CN109706168B

CN109706168B - 一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体

Info

Publication number: CN109706168B
Application number: CN201910014720.6A
Authority: CN
Inventors: 李十中; 李鹏松; 付晓芬
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-01-08
Also published as: CN109706168A

Abstract

本发明公开了一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体。该载体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。根据HSF1基因转录起始位点的核苷酸序列，设计靶向HSF1基因的sgRNA特征序列(核苷酸序列如序列表中序列2所示)；将载体自5’至3’起第11874至11881位所示的DNA小片段替换为序列表中序列2所示的核苷酸序列的反向互补序列，得到重组质粒；向马克斯克鲁维酵母中导入重组质粒，得到重组马克斯克鲁维酵母。与马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量显著增加。由此可见，本发明提供的载体可以用于促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体。

背景技术

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)能够在高达45℃条件下生长并进行乙醇发酵，其在分类学上与酿酒酵母具有一定的亲缘性，并与乳酸克鲁维酵母一样获得美国食品添加剂的安全性指标(Generally Regarded as Safe，GRAS)认证和欧洲“安全资格认定”(Qualified Presumption of Safety，QPS)认证。与前两者相比，马克斯克鲁维酵母因其可利用底物广泛、生长速率快、耐热、蛋白分泌能力强以及更适合于生物工程改造与应用而备受工业生产的青睐。

CRISPR/Cas9系统是原核微生物(细菌和古生菌)抵御外部遗传元件(如质粒和噬菌体)的一种免疫系统。其中，CRISPR即成簇规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularly-interspaced short palindromic repeats)的英文缩写，Cas为CRISPR关联蛋白(CRISPR-associated)的英文缩写。CRISPR/Cas9系统仅仅依赖单一蛋白Cas9，由一个crRNA(CRISPR-derived RNA)和一个tracrRNA(trans-activating RNA)融合形成的sgRNA(single guide RNA)引导Cas9对DNA上与sgRNA互补的目的DNA中前20个nt靶定特征序列进行识别与切割，从而引入一个DNA双键断裂(DSB)。研究表明，通过失活Cas9的核酸内切酶的活性而获得了dead Cas9(dCas9)，dCas9只会在sgRNA的引导下特异性的结合到目的位点，而不会产生切割。

发明内容

本发明的目的是在马克斯克鲁维酵母中促进目的基因表达。

本发明首先保护一种载体，可包括表达盒甲和表达盒乙；

所述表达盒甲依次可包括如下元件：启动子甲、dCas9蛋白的编码基因、转录激活因子和终止序列甲；

所述表达盒乙依次可包括如下元件：启动子乙、sgRNA骨架结构和终止序列乙。

所述启动子甲和所述启动子乙可以相同，也可以不同。

所述终止序列甲和所述终止序列乙可以相同，也可以不同。

所述表达盒甲中，dCas9蛋白的氨基酸序列可如序列表中的序列6所示。dCas9蛋白的编码基因可如序列表中序列1自5’末端起第7171至11271位所示。

所述表达盒甲中，转录激活因子可为转录激活因子VP64。所述转录激活因子VP64的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11308至11457位所示。

所述表达盒甲中还可包括一个以上细胞核定位序列。所述细胞核定位序列可为细胞核定位序列SV40。细胞核定位序列SV40的氨基酸序列可为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val。

所述表达盒甲中具体可包括一个细胞核定位序列SV40。所述细胞核定位序列SV40的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第7141至7161位所示。该细胞核定位序列SV40具体可位于启动子甲的下游、dCas9蛋白的编码基因的上游。

所述表达盒甲中，启动子甲可为ADH1启动子。终止序列甲可为ADH1终止子。所述ADH1启动子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第6715至7110位所示。所述ADH1终止子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11473至11660位所示。

所述表达盒乙中，sgRNA骨架结构的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11791至11873位的反向互补序列所示。

所述表达盒乙中，所述启动子乙可为KmSNR52启动子。所述终止序列乙可为SUP4终止子。所述KmSNR52启动子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11882至12412位的反向互补序列所示。所述SUP4终止子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11778至11788位的反向互补序列所示。

