JP2024041967A - 新規アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクター、低減されたカプシド脱アミド化を有するａａｖベクター、およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】安定した受容体結合および／または安定したカプシドを有し、抗体を中和することを回避し、かつ／または保存時に純度を保持する異種分子を送達するためのＡＡＶ系構築物を含む組成物を提供する。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、ｖｐ１タンパク質の異種集団、ｖｐ２タンパク質の異種集団、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を有するＡＡＶカプシドを含む。カプシドは、コード化ＶＰ１アミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸を含み、カプシドは、アスパラギン－グリシン対で高度脱アミド化アスパラギン残基を含み、複数の他のより少ない脱アミド化アスパラギン、および任意でグルタミン残基をさらに含む。ｒＡＡＶのＡＡＶカプシド中の脱アミド化を低減する方法が提供される。【選択図】図１－１

Description

連邦政府支援研究の記述
本発明は、国立衛生研究所の国立心肺血液研究所により授与された助成番号Ｐ０１ＨＬ０５９４０７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドは、二十面体構造であり、１：１：１０の比率で、６０個のウイルスタンパク質（ＶＰ）モノマー（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）からなる（Ｘｉｅ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２；９９（１６）：１０４０５－１０）。ＶＰ３タンパク質配列（５１９ａａ）の全体は、ＶＰ１およびＶＰ２の両方のＣ末端内に含まれ、共有ＶＰ３配列は、主に全体のカプシド構造に関与する。ＶＰ１／ＶＰ２固有領域の構造的柔軟性、ならびに組み立てられたカプシド中のＶＰ３モノマーと比較してＶＰ１およびＶＰ２モノマーの低い表現のため、ＶＰ３は、Ｘ線結晶解析を介して解決される唯一のカプシドタンパク質である（Ｎａｍ
ＨＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１（２２）：１２２６０－７１）。ＶＰ３は、ＡＡＶ血清型間の配列多様性の主な供給源である９つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３；８７（２０）：１１１８７－９９）。それらの柔軟性およびカプシド表面上の位置を考慮すると、ＨＶＲは、標的細胞、および免疫系との相互作用に大きく関与する（Ｈｕａｎｇ ＬＹ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１６；９０（１１）：５２１９－３０、Ｒａｕｐｐ
Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２；８６（１７）：９３９６－４０８）。いくつかの血清型の構造が公開されているが（それぞれ、ＡＡＶ２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ４の構造エントリについて、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）データベースからのタンパク質データバンク（ＰＤＢ）番号１ＬＰ３、４ＲＳＯ、４Ｖ８６、３ＵＸ１、３ＫＩＣ、２ＱＡ０、２Ｇ８Ｇ）、これらのカプシドの表面の修飾に関する情報は文献に非常に少ない。研究は、カプシドの細胞内リン酸化が、特定のチロシン残基で生じることを示唆している（Ｚｈｏｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００８；３８１（２）：１９４－２０２）。主要なＶＰ３配列におけるグリコシル化部位が推定されているにもかかわらず、ＡＡＶ２におけるグリコシル化事象は特定されておらず（Ｍｕｒｒａｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６；８０（１２）：６１７１－６、Ｊｉｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７；２８（５）：２５５－２６７）、他のＡＡＶ血清型は、カプシドのグリコシル化についてまだ評価されていない。

ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、通常、組換えタンパク質治療法の開発および製造に伴う分子レベルの精査をあまり受けていない。ＡＡＶカプシド翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、ほとんど探索されていないため、それらが機能に影響を与える可能性について、または製造されたＡＡＶ療法におけるＰＴＭレベルを制御するための戦略についてほとんど知られていない。

非遺伝子療法タンパク質療法の翻訳後修飾の多様性は、それらの薬物としての開発を複雑化させている。Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ，ａｎｄ Ｔｙｔｈｅｒ，Ｒ（２００８）Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｂ
ｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３９：１１３－１１８、Ｈｏｕｄｅ，Ｄ，Ｐｅｎｇ，Ｙ，Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，ＳＡ，ａｎｄ Ｅｎｇｅｎ，ＪＲ（２０１０）．Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ＩｇＧ１ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ９：１７１６－１７２８。例えば、選択されたアミノ酸の脱アミド化は、組換え保護抗原系炭疽ワクチンの安定性および免疫応答を調節する。（Ｐｏｗｅｌｌ ＢＳ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２００７；６８（２）：４５８７９、Ｖｅｒｍａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；２３（５）：３９６－４０２）。いくつかの事例では、このプロセスは、ウイルスまたは細菌デアミダーゼによって触媒され、宿主細胞シグナル伝達経路または自然免疫応答を調節する（Ｚｈａｏ
Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１６；９０（９）：４２６２－８、Ｚｈａｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１６；２０（６）：７７０－８４）。より一般的に、内因性脱アミド化は、酵素に依存しない自発的プロセスである。自発的脱アミド化の目的は完全に解明されていないが、以前の研究では、この事象は、タンパク質の相対的な年齢を示し、その代謝回転を調節するための分子時計の役割を果たすことが示唆されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＮＥ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＡＢ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１；９８（３）：９４４－９）。

脱アミド化は、アスパラギンのアミド基またはそれほど頻繁ではないグルタミンが隣接する窒素原子から求核攻撃を受け、アミド基が失われると生じる。このプロセスは、スクシニミジル中間体（Ｙａｎｇ Ｈ ａｎｄ Ｚｕｂａｒｅｖ ＲＡ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２０１０；３１（１１）：１７６４－７２）をもたらし、加水分解を介して、アスパラギン酸およびイソアスパラギン酸（またはグルタミン酸およびイソグルタミン酸）の混合物に分解される（Ｃａｔａｋ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ａ．２００９；１１３（６）：１１１１－２０）。短い合成ペプチドの研究は、この加水分解が、アスパラギン酸に対するイソアスパラギン酸の３：１混合物をもたらすことを推定する（Ｇｅｉｇｅｒ Ｔ．ａｎｄ Ｃｌａｒｋｅ Ｓ．Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９８７；２６２（２）：７８５－９４。

安定した受容体結合および／または安定したカプシドを有し、抗体を中和することを回避し、かつ／または保存時に純度を保持する異種分子を送達するためのＡＡＶ系構築物を含む組成物の必要性が引き続き存在する。

一実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の混合集団を含む組成物であって、該ｒＡＡＶの各々が、（ａ）約６０個のカプシドｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質を含むＡＡＶカプシドであって、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、選択されるＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶ ｖｐ２アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶ ｖｐ３アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質の異種集団であり、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、ＡＡＶカプシド中のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意で他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞中で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、組成物が提供される。ｒＡＡＶの混合集団
は、１つのＡＡＶ型の予測されるＡＡＶ ＶＰ１アミノ酸配列をコードする単一型ＡＡＶカプシド核酸配列を使用する産生システムから生じる。しかしながら、製造および製造プロセスは、上記のカプシドタンパク質の異種集団を提供する。特定の実施形態では、組成物は、この段落に記載されるとおりであるが、ただし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８ではない。特定の実施形態では、組成物は、この段落に記載されるとおりであるが、ただし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ではない。

特定の実施形態では、脱アミド化アスパラギンは、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換アスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化される。特定の実施形態では、カプシドは、（α）－グルタミン酸、γ－グルタミン酸、相互変換（α）－グルタミン酸／γ－グルタミン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化される脱アミド化グルタミンをさらに含む。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドの脱アミド化を低減するための方法が提供される。かかる方法は、修飾されたＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列からＡＡＶカプシドを産生することを含み、核酸配列は、修飾されたコドンがグリシン以外のアミノ酸をコードするように、参照ＡＡＶ ｖｐ１配列に対してアスパラギン－グリシン対のうちの１～３個で独立して修飾されたグリシンコドンを含む。

他の実施形態では、ＡＡＶカプシドの脱アミド化を低減するための方法が提供される。かかる方法は、修飾されたＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列からＡＡＶカプシドを産生することを含み、核酸配列は、修飾されたコドンがアスパラギン以外のアミノ酸をコードするように、参照ＡＡＶ ｖｐ１配列に対して少なくとも１つのアスパラギン－グリシン対で独立して修飾されたアスパラギンコドンを含む。

ＡＡＶの力価、効力、および／または形質導入を増加させるための方法が提供される。本方法は、カプシド中の少なくとも１つのアスパラギン－グリシン対のアスパラギンまたはグリシンを異なるアミノ酸に変更するように修飾された少なくとも１つのＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列からＡＡＶカプシドを産生することを含む。特定の実施形態では、修飾されたコドンは、ｖ２および／またはｖｐ３領域内にある。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域内のアスパラギン－グリシン対は、修飾されたｒＡＡＶ中に保持される。特定の実施形態では、これらの変異ＡＡＶカプシドをコードする核酸分子配列が提供される。

特定の実施形態では、脱アミド化部位（例えば、アスパラギン－グリシン対またはＧｌｎ）は、（ａ）ＡＡＶ８カプシドについて、最初のＭを伴うＡＡＶ８ ｖｐ１の番号付けに基づいて、配列番号６（ＡＡＶ８ ｖｐ１をコードする）のＮ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、Ｎ５１４、および／またはＮ５４０、（ｂ）ＡＡＶ９カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号７（ＡＡＶ９ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、および／またはＮ５１２、あるいは（ｃ）ＡＡＶｒｈ１０カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号１１２（ＡＡＶｒｈ１０ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ２６３、Ｎ３８５、および／またはＮ５１４以外の位置で修飾される。特定の実施形態では、修飾された脱アミド化部位は、表Ｆまたは表Ｇ部位から選択される。特定の実施形態では、修飾された脱アミド化部位は、上記の（ａ）～（ｃ）の位置を除外する、表Ｆまたは表Ｇの部位から選択される。特定の実施形態では、脱アミド化部位（例えば、アスパラギン－グリシン対またはＧｌｎ（Ｑ）は、（ａ）ＡＡＶ１カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づく、配列番号１の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２、および／またはＮ７１８、（ｂ）ＡＡＶ３Ｂカプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号２の番号付けを参照して、Ｎ５７、Ｎ３８２、Ｎ５１２、および／ま
たはＮ７１８、（ｃ）ＡＡＶ５カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号３の番号付けを参照して、Ｎ５６、Ｎ３４７、Ｎ３４７、および／またはＮ５０９、（ｄ）ＡＡＶ７カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号４の番号付けを参照して、Ｎ４１、Ｎ５７、Ｎ３８４、および／またはＮ５１４、（ｅ）ＡＡＶｒｈ３２．３３カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号５の番号付けを参照して、Ｎ５７、Ｎ２６４、Ｎ２９２、および／またはＮ３１８、あるいは（ｆ）ＡＡＶ４カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号１１１の番号付けを参照して、Ｎ５６、Ｎ２６４、Ｎ３１８、および／またはＮ５４６以外の位置で修飾される。特定の実施形態では、修飾された脱アミド化部位は、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表Ｅ、表Ｆ、または表Ｇの部位から選択される。特定の実施形態では、修飾された脱アミド化部位は、上述の（ａ）～（ｆ）の位置を除外する。

特定の実施形態では、本方法は、ＡＡＶ８の番号付けに基づくか、または選択された配列とＡＡＶ８の整列に基づく別のＡＡＶで、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ（配列番号２１）、ＡＡＶ８Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２３）、ＡＡＶ８Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２５）、またはＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２７）、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１５）、（ｃ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１６）、（ｄ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１７）、（ｅ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１８）、ＡＡＶ８
Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１９）、またはＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１２０）の変異を有する選択された変異ＡＡＶ８カプシドを有する組換えＡＡＶを生成することを含む。特定の実施形態では、本方法は、ＡＡＶ９ Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ（配列番号２９）、ＡＡＶ９Ｇ３３０Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３１）、ＡＡＶ９Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３３）、および／またはＡＡＶ９ Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３５）から選択される変異ＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶを生成することを含む。

特定の実施形態では、これらの変異ＡＡＶカプシドをコードする核酸分子配列が提供される。特定の実施形態では、核酸配列は、例えば、配列番号２０（ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ）、配列番号２２（ＡＡＶ８Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ）、配列番号２４（ＡＡＶ８Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ）、または配列番号２６（ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ）に提供される。特定の実施形態では、核酸配列は、例えば、配列番号２８（９Ｇ３３０ＡＧ４５３Ａ）、配列番号３０（９Ｇ３３０ＡＧ５１３Ａ）、配列番号３２（９Ｇ４５３ＡＧ５１３Ａ）、配列番号３４（９Ｇ３３０ＡＧ４５３ＡＧ５１３Ａ）に提供される。特定の実施形態では、他のＡＡＶは、ＡＡＶ ９との整列に基づいて、これらまたは対応するＮＧ対のかかる変化を有するように変異され得る。

増加した力価、効力、または形質導入を有するｒＡＡＶの集団を含む組成物が提供される。特定の実施形態では、組成物は、表Ａ（ＡＡＶ１）、表Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、表Ｃ（ＡＡＶ５）、表Ｄ（ＡＡＶ７）、表Ｅ（ＡＡＶｒｈ３２．３３）、表Ｆ（ＡＡＶ８）、表Ｇ（ＡＡＶ９）、または表Ｈ（ＡＡＶｈｕ３７）のうちのいずれか１つに従うカプシド脱アミド化パターンを有するｒＡＡＶと比較して、減少した総脱アミド化を有するように修飾されたカプシドを有するｒＡＡＶを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、本明細書で特定された高度脱アミド化位置で未修飾である。

本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなるであ
ろう。

図１Ａ～図１Ｇは、ＡＡＶ８ ＶＰアイソフォームの電気泳動分析。（図１Ａ）図は、アスパラギン残基が隣接する窒素原子によって求核攻撃を受け、スクシニミジル中間体を形成するメカニズムを示す。次いで、この中間体は加水分解を受け、アスパラギン酸およびイソアスパラギン酸の混合物に分解する。ベータ炭素は、このように標識される。図は、ＢＩＯＶＩＡ Ｄｒａｗ ２０１８で生成された。（図１Ｂ）１μｇのＡＡＶ８ベクターを変性一次元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで実行した。（図１Ｃ）炭酸脱水酵素ｐＩマーカースポットの等電点を示す。（図１Ｄ）５μｇのＡＡＶ８ベクターを二次元ゲル電気泳動によって分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色した。スポット１～２０は、カルバミル化炭酸脱水酵素ｐＩマーカーである。ボックス領域は、ａ＝ＶＰ１、ｂ＝ＶＰ２、ｃ＝ＶＰ３、ｄ＝内部トロポミオシンマーカーである（矢印：ＭＷ＝３３ｋＤａ、ｐＩ＝５．２のトロポミオシンスポット）。等電点電気泳動は、４～８のｐＩ範囲で実行した。図１Ｅ～図１Ｇ）４～８のｐＩ範囲で実行される等電点電気泳動の結果。１ｅ１１ ＧＣのｗｔＡＡＶ８（図１Ｅ）または変異（図１Ｆおよび図１Ｇ）ベクターであり、これを２Ｄゲル電気泳動で分析し、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙで染色した。タンパク質標識：Ａ＝ＶＰ１、Ｂ＝ＶＰ２、Ｃ＝ＶＰ３、Ｄ＝ニワトリ卵白コンアルブミンマーカー、Ｅ＝ターボヌクレアーゼマーカー。等電点電気泳動は、６～１０のｐＩ範囲で実行した。主要なＶＰ１／２／３アイソフォームスポットは円で囲まれ、マーカーの主要スポットの移行距離を垂直線（ターボヌクレアーゼ＝破線、コンアルブミン＝固体）で示す。 同上。 同上。 図２Ａ～図２Ｅは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質におけるアスパラギンおよびグルタミン脱アミド化の分析。（図２Ａ～図２Ｂ）Ａｓｎ－９４（図２Ａ）およびＡｓｐ－９４（図２Ｂ）を含む３＋ペプチド（９３－１０３）のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析、ならびに理論的および観察された質量を示す。（図２Ｃ～図２Ｄ）Ａｓｎ－２５４（図２Ｃ）およびＡｓｐ－２５４（図２Ｄ）を含む３＋ペプチド（２４７－２５９）のＥＳＩ質量分析、ならびに理論的および観察された質量を示す。Ａｓｎ－９４およびＡｓｎ－２５４で観察された質量シフトは、０．９８４Ｄａの理論的質量シフトに対して、それぞれ０．９８２Ｄａおよび０．９８６Ｄａであった。（図２Ｅ）目的の特定のアスパラギンおよびグルタミン残基での脱アミド化率は、異なる方法で精製されたＡＡＶ８トリプシンペプチドについて示される。Ｎ＋１グリシンを有するアスパラギン残基における脱アミドを示すバーが、網掛けされている。分析した少なくとも１つの調製物中で少なくとも２％脱アミド化されていると決定された残基が含まれた。データは、平均値±標準偏差で表される。 同上。 同上。 図３Ａ～図３Ｅは、ＡＡＶ８ ＶＰ３モノマーの構造モデリングおよび脱アミド化部位の分析。（図３Ａ）ＡＡＶ８ ＶＰ３モノマー（ＰＤＢ識別子：３ＲＡ８）をコイル表現で示す。リボンの色は、相対的な柔軟性の度合いを示す（青＝最も強固／普通の温度因子、赤＝最も柔軟／高い温度因子）。球体は、目的の残基を示す。拡大図は、目的の残基およびその周辺残基のボールおよびスティック表現であり、局所タンパク質構造（青＝窒素、赤＝酸素）を示す。下線が引かれた残基はＮＧモチーフのものである。図３Ｂ～図３Ｅ：Ｎ＋１グリシンを有する脱アミド化アスパラギンのイソアスパラギン系モデルを示す。２ＦｏＦｃ電子密度マップ（１シグマレベル）は、（図３Ｃ）Ｎ２６３、（図３Ｄ）Ｎ５１４、および（図３Ｅ）Ｎ５４０のイソアスパラギン酸モデルと比較した、（図３Ｂ）Ｎ４１０のアスパラギンモデルによるＡＡＶ８結晶構造（ＰＤＢ番号：３ＲＡ８）の精密化から生成される。電子密度マップは、マゼンタグリッドで示す。ベータ炭素は、このように標識される。矢印は、目的の残基のＲ基に対応する電子密度を示す。 同上。 図４Ａ～４Ｄは、ＡＡＶ８カプシド脱アミド化に影響を及ぼす因子の決定。ＡＡＶ８調製物を（図４Ａ）７０^ｏＣで３日間または７日間インキュベートし、（図４Ｂ）ｐＨ２またはｐＨ１０に７日間曝露し、または（図４Ｃ）Ｈ_２Ｏの代わりにＤ_２Ｏを使用して質量分析のために調製し、ＡＡＶカプシド形成に固有ではない脱アミド化の可能な供給源を特定した。（図４Ｄ）カプシドの構造的完全性を評価するためにＢ１抗体（変性カプシドに反応）およびＡＡＶ８構造特異的抗体（無傷のカプシドに反応）を使用して、図４Ａのように処理されたベクターのドットブロット。 同上。 同上。 同上。 図５Ａ～図５Ｂは、非ＡＡＶタンパク質の脱アミド化頻度。脱アミド化率は、ＡＡＶ脱アミド化率との比較のために、脱アミド化される可能性が高いＮＧモチーフを含む２つの非ＡＡＶ組換えタンパク質、ヒト炭素脱水酵素（図５Ａ）およびラットフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（図５Ｂ）について示される。 同上。 図６は、２つの機関からのデータ分析パイプラインを使用して計算されたＡＡＶ８脱アミド化率の比較。目的の特定のアスパラギンおよびグルタミン残基での脱アミド化率は、２つの異なる機関で評価されるＡＡＶ８トリプシンペプチドについて示される。 図７Ａ～図７Ｃは、ロット間のばらつきが大きい非ＮＧ部位での機能的なアスパラギン置換を例示する。（図７Ａ）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ８および変異ベクターの力価。力価は、ｗｔＡＡＶ８対照に対して報告される。形質導入効率は、図８Ｂに記載されているように測定した。力価および形質導入効率は、ｗｔＡＡＶ８対照の値に正規化される。（図７Ｂ）注入後１４日目の代表的なルシフェラーゼ画像を、ｗｔＡＡＶ８．ＣＢ７．ｆｆｌｕｃおよびＮ４９９Ｑカプシド変異ベクターを受容するマウスについて示す。（図７Ｃ）ルシフェラーゼイメージングによって測定し、総流量単位で報告されるｗｔＡＡＶ８または変異ベクター（ｎ＝３または４）を静脈内注入したＣ５７ＢＬ／６マウスから、研究期間の１４日目のルシフェラーゼ発現。すべてのデータは、平均値＋標準偏差として表される。 同上。 同上。 図８Ａおよび図８Ｂは、ベクター性能に対する遺伝子脱アミド化の影響のインビトロ分析の結果を示す。（図８Ａ）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ８および遺伝的脱アミド化変異ベクターの力価。力価は、ｗｔＡＡＶ８対照に対して報告される。脱アミドが多いＮＧ部位（パターン化バー）、脱アミドが少ない部位（白色バー）、および可変性が高い部位（黒色バー）は、ｗｔＡＡＶ８および陰性対照で表示する。（図８Ｂ）ｗｔＡＡＶ８対称と比較して報告されたホタルルシフェラーゼを産生する変異ＡＡＶ８ベクターの形質導入効率。形質導入効率は、ＨＵＨ７細胞に追加されたＧＣごとに生成された発光単位で測定され、複数の希釈で粗製ベクターを用いて形質導入を行うことによって決定される。形質導入効率のデータは、野生型（ｗｔ）参照に正規化される。すべてのデータは、平均値±標準偏差として表される。 同上。 図９Ａ～図９Ｄは、経時的なベクター活性損失が、進行性脱アミド化と相関していることを例示する。（図９Ａ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子をパッケージ化するＡＡＶ８ベクターを産生するトリプルトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の時間経過におけるベクター産生（ＤＮＡｓｅＩ耐性ゲノムコピー、ＧＣ）。ＧＣレベルは、最大観察値に正規化される。（図８Ｂ）精製された時間経過ベクターを使用して、Ｈｕｈ７細胞を形質導入した。形質導入効率（標的細胞に追加されたＧＣあたりの発光単位）は、図８Ｂのように、精製された時間経過ベクター試料の複数の希釈液を使用して測定した。誤差バーは、各試料時間の少なくとも１０の技術的複製の標準偏差を表す。トランスフェクションの１、２、および５日後に収集されたベクターのＡＡＶ８ ＮＧ部位（図９Ｃ）および非ＮＧ部位（図９Ｄ）の脱アミド化。 同上。 同上。 同上。 ベクター性能に対するアスパラギンの安定化の影響を例示する。図１０Ａは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ８および＋１位置変異ベクターの力価を示す。力価は、ｗｔＡＡＶ８対照に対して報告される。図１０Ｂは、ｗｔＡＡＶ８対照と比較して報告されたホタルルシフェラーゼを産生する変異ＡＡＶ８ベクターの形質導入効率を示す。形質導入効率は、粗ベクター材料を使用して図８Ｂのように測定された。２試料ｔ試験（＊ｐ＜０．００５）を実行して、Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５ＡおよびＧ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａに関するｗｔＡＶ８と変異形質導入効率との間の有意性を決定した。図１０Ｃは、ルシフェラーゼイメージングによって測定し、総流量単位で報告されるｗｔＡＡＶ８または変異ベクター（ｎ＝３～５）を静脈内注入したＣ５７ＢＬ／６マウスからの肝臓領域における、研究期間の１４日目のルシフェラーゼ発現を示す。図１０Ｄは、ｗｔＡＡＶ８対照と比較して報告されたホタルルシフェラーゼを産生する複数部位ＡＡＶ８変異ベクターの力価および形質導入効率を示す。すべてのデータは、平均値±標準偏差として表される。 ＡＡＶ９カプシドタンパク質におけるアスパラギンおよびグルタミン脱アミド化の分析。（図１１Ａ）１ｅ１１ＧＣのｗｔＡＡＶ９は、２Ｄゲル電気泳動で分析し、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙで染色した。タンパク質標識：Ａ＝ＶＰ１、Ｂ＝ＶＰ２、Ｃ＝ＶＰ３、Ｄ＝ニワトリ卵白コンアルブミンマーカー、Ｅ＝ターボヌクレアーゼマーカー。等電点電気泳動は、６～１０のｐＩ範囲で実行した。（図１１Ｂ）目的の特定のアスパラギンおよびグルタミン残基での脱アミド化率は、異なる方法で精製されたＡＡＶ９トリプシンペプチドについて示される。Ｎ＋１グリシンを有するアスパラギン残基における脱アミドを示すバーが、網掛けされている。分析した少なくとも１つの調製物中で少なくとも２％脱アミド化されていると決定された残基が含まれた。データは、平均値±標準偏差で表される。（図１１Ｃ）Ｎ５１２のイソアスパラギンモデルは、ＡＡＶ９結晶構造の非偏向精製によって生成された２ＦｏＦｃ電子密度マップ（ＰＤＢ番号：３ＵＸ１）に示される。矢印は、残基Ｎ５１２のＲ基に対応する電子密度を示す。 ＡＡＶ９カプシド脱アミド化に影響を及ぼす因子の決定。（図１１Ｄ）２つのＡＡＶ９調製物を７０^ｏＣで３日間または７日間インキュベートし、（図１１Ｆ）ｐＨ２またはｐＨ１０に７日間曝露し、ＡＡＶカプシド形成に固有ではない脱アミド化の可能な供給源を特定した。データは、平均値±標準偏差で表される。（図１１Ｆ）カプシド構造の完全性を評価するためにＢ１抗体（変性カプシドに反応する）を使用して、図１１Ｄのように処理されたベクターのドットブロット。 ＡＡＶ９のベクター性能に対する遺伝子脱アミド化の影響のインビトロ分析を例示する。（図１１Ｇ）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ９および遺伝的脱アミド化変異ベクターの力価。力価は、ｗｔＡＡＶ９対照に対して報告される。脱アミドが多いＮＧ部位（パターン化バー）、脱アミドが少ない部位（白色バー）、および可変性が高い部位（黒色バー）は、ｗｔＡＡＶ８および陰性対照で表示する。（図１１Ｈ）ホタルルシフェラーゼを産生する変異ＡＡＶ９ベクターの形質導入効率は、ｗｔＡＡＶ９対照と比較して報告される。すべてのデータは、平均値±標準偏差として表される。 図１１Ｉ～図１１Ｋは、ＡＡＶ９ベクターの効力を経時的に示す。（図１１Ｉ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子をパッケージ化するＡＡＶ９ベクターを産生するトリプルトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の時間経過におけるベクター産生（ＤＮＡｓｅＩ耐性ゲノムコピー、ＧＣ）。ＧＣレベルは、最大観察値に正規化される。（図１１Ｊ）粗製時間経過ベクターを使用して、Ｈｕｈ７細胞を形質導入した。（図１１Ｋ）トランスフェクション１日後対トランスフェクション５日後に収集されたベクターの形質導入効率を、粗製および精製ベクター試料について示す。形質導入効率は、１日目の値に正規化されたルシフェラーゼ活性／ＧＣとして表される。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１２Ａ～図１２Ｂは、ＰＡＶ９．１モノクローナル抗体の特徴付けおよびＰＡＶ９．１エピトープに基づく変異誘発戦略。図１２Ａ：天然または変性カプシドタンパク質を用いた捕捉ＥＬＩＳＡに基づく様々なＡＡＶ血清型のＰＡＶ９．１認識。図１２Ｂ：ＡＡＶ ＶＰ １アミノ酸配列（配列番号１０～１９、上から下）の整列、ＰＡＶ９．１のエピトープに関係のある残基は黒色ボックス内にある。 同上。 図１３Ａ～図１３Ｄは、ＰＡＶ９．１ Ｆａｂと複合したＡＡＶ９の低温ＥＭ再構築。図１３Ａ：ＰＡＶ９．１ Ｆａｂと結合したＡＡＶ９カプシド（フクシア）の分子表面の描写（４．２Å分解能で再構築された３倍軸の突起での青。３，０２２個の粒子をボックス化し、Ａｕｔｏ３ｄＥＭを電子顕微鏡再構築に使用した。図１３Ｂ：ＡＡＶ９－ＰＡＶ９．１複合体の断面の描写。図１３Ｃ：低温再構築から得られた密度に組み込まれたＡＡＶ９－ＰＡＶ９．１トリマーの疑似原子モデル。ＶＰ３モノマーは、緑色、灰色、およびシアンで示す。球体は、結合残基を表す。重鎖をインディゴに、軽鎖を赤色にした単一ＰＡＶ９．１ Ｆａｂを図示した。図１３Ｄ：ＰＡＶ９．１結合に関与する残基の二次元「ロードマップ」。 図１４Ａ～図１４Ｅは、ＡＡＶ９についてのＰＡＶ９．１ ｍＡｂのＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。ＡＡＶ９に対するカプシド捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、ＰＡＶ９．１の結合曲線を分析および生成した。図１４Ａ～図１４Ｅは以下を示す：５８６～５９０スワップ変異（図１４Ａ）、４９４～４９８変異（図１４Ｂ）、５８６～５９０点変異（図１４Ｃ）、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡおよびＡＡＶ９．ＳＡＱＡＮ単一ならびに組み合わせ変異（図１４Ｄ）、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡおよびＡＡＶ９．ＳＡＱＡＡ単一ならびに組み合わせ変異（図１４Ｅ）。吸光度を各カプシドの最大吸光度に正規化した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なラインおよびＥＣ５０を決定した。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１５Ａ～図１５Ｋは、インビボベクター形質導入および有効なＰＡＶ９．１ ｍＡｂ中和力価に対するＰＡＶ９．１エピトープ変異の影響を特徴付ける。図１５Ａ：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ９．ＷＴと比較したＰＡＶ９．１カプシド変異の形質導入効率。両側１試料ｔ検定を使用して有意性を決定し、各変異のパーセント形質導入をＡＡＶ９．ＷＴの形質導入（１００％と定義される）と比較した。Ｐ値は、ｐ＊＜０．０５、ｐ＊＊＊＜０．００１として示される。図１５Ｂ～図１５ｋ：ＨＡＶ２９３細胞をＡＡＶ９．ＷＴ．ＣＭＶ．ＬａｃＺ（図１５Ｂ）、ＡＡＶ９．ＡＡＱＡＡ（図１５Ｃ）、ＡＡＶ９．ＱＱＮＡＡ（図１５Ｄ）、ＡＡＶ９．ＳＳＮＴＡ（図１５Ｅ）、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱ（図１５Ｆ）、ＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥ（図１５Ｇ）、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡ（図１５Ｈ）、ＡＡＶ９．ＡＡＮＮＮ（図１５Ｉ）、ＡＡＶ９．ＳＡＱＡＮ（図１５Ｊ）、またはＡＡＶ９．ＳＡＱＡＡ（図１５Ｋ）で形質導入する場合のＰＡＶ９．１の中和力価を決定する。ｍＡｂなしのベクター（相対光単位で測定されるレベル）よりも５０％以上高い形質導入レベルを達成することができる時点以前の希釈として中和力価を定義した。すべてのデータは平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１６は、ＡＡＶ９変異のパネルのＰＡＶ９．１ ＥＣ５０および中和力価の相関関係。ＡＡＶ９．ＷＴに対するＰＡＶ９．１中和力価と比較して、各変異に対するＰＡＶ９．１中和力価の倍率低下を計算した。直線スケール（片対数プロット）で、ＡＡＶ９．ＷＴのＰＡＶ９．１ ＥＣ５０と比較した各変異のＰＡＶ９．１ ＥＣ５０の倍率増加に対して対数スケールでデータをプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、最適な片対数線を決定した；Ｒ^２＝０．８４７４。 図１７Ａ～図１７Ｇは、ＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異ベクターのインビボ分析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、マウスあたり１ｅ１１ ＧＣ（図１７Ａ～図１７Ｃ）またはマウスあたり１ｅ１２ ＧＣ（図１７Ｄ～図１７Ｆ）のＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＬａｃＺ（ＷＴまたは変異；ｎ＝３）のいずれかの静脈内注入を受けた。１４日目にマウスを犠牲にし、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを使用して、生体内分布分析（図１７Ａおよび図１７Ｄ）のために組織を採取した。値は、平均値±ＳＤとして報告される。また、β－ｇａｌ組織化学のために肝臓（図１７Ｂおよび図１７Ｅ）、心臓（図１７Ｃおよび図１７Ｆ）、および筋肉（図１７Ｇ）を採取して、酵素活性を決定した。代表的な１０倍画像を示す；スケールバー＝２００μｍ。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１８Ａ～図１８Ｄは、ＡＡＶ９の注入マウス血漿のＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。カプシド捕獲ＥＬＩＳＡを使用して、７．５ｅ８ ＧＣ／マウス（図１８Ａ）、または７．５ｅ９ ＧＣ／マウス（図１８Ｂ）のＡＡＶ９．ＷＴまたはＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異結合のｗｔＡＡＶ９．ＬＳＰ．ｈＦＩＸのいずれかの静脈内注入を受けたマウスの５６日目の血漿を分析した。吸光度を各カプシドで達成された最大吸光度に正規化した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なラインおよびＥＣ５０を決定した。各グラフは、単一動物に対応する。７．５ｅ８ ＧＣ／マウス（図１８Ｃ）、または７．５ｅ９ ＧＣ／マウス（図１８Ｄ）のＥＣ５０値を収集して、各変異の平均値を決定した。両側１試料ｔ検定を使用して、ＡＡＶ９．ＷＴ（１として定義される）の血漿のＥＣ５０と比較して、各変異の血漿のＥＣ５０と有意差があったかを決定した。ボンフェローニ補正は、タイプ１エラーの制御に適用された。Ｐ値は、＊＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１のように表される。ＥＣ５０データは、平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 同上。 同上。 図１９Ａ～図１９Ｄは、ＡＡＶ９のＮＨＰポリクローナル血清のＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。カプシド捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、（図１９Ａ）ＡＡＶ９．ＷＴまたはｈｕ６８．ＷＴベクターで処理したＮＨＰ、または（図１９Ｂ）ＡＡＶ９．ＷＴまたはＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異結合についてＡＡＶ９ ＮＡｂ（＋）である未処理ＮＨＰからの血清を分析した。吸光度を各カプシドで達成された最大吸光度に正規化した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なＥＣ５０を決定した。各グラフは、単一動物に対応する。ベクター処理ＮＨＰ（図１９Ｃ）および未処理ＮＡｂ（＋）ＮＨＰのＥＣ５０値を収集して、各変異の平均を決定した（図１９Ｄ）。両側１試料ｔ検定を使用して、ＡＡＶ９．ＷＴ（１として定義される）の血漿のＥＣ５０と比較して、各変異の血漿のＥＣ５０と有意差があるかを決定した。ボンフェローニ補正は、タイプ１エラーの制御に適用された。ＥＣ５０データは、平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 同上。 同上。 図２０Ａ～図２０Ｂは、ＡＡＶ９のヒトドナーポリクローナル血清のＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。図２０Ａ：カプシド捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、ＡＡＶ９．ＷＴまたはＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異の結合についてＡＡＶ９ ＮＡｂ（＋）であった未処理ヒトドナーからの血清を分析した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なラインおよびＥＣ５０を決定した。各グラフは、単一ドナーに対応する。図２０Ｂ：ＮＡｂ（＋）ヒトドナー血清のＥＣ５０値を収集し、各変異の平均を決定した。両側１試料ｔ検定を使用して有意性を決定し、ＡＡＶ９．ＷＴの血漿のＥＣ５０（１として定義される）に対する各変異の血漿のＥＣ５０を比較した。ボンフェローニ補正は、タイプ１エラーの制御に適用された。ＥＣ５０データは、平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 図２１Ａ～図２１Ｂは、ＡＡＶ８についてのＮ５７Ｑ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３８５Ｑ、Ｎ５１４Ｑ、Ｎ５４０Ｑ、Ｎ９４Ｑ、およびＮ４１０Ｑ変異を含む、６ウェルプレートスケール実験からのＡＡＶ８のインビトロ力価および形質導入データを示す。 図２２Ａ～図２２Ｂは、ＡＡＶ９についてのＮ５７Ｑ、Ｎ３２９Ｑ、Ｎ４５２Ｑ、Ｎ２７０Ｑ、Ｎ４０９Ｑ、Ｎ６６８Ｑ、Ｎ９４Ｑ、Ｎ２５３Ｑ、Ｎ６６３Ｑ、およびＮ７０４Ｑ変異を含む、６ウェルプレートスケール実験からのＡＡＶ９のインビトロ力価および形質導入データを示す。 図２３Ａ～２３Ｂは、１４日目のマウスにおける肝臓発現について試験したマウスにおいて、それぞれＡＡＶ８およびＡＡＶ９のインビボ形質導入データを提供する（ルシフェラーゼイメージング）。図２３Ａは、ＡＡＶ８について野生型と比較した、ＡＡＶ８変異Ｎ５７Ｑ、Ｎ２６３Ｑ、およびＮ３８５Ｑを示す。図２３Ｂは、野生型ＡＡＶ９と比較した、ＡＡＶ９変異Ｎ５７Ｑ、Ｇ５８Ａ、Ｇ３３０Ａを示す。 図２４Ａ～図２４Ｂは、ＡＡＶ９ダブルおよびトリプル変異Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ、Ｇ３３０Ａ／Ｇ５１３Ａ、Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ、およびＧ３３０／Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａの相対力価（ＧＣ）および形質導入効率を例示する。図２４Ａは、変異の相対的力価をＡＡＶ９ｗｔと比較し、図２４Ｂは、変異の相対形質導入効率（ルシフェラーゼ／ＧＣ）をＡＡＶ９ｗｔと比較する。

