CN114645062A - 一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，属于基因工程领域。本发明构建了在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中均可使用脱水四环素诱导表达的操纵子P_tet表达系统，该系统以商业化质粒pHT01为表达载体，包括阻遏蛋白tetR表达框和超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框。其中对阻遏蛋白tetR表达框中的阻遏蛋白tetR的基因序列和RBS序列进行突变以改变阻遏蛋白亲和力和表达强度。操纵子P_tet表达系统在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均表现出低泄漏和高的诱导放大倍数。因此本通用表达系统结构简单、活性高、调控严谨，在异源蛋白高效表达和合成生物学研究中有广阔的应用前景。

Description

一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导 表达系统

技术领域

本发明了涉及一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，属于基因工程学领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌作为一类革兰氏阳性菌，由于其良好的生物安全性，较强的分泌能力，无密码子偏好性而被广泛应用与各种蛋白酶制剂和有价值的蛋白质的生产。枯草芽孢杆菌表达异源蛋白存在多种表达系统，以不同启动子特性来分，主要有自诱导表达系统、组成型表达系统、诱导型表达系统。启动子从功能上主要分为组成型启动子和诱导型启动子两类。组成型启动子在菌体的生长各个阶段都可以表达外源基因，而诱导型启动子在没有被诱导时表现无活性或者低活性，在加入诱导剂之后启动子的活性大幅提高进而高效表达外源基因。诱导型启动子由于其活性可控而被广泛应用，人们可以通过调控加入诱导剂的试剂和浓度控制外源基因的表达时间和强度。

目前在枯草芽孢杆菌当中应用较为广泛的主要有IPTG诱导系统和木糖诱导系统。其中，IPTG诱导系统主要基于pHT系列载体构建而成，使用的是非天然的杂合启动子和大肠杆菌的LacI阻遏蛋白和结合位点；而木糖诱导系统通常使用天然的PxylA启动子和XylR阻遏蛋白。虽然IPTG、木糖等诱导系统在枯草芽孢杆菌中被广泛使用，但由于木糖是碳源会被利用、IPTG对人体有毒、表达强度有限、在大肠杆菌中是组成型表达无法诱导等缺点，在实际使用中均出现一定的问题；如在表达一些对菌体产生毒性的蛋白时，在大肠杆菌中的泄漏表达经常使基因序列发生突变而提前终止表达，无法构建大肠-枯草通用诱导调控系统。

因此，需要开发一种基于新型诱导剂、调控严谨、在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中通用的诱导型表达系统，对后续酶工程、代谢工程等领域打下基础。

发明内容

枯草芽孢杆菌中常用的IPTG、木糖等诱导系统在大肠杆菌中组成型表达无法诱导，不利于蛋白表达载体的构建与调控系统的构建；通用诱导型表达系统要求阻遏蛋白要在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表现出足够的亲和强度和表达强度以降低启动子的泄漏使调控更严谨。

本发明提供了一种阻遏蛋白tetR表达框，所述表达框由启动子P21、RBS序列和阻遏蛋白tetR构成；所述启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.9所示，所述阻遏蛋白tetR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或阻遏蛋白为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的阻遏蛋白tetR的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的。

本发明还提供了一种表达系统，所述表达系统由表达载体、上述表达框及目的基因构成，所述目的基因含有P_tet启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pHT01质粒、pSTOP1622质粒、pJOE8999质粒或pAD123质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述P_tet启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中含有上述阻遏蛋白tetR表达框，或上述表达系统。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于E.coli JM109、E.coliJM110、E.coli DH5α或E.coli BL21；所述枯草芽孢杆菌但不限于B.subtilis 168、WB600、WB800。

本发明还提供了上述阻遏蛋白tetR表达框在采用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌进行目的基因表达中的应用，所述目的基因含有P_tet启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。

本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP及其构建方法。

在本发明的一种实施方案中，通用型诱导表达质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP主要由三部分构成：商业化质粒pHT01表达载体、阻遏蛋白tetR表达框、超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框。