所述表达盒乙中，启动子乙和sgRNA骨架结构之间中可具有单克隆位点。所述单克隆位点具体可为限制性内切酶NotI的酶切位点。

上述任一所述表达盒甲的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第6715至11660位所示。

上述任一所述表达盒乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11778至12412位的反向互补序列所示。

上述任一所述载体还可包括表达盒丙；所述表达盒丙依次可包括如下元件：启动子丙、选择标记基因和终止序列丙。

所述表达盒丙中，选择标记基因可为G418抗性基因。所述G418抗性基因可为kanMX6基因。

上述任一所述表达盒丙的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第4348至5704位所示。

上述任一所述载体还可包括特异序列；所述特异序列的功能可为细胞分裂时进行自主复制。所述细胞可为酵母细胞。所述酵母可为马克斯克鲁维酵母。

所述特异序列可包括自主复制序列和着丝粒序列。

所述特异序列的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第2457至3723位所示。

上述任一所述的载体的核苷酸序列具体可如序列表中序列1所示。

本发明还保护X1)或X2)。

X1)上述任一所述载体在促进目的基因的表达中的应用。

X2)上述任一所述载体在促进酵母目的基因的表达中的应用。

本发明还保护促进酵母中目的基因表达的方法。

本发明所保护的促进酵母中目的基因表达的方法，具体为方法一，可包括如下步骤：将上述任一所述载体中表达盒乙的单克隆位点替换为sgRNA特征序列，然后转化出发酵母，筛选，得到重组酵母；所述sgRNA特征序列在出发酵母中的识别的靶标DNA为目的基因转录起始位点上游300bp至下游100bp的DNA片段；与出发酵母相比，重组酵母中目的基因的表达量增加。

本发明所保护的促进酵母中目的基因表达的方法，具体为方法二，可包括如下步骤：向上述任一所述载体中的启动子乙的下游、sgRNA骨架结构的上游导入sgRNA特征序列，然后转化出发酵母，筛选，得到重组酵母；所述sgRNA特征序列在出发酵母中的识别的靶标DNA为目的基因转录起始位点上游300bp至下游100bp的DNA片段；与出发酵母相比，重组酵母中目的基因的表达量增加。

上述任一所述的方法中，所述筛选为借助选择标记基因进行筛选。

上述任一所述的方法中，所述sgRNA特征序列在酵母基因组中识别的靶标DNA具有如下结构5’-N₂₀NGG-3’或5’-N₂₀NAG-3’，N为A、G、C或T。

在本发明的一个实施例中，上述任一所述目的基因可为HSF1基因。

上述任一所述酵母可为马克斯克鲁维酵母。

在本发明的实施例中，根据HSF1基因(genebank号为：AP012213.1)转录起始位点上游300bp至下游100bp的核苷酸序列，设计靶向HSF1基因的sgRNA特征序列gHSF1，gHSF1的核苷酸序列如序列表中序列2所示；然后将pKmCRPa质粒(序列表中序列1所示)自5’至3’起第11874至11881位所示的DNA小片段替换为序列表中序列2所示的核苷酸序列的反向互补序列，得到重组质粒pKmCRPa-gHSF1；向马克斯克鲁维酵母中导入重组质粒pKmCRPa-gHSF1，得到重组马克斯克鲁维酵母。与马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量显著增加。由此可见，本发明提供的载体可以用于促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为pKmCRPa质粒的图谱。

