》2003；10(26):2139-47)(未公开的数据)。尽管有这些发现，但一些临床试验的排除标准不仅包含NAb效价，还包含结合效价(George LA等人,《血液(Blood)》2017；130(增刊1):604； Mendell JR等人，《新英格兰医学杂志》2017；377(18):1713-22)。因此，表位作图研究对于鉴定结合表位的特征以及确定所述结合表位是否与中和表位共享任何共性至关重要。共享的基序表明，结合强度而不是与特异性残基的相互作用在AAV中和中起着重要作用，因此允许研究人员简单关注于减少NAb的结合。然而，不同的基序表明中和更多是结合位置的功能，而不是结合强度，并且表明研究人员应关注消融NAb与这些独特区的结合。

尽管AAV9载体中的突变显著减少了通过经过纯化的单克隆PAV9.1抗体进行的结合和中和，但是这些突变并没有显著规避通过来自先前暴露于AAV的小鼠、猕猴或人类供体的血清或血浆的多克隆抗体进行的结合或中和。最值得注意的是，来自接受较高静脉内剂量的AAV9载体的小鼠的血浆结合RGNRQ突变体的效率比WT.AAV9载体低两倍；与使用PAV9.1mAb观察到的50倍降低相比，这种变化要小得多。尽管与RGNRQ 突变相比，QQNAA、SSNTA和RGHRE突变对PAV9.1结合和中和的影响更大，但多克隆血浆以与WT.AAV9相同的方式与这些突变体结合。此结果表明，尽管586-SAQAQ-590 基序是有效的中和表位，并且此区中的突变可以阻断PAV9.1活性，但针对mAb的体外活性不能预测针对多克隆抗体的活性。也许令人惊讶的是，RGNRQ突变体通过使用三重突出有效地阻断了AAV9抗体的结合。此结果清楚地表明，并非所有突变针对多克隆应答都表现相同，并且更大的抗体库利用此区进行结合。

尽管多克隆结合减少，但是RGNRQ突变载体并未规避由这些小鼠响应于载体施用而产生的多克隆NAb应答。如所期望的，没有减少与多克隆血浆的结合的突变体也没有规避中和。鉴于RGNRQ的PAV9.1的EC50相对于WT.AAV9增加近100倍导致PAV9.1 中和效价降低了仅八倍，因此不令人惊讶的是，RGNRQ的多克隆血浆的EC50增加两倍不会降低中和效价。尽管研究表明，大多数映射的AAV表位都位于三重轴上，并且 HVR VIII与大多数血清型特异性NAb的映射的表位有关，但惊讶地发现，在此区中测试的突变中没有一种突变显著影响多克隆活性(应当注意的是，映射的表位可以不表示完整的库，因为映射的表位总数很小，并且一些研究的确切筛选和选择方法是未知的)。

Tse和同事最近使用文库方法来组合针对AAV1鉴定的三种不同NAb的表位，并产生新颖的基于AAV1的衣壳，其中从亲本AAV1变化的氨基酸超过20种。此衣壳不仅可以规避抗AAV1单克隆NAb，而且除来自暴露于AAV的正常人类供体的多克隆样品之外还可以规避来自注射AAV载体的小鼠和非人灵长类动物的多克隆样品(Tse LV等人,《美国国家科学院院刊》2017；114(24):E4812-21)。这表明在载体暴露和病毒感染后，中和表位可以重叠，但是此库是细微不同的。换言之，需要修饰以赋予规避与AAV 结合和中和的残基总数比先前认为的要更广泛。可以解决这两种情况的工程化的新颖衣壳可能需要组合和高通量方法。

这项研究探索了为规避来自先前AAV感染的预先存在的NAb应答而工程化的载体是否也将在重新施用的环境下发挥功能。基于PAV9.1的AAV9突变载体表现出甚至最小程度规避的多克隆样品是从已经接受AAV载体的来源获取的，并且不是从先前已经感染AAV的来源获取的。然而，注射的样品显示出AAV9突变体组的适度可变的结合曲线，并且由未经处理但病毒暴露源的载体产生的结合曲线与WT.AAV9的曲线类似。这些差异突出显示了响应于载体施用或感染而产生的AAV抗体库之间的基本差异。

