CN109593772B - CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法 - Google Patents

CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法 Download PDF

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Abstract

CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法，属于生物技术领域。CRISPR/Cas9质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明使用CRISPR/Cas9技术构建了用于茭白人工育种的CRISPR/Cas9质粒，通过该质粒转化菰黑粉菌，可得到基因敲除菌株，有利于更加便捷高效地用于茭白的人工育种等。

Description

CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法。
背景技术
菰黑粉菌（Ustilago esculenta）是一种独特的病原真菌，其侵染茭白植株（Zizania latifolia）后可抑制植株抽穗开花并刺激茎基部膨大形成可食用的茭白。在东亚及东南亚地区尤其是中国，茭白是一种营养很高的水生蔬菜，也是一种重要的药材。但茭白的育种一直采用很古老的方法，耗费了巨大的人力物力，科研工作者一直致力于优化茭白的人工育种。
CRISPR/Cas9 技术是近几年来快速发展的一种基因编辑技术，现已被成功运用于许多植物的基因组编辑中。
基于上述问题，申请人成功构建CRISPR/Cas9质粒，经试验发现该质粒经原生质体转化，可敲除菰黑粉菌中的特定基因，得到缺失菌株，将缺失菌株接种茭白植株后获得正常孕茭的茭白。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法的技术方案。
所述的一种含有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的CRISPR/Cas9质粒。
所述的CRISPR/Cas9质粒在茭白人工育种中的应用。
所述的CRISPR/Cas9质粒作为菰黑粉菌UET1或UET2敲除基因的原核表达载体的应用。
所述的CRISPR/Cas9质粒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）使用限制性内切酶ACC65 I将pMS7质粒进行单酶切，使其线性化并回收片段，所述pMS7质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
2）将Itd1基因序列、scaffold、U6终止子合成一个长片段Itd1-CRISPR，所述的Itd1-CRISPR的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，将长片段Itd1-CRISPR和线性pMS7质粒连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆培养后测序验证，提取重组质粒，即得CRISPR/Cas9质粒。
所述的CRISPR/Cas9质粒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备菰黑粉菌UET1或UET2原生质体；
2）将CRISPR/Cas9质粒转化至菰黑粉菌UET1或UET2原生质体中；
3）通过YEPS+Cbx平板筛选，得到基因敲除菌株。
本发明使用CRISPR/Cas9技术构建了用于茭白人工育种的CRISPR/Cas9质粒，通过该质粒转化菰黑粉菌，可得到基因敲除菌株，有利于更加便捷高效地用于茭白的人工育种等。
附图说明
图1为pMS7质粒图谱；
图2为CRISPR/Cas9质粒图谱
图3为pMS7质粒经单酶切电泳图；
图4 为CRISPR/Cas9质粒构建图；
图5为 测序结果图；
图6为人工接种孕出正常茭白图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实例1： pMS7质粒的提取
使用美基生物去内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒的提取，具体步骤如下：
1.将含有pMS7质粒的菌接种于含有15ml-20ml LB/羧苄培养液的培养瓶中，37℃摇床培养12-16h扩增质粒。
2. 3,000-5,000 x g 离心 10 分钟，收集 10～15ml 菌体。
3.倒弃培养基，在吸水纸上轻轻拍打吸尽残液。加入600µl Buffer E1/RNase A，高速涡旋充分重悬细菌。使用前，须把 RNase A 加到 Buffer E1 中。彻底重悬细菌对产量很关键，重悬后应看不到细菌团块。
4.加入 600µl Buffer E2至重悬液中，颠倒混匀 6～8次。室温放置 1～2 分钟，其间颠倒混匀 2～3 次。轻轻颠倒混匀，不要涡旋。充分裂解后，溶液变得粘稠而透亮。处理多个样品时，总操作时间不要超过4分钟。
5.加入600µl Buffer E3至裂解液倒中，立即颠倒 10～15次。加入 Buffer E3后，应立即颠倒混匀，以防止沉淀团聚而影响中和效果。混匀过程须轻柔而充分。
6. 13,000 x g 离心 10 分钟。
7. 小心转移上清至 4～10ml离心管中，加入1/3倍体积的 Buffer E4至上清中，颠倒混匀 6～8次。低温下 Buffer E4 有沉淀析出，55℃温浴 10～15 分钟使沉淀充分溶解后再使用。
8. 将HiPure EF Mini Column 套在收集管中。转移750µl 混合液至柱子中，10,000× g 离心15～60秒。
9. 倒弃滤液，把柱子套回收集管中，继续转移剩余的混合液至柱子中。10,000 ×g 离心 15～60 秒；重复此步直至所有混合液都转移至柱子中离心过滤。
10. 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入650µl Buffer E5至柱子中。10,000 ×g离心 15～60 秒。
11. 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入650µl Buffer PW2( 已加无水乙醇稀释)至柱子中。10,000 × g 离心15～60秒。
12. 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。10,000 x g 离心 2 分钟。
13. 把柱子套在灭菌的1.5ml离心管中。加入30～80µl Buffer TE 至柱子的膜中央 。静置 2 分钟，10,000 × g 离心1分钟洗脱DNA。
14. 弃去柱子，把质粒保存于-20℃。
实例2：pMS7质粒线性化
酶切体系（30 ul）
PMS7质粒DNA 4 ul
Acc65I HF(neb) 1 ul
1x Qcut Buffer 3 ul
dd H2O 22 ul
在37℃下，酶切2h。
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收。置于﹣20℃冰箱备用。pMS7质粒图谱如图1所示。pMS7质粒经单酶切如图3所示，使用限制性内切酶Acc65I将pMS7质粒进行单酶切，得到线性化片段，进行割胶回收，得到目的片段。pMS7质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实例3：Itd1基因序列长片段与单酶切开的pMS7载体连接