图2为重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

马克斯克鲁维酵母为日本NITE生物资源中心的产品，编号为DMKU3-1042(NBRC104275)。

YPD固体培养基和YPD液体培养基均为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。

YPD平板为将55℃的YPD固体培养基倒入无菌培养皿，自然冷却而成。

实施例1、pKmCRPa质粒的构建及其在马克斯克鲁维酵母中促进目的基因表达的应用

本实施例中，目的基因为HSF1基因。

一、pKmCRPa质粒的构建

本发明的发明人构建了pKmCRPa质粒。pKmCRPa质粒的图谱见图1。

pKmCRPa质粒(环形)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列1中，自5’至3’起，第2457至3723位为马克斯克鲁维酵母的自主复制序列和着丝粒序列，第4348至5704位为含有G418抗性基因kanMX6的表达盒的核苷酸序列，第6715至7110位为ADH1启动子的核苷酸序列，第7141至7161位为细胞核定位序列SV40的核苷酸序列，第7171至11271位为dCas9蛋白的编码基因，第11308至11457位为转录激活因子VP64的核苷酸序列，第11473至11660位为ADH1终止子的核苷酸序列，第11778至11788位为SUP4终止子核苷酸序列的反向互补序列，第11791至11873位为sgRNA骨架结构的核苷酸序列的反向互补序列，第11874至11881位为限制性内切酶NotI识别位点的核苷酸序列，第11882至12412位为KmSNR52启动子的核苷酸序列的反向互补序列。

表达盒甲的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第6715至11660位所示。

表达盒乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11778至12412位的反向互补序列所示。

二、pKmCRPa质粒在马克斯克鲁维酵母中促进HSF1基因表达的应用

1、根据HSF1基因(genebank号为：AP012213.1)转录起始位点上游300bp至下游100bp的核苷酸序列，设计靶向HSF1基因的sgRNA特征序列gHSF1。

gHSF1的核苷酸序列为：5’-agctttcgactacaacttta-3’(序列表中序列2)。

2、完成步骤1后，根据pKmCRPa质粒和gHSF1的核苷酸序列，设计并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物gHSF1-F和引物gHSF1-R。

引物gHSF1-F：

(方框为表达盒乙中限制性内切酶NotI识别序列的上游序列，双下划线为gHSF1的核苷酸序列)(序列表中序列3)。

引物gHSF1-R：

(方框为表达盒乙中限制性内切酶NotI识别序列的下游序列的反向互补序列，双下划线为gHSF1的核苷酸序列的反向互补序列)(序列表中序列4)。

3、完成步骤2后，用去离子水分别将引物gHSF1-F和引物gHSF1-R稀释至100μM，得到引物gHSF1-F稀释液和引物gHSF1-R稀释液；然后将引物gHSF1-F稀释液和引物gHSF1-R稀释液混合，进行退火、延伸反应，得到含有gHSF1的DNA片段。该DNA片段的核苷酸序列为：5’-caacgtccgcagttcgaatcagctttcgactacaactttagttttagagctagaaatagc-3’(序列表中序列5)。

4、取pKmCRPa质粒，用限制性内切酶NotI酶切，得到线性化的pKmCRPa质粒。

5、采用Gibson Assembly技术将步骤3得到的DNA片段和步骤4得到的线性化的pKmCRPa质粒进行重组，得到重组质粒pKmCRPa-gHSF1。

将重组质粒pKmCRPa-gHSF1进行测序。根据测序结果，对重组质粒pKmCRPa-gHSF1的结构描述如下：将序列表中序列1自5’至3’起第11874至11881位所示的DNA小片段替换为序列表中序列2所示的核苷酸序列的反向互补序列，得到重组质粒。

6、将重组质粒pKmCRPa-gHSF1电击转化马克斯克鲁维酵母，然后涂布于含200μg/mL G418硫酸盐的YPD平板上，30℃培养48h，得到若干个重组马克斯克鲁维酵母。

7、完成步骤6后，随机将其中一个重组马克斯克鲁维酵母的单克隆接种于5mL YPD液体培养基，30℃培养16h，得到培养菌液。

8、完成步骤7后，取所述培养菌液，4℃、12000离心10min，收集菌体。

9、完成步骤8后，取所述菌体，提取总RNA，然后反转录，得到重组马克斯克鲁维酵母的cDNA。

10、完成步骤9后，以重组马克斯克鲁维酵母的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量(以TAF10基因(genebank号为：NC_036029.1)为内参基因)。

检测HSF1基因的引物为5’-CGGAGTCGTCAAGAAGGGAG-3’和5’-GTGGTGCGTTTGGCTGTATC-3’。

检测TAF10基因的引物为5’-ATGGACAAGCAAGAGCCAGG-3’和5’-AACCGTATTCAGCGACAGCA-3’。

11、按照步骤6-10的方法，将步骤6中的重组质粒pKmCRPa-gHSF1替换为pKmCRPa质粒，其它步骤均不变，得到重组马克斯克鲁维酵母(空载体)中HSF1基因的相对表达量，作为对照。