在本发明的一种实施方案中，阻遏蛋白tetR表达框由枯草芽孢杆菌组成型启动子P21、RBS原始序列和阻遏蛋白基因tetR构成，阻遏蛋白基因tetR的Genbank登录号为CAA25291，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，组成型启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方案中，超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框由诱导型启动子P_tet、RBS_-sfGFP与超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)组成，超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的Genbank登录号为BAP77013.1，该基因已按照B.subtilis的密码子偏好性进行优化，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，诱导型启动子P_tet的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，RBS1序列如SEQ ID NO.8。

本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP及其构建方法，以上述质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetR的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(F119Y)，同时将质粒上阻遏蛋白tetR表达框中的RBS变成RBS0(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)。

本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP及其构建方法，以重组质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP为模板，仅将质粒上阻遏蛋白tetR表达框中的RBS变成RBS0(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)。

本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP及其构建方法，以重组质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetR的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(F119Y)。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞是分别将上述重组质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP、pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP、pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP转入到宿主细胞中得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli DH5α。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis G601。

在本发明的一种实施方式中，大肠杆菌DH5α为商业化菌株，枯草芽孢杆菌B.subtilis G601菌株(专利申请号CN2021112516567)为胞外蛋白酶敲除菌株，可以增强细胞蛋白的表达。

本发明的第四个目的是提供一种表征操纵子P_tet表达系统表达强度的方法，是应用了上述工程菌株进行96孔板发酵测定。

在本发明的一种实施方式中，将上述的基因工程菌在LB培养基中培养，培养条件为：35-37℃，200-220rpm，培养10-15h，获得种子液；以2-5％接种量将种子液接种到96孔板LB发酵液中，培养条件为：35-37℃，750rpm，培养14h-96h。

在本发明的一种实施方式中，上述LB培养基为本领域常规培养基，每升组分包括：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g。

有益效果

(1)本发明构建了在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中均可使用脱水四环素诱导表达的操纵子P_tet表达系统。其包括商业化质粒pHT01表达载体；阻遏蛋白tetR表达框；超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框。其中阻遏蛋白tetR表达框中的阻遏蛋白tetR的基因序列和RBS进行突变改变阻遏蛋白亲和力和表达强度，操纵子P_tet在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均表现出低泄漏和高的诱导放大倍数。

(2)由本发明构建的表达系统结构简单、活性高、调控严谨，1)适用于构建大肠杆菌和枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，相比传统的使用两种操纵子构建的表达系统，减少了非必要元件提高整个表达系统的简洁性与实用性；2)操纵子在枯草中完全不泄露，适用于异源蛋白的高效表达；3)操纵子调控严谨，在代谢途径和基因线路的构建研究中有广阔的应用前景。

附图说明

图1：阻遏蛋白tetR表达框。

图2：通用型诱导表达质粒pHT-P_tet-sfGFP结构示意图。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的质粒的构建在E.coli DH5α中进行，质粒构建完成构转化到B.subtilis G601中进行sfGFP的表达和发酵。所使用的载体pHT-01为商业化质粒。

下述实施例中所涉及的B.subtilis G601是以B.subtilis 168为出发菌株，使用CRISPR/Cpf1技术在基因组上整合了木糖诱导型启动子PxylA控制的转录因子comK comS基因，使其转化效率大幅提高；回复突变了trpC基因和gudB基因，使其能够合成色氨酸并有效利用谷氨酸家族氨基酸；此外，将6个胞外蛋白酶基因(胞外蛋白酶丝氨酸蛋白酶基因aprE、中性蛋白酶基因nprE、杆菌肽酶基因bpr、金属蛋白酶基因mpr与中性蛋白酶基因nprB)进行了敲除制备得到的，具体的制备方法记载于公开号为CN113957028A的中国发明专利申请文本中。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母粉和10g NaCl。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

荧光强度的测定

使用多功能微孔板检测仪Cytation 3(美国伯腾仪器有限公司)参照文献Yang S,Liu Q,Zhang Y,et al.Construction and characterization of broad-spectrumpromoters for synthetic biology[J].ACS Synthetic Biology,2018,7(1):287–291.的方法对sfGFP的相对荧光强度进行测定。

实施例1：诱导表达质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP及工程菌株的构建

如图2所示，构建的诱导表达质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP主要由三部分构成：(1)商业化质粒pHT01表达载体；(2)阻遏蛋白tetR表达框；(3)超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框。