从历史上看，注射有AAV载体的未经处理的受试者会产生对施用的载体具有特异性或仅限于紧密相关的血清型的NAb应答(Flotte TR等人,《人类基因疗法》2011； 22(10):1239-47)(未公开的数据)。大多数猕猴研究和基因疗法临床试验都示出了类似的结果(Greig JA等人,《疫苗(Vaccine)》2016；34(50):6323-29；Greig JA等人,《人类基因疗法临床开发》2017；28(1):39-50)(未公开的数据)。与之形成鲜明对比的是，具有一种AAV血清型的预先存在的抗体的受试者几乎总是血清阳性的，并且针对大多数其它血清型(甚至是较远相关的血清型)都具有NAb(Calcedo R和Wilson JM,《人类基因疗法临床开发》2016；27(2):79-82；Flotte TR等人,《人类基因疗法》2011； 22(10):1239-47；Harrington EA等人,《人类基因疗法》2016；27(5):345-53)(未公开的数据)。迄今为止，所有新颖的映射AAV mAb都对单独血清型具有特异性，并且仅与密切相关的血清型发生交叉反应(例如，与AAV1和AAV6两者结合的5H7)；先前分离的中和AAV mAb均不能重演AAV感染后常见的更广泛的应答(Gurda BL等人,《病毒学杂志》2013；87(16):9111-24)。因此，有必要进行进一步的研究以鉴定包括与先前存在的免疫相关的广泛中和表位的基序，确定表位是否与血清型特异性表位重叠，并评估重叠的基序如何赋予NAb广泛中和的表型。

在不同的暴露方法中，NAb应答的幅度变化很大；具有天然免疫的个体的NAb效价很少超过1:80(人)或1:320(猕猴)；相比之下，响应于中等剂量的载体的递送，NAb 效价>1:1,000可以容易地实现(Greig JA等人,《疫苗》2016；34(50):6323-29；Greig JA 等人,《人类基因疗法临床开发》2017；28(1):39-50；Greig JA等人,《公共科学图书馆综合(PLoSOne)》2014；9(11):e112268)。在这项研究中，接受最高载体剂量导致最高 NAb效价的小鼠在突变载体结合方面具有可测量变化；这表明NAb应答的强度影响突变体效率。通常，研究旨在将个体的NAb效价降低到干扰基因转移的阈值以下(静脉内施用为1:10)(Chicoine LG等人,《分子疗法》2014；22(2):338-47；Wang L等人,《人类基因疗法》2011；22(11):1389-1401)。仅赋予规避高效价血清的基于单个中和表位工程化的突变衣壳将不显著增加有资格接受AAV基因疗法的个体数量，因为较低的效价仍高于明显抑制转导的阈值。

减少HVR VIII中在Q590处的PAV9.1结合所需的最小程度突变，即使在将氨基酸保守地取代为天冬酰胺之后，也赋予了所得突变体的肝脱靶向性表型。表位的HVR V 部分的突变也减少了肝脏转导。这些结果与HVR V和VIII中的这些残基在肝脏转导中起着不可或缺的作用的先前观察结果一致，并且与示出与基因转移必需的区重叠的映射的中和AAV表位的先前报告一致(Adachi K等人,《自然通讯(Nature Communications)》 2014；5:3075；Tseng TS等人,《病毒学杂志》2015；89(3):1794-808)。这表明在维持亲本转导谱的同时，对可以规避NAb的突变体进行工程化将是困难的。对于心脏和肌肉中的一些适应症，其中肝脏转导可能是不那么间接的，这种向性修饰可能是可接受的。值得注意的是，在两种剂量下，大多数突变体在外周器官中均维持了WT.AAV9的转导水平。

然而，RGNRQ突变体在存在多克隆抗体的情况下表现出适度的结合修饰，示出了AAV2样转导谱：不仅对肝脏而且对所有周围器官的转导都很差。综上所述，这些数据表明将关于映射的中和表位的知识与关于AAV功能结构域的可用信息进行整合的重要性。产生可以规避NAb的衣壳是不够的，因为仅当衣壳仍然可以执行其靶组织转导的主要功能时，所述衣壳才是有用的。最近的研究已经使用此策略并入AAV1的多个表位以产生基于AAV1的载体，所述基于AAV1的载体可以规避NAb，同时维持AAV1样转导谱(Tse LV等人,《美国国家科学院院刊》2017；114(24):E4812-21)。