12、按照步骤7-10的方法，将步骤7中的“随机将其中一个重组马克斯克鲁维酵母的单克隆”替换为马克斯克鲁维酵母的单克隆，其它均不变，得到马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量，作为对照。

将马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量作为1，重组马克斯克鲁维酵母和重组马克斯克鲁维酵母(空载体)中HSF1基因的相对表达量见图2(pKmCRPa-gHSF1为重组马克斯克鲁维酵母，pKmCRPa为重组马克斯克鲁维酵母(空载体))。结果表明，与马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量显著增加；重组马克斯克鲁维酵母(空载体)和马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量无显著差异。

由此可见，向马克斯克鲁维酵母中导入重组质粒pKmCRPa-gHSF1可以促进HSF1基因的表达。

<110> 清华大学

<120> 一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12542

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag 60

tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg 120

cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta 180

aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata 240

ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc 300

ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga 360

agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct 420

tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg 480

tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta 540

ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat 600

gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt 660

acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga 720

tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga 780

gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga 840

actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc 900

aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc 960

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tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat 1080

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tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct 1200

ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 1260

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 1320

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 1380

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 1440

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 1500

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 1560

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 1620

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 1680

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 1740

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 1800

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 1860

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 1920

gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 1980

cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 2040

gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 2100

ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 2160

gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca 2220

cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 2280

accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg 2340

cagctgggcc attctcatga agaatatctt gaatttattg tcatattact agttggtgtg 2400

gaagtccata tatcggtgat caatatagtg gttgacatgc tggctagtca acattggagc 2460

tcctttcatt tctgataaaa gtaagattac tccatttatc ttttcaccaa catattcata 2520

gttgaaagtt atccttctaa gtacgtatac aatattaatt aaacgtaaaa acaaaactga 2580

ctgtaaaaat gtgtaaaaaa aaaatatcaa attcatagca gtttcaagga atgaaaacta 2640

ttatgatctg gtcacgtgta tataaattat taattttaaa cccatataat ttattatttt 2700

tttattctaa agtttaaagt aattttagta gtattttata ttttgaataa atatacttta 2760

aatttttatt tttatatttt attactttta aaaataatgt ttttatttaa aacaaaatta 2820

taagttaaaa agttgttccg aaagtaaaat atattttata gtttttacaa aaataaatta 2880

tttttaacgt atttttttta attatatttt tgtatgtgat tatatccaca ggtattatgc 2940

tgaatttagc tgtttcagtt taccagtgtg atagtatgat tttttttgcc tctcaaaagc 3000

tattttttta gaagcttcgt cttagaaata ggtggtgtat aaattgcggt tgacttttaa 3060

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ttgaaatgat tgatatgttg gtggattttc tctgattttc aaacaagagg tattttattt 3300

catatttatt atatttttta catttatttt atattttttt attgtttgga agggaaagcg 3360

acaatcaaat tcaaaatata ttaattaaac tgtaatactt aataagagac aaataacagc 3420

caagaatcaa atactgggtt tttaatcaaa agatctctct acatgcaccc aaattcatta 3480

tttaaattta ctatactaca gacagaatat acgaacccag attaagtagt cagacgcttt 3540

tccgctttat tgagtatata gccttacata ttttctgccc ataatttctg gatttaaaat 3600

aaacaaaaat ggttactttg tagttatgaa aaaaggcttt tccaaaatgc gaaatacgtg 3660

ttatttaagg ttaatcaaca aaacgcatat ccatatgggt agttggacaa aacttcaatc 3720

gattgcaggc aagtgcacaa acaatactta aataaatact actcagtaat aacctatttc 3780

ttagcatttt tgacgaaatt tgctattttg ttagagtctt ttacaccatt tgtctccaca 3840

cctccgctta catcaacacc aataacgcca tttaatctaa gcgcatcacc aacattttct 3900

ggcgtcagtc caccagctaa cataaaatgt aagctcgaat ttcgagaaag tgcccatcag 3960

tgttcatatt tgttacaaag tggttttctg atttggtact actgcagagg cgtatttttt 4020

gcttcagtta ccatagcgta agaacactag cgacttttgt tcgtgaacca acagagtagg 4080

atttctactg ctacatctct taggtagttg gttagtccga tcgctcactt ttggttgttg 4140

ttaagtactt cataagttta tccttttcct ttttcacact gagctacttt gggtatagct 4200

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cggttttcat attttaaaaa gcttttaatc attcctttgc gtagatctgt ttagcttgcc 4320

