CN111621515A - 一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，尤指一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，本发明在PCR2后添加了一轮将U₃和U_6a的gRNA表达盒连接的PCR反应，然后再进行酶切连接，得到重组质粒；对U₃表达盒与U_6a表达盒连接，连接后的产物再与MH质粒连接，相对于现有技术同时将U₃表达盒、U_6a表达盒、MH质粒一起连接，本发明连接的难度远低于现有技术的连接难度，阳性克隆的比例大大增加，实现上述U₃表达盒和U_6a表达盒连接，重新设计了U₃表达盒的下引物B2‑M和U_6a表达盒的上引物B2’‑M，使B2‑M与B2’‑M的序列部分互补，这样可以使U₃表达盒和U_6a表达盒产物在第三轮PCR反应中通过粘性末端碱基互补连接起来。

Description

一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤指一种用于水稻或单子叶植物的增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法。

背景技术

基因的多样性是研究植物性状和遗传的重要资源。千百年来，植物的驯化依赖于自然变异的人工选择，但此过程中变异的方向是随机的，变异的频率也很低。为了创制新的品种，育种学家们利用了各种方法向植物基因组中引入突变，包括物理诱变、化学诱变和生物诱变等，但是这些突变的方向都不能控制。如果可以对目标序列进行定点编辑，将对作物遗传改良和植物基因功能研究起着重要作用。

基因编辑技术是一种通过人工设计和改造核酸酶达到对基因进行定点修饰的技术。目前发展起来的基因编辑技术主要包括第一代的锌指核酸酶(ZFNs,zinc finernucleases)、第二代的转录激活子样效应子介导核酸酶(TALENs,transcriptionactivator-like effector nucleases)和近几年兴起的第三代CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统由于操作简单、设计灵活、价格低廉、能实现多点编辑、可扩展性强，成为应用最广、研究最透彻的系统。该系统有gRNA和Cas9蛋白两部分组成。gRNA首先通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成复合体，然后复合体搜寻并匹配PAM序列，随后gRNA识别靶序列，最后Cas9蛋白对靶序列进行切割，形成DNA双链断裂(Double-strand break，DSB)(JinekM,Chylinski K,Fonfara I,et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.Science,2012,337:816–821)。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，由于其基因组小、易于操作、遗传转化体系高效，适合用于基因编辑技术的研究。华南农业大学刘耀光院士团队开发了一套适合于植物的多靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体系统(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robustCRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing inmonocot and dicot plants.Molecular plant,2015,8(8):1274-1284)，该方法可以同时编辑植物基因组的多个靶位点。当有两个靶点时，该方法通过一次Overlapping PCR分别得到U₃和U_6a表达盒，然后通过一次边切边连将U₃表达盒、U_6a表达盒和MH质粒三个片段连接在一起，由于T₄连接酶连接效率有限，经常出现只连接上了U₃、只连接上了U_6a或者空载的情况，导致阳性克隆的比例非常低，基因编辑效率较低。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其目的在于，解决现有技术中水稻等植物基因编辑效率慢的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：

利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序、基于U₃表达盒和U_6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序以及重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序，其中，利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序的具体步骤为：

采用Overlapping PCR法分别得到U₃表达盒SEQ ID NO：2片段和U_6a表达盒SEQ IDNO：3片段，并将U₃表达盒和U_6a表达盒连接起来。包括Overlapping PCR法的三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1的上下游引物分别为：U-F、gRNA-R；PCR2的上游引物为B1’-M、B2’-M，下游引物为B2-M、BL-M；PCR3的引物为U₃’、U_6a’，所述引物序列为：