总之，这项研究提供了有关能够规避体液免疫应答的基于AAV9的载体的设计的关键信息。需要进一步的研究来进一步了解NAb对AAV9载体的应答的复杂性，以告知下一代衣壳的设计。

(序列表自由文本)

对于在数字标识符<223>下含有自由文本的序列，提供了以下信息。

本说明书中引用的所有文件通过引用并入本文中。均于2018年8月24日提交的美国临时专利申请第62/722,388号和第62/722,382号、均于2018年7月26日提交的美国临时专利申请第62/703,670号和第62/703,673号、均于2018年5月29日提交的美国临时专利申请第62/677,471号和第62/677,474号、于2018年5月29日提交的美国临时专利申请第62/667,585号以及于2018年2月27日提交的美国临时专利申请第62/635,964 号通过引用并入本文中。于2018年5月7日提交的美国临时专利申请第63/667,881号、于2018年5月7日提交的美国临时专利申请第62/667,888号、于2018年5月6日提交的美国临时专利申请号第62/667,587号、于2018年4月27日提交的美国临时专利申请第62/663,797号、于2018年4月27日提交的美国临时专利申请第62/663,788号、于2018 年2月27日提交的美国临时专利申请第62/635,968号通过引用并入。本文引用的并出现在所附序列表中的SEQ ID NO通过引用并入。尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解的是，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (28)

1.一种组合物，其包括重组腺相关病毒(rAAV)的混合群体，所述rAAV中的每个rAAV包括：

(a)AAV衣壳，所述AAV衣壳包括约60个衣壳vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白，其中所述vp1蛋白、所述vp2蛋白和所述vp3蛋白为：

vp1蛋白的异质群体，所述vp1蛋白由对所选AAV vp1氨基酸序列进行编码的核酸序列产生，

vp2蛋白的异质群体，所述vp2蛋白由对所选AAV vp2氨基酸序列进行编码的核酸序列产生，

vp3蛋白的异质群体，所述vp3蛋白由对所选AAV vp3氨基酸序列进行编码的核酸序列产生，

其中：所述vp1蛋白、所述vp2蛋白和所述vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括所述AAV衣壳中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化引起氨基酸变化，条件是所述rAAV不是AAVhu68；以及

(b)所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括核酸分子，所述核酸分子包括AAV反向末端重复序列和对产物进行编码的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列可操作地连接到引导所述产物在宿主细胞中的表达的序列。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱酰胺化的天冬酰胺被脱酰胺化为天冬氨酸、异天冬氨酸、相互转化的天冬氨酸/异天冬氨酸对或其组合。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述衣壳进一步包括一种或多种脱酰胺化的谷氨酰胺，所述一种或多种脱酰胺化的谷氨酰胺被脱酰胺化为(α)-谷氨酸、γ-谷氨酸、相互转化的(α)-谷氨酸/γ-谷氨酸对或其组合。

4.根据权利要求1到4中任一项所述的组合物，其中所述衣壳包括天冬酰胺-甘氨酸对中的四到五个高度脱酰胺化的天冬酰胺。

5.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其中所述衣壳包括在相对于AAV8或AAV9的编号的位置57处65％到100％脱酰胺化的天冬酰胺，如使用质谱测定的。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其包括：

(a)具有AAV8衣壳的rAAV，所述组合物进一步包括亚群体，在所述亚群体中，所述衣壳中的至少70％到100％的所述N在具有起始M的SEQ ID NO:6(经过编码的AAV8 vp1)的基于所述AAV8 vp1的编号的以下位置处被脱酰胺化：N57、N263、N385、N514和/或N540；

(b)具有AAV9衣壳的rAAV，所述rAAV进一步包括亚群体，在所述亚群体中，所述衣壳中的至少65％到100％的所述N在基于具有起始M的SEQ ID NO:7(经过编码的AAV9 vp1)的编号的以下位置处被脱酰胺化：N57、N329、N452和/或N512；

(c)具有AAVrh10衣壳(AAVrh10)的rAAV，所述rAAV进一步包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的SEQ ID NO:112(经过编码的AAVrh10 vp1)的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N263、N385和/或N514，或者

(d)具有AAVhu37衣壳(AAVhu37)的rAAV，所述rAAV进一步包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的SEQ ID NO:36(经过编码的AAVhu37 vp1)的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N263、N385和/或N514。

7.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：

(a)具有AAV1衣壳的rAAV，所述rAAV包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、基于SEQ ID NO:1的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N57、N383、N512、N718；