tcgtccccgc cgggtcaccc ggccagcgac atggaggccc agaataccct ccttgacagt 4380

cttgacgtgc gcagctcagg ggcatgatgt gactgtcgcc cgtacattta gcccatacat 4440

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ttctttcata tacttccttt taaaatcttg ctaggataca gttctcacat cacatccgaa 4680

cataaacaac catgggtaag gaaaagactc acgtttcgag gccgcgatta aattccaaca 4740

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caatctatcg attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag 4860

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tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca 4980

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ttaatcaaat gttagcgtga tttatatttt ttttcgcctc gacatcatct gcccagatgc 5640

gaagttaagt gcgcagaaag taatatcatg cgtcaatcgt atgtgaatgc tggtcgctat 5700

actgctgtcg attcgatact aacgccgcca tccagtttaa actgagtatt ttatctgcaa 5760

ttacggatac ggttggtctt atgtagatac atataaatat atatcttttt ctttcttttt 5820

cttagtcagg attgtcgttt agcataatat acatgtagtt tatttaatca cataccactg 5880

attatcttta gaattttata aatttttgaa ataaatgggt ggcttttaat ggtgtctatg 5940

ttaagtgagg cttttagaat gctcttcctg ctttgtttat tatatgtgta tgaaagatat 6000

gtatgtattt acatgtgttt gtagcgtccc cagtcaaaac ctgtgcgcta tacctaaatg 6060

gattgataat cttcattcac taattctaaa atagacttct tccccaaaga acggtgtaac 6120

gatgaggctc tatccagctg cttatctaaa tcaactttaa cgatggatga tcttatgaca 6180

cggggatctt tctttaaagt tcttagaatt tcagactgta ccgcagctga tgaatcaaac 6240

agcattaaaa agtgatatgc tcgaaaatgt ttttcctggt ctttcttcat tattttagga 6300

agatacctta tgcccatggg tacaatgtcc ctcaccacac ctctgttttg aataatcagt 6360

ttcccgattg tggaagacaa ttcttttgct tccaactttg gcgcattgga gttggttatg 6420

cgaacaagtc cgatcagctc ataaagcatc ttagtgaaaa gggtggtttt gcgttattct 6480

ttcctctgga tcctctagct ccctaacatg taggtggcgg aggggagata tacaatagaa 6540

cagataccag acaagacata atgggctaaa caagactaca ccaattacac tgcctcattg 6600

atggtggtac ataacgaact aatactgtag ccctagactt gatagccatc atcatatcga 6660

agtttcacta ccctttttcc atttgccatc tattgaagta ataataggcg catgcaactt 6720

cttttctttt tttttctttt ctctctcccc cgttgttgtc tcaccatatc cgcaatgaca 6780

aaaaaatgat ggaagacact aaaggaaaaa attaacgaca aagacagcac caacagatgt 6840

cgttgttcca gagctgatga ggggtatctc gaagcacacg aaactttttc cttccttcat 6900

tcacgcacac tactctctaa tgagcaacgg tatacggcct tccttccagt tacttgaatt 6960

tgaaataaaa aaagtttgct gtcttgctat caagtataaa tagacctgca attattaatc 7020

ttttgtttcc tcgtcattgt tctcgttccc tttcttcctt gtttcttttt ctgcacaata 7080

tttcaagcta taccaagcat acaatcaact ggtacccggg ccgccaccat gtctagagcc 7140

ccaaagaaga agagaaaagt tagacccggg gataagaaat actctattgg tttggctatc 7200

ggtacaaact ctgttggttg ggctgttatt actgatgaat acaaggttcc atccaagaag 7260

ttcaaggttt tgggtaacac tgatagacac tccatcaaaa agaacttgat tggtgccttg 7320

ttgttcgatt ctggtgaaac tgctgaagct actagattga aaagaaccgc tagaagaaga 7380

tacaccagaa gaaagaacag aatctgctac ttgcaagaaa tcttctccaa cgaaatggcc 7440

aaggttgatg attcattctt ccacagattg gaagaatcct tcttggtcga agaagataag 7500

aagcacgaaa gacatccaat cttcggtaac atcgttgatg aagttgctta ccacgaaaag 7560