具体步骤如下：

(1)pHT质粒骨架的构建

使用引物pHT-LiF：5’-ctgcaggtcgacgtcccc-3’和pHT-LiR：5’-agcgcaacgcaattaatgtga-3’，以商业化质粒pHT01为模板扩增得到pHT质粒骨架。

(2)阻遏蛋白tetR表达框的构建

化学合成阻遏蛋白tetR表达框(图1)；所述阻遏蛋白tetR表达框由枯草芽孢杆菌组成型启动子P21、RBS序列和阻遏蛋白基因tetR构成：

所述组成型启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述阻遏蛋白基因tetR核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

阻遏蛋白tetR能够在没有诱导剂存在的情况下与启动子P_tet结合阻遏启动子的表达，在诱导剂存在的情况下脱离启动子使得启动子表达。

得到阻遏蛋白tetR表达框P₂₁-tet-RBS。

(3)超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框的构建

化学合成超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框；所述超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框由诱导型启动子P_tet、RBS1序列、超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)组成：

所述sfGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述诱导型启动子P_tet的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，RBS1序列如SEQ ID NO.8，该蛋白通过荧光强度来表征表达系统的性能。得到超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框，命名为P_tet-sfGFP。

(4)质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP的构建

分别将两个表达框一起连接到步骤(1)制备得到的载体pHT01骨架上之后，得到质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

(5)工程菌株的构建

分别将上述质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP转化到E.coli DH5α与B.subtilisG601菌株中之后，分别制备得到工程菌株E.coli DH5α/pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP和B.subtilis G601/pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP。

实施例2：通用型诱导表达质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP及工程菌株的构建

具体步骤如下：

(1)突变质粒的制备pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP制备

以实施例1制备得到的质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetR的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(F119Y)，同时将质粒上阻遏蛋白tetR表达框中的RBS变成RBS0(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)。

所涉及的引物序列如下：

使用引物

RBS0-F：5’-attcctccttatttatgtagttactatataaaagcattagtgtatcaattccacga-3’；

RBS0-R：5’-ctacataaataaggaggaatcacatgtccagattagataaaagtaaagtgattaac-3’。

F119Y-F：5’-agtgaaaaaccttgttggcataaataggctaattgattttcgagagttt-3’，

F119Y-R：5’-aaactctcgaaaatcaattagcctatttatgccaacaaggtttttcact-3’。

所涉及的PCR反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火35s，72℃延伸15s，反应10个循环，最后72℃延伸5min。

进行PCR得到的片段通过Seamless Cloning Kit(Beyotime Biotechnology)构建重组质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP，测序验证，确认重组质粒构建成功。

(2)工程菌的构建

将制备得到的重组质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP转入E.coli DH5α与B.subtilis G601菌株得到工程菌株E.coli DH5α/pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP和B.subtilis G601/pHT-P₂₁-F119Y-RBS0-P_tet-sfGFP。

实施例3：诱导表达质粒pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP及工程菌株的构建

具体步骤如下：

(1)pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP的构建

以实施例1制备得到的重组质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP为模板，仅将质粒上阻遏蛋白tetR表达框中的RBS变成RBS0(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，所使用引物序列如下：RBS0-F：5’-attcctccttatttatgtagttactatataaaagcattagtgtatcaattccacga-3’；

RBS0-R：5’-ctacataaataaggaggaatcacatgtccagattagataaaagtaaagtgattaac-3’。

进行PCR(反应条件同实施例2)得到的片段通过Seamless Cloning Kit(BeyotimeBiotechnology)构建重组质粒pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP，测序验证，确认重组质粒构建成功。

制备得到重组质粒pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP。

(2)工程菌的构建

分别将制备得到的重组质粒pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP转入E.coli DH5α和B.subtilis G601中，分别得到工程菌株B.subtilis G601/pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP和E.coli DH5α/pHT-P₂₁-tet-RBS0-P_tet-sfGFP。

实施例4：诱导表达质粒pHT-P₂₁-F119Y--RBS-P_tet-sfGFP及工程菌株的构建

具体步骤如下：

(1)pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP的构建

以实施例1制备得到的重组质粒pHT-P₂₁-tet-RBS-P_tet-sfGFP为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetR的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(F119Y)，所使用引物序列如下：