(b)具有AAV3B衣壳的rAAV，所述rAAV包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:2的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N57、N382、N512、N718；

(c)具有AAV5衣壳的rAAV，所述rAAV包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:3的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N56、N347、N347、N509；

(d)具有AAV7衣壳的rAAV，所述rAAV包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:4的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N41、N57、N384、N514；

(e)具有AAVrh32.33衣壳的rAAV，所述rAAV包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:5的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N57、N264、N292、N318；或者

(f)rAAV4载体，所述rAAV4载体包括vp1、vp2和/或vp3的亚群体，所述vp1、vp2和/或vp3在基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:111的编号的以下位置中的一个或多个位置处在所述N-G对处有至少70％到100％N脱酰胺化：N56、N264、N318、N546。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的组合物，其中所述衣壳包括在相对于AAV8或AAV9的编号的位置57处80％到100％脱酰胺化的天冬酰胺。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的组合物，其中所述AAV vp1蛋白和/或vp3蛋白的全部或亚群体在其N端处截短约1个到约5个氨基酸。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的组合物，其中所述AAV vp1蛋白和/或vp3蛋白的全部或亚群体在其C端处截短约1个到约5个氨基酸。

11.一种用于降低AAV衣壳的脱酰胺化的方法，所述方法包括由含有经过修饰的AAV vp密码子的核酸序列产生AAV衣壳，相对于参考AAV vp1序列，所述核酸序列包括处于天冬酰胺-甘氨酸对中的一到三个天冬酰胺-甘氨酸对处的独立地经过修饰的甘氨酸密码子，使得所述经过修饰的密码子对除甘氨酸之外的其它氨基酸进行编码。

12.一种用于降低AAV衣壳的脱酰胺化的方法，所述方法包括由含有经过修饰的AAV vp密码子的核酸序列产生AAV衣壳，相对于参考AAV vp1序列，所述核酸序列包括至少一个天冬酰胺-甘氨酸对的独立地经过修饰的天冬酰胺密码子，使得所述经过修饰的密码子对除天冬酰胺之外的其它氨基酸进行编码。

13.一种用于增加重组AAV的效价、效力或转导的方法，所述方法包括由含有至少一个AAV vp密码子的核酸序列产生AAV衣壳，所述至少一个AAV vp密码子被修饰成将所述衣壳中的至少一个天冬酰胺-甘氨酸对的天冬酰胺或甘氨酸变成不同的氨基酸。

14.根据权利要求11到13中任一项所述的方法，其中所述经过修饰的密码子在v2和/或vp3区中。

15.根据权利要求11到13中任一项所述的方法，其中vp1独特区中的天冬酰胺-甘氨酸对保留在经过修饰的rAAV中。

16.根据权利要求11到16中任一项所述的方法，其中在除以下位置之外的位置处修饰脱酰胺化位点：

(a)对于AAV8衣壳，具有起始M的SEQ ID NO:6(经过编码的AAV8 vp1)的基于所述AAV8vp1的编号的N57、N263、N385、N514和/或N540；

(b)对于AAV9衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:7(经过编码的AAV9 vp1)的编号的N57、N329、N452和/或N512；

(c)对于AAVrh10衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:112(经过编码的AAVrh10 vp1)的编号的N57、N263、N385和/或N514；或者

(d)对于AAVhu37衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:36(经过编码的AAVhu37 vp1)的编号的N57、N263、N385和/或N514。

17.根据权利要求16所述的方法，其中经过修饰的脱酰胺化位点选自表F、表G或表H上的位点。

18.根据权利要求11到15中任一项所述的方法，其中在除以下位置之外的位置处修饰脱酰胺化位点：

(a)对于AAV1衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、基于SEQ ID NO:1的编号的N57、N383、N512和/或N718；

(b)对于AAV3B衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:2的编号的N57、N382、N512和/或N718；

(c)对于AAV5衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:3的编号的N56、N347、N347和/或N509；

(d)对于AAV7衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:4的编号的N41、N57、N384和/或N514；

(e)对于AAVrh32.33衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ IDNO:5的编号的N57、N264、N292和/或N318；或者

(f)对于AAV4衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:111的编号的N56、N264、N318和/或N546。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述经过修饰的脱酰胺化位点选自表A、表B、表C、表D、表E、表F、表G或表H上的位点。