为完成此步骤，使用南京诺维赞生物科技有限公司生产的ClonExpress II OneStep Cloning Kit重组克隆试剂盒。将Itd1基因的部分片段序列（如SEQ ID No.2所示）、scaffold、U6终止子合成一个长片段Itd1-CRISPR，所述的Itd1-CRISPR的核苷酸序列如SEQID No.4所示。具体步骤如下所示：
1）于冰上配制以下反应体系
组分（20 ul）
pMS7线性化载体 1.5ul
Itd1-CRISPR 1ul
5×CEⅡ buffer 4 ul
ExnaseⅡ 2ul
dd H2O 11.5ul
(注：ClonExpress® II 重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03 pmol， 最适插入片段使用量为0.06 pmol(载体与插入片段摩尔比为1 : 2)。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol) ；最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol))。
2）使用移液器轻轻吹打混匀，（请勿震荡混匀），短暂离心反应液收集至管底。
3）37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
实例4：重组产物转化
1）于- 80℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞（100μL），冰上放置溶解，做好标记；
2）加入10 μL连接产物，小心吹打混匀，冰上放置20～30 min；（备注：该过程用于使连接产物充分吸附到感受态细胞表面）
3）42℃水浴热激90 s ，快速放置到冰上冷却，并保持3-5 min；
4）加入800 μL LB培养基，37 ℃，200 rpm培养1 h；
5）8000 rpm，2 min离心；
6）移除约700 μL培养基，剩余100 μL培养基吹打混匀，涂相应抗性的平板，37 ℃倒置培养10-14 h；
7）挑取单菌落，挑单菌落于2 mL离心管，离心管中加入1 mL加入抗生素的LB液体培养基，37 ℃，180 rpm培养4-8 h即可进行菌液PCR验证。
将菌液PCR条带相符的菌液送到上海桑尼测序公司进行测序。测序正确的菌液扩摇并提质粒，将其命名为CRISPR/Cas9质粒。该质粒图谱如图2所示， CRISPR/Cas9质粒核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。CRISPR/Cas9质粒构建如图4所示。
实例5：UET1/ UET2原生质体的制备
1、菌株培养：
从平板上挑UET1和UET2单菌落分别接种到15-20mL YEPS液体培养基中，28℃，180rpm摇床振荡预培养至OD600为0.8-1.5之间（约24 h）。
将小摇的菌液5 mL接种到新的50 mL YEPS液体培养基中继续培养至OD600为0.6～0.8，（6～8 h），最长时间不超过12 h。
2、原生质体制备
（1）取少许培养好的菰黑粉菌置于载玻片上在显微镜下观察，确认无污染；
（2）将50 mL菌液收集到50 mL的无菌管中，常温3000rpm，离心5 min，弃上清；
（3）将菌体重悬于25 mL SCS中，常温3000 rpm，离心5min，弃上清；
（4）加入配制好的2mL SCS/lywallzyme重悬菌体（轻柔吹打，避免产生过多气泡）；
（5）室温（25℃左右）水平慢速摇床（50 rpm以下）上酶解（MT型约40～50 min），每隔约10分钟取样观察，最终时间以酶解效果为准，原生质体产生量约为50%，几乎所有细胞开始产生原生质体时进行下一步；
（6）在菌液中加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；
（7）再次加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；
（8）再次加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；
（9）将细胞重悬于10 mL预冷的STC中，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；
（10）将细胞重悬于500 μL预冷的STC（山梨醇）中，冰上放置，分装到提前在-80℃冰箱中预冷的1.5 mL离心管中，每管50 μL，置于-80℃冰箱中保存。
实例6：UET1和 UET2原生质体转化
1、取两瓶Regenerations-Agar（蔗糖）微波加热至融化，冷却至60℃后取其中一瓶培养基加入萎锈灵（10 mg/mL）使萎锈灵终浓度为50μg/mL后倒平板，每个平皿上倒约10 mL培养基（可略厚），另一瓶暂时放置在60℃烘箱中保温；
2、取原生质体冰上放置10 min；
3、各原生质体中分别加入1 μL Heparin；
4、每管加入总量为1～5 μg的准备好的CRISPR/Cas9质粒DNA（体积不允许超过10μL）；
轻轻吹打两三下混匀，冰浴10 min。在此期间，自烘箱中取出未加抗生素的100ml的Regenerations-Agar培养基，在已凝固的含萎锈灵的Regenerations-Agar平板上再倒一层培养基，每个平板倒约10 mL培养基（可略薄），制成再生平板；
5、每管原生质体中加入500 μL STC-PEG（蔗糖），轻轻颠倒两下混匀后冰上放置15min；
6、将冰上放置15 min后的原生质体全部加入到相应抗性的再生平板上，颠倒涂板；
7、将涂好的平板正置放在28 ℃培养箱中培养3-4天等表面干燥后倒置，再培养2-5天筛选转化子。
实例7：转化子验证
将再生平板上长出的转化子，继代于YEPS加入萎锈灵（终浓度为50μg/mL）抗性的平板上扩大培养。2-3天后，将YEPS+Cbx平板上的转化子继代到新的YEPS+Cbx平板，此步骤的关键是一定要划出单菌落。将继代好的平板置于28℃培养2天。2天后，从平板上挑取单菌落到加入2ml YEPS液体培养基的10ml离心管中，置于28℃摇床中，摇菌24h，24h后吸取2ul菌液到YEPS+Cbx的平板上（依旧是要划出单菌落）菌在YEPS平板长48h左右后，继续挑取单菌落到YEPS液体培养基中摇菌。一直重复此过程，培养到六代。当培养到第六代时，吸取2ul菌液在YEPS+Cbx平板上划出单菌落，再吸取2ul菌液到YEPS平板上点点，这样重复三代，即可看到YEPS+Cbx平板上有菌落生长而YEPS平板上不再有菌落生长，此时将 YEPS+Cbx平板上的菌提DNA进行PCR验证并送测序公司进行测序，测序结果如图5所示：A图结果表示有两个碱基发生突变，B图结果显示有四个碱基发生突变。
实例8 敲除转化子接种验证
1）将实例7得到的测序结果显示发生碱基突变的菌株在YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD600为0.8-1.0，离心收集菌体，用0.5×YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD600为2.0-3.0的菌液，将该菌液用于接菌；
2）将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，温室培养15-20天，以萌发有3个以上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理；
3）将步骤1）得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止；
4）将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，22-25℃温室黑暗放置12-24 h；
5）将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合菌液倒入土中，22-25℃温室黑暗培养7 d，完成接种；