本明細書に提供されるのは、組換えＡＡＶのカプシド内に見出される３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３集団のそれぞれにおける配列および電荷異種性を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびにそれらを含む組成物である。本
発明で提供されるのは、新規ｒＡＡＶ、ならびに脱アミド化を低減するための方法、および任意で他のカプシドモノマー修飾である。本明細書でさらに提供されるのは、修飾が低減されている修飾ｒＡＶであり、より高い安定性、効力、および／または純度を保持するカプシドを有するｒＡＡＶを提供するのに有用である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８ではない。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ではない。

一実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の混合集団を含む組成物であって、該ｒＡＡＶの各々が、（ａ）約６０個のカプシドｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質を含むＡＡＶカプシドであって、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、選択されるＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶ ｖｐ２アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶ ｖｐ３アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質の異種集団であり、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、ＡＡＶカプシド中のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意で他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞中で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、組成物が提供される。特定の実施形態では、組成物は、この段落に記載されるとおりであるが、ただし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８ではない。本明細書で使用される場合、ＡＡＶｈｕ６８は、ＷＯ２０１８／１６０５８２に定義されるとおりである。ＡＡＶｕ６８ ＶＰ１の予測されるアミノ酸配列は、配列番号１１４に再現され、天然核酸配列は、配列番号１１３に提供される。特定の実施形態では、組成物は、この段落に記載されるとおりであるが、ただし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ではない。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶの混合集団は、１つのＡＡＶ型の予測されるＡＡＶ ＶＰ１アミノ酸配列をコードする単一のＡＡＶカプシド核酸配列を使用する産生システムから生じる。しかしながら、産生および製造プロセスは、上記のカプシドタンパク質の異種集団を提供する。

特定の実施形態では、組み換えＡＡＶは、未修飾ＡＡＶ８カプシドと比較して１つ以上の改善された特性を有する変異ＡＡＶ８カプシドを有するものが提供される。かかる改善された特性は、例えば、ＡＡＶ８と比較して、力価の増加および／または相対導入効率の増加を含み得る。特定の実施形態では、変異は、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ（配列番号２１）、ＡＡＶ８Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２３）、ＡＡＶ８Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２５）、またはＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２７）を含み得る。特定の実施形態では、これらの変異ＡＡＶ８カプシドをコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態では、核酸配列は、例えば、配列番号２０（ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ）、配列番号２２（ＡＡＶ８Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ）、配列番号２４（ＡＡＶ８Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ）、または配列番号２６（ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ）に提供される。特定の実施形態では、ＡＡＶ８変異は、Ｎ４９９Ｑ、Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５ＱＮ４９９Ｑ、Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５ｑ／Ｎ４９９Ｑ、またはＮ２０５Ｑ、Ｎ４５９Ｑ、またはＮ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ、Ｎ４９９Ｑであり得る。特定の実施形態では、これらの変異は、Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ変異と組み合わされる。特定の実施形態では、変異は、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１５）、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１６）、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１７）、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ
５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１８）、Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１９）、またはＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１２０）である。他の実施形態では、単一変異は、例えば、ＡＡＶ８Ｎ２６３Ａ、ＡＡＶ８Ｎ５１４Ａ、ＡＡＶ８Ｎ５４０Ａであるか、またはそれから選択され得る。特定の実施形態では、他のＡＡＶは、ＡＡＶ８との整列に基づいて、これらまたは対応するＮＧ対の変化を有するように変異され得る。かかるＡＡＶは、クレードＥ ＡＡＶであり得る。例えば、実施例２（配列番号９）に記載されるＡＡＶ８変異を参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶ８変異は、Ｎ５７位、Ｎ９４位、Ｎ２６３位、Ｎ３０５位、Ｇ３８６位、Ｑ４６７位、Ｎ４７９位、および／またはＮ６５３位でＮＧ対を変更することを回避する。特定の実施形態では、他のＡＡＶは、参照としてＡＡＶ８番号付けを使用して、ＡＡＶ８との整列に基づいて決定される、対応するＮ位置での変異を回避する。

特定の実施形態では、組み換えＡＡＶは、未修飾ＡＡＶ９カプシド比較して１つ以上の改善された特性を有する変異ＡＡＶ９カプシドを有するものが提供される。かかる改善された特性は、例えば、ＡＡＶ９と比較して、力価の増加および／または相対導入効率の増加を含み得る。特定の実施形態では、変異ＡＡＶ９カプシドは、例えば、ＡＡＶ９ Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ（配列番号２９）、ＡＡＶ９Ｇ３３０Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３１）、ＡＡＶ９Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３３）、および／またはＡＡＶ９ Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３５）を含み得る。特定の実施形態では、これらの変異ＡＡＶ９カプシドをコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態では、核酸配列は、例えば、配列番号２８（９Ｇ３３０ＡＧ４５３Ａ）、配列番号３０（９Ｇ３３０ＡＧ５１３Ａ）、配列番号３２（９Ｇ４５３ＡＧ５１３Ａ）、配列番号３４（９Ｇ３３０ＡＧ４５３ＡＧ５１３Ａ）に提供される。特定の実施形態では、他のＡＡＶは、ＡＡＶ ９との整列に基づいて、これらまたは対応するＮＧ対のかかる変化を有するように変異され得る。かかるＡＡＶは、クレードＦ ＡＡＶであり得る。

特定の実施形態では、クレードＡ、クレードＢ、クレードＣ、またはクレードＤの変異ＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶは、クレードＥおよびクレードＦについて上記で特定されたものに対応するＮＧ対のアミノ酸修飾を有するように操作され得る。特定の実施形態では、クレードＡ（例えば、ＡＡＶ）変異は、配列番号１（ＡＡＶ１）の番号付けを参照して、Ｎ３０３位、Ｎ４９７位、またはＮ３０３／Ｎ４９７位に変異を含み得る。特定の実施形態では、変異は、Ｎ４９７Ｑである。特定の実施形態では、ＡＡＶ３Ｂ変異は、配列番号２の番号付けを参照して、Ｎ３０２位、Ｎ４９７位、またはＮ３０２／Ｎ４９７位の変異を含み得る。特定の実施形態では、変異は、Ｎ４９７Ｑである。特定の実施形態では、ＡＡＶ５変異は、配列番号３の番号付けを参照して、Ｎ３０２位、Ｎ４９７位、またはＮ３０２／Ｎ４９７位の変異を含み得る。特定の実施形態では、変異は、Ｎ４９７Ｑである。

理論に束縛されることを意図するものではないが、質量分析は、ＡＡＶについて以前に説明されていない複数のＶＰアイソフォームの存在の説明として、カプシド上のいくつかの位置におけるアスパラギンの脱アミド化を明らかにした。加えて、脱アミドの分布および程度は、ベクター精製のいくつかの方法にわたって一貫しており、この現象がベクター処理とは独立して生じることを示唆した。これらの脱アミド化の機能的意義は、いくつかのアスパラギンをアスパラギン酸に個別に変異させることによって調査された。これらの変異のサブセットは、粒子組み立ての効率だけでなく、インビトロおよびインビボの両方で標的細胞を形質導入するベクターの能力にも影響を与えた。これらの脱アミド残基のＡＡＶ８構造への新規モデリングはまた、これらの脱アミド事象の存在に関する構造的根拠を明らかにし、ＡＡＶ８カプシドがアミノ酸同一性および特性のこれらの変化を許容する
理由について計算上の説明を提供した。脱アミノ酸化の事実上同一の所見は、ＡＡＶ９、および様々な追加のＡＡＶで見られた。したがって、ｒＡＡＶは、以前に知られていないＡＡＶカプシド構造異性を特徴とする。

本明細書で報告された研究では、広範なアスパラギン、および時折、グルタミン脱アミド化が１７残基の影響を受けることを見出した。ＡＡＶ８脱アミド化を制御する因子、主に一次配列および３Ｄ構造制約は、これまで我々が分析したすべての血清型が顕著に類似した修飾パターンを示すように、ＡＡＶの系統発生全体にわたって保存される可能性が高い。したがって、脱アミド化は、将来のすべてのＡＡＶ治療法の開発における潜在的に重要な要因である。

この発見を受けて、ＡＡＶ脱アミドの機能的影響を探求する意欲を持った。ＡＡＶベクターカプシドの多量体性質、修飾されたカプシド残基の程度および数、ならびに得られたベクター粒子組成物中のモザイク多様性は、この分析に対していくつかの特別な課題を提示した。翻訳後修飾（ＰＴＭ）の影響をより単純なタンパク質の状況下で十分にパラメータ化し得る実験レパートリーは、ＡＡＶカプシド分析に直接適用されなかった。例えば、特定の脱アミド化ベクター種の調製物を精製または濃縮して、その機能を直接かつ単離して試験することは不可能であろう。

アスパルテートへの遺伝子置換は、所与の部位での修飾の近似を強制的に行おうとした１つのアプローチである。内因性（モザイク）対遺伝的（完全）脱アミド化を伴うカプシド組み立て上の位置特異的修飾の分布間の前述の違いを超えて、我々のデータは、このデータを解釈するための追加の考慮事項を指摘する。例えば、ｗｔＡＡＶ８と比較して、Ｎ２６３Ｄ変異では５０倍を超える形質導入損失を観察した（図８Ｂ）。これは、遺伝的変換によるこの位置でのアスパルテート含有量の変化がわずかであることを考えると、驚くべきことであり、Ｎ２６３は、ｗｔＡＡＶ８で９９％が脱アミド化されている。この相違の１つの説明は、遺伝的にコードされたアスパルテートおよびアスパラギン脱アミド化の産物が分子的に異なることである（Ｌ－アスパルテート対推定されるＬ／Ｄ－イソアスパルテートの３：１混合物：Ｌ／Ｄ－アスパルテート）。したがって、遺伝的近似は、いくつかの位置では不十分であり得る。別の残基、高度に保存されたＮ５７もまた、アスパルテートへの置換に耐性がなかったが、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９においてそれぞれ平均８０％および９７％の脱アミド化であった（図８Ｂおよび１１）。ここで、残留無傷のアミドは、モザイク効果を通じてｗｔ調製物の活性を緩衝し得、Ｎ５７の分析を混乱させる他のアスパラギンとのクロストークの可能性も検出し、隣接するＮ６６は、５７位のアミドが変異誘発的に保存されると著しく脱アミド化した（ＡＡＶ８についてはＮ５７Ｑ、Ｇ５８Ａ、およびＧ５８Ｓ；ＡＡＶ９についてはＮ５７ＱおよびＧ５８Ａ；データは示されない）。これは変異の質量分析から検出した唯一のクロストークのケースであったが、それは機能喪失型変異原性データの解釈の別の複雑さを強調する。

これらの注意事項を考慮して、時間経過および機能獲得型変異誘発実験を通じて脱アミドの影響の証拠を開発した。我々のデータは、非常に早い時点での脱アミドに関連する機能損失におけるＮＧ部位のサブセットの役割と一致する。我々の知る限りでは、この事象は過去に報告されていない。確かに、我々がこの減衰を特定するために使用した特定の実験手順は、非常に短い半減期ベクターＮＧ脱アミド化の新規観察によって通知され、初期試料を冷蔵庫に１日でも保存することは、我々が観察した自発的脱アミド化の速度を考えると、遅期時点試料とのそれらの区別を低下させる可能性がある。処理後数日または数週間にわたるベクター調製物の活性を比較する貯蔵安定性実験は、我々の実験室ｊおよび他の製造グループでは日常的であるが、これらの比較は、活性減衰（およびＮＧ部位脱アミド化）のほとんどまたは全てが完了したとき、ほとんどの場合、少なくとも７日経過したベクター材料で行われる。データは、改善されたカプシドを得るためのプロセス介入また
はＮ安定化変異原性アプローチの機会を強調する。広い観点から、ＡＡＶの自然生態における「脱アミド化時計」の役割を検討することも重要であり、この現象は、感染細胞の最新の翻訳されたウイルス粒子が次の感染ラウンドで有利になると推測される。

ＮＧ脱アミド化誘導機能損失のメカニズムの土台は探索しなかったが、いくつかの顕著な可能性が存在する。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ ＶＰ３のすべてのＮＧモチーフは、表面ＨＶＲループにある。ＡＡＶ８では、ＮＧ５１４および５４０は、細胞受容体との相互作用により、形質導入において重要な役割を果たすことが知られている領域内の３倍軸付近に位置する。ＡＡＶ８受容体結合部位は完全に調査されていないが、ＬａｍＲ受容体はＡＡＶ８形質導入に関与している。これらの研究は、これらの相互作用にとって重要であるとしてａａ４９１－５５７を特定する。カプシドの機能的調査により、ＡＡＶ９ガラクトース結合ドメインの残基が特定されたため、ＡＡＶ９の受容体結合はＡＡＶ８よりも優れていると特徴付けされる。これらの残基のうち、単一アスパラギンは、Ｎ５１５が低レベル（３％）で脱アミド化されることを見出し、一方で、このドメインの他の２つのアスパラギン、Ｎ２７２およびＮ４７０は、脱アミド化されていないことを見出した。したがって、脱アミド化がガラクトース結合に影響を及ぼす可能性はあるものの、おそらくわずかな程度しかない。

まとめると、ＡＡＶベクター脱アミド化が形質導入効率に影響を及ぼす可能性があることを特定し、アミドを安定化し、ベクター性能を向上させる戦略を示した。今後の主な目標は、これらの発見を適切な動物モデルシステムに拡張し、脱アミド化の影響およびより複雑な機能的状況における我々の安定化されたバリアントの性能を検討することであろう。組織向性およびカプシドと免疫系との相互作用に影響を及ぼす可能性があり、慎重に評価されなければならない。これらの複雑な影響は、カプシド内のすべての脱アミド化残基について確証的に決定することが非常に困難であろうため、可変ＡＡＶ８アスパラギン４５９および４９９について成功したように、変異誘発による安定化のために脱アミド化のロット間可変性が高い限られた残基の数を標的とすることは慎重であり得る。加えて、当社の質量分析ワークフローを使用したベクター調製物の脱アミド化分析は、製造されたＡＡＶ遺伝子治療用医薬品のロットで機能の一貫性を達成するのに有益であることが証明され得る。

「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、およびＡＡＶカプシド内にパッケージされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子または機能的ＡＡＶキャップ遺伝子を欠き、子孫を生成することができないため、「複製欠陥ウイルス」または「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子および調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’および３’最末端に位置する。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の実施例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、コード配列、およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、または完全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能またはトランス相補ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。さらに、他のＩＴＲが使用され得る。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する制御配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。

ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドおよびベクターゲノムからなる。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団、およびｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。

本明細書で使用される場合、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意で他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意の修飾をもたらす。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中のすべてのｖｐ３タンパク質よりも少ない１つ（１）ｖｐ３タンパク質であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であり得、ｖｐ３は、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらなる亜集団であり得る。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有するサブ集団を含み得る。

別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号１［ＡＡＶ１］、２［ＡＡＶ３Ｂ］、４［ＡＡＶ７］、５、［ＡＡＶｒｈ３２．３３］、６［ＡＡＶ８］、７［ＡＡＶ９］、９［ＡＡＶ８トリプル］、もしくは１１１［ＡＡＶｈｕ３７］の番号付けに基づくアミノ酸５７、または配列番号３［ＡＡＶ５］の番号付けに基づくアミノ酸５６での少なくとも８０％のアスパラギンは、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化され得、総ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化され得る）。かかる割合は、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。

本明細書で使用される場合、「脱アミド化」ＡＡＶは、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する核酸配列においてそれをコードするものとは異なる残基に誘導体化されているものである。

理論に束縛されることを意図するものではないが、ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質
中の少なくとも高度に脱アミドされた残基の脱アミド化は、本質的に非酵素的であると考えられ、選択されたアスパラギンを脱アミド化するカプシドタンパク質内の官能基、およびより少ない程度でグルタミン残基によって引き起こされる。大部分の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組み立ては、これらの事象がカプシド組み立て後に生じるか、または個々のモノマー（ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）における脱アミドが構造的に十分許容され、ほとんどが組み立て動態に影響を及ぼさないことを示す。一般に、細胞侵入前に内部に位置すると考えられるＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（～ａａ１－１３７）における広範な脱アミド化は、カプシド組み立ての前にＶＰ脱アミド化が生じ得ることを示唆する。Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の骨格窒素原子を介して、Ａｓｎの側鎖アミド基炭素原子に対して求核攻撃を行うことによって生じ得る。中間環閉鎖スクシンイミド残基が形成されると考えられる。次いで、スクシンイミド残基は、高速加水分解を行って、最終産物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化は、ＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらし、例えば、以下に例示するように、スクシンイミド中間体を介して相互変換され得る。

本明細書に提供されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３中の各脱アミド化Ｎは、独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート、および／またはＡｓｐおよびｉｓｏＡｓｐの相互変換ブレンド、またはこれらの組み合わせであり得る。α－およびイソアスパラギン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のアスパラギン対イソアスパラギン、約５０：５０のアスパラギン：イソアスパラギン、もしくは約１：３のアスパラギン：イソアスパラギン、または別の選択された比率であり得る。

特定の実施形態では、１つ以上のグルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわちα－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、またはα－およびγ－グルタミン酸のブレンドに誘導体化（脱アミド化）され得、共通のグルタリミド中間体を介して相互変換され得る。α－およびγ－グルタミン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、もしくは約１：３のα：γ、または別の選択された比率であり得る。

したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド中に亜集団を含む。さらに、他の修飾は、特に選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の亜集団を含み、そのうちの少なくとも１～１０％は、ｖｐタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化される。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基は脱アミド化され得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、実施例に提供され、参照により本明細書に組み込まれる表に示される位置に、２つ、３つ、４つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、および／または質量分析、および／またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラムおよびＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富なまだ配列決定されていない前駆体イオンを動的に選択する。シーケンシングは、予測自動増加制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、４ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を行った。ｍ／ｚ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０のｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドが占めるｍ／ｚ領域の透過率を最適化できる。前駆体イオンは、単一、割り当てられていない、または断片化選択から６つ以上の電荷状態で除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、取得したデータの分析に使用され得る。ペプチドマッピングのために、固定変更としてカルバミドメチル化が設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド、およびリン酸化の設
定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルに対する信頼レベル０．８を使用して検索を行う。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨおよび－ＮＨ_２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化および天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定される。考えられる脱アミド化部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている等張種は、単一のピークで共移行し得る。したがって、複数の潜在的脱アミド化部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミド化部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位において独立していることを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、またはＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎまたはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、ＷａｔｅｒｓまたはＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００または１２００シリーズ）からのＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムが含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＰｉｎｐｏｉｎｔおよびＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が含まれ得る。さらに他の技法は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。

脱アミド化に加えて、他の修飾が生じても、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、または酸化を含み得る。

脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対のグリシンを変更し、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、またはアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギンが、アミド基を含む）、および／またはアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが、アミン基を含む）に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン、および／またはプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、または３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。より低い脱アミド率を有する、ＡＡＶおよび／または操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法が本明細書に提供される。加えて、または代替え的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ＡＡＶの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニンまたはセリンに変化するように、アスパラギン－グリシン対において変異を含む。変異ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む１つ、２つ、または３つの変異を含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む１つ、２つ、３つ、または４つのかかる変異を含み得る。特定の実施
形態では、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、変異を含む２つの異なるＮＧ対であり、ＡＡＶカプシド中の構造的に別個の位置に位置する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異の１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意で、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対の外側に位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミン中の脱アミド化を最小化または排除するための変異を含む。

特定の実施形態では、野生型ＡＡＶカプシド中のＮＧの１つ以上を排除するＡＡＶカプシドを操作することを含む、ｒＡＡＶベクターの効力を増加させる方法が提供される。特定の実施形態では、「ＮＧ」の「Ｇ」のコード配列は、別のアミノ酸をコードするように操作される。以下の特定の例では、「Ｓ」または「Ａ」が置換される。しかしながら、他の好適なアミノ酸コード配列が選択され得る。例えば、ＡＡＶ８の番号付けに基づき、以下の位置のうちの少なくとも１つのコード配列についての以下の表を参照されたい：Ｎ５７＋１、Ｎ２６３＋１、Ｎ３８５＋１、Ｎ５１４＋１、Ｎ５４０＋１が修飾される。特定の実施形態では、ＡＡＶ８変異は、Ｎ５７位、Ｎ９４位、Ｎ２６３位、Ｎ３０５位、Ｑ４６７位、Ｎ４７９位、および／またはＮ６５３位でＮＧ対を変更することを回避する。特定の実施形態では、他のＡＡＶは、参照としてＡＡＶ８番号付けを使用して、ＡＡＶ８との整列に基づいて決定される、対応するＮ位置での変異を回避する。

これらのアミノ酸修飾は、従来の遺伝子工学技術によって行われ得る。例えば、修飾ＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列が生成され得、アスパラギン－グリシン対中のグリシンをコードするコドンのうちの１～３個が、グリシン以外のアミノ酸をコードするように修飾される。特定の実施形態では、修飾アスパラギンコドンを含む核酸配列は、アスパラギン－グリシン対のうちの１～３個が操作され得、その結果、修飾コドンはアスパラギン以外のアミノ酸をコードする。各修飾コドンは、異なるアミノ酸をコードし得る。代替的に、改変されたコドンのうちの１個以上は、同じアミノ酸をコードし得る。特定の実施形態では、これらの修飾ＡＡＶ核酸配列は、天然カプシドよりも低い脱アミド化を有するカプシドを有する変異ｒＡＡＶを生成するために使用され得る。かかる変異ｒＡＡＶは、免疫原性が低下しており、および／または貯蔵、特に懸濁形態での貯蔵の際の安定性を増加させ得る。

本明細書には、低減された脱アミド化を有するＡＡＶカプシドをコードする核酸配列も提供される。ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を設計することは当該技術の範囲内である。かかる核酸配列は、選択されたシステム（すなわち、細胞型）における発現のためにコドン最適化され得、様々な方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行され得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、米国国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号および米国特許公開第２００６／０１３６１８４号を参照されたい。好適には、製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修正する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみが改変され得る。これらの方法のうちの１つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。コドンへの実際の変更を実行するため、または本明細書に記載されるように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、各８０～９０ヌク
レオチドの長さ、かつ所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニールすると、凝集末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対中の各オリゴヌクレオチドは、対中の他のオリゴヌクレオチドと相補的である領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いで、これらの二本鎖断片のおよそ５～６個を、凝集性一本鎖末端を介して一緒にアニールさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法で配列決定する。一緒にライゲーションされた８０～９０塩基対断片の５～６個の断片、すなわち、約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかを調製し、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるようにする。次いで、これらのプラスミドの挿入物を適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして、最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。追加の方法は、当業者にはすぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。

特定の実施形態では、複数の高度に脱アミド化された「ＮＧ」位置を含むＡＡＶカプシドアイソフォーム（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の異種集団を有するＡＡＶカプシドが提供される。特定の実施形態では、高度に脱アミド化された位置は、予測される完全長のＶＰ１アミノ酸配列を参照して、以下に示す位置にある。他の実施形態では、カプシド遺伝子は、参照される「ＮＧ」が除去されるように修飾され、変異「ＮＧ」は、別の位置に操作される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ１は、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成物により特徴付けされる。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、５７位、３８３位、５１２位、および／または７１８位のＮに続くグリシンが保存されている（すなわち、未修飾のままである）ＡＡＶ１変異が構築される。特定の実施形態では、前文で示した４つの位置のＮＧは、天然配列で保存される。残基番号は、配列番号１に再現される公開されたＡＡＶ１ ＶＰ１に基づく。

特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。

残基番号は、配列番号１に再現される公開されたＡＡＶ１配列に基づく。

特定の実施形態では、ＡＡＶ３Ｂカプシドは、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成物により特徴付けされる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、５７位、３８３位、５１２位、および／または７１８位のＮに続くグリシンが保存されている（すなわち、未修飾のままである）ＡＡＶ３変異が構築される。特定の実施形態では、前文で示した４つの位置のＮＧは、天然配列で保存される。残基番号は、配列番号２に再現される公開されたＡＡＶ３Ｂ ＶＰ１に基づく。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、カプシドは、「ＮＧ」対以外の位置で「Ｎ」または「Ｑ」を減少させるように修飾される。残基番号は、配列番号２に再現される公開されたＡＡＶ３Ｂ配列に基づく
。

特定の実施形態では、ＡＡＶ５カプシドは、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成物により特徴付けされる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定されるように、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、カプシドは、「ＮＧ」対以外の位置で「Ｎ」または「Ｑ」を減少させるように修飾される。残基番号は、配列番号３に再現される公開されたＡＡＶ５配列に基づく。

特定の実施形態では、ＡＡＶ７カプシドは、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成物により特徴付けされる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定されるように、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、カプシドは、「ＮＧ」対以外の位置で「Ｎ」または「Ｑ」を減少させるように修飾される。残基番号は、配列番号４に再現される公開されたＡＡＶ７配列に基づく。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ３２．３３カプシドは、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成物により特徴付けされる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、カプシドは、「ＮＧ」対以外の位置で「Ｎ」または「Ｑ」を減少させるように修飾される。残基番号は、配列番号５に再現される公開されたＡＡＶｒｈ３２．３３配列に基づく。