tacccaacta tctaccattt gagaaagaag ttggttgact ctaccgataa ggctgatttg 7620

agattgatct atttggcttt ggcccacatg attaagttca gaggtcattt cttgatcgaa 7680

ggtgatttga acccagataa ctccgatgtt gataagttgt tcatccaatt agtccaaacc 7740

tacaatcaat tattcgaaga aaacccaatc aacgcctctg gtgttgatgc taaagctatt 7800

ttgtctgcca gattgtccaa gtccagaaga ttagaaaatt tgatcgccca attaccaggt 7860

gaaaagaaga atggtttgtt cggtaatttg attgccttgt ctttgggttt gactccaaac 7920

ttcaagtcca atttcgattt ggctgaagat gccaagttgc aattatctaa ggatacctac 7980

gatgacgatt tggataactt gttggctcaa atcggtgatc aatacgctga tttgtttttg 8040

gctgctaaga acttgtccga tgccattttg ttgtccgata ttttgagagt caacaccgaa 8100

attactaagg ctccattgtc tgcctctatg atcaaaagat acgatgaaca ccaccaagac 8160

ttgactttgt tgaaggcttt ggtcagacaa caattacctg aaaagtacaa agaaattttc 8220

ttcgatcaat ccaagaacgg ttacgccggt tatattgatg gtggtgcttc tcaagaagaa 8280

ttttacaagt tcatcaagcc aatcttggaa aagatggacg gtactgaaga attattggtc 8340

aagttgaaca gagaagattt gttgagaaag caaagaacct tcgacaacgg ttctattcca 8400

catcaaattc acttgggtga attgcacgca attttgagaa gacaagaaga tttttatcca 8460

ttcttgaagg acaacagaga aaagatcgaa aagattctga ccttcagaat cccttactac 8520

gttggtccat tggctagagg taattcaaga tttgcctgga tgactagaaa gtccgaagaa 8580

actattactc cttggaactt cgaagaagtt gtagataagg gtgcttctgc ccaatccttt 8640

attgaaagaa tgaccaactt cgacaagaac ttgccaaacg aaaaggtttt gccaaagcac 8700

tctttgttgt acgaatactt caccgtctac aacgaattga ctaaggttaa gtacgtcacc 8760

gaaggtatga gaaaaccagc ttttttatcc ggtgaacaaa agaaggctat cgtcgatttg 8820

ttgttcaaga ccaacagaaa ggttactgtc aagcaattaa aagaagatta cttcaagaaa 8880

atcgaatgct tcgactccgt tgaaatttct ggtgtcgaag atagattcaa tgcctcttta 8940

ggtacttacc atgacttgtt gaaaatcatc aaggacaagg atttcttgga caacgaagaa 9000

aacgaagata ttttggaaga tattgtcttg acattgacct tgtttgaaga tagagaaatg 9060

attgaagaaa gattgaaaac ctacgcccac ttgttcgatg ataaggttat gaagcaatta 9120

aagagaagaa gatacactgg ttggggtaga ttgtccagaa aattgattaa cggtatcaga 9180

gacaagcaat ccggtaagac cattttggac tttttgaagt ctgatggttt cgctaacaga 9240

aacttcatgc aattaatcca cgacgattcc ttgactttca aagaagatat acaaaaggcc 9300

caagtctctg gtcaaggtga ttctttacat gaacatatcg ctaacttggc tggttctcca 9360

gctattaaga agggtatttt acaaaccgtt aaggtcgttg acgaattggt caaagttatg 9420

ggtagacata agccagaaaa catcgttatc gaaatggcta gagaaaatca aaccacccaa 9480

aagggtcaaa agaactccag agaaagaatg aagagaatcg aagaaggtat caaagaattg 9540

ggttcccaaa ttttgaaaga acacccagtt gaaaacaccc aattacaaaa cgaaaagttg 9600

tacttgtact acttgcaaaa cggtagagat atgtacgttg accaagaatt ggacatcaac 9660

agattgtctg attacgatgt tgacgctatc gttccacaat cttttttgaa ggatgactcc 9720

attgacaaca aggtcttgac tagatccgat aagaatagag gtaagtccga taacgttcca 9780

tctgaagaag tcgttaagaa aatgaagaac tattggagac aattattgaa cgccaagttg 9840

atcacccaaa gaaagtttga caatttgacc aaggctgaaa gaggtggttt gtctgaattg 9900

gataaggcag gtttcatcaa aagacaatta gtagaaacca gacaaatcac caagcacgtt 9960

gctcaaattt tggatagtag aatgaacact aagtacgacg aaaacgacaa attgatcaga 10020

gaagttaagg tcattacctt gaagtccaag ttggtttccg atttcagaaa ggacttccaa 10080