6）将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥参考正常茭白种植标准。
用实施例8中人工接种方法，我们实现了人工接种孕出正常茭白(如图6所示), 将孕出的茭白剖开，发现与正常茭白一样。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10585
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 1
gatccatgcc gcctaagaag aaacgcaagg ttgaggataa gaagtacagc atcggactcg 60
acatcggtac taactcggta ggatgggcag tcatcacgga tgaatacaag gttccttcca 120
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ctttgctctt tgactcagga gaaaccgctg aggcgacacg cctcaaacgc acggcacgtc 240
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ctcaagtgaa catcgtcaag aaaacggagg tccaaaccgg tggcttcagc aaggagtcga 3360
ttctgccgaa acgcaattcg gacaaattga ttgcacgcaa gaaggattgg gaccctaaga 3420
aatatggcgg cttcgattca ccgacagtgg cctattcggt tctggtcgtc gcgaaagtgg 3480
agaagggcaa gtcaaagaag ctcaagtcag tgaaggagct cctgggaatc accatcatgg 3540
aacgttcctc ttttgagaag aaccctatcg actttctcga ggctaagggc tacaaagagg 3600
tcaagaaaga tctcatcatc aaactcccaa aatactcact tttcgagctc gagaacggcc 3660
gtaaacgaat gctggcgagc gcaggagagc ttcaaaaggg aaatgaactg gctttgccct 3720
ccaagtacgt caacttcctc tacctcgcaa gccattatga gaagttgaag ggtagccccg 3780
aggacaacga acaaaagcag ctcttcgtgg agcaacacaa acattacctg gatgaaatca 3840
tcgagcaaat ctcggagttt agcaagcgag tgatcttggc tgatgccaac ctcgacaagg 3900
tgttgtctgc ctacaacaag catcgagata agccgattcg cgagcaggcc gagaacatca 3960
tccacctctt cactctcact aacttgggtg cgcctgcggc gtttaaatac tttgacacga 4020
ccatcgaccg caagcgttac acaagcacga aggaagtcct cgacgctaca ctgatccatc 4080
agtcgatcac cggtctgtac gaaacccgca tcgatctgtc tcaactgggc ggtgacagcg 4140
gcggctaccc atacgatgtg cccgattacg ctagcggcgg aaagcgtccc gcagccacta 4200
agaaggctgg acaggccaag aagaagaagt gagcggccgc ccggctgcag atcgttcaaa 4260
catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 4320
ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 4380
tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 4440
caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 4500
tccgatgata agctgtcaaa catgagaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4560
gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4620
ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 4680
gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 4740
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 4800
cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 4860
aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 4920
gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 4980
tggtttctta ggcggccgca cgctaagtgg agttgtccga gtccccgaat cacaagaatt 5040
aggctcgtgc tctgtgagat ctctcgcgaa acccagatga aggaaaaaaa tcggaagatc 5100
gcggaagaag tggggttcgc atggtctaac attgtcgcat tcctcacagt ttcggctgga 5160
aacggcaggg acaatcacga gaaatgcgcg acgagtattc agttgtccaa aattatgtca 5220
gcttgaaagt tggaaacggc ggaagaaaat tcgtcaggag ggcgttgcgg ctagggtgaa 5280
gaacggagac aatttcggct ttgaaattgg ctcgactctg attggatcat gacgcactgc 5340
tggtccacaa ccgtgtcgaa ggtgccgtct ttactacagg tccgctggaa gcaaaatgga 5400
aaaagccgct ggagcccgac tacagagccg ccgtgttttg gtaatcagtc ggcaaatagg 5460
tcagcacagc gcagcgtgac aggttcttgc aatttacagc acagctcgtc cgtctacgac 5520
tttgcacacc acaaagtgtg cggggagcaa aggagccgat cttggtcgcg cgcaaagcca 5580
aggagtcttg aacctgagag tgtgcgtgtc ttgtgacgct tgcccttctg tactttgctg 5640
tgacactacc accacatctg tcttggcttt ttgttcatac atccacaccg accatgtcgc 5700
tattcaacgt cagcaacggt cttcgtaccg ctctccgacc ttctgttgcc agctcttcgc 5760
gcgttgctgc cttttccaca accgccgctg cccgtctcgc cacacccacc tctgacaacg 5820