B1’-M：5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

B2-M：5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’，

B2’-M：5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

BL-M：5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’，

U₃’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’，

U_6a’：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’；

PCR1:将靶点序列引入到启动子的下游和gRNA序列的上游，此轮PCR包括四个PCR反应；

PCR2:将启动子片段和gRNA片段连接在一起，得到U₃表达盒和U_6a表达盒，此轮PCR包括两个PCR反应；

PCR3:将U₃和U_6a表达盒产物连接起来，同时使U₃片段的5’端和U_6a片段的3’端带上BsaⅠ酶切位点，此轮PCR包括一个PCR反应。

进一步地，在利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序前，还具有对质粒的定点工序。

进一步地，每完成一个反应体系进行一次电泳检测。

进一步地，所述限制性内切酶为KOD FX高保真酶。

进一步地，基于U₃表达盒和U_6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序为对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物进行纯化，再通过酶切使U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物与MH质粒分别露出互补的粘性末端，酶切后再利用天根通用型DNA纯化回收试剂盒对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物与MH质粒进行纯化，最后通过T₄连接酶将露出互补粘性末端的U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物和MH质粒连接起来。

进一步地，所述酶切为通过BsaⅠ限制性内切酶进行双酶切。

进一步地，在重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序后，还需利用菌落PCR鉴定阳性克隆。

进一步地，位于PCR1反应体系中的上下游引物，所述引物序列分别为：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’

gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。

本发明的有益效果：

本发明在PCR2后添加了一轮将U₃和U_6a的gRNA表达盒连接的PCR反应，然后再进行酶切连接，得到重组质粒；其中，先对U₃表达盒与U_6a表达盒连接，连接后的产物再与MH质粒连接，相对于现有技术同时将U₃表达盒、U_6a表达盒、MH质粒一起连接，本发明连接的难度远低于现有技术的连接难度，阳性克隆的比例大大增加，实现上述U₃表达盒和U_6a表达盒连接，重新设计了U₃表达盒的下引物B2-M和U_6a表达盒的上引物B2’-M，使B2-M与B2’-M的序列部分互补，这样可以使U₃表达盒和U_6a表达盒产物在第三轮PCR反应中通过碱基互补连接起来；

现有技术的多靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体系统中虽然也有B2和B2’也相互互补，但是其中含有BsaⅠ酶切位点，如果还是用以前的引物，在下一步酶切当中会被酶切掉。同时，由于原系统中B2和BL引物很相似，最后19个碱基一模一样，如果用B2和BL做新一轮PCR的话,扩出来的多是U₃表达盒片段，而不是U₃表达盒与U_6a表达盒连接生成的产物；

因此，本发明重新设计了B1’-M和BL-M，替换到原来的B1’和BL，保证能扩增出U₃表达盒与U_6a表达盒连接的质粒。此外，还重新设计了一对引物U₃’和U_6a’，使上述质粒两端重新带上BsaⅠ酶切位点，便于下一步进行酶切。通过这样的方式，大大提高了阳性克隆的比例，从而提高了基因编辑的效率。

附图说明

图1为水稻CRISPR/Cas9单基因双靶点基因编辑技术中涉及的引物图。

图2是CRISPR/Cas9系统U₃表达盒和U_6a表达盒的结构示意图。

图3是PCR1反应后的电泳结果的图。

图4是PCR2反应后的电泳结果的图。

图5为OsTFIIB1阳性克隆U₃表达盒测序结果的图。

图6为OsTFIIB1阳性克隆U_6a表达盒测序结果的图。

具体实施方式

本发明关于一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，以下对发明进行详细说明。

利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序、基于U₃表达盒和U_6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序以及重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序。

根据本发明的方法，通过使用水稻进行单基因双靶点定点编辑，水稻的品种为日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)。

一、基因组编辑的质粒定点工序

从日本晴水稻基因组上提取OsTFIIB1的基因序列，在基于脱靶效应的前提下，并遵循CRISPR/Cas9系统的规定在目的基因的外显子范围内，设计两个靶点并合成引物；

对于靶点设计的标准为：GC含量在45％-70％之间，连续T碱基数为1-4个之间，与gRNA序列没有8个以上连续碱基配对。

在具体实施例中，复制OsTFIIB1基因序列SEQ ID NO:1，黏贴至靶点设计软件，选择对应的PAM类型以及靶向参考基因组，提交后查看筛选结构，筛选出CG含量适中、脱靶率较低的靶点作为第一顺位靶位点。