特定の実施形態では、ＡＡＶ８カプシドは、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成物により特徴付けされる。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。例えば、特定の実施形態では、Ｇは、例えば、５８位、６７位、９５位、２１６位、２６４位、３８６位、４１１位、４６０位、５００位、５１５位、または５４１位でＳまたはＡに修飾され得る。ＮＧ５７／５８がＮＳ５７／５８またはＮＡ５７／５８に改変される場合、脱アミド化の有意な減少が観察される。しかしながら、特定の実施形態では、ＮＧがＮＳまたはＮＡに改変される場合、脱アミド化の増加が観察される。特定の実施形態では、ＮＧ対のＮは、Ｇを保持しながらＱに修飾される。特定の実施形態では、ＮＧ対の両方のアミノ酸が修飾される。特定の実施形態では、Ｎ３８５Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な低減をもたらす。特定の実施形態では、Ｎ４９９Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な増加をもたらす。特定の実施形態では、ＮＧ変異は、Ｎ２６３（例えば、Ｎ２６３Ａ）に位置する対に作製される。特定の実施形態では、ＮＧ変異は、Ｎ５１４（例えば、Ｎ５１４Ａ）に位置する対に作製される。特定の実施形態では、ＮＧ変異は、Ｎ５４０（例えば、Ｎ５４０Ａ）に位置する対に作製される。特定の実施形態では、複数の変異およびこれらの位置での変異の少なくとも１つを含むＡＡＶ変異が操作される。特定の実施形態では、変異は、Ｎ５７位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ９４位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ３０５位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｇ３８６位に作製
されない。特定の実施形態では、変異は、Ｑ４６７位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ４７９位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ６５３位に作製されない。特定の実施形態では、カプシドは、「ＮＧ」対以外の位置で「Ｎ」または「Ｑ」を減少させるように修飾される。残基番号は、配列番号６に再現される公開されたＡＡＶ８配列に基づく。

特定の実施形態では、変異は、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ（配列番号２１）、ＡＡＶ８Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２３）、ＡＡＶ８Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２５）、またはＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２７）を含み得る。特定の実施形態では、これらの変異ＡＡＶ８カプシドをコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態では、核酸配列は、例えば、配列番号２０（ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ）、配列番号２２（ＡＡＶ８Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ）、配列番号２４（ＡＡＶ８Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ）、または配列番号２６（ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ）に提供される。特定の実施形態では、ＡＡＶ８変異は、Ｎ４９９Ｑ、Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５ＱＮ４９９Ｑ、Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ、Ｎ３０５ｑ／Ｎ４９９Ｑ、またはＮ２０５Ｑ、Ｎ４５９Ｑ、またはＮ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ、Ｎ４９９Ｑであり得る。特定の実施形態では、これらの変異は、Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ変異と組み合わされる。特定の実施形態では、変異は、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１５）、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１６）、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１７）、ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１８）、Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１９）、またはＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１２０）である。これらのＡＡＶ８変異をコードする核酸配列も包含される。

特定の実施形態では、ＡＡＶ９カプシドは、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成物により特徴付けされる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、ＡＡＶ９カプシドがコードするＮ２１４／Ｇ２１５位は、Ｎ２１４Ｑに修飾され、これは、著しく増加した脱アミド化を有することが観察される。特定の実施
形態では、ＮＧ変異は、Ｎ４５２（例えば、Ｎ４５２Ａ）に位置する対に作製される。特定の実施形態では、変異は、Ｎ５７位に作製されない。特定の実施形態では、複数の変異およびこれらの位置での変異の少なくとも１つを含むＡＡＶ変異が操作される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、カプシドは、「ＮＧ」対以外の位置で「Ｎ」または「Ｑ」を減少させるように修飾される。残基番号は、配列番号７に再現される公開されたＡＡＶ９配列に基づく。

追加的に、または代替的に、ＡＡＶｈｕ３７カプシドは、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号３６の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８でのアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、および配列番号３６の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、配列番号３６のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意で他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化をもたらす。ＡＡＶｈｕ３７は、ＡＡＶｈｕ ３７ ＶＰ１（配列番号３６）の番号付けに基づいて、例えばＮ５７位、Ｎ２６３位、Ｎ３８５位、および／またはＮ５１４位に高度脱アミド化残基を有することによって特徴付けされる。

脱アミド化は、以下の表および実施例に示されるように、他の残基において観察されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７カプシドは、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。例えば、特定の実施形態では、Ｇは、例えば、５８位、２６４位、３８６位、または５１５位でＳまたはＡに修飾され得る。一実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７カプシドは、Ｎ５７位／Ｇ５８位からＮ５７Ｑ位またはＧ５８Ａ位で修飾され、この位置で減少した脱アミド化を有するカプシドを得る。別の実施形態では、Ｎ５７／Ｇ５８は、ＮＳ５７／５８またはＮＡ５７／５８に改変される。しかしながら、特定の実施形態では、ＮＧがＮＳまたはＮＡに改変される場合、脱アミド化の増加が観察される。特定の実施形態では、ＮＧ対のＮは、Ｇを保持しながらＱに修飾される。特定の実施形態では、ＮＧ対の両方のアミノ酸が修飾される。特定の実施形態では、Ｎ３８５Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な低減をもたらす。特定の実施形態では、Ｎ４９９Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な増加をもたらす。

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７は、これらまたは他の残基が、例えば、典型的には１０％未満で脱アミド化され得、かつ／またはメチル化（例えば、～Ｒ４８７）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満）、異性化（例えば、Ｄ９７で）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満、リン酸化（例えば、存在する場合、約１０～約６０％、または約１０～約３０％、または約２０～約６０％の範囲）（例えば、Ｓ１４９、～Ｓ１５３、～Ｓ４７４、～Ｔ５７０、～Ｓ６６５のうちの１つ以上で）、もしくは酸化（例えば、Ｗ２４８、Ｗ３０７、Ｗ３０７、Ｍ４０５、Ｍ４３７、Ｍ４７３、Ｗ４８０、Ｗ４８０、Ｗ５０５、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６１、Ｗ６２１、Ｍ６３７、および／またはＷ６９７のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意で、Ｗは、キヌレニンに酸化し得る。

さらに他の位置は、これらまたは他の修飾（例えば、アセチル化またはさらなる脱アミド化）を有し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３７に提供される。他の実施形態では、配列番号３７と７０％～９９．９％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｈｕ３７カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。しかしながら、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ３７カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７の核酸配列、または配列番号３７と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３６をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７の核酸配列、または配列番号３７の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１４と少なくともと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３６のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３８）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７の約ｎｔ６１０～約ｎｔ２２１４の核酸配列、または配列番号３７のｎｔと少なくともと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３６のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０４～７３８）をコードする。ＥＰ ２ ３４５ ７３１ Ｂ１およびその中の配列番号８８を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「コードされたアミノ酸配列」は、アミノ酸に翻訳される参照核酸配列の既知のＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。以下の表は、ＤＮＡコドンおよび２０個の共通アミノ酸を例示し、１文字コード（ＳＬＣ）および３文字コード（３ＬＣ）の両方を示す。

ｒＡＡＶベクター
上述のように、新規ＡＡＶ配列およびタンパク質は、ｒＡＡＶの産生に有用であり、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター、またはワクチンベクターであり得る組換えＡＡＶベクターにも有用である。加えて、本明細書に記載の操作されたＡＡＶカプシドは、標的細胞および組織へのいくつかの好適な核酸分子の送達のためのｒＡＡＶベクターを操作するために使用され得る。

ＡＡＶカプシドにパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でもトランス遺伝子、およびその調節配列、およびＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から構成される。一本鎖ＡＡＶおよび自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に連結される。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５′および３′逆方向末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素が５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列である。Ｄ配列および最終的な分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、シュードタイプであると称され得る。しかし、これらの要素の他の構造も適切であり得る。

組換えＡＡＶベクターについて上述した主要要素に加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にするような様式で導入遺伝子と作動可能に連結される必要な従来の制御要素も含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。

調節制御要素は、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、または生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに使用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０前初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックスメタロプロテインプロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリベータアクチンプロモーターから選択され得る。プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の適切なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例え
ば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離される。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータアクチンイントロンをさらに含む。他の適切なイントロンは、当該分野において周知のもの、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されているものなどを含む。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意で、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい。

これらのｒＡＡＶは、特に、防御免疫を誘導することを含む、治療目的および免疫化のための遺伝子送達に適している。さらに、本発明の組成物は、インビトロで所望の遺伝子産物を産生するために使用され得る。インビトロ産生のために、所望の産物（例えば、タンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含むｒＡＡＶで宿主細胞をトランスフェクションし、発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養した後、所望の培養物から得ることができる。次いで、発現した産物は、所望される場合、精製および単離され得る。トランスフェクション、細胞培養、精製、および単離に好適な技術は、当業者に既知である。

治療用導入遺伝子
導入遺伝子によってコードされる有用な産物としては、欠損または欠損遺伝子を置き換え、不活性化または「ノックアウト」、または「ノックダウン」または望ましくない高レベルで発現している遺伝子の発現を低下させる、または所望の治療効果を有する遺伝子産物を送達する様々な遺伝子産物が含まれる。ほとんどの実施形態では、治療は、「体細胞遺伝子治療」、すなわち、精子または卵子を産生しない体の細胞への遺伝子の導入である。特定の実施形態では、導入遺伝子発現タンパク質は、天然ヒト配列の配列を有する。しかしながら、他の実施形態では、合成タンパク質が発現される。かかるタンパク質は、ヒトの治療を企図するか、または他の実施形態では、イヌもしくはネコ集団などの同伴動物を含む動物の治療、またはヒト集団と接触する家畜もしくは他の動物の治療のために設計され得る。

好適な遺伝子産物の例としては、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、および希少疾患または孤児疾患に関連するものが含まれ得る。かかる希少疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えば、フラタキシン）、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭部認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、および意味認知症を含む非アルツハイマー性脳変性に関連する）などが含まれる。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。

好適な遺伝子の例としては、例えば、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）（例えば、ヒト、イヌ、またはネコｅｐｏを含む）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、好中球因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦ
ＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを含む形質転換，成長因子αスーパーファミリーのうちのいずれか１つ、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１－１５のうちのいずれか、成長因子のヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３およびＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリンのうちのいずれか１つ、セマフォリン／コラプシン、ネトリン１およびネトリン２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、チロシンヒドロキシラーゼのファミリーのうちのいずれか１つを含むがこれらに限定されない、ホルモンならびに成長および分化因子が含まれ得る。

他の有用な導入遺伝子産物としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１からＩＬ－３６（例えば、ヒトインターロイキンＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３５）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドなどのサイトカインならびにリンホカインを含むがこれらに限定されない免疫系を制御するタンパク質が含まれる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれるがこれらに限定されない。例えば、特定の実施形態では、ｒＡＡＶ抗体は、例えば、抗ＩｇＥ、抗ＩＬ３１、抗ＣＤ２０、抗ＮＧＦ、抗ＧｎＲＨなどのイヌまたはネコ抗体を送達するように設計され得る。有用な遺伝子産物としては、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、ＣＤ５９、およびＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）などの補体制御性タンパク質も含まれる。

さらに他の有用な遺伝子産物としては、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、制御性タンパク質、および免疫系タンパク質の受容体のうちのいずれか１つが含まれる。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、およびスカベンジャー受容体を含む、コレステロール制御および／または脂質調節のための受容体を包含する。本発明はまた、糖質コルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体および他の核受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物を包含する。加えて、有用な遺伝子産物としては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニンなどの転写因子、タンパク質を含むＥＴＳボックス、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ－３、ならびに翼状螺旋タンパク質のフォークヘッドファミリーが含まれる。

他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ欠乏症の治療のためのアルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマル酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、アカ
ゲザルアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオンベータ－シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニ－またはマイクロ－ジストロフィン］が含まれる。さらに他の有用な遺伝子産物は、酵素補充療法に有用であり得るような酵素を含み、これは酵素の不十分な活性に起因する様々な状態において有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含む酵素は、リソソーム蓄積症の治療に利用され得る（例えば、好適な遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子を含む）。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、遺伝子編集システムで使用され得、システムは、１つのｒＡＡＡＶまたは複数のｒＡＡＶ系統の共投与を伴い得る。例えば、ｒＡＡＶは、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＡＲＣＵＳ、Ｃｐｆ１、および他の好適な遺伝子編集構築物を送達するように操作され得る。

さらに他の有用な遺伝子産物としては、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）および血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子およびそのバリアント、例えばヘテロ二量体およびＢ－欠失ドメインの軽鎖ならびに重鎖を含む；米国特許第６，２００，５６０号および米国特許第６，２２１，３４９号）を含む血友病の治療に使用されるものが含まれる。いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子は、１０個のアミノ酸シグナル配列をコードする第ＶＩＩ因子重鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧ Ｈ）ポリアデニル化配列を含む。代替的な実施形態では、ミニ遺伝子は、Ａ１およびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５個のアミノ酸、かつ／またはＢドメインのＣ末端の８５個のアミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインをさらに含む。さらに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖および軽鎖をコードする核酸は、Ｂドメインの１４個のアミノ酸をコードする４２個の核酸によって分離される単一ミニ遺伝子内に提供される［米国特許第６，２００，５６０号］。

他の有用な遺伝子産物としては、挿入、欠失、またはアミノ酸置換を含む非天然アミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドなどの非天然ポリペプチドが含まれる。例えば、一本鎖操作された免疫グロブリンは、特定の免疫不全患者において有用であり得る。他の種類の非天然遺伝子配列としては、アンチセンス分子およびリボザイムなどの触媒核酸が含まれ、標的の過剰発現を低減するために使用され得る。

遺伝子の発現の低減および／または調節は、がんおよび乾癬と同様に、過増殖細胞を特徴とする過増殖状態の治療に特に望ましい。標的ポリペプチドとしては、正常細胞と比較して、過剰増殖細胞において排他的またはより高いレベルで産生されるポリペプチドが含まれる。標的抗原としては、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎなどのがん遺伝子、ならびに転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ、およびＥＧＲＦによってコードされるポリペプチドが含まれる。標的抗原としてのがん遺伝子産物に加えて、抗がん治療および保護レジメンのための標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫によって作製された抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を含み、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７－１Ａおよび葉酸結合ポリペプチドによって認識されるポリペプチドを含む腫瘍細胞中でより高いレベルで見出されるポリペプチドなどの標的ポリペプチドとして使用することができる。

他の好適な治療用ポリペプチドおよびタンパク質としては、細胞受容体および「自己」指向性抗体を産生する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対する広範な防御免疫応答を付与することにより、自己免疫疾患および障害に罹患する個体を治療するために有用であり得るものが含まれる。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病、および潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原と結合し、自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。

ｒＡＡＶを介して送達され得るさらなる例示的な遺伝子にとしては、限定されないが、グリコーゲン蓄積症または１Ａ型欠乏症（ＧＳＤ１）に関連するグルコース－６－ホスファターゼ、ＰＥＰＣＫ欠乏症に関連するホスホエノールピルビン酸－カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、発作および重度神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られるサイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、ガラクトース血症に関連するガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、メープルシロップ尿症に関連する分枝鎖アルファ－ケト酸デヒドロゲナーゼ、チロシン血症１型に関連するフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロン酸血症に関連するメチルマロニル－ＣｏＡムターゼ、中鎖アセチルＣｏＡ欠乏症に関連する中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、シトルリン血症に関連するアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠乏症、アメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマンピック病、Ｃ１型）、プロピオン酸血症（ＰＡ）、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質、クリグラー・ナジャー病に関連するＵＤＰ－グルコウロシルトランスフェラーゼ、重症複合免疫不全症に関連するアデノシンデアミナーゼ、痛風およびレッシュニャン症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチミダーゼ欠乏症に関連するビオチミダーゼ、ファブリー病に関連するアルファ－ガラクトシダーゼＡ（ａ－Ｇａｌ Ａ））、ウィルソン病に関連するＡＴＰ７Ｂ、ゴーシェ病２型および３型に関連するベータグルコセレブロシダーゼ、ゼルウィガー症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ、異染性白質ジストロフィーに関連するイルスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、クラッベ病に関連するガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素、ポンペ病に関連するアルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ニーマンピック病Ａ型に関連するスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子、成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連するアルギニノスクシン酸シンターゼ、尿素サイクル障害に関連するカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、脊髄性筋萎縮症に関連する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、ファーバー脂肪肉芽腫症に関連するセラミダーゼ、ＧＭ２ガングリオシドーシスおよびテイサックスおよびサンドホフ病に関連するｂ－ヘキソサミニダーゼ、アスパルチル－グルコサミニウリアに関連するアスパルチル－グルコサミニダーゼ、フコシドーシスに関連するａ－フコシダーゼ、アルファ－マンノシドーシスに関連するα－マンノシダーゼ、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連するポルホビリノーゲンデアミナーゼ、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症（肺気腫）の治療のためのアルファ－１アンチトリプシン、サラセミアまたは腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン、虚血性疾患の治療のための血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、および線維芽細胞増殖因子、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、または塞栓症に見られる閉塞した血管の治療のためのトロンボモジュリンおよび組織因子経路阻害剤、パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、うっ血性心不全の治療のためのベータアドレナリン受容体、ホス
ホランバンに対するアンチセンスまたはその変異体、筋節（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、および心臓アデニル酸シクラーゼ、様々ながんの治療のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、炎症性および免疫障害およびがんの治療のための様々なインターロイキンのうちの１つのようなサイトカイン、筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィンまたはミニジストロフィンおよびユートロフィンまたはミニトロフィン、ならびに糖尿病の治療のためのインスリンまたはＧＬＰ－１が含まれる。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、ムコ多糖症（ＭＰＳ）障害の治療において使用され得る。かかるｒＡＡＶは、ＭＰＳ Ｉ（ハーラー、ハーラー・シャイエおよびシャイエ症候群）を治療するためのα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）を治療するためのイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードする核酸配列、ＭＰＳＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ（サンフィリッポ症候群）を治療するためのスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＩＶ ＡおよびＢ（モルキオ症候群）を治療するためのＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ
ＶＩ（マロトー・ラミー症候群）を治療するためのアリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）をコードする核酸配列、ＭＰＳＩ ＩＸ（ヒアルロニダーゼ欠損症）を治療するためのヒアルロニダーゼをコードする核酸配列、ならびにＭＰＳ ＶＩＩ（スライ症候群）を治療するためのベータグルクロニダーゼをコードする核酸配列を運ぶことを含み得る。

免疫原性導入遺伝子
いくつかの実施形態では、がんに関連する遺伝子産物（例えば、腫瘍抑制因子）をコードする核酸を含むｒＡＡＶベクターは、がんを有する対象にｒＡＡＶベクターを収容するｒＡＡＶを投与することによって、がんを治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんに関連する遺伝子産物（例えば、がん遺伝子）の発現を阻害する低分子干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含むｒＡＡＶベクターは、がんを有する対象にｒＡＡＶベクターを収容するｒＡＡＶを投与することによって、がんを治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんに関連する遺伝子産物（またはがんに関連する遺伝子の発現を阻害する機能性ＲＮＡ）をコードする核酸を含むｒＡＡＶベクターは、研究目的、例えば、がんを研究するために、またはがんを治療する治療薬を特定するために使用され得る。以下は、がんの発症に関連することが知られている例示的な遺伝子（例えば、がん遺伝子および腫瘍抑制因子）の非限定的なリストである：ＡＡＲＳ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ４、ＡＢＩ２、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫ１、ＡＣＰ２、ＡＣＹ１、ＡＤＳＬ、ＡＫ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＡＮＰＥＰ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ７、ＡＰ２Ｍ１、ＡＰＣ、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＥＦ５、ＡＲＩＤ４Ａ、ＡＳＮＳ、ＡＴＦ４、ＡＴＭ、ＡＴＰ５Ｂ、ＡＴＰ５Ｏ、ＡＸＬ、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＨＬＨＢ２、ＢＬＭＨ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＴＫ、ＣＡＮＸ、ＣＡＰ１、ＣＡＰＮ１、ＣＡＰＮＳ１、ＣＡＶ１、ＣＢＦＢ、ＣＢＬＢ、ＣＣＬ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＴ５、ＣＣＹＲ６１、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣ２Ｌ５、ＣＤＫ１０、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ９、ＣＤＫＬ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＣＥＢＰＧ、ＣＥＮＰＣ１、ＣＧＲＲＦ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＣＩＢ１、ＣＫＭＴ１、ＣＬＫ１、ＣＬＫ２、ＣＬＫ３、ＣＬＮＳ１Ａ、ＣＬＴＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＯＸ７Ａ２、ＣＲＡＴ、ＣＲＨＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＫ、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＣＴＮＮＡ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＰＳ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＣＵＬ１、ＣＹＲ６１、ＤＣＣ、ＤＣＮ、ＤＤＸ１０、ＤＥＫ、ＤＨＣＲ７、ＤＨＲＳ２、ＤＨＸ８、ＤＬＧ３、ＤＶＬ１、ＤＶＬ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ５、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＩＦ５、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣＣ３、ＥＴＶ１、ＥＴＶ３、ＥＴＶ６、Ｆ２Ｒ、ＦＡＳＴＫ、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＲ、ＦＫ
ＢＰ８、ＦＮ１、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＳＬ２、ＦＯＸＧ１Ａ、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＲＡＰ１、ＦＲＺＢ、ＦＴＬ、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ９、Ｇ２２Ｐ１、ＧＡＳ６、ＧＣＮ５Ｌ２、ＧＤＦ１５、ＧＮＡ１３、ＧＮＡＳ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＧＰＲ３９、ＧＲＢ２、ＧＳＫ３Ａ、ＧＳＰＴ１、ＧＴＦ２Ｉ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＧＦ、ＨＭＭＲ、ＨＰＲＴ１、ＨＲＢ、ＨＳＰＡ４、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＢ１、ＨＳＰＨ１、ＨＹＡＬ１、ＨＹＯＵ１、ＩＣＡＭ１、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤＵＡ、ＩＥＲ３、ＩＦＩＴＭ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、ＩＬ１Ｂ、ＩＬＫ、ＩＮＧ１、ＩＲＦ３、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＪＡＫ１、ＪＡＲＩＤ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、Ｋ－ＡＬＰＨＡ－１、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＫ１０、ＫＰＮＡ２、ＫＲＡＳ２、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＰ２、ＬＣＫ、ＬＣＮ２、ＬＥＰ、ＬＩＴＡＦ、ＬＲＰＡＰ１、ＬＴＦ、ＬＹＮ、ＬＺＴＲ１、ＭＡＤＨ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ１３、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＡＰＲＥ１、ＭＡＲＳ、ＭＡＳ１、ＭＣＣ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ４、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＧＳＴ１、ＭＩＣＢ、ＭＬＬＴ３、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ２、ＭＮＤＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴ３、ＭＹＢ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ９、ＭＹＬＫ、ＮＥＯ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＦＳＦ７、ＮＩＤ、ＮＩＮＥ、ＮＭＢＲ、ＮＭＥ１、ＮＭＥ２、ＮＭＥ３、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ４、ＮＰＭ１、ＮＱＯ１、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＥＰ１、ＯＳＭ、ＰＡ２Ｇ４、ＰＡＢＰＣ１、ＰＣＮＡ、ＰＣＴＫ１、ＰＣＴＫ２、ＰＣＴＫ３、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＰＫ１、ＰＥＡ１５、ＰＦＤＮ４、ＰＦＤＮ５、ＰＧＡＭ１、ＰＨＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＭ１、ＰＫＭ２、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＩＨ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ４、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＢＰ１、ＰＲＮＰ、ＰＲＳＳ１５、ＰＳＭＡ１、ＰＴＣＨ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ１、ＰＴＭＡ、ＰＴＮ、ＰＴＰＲＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＲＡＣ１、ＲＡＤ５０、ＲＡＦ１、ＲＡＬＢＰ１、ＲＡＰ１Ａ、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＳＧＲＦ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ４、ＲＢＬ２、ＲＥＡ、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＲＥＴ、ＲＦＣ２、ＲＧＳ１９、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＨＯＣ、ＲＨＯＤ、ＲＩＰＫ１、ＲＰＮ２、ＲＰＳ６ ＫＢ１、ＲＲＭ１、ＳＡＲＳ、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＦＮ、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＳ７、ＳＨＢ、ＳＨＨ、ＳＩＡＨ２、ＳＩＶＡ、ＳＩＶＡ ＴＰ５３、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＭＯ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）、ＳＮＡＩ２、ＳＮＤ１、ＳＮＲＰＢ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＯＤ１、ＳＯＲＴ１、ＳＰＩＮＴ２、ＳＰＲＹ２、ＳＲＣ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＣ１、ＴＡＦ１、ＴＢＬ３、ＴＢＲＧ４、ＴＣＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＴＦＤＰ１、ＴＦＤＰ２、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＩＥ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＴＪＰ１、ＴＫ１、ＴＬＥ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＫ１、ＴＯＢ１、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＰ５３１３、ＴＰ７３、ＴＰＢＧ、ＴＰＴ１、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＭ１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＧ１０１、ＴＵＦＭ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＹＲＯ３、ＵＢＣ、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ７、ＶＤＡＣ１、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＶＩＬ２、ＷＥＥ１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＴ１、ＸＲＣＣ１、ＹＥＳ１、ＹＷＨＡＢ、ＹＷＨＡＺ、ＺＡＰ７０、およびＺＮＦ９。

ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子として、アポトーシスを調節するタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする核酸を含み得る。以下は、本発明の特定の実施形態での導入遺伝子として有用であるこれらの遺伝子およびその相同体の発現を阻害する、アポトーシスに関連する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子およびその相同体の産物をコードする、ならび
に低分子干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸の非限定的なリストである：ＲＰＳ２７Ａ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＰＡＦ１、ＢＡＤ、ＢＡＧ１、ＢＡＧ３、ＢＡＧ４、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬＡＦ１、ＢＦＡＲ、ＢＩＤ、ＢＩＫ、ＮＡＩＰ、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＸＩＡＰ、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ７、ＢＩＲＣ８、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ２、ＢＮＩＰ３、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＢＯＫ、ＢＲＡＦ、ＣＡＲＤ１０、ＣＡＲＤ１１、ＮＬＲＣ４、ＣＡＲＤ１４、ＮＯＤ２、ＮＯＤ１、ＣＡＲＤ６、ＣＡＲＤＳ、ＣＡＲＤＳ、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ１４、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ５、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＦＬＡＲ、ＣＩＤＥＡ、ＣＩＤＥＢ、ＣＲＡＤＤ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＤＦＦＡ、ＤＦＦＢ、ＦＡＤＤ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＤＮＦ、ＨＲＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＡ、ＬＴＢＲ、ＭＣＬ１、ＮＯＬ３、ＰＹＣＡＲＤ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ２、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ４０、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１８、ＣＤ４０ＬＧ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７０、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＰ７３、ＴＰ６３、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、およびＴＲＡＦ５。

有用な導入遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡも含まれる。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３′非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通じてそれらの活性を示す。これらの内因性発現ｍｉＲＮＡはヘアピン前駆体を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子に処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。

以下の非限定的なｍｉＲＮＡ遺伝子およびその相同体のリストは、導入遺伝子、または以下の方法の特定の実施形態での導入遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴｕＤ ＲＮＡ）によってコードされる低分子干渉核酸の標的として有用である：ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７１、ｈｓａ－ｌｅｔ－７１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２００、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０
７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３００、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ｂ、ｈｓａ
－ｍｉＲ－１４８ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０８ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６
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８７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５００、ｈｓａ－ｍｉＲ－５００＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｃ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｅ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｆ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｅ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｈ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｈ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｉ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｊ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｋ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｍ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｎ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｏ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５
７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６００、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－７、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７７０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７４、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９、ｈｓａ－ｍｉＲ－９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２３、ｈｓａ－ｍｉＲ
－９２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ＊。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連するスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）を発現する第８染色体のオープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）を標的とするｍｉＲＮＡが興味深い。

ｍｉＲＮＡは、標的とするｍＲＮＡの機能を阻害し、結果として、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を阻害する。したがって、ｍｉＲＮＡの活性を（部分的または完全に）遮断する（例えば、ｍｉＲＮＡをサイレンシングする）ことは、発現が阻害されるポリペプチドの発現を効果的に誘導するか、または回復することができる（ポリペプチドの抑制を解除する）。一実施形態では、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的によってコードされるポリペプチドの抑制解除は、様々な方法のいずれか１つを通じて細胞内のｍｉＲＮＡ活性を阻害することによって達成される。例えば、ｍｉＲＮＡの活性を遮断することは、ｍｉＲＮＡに相補的であるか、または実質的に相補的である低分子干渉核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＴｕＤ ＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションによって達成され得、それによってｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの相互作用を遮断する。本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的である低分子干渉核酸は、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし、ｍｉＲＮＡの活性を遮断することができる核酸である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的である低分子干渉核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８塩基を除くすべてでｍｉＲＮＡと相補的である低分子干渉核酸である。「ｍｉＲＮＡ阻害剤」は、ｍｉＲＮＡの機能、発現、および／またはプロセシングを遮断する薬剤である。例えば、これらの分子としては、マイクロＲＮＡ特異的アンチセンス、マイクロＲＮＡスポンジ、タフなデコイＲＮＡ（ＴｕＤ ＲＮＡ）、およびＤｒｏｓｈａ複合体とのｍｉＲＮＡ相互作用を阻害するマイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖、ヘアピン、短いオリゴヌクレオチド）が含まれるが、これらに限定されない。

さらに他の有用な導入遺伝子は、病原体に受動免疫を付与する免疫グロブリンをコードするものを含み得る。「免疫グロブリン分子」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に組み合わせることができる免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含むタンパク質である。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスである。「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。

「免疫グロブリン重鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部分および免疫グロブリン重鎖の可変領域の少なくとも一部分または免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来重鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸配列相同性の有意な領域を有する。例えば、Ｆａｂ断片中の重鎖は、免疫グロブリン由来重鎖である。

「免疫グロブリン軽鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部分および免疫グロブリン軽鎖の可変領域の少なくとも一部分または定常領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来軽鎖は、免疫グロブリン
遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸相同性の有意な領域を有する。

「イムノアドヘシン」は、結合タンパク質、通常は受容体、リガンド、または細胞接着分子の機能ドメインと、通常はヒンジ領域およびＦｃ領域を含む免疫グロブリン定常ドメインとを組み合わせたキメラの抗体様分子である。

「断片抗原結合」（Ｆａｂ）断片」は、抗原と結合する抗体上の領域である。それは重鎖および軽鎖の各々の定常ドメインおよび可変ドメインから構成される。

抗病原体構築物は、保護が求められる疾患の原因物質（病原体）に基づいて選択される。これらの病原体は、ウイルス、細菌、または真菌由来であり得、ヒト疾患に対するヒトにおける感染を予防するために、または獣医疾患を予防するために非ヒト哺乳類もしくは他の動物における感染を予防するために使用され得る。

ｒＡＡＶは、抗体をコードする遺伝子、特にウイルス病原体に対する中和抗体を含み得る。かかる抗ウイルス抗体としては、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびインフルエンザＣのうちの１つ以上に対して指向される抗インフルエンザ抗体が含まれ得る。Ａ型ウイルスは、最も悪性のヒト病原体である。パンデミックに関連しているインフルエンザＡの血清型としては、１９１８年にスペインインフルエンザを引き起こしたＨ１Ｎ１、２００９年の豚インフルエンザ、１９５７年にアジアインフルエンザを引き起こしたＨ２Ｎ２、１９６８年に香港インフルエンザを引き起こしたＨ３Ｎ２、２００４年にトリインフルエンザを引き起こしたＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、およびＨ１０Ｎ７が含まれる。他の標的病原性ウイルスとしては、アレナウイルス（ｆｕｎｉｎ、マチュポ、およびラッサを含む）、フィロウイルス（マールブルグおよびエボラを含む）、ハンタウイルス、ピコルナウイルス科（ライノウイルス、エコーウイルスを含む）、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、トガウイルス、コクサッキーウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、パラインフルエンザ、アデノウイルス、レオウイルス、水痘ウイルス（大痘瘡（天然痘））、およびポックスウイルスファミリー由来のワクシニアウイルス（牛痘）、および水痘帯状疱疹（仮性狂犬病）が含まれる。ウイルス性出血熱は、アレナウイルスファミリー（ラッサ熱）（リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）にも関連するファミリー）、フィロウイルス（エボラウイルス）、およびハンタウイルス（プレマラ）のメンバーによって引き起こされる。ピコルナウイルス（ライノウイルスの亜科）のメンバーは、ヒトの一般的な風邪に関連している。コロナウイルスファミリーは、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集素脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）などの複数の非ヒトウイルスを含む。ヒト呼吸器コロナウイルスは、一般的な風邪、非Ａ、Ｂ、またはＣ型肝炎、および突然の急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関連していると推定される。パラミクソウイルスファミリーには、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンパーを含むモルビリウイルス、ならびに呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む肺炎ウイルスが含まれる。パルボウイルスファミリーとしては、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、およびブタパルボウイルスが含まれる。アデノウイルスファミリーは、呼吸器疾患を引き起こすウイルス（例えば、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、抗エボラ抗体、例えば、２Ｇ４、４Ｇ７、１３Ｃ６、抗インフルエンザ抗体、例えば、ＦＩ６、ＣＲ８０３３、および抗ＲＳＶ抗体、例えば、パリビズマブ、モタビズマブを発現するように操作され得る。