ttggcagttc gggcaagcct cagcacttga agcagttcaa gatctaccga tggaaccctg 5880
acaagccctc ggagaagcct cgtctgcagt cgtacacact ggacctcaac cagaccggtc 5940
caatggttct cgacgcgctc atcaaaatca agaacgaaat tgaccctacg ctcaccttcc 6000
gtcgctcgtg ccgtgagggt atctgcggtt cgtgcgctat gaatattgac ggtgtcaaca 6060
ccctcgcctg cctctgccgg atcgacaagc agaatgacac caagatctac cccttgccgc 6120
acatgtacat tgtcaaggac ctcgtgccag acttgaccca gttctacaag cagtaccgat 6180
ccatcgagcc tttcctcaag tccaacaaca ccccttctga gggtgaacat cttcagtcgc 6240
ccgaggagcg tcgtcgactc gacggtctgt acgagtgcat tctgtgcgcg tgctgctcca 6300
catcctgccc ctcttactgg tggaatcagg acgagtacct tggccccgcc gtgctcatgc 6360
aggcgtaccg atggatggcc gactcgcgtg acgactttgg tgaggagcga agacagaagc 6420
tcgagaacac cttttcgctc taccgatgcc ttaccatcat gaactgctcc aggacctgcc 6480
ccaagaacct caaccctggt aaggcaattg cacagatcaa gaaggacatg gccgtcggcg 6540
cacccaaggc ttccgagcgc cctatcatgg cttcgtcgta atcttgatat atcatatcgt 6600
tctttcctca gcacttcttt tgtcaatttc aaaagtatct aattgcattc aactccgctt 6660
gtggtttgtt gttcagtgag agtggaaacg ctacgggcaa gatgagggca gtgttctggc 6720
gacggaaaag tgtgcaagtg tctggcctgc gtcctcgctg gttccagcag ccgatgcagg 6780
acgtgtacct agcgatttct tcgacagcct attgtggcag ccgcgattcg ccacaatcgt 6840
acgtgcggcc gccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6900
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6960
aataatatta ccgatcctcg atctttgtgc aagctagccc gcctcggcag caacaaagca 7020
gccgagcaag aagcagtact tgccttctga atcgtgaatg ggttacgttc ttcaccgctg 7080
tgatcagcga atcatgaatc aaatcatgag ggcattgctg atcatgaatc aaatcatgag 7140
ggcatttaaa aattcagtct gagtcgtgag tagcaagtcg gttctggatc ggatggcatt 7200
catgaatcac agggtcgtga atcatgaatg ttcaagtccc cttttctcga gaggctggtg 7260
ggatcggtgc gaatcacgaa tcatgattgt aattcattga gtgaaggagt ttcgcagcca 7320
cccacagtac tagaatcacg aatgacaata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 7380
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 7440
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 7500
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 7560
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 7620
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 7680
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 7740
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 7800
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 7860
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 7920
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 7980
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 8040
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 8100
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 8160
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 8220
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 8280
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 8340
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 8400
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 8460
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 8520
cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 8580
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 8640
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 8700
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 8760
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 8820
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 8880
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 8940
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 9000