F119Y-F：5’-agtgaaaaaccttgttggcataaataggctaattgattttcgagagttt-3’，

F119Y-R：5’-aaactctcgaaaatcaattagcctatttatgccaacaaggtttttcact-3’；

进行PCR(反应条件同实施例2)得到的片段通过Seamless Cloning Kit(BeyotimeBiotechnology)构建重组质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP，测序验证，确认重组质粒构建成功。

制备得到重组质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP。

(2)工程菌的构建

分别将制备得到的重组质粒pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP转入E.coli DH5α和B.subtilis G601中，分别得到工程菌株B.subtilis G601/pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP和E.coli DH5α/pHT-P₂₁-F119Y-RBS-P_tet-sfGFP。

实施例5：操纵子P_tet表达系统在E.coli与B.subtilis中诱导验证

具体步骤如下：

(1)将实施例1～4中所得到的工程菌株分别接种到含氨苄青霉素(100mg/L)、氯霉素(5mg/L)的LB培养基中，在37℃，220rpm震荡培养12h，制备得到种子液。

(2)分别将上述种子液按4％(v/v)的接种量转接到含LB培养基(含氨苄青霉素100mg/L、氯霉素5mg/L)的96孔板中，分别向96孔板中添加脱水四环素，浓度分别为0nM、200nM的脱水四环素；

分别将上述体系置于37℃，750rpm条件下震荡培养在24h，分别制备得到发酵液；分别测量96孔板中发酵液的荧光表达强度，结果如表1所示。

表1：不同工程菌株对于荧光蛋白的表达量

结果显示，突变后的表达系统在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的泄露均很低，并且，操纵子pHT-P_F119Y-RBS0-sfGFP表达系统在大肠杆菌泄漏很低，枯草芽孢杆菌中无泄漏(荧光表达量为0)；

在200nM脱水四环素的诱导下，操纵子pHT-P_F119Y-RBS0-sfGFP在大肠杆菌中表达增强，枯草芽孢杆菌中略微减弱。

通过对两个突变位置的单独突变可知，RBS0是通过增强tetR的表达强度以减少启动子的泄漏，但这同时也减弱了整个操纵子的表达强度。119位点的氨基酸突变略微增强了tetR与阻遏蛋白结合位点的亲和力，使操纵子在的泄漏略微降低，操纵子表达强度也略微降低。但当两种突变结合在一起时，操纵子的性能达到最优，在大肠杆菌中泄漏低诱导表达高，在枯草芽孢杆菌中没有泄漏。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统

<130> BAA220189A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtccagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60

ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120

ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180

gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240

aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300

ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360

tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420

actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480

cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540

ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600

cttaaatgtg aaagtgggtc ctaa 624

<210> 2

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu

1 5 10 15

Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln

20 25 30

Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys

35 40 45

Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His

50 55 60

Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg

65 70 75 80

Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly

85 90 95

Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr

100 105 110

Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu

115 120 125

Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr

145 150 155 160

Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu

165 170 175

Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu

180 185 190

Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser

195 200 205

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

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aaaaatattt taaaaacgag caggatttca gaaaaaatcg tggaattgat acactaatgc 60

ttttatatag 70

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaataatca aggtggcaaa aa 22

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtccgt ggagagggtg aaggtgatgc tacaaacgga 120

aaactcaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccgtg gccaacactt 180

gtcactactc tgacctatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca catgaaacgg 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300

aaagatgacg ggacctacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatcgtatcg agttaaaggg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ctcgagtaca actttaactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac gttgaagatg gttccgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtcgacac aatctgtcct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660

cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa 717

<210> 6

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaaaactaa aaaaaatatt gacactctat cattgataga gtataattaa cg 52

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagagggtaa gtaaaagaaa ggaggtttat ttt 33

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taactacata aataaggagg aatcac 26