ttctacaagg tcagagaaat caacaactac catcatgcac atgatgctta cttgaatgct 10140

gttgttggta ctgccttgat taagaagtat ccaaagttgg aatccgaatt tgtctacggt 10200

gattacaagg tttacgacgt tagaaagatg atcgccaagt ccgaacaaga aattggtaaa 10260

gctactgcca aatacttctt ctactccaat attatgaatt tctttaagac cgaaatcact 10320

ttggccaacg gtgaaattag aaaaagacca ttgattgaaa ctaatggtga aacaggtgaa 10380

atcgtttggg ataagggtag agattttgcc actgttagaa aggtattgtc catgccacaa 10440

gtaaacatcg tcaaaaagac cgaagttcaa actggtggtt tctccaaaga atccattttg 10500

cctaagagaa actccgataa gttgatcgct agaaaaaaag actgggaccc aaaaaagtac 10560

ggtggttttg attctccaac tgttgcttac tctgttttgg ttgttgctaa ggtcgaaaag 10620

ggtaagagta agaagttgaa gtccgtcaaa gaattattag gtatcactat catggaaaga 10680

tcctcattcg aaaagaatcc tatcgacttt ttggaagcca agggttacaa agaagtcaag 10740

aaggacttga tcattaagtt gccaaagtac agtttgttcg aattggaaaa tggtagaaag 10800

agaatgttgg cttctgccgg tgaattacaa aagggtaatg aattggcttt gccatccaag 10860

tacgttaatt tcttatactt ggcctcccac tacgaaaaat tgaaaggttc tcctgaagat 10920

aacgaacaaa agcaattatt tgtcgaacaa cacaagcact acttggacga aatcattgaa 10980

caaatttccg aattttccaa aagagtcatt ttggctgacg ccaatttgga caaagttttg 11040

tcagcttaca acaagcacag agataagcca attagagaac aagctgaaaa catcattcac 11100

ttgttcactt tgactaactt gggtgctcca gctgctttta agtatttcga taccactatc 11160

gacagaaaga gatacacctc taccaaagaa gttttggacg ctactttgat ccaccaatct 11220

attactggtt tgtacgaaac tagaatcgac ttgtctcaat taggtggtga tggttctggt 11280

agatctggag tcgacggtgg aggttctgac gctttggacg acttcgactt ggatatgctg 11340

ggttctgatg cgctagatga ctttgacctc gacatgcttg gaagtgacgc cttagatgat 11400

tttgacctgg atatgcttgg atcagacgct ctggacgatt tcgacttaga catgctttcc 11460

taggaactcg aggcgaattt cttatgattt atgattttta ttattaaata agttataaaa 11520

aaaataagtg tatacaaatt ttaaagtgac tcttaggttt taaaacgaaa attcttattc 11580

ttgagtaact ctttcctgta ggtcaggttg ctttctcagg tatagcatga ggtcgctctt 11640

attgaccaca cctctaccgg catgccgagc aaatgcctgc aaatcgctcc ccatttctct 11700

agagcggccg tggtatcgtt tagattggca attacagtgt cttagctcac atgcttataa 11760

ctaattacat gactcgacat aaaaaacaaa aaaagcacca ccgactcggt gccacttttt 11820

caagttgata acggactagc cttattttaa cttgctattt ctagctctaa aacgcggccg 11880

cgattcgaac tgcggacgtt gcgaatcccg ccctgtcagg cgagaataca gcgcgcgcac 11940

tccgggcgga ccgcctgatc cgcgcttttc aacttatttt ttttgttgtt tttctcgaaa 12000

cacatcgcaa tctgggggcc cggaccgcta cactacgagg ggtcctaagg cagtacaaga 12060

tgcgaggggg gaaacacagg gccagggtaa cgtcacgtgg ccttctcatt cccaaaagaa 12120

aaaataaaaa aaggggaccg taccgtaccg tgtccgccaa gtccacctga tacgagcatc 12180

atcaccctgc acgaagtgta cttcgcgtac atttcaaagt cagggtaata caggggcaca 12240

cacctgggta actgtttttt cttccctctg gggccatact caagctggcg atttcgcccg 12300

gcaatgcctc ctgacaatgc ctcctgacaa tgcctccagg cataccgtct ggcatacgcc 12360

ttgtataccg ccctgtatac cgccttgtat atcgcctgcc ctatttgcgg caacccaatt 12420

gtagatatgc taactccagc aatgagttga tgaatctcgg tgtgtatttt atgtcctcag 12480

aggacaacac ctgttgtaat cgttcttcca cacggatcca cagcctagcc ttcagtcgag 12540

gc 12542