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 9060
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 9120
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 9180
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 9240
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 9300
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 9360
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttcttc acgaggggca 9420
cgcattgact caggtcaggc ttgcctcgac gcccagttgc caacagactc ccgacgtgct 9480
tgcaatctcc ttgctttgca gtcggggtga gtctgatata gataaacacc agctgactgc 9540
gcagtgccca cggcaacgcc gatcaaacgc agaaggatga aaaggcaggc caagacggcg 9600
accctgcgca ccctcttcgc gaacttcgcc gaacaaattt tcagtacaaa cccttcaaaa 9660
acgcatacac caacccttcc tcccgcgtac acaccagccc gttccttccc ttggtacccg 9720
taccgagctc gactttcact tttctctatc actgataggg agtggtaaac tcgactttca 9780
ttttctctat cactgatagg gagtggtaaa ctcgactttc acttttctct atcactgata 9840
gggagtggta aactcgactt tcacttttct ctatcacgga tagggagtgg taaactcgac 9900
tttcactttt ctctatcact gatagggagt ggtaaactcg actttcactt ttctctatca 9960
ctgataggga gtggtaaact cgactttcac ttttctctat cactgatagg gagtggtaaa 10020
ctcgagtacc gagctcgact ttcacttttc tctatcactg atagggagtg gtaaactcga 10080
ctttcatttt ctctatcact gatagggagt ggtaaactcg actttcactt ttctctatca 10140
ctgataggga gtggtaaact cgactttcac ttttctctat cacggatagg gagtggtaaa 10200
ctcgactttc acttttctct atcactgata gggagtggta aactcgactt tcacttttct 10260
ctatcactga tagggagtgg taaactcgac tttcactttt ctctatcact gatagggagt 10320
ggtaaactcg aggggatcaa ttcgaccaat gaggcgcgag acgaggggac gctggaagtt 10380
gaggcgcaag aaaatttttc tctggttctg cgcggcagag acgaccagat tcgcccgctt 10440
tcttctgcgt tgggtgcctc ttttgggtgc cagactttgt gtgtgcgcca gcgagacgtt 10500
ccaataaagg gcgctgtctc ggcactatct ttctttcttt cctcatacat cgtatcatac 10560
catacacaga caacatcatc cacgg 10585
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
gtacgaaatg aggtgctgtg 20
<210> 3
<211> 10722
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 3
gatccatgcc gcctaagaag aaacgcaagg ttgaggataa gaagtacagc atcggactcg 60
acatcggtac taactcggta ggatgggcag tcatcacgga tgaatacaag gttccttcca 120
agaagtttaa ggtccttggt aacaccgacc gccattctat caagaagaac ctcattggcg 180
ctttgctctt tgactcagga gaaaccgctg aggcgacacg cctcaaacgc acggcacgtc 240
gacgttatac acgcagaaag aatcgtatct gctatctgca ggaaatcttt tcgaacgaaa 300
tggcaaaagt tgatgacagc ttcttccatc gcctggagga atcgtttctc gtggaggagg 360
acaagaagca cgagagacat cctatcttcg gcaacattgt cgatgaggtc gcttaccacg 420
agaagtaccc tactatctac caccttagaa agaagctcgt agactcaact gacaaagcgg 480
atcttcgtct gatctatttg gctcttgccc acatgatcaa gttccgtggt cattttctca 540
tcgaaggcga ccttaatccc gacaactcgg acgtcgataa gctgtttatc cagctcgtac 600
agacatacaa ccagctcttc gaagaaaacc caattaatgc ttccggtgtt gatgcaaaag 660
ctatcctcag cgcgagattg agcaagagca gacgcctcga aaacctcatc gcccaattgc 720
ctggtgaaaa gaagaacggc ttgttcggca atcttattgc cctgagcctt ggcctcactc 780
cgaacttcaa gtcgaacttc gatcttgcgg aagatgccaa gctgcaactc tccaaggaca 840
cgtacgatga tgacttggac aatctccttg cccagattgg cgatcaatac gccgatcttt 900
tcctcgcggc gaagaacttg tcggacgcaa tcttgctctc agacatcctt cgcgtcaaca 960
ctgagatcac caaagcccct ctctctgcct cgatgatcaa gcgctatgac gaacaccacc 1020
aggatctcac gctccttaag gcattggtgc gtcagcagtt gcctgagaag tacaaagaga 1080
ttttctttga tcagtcgaag aacggatacg ctggctacat cgacggtggc gcttctcagg 1140
aggagttcta caagtttatc aaacccattc ttgagaagat ggatggcacg gaggagctcc 1200
tcgtcaagct gaatcgcgag gacctcctcc gtaagcaacg tacgttcgac aatggctcga 1260