<210> 10

<211> 8127

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tatgactggt tttaagcgca aaaaaagttg ctttttcgta cctattaatg tatcgtttta 60

gaaaaccgac tgtaaaaagt acagtcggca ttatctcata ttataaaagc cagtcattag 120

gcctatctga caattcctga atagagttca taaacaatcc tgcatgataa ccatcacaaa 180

cagaatgatg tacctgtaaa gatagcggta aatatattga attaccttta ttaatgaatt 240

ttcctgctgt aataatgggt agaaggtaat tactattatt attgatattt aagttaaacc 300

cagtaaatga agtccatgga ataatagaaa gagaaaaagc attttcaggt ataggtgttt 360

tgggaaacaa tttccccgaa ccattatatt tctctacatc agaaaggtat aaatcataaa 420

actctttgaa gtcattcttt acaggagtcc aaataccaga gaatgtttta gatacaccat 480

caaaaattgt ataaagtggc tctaacttat cccaataacc taactctccg tcgctattgt 540

aaccagttct aaaagctgta tttgagttta tcacccttgt cactaagaaa ataaatgcag 600

ggtaaaattt atatccttct tgttttatgt ttcggtataa aacactaata tcaatttctg 660

tggttatact aaaagtcgtt tgttggttca aataatgatt aaatatctct tttctcttcc 720

aattgtctaa atcaatttta ttaaagttca tttgatatgc ctcctaaatt tttatctaaa 780

gtgaatttag gaggcttact tgtctgcttt cttcattaga atcaatcctt ttttaaaagt 840

caatattact gtaacataaa tatatatttt aaaaatatcc cactttatcc aattttcgtt 900

tgttgaacta atgggtgctt tagttgaaga ataaaagacc acattaaaaa atgtggtctt 960

ttgtgttttt ttaaaggatt tgagcgtagc gaaaaatcct tttctttctt atcttgataa 1020

taagggtaac tattgccgat cgtccattcc gacagcatcg ccagtcacta tggcgtgctg 1080

ctagcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc 1140

ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac 1200

gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattcg agctcaggcc 1260

ttaactcaca ttaattgcgt tgcgctttag gacccacttt cacatttaag ttgtttttct 1320

aatccgcata tgatcaattc aaggccgaat aagaaggctg gctctgcacc ttggtgatca 1380

aataattcga tagcttgtcg taataatggc ggcatactat cagtagtagg tgtttccctt 1440

tcttctttag cgacttgatg ctcttgatct tccaatacgc aacctaaagt aaaatgcccc 1500

acagcgctga gtgcatataa tgcattctct agtgaaaaac cttgttggca taaataggct 1560

aattgatttt cgagagtttc atactgtttt tctgtaggcc gtgtacctaa atgtactttt 1620

gctccatcgc gatgacttag taaagcacat ctaaaacttt tagcgttatt acgtaaaaaa 1680

tcttgccagc tttccccttc taaagggcaa aagtgagtat ggtgcctatc taacatctca 1740

atggctaagg cgtcgagcaa agcccgctta ttttttacat gccaatacaa tgtaggctgc 1800

tctacaccta gcttctgggc gagtttacgg gttgttaaac cttcgattcc gacctcatta 1860

agcagctcta atgcgctgtt aatcacttta cttttatcta atctggacat gtgattcctc 1920

cttatttatg tagttactat ataaaagcat tagtgtatca attccacgat tttttctgaa 1980

atcctgctcg tttttaaaat atttttctag aatgaaaggg gattttatgc ttcagaacgc 2040

tcggttgccg ccgggcgttt tttatactag tcaaaaacta aaaaaaatat tgacactcta 2100

tcattgatag agtataatta acgagtgata gcggtaccct cgaagctgtc accggatgtg 2160

ctttccggtc tgatgagtcc gtgaggacga aacagcctct acaaataatt ttgtttaata 2220

gagggtaagt aaaagaaagg aggtttattt tatgagcaaa ggagaagaac ttttcactgg 2280

agttgtccca attcttgttg aattagatgg tgatgttaat gggcacaaat tttctgtccg 2340

tggagagggt gaaggtgatg ctacaaacgg aaaactcacc cttaaattta tttgcactac 2400

tggaaaacta cctgttccgt ggccaacact tgtcactact ctgacctatg gtgttcaatg 2460

cttttcccgt tatccggatc acatgaaacg gcatgacttt ttcaagagtg ccatgcccga 2520

aggttatgta caggaacgca ctatatcttt caaagatgac gggacctaca agacgcgtgc 2580

tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatcgtatc gagttaaagg gtattgattt 2640

taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa actcgagtac aactttaact cacacaatgt 2700

atacatcacg gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagct aacttcaaaa ttcgccacaa 2760

cgttgaagat ggttccgttc aactagcaga ccattatcaa caaaatactc caattggcga 2820

tggccctgtc cttttaccag acaaccatta cctgtcgaca caatctgtcc tttcgaaaga 2880

tcccaacgaa aagcgtgacc acatggtcct tcttgagttt gtaactgctg ctgggattac 2940

acatggcatg gatgagctct acaaataact gcaggtcgac gtccccgggg cagcccgcct 3000

aatgagcggg cttttttcac gtcacgcgtc catggagatc tttgtctgca actgaaaagt 3060

ttatacctta cctggaacaa atggttgaaa catacgaggc taatatcggc ttattaggaa 3120

tagtccctgt actaataaaa tcaggtggat cagttgatca gtatattttg gacgaagctc 3180

ggaaagaatt tggagatgac ttgcttaatt ccacaattaa attaagggaa agaataaagc 3240

gatttgatgt tcaaggaatc acggaagaag atactcatga taaagaagct ctaaaactat 3300

tcaataacct tacaatggaa ttgatcgaaa gggtggaagg ttaatggtac gaaaattagg 3360

ggatctacct agaaagccac aaggcgatag gtcaagctta aagaaccctt acatggatct 3420

tacagattct gaaagtaaag aaacaacaga ggttaaacaa acagaaccaa aaagaaaaaa 3480

agcattgttg aaaacaatga aagttgatgt ttcaatccat aataagatta aatcgctgca 3540

cgaaattctg gcagcatccg aagggaattc atattactta gaggatacta ttgagagagc 3600

tattgataag atggttgaga cattacctga gagccaaaaa actttttatg aatatgaatt 3660

aaaaaaaaga accaacaaag gctgagacag actccaaacg agtctgtttt tttaaaaaaa 3720

atattaggag cattgaatat atattagaga attaagaaag acatgggaat aaaaatattt 3780

taaatccagt aaaaatatga taagattatt tcagaatatg aagaactctg tttgtttttg 3840

atgaaaaaac aaacaaaaaa aatccaccta acggaatctc aatttaacta acagcggcca 3900

aactgagaag ttaaatttga gaaggggaaa aggcggattt atacttgtat ttaactatct 3960

ccattttaac attttattaa accccataca agtgaaaatc ctcttttaca ctgttccttt 4020

aggtgatcgc ggagggacat tatgagtgaa gtaaacctaa aaggaaatac agatgaatta 4080

gtgtattatc gacagcaaac cactggaaat aaaatcgcca ggaagagaat caaaaaaggg 4140

aaagaagaag tttattatgt tgctgaaacg gaagagaaga tatggacaga agagcaaata 4200

aaaaactttt ctttagacaa atttggtacg catatacctt acatagaagg tcattataca 4260

atcttaaata attacttctt tgatttttgg ggctattttt taggtgctga aggaattgcg 4320

ctctatgctc acctaactcg ttatgcatac ggcagcaaag acttttgctt tcctagtcta 4380

caaacaatcg ctaaaaaaat ggacaagact cctgttacag ttagaggcta cttgaaactg 4440

cttgaaaggt acggttttat ttggaaggta aacgtccgta ataaaaccaa ggataacaca 4500

gaggaatccc cgatttttaa gattagacgt aaggttcctt tgctttcaga agaactttta 4560

aatggaaacc ctaatattga aattccagat gacgaggaag cacatgtaaa gaaggcttta 4620

aaaaaggaaa aagagggtct tccaaaggtt ttgaaaaaag agcacgatga atttgttaaa 4680

aaaatgatgg atgagtcaga aacaattaat attccagagg ccttacaata tgacacaatg 4740

tatgaagata tactcagtaa aggagaaatt cgaaaagaaa tcaaaaaaca aatacctaat 4800

cctacaacat cttttgagag tatatcaatg acaactgaag aggaaaaagt cgacagtact 4860

ttaaaaagcg aaatgcaaaa tcgtgtctct aagccttctt ttgatacctg gtttaaaaac 4920

actaagatca aaattgaaaa taaaaattgt ttattacttg taccgagtga atttgcattt 4980

gaatggatta agaaaagata tttagaaaca attaaaacag tccttgaaga agctggatat 5040

gttttcgaaa aaatcgaact aagaaaagtg caataaactg ctgaagtatt tcagcagttt 5100

tttttattta gaaatagtga aaaaaatata atcagggagg tatcaatatt taatgagtac 5160

tgatttaaat ttatttagac tggaattaat aattaacacg tagactaatt aaaatttaat 5220

gagggataaa gaggatacaa aaatattaat ttcaatccct attaaatttt aacaaggggg 5280

ggattaaaat ttaattagag gtttatccac aagaaaagac cctaataaaa tttttactag 5340

ggttataaca ctgattaatt tcttaatggg ggagggatta aaatttaatg acaaagaaaa 5400

caatctttta agaaaagctt ttaaaagata ataataaaaa gagctttgcg attaagcaaa 5460

actctttact ttttcattga cattatcaaa ttcatcgatt tcaaattgtt gttgtatcat 5520

aaagttaatt ctgttttgca caaccttttc aggaatataa aacacatctg aggcttgttt 5580

tataaactca gggtcgctaa agtcaatgta acgtagcata tgatatggta tagcttccac 5640

ccaagttagc ctttctgctt cttctgaatg tttttcatat acttccatgg gtatctctaa 5700