20.根据权利要求11到19中任一项所述的方法，其中每个经过修饰的密码子对不同的氨基酸进行编码。

21.根据权利要求11到19中任一项所述的方法，其中两个或更多个经过修饰的密码子对相同的氨基酸进行编码。

22.一种突变rAAV，其包括与未经修饰的AAV衣壳相比具有降低的脱酰胺化的AAV衣壳，所述AAV衣壳是使用根据权利要求11到21中任一项所述的方法产生的。

23.根据权利要求22所述的突变rAAV，其具有含有以下衣壳蛋白的突变AAV衣壳，所述衣壳蛋白具有基于VP1的编号的以下取代中的一个或多个取代：

(a)AAV8 G264A/G541A(SEQ ID NO:23)；

(b)AAV8 G264A/G541A/N499Q(SEQ ID NO:115)；

(c)AAV8 G264A/G541A/N459Q(SEQ ID NO:116)；

(d)AAV8 G264A/G541A/N305Q/N459Q(SEQ ID NO:117)；

(e)AAV8 G264A/G541A/N305Q/N499Q(SEQ ID NO:118)；

(f)AAV8 G264A/G541A/N459Q/N499Q(SEQ ID NO:119)；

(g)AAV8 G264A/G541A/N305Q/N459Q/N499Q(SEQ ID NO:120)；

(h)AAV8 G264A/G515A(SEQ ID NO:21)；

(i)AAV8G515A/G541A(SEQ ID NO:25)；

(j)AAV8 G264A/G515A/G541A(SEQ ID NO:27)；

(k)AAV9 G330/G453A(SEQ ID NO:29)；

(l)AAV9G330A/G513A(SEQ ID NO:31)；

(m)AAV9G453A/G513A(SEQ ID NO:33)；和/或

(n)G330 G453A/G513A(SEQ ID NO:35)。

24.根据权利要求22所述的突变rAAV，其具有含有以下衣壳蛋白的突变AAV衣壳，所述衣壳蛋白具有基于AAV8 VP1的编号的以下取代中的一个或多个取代：N263A、N514A或AAVN540A。

25.根据权利要求22所述的突变rAAV，其具有含有衣壳蛋白的突变AAV衣壳，其中以下位置处的野生型NG对被保留：N57、N94、N263、N305、G386、Q467、N479和/或N653。

26.一种组合物，其包括具有增加的效价、效力或转导的rAAV的群体，所述组合物包括具有衣壳的rAAV，与具有含有根据以下中的任一项的衣壳脱酰胺化模式的脱酰胺化模式的rAAV相比，所述衣壳被修饰成具有降低的总脱酰胺化：表A(AAV1)、表B(AAV3B)、表C(AAV5)、表D(AAV7)、表E(AAVrh32.33)、表F(AAV8)、表G(AAV9)或表H(AAVhu37)，条件是所述rAAV不是AAVhu68。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述rAAV具有在除以下位置之外的位置处修饰的脱酰胺位点：

(a)对于AAV8衣壳，具有起始M的SEQ ID NO:6(经过编码的AAV8 vp1)的基于所述AAV8vp1的编号的N57、N263、N385、N514和/或N540；

(b)对于AAV9衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:7(经过编码的AAV9 vp1)的编号的N57、N329、N452和/或N512；

(c)对于AAVrh10衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:112(经过编码的AAVrh10 vp1)的编号的N57、N263、N385和/或N514；或者

(d)对于AAVhu37衣壳，基于具有起始M的SEQ ID NO:36(经过编码的AAVhu37 vp1)的编号的N57、N263、N385和/或N514。

28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述rAAV具有在除以下位置之外的位置处修饰的经过修饰的氨基酸序列脱酰胺化位点：

(a)对于AAV1衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、基于SEQ ID NO:1的编号的N57、N383、N512和/或N718；

(b)对于AAV3B衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:2的编号的N57、N382、N512和/或N718；

(c)对于AAV5衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:3的编号的N56、N347、N347和/或N509；

(d)对于AAV7衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:4的编号的N41、N57、N384和/或N514；

(e)对于AAVrh32.33衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ IDNO:5的编号的N57、N264、N292和/或N318；或者

(f)对于AAV4衣壳，基于具有起始M的预测的vp1氨基酸序列的编号、参考SEQ ID NO:111的编号的N56、N264、N318和/或N546。

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