ttccacacca gattcatctg ggcgaactcc acgccatcct caggaggcag gaggacttct 1320
atcccttcct caaggataat cgagagaaaa ttgagaagat cctcacattc cgcatcccct 1380
attatgtagg cccactcgct cgcggaaact ctcgctttgc ctggatgacc cgcaagtcgg 1440
aagaaacaat caccccgtgg aacttcgaag aggtggtgga caagggtgca tctgcgcagt 1500
cgtttattga gaggatgaca aactttgata agaacctccc gaatgagaaa gtcctgccaa 1560
aacattccct cctgtatgaa tacttcacgg tctataacga actgacaaag gtgaagtacg 1620
tgaccgaggg tatgcgtaag cctgcctttc tttcgggtga gcagaagaaa gctattgtcg 1680
acttgttgtt caagaccaac cgcaaggtca ctgtcaagca actgaaggaa gattacttca 1740
agaaaatcga gtgttttgat tcggtagaga tctcgggcgt cgaggacagg ttcaacgcct 1800
ctctcggcac ctatcacgat cttctcaaga tcatcaagga caaagacttt cttgacaacg 1860
aagagaacga ggatattctc gaggacatcg tgctcaccct cactttgttc gaagatcgcg 1920
aaatgattga ggaacgtctt aagacatatg ctcacttgtt cgacgacaaa gtgatgaagc 1980
agctgaagcg taggcgatac acaggttggg gccgcctctc gcgcaagctg attaacggta 2040
tccgcgacaa gcaatccggc aagacaatct tggatttcct taagagcgac ggttttgcta 2100
accgcaactt catgcagctc atccacgacg acagccttac gttcaaggag gacatccaga 2160
aggcccaggt ttccggacaa ggtgactctc tccatgagca catcgctaac ctggcgggaa 2220
gccccgcgat caagaaaggt atcctccaga ccgtcaaagt tgtggacgag ctggtcaagg 2280
taatgggccg acacaaaccg gagaacattg ttatcgagat ggcacgagag aatcagacga 2340
cccagaaagg ccaaaagaac tccagagaac gtatgaaacg aatcgaagag ggtatcaagg 2400
aactgggatc gcagatcctg aaggagcacc ccgttgagaa cacgcagctc caaaacgaaa 2460
agctgtacct ctactacttg caaaatggta gggatatgta cgtcgaccag gaactggata 2520
ttaatcgtct gtccgactac gacgttgacc acatcgtgcc ccaatcgttt ctcaaggatg 2580
actcgatcga taataaagta cttacgcgct cagacaagaa ccgaggtaaa tcggacaatg 2640
tcccatcgga ggaagtcgtg aagaagatga agaactattg gcgccaactt cttaacgcaa 2700
agctgatcac ccagaggaaa ttcgacaacc tcaccaaagc agaacgcggc ggcctctccg 2760
agctcgacaa ggctggattt atcaagcgtc agctcgtcga aacgcgtcag attaccaagc 2820
acgtcgcaca gatcctggat agccgcatga acacaaagta cgacgaaaac gacaagctca 2880
tccgtgaggt taaggtcatc accttgaagt cgaaactcgt gtcggacttc cgcaaagatt 2940
ttcagttcta taaagttaga gagatcaaca actaccacca tgcgcatgac gcctacctca 3000
atgccgtcgt gggcaccgca cttattaaga aatacccgaa gctcgagtcc gagtttgtct 3060
acggcgatta caaggtatac gacgttcgca agatgattgc caaatcggag caggagatcg 3120
gtaaggccac tgccaagtac ttcttttact cgaacatcat gaatttcttc aaaacagaaa 3180
tcaccctcgc caacggcgag attcgcaaac gaccactcat cgagactaac ggtgaaacgg 3240
gagagatcgt ctgggataag ggccgagact ttgctacggt tcgaaaggtc ctttcgatgc 3300
ctcaagtgaa catcgtcaag aaaacggagg tccaaaccgg tggcttcagc aaggagtcga 3360
ttctgccgaa acgcaattcg gacaaattga ttgcacgcaa gaaggattgg gaccctaaga 3420
aatatggcgg cttcgattca ccgacagtgg cctattcggt tctggtcgtc gcgaaagtgg 3480
agaagggcaa gtcaaagaag ctcaagtcag tgaaggagct cctgggaatc accatcatgg 3540
aacgttcctc ttttgagaag aaccctatcg actttctcga ggctaagggc tacaaagagg 3600
tcaagaaaga tctcatcatc aaactcccaa aatactcact tttcgagctc gagaacggcc 3660
gtaaacgaat gctggcgagc gcaggagagc ttcaaaaggg aaatgaactg gctttgccct 3720
ccaagtacgt caacttcctc tacctcgcaa gccattatga gaagttgaag ggtagccccg 3780
aggacaacga acaaaagcag ctcttcgtgg agcaacacaa acattacctg gatgaaatca 3840
tcgagcaaat ctcggagttt agcaagcgag tgatcttggc tgatgccaac ctcgacaagg 3900
tgttgtctgc ctacaacaag catcgagata agccgattcg cgagcaggcc gagaacatca 3960
tccacctctt cactctcact aacttgggtg cgcctgcggc gtttaaatac tttgacacga 4020
ccatcgaccg caagcgttac acaagcacga aggaagtcct cgacgctaca ctgatccatc 4080
agtcgatcac cggtctgtac gaaacccgca tcgatctgtc tcaactgggc ggtgacagcg 4140