atgattttcc tcatgtagca aggtatgagc aaaaagttta tggaattgat agttcctctc 5760

tttttcttca acttttttat ctaaaacaaa cactttaaca tctgagtcaa tgtaagcata 5820

agatgttttt ccagtcataa tttcaatccc aaatctttta gacagaaatt ctggacgtaa 5880

atcttttggt gaaagaattt ttttatgtag caatatatcc gatacagcac cttctaaaag 5940

cgttggtgaa tagggcattt tacctatctc ctctcatttt gtggaataaa aatagtcata 6000

ttcgtccatc tacctatcct attatcgaac agttgaactt tttaatcaag gatcagtcct 6060

ttttttcatt attcttaaac tgtgctctta actttaacaa ctcgatttgt ttttccagat 6120

ctcgagggta actagcctcg ccgatcccgc aagaggcccg gcagtcaggt ggcacttttc 6180

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 6240

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 6300

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 6360

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 6420

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 6480

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 6540

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 6600

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 6660

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 6720

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 6780

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 6840

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 6900

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 6960

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 7020

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 7080

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 7140

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 7200

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 7260

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 7320

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 7380

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 7440

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 7500

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 7560

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 7620

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 7680

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 7740

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 7800

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 7860

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 7920

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 7980

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 8040

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 8100

gcccaatacg catgcttaag ttattgg 8127

Claims (10)

1.一种阻遏蛋白tetR表达框，其特征在于，所述表达框由启动子P21、RBS序列和阻遏蛋白tetR构成；所述启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.9所示，所述阻遏蛋白tetR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或阻遏蛋白为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的阻遏蛋白tetR的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的。

2.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统由表达载体、权利要求1所述的表达框及目的基因构成，所述目的基因含有P_tet启动子。

3.如权利要求2所述的表达系统，其特征在于，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。

4.如权利要求2或3所述的表达系统，其特征在于，所述表达载体包括但不限于pHT01质粒、pSTOP1622质粒、pJOE8999质粒或pAD123质粒。

5.如权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述P_tet启动子核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中含有权利要求1所述的阻遏蛋白tetR表达框，或权利要求2～5任一所述的表达系统。

7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为表达宿主。

8.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述大肠杆菌包括但不限于E.coliJM109、E.coli JM110、E.coli DH5α或E.coli BL21；所述枯草芽孢杆菌但不限于B.subtilis 168、WB600、WB800。

9.权利要求1所述的阻遏蛋白tetR表达框在采用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌进行目的基因表达中的应用，其特征在于，所述目的基因含有P_tet启动子。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。

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