細菌性病原体に対する中和抗体構築物もまた、本発明で使用するために選択され得る。一実施形態では、中和抗体構築物は、細菌自体に対して指向される。別の実施形態では、中和抗体構築物は、細菌によって産生される毒素に対して指向される。空中浮遊細菌性病原体の例としては、例えば、髄膜炎菌（髄膜炎）、肺炎桿菌（肺炎）、緑膿菌（肺炎）、類鼻疽菌（肺炎）、鼻疽菌（肺炎）、アシネトバクター（肺炎）、カタル球菌、モラクセララクナータ、アルカリゲネス、カルジオバクテリウム、インフルエンザ菌（インフルエンザ）、パラインフルエンザ菌、百日咳菌（百日咳）、野兎病菌（肺炎・発熱）、レジオネラ肺炎（レジオナイレス病）、オウム病クラミジア（肺炎）、肺炎クラミジア（肺炎）、結核菌（結核（ＴＢ））、マイコバクテリウム・カンサシ（ＴＢ）、マイコバクテリウム・アビウム（肺炎）、ノカルジア・アステロイデス（肺炎）、炭疽菌（炭疽菌）、黄色ブドウ球菌（肺炎）、化膿性連鎖球菌（猩紅熱）、肺炎球菌（肺炎）、コリネバクテリウムジフテリア（ジフテリア）、肺炎マイコプラズマ（肺炎）が含まれる。

ｒＡＡＶは、抗体をコードする遺伝子、特に炭疽菌によって産生される毒素である炭疽病の原因物質などの細菌病原体に対する中和抗体を含み得る。トキソイドを形成する３つのペプチドの１つである保護剤（ＰＡ）に対する中和抗体が記載されている。他の２つのポリペプチドは、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）からなる。抗ＰＡ中和抗体は、炭疽菌に対する受動免疫に有効であると記載されている。例えば、米国特許第７，４４２，３７３号、Ｒ．Ｓａｗａｄａ－Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４；２：５．（ｏｎ－ｌｉｎｅ ２００４ Ｍａｙ １２）を参照されたい。さらに他の抗炭疽毒素中和抗体が記載されており、かつ／または生成され得る。同様に、他の細菌および／または細菌毒素に対する中和抗体を使用して、本明細書に記載されるようなＡＡＶ送達抗病原体構築物を生成し得る。

感染症に対する抗体は、寄生虫または真菌によって引き起こされ得、例えば、アスペルギルス、アブシジアコリムビフェラ、クモノスカビ、ムコールプルベウス、クリプトコッカスネオフォルマンス、ヒストプラズマカプスラーツム、ブラストミセスデルマチチジス、コクシジオイデスイミチス、ペニシリウム種、ミクロポリスポーラ－フェニ、テルモアクチノミセス－ブルガリス、アルテルナリアアルテルナータ、クラドスポリウム種、ヘルミントスポリウム、およびスタキボトリス種を含む。

ｒＡＡＶは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連パーキンソン病（ＧＢＡ－ＰＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、がん、腫瘍、全身性硬化症、喘息、および他の疾患などの疾患の病原性因子に対する抗体、特に中和抗体をコードする遺伝子を含み得る。かかる抗体は、限定されないが、例えば、アルファ－シヌクレイン、抗血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（抗ＶＥＧＦ）、抗ＶＥＧＦＡ、抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＴＮＦ－アルファ、抗ＩＬ－１７、抗ＩＬ－２３、抗ＩＬ－２１、抗ＩＬ－６、抗ＩＬ－６受容体、抗ＩＬ－５、抗ＩＬ－７、抗第ＸＩＩＩ因子、抗ＩＬ－２、抗ＨＩＶ、抗ＩｇＥ、抗腫瘍壊死因子受容体－１（ＴＮＦＲ１）、抗ノッチ２／３、抗ノッチ１、抗ＯＸ４０、抗ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ３（ＥｒｂＢ３）、抗ＥｒｂＢ２、抗ベータ細胞成熟抗原、抗Ｂリンパ球刺激因子、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、抗オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、抗リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）タンパク質、抗ＣＣＬ２０、抗血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）、抗プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤、抗ＣＤ３８、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３０、抗ＩＬ－１ベータ、抗上皮成長因子受容体、抗ＣＤ２５、抗ＲＡＮＫリガンド、抗補体系タンパク質Ｃ５、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ３受容体、抗アルファ－４（α４）インテグリン、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質、および抗インテグリンα_４β_７であり得る。さらに他の病原体および疾患は、当業者に明らかであろう。他の好適な抗体としては、例えば、とりわけ
抗ベータ－アミロイド（例えば、クレネズマブ、ソラネズマブ、アダクナマブ）、抗ベータアミロイド原線維、抗ベータアミロイドプラーク、抗タウ、バピネウザマブなど、アルツハイマー病を治療するために有用な抗体を含み得る。様々な適応症を治療するための他の適切な抗体としては、例えば、ＷＯ２０１７／０７５１１９Ａ１として公開された、２０１６年１０月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８９６８に記載されているものが含まれる。

ｒＡＡＶベクター産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製およびパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／または当業者によって容易に設計することができる。

ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，「Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，」Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，「Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，」Ｊ．Ｇｅｎｅ「Ｍｅｄ．」１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。導入遺伝子をビリオンにパッケージするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを産生するために、その上に運ばれる免疫グロブリン構築物配列をパッケージング宿主細胞に導入する遺伝要素（例えば、シャトルプラスミド）に操作される。一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。代替的には、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成するために、またはインビトロでの抗体の混合物の産生のために使用され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

用語「ＡＡＶ９中間体」または「ＡＡＶ９ベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞に導入するために非機能的である。

本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；ＵＳ７５８８７７２ Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、およびｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

一実施形態では、組換えＡＡＶを産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシド中にパッケージするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノム、および宿主細胞中の産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列、ならびに組換えＡＡＶカプシドへの核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）で構成される。

任意で、ｒｅｐ機能は、カプシドを提供するＡＡＶ以外のＡＡＶによって提供される。例えば、ｒｅｐは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、またはｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、ｒｅｐ
４０、ｒｅｐ６８／７８、およびｒｅｐ４０／５２、またはそれらの断片であり得る。任意で、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、細胞培養物中の同じ遺伝子要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し得る。これらのＡＡＶまたは変異ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性制御性調節配列の調節下にあり得る。

一実施形態では、細胞は、適切な細胞培養（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、産生されたプラスミドは、ＡＡＶゲノムおよび目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター産生プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡを用いた細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の血清不含培地への培地交換、ベクター含有細胞および培養培地の回収などの方法工程を含むことができる。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。さらに別のシステムでは、遺伝子治療ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，」Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に
組み込まれる。これらおよび他のＡＡＶ生産システムの製造および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、および７，４３９，０６５。

粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物のダイアフィルトレーション、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過によるバッファー交換、および／またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの方法工程に供される。

２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、およびその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特出願第許６２／３２２，０７１号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という題名の第６２／２２６，３５７号により詳細が記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ８のための精製方法、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号、および２０１５年１２月１１日に出願された第６２／２６６，３４１号、ならびにｒｈ１０については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０５５号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」という題名の第６２／２６６，３４７号、ならびにＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０８３号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」という第６２／２６，３５１号にあり、それらは参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。

空のおよび完全粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配－精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた直線等式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験品目ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、負荷した２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬを与える。空のｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで除算して、次いで、ｘ１００をすることにより、空の粒子のパーセンテージを得る。

一般に、空のカプシドおよびパッケージされたゲノムを伴うＡＡＶベクター粒子のためのアッセイ方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、方法は、例えば、緩衝液中３～８％のＴｒｉｓ－
アセテートを含有する勾配ゲルなどの３つのカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供すること、次いで、試料材料が分離するまでゲルをランさせること、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレン、好ましくは、ナイロンにゲルをブロットすることを含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次および二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または発色変化を検出可能な検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、カラムフラクションからの試料が、採集され、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥロード用緩衝液中で加熱され、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）上で分解される。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅＩ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。

一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理工程は、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

追加的に、または代替的には、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶウイルス粒子およびＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィーに供することを含み、ＡＡＶウイルス粒子およびＡＡＶ中間体は、高ｐＨで平衡化された強力アニオン交換樹脂に結合され、約２６０および約２８０で紫外吸光度のために溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｐＨは、選択されたＡＡＶに応じて調整され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１６０３６０（ＡＡＶ９）、ＷＯ２０１７／１００７０４（ＡＡＶｒｈ１０）、ＷＯ２０１７／１００６７６（例えば、ＡＡＶ８）、およびＷＯ２０１７／１００６７４（ＡＡＶ１）］を参照されたい。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィー工程のために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉する。

組成物および使用
本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶストック（例えば、ｒＡＡＶストックまたは変異体ｒＡＡＶストック）および任意の担体、賦形剤および／または防腐剤を含む組成物を提供する。ｒＡＡＶストックは、同じである複数のｒＡＡＶベクターを指し、例えば、濃度および用量単位の考察において以下に記載される量である。

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意で、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。

適切な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤のうちから選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８ ［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリ
マー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字ｘ１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。

ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来および薬学的に許容される投与経路には、所望の臓器（例えば、肝臓（任意で肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、および他の親の投与経路への直接送達が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

ウイルスベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの約１×１０^９～１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含む溶液の範囲である。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意で、治療目的で記載されるものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。

複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルス（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）を含み、その範囲内の全ての整数または分数量、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲に含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０^９、２ｘ１０^９、３ｘ１０^９、４ｘ１０^９、５ｘ１０^９、６ｘ１０^９、７ｘ１０^９、８ｘ１０^９、または９ｘ１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０^１０、２ｘ１０^１０、３ｘ１０^１０、４ｘ１０^１０、５ｘ１０^１０、６ｘ１０^１０、７ｘ１０^１０、８ｘ１０^１０、または９ｘ１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０^１１、２ｘ１０^１１、３ｘ１０^１１、４ｘ１０^１１、５ｘ１０^１１、６ｘ１０^１１、７ｘ１０^１１、８ｘ１０^１１、または９ｘ１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０^１２、２ｘ１０^１２、３ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、７ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、または９ｘ１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、または９ｘ１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１
４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、または９ｘ１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０^１５、２ｘ１０^１５、３ｘ１０^１５、４ｘ１０^１５、５ｘ１０^１５、６ｘ１０^１５、７ｘ１０^１５、８ｘ１０^１５、または９ｘ１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内の全ての整数または分数量を含む、用量あたり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤、またはその範囲内のすべての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００～１０００μＬである。

特定の実施形態では、用量は、約１ｘ１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約３ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１．８５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。

一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約１×１０^９ＧＣ～約１×１０^１５、または約１×１０^１１～５×１０^１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者により決定されることができる。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人のために選択され得る。典型的に、新生児幼児のために、適切な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年齢の高い乳幼児のためには、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの容量が選択され得る。プレティーンおよびティーン世代のために、最大約５０ｍＬの容量が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の適切な容量および投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液
中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかし、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤のうちから選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字ｘ１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム７Ｈ_２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム２Ｈ_２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）である、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意で、髄腔内送達のために、商業的に入手可能な希釈剤は、懸濁化剤として使用され得るか、または別の懸濁化剤および他の任意の賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、ＥｌｌｉｏｔｔｓＢ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含み得る。

任意で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の薬学的成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適
な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。

本発明による組成物は、上記に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、有効量の薬学的に好適な担体に懸濁された、および／または注入、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを含む。一実施例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注入による、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。

本明細書で使用される場合、「槽内送達」または「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、または大槽内への直接的な注入による、永久的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

一態様では、本明細書に提供されるベクターは、方法および／またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。例えば、ＷＯ２０１７／１８１１１３を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択され得る。方法は、脊椎ニードルを患者の大槽内に前進させる工程、１本の可撓性チューブを脊椎ニードルの近位ハブに連結し、バルブの出口ポートを可撓性チューブの近位端に連結する工程と、その前進および連結工程の後、患者の脳脊髄液を用いてチューブをセルフプライム可能とした後、一定量の等張溶液を含有する第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結し、その後、一定量の薬学的組成物を含有する第２の容器をバルブのベクター入口ポートに連結する工程と、を含む。第１および第２容器をバルブに連結した後、流体流れのための通路は、ベクター入口ポートとバルブの出口ポートとの間に開かれ、薬学的組成物は脊椎ニードルを通して患者に注入され、薬学的組成物の注射後、流体流れのための通路は、フラッシュ入口ポートとバルブの出口ポートを通って開かれ、等張溶液は、薬学的組成物を患者にフラッシュするために脊椎ニードル中に注入される。

この方法およびこのデバイスは、それぞれ任意で、本明細書で提供される組成物の髄腔内送達のために使用されて得る。代替的には、他の方法およびデバイスが、かかる髄腔内送達のために使用され得る。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語句、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言
葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％（±１０％）の可変性を意味する。

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、および「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。

本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されているもの、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供している公開文書への参照により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性または安定であり得る。

本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定され得、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得、そのカセットは、遺伝子要素（例えば、プラスミド）によりパッケージング宿主細胞に送達され得、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）へパッケージされる。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのかかる発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。

省略形「ｓｃ」は、自己相補的であることを指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有するコーディング領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計される構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞介在合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的片割れが会合して、即時の複製および転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，「Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、および第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々が参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列と、目的の遺伝子に対してトランスに作用するか、または目的
の遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列との両方を指す。

タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質または核酸が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない、２つ以上の配列または下位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子からコーディング配列の発現を導くように配置された１つの遺伝子からのプロモーターを有する。したがって、コーディング配列に関しては、プロモーターは、異種性である。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

多くの事例では、ｒＡＡＶ粒子は、ＤＮａｓｅ耐性として参照される。しかしながら、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンド－およびエキソ－ヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製工程において使用され得る。かかるヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを分解するために選択され得る。かかる工程は、単一ヌクレアーゼ、または異なる標的に指向されたヌクレアーゼの混合物を含み得、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。

「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に導入遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周りで完全に構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計されたヌクレアーゼインキュベーション工程の間の分解（消化）からこれらのパッケージされたゲノム配列を保護する。

本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームでのプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖は、アミノ酸配列の集合を制御して、タンパク質またはペプチドを生成する。

本明細書および特許請求の範囲全体を通して使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、他の構成要素、要素、整数、ステップなどを含む。逆に、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語およびその変形は、他の構成要素、要素、整数、ステップなどを除外する。

上述のように、「約」という用語は、別段の指定がない限り、数値を修正するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。

以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

以下の実施例は、構造、生化学、および質量分析アプローチからの裏付けとなる証拠とともに、ＡＡＶ８および７つの追加の多様なＡＡＶ血清型の広範な脱アミド化を報告する。各部位における脱アミド化の程度は、ベクターの年齢および複数の一次配列および３Ｄ構造因子に依存していたが、ベクター回収および精製の条件からほぼ独立していた。ベクター導入活性に影響を与える脱アミド化の可能性を示し、いくつかのＡＡＶ８アスパラギンでのベクター活性における初期時点の損失を、急速に進行する自発的な脱アミド化と相関させる。側鎖アミドを安定化し、ベクターの形質導入を改善し、生物製剤製造における重要な懸念であるロット間の分子可変性を低減する変異戦略を探求する。この研究は、ＡＡＶカプシド異種性の以前に知られていない態様を示し、遺伝子治療のためのこれらのベクターの開発におけるその重要性を強調する。

以下の実施例１は、１次元および２次元ゲル電気泳動、質量分析、および新規構造モデリングによる、ＡＡＶ８ベクターカプシドへの翻訳後修飾の特徴付けを提供する。カプシド表面上の複数の推定脱アミド化部位の特定に続いて、インビトロおよびインビボの両方でカプシド構造および機能への影響を評価する。実施例１は、この分析をさらにＡＡＶ９に拡張して、この現象がＡＡＶ８以外の血清型に適用されるかを特定し、ＡＡＶカプシドの脱アミド化が血清型特異的でないことを確認する。実施例２および３は、さらなるＡＡＶにおける脱アミド化を例示する。

実施例４は、ＡＡＶ９カプシド上にマッピングされた新規エピトープに関する。

実施例１：アデノ随伴ウイルスカプシド表面上のアミノ酸の脱アミド化
Ａ．材料および方法
１．１Ｄおよび２Ｄゲル電気泳動
１Ｄ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析では、まずＡＡＶベクターをドデシル硫酸リチウムおよび還元剤の存在下で、８０^ｏＣで２０分間変性した。次に、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上で、９０分間２００Ｖで泳動し、クーマシーブルーで染色した。図１Ａ～図１Ｄのデータについて、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が、２Ｄゲル電気泳動を実行した。その後の実験では、社内で２Ｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行した。そのために、３５ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、３ｘ１０^１１ＧＣのＡＡＶベクターおよび５００Ｕターボヌクレアーゼマーカー（Ａｃｃｅｌａｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を組み合わせ、３７^ｏＣで１０分間インキュベートした。次に、９体積の無水エタノールを加え、試料をボルテックスし、－８０^ｏＣで少なくとも２時間インキュベートした後、氷上で５分間インキュベートし、最大速度で、１５^ｏＣで３０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを空気乾燥させ、次いで、再懸濁緩衝液＃１［０．１５％ＳＤＳ、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、および１μＬ ｐＨ６～９両性電解質、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＺＭ００２３をｄｄＨ_２Ｏ中に追加した］に再懸濁し、室温で静かにインキュベートした。３０分後、試料チューブをフリックして混合し、１μｇのニワトリコンアルブミンマーカー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を追加し、試料を３７^ｏＣで３０分間インキュベートし、１５分でフリックして混合した。次に、試料を５０^ｏＣに１５～２０分間移し、ボルテックスし、９５^ｏＣで２．５分間インキュベートし、冷却してから、最大速度で１分間遠心分離し、短時間ボルテックスした。次に、各試料１０μＬを１４０μＬの再懸濁緩衝液＃２（９．７Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー、および上述の０．０５％両性電解質をｄｄＨ_２Ｏ中に追加した）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、混合物をｐＨ６～１０固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に適用し、製造元の指示に従ってＺＯＯＭ ＩＰＧＲｕｎｎｅｒシステム上で実行した。以下の等電点電気泳動パラメータを使用した。ストリップあたり０．１Ｗ
および０．０５ｍＡの制限で、１００～１，０００Ｖで１２０分、１，０００～２，０００ Ｖで１２０分、２，０００ Ｖで１２０分泳動した。次いで、ＩＰＧストリップを還元し、単一ウェルの４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル中に負荷し、上記のように１Ｄで実行した。内部対照タンパク質ターボヌクレアーゼ（Ａｃｅｌａｇｅｎ，２７ｋＤａ）およびニワトリ卵白コンアルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，７６ｋＤａ，ｐＩ６．０～６．６）と比較して、ＡＡＶ ＶＰの相対的な移動を決定した。

２．ベクター産生
ペンシルバニア大学のベクターコアは、１Ｄおよび２Ｄゲル電気泳動ならびに質量分析実験用の組換えＡＡＶベクターを作製し、前述のように塩化セシウムまたはイオジキサノール勾配で精製した。（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０；２１（１０）：１２５９－７１、Ｇａｏ ＧＰ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２；９９（１８）：１１８５４－９）。親和性精製ベクターを以下のように産生した：１０個の３６層ハイパースタック容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でＨＥＫ２９３細胞を増殖させ、ベクターゲノムプラスミド（ｐＡＡＶ－ＬＳＰ－ＩＶＳ２．ｈＦＩＸｃｏ－ＷＰＲＥ－ｂＧＨ）、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子を含むトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドの混合物でそれらを共トランスフェクションした。トランスフェクション試薬としてＰＥＩｐｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ）を使用した。トランスフェクションの５日後、上清を回収し、Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳ Ｍｉｄｉｃａｐフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を通じて清澄化し、ベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理し、その後、塩を添加して０．６Ｍにした。清澄化したバルク回収材料を、タンジェンシャル流濾過（ＴＦＦ）によって１０倍濃縮し、次いで４体積の親和性カラム充填緩衝液に対してダイア濾過した。ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）親和性カラム上でベクターを捕捉し、低ｐＨでベクターピークを中和緩衝液に直接溶出した。中和溶出液を高ｐＨ結合緩衝液に希釈し、陰イオン交換研磨カラム（Ｃｉｍｕｌｔｕｓ ＱＡ－８；Ｂｉａ Ｓｐｒｅｓｔｉｏｎｓ）に負荷し、ゲノム含有（完全）粒子について調製物を濃縮した。完全ベクター粒子を浅塩溶出勾配で溶出し、すぐに中和した。最後に、最終濃縮および製剤緩衝液（ＰＢＳ＋０．００１％プルロニックＦ－６８）への緩衝液交換のために、ベクターを２回目のＴＦＦに供した。

６ウェルプレートにおけるＨＥＫ２９３細胞の小規模トリプルトランスフェクションによるインビトロアッセイのための変異ベクターを産生した。プラスミドＤＮＡ（９０μＬの無血清培地中の０．０９１μｇシスプラスミド、０．９１μｇトランスプラスミド、１．８２μｇデルタＦ６ Ａｄヘルパープラスミド）を５．６μＬの１ｍｇ／ｍＬポリエチレンイミン溶液および９０μＬの無血清培地中で混合し、室温で１５分間インキュベートし、細胞に追加し、さらに０．８ｍＬの新鮮な無血清培地を加えた。翌日、０．５ｍＬの上位培地を全血清培地に交換した。トランスフェクションの３日後に３回の凍結／解凍サイクルでベクターを回収し、その後遠心分離して細胞破片および上清を回収した。シスプラスミドは、プロメガキメライントロンおよびウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナルを伴うニワトリベータアクチン（ＣＢ７）プロモーターの制御下でホタルシフェラーゼ導入遺伝子をコードする導入遺伝子カセットを含む。トランスプラスミドは、ｗｔＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子をコードし、変異ＡＡＶ８ ｃａｐバリアントを生成するために、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用した。ベクターを前述のように力価測定した。（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。

時間経過ベクター生成実験のために、１５ｃｍの組織培養皿におけるＨＥＫ２９３細胞の中規模トリプルトランスフェクションによるベクターを生成した。プレートあたり、２
ｍＬの無血清培地中の３６μＬの１μｇ／ｍＬポリエチレンイミン溶液をプラスミドＤＮＡ（０．６μｇシスプラスミド、５．８μｇトランスプラスミド、１１．６μｇデルタＦ６ Ａｄ－ヘルパープラスミド）と混合し、室温で１５分間インキュベートし、１４ｍｌの無血清培地でリフレッシュしたプレート上で約６０％の集密度で細胞に追加した。翌日、８ｍｌの上部培地を新鮮で完全な血清培地に交換した。すべての上部培地を収集し、ディッシュから細胞をかき取り、これを－８０℃で凍結することによってベクターを回収した。３回の凍結／解凍サイクルを適用し、遠心分離により溶解物を清澄化することにより、上清／細胞混合物から粗ベクターを回収した。清澄化溶解物にベンゾナーゼ、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、および５Ｍ ＮａＣｌを追加して、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓおよび３６０ｍＭ ＮａＣｌの最終濃度にすることにより、質量分析用のベクターを精製および濃縮した。１ ｍｌ ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ親和性カラム上でベクターを捕捉し、低ｐＨでベクターピークを中和緩衝液に直接溶出した。画分を２８０ｎｍでの吸光度によって分析し、最も濃縮された画分を質量分析に供した。

インビボ実験のために、前述のｗｔＡＡＶ８カプシドまたは６個の脱アミド化変異体のうちの１つを用いてベクターを産生し、導入遺伝子カセットは、ＣＢ７プロモーター、ＰＩイントロン、ホタルルシフェラーゼ導入遺伝子、およびＲＢＧポリアデニル化シグナルを含む（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。

３．質量分析の実行／ダイジェスト／分析
材料：Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から炭酸水素アンモニウム、ＤＴＴ、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、および１８Ｏ濃縮水（９７．１％純度）、ならびにＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からアセトニトリル、ギ酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、８Ｍグアニジン塩酸（ＧｎｄＨＣｌ）、およびトリプシンを購入した。

トリプシン消化：１Ｍ ＤＴＴおよび１．０Ｍヨードアセトアミドのストック溶液を調製した。カプシドタンパク質を変性させ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび２Ｍ ＧｎｄＨＣｌの存在下で９０^ｏＣで１０分間還元した。試料を室温に冷却させ、次いで、暗所で３０分、室温で３０ ｍＭ ＩＡＭを使用してアルキル化した。１ｍＬ ＤＴＴを追加してアルキル化反応をクエンチした。最終ＧｎｄＨＣｌ濃度を２００ ｍＭに希釈する量で、変性タンパク質溶液に２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．５～８）を追加した。トリプシン対タンパク質の比率が１：２０になるようにトリプシン溶液を加え、３７^ｏＣで一晩インキュベートした。消化後、ＴＦＡを最終濃度０．５％になるように添加し、消化反応をクエンチした。

１８Ｏ－水実験では、最初にカプシド試料を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して１８Ｏ－水で調製した１００ ｍＭ重炭酸アンモニウムに緩衝液交換した。試料中の水を完全に除去するために、緩衝液交換を２回行った。１８Ｏ－水中で１Ｍ ＤＴＴおよび１Ｍ ＩＡＭのストック溶液を調製した。１８Ｏ－水試薬および緩衝液を用いて、上記と同様の変性、アルキル化、および消化ステップに従った。

液体クロマトグラフィータンデム質量分析：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラム（長さ１５ｃｍ、内径３００μｍ）およびＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦと結合したＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたオンラインクロマトグラフィーを実行した。オンライン分析中、カラム温度を３５℃の温度で維持した。移動相Ａ（０．１％ギ酸を含む
ＭｉｌｌｉＱ水）および移動相Ｂ（０．１％ギ酸を含むアセトニトリル）の勾配でペプチドを分離した。１５分間にわたって４％Ｂから６％Ｂへ、２５分間（合計４０分間）で１０％Ｂへ、その後４６分間（合計８６分間）で３０％Ｂへと勾配を実行した。試料を直接カラムに負荷した。カラムサイズは、７５ｃｍ×１５μｍのＩＤであり、２ミクロンのＣ１８培地（Ａｃｌａｍｅ ＰｅｐＭａｐ）を充填した。負荷、導入、および洗浄ステップにより、各液体クロマトグラフィータンデム質量分析実行の合計時間は約２時間であった。

Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析器におけるデータ依存のｔｏｐ－２０法を用いて質量分析データを取得し、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富な未配列前駆体イオンを動的に選択した。予測自動利得制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介してシークエンシングを実行し、４ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を実行した。調査スキャンを２００ｍ／ｚで、１２０，０００の解像度で取得した。５０ｍｓの最大イオン注入時間、３０の正規化衝突エネルギーを伴うｍ／ｚ２００でＨＣＤスペクトルの解像度を３０，０００に設定した。ＳレンズのＲＦレベルを５０に設定し、これにより、ダイジェストからのペプチドが占めるｍ／ｚ領域が最適に伝達される。単一、未割り当て、または６以上の電荷状態を有する前駆体イオンを断片化選択から除外した。

データ処理：ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、取得したすべてのデータを分析した。ペプチドマッピングについては、固定修飾としてカルバミドメチル化を設定し、可変修飾として酸化、脱アミド化、およびリン酸化を設定して、単一エントリタンパク質ＦＡＳＴＡデータベースを使用して検索を実行した。タンデム質量分析スペクトルには１０ｐｐｍの質量精度、高いプロテアーゼ特異性、０．８の信頼レベルを使用した。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４ Ｄａ（－ＯＨおよび－ＮＨ２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化および天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定した。考えられる脱アミド化部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている等張種は、単一のピークで共移行し得る。したがって、複数の潜在的脱アミド化部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミド化部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位において独立していることを想定する。このアプローチにより、脱アミド化に関与する特定の部位および脱アミド化に関与する潜在的な組み合わせの定義が可能となる。

二次データ処理：生の質量分析の二次分析を、メリーランド大学ボルチモア郡で以下の方法を使用して実行した。Ｐｅａｋｓ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ５．３ソフトウェア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）をすべての質量分析に使用した。生データファイルのデータ精密化を、≦１０ｐｐｍの前駆体ｍ／ｚ許容値、最小２、最大４の前駆体の電荷状態のパラメータを使用して実行した。入力スペクトルの新規シーケンシングを、１０ｐｐｍの前駆体イオン誤差許容値および０．１Ｄａの生成物イオン誤差許容値を有するピークスアルゴリズムを使用して実行した。消化酵素をトリプシンとして設定し、可変修飾は酸化、リン酸化、脱アミド化であり、固定修飾はシステインのカルバミドメチル化であった。

４．ＡＡＶカプシドの構造解析
ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋからＡＡＶ８原子座標、構造因子、お
よび関連するカプシドモデルを取得した（ＰＤＢ番号：３ＲＡ８）。カプシドの３次元（３Ｄ）構造解析で使用するために、構造の精密化を実行し、ＡＡＶ８ ＶＰ３の一次アミノ酸配列に依存しない電子密度を生成した。ＡＡＶ８ ＶＰ３の予想される一次配列によって偏らなかったＡＡＶ８カプシドのイソアスパラギン酸の電子密度を観察するために、この分析を実行した。得られた構造を使用して、Ｎ＋１グリシンをイソアスパラギン酸とするＡＡＶ８ ＶＰ３一次配列中の４つのアスパラギンをモデル化し、次いで、標準的な精製プロトコルを用いてイコサヘドラル非結晶マトリックスを厳密に強制することによって、結晶学およびＮＭＲシステム（ＣＮＳ）ソフトウェアを使用してＡＡＶ８カプシド構造を精製した（Ｂｒｕｎｇｅｒ ＡＴ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ
Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ １９９８；５４（Ｐｔ ５）：９０５－２１）。ＨＩＣ－ＵＰデータベースからイソアスパラギン酸の構造モデルを取得し、続いて、構造精製のためのＰＲＯＤＲＧにおける分子辞書を生成した（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ ＧＪ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ２００７；６３（Ｐｔ １）：９４－１００）。次いで、ＡＡＶ８カプシドの平均電子密度マップ（ＣＮＳにおいても）を計算し、ＣＯＯＴソフトウェアを使用して可視化し、その後、モデル化したイソアスパラギン酸残基を電子密度マップに適合させるために得られたモデルの軽微な調整を行った（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ Ｋ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ２００４；６０（Ｐｔ １２ Ｐｔ １）：２１２６－３２）。本プロトコルを繰り返し、Ｎ ＋ １グリシンを含むＡＡＶ９ ＶＰ３一次配列中のＮ５１２をさらにモデル化した（ＰＤＢ番号：３ＵＸ１）。ＣＯＯＴ、ＰｙＭｏｌ、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを使用してすべての図を生成した（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ Ｋ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ
Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ２００４；６０（Ｐｔ １２ Ｐｔ １）：２１２６－３２、ＤｅＬａｎｏ ＷＬ ＰｙＭＯＬ：Ａｎ Ｏｐｅｎ－Ｓｏｕｒｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｔｏｏｌ Ｖｏｌ．４０，２００２：８２－９２、Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ＥＦ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ２００４；２５（１３）：１６０５－１２）。脱アミド化イソアスパラギン酸残基の電子密度マップと、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９のモデル化されたイソアスパラギン酸残基を比較するために、以前に特定した脱アミド化タンパク質の複数の構造を取得した（ＰＤＢ番号：１ＤＹ５、４Ｅ７Ｇ、１ＲＴＵ、１Ｗ９Ｖ、４Ｅ７Ｄ、および１Ｃ９Ｄ）（Ｒａｏ ＦＶ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００５；１２（１）：６５－７６、Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５；３４（４７）：１５５８３－９１、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０００；２９７（３）：７１３－３２）。