gcggctaccc atacgatgtg cccgattacg ctagcggcgg aaagcgtccc gcagccacta 4200
agaaggctgg acaggccaag aagaagaagt gagcggccgc ccggctgcag atcgttcaaa 4260
catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 4320
ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 4380
tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 4440
caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 4500
tccgatgata agctgtcaaa catgagaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4560
gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4620
ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 4680
gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 4740
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 4800
cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 4860
aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 4920
gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 4980
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gcggaagaag tggggttcgc atggtctaac attgtcgcat tcctcacagt ttcggctgga 5160
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ccaagaacct caaccctggt aaggcaattg cacagatcaa gaaggacatg gccgtcggcg 6540
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gtggtttgtt gttcagtgag agtggaaacg ctacgggcaa gatgagggca gtgttctggc 6720
gacggaaaag tgtgcaagtg tctggcctgc gtcctcgctg gttccagcag ccgatgcagg 6780
acgtgtacct agcgatttct tcgacagcct attgtggcag ccgcgattcg ccacaatcgt 6840
acgtgcggcc gccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6900
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6960
aataatatta ccgatcctcg atctttgtgc aagctagccc gcctcggcag caacaaagca 7020
gccgagcaag aagcagtact tgccttctga atcgtgaatg ggttacgttc ttcaccgctg 7080
tgatcagcga atcatgaatc aaatcatgag ggcattgctg atcatgaatc aaatcatgag 7140
ggcatttaaa aattcagtct gagtcgtgag tagcaagtcg gttctggatc ggatggcatt 7200
catgaatcac agggtcgtga atcatgaatg ttcaagtccc cttttctcga gaggctggtg 7260
ggatcggtgc gaatcacgaa tcatgattgt aattcattga gtgaaggagt ttcgcagcca 7320
cccacagtac tagaatcacg aatgacaata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 7380
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 7440
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 7500
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 7560
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 7620
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 7680
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 7740
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 7800
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 7860
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 7920
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 7980
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 8040
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 8100
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 8160
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 8220
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 8280
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 8340
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 8400
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 8460
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 8520
cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 8580
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 8640
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 8700
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 8760
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 8820