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

agctttcgac tacaacttta 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

caacgtccgc agttcgaatc agctttcgac tacaacttta 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gctatttcta gctctaaaac taaagttgta gtcgaaagct 40

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

caacgtccgc agttcgaatc agctttcgac tacaacttta gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 6

<211> 1367

<212> DNA

<213> PRT

<220>

<223>

<400> 6

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

305 310 315 320

Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

595 600 605

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

610 615 620

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

945 950 955 960

Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

995 1000 1005

Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr

1025 1030 1035

Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn

1040 1045 1050

Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr

1055 1060 1065

Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg

1070 1075 1080

Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu

1085 1090 1095

Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

1100 1105 1110

Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

1115 1120 1125

Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu

1130 1135 1140

Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

1145 1150 1155

Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

1160 1165 1170

Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu

1175 1180 1185

Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

1190 1195 1200

Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

1205 1210 1215

Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn

1220 1225 1230

Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro

1235 1240 1245

Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg

1265 1270 1275

Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

1280 1285 1290

Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

1295 1300 1305

Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

1310 1315 1320

Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

1325 1330 1335

Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

1340 1345 1350

Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

Claims

1.一种载体在促进马克斯克鲁维酵母表达HSF1基因中的应用，其特征在于：所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；将所述载体中限制性内切酶NotI的酶切位点替换为SEQID NO：2所示的sgRNA特征序列。

2.一种促进马克斯克鲁维酵母中HSF1基因表达的方法，包括如下步骤：将权利要求1中所述载体中限制性内切酶NotI的酶切位点替换为SEQ ID NO：2所示的sgRNA特征序列，然后转化出发马克斯克鲁维酵母，筛选，得到重组马克斯克鲁维酵母；与出发马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的表达量增加。

3.一种促进马克斯克鲁维酵母中HSF1基因表达的方法，包括如下步骤：向权利要求1中所述载体中的启动子乙的下游、sgRNA骨架结构的上游导入SEQ ID NO：2所示的sgRNA特征序列，然后转化出发马克斯克鲁维酵母，筛选，得到重组马克斯克鲁维酵母；与出发马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的表达量增加；

所述启动子乙的核苷酸序列如SEQ ID NO：1自5’末端起第11882至12412位的反向互补序列所示；

所述sgRNA骨架结构的核苷酸序列如SEQ ID NO：1自5’末端起第11791至11873位的反向互补序列所示。