ＡＡＶ８またはＡＡＶ９結晶構造の原子座標で報告された各アスパラギン残基の各原子の温度係数を平均することにより、脱アミド化残基の温度係数を決定した（ＰＤＢ番号：３ＲＡ８、３ＵＸ１）。

５．動物研究
ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会は、すべての動物手順を承認した。ベクター性能を評価するために、尾静脈注入を介して８週間齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、３ｅ１０ ＧＣのｗｔＡＡＶ８またはカプシド変異ベクターを１００μＬの容量で静脈内注入した。１４日目に全てのマウスを犠牲にした。ルシフェラーゼ発現のインビボ評価のために、マウス（約２０ｇ）を麻酔し、２００μＬまたは１５ｍｇ／ｍＬのルシフェリン基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を腹腔内注入した。ルシフェリン投与の５分後にマウスを画像化し、ＩＶＩＳ Ｘｅｎｏｇｅｎインビボ画像化システムを介して画像化した。Ｌｉｖｉｎｇイメージ３．０ソフトウェアを使用して、目的の領域のシグナルを定量化した。７日目および１４日目に測定を行った。

６．変異ベクター力価およびインビトロ導入効率の評価
ＤＮＡｓｅＩ耐性ゲノムのｑＰＣＲによってベクター力価を決定した。ｑＰＣＲプライマーは、パッケージ化された導入遺伝子のポリアデニル化配列にアニールする。ルシフェラーゼ発現によるベクター導入効率のインビトロ評価のために、完全なＤＭＥＭ（１０％胎児ウシ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）の黒壁９６ウェルプレートに０．９ｅ５ Ｈｕｈ７細胞／ウェルを播種した。翌日、培地を除去し、完全培地で希釈した５０μＬの粗または精製ベクターに変更した。各粗ベクター試料について、３倍希釈系列で４回希釈を試験した。４８時間後、０．３μｇ／μＬの完全培地中のルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を調製し、５０μＬの容量で形質導入細胞に追加した。結果をＢｉｏｔｅｋ Ｃｌａｒｉｔｙルミノメータで読み取った。標的細胞に追加したルシフェラーゼ活性／ＧＣは、広範囲のＧＣにわたって一定であるが、高いＭＯＩで飽和できることを見出した。したがって、希釈系列データ（発光単位対ＧＣ）の直線性を検査し、飽和が明らかな場合の最高点を除外し、各バリアントの各アッセイの直線範囲内の値について平均ルシフェラーゼ／ＧＣを計算する。これにより、形質導入効率値が得られる。Ｗｔ対照を１の値に設定することで比較を簡素化するためにデータを正規化した。

７．体内分布
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて肝臓試料からＤＮＡを抽出し、次いで、導入遺伝子カセットのＲＢＧポリアデニル化シグナルに対して設計されたプライマー／プローブセットで前述のようにリアルタイムＰＣＲによってベクターＧＣのＤＮＡを分析した（Ｃｈｅｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ２０１３；２４（４）：１５４－６０）。

Ｂ．結果
ＡＡＶ８は、そのカプシドタンパク質における実質的な電荷異質性を示す。
ベクター性能に影響を及ぼす可能性があるＡＡＶ８ベクターカプシド上の翻訳後修飾の存在を定性的に評価するために、１Ｄおよび２Ｄゲル電気泳動の両方によってイオジキサノール勾配によって精製されたＡＡＶ８総カプシドタンパク質を分析した。１Ｄ還元型ドデシル硫酸ナトリウムＳＤＳゲルでは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、適切な分子量で単一バンドとして分解された（図１Ｂ）（Ｒｏｓｅ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９７１；８（５）：７６６－７０）。電荷に基づいてタンパク質を分離する２Ｄゲル電気泳動でさらに評価すると（図１Ｃ）、カプシドタンパク質の各々は、さらに、ＶＰアイソフォームに依存するｐＨ６．３～＞７．０の範囲の異なる等電点（ｐＩ）を有する一連の異なるスポットとして分解された（図１Ｄ）。各ＶＰの個々のスポットは、炭酸脱水酵素アイソフォームの内部等電点標準と比較して移行として測定した場合、０．１ ｐＩ単位の離散間隔で分離されており、単一の残基電荷の変化を示唆した。これらのアイソフォームの存在は、各ＶＰが多くの修飾を受ける可能性を有し、それによって、等電点電気泳動下で異なる移行をもたらすことを示唆する。

（典型的にはアスパラギン）側鎖アミド基の一部がカルボン酸に変換される脱アミド化（図１Ａ）は、タンパク質調製物における共通の電荷異性源である。脱アミド化がＶＰ電荷アイソフォームの異なる集団の原因であるかを判断するために、２つのＡＡＶ８アスパラギン残基を個別に変異させてアスパルテートにした。これらのカプシド変異は、単一の追加のアスパラギン残基の完全な脱アミド化に相当する量の電荷をシフトさせる必要がある。変異体の２Ｄゲル分析は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の主なスポットが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ８における等価スポットよりも酸性（０．１ｐＨ単位）の１つのスポット位置をシフトしたことを示す（図１Ｅ～図１Ｇ）。このシフトの大きさは、ｗｔ ＶＰ電荷アイソフォーム間の観測された間隔に相当する。したがって、ＡＡＶカプシドタンパク質の２Ｄゲルパターンは、多部位脱アミドと一致する。

ＡＡＶ８ベクターカプシドで自発的脱アミド化が生じる
各カプシドタンパク質についての個別のスポット化パターンの原因となる修飾を特定す
るために、質量分析によってＡＡＶ８ベクターのパネルを分析した。ＡＡＶ８カプシドタンパク質の被覆度は、平均して総ＶＰ１配列の９５％を超えていた（データは示さず）。質量分析によるアスパラギンおよびグルタミン残基のサブセットの広範な脱アミド化を検出し、ＤＮＡによってコードされる配列に基づく予測値と比較して、個々のペプチドの観察された質量の約１Ｄａの増加を示し、ＡＡＶ８ベクターのすべての調製物においてこの脱アミド化パターンを観察した（図２Ａ～図２Ｄ）。

一般に使用される精製方法間の脱アミド化の全体的な異質性を評価し、ＶＰ１およびＶＰ２固有領域における脱アミド化を調べるために、２９３細胞においてトリプルトランスフェクションによって産生される９つのロットのＡＡＶ８を選択し、塩化セシウム勾配、イオジキサノール勾配、または親和性クロマトグラフィーのいずれかによって精製した。ベクターはまた、プロモーターおよび導入遺伝子カセットに関して様々であった。ベクターゲノムの存在が脱アミド化に影響を及ぼしたかを判断するために、シスプラスミドの不存在下で２９３細胞においてトリプルトランスフェクションによって産生されたＡａｖ ８プレップも評価し（空カプシドのみを産生する）、イオジキサノール勾配によって精製した。

検出不可能な範囲から脱アミド化されている個々のアミノ酸の９９％を超える範囲で、ＡＡＶ８カプシドのアスパラギンおよびグルタミン残基にわたって広範囲の脱アミド化が存在した（図２Ｅ）。脱アミド化の最高レベル（７５％を超える）は、Ｎ＋１残基がグリシン（すなわち、ＮＧ対）であったアスパラギン残基において生じた（表１）。Ｎ＋１がグリシンではなかった追加のアスパラギン残基において、より低いレベルの脱アミド化（すなわち、最大１７％）を検出した。アスパラギンの平均脱アミド化は、調製物間でほぼ一致した。また、グルタミン残基での脱アミド化も検出したが、アスパラギンよりも低い頻度で検出し、観察した最も高いパーセントはＱ４６７で２％未満であった（図７）。この観察は、調製物にわたって矛盾していた（データは示さず）。残基Ｎ４９９（Ｎ＋１残基はアスパラギンである）で最も大きな調製対調製の違いを観察し、値は１％未満～５０％を超える脱アミド化の範囲であった。いずれにせよ、ベクターの調製物間の脱アミド化で観察した変動は、精製方法、導入遺伝子同一性、またはベクターゲノムの存在に関連していないようであり、これらの因子が脱アミド化率に影響を与えないことを示唆した。

次に、試料処理がＡＡＶ８における脱アミド化の観察したレベルに寄与したかを決定するために一連の実験を行った。極端な温度（７０℃で７日間）またはｐＨ（ｐＨ２またはｐＨ１０で７日間）は、ＡＡＶ８カプシド中で追加の脱アミド化を有意に誘導しなかった（図４Ａおよび図４Ｂ）。この抵抗性を考えると、観察した脱アミド化は精製段階でのみ発生した可能性が低く、それよりも短く、比較的軽度であったと考察する。精製前後の脱アミド化の程度を決定するために、未精製ベクターに対して質量分析を行おうとしたが、成功しなかった。同様に、重水対照は、質量分析ワークフローに特有の処理が追加の脱アミド化事象に寄与しないことを示す（図４Ｃ）。

質量分析ワークフローを検証するために、以前に脱アミド化について評価されている２つの組換えタンパク質を調査し、所見（図５Ａおよび図５Ｂ）は、公表された結果と一致する［Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ＬＥ，Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，Ｄ，ａｎｄ Ｎｙｍａｎ，ＰＯ（１９７６）．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｃ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５１：５４５７－５４６３、およびＣａｒｖａｌｈｏ，ＲＮ，Ｓｏｌｓｔａｄ，Ｔ，Ｂｊｏｒｇｏ，Ｅ，Ｂａｒｒｏｓｏ，ＪＦ，ａｎｄ Ｆｌａｔｍａｒｋ，Ｔ（２００３）．Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｂｉｌｅ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｎ－－＞Ａｓｐ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７８：１５１４２－１５１５］。さらに、ＡＡＶ８からの生データを評価するために二次機関を雇った。この独立した分析は、脱アミド化された部位と同じ部位を特定し、ピーク検出および面積計算におけるソフトウェア間の変動に起因する
各部位における修正の程度の変動は最小限であった（図６）。

構造形態、温度因子、およびＮ＋１アミノ酸の同一性は脱アミド化頻度に寄与する
ＡＡＶ８の構造が解析され、公開されており（ＰＤＢ識別子：２ＱＡ０）（Ｎａｍ ＨＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１１；８５（２２）：１１７９１－９９）、次に、非酵素脱アミドの好条件の証拠についてＡＡＶ８カプシド構造を調査し、脱アミド化率を確立された構造特徴と相関させた（Ｎａｍ ＨＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００７；８１（２２）：１２２６０－７１）。アスパラギン脱アミド化に影響を及ぼす要因は文献でよりよく特徴付けられており、アスパラギン脱アミド化事象はグルタミン脱アミド化事象よりはるかに一般的であるため、アスパラギン残基のみに焦点を当てた（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＮＥ，ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＡＢ（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：９４４－９４９）。また、ＡＡＶ８結晶構造からこれらの残基の各々の温度（またはＢ）因子を決定し、温度因子は、原子のその平均位置からの変位の測定値であり、より高い値は、より大きな変位、より高い熱振動、したがって柔軟性の増加を示す（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ
Ｓ ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ ＭＲ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９９７；６：２５６１－７）。目的のアスパラギンの大部分は、表面に露出されたＨＶＲ内またはその近くに位置し（表１）、構造的に脱アミド化に有利であり、溶媒に曝露される環境を提供する（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１３；８７（２０）：１１１８７－９９）。これらの柔軟性ループ領域に位置する残基は、ベータ鎖およびアルファヘリックスなどの柔軟性の低い領域内の残基よりも平均的に脱アミド化される頻度が高いことを見出した。例えば、Ｎ２６３位のＮＧ残基は、ＨＶＲ Ｉの一部であり、高温因子を有し、平均で９８％を超えて脱アミド化された（図７Ａおよび図６、表１）。約８５％の時間を脱アミド化したＮ５１４（図３および図６、表１）はまた、Ｎ＋１グリシンを有するＨＶＲ（ＨＶＲ Ｖ）中にあり、しかしながら、局所温度因子は、３倍軸における他のＶＰモノマー上の残基と相互作用するため、Ｎ２６３と比較して比較的低い。好ましくない＋１残基およびより低い局所温度因子は、ＨＶＲ残基であっても、より低い脱アミドと相関している。例えば、Ｎ５１７は、平均して４％のみ脱アミド化されており（表１）、この残基は、高度脱アミド化Ｎ５１４と同等の温度因子を有するが、そのＮ＋１残基はセリンであり、立体障害による脱アミド化事象の可能性を低下させる。これは、いくつかの要因が所与のカプシド位置で脱アミド化の程度を累積的に決定することを示すが、＋１残基の同一性は明らかに最も影響力のある要因である。

アスパラギン脱アミドにおける＋１残基の役割を試験するために、ＡＡＶ８ ＮＧ部位が＋１位で個別にアラニンまたはセリンのいずれかに変異した変異ベクターを生成した。モデルペプチド研究は、ＮＧペプチドは半減期が１日ほど短く脱アミド化するのに対し、ＮＡまたはＮＳペプチドは典型的には、それぞれ２５または１６倍遅く脱アミド化することを示す（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＮＥ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＡＢ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１；９８（８）：４３６７－７２）。ベクター変異体の質量分析は、ベクター脱アミド化の程度を決定する＋１部位の中心的役割を確認した。このセット中のＮＧ部位（ｗｔで８０％を超える脱アミド化）は、＋１部位をアラニン（５％未満の脱アミド化）またはセリン（１４％未満の脱アミド化）に変更されると、隣接するアスパラギンの選択的安定化を示した（表２）。

少なくとも部分的に埋没され、溶媒に容易に曝露されない、かつ／または無傷の完全に組み立てられたＡＡＶ８カプシドの局所的柔軟性が低い領域に位置した残基は、より好ましい環境に位置するものと比較して、脱アミドの頻度が低かった（表１）。それにもかかわらず、好ましくない状態の残基のいくつかが脱アミド化されていた。例えば、Ｎ６３０は、少なくとも部分的に埋没されるが、依然として検出可能な程度の脱アミド化を有した。この残基について、Ｎ＋１残基としてのフェニルアラニンの存在は、この領域がＡＡＶ８ ＶＰ３タンパク質中の非酵素的自己タンパク質分解切断の新規部位である可能性を示唆する。

ＡＡｖ８ ＶＰ３の構造モデリングは脱アミド事象を確認する
組み立てられたカプシドの文脈において脱アミド化の直接の証拠を提供するために、ＡＡＶ８の結晶構造を評価した（Ｎａｍ Ｈ－Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１１；８５（２２）：１１７９１－９）。この血清型の利用可能な結晶構造（すなわち、２．７Å）の分解能は、Ｒ基中の末端原子を特定するのに十分に高くはなく、したがって、アスパラギン、アスパラギン酸、およびイソアスパラギン酸残基を直接区別するのに不十分である。これらの条件下で形成されるアスパラギン酸の異性体の構造の他の態様は、２．７Å構造から脱アミド化を決定する機会を提供した。この分析は、以下の２つの前提に基づく：１）アスパラギンの自発的脱アミド化の主な生成物は、アスパラギン酸ではなくイソアスパラギン酸であり、３：１の比率で生成される（Ｇｅｉｇｅｒ Ｔ ａｎｄ Ｃｌａｒｋｅ Ｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７；２６２（２）：７８５－９４）、２）アスパラギンまたはアスパラギン酸は、イソアスパラギン酸のＲ基に対応する電子密度マップの長さが短いため、イソアスパラギン酸と区別できる。このより短いＲ基は、脱アミド化反応中のサクシニミジル中間体の分解後に、Ａ ＡＶ８ ＶＰ３カプシドタンパク質骨格の主鎖に組み込まれるときに、イソアスパラギン酸のＲ基からのベータ炭素が失われるときに作製される。

最初にＡＡＶ８構造自体を改良し、既知のＡＡＶ８ ＶＰ３配列によって偏らなかったＡＡＶ８カプシド電子密度を生成した。次いで、イソアスパラギン酸に関連するより短いＲ基の存在に基づいて、脱アミド化の証拠について、精製されたＡＡＶ８結晶構造を調べた（図３Ａ～図３Ｅ）。電子密度マップは、質量分析によって検出された脱アミド化を有しなかった４１０におけるアスパラギンと比較すると、２６３位（図３Ｃ）、３８５位（示さず）、５１４位（図３Ｄ）、および５４０位（図３Ｅ）における高度脱アミド化Ｎ＋１グリシン残基についてより短いＲ基を確認した（図３Ｂ）。したがって、電子密度マップによって示される脱アミド化は、これらの部位で質量分析によって生成された、７５％を超える脱アミドを伴うデータと一致する。得られたイソアスパラギン酸モデルは、他の既知の脱アミド化タンパク質の結晶構造で観察されたイソアスパラギン酸残基と同等であり、ＡＡＶ８の分析の妥当性を裏付けた（Ｒａｏ ＦＶ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００５；１２（１）：６５－７６、Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５；３４（４７）：１５５８３－９１、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｌ，
ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０００；２９７（３）：７１３－３２）。この構造解析は、質量分析を介してＡＡＶ８カプシドを解析する際に観察される脱アミド化現象の独立した確認として機能する。

ＡＡＶカプシドの脱アミド化は血清型特異的ではない
カプシド脱アミド化の証拠として、ＡＡＶ８を超える血清型を調査した。潜在的なベクター処理効果の対照を含む（図１１Ｄ～図１１Ｆ）、２Ｄゲル電気泳動（図１１Ａ）および質量分析（図１１Ｂ）を使用してＡＡＶ９ベクター調製物を調査した。ＡＡＶ９脱アミド化のパターンおよび程度は、ＡＡＶ８と同様であった。４つのＡＡＶ９ ＮＧ部位のすべてが、８５％を超えて脱アミド化され、１３個の非ＮＧ部位は、より少ない程度で脱アミド化され、いくつかの部位は、脱アミド化％における高いロット間可変性を示した。次に、構造解析ワークフローを適用し、既存のＡＡＶ９結晶データを再適合した（図１１Ｃ、表３）。ＡＡＶ８と同様に、イソアスパラギン酸は、ＡＡＶ９結晶構造内のいくつかのＮＧ部位の電子密度により適合する。２Ｄゲル分析（データは図示さず）および質量分析（表４に要約）を、さらに進化学的に多様な５つの血清型（ｒｈ３２．３３、ＡＡＶ７、ＡＡＶ５、ＡＡＶ４、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ１）に拡張した。調査したカプシドのすべては、同様のパターンおよび脱アミド化の程度を含み、この修飾が臨床的に関連するＡＡＶベクターにおいて広範であることを示し、同様の基本的な一次配列および構造的要因によって決定される。

脱アミド化事象は、カプシド組み立ておよび形質導入効率に影響を及ぼす可能性がある
脱アミド化の機能的影響を試験する１つのアプローチは、アスパラギンを遺伝子変異によってアスパルテートに置き換えることである。２９３細胞の小規模なトリプルトランスフェクションによって、各脱アミド化ＡＡＶ８アスパラギンについてルシフェラーゼレポーターをコードするアスパルテート変異ベクターを生成し、ＤＮＡｓｅＩ耐性ゲノムコピーのｑＰＣＲによってベクターを力価測定した（図８Ａ）。変異は、ｗｔＡＡＶ８と比較してカプシド組み換えにほとんど影響を与えず、効果は、ｗｔベクターにおける全体的な脱アミド化が低い、ほとんど埋没された非ＮＧ部位に限定された。次に、ヒト肝臓由来Ｈｕｈ７細胞のインビトロ導入効率について変異パネルを評価した（図８Ｂ）。いくつかの変異体は、形質導入効率の低下を示し、Ｎ５７位、Ｎ９４位、Ｎ２６３位、Ｎ３０５位、Ｑ４６７位、Ｎ４７９位、およびＮ６５３位は、１０倍を超える形質導入損失を示した。ＡＡＶ９について同様の数の感受性部位を観察した（図１１Ｇおよび図１１Ｈ）。典型的には、所与の位置における残基の一部のみが内因的に脱アミド化されるため、このアプローチは、機能単位がホモマー集合体であるカプシドなどのタンパク質の機能損失を過大評価する可能性を有し、１つのカプシド部位における内因性修飾は、無傷の残基を有する隣接するサブユニットによって補償され得る。それにもかかわらず、この方法は、製造中または変異安定化中の将来のモニタリングのために脱アミド化残基の優先順位付けに役立つ可能性があると推論した。この機能損失変異誘発データを適切な文脈に配置するには、内因性脱アミド化ベクターの集団からの機能データが必要であろう。

経時によるベクター活性の損失は、進行性脱アミド化と相関する
ＮＧの脱アミドの明らかに短い半減期を考慮すると、年齢がわずか１日異なるベクター試料は、異なる脱アミド化プロファイルを示し、内因性脱アミド化を機能と相関させる機会を提供することを推論した。大規模ベクター調製プロトコルでは、２９３細胞のトリプルトランスフェクション、その後のベクター産生のための５日間のインキュベーション、およびベクター精製のための１～２日間を必要とする。このプロセスに近似するために、ｗｔ ＡＡＶ８有する２９３細胞の中規模トリプルトランスフェクション（各１０ｘ１５ｃｍの細胞培養皿）を調製した。ベクター（２×１５ｃｍ細胞培養皿／日）を１日間隔で５日間収集し、－８０℃でベクターを凍結することによって、５日間期間の終了まで時点を保持した。次に、上述のように粗ベクター力価およびインビトロ導入効率を評価した。予想通り、組み立てられたＤＮＡｓｅＩ耐性ゲノムコピーの数は、経時的に増加した（図９Ａ）。その後、親和性精製による初期（１日目および２日目）および後期（５日目）の時点について粗ベクターを迅速に処理し、ｈｕｈ７細胞のインビトロ形質導入効率を測定した。ベクターの相対的な形質導入効率は、経時的に徐々に低下した（図９Ｂ）。標的細胞に追加したＧＣあたりの導入遺伝子発現に関して、５日目のベクターは、１日目の物質のわずか４０％であった。この活性低下は、粗物質についても観察され、精製前の分子組成物の変化を示した（図）。５日間にわたるＡＡＶ９の活性損失の同様の傾向を観察し、ベクターの効力が約４０％減少した（図１１Ｉ～図１１Ｋ）。

次に質量分析による時間経過試料の脱アミド化を測定した。ＮＧ部位脱アミド化は、各間隔にわたって実質的に進行し、１日目で平均２５％の脱アミド化、および５日目までに６０％を超える部位が変換された（図９Ｃ）。非ＮＧ部位脱アミド化は、概して５日間にわたって進行したが、２日目から５日目にかけてはるかに低いレベルであり、一貫性が低かった（図９Ｄ）。データは、内因性ベクター脱アミド化を特定の活性における早期時点減衰と相関させ、産生サイクルを短縮するか、またはアスパラギンを安定させるカプシド変異を見出すことよって、より活性なベクターを捕捉する潜在的な機会を強調する。

図２Ａ～図２Ｅの質量分析に使用される材料は、精製のためにさらに２日かかるため、トランスフェクション後少なくとも７日であったことに留意されたい。これらの試料中の
より高いＮＧ部位脱アミド化（８０％を超える）は、脱アミド化が、発現期間の後、ならびに回収および精製プロセス中に、ほぼ同じ速度で、ＮＧ部位が完全に脱アミド化されるか、またはベクター試料が凍結されるまで続く可能性が高いことを示す。したがって、脱アミド化は、主にベクターの年齢によって決定され、回収および精製プロセスと排他的であるか、またはそれによって引き起こされるプロセスではない。１日目の物質中のはるかに低い脱アミド化値は、５日目の物質（両方とも親和性精製した）と比較して、この点を強調する。

ＮＧアスパラギンの安定化は、ベクター性能を向上させることができる
ベクターＮＧ脱アミド化および形質導入効率損失の相関関係を考慮して、ＮＧアミドを＋１部位変異誘発によって安定化させることがベクター機能を向上させる可能性があることを推論した。各＋１残基をアラニンまたはセリンに個別に変換したＡＡＶ８ ＮＧ部位変異体について、小規模でベクターを産生した。単一＋１変異体は、ベクター組み立て（図１０Ａ）および形質導入効率（図１０Ｂ）の観点で良好に耐性を有した。カプシド表面上の以前に定義された「デッドゾーン」の近くに位置するＧ３８６置換（Ａｙｄｅｍｉｒ
Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｊｕｌｙ ２０１６；９０（１６）：７１９６－２０４）は、インビトロ形質導入について欠陥があった。Ｇ３８６変異体についての機能の損失は、Ｎ３８５での脱アミド化アスパラギンの選択を示し得る。あるいは、＋１位置における追加の側鎖バルクは、アミド基安定化から独立して、機能に悪影響を及ぼし得る。単一部位の変異体は、隣接するアスパラギンの劇的な安定化にもかかわらず、インビトロ形質導入を著しく改善しなかった（表２）。インビトロおよびインビボ導入活性が一致しない可能性があるため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの肝臓の形質導入について、単一部位＋１変異体のサブセットを試験した。静脈内尾静脈注入（ｎ＝３～５）を実施し、２週間にわたって毎週イメージングすることによりルシフェラーゼ発現を調査した（図１０Ｃ）。インビボおよびインビトロ形質導入データは、各アッセイの関連する誤差（すなわち、誤差範囲内）と一致した。Ｇ３８６置換は、形質導入に欠損があったが、他の位置での＋１部位の変異は、ほぼ許容的であり、ｗｔＡＡＶ ８に等しいがそれを超えないレベルで肝臓に形質導入された。

任意の１つのＮＧ部位でアミドを安定化させることは、機能回復に必要であり得るが十分ではないため、次に、＋１部位のアラニン置換の組み合わせを有するベクターバリアントを評価した。＋１アラニンが高度に機能的であったすべての３つのＡＡＶ８ ＮＧ部位（Ｎ２６３、Ｎ５１４、およびＮ５４０）を組み換えた。トリプル変異Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａを含むいくつかの組み合わせは、組み立てが悪く、形質導入のために機能不全であった。しかしながら、Ｎ２６３（Ｇ２４６Ａ／Ｇ５１５ＡおよびＧ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ）を伴う両方の対的な組み合わせは、インビトロ導入効率（それぞれ、ｗｔＡＡＶ８に対して２．０および２．６倍）を向上させ、力価の損失はなかった（図１０Ｄ）。これらの変異は、少なくとも２つの変更（Ｎ－アミド安定化および＋１残基側鎖置換）をもたらすため、これらのデータは、ＮＧ脱アミド化を機能損失に結論的に結びつけない。しかしながら、データは、ＮＧ部位脱アミド化がインビトロ導入効率に影響を与えることができる時間経過研究で確立されたモデルと一致する。

機能性アスパラギン置換により、ベクター製造におけるロット間再現性が改善する
報告するベクター脱アミド化プロファイルの別の潜在的に問題となる態様は、いくつかの位置における脱アミド化の高いロット間可変性である。ｗｔＡＡＶ ８については、この可変性は、Ｎ４５９（観察した脱アミドは０％～３１％の範囲）およびＮ４９９（観察した脱アミドは０％～５３％の範囲）で最も顕著であった。翻訳後修飾における可変性は、典型的には、この可変性を示すクローンを完全に回避し、産生株および条件を慎重にモニタリングならびに制御するか、または影響を受ける候補のタンパク質工学によって、生物製剤の開発中に事実上回避される。

Ｎ４５９およびＮ４９９脱アミド化可変性に寄与する産生または処理因子を決定することができなかったため（図２Ｅ）、これらの位置で機能的アミノ酸置換を求めた。まず、各位置でグルタミンへの保存的置換のための小規模ベクター調製物を個別に評価した。Ｎ４５９ＱおよびＮ４９９Ｑの両方をベクターに効率的に組み込まれ、インビトロ形質導入効率のためのｗｔＡＡＶ８参照と同等であった（図７Ａ）。次に、変異体を大規模で産生し、質量分析を実施した。極めて希少なグルタミンデアミド化の観察と一致して、これらの変異体における４５９位または４９９位におけるグルタミンアミドの選択的かつ完全な安定化を観察した（データは示さず）。これらの変異ロットを上記のようにＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈注射後の肝臓形質導入についてインビボで評価した（図７Ｂおよび図７Ｃ）。この実験で対照として使用したｗＴＡＡＶ８ベクターロットは、Ｎ４９９で１６．８％脱アミド化したが、Ｎ４５９で脱アミド化は検出しなかった（データは示さず）。両方の変異体の１４日目の肝臓形質導入は、ｗｔＡＡＶ８に相当した。このデータは、製造されるＡＡＶベクターにおける脱アミド化に関連する分子可変性に対処するタンパク質工学的アプローチの可能性を示す。

Ｃ．考察
２Ｄゲル電気泳動、質量分析、新規タンパク質モデリング、ならびにインビトロおよびインビボの両方の機能研究によって、ＡＡＶ８カプシド上のアスパラギンおよびグルタミン残基の非酵素脱アミド化を独立して特定および評価した。脱アミド化は、多種多様なタンパク質で生じ、抗体系治療薬（Ｎｅｂｉｊａ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０１４；１５（４）：６３９９－４１１）およびペプチド系ワクチン（Ｖｅｒｍａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；２３（５）：３９６－４０２）を含む生物製剤の活性に有意な影響を与えることが示されている。ロタウイルスのＶＰ６タンパク質などの他のウイルスタンパク質は、質量分析によって脱アミド化事象を受けることが示されている（Ｅｍｓｌｉｅ ＫＲ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔ Ｉｎｔｅｇｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０００；１（１）：１２－２４）。

これらの脱アミド化がＡＡＶ８で発生した状況は、それらが自発的な非酵素的事象の結果であることを示唆した。アスパラギン残基は、グルタミン残基よりも広範囲に脱アミド化されていることが知られており、アスパラギンの下流のアミノ酸は、Ｎ＋１のグリシン（すなわち、ＮＧ）が最も効率的に脱アミド化されている脱アミド化の比率に実質的に影響を及ぼす。ＶＰ１中に存在するすべてのＮＧが７５％を超えるレベルで脱アミド化され、一方で脱アミド化は、カプシド中の他のアスパラギンまたはグルタミンのいずれにおいても一貫して２０％を超えていなかったという点で、ＡＡＶカプシドの脱アミド化におけるＮ＋１アミノ酸の役割の顕著な確認を観察した。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９カプシド（すなわち、７／９）中の実質的にすべてのＮＧモチーフは、高次構造の柔軟性および熱振動に関連するＨＶＲ領域に含まれるカプシドの表面にも存在していた。これは、適切なタンパク質機能のために柔軟性が必要とされ得る領域に位置する他のタンパク質のＮＧモチーフの以前の報告と一致しており、アルファヘリックスまたはベータシートなどの秩序だった構造ではない（Ｙａｎ ＢＸ ａｎｄ Ｓｕｎ ＹＱ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２（６）：３１９０－４）。表面に露出したＨＶＲのＮＧモチーフの選択は、溶媒露出度および立体構造の柔軟性を提供することによって脱アミド化の比率をさらに向上させ、それによってサクシニミジル中間体の形成を容易にする。予測通り、好ましくない環境は脱アミド化の比率をはるかに低くすることにつながる。