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 8880
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 8940
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 9000
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 9060
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 9120
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 9180
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 9240
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 9300
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 9360
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttcttc acgaggggca 9420
cgcattgact caggtcaggc ttgcctcgac gcccagttgc caacagactc ccgacgtgct 9480
tgcaatctcc ttgctttgca gtcggggtga gtctgatata gataaacacc agctgactgc 9540
gcagtgccca cggcaacgcc gatcaaacgc agaaggatga aaaggcaggc caagacggcg 9600
accctgcgca ccctcttcgc gaacttcgcc gaacaaattt tcagtacaaa cccttcaaaa 9660
acgcatacac caacccttcc tcccgcgtac acaccagccc gttccttccc ttggtacgaa 9720
atgaggtgct gtggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 9780
aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct ttttttctag acccagcttt cttgtacaaa 9840
gttggcatta gtacccgtac cgagctcgac tttcactttt ctctatcact gatagggagt 9900
ggtaaactcg actttcattt tctctatcac tgatagggag tggtaaactc gactttcact 9960
tttctctatc actgataggg agtggtaaac tcgactttca cttttctcta tcacggatag 10020
ggagtggtaa actcgacttt cacttttctc tatcactgat agggagtggt aaactcgact 10080
ttcacttttc tctatcactg atagggagtg gtaaactcga ctttcacttt tctctatcac 10140
tgatagggag tggtaaactc gagtaccgag ctcgactttc acttttctct atcactgata 10200
gggagtggta aactcgactt tcattttctc tatcactgat agggagtggt aaactcgact 10260
ttcacttttc tctatcactg atagggagtg gtaaactcga ctttcacttt tctctatcac 10320
ggatagggag tggtaaactc gactttcact tttctctatc actgataggg agtggtaaac 10380
tcgactttca cttttctcta tcactgatag ggagtggtaa actcgacttt cacttttctc 10440
tatcactgat agggagtggt aaactcgagg ggatcaattc gaccaatgag gcgcgagacg 10500
aggggacgct ggaagttgag gcgcaagaaa atttttctct ggttctgcgc ggcagagacg 10560
accagattcg cccgctttct tctgcgttgg gtgcctcttt tgggtgccag actttgtgtg 10620
tgcgccagcg agacgttcca ataaagggcg ctgtctcggc actatctttc tttctttcct 10680
catacatcgt atcataccat acacagacaa catcatccac gg 10722
<210> 4
<211> 189
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
ggtaccccag cccgttcctt cccttggtac gaaatgaggt gctgtggttt tagagctaga 60
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 120
gctttttttc tagacccagc tttcttgtac aaagttggca ttagtacccg taccgagctc 180
gacggatcc 189

Claims (5)

1.一种含有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的CRISPR/Cas9质粒。
2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9质粒在茭白人工育种中的应用。
3.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9质粒作为菰黑粉菌UET1或UET2敲除基因的原核表达载体的应用。
4.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9质粒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）使用限制性内切酶ACC65 I将pMS7质粒进行单酶切，使其线性化并回收片段，所述pMS7质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
2）将Itd1基因序列、scaffold、U6终止子合成一个长片段Itd1-CRISPR，所述的Itd1-CRISPR的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，将长片段Itd1-CRISPR和线性pMS7质粒连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆培养后测序验证，提取重组质粒，即得CRISPR/Cas9质粒。
5.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9质粒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备菰黑粉菌UET1或UET2原生质体；
2）将CRISPR/Cas9质粒转化至菰黑粉菌UET1或UET2原生质体中；
3）通过YEPS+Cbx平板筛选，得到基因敲除菌株。
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