ＡＡＶの生物学およびそのベクターとしての使用に関する重要な疑問は、これらの脱アミド化の機能的結果である。アスパラギンをアスパラギン酸に変換するカプシドＤＮＡの変異は、特定の部位でのすべてのアミノ酸がアスパラギン酸として表されるカプシドの評価を可能にする。しかしながら、第２の部位変異の直接的結果によって混同される、Ｎ＋
１残基を潜在的に変異させる以外に、変異誘発を使用して脱アミド化を防ぐ容易な戦略は存在しない。アスパラギン残基が、変異誘発によってアスパラギン酸に変換される限られたバリアントを研究した。機能分析は、カプシド組み立てならびにインビトロおよびインビボ形質導入を含む。ベクター機能に対する変異誘発の最も実質的な影響は、ベースラインで不完全に脱アミド化され、表面が露出されていないアスパラギンを含むものであった。しかしながら驚くことに、５１４での高度脱アミド化アスパラギンのアスパラギン酸への変異誘発は、機能に何らかの影響を及ぼした。この結果は、対応するアミドの残量の存在が機能に影響を及ぼし得ることを示唆する。これは、脱アミド後にこの残基をアスパラギン酸に変換する際に失われる別の３倍関連ＶＰ３モノマー（ｗｔＡＡＶ８結晶構造において特定される）のＮ５１４とＤ５３１との間の水素結合相互作用の存在に部分的に起因し得る。

これらの脱アミド化が新規治療薬の開発に及ぼす影響を評価する際に、ＡＡＶベクターにおける脱アミド化の程度に影響を及ぼす因子をよりよく理解することが重要である。脱アミド化動態を著しく加速させることが知られている極端な条件下でのベクターのインキュベートは、ほとんど効果がなかった。同位体組み込み研究と併せて、この結果は、脱アミド化がカプシド組み立て中に生じ、ベクター処理または質量分析の人工産物ではないことを示唆する。ＮＧ部位における脱アミド化は、評価したすべての試料において反応が事実上完了したため、ベクター性能に実質的な影響を及ぼす可能性は低い。しかしながら、最初の機能研究は、非脱アミド化アスパラギンの残存量が機能に寄与することができることを示唆している。脱アミド化の完全性が低かった部位について懸念されるが、ほとんどの場合、試料間の変動にも関連していた。一例は、１７％の平均値を伴う０％～５３％の範囲の脱アミド化を示した４９９位でのアスパラギンである。ベクター産生の条件の微妙な差が、この異質性に寄与する可能性がある。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９における脱アミド化の顕著な類似性は、これがこのウイルスファミリー全体の性質であることを示唆している。

要約すると、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９カプシドタンパク質の一次アミノ酸構造において実質的な異種性を発見した。これらの研究は、いくつかの方法でベクターとしてのＡＡＶの開発に潜在的に影響を及ぼす。第１に、ＶＰタンパク質の実際のアミノ酸配列は、対応するＤＮＡ配列によって予測されるものではない。第２に、産生方法の態様は、脱アミド化の変形およびベクター機能の対応する変化につながり得る。非ＮＧ部位での脱アミド化比率に影響を及ぼす要因を把握し、その機能的結果をよりよく理解するまで、臨床グレードのＡＡＶベクターの特性評価に脱アミド化を含める必要があり得る。２Ｄゲル電気泳動は、正味の脱アミド化の全体的な評価を提供できるが、特定の残基での脱アミド化を評価するには質量分析が必要であろう。

実施例２：脱アミド化ＡＡＶ８トリプル変異（クレードＥ）
ＡＡＶ８トリプル変異カプシドを使用して、ｒＡＡＶベクターを生成した。このカプシドのＶＰ１タンパク質の予測されるアミノ酸配列は、本明細書の配列番号９に提供され、カプシドをコードする核酸配列は、配列番号８に提供される。また、ＷＯ２０１７／１８０８５４として公開されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／２７３９２も参照されたい。

ＡＡＶ８トリプル変異ベクターを、ＡＡＶ８について実施例１に記載されるように脱アミド化について評価した。高度脱アミド化残基は、Ｎ５７、Ｎ３８４、Ｎ４９８、Ｎ５１３、Ｎ５３９で見られる。１０％～４０％の脱アミド化を、Ｎ９４、Ｎ２５４、Ｎ２５５
Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ５１６で観察した。

実施例３：さらなる脱アミド化研究
例示的なベクターを、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９について実施例１に記載されるように脱アミド化について評価した。ＡＡＶ１はクレードＡに属し、ＡＡＶ７はクレードＤに属し、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶｒｈ３２／３３、およびＡＡＶ４はクレードＡ～Ｆのいずれにも属しない。

Ａ．ＡＡＶ１脱アミド化
ＡＡＶ１ベクターを、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９について実施例１に記載されるように脱アミド化について評価した。結果は、ベクターが、配列番号１に再現されるＡＡＶ１ ＶＰ１の一次配列の番号付けに基づいて、高度に脱アミド化された４つのアミノ酸（Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２、およびＮ７１８）を含むことを示す。

Ｂ．ＡＡＶ３Ｂ脱アミド化
ＡＡＶ３Ｂベクターを、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９について実施例１に記載されるように脱アミド化について評価した。ＡＡＶ３Ｂの番号付けを参照して、４個のアスパラギン残基、Ｎ５７、Ｎ３８２、Ｎ５１２、およびＮ７１８で高レベルの脱アミド化を観察した。これらの番号は、配列番号２に再現されるＡＡＶ３Ｂ ＶＰ１に基づく。

Ｃ．ＡＶＶ５脱アミド化
ＡＡＶ５ベクターを、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９について実施例１に記載されるように脱アミド化について評価した。高レベルの脱アミド化を、残基Ｎ５６、Ｎ３４７、Ｎ３４７、およびＮ５０９で観察した。約１％～約３５％の脱アミドを、Ｎ３４位、Ｎ１１２位、Ｎ２１３位、Ｎ２４３位、Ｎ２９２位、Ｎ３２５位、Ｎ４００位、Ｑ４２１位、Ｎ４４２位、Ｎ４５９位、およびＮ６９１位で観察した。これらの番号は、配列番号３に再現されるＡＡＶ５ ＶＰ１に基づく。

Ｄ．ＡＡＶ７脱アミド化
ＡＡＶ７ベクターを、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９について実施例１に記載されるように脱アミド化について評価した。高レベルの脱アミド化を、Ｎ４１、Ｎ５７、Ｎ３８４、およびＮ５１４で観察した。１％～２５％の比率での脱アミド化を、Ｎ６６、Ｎ２２４、Ｎ２２８、Ｎ３０４、Ｎ４９９、Ｎ５１７、Ｎ７０５、およびＮ７３６で観察した。これらの番号は、配列番号４に再現されるＡＡＶ７ ＶＰ１に基づく。

Ｅ．ＡＡＶｒｈ３２．３３脱アミド化
ＡＡＶｒｈ３２．３３ベクターを、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９について実施例１に記載されるように脱アミド化について評価した。高レベルの脱アミド化を、Ｎ５７位、Ｎ２６４位、Ｎ２９２位、Ｎ３１８位で観察した。１～４５％の脱アミド化を、Ｎ１４位、Ｎ１１３位、Ｑ２１０位、Ｎ２４７位、Ｑ３１０位、Ｎ３８３位、Ｎ４００位、Ｎ４７０位、Ｎ５１０位、およびＮ７０１位で観察した。これらの番号は、配列番号５に再現されるｒｈ３２．３３ ＡＡＶ ＶＰ１に基づく。

Ｆ．ＡＡＶ４脱アミド化
ＡＡＶ４は、前述のように評価した。高レベルの脱アミド化を、５６位および２６４位で観察した。高レベルの脱アミド化を有する他の位置は、３１８位および５４６位を含み得る。

トリプシンおよびキモトリプシンの調製物を別々に報告した。しかしながら、特定の残基は、得られた配列およびペプチドに基づいてトリプシンまたはキモトリプシンによって失われる。両方の調整物で残基を観察した場合、脱アミド化は一貫しているため、平均を大きく離すべきでない。

実施例４：アデノ関連ウイルス９特異的中和エピトープをマッピングする
この研究では、このエピトープマッピングアプローチによってまだ評価されていないＡＡＶ９での中和エピトープを特定しようと試みた。重要なことに、ＡＡＶ９は現在、いくつかの心臓、筋骨格、および中枢神経系適応症（Ｂｉｓｈ ＬＴ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８；１９（１２）：１３５９－６８、Ｆｏｕｓｔ ＫＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００９；２７（１）：５９－６５、Ｋｏｒｎｅｇａｙ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０；１８（８）：１５０１－８）、特に脊髄性筋萎縮症（Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ 「Ｍｅｄ．」２０１７；３７７（１８）：１７１３－２２）のために、診療所で静脈内投与されている。ここでは、これまでに再構築した最も高分解能のＡＡＶ－Ａｂ複合体、すなわち、強力なＮＡｂ ＰＡＶ９．１との複合体におけるＡＡＶ９の４．２Å構造を報告する。血清型スワッピング、アラニン置換、および追加の点変異の使用を通じて、ＰＡＶ９．１のエピトープを検証し、得られた変異体がＰＡＶ９
．１結合および中和を著しく妨害する能力を実証した。しかしながら、様々な供給源からのポリクローナル試料のパネルに対して変異体を試験した際に、ＰＡＶ９．１の結合能力および中和能力の両方へのこの影響は顕著に低減したか、または観察しなかった。この結果は、いくつかの状況において、このエピトープがＡＡＶ形質導入の中和に役割を果たし得るが、ＡＡＶ形質導入の遮断に関与するＮＡｂのレパートリーを回避することができる新規カプシドを操作するために、より広い範囲の中和エピトープの標的変異が必要であろうことを示唆する。

Ａ．材料および方法
１．ハイブリドーマ生成
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＡＡＶ９ベクターの最大５回の免疫を受けた。脾臓細胞を収集して融合した。ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）は、同社の標準的なカスタムマウスモノクローナル抗体ハイブリドーマ開発プロトコルに従ってクローナル上清を生成した。３０個の上清を、ＥＬＩＳＡによるＡＡＶ９反応性について、およびＮＡｂアッセイによるＡＡＶ９を中和するそれらの能力についてスクリーニングした。３ｍｇ／ｍＬの濃度でスクリーニングした後、精製ＰＡＶ９．１ ｍＡｂを得た。

２．ＡＡＶカプシドＥＬＩＳＡ
コーニングポリスチレン高結合マイクロプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した１ｅ９ＧＣ／ウェルＡＡＶでコーティングし、４^ｏＣで一晩保持した。コーティング溶液を破棄した後、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間室温でプレートをブロックし、３００μＬＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、ハイブリドーマ上清、精製ｍＡｂ、血清、または血漿（ＰＢＳ中の０．７５％ＢＳＡで希釈した）を３７℃で１時間インキュベートし、３００μＬＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、３７℃で１時間、１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（ＰＢＳ中の０．７５％ＢＳＡで希釈した；カタログ番号３１４３０；Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、続いて３００μＬＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎの三重洗浄を使用して、マウス試料を検出した。次に、室温で１時間、１：１０，０００（ＰＢＳ中で希釈した）のヤギ抗ヒトＩｇＧビオチン－ＳＰ（カタログ番号１０９－０６５－０９８，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、続いて３００μＬＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎの三重洗浄、および室温で１時間、１：３０，０００（ＰＢＳ中で希釈した）のストレプトアビジン（カタログ番号０１６－０００－０８４，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）（続いて３００μＬＰＢＳ ＋ ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した）を使用して、ヒトおよび非ヒト霊長類の試料を検出した。テトラメチルベンジジンを用いたすべてのＥＬＩＳＡを開発した。

３．中和抗体アッセイ
いくつかの変更を加えて前述のようにＮＡｂアッセイを実行した（Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００９；１９９（３）：３８１－９０）。黒壁、透明底、ポリリジンコーティングプレートに１ｅ５細胞／ウェルの密度で播種したＨＥＫ２９３細胞を使用した（カタログ番号０８－７７４－２５６，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）。９０ ｗｔＡｄ５／細胞の多重感染を使用し、４ｅ１０ＧＣ／ｍＬのＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＬａｃＺベクターの作業溶液を利用して、２ｅ９ＧＣ／ウェルの最終濃度を達成した。製造元のプロトコルに従って、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で生物発光を測定した。任意の所与の試料について、未処理対照の存在下でのＷＴ．ＡＡＶ導入と比較して、試料の存在下でＡＡＶ導入が５０％を超えて低減した最後の希釈物としてＮＡｂ力価を定義した。上記のようにＨＥＫ２９３形質導入実験を行
ったが、中和血清を保留した。

４．Ｆａｂ生成およびＡＡＶ－Ｆａｂ複合化
ＰＡＶ９．１ Ｆａｂ（０．２１１ｍｇ／ｍＬ）を製造元の指示書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆａｂ調製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して生成した。次に、ＰＡＶ９．１ ＦａｂとＡＡＶ９ベクターを、室温で３０分間、６００ Ｆａｂ：１ ＡＡＶ９カプシド（または１０ Ｆａｂ：１潜在的結合部位）の比率で複合化した。

５．Ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製、データ取得、および複雑な再構築
試料調製：３μＬのＰＡＶ９．１－ＡＡＶ９複合体を、洗浄されたばかりのグロー放電した穴のあいたカーボングリッドに適用した。２２°Ｃ、相対湿度９５％のＷｈａｔｍａｎ＃１濾紙で３～４秒間ブロットした後、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（ＦＥＩ）を使用してグリッドを液体エタンスラッシュで急速に凍結した。次に、相対湿度９５％、２２^ｏＣのＷｈａｔｍａｎ濾紙で、３～４秒のブロットを１回適用した。凍結後、グリッドを液体窒素中に保管した。次に、Ｇａｔａｎ Ｋ２ Ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出カメラ（Ｇａｔａｎ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＵＳＡ）を搭載した２００ ｋＶで動作するＦＥＩ Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ電子顕微鏡にグリッドを移した。

データ取得：ＳｅｒｉａｌＥＭソフトウェアを使用してデータを取得した（Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ ＤＮ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１５２（１）：３６－５１）。画像を、２２，０００倍の公称倍率（０．９４４Åの較正画素サイズに対応する）、および１．０～２．０μｍの脱焦点範囲（Ｒｏｈｏｕ Ａ．ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１５；１９２（２）：２１６－２１）の２．２１電子／平方オングストローム／秒の用量率で捕捉した。露光ごとに、６０フレーム用量分割動画スタックを合計１２秒間超解像モードで記録した。ＩＭＯＤソフトウェアパッケージ内の「整列フレーム」プログラムを使用して、動画フレームを整列した（Ｋｒｅｍｅｒ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９６；１１６（１）：７１－６）。

データ収集および処理：各顕微鏡写真からすべての粒子画像を手動で抽出し、ＥＭＡＮ２スイートで利用可能なｅ２ｂｏｘｅｒプログラムを使用してそれらを処理した（Ｔａｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２００７；１５７（１）：３８－４６）。次に、ボックス粒子を凍結再構築のためにＡＵＴＯ３ＤＥＭプログラムに移し、１５０個の粒子画像に基づいて初期低解像度モデル（３０Å）をもたらした（Ｙａｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２００７；１５７（１）：７３－８２）。プログラムは無作為モデル生成手順を採用し、厳密な６０非結晶学的対称軸を適用した。この低解像度再構築モデルマップは、粒子起点を決定し、完全な方向付け、ＡＵＴＯ３ＤＥＭを使用したすべての画像のコントラスト転送機能を絞り込むのに有用であった。再構築したマップの品質を向上させるために、温度係数補正を適用し、グラフィックプログラムのＣｏｏｔおよびＣｈｉｍｅｒａでマップを視覚化した（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ＥＦ，ｅｔ ａｌ．Ｊ ＣｏｍｐｕｔＣｈｅｍ．２００４；２５（１３）：１６０５－１２、Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ Ｋ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００４；６０（Ｐｔ １２ Ｐｔ １）：２１２６－３２）。モデルのドッキングおよび解釈に温度係数１５０補正マップを使用した。合計３，０２２個のボックス粒子を１，１００枚の顕微鏡写真から抽出し、フーリエシェル相関が０．１５の４．２Å解像度の再構築マップを最終的に生成した。厳密な二十面体対称軸（Ｔ＝１）を適用しながら、ＶＩＰＥＲデータベースを使用してＡＡＶ９－６０ｍｅｒモデルを生成した（Ｃａｒｒｉｌｌｏ－Ｔｒｉｐｐ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００９；３７（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４３６－４
２）。キメラプログラムのＦＩＴ関数を使用して、ＡＡＶ９カプシドの６０ｍｅｒコピーを低温再構築電子密度マップにドッキングした。これにより、０．９の相関係数を産生した。精度を上げるために、ＣｏｏｔおよびＣｈｉｍｅｒａのドッキングモデルを視覚化して調整した。ＡＢｏｄｙＢｕｉｌｄｅｒを使用して抗体モデルを生成し、次いでドッキングし、Ｃｈｉｍｅｒａを使用して冷凍再構築密度に手動で調整した（Ｌｅｅｍ Ｊ，ｅｔ
ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１６；８（７）：１２５９－１２６８）。次に、モデルをＡＡＶ９および抗体結合領域の解釈のために視覚化した。ＣｈｉｍｅｒａおよびＰｙＭＯＬプログラムを使用して、すべての数値を作製した。ＲＩＶＥＭプログラムを使用して、ロードマップの二次元描写を作製した（ＤｅＬａｎｏ ＷＬ．ＰｙＭＯＬ：Ａｎ Ｏｐｅｎ－Ｓｏｕｒｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｔｏｏｌ．２００２；Ｖｏｌ．４０：８２－９２）。ＲＩＶＥＭプログラムを使用して、ロードマップの二次元描写を作製した（Ｘｉａｏ Ｃ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ ＭＧ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２００７．１５８（２）：１８２－７）。

６．ＡＡＶ９－ＰＡＶ９．１変異トランスプラスミド構築
ＡＡＶ９カプシド変異誘発には、社内トランスプラスミド構築物ｐＡＡＶ２／９（ＡＡＶ２ ｒｅｐ／ＡＡＶ９ ｃａｐ）を使用した。すべてのカプシド変異体は、製造元の指示に従って、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して構築した。

７．ベクター産生
前述したように、ＨＥＫ２９３細胞でのトリプルトランスフェクションとそれに続くイオジキサノール勾配精製により、ＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＬａｃＺ．ｂＧＨおよびＡＡＶ９変異ベクターを産生した（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。ペンシルバニア大学のベクターコアは、前述のようにｂＧＨ ｐｏｌｙＡに対して定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用してベクターを力価測定した（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。

８．ＰＡＶ９．１ ｍＡｂおよびポリクローナル血清／血漿のＥＣ５０の決定する。
上述のように、ＡＡＶ９．ＷＴまたはＡＡＶ９変異ベクターのいずれかを用いてカプシド捕捉ＥＬＩＳＡを実行した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０値を計算した。簡潔には、ＰＡＶ９．１ ｍＡｂ濃度をｍｇ／ｍＬで対数変換し、ｘ軸上にプロットした。マウス血漿中のＩｇＧ濃度を５ｍｇ／ｍＬ（Ｍｉｎｋ ＪＧ．Ｓｅｒｕｍ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｄｉｓｓ．Ｅｒａｓｍｕｓ ＭＣ．１９８０）、および非ヒト霊長類およびヒト血清中のＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍＬ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｑｕｉｎｔｅｌａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００８；１５１（１）：４２－５０）と定義した。血漿／血清濃度（μｇ／ｍＬ）を対数変換し、ｘ軸上にプロットした。各変異体で達成した最大吸光度を定義し、吸光度を１００％に正規化し、ｙ軸上にプロットした。次に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの「対数（アゴニスト）対正規化応答－可変勾配」関数を使用して、用量応答曲線（抗体結合）を生成した。最後に、ＰＡＶ９．１
ｍＡｂ、ポリクローナル血清、またはポリクローナル血漿についてＥＣ５０を計算した。

９．動物研究
動物プロトコルは、ペンシルベニア大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認され、その基準に従って実施した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）は、同じ導入遺伝子カセットを有する１ｅ１１ＧＣ／マウスＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＬａｃＺ．ｂＧＨまたは
ＡＡＶ９変異ベクターの尾静脈に静脈内注入を受けた。ベクターを受け取った１４日後に動物を犠牲にした。各動物の臓器を分割し、生体分布のためにドライアイス上で瞬間凍結するか、または最適な切断温度化合物に埋め込み、その後の切断のために凍結し、β－ｇａｌ活性のために染色した。

１０．生体分布分析
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して目的の組織からＤＮＡを抽出した。前述のように、ｂＧＨポリアデニル化シグナルに対するｑＰＣＲによってベクターＧＣの組織を分析した（Ｃｈｅｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１３；２４（４）：１５４－６０）。

１１．β－ｇａｌ活性化染色
凍結切片をＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで４℃で１０分間固定し、その後β－ｇａｌ活性について染色した。ＰＢＳで洗浄した後、切片をＰＢＳ（約ｐＨ７．３）中の２０ｍＭのフェロシアン化カリウム、２０ｍＭのフェリシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２中の１ｍｇ／ｍのＸ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）中でインキュベートし、組織を３７℃で一晩保持した。Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて切片を対比染色した後、エタノールおよびキシレンを使用して脱水し、続いてカバーガラスで覆った。

Ｂ．結果
１．ＮＡｂ ＰＡＶ９．１は、強力であり、かつＡＡＶ９に特異的である
最初に、エピトープマッピングのために新規で強力な抗ＡＡＶ９ ＮＡｂを特定することを目指した。複数の血清型に対する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＡＡＶ反応性について、およびＮＡｂアッセイによるＡＡＶ９中和について、３０個のハイブリドーマクローンからなるパネルをスクリーニングした。ＡＡＶ９に対する特異性のため、このパネルからモノクローナル抗体ＰＡＶ９．１を選択した（図１２Ａ）。ＰＡＶ９．１はＥＬＩＳＡによって無傷カプシドのみを認識し（図１２Ａ）、ウエスタンブロットによってＡＡＶを認識せず（データは示さず）、ＰＡＶ９．１がカプシド表面上の立体構造エピトープを識別することを示唆する。これは、スクリーニングに含まれるＡＡＶのパネルにさらに広く結合し、ウエスタンブロットによってＡＡＶも認識した残りのクローンとは対照的である（データは示さず）。ＮＡｂアッセイでは、精製ＰＡＶ９．１ ｍＡｂは１：１６３，８４０の有効なＮＡｂ力価を示し、この新規の抗ＡＡＶ９抗体がＡＡＶ９の強力な中和剤であることを示す。繰り返すが、これは、ＮＡｂアッセイによってスクリーニングした他のクローンと対照的であり、これらのいずれもＡＡＶ形質導入を中和することができなかった。

２．ＰＡＶ９．１と複合するＡＡＶ９の低温再構築
ＡＡＶ９とＰＡＶ９．１抗原結合断片（Ｆａｂ）との複合体化後、１，１００枚の画像を捕捉し、３，０２２個の粒子をボックス化し、ＡＵＴＯ３ＤＥＭを使用して４．２Åの複合体の再構築を生成した。ＨＶＲ ＩＶ、Ｖ、およびＶＩＩによって構成される３倍軸から伸びるＦａｂ密度を観察し、Ｆａｂ電子密度を垂直方向に中心に配置して３倍突起の内面を装飾した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。この領域は、主に電荷残基から構成され、３倍関連ＶＰモノマー間、ならびに受容体およびｍＡｂとの強い静電相互作用を促進する。単一のＦａｂ分子を結合させ、３つの突起のうちの２つにわたって各３倍軸で伸長させ、立体障害によるこれらの部位における追加のＦａｂ分子の結合を遮断した（図１３Ｃ）。３倍突起と接触するＰＡＶ９．１ Ｆａｂ相補決定領域（ＣＤＲ）の領域は、２．５シグマレベルの平均密度を有し、他のＡＡＶ－Ｆａｂ再構築のために報告した密度と同等で
ある。およそ０．８シグマレベルでＰＡＶ９．１ Ｆａｂ定常領域密度、またはＰＡＶ９．１ ＣＤＲの接触領域で観察した密度の約３分の１が３倍軸あたりの単一Ｆａｂ占有率に対応して、観察した。ＰＡＶ９．１ Ｆａｂ ＣＤＲは、残基４９６－ＮＮＮ－４９８（ＨＶＲ Ｖ）および５８８－ＱＡＱＡＱＴ－５９３（ＨＶＲ ＶＩＩＩ）と直接相互作用した（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）。ＰＡＶ９．１結合は、Ｇ４５５およびＱ４５６（ＨＶＲ ＩＶ）、Ｔ４９４、Ｑ４９５、ならびにＥ５００（ＨＶＲ Ｖ）、ならびにＮ５８３、Ｈ５８４、Ｓ５８６、およびＡ５８７（ＨＶＲ ＶＩＩＩ）をさらに排除し、ＰＡＶ９．１との静電相互作用には関与しないが、Ｆａｂ結合後のカプシドのこの領域に構造的安定性を提供し得る（表３）。重鎖のＣＤＲはＨＶＲ Ｖと相互作用したが、軽鎖のＣＤＲは同じＶＰ３モノマーのＨＶＲ ＶＩＩＩと相互作用した（図１３Ｃ）。

ＰＡＶ９．１フットプリント（図１３Ｄ、表３）に基づいて、エピトープ検証およびエスケープ変異設計に焦点を合わせた変異誘発のために、５残基の２セットを選択した：５８６－ＳＡＱＡＱ－５９０および４９４－ＴＱＮＮＮ－４９８。この部位が高程度の配列多様性を含むため、残基５８６－ＳＡＱＡＱ－５９０を選択した（図１２Ｂ）。選択したモチーフは、ＰＡＶ９．１と直接相互作用する再構築によって識別された残基、および排除と識別された残基を含み、結合残基と排除残基との間の接合部の調査を可能にする。これらの残基は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ８の中和エピトープにも関与しており、ＡＡＶ ９エピトープ残基を以前に公開されたもの（Ｔｓｅｎｇ ＹＳ ａｎｄ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：９）と比較できる。最後に、このモチーフはカプシドの構造的完全性に寄与する領域との相互作用がより限定されているため、ＨＶＲ ＶＩＩＩ変異誘発をこれら５つの残基に制限すると、カプシドがより大きな変異を許容する可能性が増加した。ＰＡＶ９．１はＡＡＶ９に特異的であるにもかかわらず、ＰＡＶ９．１と相互作用すると特定したＨＶＲ Ｖモチーフ４９６－ＮＮＮ－４９８は、血清型間で高度に保存された（図１２Ｂ）。しかしながら、未発表のファージディスプレイ検討（データは示さず）は、ＰＡＶ９．１のエピトープにおけるアスパラギンリッチモチーフの関与を示唆し、したがって、変異誘発のためにこのモチーフを選択した。また、残基４９４－ＴＱ－４９５を追加して、結合残基と排除残基との間の接合部を再度調査した（Ｔｓｅｎｇ ＹＳ ａｎｄ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：９）。

３．エピトープに基づく変異は、ＡＡＶ９－ＰＡＶ９．１結合を著しく低減する
最初に、部位特異的変異誘発を使用して５８６－ＳＡＱＡＱ－５９０血清型スワップ変異体を生成した。ＰＡＶ９．１がＡＡＶ９を特異的に認識し、この位置におけるアミノ酸配列および構造形状がＡＡＶ血清型間で大きく異なるという知識に基づいて、クレードＢ（ＡＡＶ２）、クレードＣ（ＡＡＶ３Ｂ）、およびクレードＤ／Ｅ（ＡＡＶ８／ｒｈ１０）からの代表的な血清型から対応する残基との完全なスワップを選択した（表４）。

その際、効率的なカプシド組み立ての可能性を最大限に引き出しながら、この場所での自然変動も最大限に引き出すことを期待した。ＡＡＶ９．ＡＡＱＡＡ（ＡＡＶ９．ＱＱＮＡＡより収束性が高い）およびＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥ（ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱより発散性が高い）の２つの追加変異体を生成して、（１）ＰＡＶ９．１の相互作用を妨害するために必要な最小変異、および（２）導入できる最大の妨害を決定する。ＡＡＶ９．ＡＡＱＡＡ、ＡＡＶ９．ＱＱＮＡＡ、およびＡＡＶ９．ＳＳＮＴＡ変異体は、ＡＡＶ９．ＷＴと同等な力価のベクターを産生したが、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱおよびＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥの力価は、ＡＡＶ９．ＷＴと比較して２～３倍低減した（データは示さず）。ＰＡＶ９．１
ｍＡｂの各変異カプシドとの結合を、捕捉ＥＬＩＳＡによってＡＡＶ９．ＷＴと比較して決定した（図１４Ａ）。各スワップ変異体のＰＡＶ９．１のＥＣ５０、または最大結合の半分に到達するために必要なＰＡＶ９．１ ｍＡｂの濃度は、ＡＡＶ９．ＷＴのＥＣ５０と比較して著しく増加した（カプシド結合の減少を示す）。この結果は、エピトープマッピング結果を検証し、残基５８６－ＳＡＱＡＱ－５９０がＡＡＶ９－ＰＡＶ９．１相互作用に関与していることを示す。ＥＣ５０の増加は、４５倍（ＡＡＶ９．ＡＡＱＡＡ）からほぼ３００倍（ＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥ）の範囲であり（表５）、ＥＣ５０の増加は、この位置でのＡＡＶ９からの配列分散の程度と直接的に相関する。１つの例外は、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱであり、これはＡＡＶ９とＱ５９０を共有し、配列分析によって予想されるよりも強力なＰＡＶ９．１結合に寄与する可能性がある。

ＡＡＶ９．ＡＡＱＡＡにおけるＳ５８６ＡおよびＱ５９０Ａ変異は、ＡＡＶ９のＰＡＶ９．１結合を破壊するのに十分だったため、次に、この破壊を引き起こすのに必要な最小限の変更を決定した。アラニン置換またはより保守的な置き換え（Ｓ－＞ＴまたはＱ－＞Ｎ）のいずれかによって、これらの位置の１つで点変異を導入した。Ｓ５８６でのアラニンまたはスレオニンへの変異はＰＡＶ９．１結合を有意に低減しなかったが、Ｑ５９０でのアラニンまたはアスパラギンへの単一変異はＰＡＶ９．１によるカプシド認識を破壊するのに十分であった（図１４Ｃ）。この結果は、５９０位がＡＡＶ９カプシドのＰＡＶ９．１認識に重要であることを示す。

次に、同じ変異誘発戦略を使用して、ＰＡＶ９．１エピトープに含まれるＨＶＲ Ｖの４９４－ＴＱＮＮＮ－４９８モチーフを調査し、進化的に保存されたアミノ酸またはアラニンのみへの残基セットを変異させた。４９６－ＮＮＮ－４９８が試験したすべての血清型にわたって保存されるため、この残基の伸長に対してアラニン置換のみを使用し、４９４－ＴＱ－４９５について、この部位で天然に存在する多様性を表すためにＡＡならびにＧＱおよびＴＤに変異した。ＡＡＶ９に対するＰＡＶ９．１の特異性およびこの位置における多様性にもかかわらず、ＡＡＶ９．ＧＱＮＮＮ、ＡＡＶ９．ＴＤＮＮＮ、およびＡＡＶ９．ＡＡＮＮＮは、ＡＡＶのＰＡＶ９．１のＥＣ５０を増加を増加しなかった（図１４Ｂ）。これは、４９４－ＴＱ－４９５部位がＰＡＶ９．１エピトープに関与しないという低温再構築マップの結論を裏付ける。しかしながら、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡ変異によりＰＡＶ９．１ ＥＣ５０が１５倍に増加し、これは、４９６－ＮＮＮ－４９８が保存されたモチーフであるにもかかわらず、ＰＡＶ９．１のＡＡＶ９特異的結合において重要な役割を果たすことを示す。最後に、ＨＶＲ Ｖおよび最小限のＨＶＲ ＶＩＩＩ変異（ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡ／ＳＡＱＡＮ、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡ／ＳＡＱＡＡ）から組み合わせ変異体を生成しまし、これらの組み合わせ変異体のＰＡＶ９．１ ＥＣ５０値は、ＰＡＶ９．１エピトープのモチーフの変化の影響が付加的であることを示す（図１４Ｂおよび図１４Ｅ）。

４．エピトープに基づく変異は、ＡＡＶ９形質導入を調節する
新規ＡＡＶ９変異体がＡＡＶ９．ＷＴの特性を維持しながらＮＡｂを回避する能力を評価するために、まずインビトロおよびインビボ導入を評価した。ＰＡＶ９．１結合の低減をもたらす変異の大部分はまた、ＨＥＫ２９３細胞における導入効率を低下させたが、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱを除き、ベクターの形質導入を２．３倍改善した（図１５ Ａ）。この改善は、ＡＡＶ２によるヘパリン認識に関与する２残基であるＲ５８６およびＲ５８９（ＡＡＶ２ ＶＰ１番号付けによるＲ５８５およびＲ５８８）の導入によるものであった可能性があり、これらのヘパリン結合モチーフが含まれる高い可能性、これらのヘパリン結合モチーフが含まれる高い可能性のため（Ｅｌｌｉｓ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ
Ｊ．２０１３；１０（１）：７４）、ほとんどの細胞株においてインビトロでＡＡＶ９よりも大幅に優れている。しかしながら、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱとＲ５８６およびＲ５８９を共有するＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥは、ＡＡＶ２のような形質導入効率を表示せず、他の要因の関与を示唆した。ＡＡＶ９．ＡＡＱＡＡは、形質導入効率の最大の低減を示し、Ｓ５８６および／またはＱ５９０がインビトロでＡＡＶ９形質導入に不可欠な残基であることを示す。

５．エピトープに基づく変異は、ＰＡＶ９．１中和を無効にする
次に、変異がＰＡＶ９．１の中和力価に及ぼす影響を調査した。ＰＡＶ９．１結合に影響を及ぼさない変異ＡＡＶ９．ＡＡＮＮＮは、中和力価に影響を及ぼさなかった（図１５Ｂおよび図１５Ｉ）。しかしながら、ＰＡＶ９．１ ＥＣ５０を増加させたすべての変異ベクターは、ＰＡＶ９．１の有効な中和力価を低下させた。ＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥは、ＥＣ５０をほぼ３００倍に劇的に増加させ、ＰＡＶ９．１のＮＡｂ力価を少なくとも２，０４８倍低減した（試験した最も低い希釈度である１：１６３，８４０～＜１：８０）（図１５Ｃ～図１５Ｋ）。ＡＡＶ９．ＳＡＱＡＮなどのＥＣ５０を適度に増加させた変異ベクターは、ＰＡＶ９．１の有効ＮＡｂ力価をより低い程度に低減した（図１５Ｌ）。全体的に、ＥＣ５０によって測定したＰＡＶ９．１結合の低下と、有効なＮＡｂ力価の低下との間の強い相関関係を観察した（図１６）。注目すべき例外は、再びＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱであり、これは、ＰＡＶ９．１結合を低減する第４の有効な変異であるにもかかわらず、ＮＡｂ力価の減少がわずか８倍であった（第２の低減）。

６．ＰＡＶ９．１エピトープはＡＡＶ９肝臓指向性に重要である
ＡＡＶ ９様遺伝子治療ベクターとしてのこれらの変異体の生存性を評価するために、ＰＡＶ９．１活性を低減したＡＡＶ９．ＷＴ．ＣＭＶ．ＬａｃＺの１ｅ１１ゲノムコピー（ＧＣ）／マウスまたはＡＡＶ９変異ベクター（群あたりｎ＝３）をＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注入した。１４日目の組織試料の生体分布は、すべて変異体についての肝臓形質導入の減少を示した。ＡＡＶ９．ＱＱＮＡＡは、ＧＣ／μｇ ＤＮＡが１７倍減少したＡＡＶ９．ＷＴと最も類似して機能したが、ＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥは、ＧＣ／μｇ ＤＮＡが１，１１０倍減少して肝臓に最も低い効率で形質導入された（図１７Ａ）。しかしながら、心臓および脳などの他の臓器では、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱおよびＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥのＡＡＶ２様変異体を除いて、変異体の大部分は、ＡＡＶ９．ＷＴレベルの形質導入の近くに維持された。組織ＧＣにおけるこれらの違いは統計的に有意ではなかったが、観察した傾向は、これらの残基がＡＡＶ９肝臓指向性にとって重要であるが、大部分の変異体が「肝臓を標的としない」表現型を示したため、他の組織の形質導入においてあまり役割を果たさないことを示唆する。これらの結果は、肝臓および心臓におけるベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）の発現にさらに反映され、肝臓β－ｇａｌ活性は、ＡＡＶ９．ＷＴを受ける動物において最も高く、一方で、心臓β－ｇａｌ活性は、ＡＡＶ９．ＷＴおよび大部分の変異体（ＡＡＶ２様変異体を除く）と同様であった（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）。

ＡＡＶ９変異ベクターの代表的なサブセットについて、これらの実験を１０倍高い用量（１ｅ１２ ＧＣ／マウス）で繰り返した。この用量では形質導入の差は有意性に達しな
かったが、組織指向性の傾向は、特に心臓および筋肉試料について、より低い用量で観察された傾向と一致した（図１７Ｄ）。繰り返すが、これらの結果は、肝臓、心臓、および筋肉の組織切片におけるβ－ｇａｌ活性に反映された（図１７Ｅ～図１７Ｇ）。

７．ＡＡＶ９におけるエピトープに基づく変異は、ポリクローナル血漿または血清による結合または中和に有意に影響しない
次に、ＰＡＶ９．１エピトープに基づく変異ベクターが、ポリクローナル血漿または血清による結合および中和を回避する能力を評価した。最初に、以前のＡＡＶ９．ＷＴ（７．５ｅ８または７．５ｅ９ ＧＣ／マウス、群あたりｎ＝６）を静脈内注入したＣ５７ＢＬ／６マウスからの血漿を利用した。最大結合の半分に到達するために必要な血漿の希釈を決定した。低用量マウスからの変異ベクターとの血漿の結合は、ＡＡＶ９．ＷＴとの結合とほぼ区別できなかった（図１８Ａ～図１８Ｃ）。対照的に、ＡＡＶ９．ＷＴのＥＣ５０に対して、変異体のサブセット、特にＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱのサブセットについて、高用量マウスからの血漿のＥＣ５０に有意な差があることを観察した（図１８Ｂ～図１８Ｄ）。ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱの高用量マウス血漿のＥＣ５０が平均２倍増加したにもかかわらず、この変異では血漿の有効なＮＡｂ力価の低下を観察しなかった（データは示さず）。

ＥＣ５０増加におけるこの傾向が非ヒト霊長類の試料に当てはまるかを決定するために、ＡＡＶ９ベクターまたは同じＶＰ３配列（非構造的ＶＰ１領域内の２アミノ酸の差異）を有するＡＡＶ９と密接に関連する新規ベクターを受け取った６匹のマカクのパネルから血清を得た。投与前に、マカクが１：５を超える（ＮＡｂ陰性と定義した）ＡＡＶ９に対するＮＡｂ抗体価を有したことを確認した。ＡＡＶ９．ＷＴのＥＣ５０と比較した場合、変異ベクターについて各動物の血清のＥＣ５０のいくつかの変動を観察したが、変異同一性に基づいて結合の増加または減少の明確な傾向は現れなかった（図１９Ａおよび図１９Ｃ）。ＡＡＶ９に対して既存のＮＡｂ力価を有するマカクからの血清を試験する場合（以前のＡＡＶ感染に起因する）、ＡＡＶ９変異体のパネルについて、血清のＥＣ５０にほとんど変化がないことを観察した（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。これは、注入した血清のＥＣ５０で見られる変動とは全く対照的であり、ＡＡＶ感染およびＡＡＶベクター投与に応答して生成された血清の関連する抗ＡＡＶエピトープレパートリー間の基本的な違いを示唆する。加えて、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱの注入した非ヒト霊長類血清のＥＣ５０の増加は、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱの血清の有効なＮＡｂ力価を減少させなかった（データは示さず）。

最後に、ＡＡＶ９．ＷＴおよび変異ベクターとの結合について、４人の正常なヒトドナーからのＮＡｂ陽性血清試料を評価した。未注入のＮＡｂ陽性の非ヒト霊長類血清試料の場合と同様に、４人のＮＡｂ陽性正常ヒトドナー試料はすべて、ＡＡＶ９変異およびＷＴベクターのＥＣ５０の変動が最小であることを示した（図２０Ａ～図２０Ｂ）。予想通り、変異ベクターのＥＣ５０の変化の欠如から、ＡＡＶ９変異ベクターに対する血清のＮＡｂ力価の低減の欠如が判明した（データは示さず）。

Ｃ．考察
ここで、非常に強力で特定のｍＡｂ ＰＡＶ９．１と複合したＡＡＶ９の低温再構築を報告する。ＰＡＶ９．１について決定したエピトープは、マウスハイブリドーマから単離した他のＡＡＶ ＮＡｂ、すなわちＡＤＫ８（ＡＡＶ８；５８６－ＬＱＱＱＮＴ－５９１）、Ｅ４Ｅ（ＡＡＶ１；４９２－ＴＫＴＤＮＮＮ－４９８）、５Ｈ７（ＡＡＶ１；４９６－ＮＮＮＳ－４９９、５８８－ＳＴＤＰＡＴＧＤ－５９５）、およびＣ３７（ＡＡＶ２；４９２－ＳＡＤＮＮＮＳ－４９８、５８５－ＲＧＮＲＱ－５８９）のエピトープ領域とほとんど重複する（Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２；８６（１５）：７７３９－５１、Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３；８
７（１６）：９１１１－２４、Ｔｓｅｎｇ ＹＳ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１５；８９（３）：１７９４－１８０８）。したがって、ＨＶＲ ＶおよびＶＩＩＩにおける血清型間の配列および構造変動の程度が大きいにもかかわらず、この所見は、３倍突起が、他の血清型のようにＡＡＶ９中和の有意な部位であり得ることを示唆する。したがって、他のＡＡＶカプシドに対して指向されるＮＡｂのレパートリーに関する以前の所見は、ＡＡＶ９に適用可能であり得る。様々なマッピングした中和エピトープは重複を示すが、ＮＡｂの結合角度および配向は著しく異なる。ＡＡＶ９と結合すると、ＰＡＶ９．１は３倍軸の対称の中心に伸び、占有率を２０ Ｆａｂ粒子に立体的に制限し、対照的に、他の血清型に対して上昇したｍＡｂは、３倍軸の上または外向きに結合し、より高い占有率を可能にする。研究は、ＡＡＶ２（Ｃ３７Ｂと複合、１１Å）、ＡＡＶ８（ＡＤＫ８と複合、１８．７Å）、およびＡＡＶ１（５Ｈ７と複合、２３Å）を含む血清型にわたって共有抗原領域としてＨＶＲ ＶおよびＶＩＩＩの両方を特定しており、ＡＡＶ９のＰＡＶ９．１の結合フットプリントと最も類似する（Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２；８６（１５）：７７３９－５１、Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３；８７（１６）：９１１１－２４、Ｔｓｅｎｇ ＹＳ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１５；８９（３）：１７９４－１８０８）。したがって、ここで報告した構造は、他のＡＡＶ血清型について以前に報告した、より低い分解能の構造と類似する。

ＨＶＲ ＶＩＩＩ血清型スワップは、それらの対応する変異ベクターに異なる程度の結合および中和回避を付与した。この領域を、ＷＴ．ＡＡＶ９配列から最も異なる変異であるＡＡＶ２に基づくＲＧＨＲＥモチーフとスワッピングして、試験したすべての希釈でＰＡＶ９．１中和が消失した。したがって、カプシド中の５つのアミノ酸のみを操作することで、モノクローナルＮａｂを回避することができる。実際に、ＰＡＶ９．１活性を著しく低減するために必要な最小限の変更は、単一アミノ酸置換であり、保存されたアミノ酸でさえ、結合および中和の両方の消失につながった。ＨＶＲ ＶにおけるＮＮＮモチーフの変異は、血清型間で高い保存性を有するにもかかわらず、ＰＡＶ９．１がＡＡＶ９と結合して中和する能力を低下させ、ＰＡＶ９．１エピトープの不可欠な部分でもあることを示す。

所与のＡＡＶ９変異とのＰＡＶ９．１の結合の低下と、その変異のインビトロでの形質導入を遮断する能力との間の強い相関関係を観察し、ＡＡＶに対するＮＡｂの相対強度が、ＮＡｂの中和能力と相関することを示唆した。しかしながら、いくつかの個体がＡＡＶに対して中程度の結合力価を有するが、ＮＡｂ陰性であるため、当研究所および他の個体からのデータは、ＡＡＶに対する結合抗体力価が必ずしも個体のＮＡｂ力価の良好な予測因子ではないことを示唆する（Ｆａｌｅｓｅ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１７；２４（１２）：７６８－７８、Ｈｕｔｔｎｅｒ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３；１０（２６）：２１３９－４７）（未公開データ）。これらの所見にもかかわらず、いくつかの臨床試験の除外基準には、ＮＡｂ力価のみならず、結合力価も含まれる（Ｇｅｏｒｇｅ ＬＡ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（Ｓｕｐｐｌ １）：６０４、Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ 「Ｍｅｄ．」２０１７；３７７（１８）：１７１３－２２）。したがって、エピトープマッピング研究は、結合エピトープの特徴を特定し、それらが中和エピトープといずれかの共通点を共有するかどうかを決定するために重要である。共有モチーフは、特定の残基との相互作用ではなく、結合の強度がＡＡＶ中和において大きな役割を果たすことを示唆し、したがって、研究者が単にＮＡｂの結合を低減することに焦点を当てることを可能にする。しかしながら、異なるモチーフは、中和は結合の強度ではなく結合位置の機能であることを示唆し、研究者はこれらの固有領域へのＮＡｂ結合の除去に焦点を当てるべきであることを示唆するであろう。

ＡＡＶ９ベクターにおける変異は、精製モノクローナルＰＡＶ９．１抗体による結合および中和を著しく低減したが、これらの変異は、以前にＡＡＶに曝露したマウス、マカク、またはヒトドナーの血清または血漿由来のポリクローナル抗体による結合または中和を著しく回避しなかった。最も顕著に、より高い静脈内用量のＡＡＶ９ベクターを受けたマウスからの血漿は、ＷＴ．ＡＡＶ９ベクターよりも約２倍低い効率でＲＧＮＲＱ変異体と結合せず、この変更は、ＰＡＶ９．１ ｍＡｂで観察した５０倍低減よりもはるかに穏やかであった。ＱＱＮＡＡ、ＳＳＮＴＡ、およびＲＧＨＲＥの変異は、ＲＧＮＲＱの変異よりもＰＡＶ９．１の結合および中和に大きな影響を及ぼしたが、ポリクローナル血漿は、ＷＴ．ＡＡＶ９と同じ方法でこれらの変異体と結合した。この結果は、５８６－ＳＡＱＡＱ－５９０モチーフが強力な中和エピトープであり、この領域における変異がＰＡＶ９．１活性を遮断することができるが、ｍＡｂに対するインビトロ活性は、ポリクローナル抗体に対する活性を予測しないことを示唆する。おそらく驚くべきことに、ＲＧＮＲＱ変異は、３倍突起を使用することによって、ＡＡＶ９抗体の結合を効率的に遮断した。この結果は、すべての変異がポリクローナル応答に対して同じように機能するわけではなく、抗体のより大きなレパートリーがこの領域を結合に利用することを明確に示す。

ポリクローナル結合の低減にもかかわらず、ＲＧＮＲＱ変異ベクターは、ベクター投与に応答してこれらのマウスによって生成されたポリクローナルＮＡｂ応答を回避しなかった。予想通り、ポリクローナル血漿との結合を低減しなかった変異体も中和を回避しなかった。ＷＴ．ＡＡＶ９と比較してＲＧＮＲＱに対するＰＡＶ９．１のＥＣ５０の１００倍近くの増加が、ＰＡＶ９．１中和力価の８倍の減少のみをもたらしたことを考慮すると、ＲＧＮＲＱに対するポリクローナル血漿のＥＣ５０の２倍の増加が、中和力価を低減しなかったことは不思議ではなかった。研究は、マッピングしたＡＡＶエピトープの大部分が３倍軸上にあり、ほとんどの血清型特異的ＮＡｂについてＨＶＲ ＶＩＩＩがマッピングしたエピトープに関与していることを示すが、この領域で試験された変異のうちのいずれもポリクローナル活性に劇的に影響を及ぼさないことに驚いた（マッピングしたエピトープの総数が少なく、いくつかの研究の正確なスクリーニングおよび選択方法が不明であるため、マッピングしたエピトープが完全なレパートリーを表現しない場合があることに留意されたい）。

Ｔｓｅおよび同僚は最近、ライブラリアプローチを使用して、ＡＡＶ１に対して特定した３つの異なるＮＡｂのエピトープを組み合わせ、親ＡＡＶ１から２０を超えるアミノ酸の変更を伴う、新規ＡＡＶ１に基づくカプシドを生成した。このカプシドは、抗ＡＡＶ１モノクローナルＮＡｂだけでなく、ＡＡＶに曝露した正常なヒトドナーからのポリクローナル試料に加えて、ＡＡＶベクター注入マウスおよび非ヒト霊長類からのポリクローナル試料も回避することができる（Ｔｓｅ ＬＶ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１７；１１４（２４），Ｅ４８１２－２１）。これは、ベクター曝露およびウイルス感染の後に中和エピトープが重複する可能性があることを示唆しているが、このレパートリーはわずかに多様である。換言すれば、ＡＡＶとの結合および中和回避を付与するために修飾を必要とする残基の総数は、以前に考えられたより広範囲である。両方のシナリオに対処できる新規カプシドを操作するには、組み合わせおよびハイスループッのアプローチが必要であり得る。

この研究は、以前のＡＡＶ感染から既存のＮＡｂ応答を回避するように操作したベクターが、再投与環境でも機能するかを調査した。ＰＡＶ９．１に基づくＡＡＶ９変異ベクターが最小限の回避を示したポリクローナル試料は、以前にＡＡＶに感染していた供給源からではなく、ＡＡＶベクターを受け取った供給源から取得した。注入した試料がＡＡＶ９変異体のパネルに対して適度に変化する結合曲線を示したのに対し、ベクター未処理であるがウイルスに曝露した供給源によって生成した結合曲線は、ＷＴ．ＡＡＶ９の曲線と類似していた。これらの相違は、ベクター投与または感染に応答して生成されるＡＡＶ抗体
レパートリー間の根本的な違いを強調する。

歴史的に、ＡＡＶベクターを注入した未処理対象は、投与されるベクターに特異的な、または密接に関連する血清型に限定されるＮＡｂ応答を生成する（Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１；２２（１０）：１２３９－４７）（未公開データ）。ほとんどのマカク研究および遺伝子療法臨床治験は、同様の結果が示されている（Ｇｒｅｉｇ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１６；３４（５０）：６３２３－２９、Ｇｒｅｉｇ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７；２８（１）：３９－５０）（未公開データ）。全く対照的に、１つのＡ ＡＶ血清型について既存の抗体を有する対象は、遠隔に関連するものであっても、ほぼ常に他の血清型の大部分に対して血清型陽性であり、かつＮＡｂを有する（Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ
Ｄｅｖ ．２０１６；２７（２）：７９－８２、Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１；２２（１０）：１２３９－４７、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１６；２７（５）：３４５－５３）（未公開データ）。これまで、すべての新規にマッピングしたＡＡＶ ｍＡｂは、個々の血清型に特異的であり、密接に関連する血清型とのみ交差反応し（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６の両方と結合する５Ｈ７）、以前に単離した中和ＡＡＶ ｍＡｂは、ＡＡＶ感染後に一般的に見られる広範な応答を再現しない（Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３；８７（１６）：９１１１－２４）。したがって、既存の免疫に関連する広範な中和エピトープを含むモチーフを特定し、エピトープが血清型特異的エピトープと重複するかを決定し、重複するモチーフがどのように広範に中和する表現型をＮＡｂに付与するかを評価するには、さらなる研究が必要である。

曝露方法によって、ＮＡｂ応答の大きさは広く異なり、自然免疫を有する個体は、１：８０（ヒト）または１：３２０（マカク）を超えるＮＡｂ力価を有することは稀であり、対照的に、１：１０００を超えるＮＡｂ力価は、適度な用量のベクターの送達に応答して容易に達成され得る（Ｇｒｅｉｇ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１６；３４（５０）：６３２３－２９、Ｇｒｅｉｇ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７；２８（１）：３９－５０、Ｇｒｅｉｇ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４；９（１１）：ｅ１１２２６８）。この研究では、最高のＮＡｂ力価をもたらす最高のベクター用量を受けたマウスは、変異ベクター結合において測定可能な変動を有し、これは、ＮＡｂ応答の強度が変異効率に影響を与えることを示唆している。多くの場合、研究は、遺伝子導入を妨げる閾値を下回るように個体のＮＡｂ力価を低減させることを目指す（静脈内投与については１：１０）（Ｃｈｉｃｏｉｎｅ
ＬＧ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４；２２（２）：３３８－４７、Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１；２２（１１）：１３８９－１４０１）。高力価血清のみに回避を付与する単一中和エピトープに基づいて操作した変異型カプシドは、より低い力価が、形質導入が顕著に阻害される閾値を依然として上回っているため、ＡＡＶ遺伝子治療を受ける対象となる個体の数を有意に増加させることはない。

ＨＶＲ ＶＩＩＩにおけるＱ５９０でのＰＡＶ９．１結合を低減するために必要な最小変異は、アスパラギンへの保存的アミノ酸置換後であっても、得られた変異体に肝臓脱標的表現型を付与した。エピトープのＨＶＲ Ｖ部分における変異はまた、肝臓導入を低減した。これらの結果は、ＨＶＲ ＶおよびＶＩＩＩ中のこれらの残基が肝臓形質導入における不可欠な役割を果たすという以前の観察、ならびに遺伝子導入に不可欠な領域との重複を示すマッピング中和ＡＡＶエピトープの以前の報告と一致する（Ａｄａｃｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１４；５：３０７５、Ｔｓｅｎｇ ＴＳ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１５；８９（３）：１７９４－８
０８）。これは、親導入プロファイルを維持しながらＮＡｂを回避することができる変異体を操作することが困難であることを示唆する。肝臓形質導入がそれほど重要ではない可能性がある心臓および筋肉のいくつかの適応症では、この指向性の変化が許容され得る。特に、変異体の大部分は、末梢臓器におけるＷＴ．ＡＡＶ９レベルの形質導入を両方の用量で維持した。

ＲＧＮＲＱ変異は、ポリクローナル抗体の存在下で適度な結合修飾を示したが、ＡＡＶ２様形質導入プロファイルを示し、肝臓だけでなく、すべての末梢臓器の形質導入が不十分であった。まとめると、これらのデータは、マッピングした中和エピトープに関する知識をＡＡＶ機能ドメインに関する利用可能な情報と統合することの重要性を示している。ＮＡｂを回避することができるカプシドを生成することは、カプシドが依然として標的組織導入の主要な機能を果たすことができる場合にのみ有用であるため、十分ではない。最近の研究は、この戦略を使用して、ＡＡＶ１の複数のエピトープを組み込み、ＡＡＶ１様形質導入プロファイルを維持しながらＮＡｂを回避することができるＡＡＶ１に基づくベクターを生成する（Ｔｓｅ ＬＶ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ．２０１７；１１４（２４），Ｅ４８１２－２１）。

まとめると、本研究は、体液性免疫応答を回避することができるＡＡＶ９に基づくベクターの設計に関する重要な情報を提供する。次世代カプシドの設計を通知し、ＡＡＶ９ベクターに対するＮＡｂ応答の複雑さをさらに理解するために今後の研究が必要とされる。

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本明細書に引用される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年８月２４日に両方とも出願された米国仮特許出願第６２／７２２，３８８号および同号第６２／７２２，３８２号、２０１８年７月２６日に両方とも出願された米国仮特許出願第６２／７０３，６７０号および同号第６２／７０３，６７３号、２０１８年５月２９日に両方とも出願された米国仮特許出願第６２／６７７，４７１号および同号第６２／６７７，４７４号、２０１８年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６６７，５８５号、ならびに２０１８年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６３５，９６４号が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年５月７日に出願された米国仮特許出願第６３／６６７，８８１号、２０１８年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／６６７，８８８号、２０１８年５月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６６７，５８７号、２０１８年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６６３，７９７号、２０１８年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６６３，７８８号、２０１８年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６３５，９６８号が参照により組み込まれる。本明細書に参照され、添付の配列表に表示される配列番号は、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

図１Ａ～図１Ｇは、ＡＡＶ８ ＶＰアイソフォームの電気泳動分析。（図１Ａ）図は、アスパラギン残基が隣接する窒素原子によって求核攻撃を受け、スクシニミジル中間体を形成するメカニズムを示す。次いで、この中間体は加水分解を受け、アスパラギン酸およびイソアスパラギン酸の混合物に分解する。ベータ炭素は、このように標識される。図は、ＢＩＯＶＩＡ Ｄｒａｗ ２０１８で生成された。（図１Ｂ）１μｇのＡＡＶ８ベクターを変性一次元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで実行した。（図１Ｃ）炭酸脱水酵素ｐＩマーカースポットの等電点を示す。（図１Ｄ）５μｇのＡＡＶ８ベクターを二次元ゲル電気泳動によって分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色した。スポット１～２０は、カルバミル化炭酸脱水酵素ｐＩマーカーである。ボックス領域は、ａ＝ＶＰ１、ｂ＝ＶＰ２、ｃ＝ＶＰ３、ｄ＝内部トロポミオシンマーカーである（矢印：ＭＷ＝３３ｋＤａ、ｐＩ＝５．２のトロポミオシンスポット）。等電点電気泳動は、４～８のｐＩ範囲で実行した。図１Ｅ～図１Ｇ）４～８のｐＩ範囲で実行される等電点電気泳動の結果。１ｅ１１ ＧＣのｗｔＡＡＶ８（図１Ｅ）または変異（図１Ｆおよび図１Ｇ）ベクターであり、これを２Ｄゲル電気泳動で分析し、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙで染色した。タンパク質標識：Ａ＝ＶＰ１、Ｂ＝ＶＰ２、Ｃ＝ＶＰ３、Ｄ＝ニワトリ卵白コンアルブミンマーカー、Ｅ＝ターボヌクレアーゼマーカー。等電点電気泳動は、６～１０のｐＩ範囲で実行した。主要なＶＰ１／２／３アイソフォームスポットは円で囲まれ、マーカーの主要スポットの移行距離を垂直線（ターボヌクレアーゼ＝破線、コンアルブミン＝固体）で示す。 同上。 同上。 図２Ａ～図２Ｅは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質におけるアスパラギンおよびグルタミン脱アミド化の分析。（図２Ａ～図２Ｂ）Ａｓｎ－９４（図２Ａ）およびＡｓｐ－９４（図２Ｂ）を含む３＋ペプチド（９３－１０３）のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析、ならびに理論的および観察された質量を示す。（図２Ｃ～図２Ｄ）Ａｓｎ－２５４（図２Ｃ）およびＡｓｐ－２５４（図２Ｄ）を含む３＋ペプチド（２４７－２５９）のＥＳＩ質量分析、ならびに理論的および観察された質量を示す。Ａｓｎ－９４およびＡｓｎ－２５４で観察された質量シフトは、０．９８４Ｄａの理論的質量シフトに対して、それぞれ０．９８２Ｄａおよび０．９８６Ｄａであった。（図２Ｅ）目的の特定のアスパラギンおよびグルタミン残基での脱アミド化率は、異なる方法で精製されたＡＡＶ８トリプシンペプチドについて示される。Ｎ＋１グリシンを有するアスパラギン残基における脱アミドを示すバーが、網掛けされている。分析した少なくとも１つの調製物中で少なくとも２％脱アミド化されていると決定された残基が含まれた。データは、平均値±標準偏差で表される。 同上。 同上。 図３Ａ～図３Ｅは、ＡＡＶ８ ＶＰ３モノマーの構造モデリングおよび脱アミド化部位の分析。（図３Ａ）ＡＡＶ８ ＶＰ３モノマー（ＰＤＢ識別子：３ＲＡ８）をコイル表現で示す。リボンの色は、相対的な柔軟性の度合いを示す（青＝最も強固／普通の温度因子、赤＝最も柔軟／高い温度因子）。球体は、目的の残基を示す。拡大図は、目的の残基およびその周辺残基のボールおよびスティック表現であり、局所タンパク質構造（青＝窒素、赤＝酸素）を示す。下線が引かれた残基はＮＧモチーフのものである。図３Ｂ～図３Ｅ：Ｎ＋１グリシンを有する脱アミド化アスパラギンのイソアスパラギン系モデルを示す。２ＦｏＦｃ電子密度マップ（１シグマレベル）は、（図３Ｃ）Ｎ２６３、（図３Ｄ）Ｎ５１４、および（図３Ｅ）Ｎ５４０のイソアスパラギン酸モデルと比較した、（図３Ｂ）Ｎ４１０のアスパラギンモデルによるＡＡＶ８結晶構造（ＰＤＢ番号：３ＲＡ８）の精密化から生成される。電子密度マップは、マゼンタグリッドで示す。ベータ炭素は、このように標識される。矢印は、目的の残基のＲ基に対応する電子密度を示す。 同上。 図４Ａ～４Ｄは、ＡＡＶ８カプシド脱アミド化に影響を及ぼす因子の決定。ＡＡＶ８調製物を（図４Ａ）７０^oＣで３日間または７日間インキュベートし、（図４Ｂ）ｐＨ２またはｐＨ１０に７日間曝露し、または（図４Ｃ）Ｈ₂Ｏの代わりにＤ₂Ｏを使用して質量分析のために調製し、ＡＡＶカプシド形成に固有ではない脱アミド化の可能な供給源を特定した。（図４Ｄ）カプシドの構造的完全性を評価するためにＢ１抗体（変性カプシドに反応）およびＡＡＶ８構造特異的抗体（無傷のカプシドに反応）を使用して、図４Ａのように処理されたベクターのドットブロット。 同上。 同上。 同上。 図５Ａ～図５Ｂは、非ＡＡＶタンパク質の脱アミド化頻度。脱アミド化率は、ＡＡＶ脱アミド化率との比較のために、脱アミド化される可能性が高いＮＧモチーフを含む２つの非ＡＡＶ組換えタンパク質、ヒト炭素脱水酵素（図５Ａ）およびラットフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（図５Ｂ）について示される。 同上。 図６は、２つの機関からのデータ分析パイプラインを使用して計算されたＡＡＶ８脱アミド化率の比較。目的の特定のアスパラギンおよびグルタミン残基での脱アミド化率は、２つの異なる機関で評価されるＡＡＶ８トリプシンペプチドについて示される。 図７Ａ～図７Ｃは、ロット間のばらつきが大きい非ＮＧ部位での機能的なアスパラギン置換を例示する。（図７Ａ）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ８および変異ベクターの力価。力価は、ｗｔＡＡＶ８対照に対して報告される。形質導入効率は、図８Ｂに記載されているように測定した。力価および形質導入効率は、ｗｔＡＡＶ８対照の値に正規化される。（図７Ｂ）注入後１４日目の代表的なルシフェラーゼ画像を、ｗｔＡＡＶ８．ＣＢ７．ｆｆｌｕｃおよびＮ４９９Ｑカプシド変異ベクターを受容するマウスについて示す。（図７Ｃ）ルシフェラーゼイメージングによって測定し、総流量単位で報告されるｗｔＡＡＶ８または変異ベクター（ｎ＝３または４）を静脈内注入したＣ５７ＢＬ／６マウスから、研究期間の１４日目のルシフェラーゼ発現。すべてのデータは、平均値＋標準偏差として表される。 同上。 同上。 図８Ａおよび図８Ｂは、ベクター性能に対する遺伝子脱アミド化の影響のインビトロ分析の結果を示す。（図８Ａ）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ８および遺伝的脱アミド化変異ベクターの力価。力価は、ｗｔＡＡＶ８対照に対して報告される。脱アミドが多いＮＧ部位（パターン化バー）、脱アミドが少ない部位（白色バー）、および可変性が高い部位（黒色バー）は、ｗｔＡＡＶ８および陰性対照で表示する。（図８Ｂ）ｗｔＡＡＶ８対称と比較して報告されたホタルルシフェラーゼを産生する変異ＡＡＶ８ベクターの形質導入効率。形質導入効率は、ＨＵＨ７細胞に追加されたＧＣごとに生成された発光単位で測定され、複数の希釈で粗製ベクターを用いて形質導入を行うことによって決定される。形質導入効率のデータは、野生型（ｗｔ）参照に正規化される。すべてのデータは、平均値±標準偏差として表される。 同上。 図９Ａ～図９Ｄは、経時的なベクター活性損失が、進行性脱アミド化と相関していることを例示する。（図９Ａ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子をパッケージ化するＡＡＶ８ベクターを産生するトリプルトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の時間経過におけるベクター産生（ＤＮＡｓｅＩ耐性ゲノムコピー、ＧＣ）。ＧＣレベルは、最大観察値に正規化される。（図８Ｂ）精製された時間経過ベクターを使用して、Ｈｕｈ７細胞を形質導入した。形質導入効率（標的細胞に追加されたＧＣあたりの発光単位）は、図８Ｂのように、精製された時間経過ベクター試料の複数の希釈液を使用して測定した。誤差バーは、各試料時間の少なくとも１０の技術的複製の標準偏差を表す。トランスフェクションの１、２、および５日後に収集されたベクターのＡＡＶ８ ＮＧ部位（図９Ｃ）および非ＮＧ部位（図９Ｄ）の脱アミド化。 同上。 同上。 同上。 ベクター性能に対するアスパラギンの安定化の影響を例示する。図１０Ａは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ８および＋１位置変異ベクターの力価を示す。力価は、ｗｔＡＡＶ８対照に対して報告される。図１０Ｂは、ｗｔＡＡＶ８対照と比較して報告されたホタルルシフェラーゼを産生する変異ＡＡＶ８ベクターの形質導入効率を示す。形質導入効率は、粗ベクター材料を使用して図８Ｂのように測定された。２試料ｔ試験（＊ｐ＜０．００５）を実行して、Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５ＡおよびＧ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａに関するｗｔＡＶ８と変異形質導入効率との間の有意性を決定した。図１０Ｃは、ルシフェラーゼイメージングによって測定し、総流量単位で報告されるｗｔＡＡＶ８または変異ベクター（ｎ＝３～５）を静脈内注入したＣ５７ＢＬ／６マウスからの肝臓領域における、研究期間の１４日目のルシフェラーゼ発現を示す。図１０Ｄは、ｗｔＡＡＶ８対照と比較して報告されたホタルルシフェラーゼを産生する複数部位ＡＡＶ８変異ベクターの力価および形質導入効率を示す。すべてのデータは、平均値±標準偏差として表される。 ＡＡＶ９カプシドタンパク質におけるアスパラギンおよびグルタミン脱アミド化の分析。（図１１Ａ）１ｅ１１ＧＣのｗｔＡＡＶ９は、２Ｄゲル電気泳動で分析し、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙで染色した。タンパク質標識：Ａ＝ＶＰ１、Ｂ＝ＶＰ２、Ｃ＝ＶＰ３、Ｄ＝ニワトリ卵白コンアルブミンマーカー、Ｅ＝ターボヌクレアーゼマーカー。等電点電気泳動は、６～１０のｐＩ範囲で実行した。（図１１Ｂ）目的の特定のアスパラギンおよびグルタミン残基での脱アミド化率は、異なる方法で精製されたＡＡＶ９トリプシンペプチドについて示される。Ｎ＋１グリシンを有するアスパラギン残基における脱アミドを示すバーが、網掛けされている。分析した少なくとも１つの調製物中で少なくとも２％脱アミド化されていると決定された残基が含まれた。データは、平均値±標準偏差で表される。（図１１Ｃ）Ｎ５１２のイソアスパラギンモデルは、ＡＡＶ９結晶構造の非偏向精製によって生成された２ＦｏＦｃ電子密度マップ（ＰＤＢ番号：３ＵＸ１）に示される。矢印は、残基Ｎ５１２のＲ基に対応する電子密度を示す。 ＡＡＶ９カプシド脱アミド化に影響を及ぼす因子の決定。（図１１Ｄ）２つのＡＡＶ９調製物を７０^oＣで３日間または７日間インキュベートし、（図１１Ｅ）ｐＨ２またはｐＨ１０に７日間曝露し、ＡＡＶカプシド形成に固有ではない脱アミド化の可能な供給源を特定した。データは、平均値±標準偏差で表される。（図１１Ｆ）カプシド構造の完全性を評価するためにＢ１抗体（変性カプシドに反応する）を使用して、図１１Ｄのように処理されたベクターのドットブロット。 ＡＡＶ９のベクター性能に対する遺伝子脱アミド化の影響のインビトロ分析を例示する。（図１１Ｇ）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定された２９３細胞での小規模なトリプルトランスフェクションによって産生されたｗｔＡＡＶ９および遺伝的脱アミド化変異ベクターの力価。力価は、ｗｔＡＡＶ９対照に対して報告される。脱アミドが多いＮＧ部位（パターン化バー）、脱アミドが少ない部位（白色バー）、および可変性が高い部位（黒色バー）は、ｗｔＡＡＶ８および陰性対照で表示する。（図１１Ｈ）ホタルルシフェラーゼを産生する変異ＡＡＶ９ベクターの形質導入効率は、ｗｔＡＡＶ９対照と比較して報告される。すべてのデータは、平均値±標準偏差として表される。 図１１Ｉ～図１１Ｋは、ＡＡＶ９ベクターの効力を経時的に示す。（図１１Ｉ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子をパッケージ化するＡＡＶ９ベクターを産生するトリプルトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の時間経過におけるベクター産生（ＤＮＡｓｅＩ耐性ゲノムコピー、ＧＣ）。ＧＣレベルは、最大観察値に正規化される。（図１１Ｊ）粗製時間経過ベクターを使用して、Ｈｕｈ７細胞を形質導入した。（図１１Ｋ）トランスフェクション１日後対トランスフェクション５日後に収集されたベクターの形質導入効率を、粗製および精製ベクター試料について示す。形質導入効率は、１日目の値に正規化されたルシフェラーゼ活性／ＧＣとして表される。 図１２Ａ～図１２Ｂは、ＰＡＶ９．１モノクローナル抗体の特徴付けおよびＰＡＶ９．１エピトープに基づく変異誘発戦略。図１２Ａ：天然または変性カプシドタンパク質を用いた捕捉ＥＬＩＳＡに基づく様々なＡＡＶ血清型のＰＡＶ９．１認識。図１２Ｂ：ＡＡＶ ＶＰ １アミノ酸配列（配列番号１０～１９、上から下）の整列、ＰＡＶ９．１のエピトープに関係のある残基は黒色ボックス内にある。 同上。 図１３Ａ～図１３Ｄは、ＰＡＶ９．１ Ｆａｂと複合したＡＡＶ９の低温ＥＭ再構築。図１３Ａ：ＰＡＶ９．１ Ｆａｂと結合したＡＡＶ９カプシド（フクシア）の分子表面の描写（４．２Å分解能で再構築された３倍軸の突起での青。３，０２２個の粒子をボックス化し、Ａｕｔｏ３ｄＥＭを電子顕微鏡再構築に使用した。図１３Ｂ：ＡＡＶ９－ＰＡＶ９．１複合体の断面の描写。図１３Ｃ：低温再構築から得られた密度に組み込まれたＡＡＶ９－ＰＡＶ９．１トリマーの疑似原子モデル。ＶＰ３モノマーは、緑色、灰色、およびシアンで示す。球体は、結合残基を表す。重鎖をインディゴに、軽鎖を赤色にした単一ＰＡＶ９．１ Ｆａｂを図示した。図１３Ｄ：ＰＡＶ９．１結合に関与する残基の二次元「ロードマップ」。 図１４Ａ～図１４Ｅは、ＡＡＶ９についてのＰＡＶ９．１ ｍＡｂのＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。ＡＡＶ９に対するカプシド捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、ＰＡＶ９．１の結合曲線を分析および生成した。図１４Ａ～図１４Ｅは以下を示す：５８６～５９０スワップ変異（図１４Ａ）、４９４～４９８変異（図１４Ｂ）、５８６～５９０点変異（図１４Ｃ）、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡおよびＡＡＶ９．ＳＡＱＡＮ単一ならびに組み合わせ変異（図１４Ｄ）、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡおよびＡＡＶ９．ＳＡＱＡＡ単一ならびに組み合わせ変異（図１４Ｅ）。吸光度を各カプシドの最大吸光度に正規化した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なラインおよびＥＣ５０を決定した。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１５Ａ～図１５Ｋは、インビボベクター形質導入および有効なＰＡＶ９．１ ｍＡｂ中和力価に対するＰＡＶ９．１エピトープ変異の影響を特徴付ける。図１５Ａ：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ９．ＷＴと比較したＰＡＶ９．１カプシド変異の形質導入効率。両側１試料ｔ検定を使用して有意性を決定し、各変異のパーセント形質導入をＡＡＶ９．ＷＴの形質導入（１００％と定義される）と比較した。Ｐ値は、ｐ＊＜０．０５、ｐ＊＊＊＜０．００１として示される。図１５Ｂ～図１５ｋ：ＨＡＶ２９３細胞をＡＡＶ９．ＷＴ．ＣＭＶ．ＬａｃＺ（図１５Ｂ）、ＡＡＶ９．ＡＡＱＡＡ（図１５Ｃ）、ＡＡＶ９．ＱＱＮＡＡ（図１５Ｄ）、ＡＡＶ９．ＳＳＮＴＡ（図１５Ｅ）、ＡＡＶ９．ＲＧＮＲＱ（図１５Ｆ）、ＡＡＶ９．ＲＧＨＲＥ（図１５Ｇ）、ＡＡＶ９．ＴＱＡＡＡ（図１５Ｈ）、ＡＡＶ９．ＡＡＮＮＮ（図１５Ｉ）、ＡＡＶ９．ＳＡＱＡＮ（図１５Ｊ）、またはＡＡＶ９．ＳＡＱＡＡ（図１５Ｋ）で形質導入する場合のＰＡＶ９．１の中和力価を決定する。ｍＡｂなしのベクター（相対光単位で測定されるレベル）よりも５０％以上高い形質導入レベルを達成することができる時点以前の希釈として中和力価を定義した。すべてのデータは平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１６は、ＡＡＶ９変異のパネルのＰＡＶ９．１ ＥＣ５０および中和力価の相関関係。ＡＡＶ９．ＷＴに対するＰＡＶ９．１中和力価と比較して、各変異に対するＰＡＶ９．１中和力価の倍率低下を計算した。直線スケール（片対数プロット）で、ＡＡＶ９．ＷＴのＰＡＶ９．１ ＥＣ５０と比較した各変異のＰＡＶ９．１ ＥＣ５０の倍率増加に対して対数スケールでデータをプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、最適な片対数線を決定した；Ｒ²＝０．８４７４。 図１７Ａ～図１７Ｇは、ＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異ベクターのインビボ分析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、マウスあたり１ｅ１１ ＧＣ（図１７Ａ～図１７Ｃ）またはマウスあたり１ｅ１２ ＧＣ（図１７Ｄ～図１７Ｆ）のＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＬａｃＺ（ＷＴまたは変異；ｎ＝３）のいずれかの静脈内注入を受けた。１４日目にマウスを犠牲にし、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを使用して、生体内分布分析（図１７Ａおよび図１７Ｄ）のために組織を採取した。値は、平均値±ＳＤとして報告される。また、β－ｇａｌ組織化学のために肝臓（図１７Ｂおよび図１７Ｅ）、心臓（図１７Ｃおよび図１７Ｆ）、および筋肉（図１７Ｇ）を採取して、酵素活性を決定した。代表的な１０倍画像を示す；スケールバー＝２００μｍ。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１８Ａ～図１８Ｄは、ＡＡＶ９の注入マウス血漿のＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。カプシド捕獲ＥＬＩＳＡを使用して、７．５ｅ８ ＧＣ／マウス（図１８Ａ）、または７．５ｅ９ ＧＣ／マウス（図１８Ｂ）のＡＡＶ９．ＷＴまたはＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異結合のｗｔＡＡＶ９．ＬＳＰ．ｈＦＩＸのいずれかの静脈内注入を受けたマウスの５６日目の血漿を分析した。吸光度を各カプシドで達成された最大吸光度に正規化した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なラインおよびＥＣ５０を決定した。各グラフは、単一動物に対応する。７．５ｅ８ ＧＣ／マウス（図１８Ｃ）、または７．５ｅ９ ＧＣ／マウス（図１８Ｄ）のＥＣ５０値を収集して、各変異の平均値を決定した。両側１試料ｔ検定を使用して、ＡＡＶ９．ＷＴ（１として定義される）の血漿のＥＣ５０と比較して、各変異の血漿のＥＣ５０と有意差があったかを決定した。ボンフェローニ補正は、タイプ１エラーの制御に適用された。Ｐ値は、＊＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１のように表される。ＥＣ５０データは、平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 同上。 同上。 図１９Ａ～図１９Ｄは、ＡＡＶ９のＮＨＰポリクローナル血清のＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。カプシド捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、（図１９Ａ）ＡＡＶ９．ＷＴまたはｈｕ６８．ＷＴベクターで処理したＮＨＰ、または（図１９Ｂ）ＡＡＶ９．ＷＴまたはＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異結合についてＡＡＶ９ ＮＡｂ（＋）である未処理ＮＨＰからの血清を分析した。吸光度を各カプシドで達成された最大吸光度に正規化した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なＥＣ５０を決定した。各グラフは、単一動物に対応する。ベクター処理ＮＨＰ（図１９Ｃ）および未処理ＮＡｂ（＋）ＮＨＰのＥＣ５０値を収集して、各変異の平均を決定した（図１９Ｄ）。両側１試料ｔ検定を使用して、ＡＡＶ９．ＷＴ（１として定義される）の血漿のＥＣ５０と比較して、各変異の血漿のＥＣ５０と有意差があるかを決定した。ボンフェローニ補正は、タイプ１エラーの制御に適用された。ＥＣ５０データは、平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 同上。 同上。 図２０Ａ～図２０Ｂは、ＡＡＶ９のヒトドナーポリクローナル血清のＥＣ５０に対するエピトープ変異の影響。図２０Ａ：カプシド捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、ＡＡＶ９．ＷＴまたはＡＡＶ９ ＰＡＶ９．１変異の結合についてＡＡＶ９ ＮＡｂ（＋）であった未処理ヒトドナーからの血清を分析した。Ｐｒｉｓｍの用量反応関数を使用して、最適なラインおよびＥＣ５０を決定した。各グラフは、単一ドナーに対応する。図２０Ｂ：ＮＡｂ（＋）ヒトドナー血清のＥＣ５０値を収集し、各変異の平均を決定した。両側１試料ｔ検定を使用して有意性を決定し、ＡＡＶ９．ＷＴの血漿のＥＣ５０（１として定義される）に対する各変異の血漿のＥＣ５０を比較した。ボンフェローニ補正は、タイプ１エラーの制御に適用された。ＥＣ５０データは、平均値±ＳＤとして報告される。 同上。 図２１Ａ～図２１Ｂは、ＡＡＶ８についてのＮ５７Ｑ、Ｎ２６３Ｑ、Ｎ３８５Ｑ、Ｎ５１４Ｑ、Ｎ５４０Ｑ、Ｎ９４Ｑ、およびＮ４１０Ｑ変異を含む、６ウェルプレートスケール実験からのＡＡＶ８のインビトロ力価および形質導入データを示す。 図２２Ａ～図２２Ｂは、ＡＡＶ９についてのＮ５７Ｑ、Ｎ３２９Ｑ、Ｎ４５２Ｑ、Ｎ２７０Ｑ、Ｎ４０９Ｑ、Ｎ６６８Ｑ、Ｎ９４Ｑ、Ｎ２５３Ｑ、Ｎ６６３Ｑ、およびＮ７０４Ｑ変異を含む、６ウェルプレートスケール実験からのＡＡＶ９のインビトロ力価および形質導入データを示す。 図２３Ａ～２３Ｂは、１４日目のマウスにおける肝臓発現について試験したマウスにおいて、それぞれＡＡＶ８およびＡＡＶ９のインビボ形質導入データを提供する（ルシフェラーゼイメージング）。図２３Ａは、ＡＡＶ８について野生型と比較した、ＡＡＶ８変異Ｎ５７Ｑ、Ｎ２６３Ｑ、およびＮ３８５Ｑを示す。図２３Ｂは、野生型ＡＡＶ９と比較した、ＡＡＶ９変異Ｎ５７Ｑ、Ｇ５８Ａ、Ｇ３３０Ａを示す。 図２４Ａ～図２４Ｂは、ＡＡＶ９ダブルおよびトリプル変異Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ、Ｇ３３０Ａ／Ｇ５１３Ａ、Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ、およびＧ３３０／Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａの相対力価（ＧＣ）および形質導入効率を例示する。図２４Ａは、変異の相対的力価をＡＡＶ９ｗｔと比較し、図２４Ｂは、変異の相対形質導入効率（ルシフェラーゼ／ＧＣ）をＡＡＶ９ｗｔと比較する。

Claims (28)

1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の混合集団を含む組成物であって、前記ｒＡＡＶの各々が、
   （ａ）約６０個のカプシドｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質を含むＡＡＶカプシドであって、前記ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、
   選択されるＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質の異種集団、
   選択されるＡＡＶ ｖｐ２アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質の異種集団、
   選択されるＡＡＶ ｖｐ３アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質の異種集団であり、
   前記ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、前記ＡＡＶカプシド中のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意で他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、前記脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらすが、ただし、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｈｕ６８ではない、ＡＡＶカプシドと、
   （ｂ）前記ＡＡＶカプシド中のベクターゲノムであって、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞中で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される前記産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、組成物。
2. 前記脱アミド化アスパラギンが、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換アスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記カプシドが、（α）－グルタミン酸、γ－グルタミン酸、相互変換（α）－グルタミン酸／γ－グルタミン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化される脱アミド化グルタミンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記カプシドが、アスパラギン－グリシン対中にある４～５個の高度脱アミド化アスパラギンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記カプシドが、質量分析を使用して決定されたときに、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の番号付けに対して５７位に６５％～１００％の脱アミド化アスパラギンを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
6. （ａ）前記組成物が、最初のＭを伴うＡＡＶ８ ｖｐ１の番号付けに基づいて、配列番号６（ＡＡＶ８ ｖｐ１をコードする］のＮ５７位、Ｎ２６３位、Ｎ３８５位、Ｎ５１４位、および／またはＮ５４０位で前記カプシド中のＮの少なくとも７０％～１００％が脱アミド化されている亜集団をさらに含む、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ、
   （ｂ）最初のＭを伴う配列番号７（ＡＡＶ９ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７位、Ｎ３２９位、Ｎ４５２位、および／またはＮ５１２位で前記カプシド中のＮの少なくとも６５％～１００％が脱アミド化されている亜集団をさらに含む、ＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶ、
   （ｃ）最初のＭを伴う配列番号１１２（ＡＡＶｒｈ１０ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ２６３位、Ｎ３８５位、および／またはＮ５１４位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団をさらに含む、ＡＡＶｒｈ１０カプシド（ＡＡＶｒｈ１
   ０）を有するｒＡＡＶ、あるいは
   （ｄ）最初のＭを伴う配列番号３６（ＡＡＶｈｕ３７ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ２６３位、Ｎ３８５位、および／またはＮ５１４位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団をさらに含む、ＡＡＶｈｕ３７カプシド（ＡＡＶｈｕ３７）を有するｒＡＡＶ、を含む、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
7. 前記組成物が、
   （ａ）最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づく、配列番号１の番号付けに基づいて、Ｎ５７位、Ｎ３８３位、Ｎ５１２位、Ｎ７１８位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団を含む、ＡＡＶ１カプシドを有するｒＡＡＶ、
   （ｂ）最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号２の番号付けを参照して、Ｎ５７位、Ｎ３８２位、Ｎ５１２位、Ｎ７１８位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団を含む、ＡＡＶ３Ｂカプシドを有するｒＡＡＶ、
   （ｃ）最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号３の番号付けを参照して、Ｎ５６位、Ｎ３４７位、Ｎ３４７位、Ｎ５０９位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団を含む、ＡＡＶ５カプシドを有するｒＡＡＶ、
   （ｄ）最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号４の番号付けを参照して、Ｎ４１位、Ｎ５７位、Ｎ３８４位、Ｎ５１４位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団を含む、ＡＡＶ７カプシドを有するｒＡＡＶ、
   （ｅ）最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号５の番号付けを参照して、Ｎ５７位、Ｎ２６４位、Ｎ２９２位、Ｎ３１８位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団を含む、ＡＡＶｒｈ３２．３３カプシドを有するｒＡＡＶ、あるいは
   （ｆ）最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号１１１の番号付けを参照して、Ｎ５６位、Ｎ２６４位、Ｎ３１８位、Ｎ５４６位のうちの１つ以上のＮ－Ｇ対で少なくとも７０％～１００％のＮが脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の亜集団を含む、ｒＡＡＶ４ベクター、を含む、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
8. 前記カプシドが、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の番号付けに対して５７位に８０％～１００％の脱アミド化アスパラギンを含む、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
9. 前記ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質および／またはｖｐ３タンパク質のすべてもしくは亜集団が、そのＮ末端に約１～約５個のアミノ酸のトランケーションを有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質および／またはｖｐ３タンパク質のすべてもしくは亜集団が、そのＣ末端に約１～約５個のアミノ酸のトランケーションを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. ＡＡＶカプシドの脱アミド化を低減するための方法であって、前記方法が、修飾されたＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列からＡＡＶカプシドを産生することを含み、前記核酸配列が、前記修飾されたコドンがグリシン以外のアミノ酸をコードするように、参照ＡＡＶ ｖｐ１配列に対して前記アスパラギン－グリシン対のうちの１～３個で独立して修飾
    されたグリシンコドンを含む、方法。
12. ＡＡＶカプシドの脱アミド化を低減するための方法であって、前記方法が、修飾されたＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列からＡＡＶカプシドを産生することを含み、前記核酸配列が、前記修飾されたコドンがアスパラギン以外のアミノ酸をコードするように、参照ＡＡＶ ｖｐ１配列に対して少なくとも１つのアスパラギン－グリシン対で独立して修飾されたアスパラギンコドンを含む、方法。
13. 組換えＡＡＶの力価、効力、または形質導入を増加させるための方法であって、前記方法が、カプシド中の少なくとも１つのアスパラギン－グリシン対のアスパラギンまたはグリシンを異なるアミノ酸に変更するように修飾された少なくとも１つのＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列からＡＡＶカプシドを産生することを含む、方法。
14. 前記修飾されたコドンが、ｖ２および／またはｖｐ３領域内にある、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. ｖｐ１固有領域内の前記アスパラギン－グリシン対が、修飾されたｒＡＡＶ中に保持される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 脱アミド化部位が、
    （ａ）ＡＡＶ８カプシドについて、最初のＭを伴うＡＡＶ８ ｖｐ１の番号付けに基づいて、配列番号６（ＡＡＶ８ ｖｐ１をコードする）のＮ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、Ｎ５１４、および／またはＮ５４０、
    （ｂ）ＡＡＶ９カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号７（ＡＡＶ９ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、および／またはＮ５１２、
    （ｃ）ＡＡＶｒｈ１０カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号１１２（ＡＡＶｒｈ１０ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、および／またはＮ５１４、あるいは
    （ｄ）ＡＡＶｈｕ３７カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号３６（ＡＡＶｈｕ３７ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、および／またはＮ５１４以外の位置で修飾される、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記修飾された脱アミド化部位が、表Ｆ、表Ｇ、または表Ｈの部位から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 脱アミド化部位が、
    （ａ）ＡＡＶ１カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づく、配列番号１の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２、および／またはＮ７１８、
    （ｂ）ＡＡＶ３Ｂカプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号２の番号付けを参照して、Ｎ５７、Ｎ３８２、Ｎ５１２、および／またはＮ７１８、
    （ｃ）ＡＡＶ５カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号３の番号付けを参照して、Ｎ５６、Ｎ３４７、Ｎ３４７、および／またはＮ５０９、
    （ｄ）ＡＡＶ７カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号４の番号付けを参照して、Ｎ４１、Ｎ５７、Ｎ３８４、および／またはＮ５１４、
    （ｅ）ＡＡＶｒｈ３２．３３カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号５の番号付けを参照して、Ｎ５７、Ｎ２６４、Ｎ２９２、および／またはＮ３１８、あるいは
    （ｆ）ＡＡＶ４カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号１１１の番号付けを参照して、Ｎ５６、Ｎ２６４、Ｎ３１８、および／またはＮ５４６以外の位置で修飾される、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記修飾された脱アミド化部位が、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表Ｅ、表Ｆ、表Ｇ、または表Ｈの部位から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 各修飾されたコドンが、異なるアミノ酸をコードする、請求項１１～１９のいずれかに記載の方法。
21. ２つ以上の修飾されたコドンが、同じアミノ酸をコードする、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の方法。
22. 請求項１１～２１のいずれか一項に記載の方法を使用して産生される、未修飾ＡＡＶカプシドと比較して、低減した脱アミド化を有するＡＡＶカプシドを含む、変異ｒＡＡＶ。
23. ＶＰ１の番号付けに基づいて、
    （ａ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２３）、
    （ｂ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１５）、
    （ｃ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１６）、
    （ｄ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ（配列番号１１７）、
    （ｅ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１８）、
    （ｆ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１１９）、
    （ｇ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５４１Ａ／Ｎ３０５Ｑ／Ｎ４５９Ｑ／Ｎ４９９Ｑ（配列番号１２０）、
    （ｈ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ（配列番号２１）、
    （ｉ）ＡＡＶ８Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２５）、
    （ｊ）ＡＡＶ８ Ｇ２６４Ａ／Ｇ５１５Ａ／Ｇ５４１Ａ（配列番号２７）、
    （ｋ）ＡＡＶ９ Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ（配列番号２９）、
    （ｌ）ＡＡＶ９Ｇ３３０Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３１）、
    （ｍ）ＡＡＶ９Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３３）、および／または
    （ｎ）Ｇ３３０／Ｇ４５３Ａ／Ｇ５１３Ａ（配列番号３５）の置換のうちの１つ以上を有するカプシドタンパク質を有する変異ＡＡＶカプシドを有する、請求項２２に記載の変異ｒＡＡＶ。
24. ＡＡＶ８ ＶＰ１の番号付けに基づいて、Ｎ２６３Ａ、Ｎ５１４Ａ、またはＡＡＶ Ｎ５４０Ａの置換のうちの１つ以上を有するカプシドタンパク質を有する変異ＡＡＶカプシドを有する、請求項２２に記載の変異ｒＡＡＶ。
25. カプシドタンパク質を有する変異ＡＡＶカプシドを有し、Ｎ５７、Ｎ９４、Ｎ２６３、Ｎ３０５、Ｇ３８６、Ｑ４６７、Ｎ４７９、および／またはＮ６５３の位置で野生型ＮＧ対が保持される、請求項２２に記載の変異ｒＡＡＶ。
26. 増加した力価、効力、または形質導入を有するｒＡＡＶの集団を含む組成物であって、前記組成物が、表Ａ（ＡＡＶ１）、表Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、表Ｃ（ＡＡＶ５）、表Ｄ（ＡＡＶ７）、表Ｅ（ＡＡＶｒｈ３２．３３）、表Ｆ（ＡＡＶ８）、表Ｇ（ＡＡＶ９）、または表Ｈ（ＡＡＶｈｕ３７）のうちのいずれか１つに従うカプシド脱アミド化パターンを有する脱アミド化パターンを有するｒＡＡＶと比較して、減少した総脱アミド化を有するように修飾されたカプシドを有するｒＡＡＶを含むが、ただし、前記ｒＡＡＶがＡＡＶｈｕ６８ではない、組成物。
27. 前記ｒＡＡＶが、
    （ａ）ＡＡＶ８カプシドについて、最初のＭを伴うＡＡＶ８ ｖｐ１の番号付けに基づいて、配列番号６（ＡＡＶ８ ｖｐ１をコードする）のＮ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、Ｎ５１４、および／またはＮ５４０、
    （ｂ）ＡＡＶ９カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号７（ＡＡＶ９ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、および／またはＮ５１２、
    （ｃ）ＡＡＶｒｈ１０カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号１１２（ＡＡＶｒｈ１０ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、および／またはＮ５１４、あるいは
    （ｄ）ＡＡＶｈｕ３７カプシドについて、最初のＭを伴う配列番号３６（ＡＡＶｈｕ３７ ｖｐ１をコードする）の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、および／またはＮ５１４以外の位置で修飾された脱アミド化部位を有する、請求項２６に記載の組成物。
28. 前記ｒＡＡＶが、
    （ａ）ＡＡＶ１カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づく、配列番号１の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２、および／またはＮ７１８、
    （ｂ）ＡＡＶ３Ｂカプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号２の番号付けを参照して、Ｎ５７、Ｎ３８２、Ｎ５１２、および／またはＮ７１８、
    （ｃ）ＡＡＶ５カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号３の番号付けを参照して、Ｎ５６、Ｎ３４７、Ｎ３４７、および／またはＮ５０９、
    （ｄ）ＡＡＶ７カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号４の番号付けを参照して、Ｎ４１、Ｎ５７、Ｎ３８４、および／またはＮ５１４、
    （ｅ）ＡＡＶｒｈ３２．３３カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号５の番号付けを参照して、Ｎ５７、Ｎ２６４、Ｎ２９２、および／またはＮ３１８、あるいは
    （ｆ）ＡＡＶ４カプシドについて、最初のＭを伴う予測されたｖｐ１アミノ酸配列の番号付けに基づいて、配列番号１１１の番号付けを参照して、Ｎ５６、Ｎ２６４、Ｎ３１８、および／またはＮ５４６以外の位置で修飾された、修飾されたアミノ酸配列脱アミド化部位を有する、請求項２６に記載の組成物。

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