根据靶点序列设计gRNA上下游引物，将gRNA序列作为正义链，gRNA反向互补序列作为反义链，分别在正义链和反义链5’端添加ggc/gcc和aaac作为保护碱基，上述引物为U₃-F、U₃-R、U_6a-F、U_6a-R，所述引物序列为：

U₃-F：5’-ggcAGAGCAAATGCACGACGCGG-3’

U₃-R：5’-aaacCCGCGTCGTGCATTTGCTC-3’

U_6a-F：5’-gccGAACGACGGGGCCTACTGCC-3’

U_6a-R：5’-aaacGGCAGTAGGCCCCGTCGTT-3’

将两条互补配对的靶点引物(靶点引物分别为U₃与U_6a两种)取出上游引物、下游引物混合并进行退火形成双链靶点接头，将退火后的双链靶点接头连接到载体pYLg-OsU₃、pYLgRNA-OsU_6a上；

在靶点接头制备过程，将上述上游引物、下游引物稀释至100μM后90℃水浴30s，取出后立即放在冰上，得到双链DNA靶点接头；

双链DNA靶点接头与载体pYLg-OsU₃、pYLgRNA-OsU_6a连接是通过边切边连反应体系进行，该边切边连反应体系为：Bsa I 1μL、Cutsmart buffer 1μL、ATP(10Mm)1μL、pYLgRNA-OsU₃(50ng/μL)1μL、pYLgRNA-OsU_6a(50ng/μL)1μL、靶点接头1μL、T₄ DNA ligase(NEB)1μL、T₄DNA ligase(NEB)buffer 1μL、ddH₂O 3μL，在37℃的环境下处理5min，再转移到20℃的环境下进行5min的反应，以上两种反应程序作为1个循环，一共进行4个循环。

二、U₃表达盒和U_6a表达盒的合成与连接

参阅图2所示，通过Overlapping PCR法分别生成U₃和U_6a的gRNA表达盒，并将U₃表达盒和U_6a表达盒连接起来。其中，所述Overlapping PCR法包括三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1将靶点序列引入到启动子的下游和gRNA序列的上游，PCR2将启动子片段和gRNA片段连接在一起，分别得到U₃表达盒和U_6a表达盒，PCR3将U₃表达盒和U_6a表达盒产物连接起来，同时使U₃片段的5’端和U_6a片段的3’端带上Bsa I酶切位点；

可以理解为，采用Overlapping PCR法分别得到U₃表达盒SEQ ID NO：2片段和U_6a表达盒SEQ ID NO：3片段，并将U₃表达盒和U_6a表达盒连接起来。包括Overlapping PCR法的三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1的上下游引物分别为：U-F、gRNA-R；PCR2的上游引物为B1’-M、B2’-M，下游引物为B2-M、BL-M；PCR3的引物为U₃’、U_6a’；

需要说明的是，PCR1具有四个PCR反应，PCR1反应体系的引物序列为：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’，

gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’，

PCR2具有两个PCR反应，PCR2反应体系的引物序列分别为：

B1’-M：5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

B2-M：5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’，

B2’-M：5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

BL-M：5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’，

PCR3具有两个PCR反应，PCR3反应体系的引物序列分别为：

U₃’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’，

U_6a’：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’；

从PCR2得到的U₃表达盒和U_6a表达盒，经PCR3反应将U₃表达盒和U_6a表达盒连接起来。

PCR1体系具体为：pYLg-OsU₃或pYLgRNA-OsU_6a与靶点连接后产物1μL、KOD FX0.2μL、KOD buffer 10μL、dNTP 2μL、ddH₂O 6μL以及上下游引物各为0.4μL(启动子上游端扩增引物为U-F、U₃-R/U_6a-R，gRNA端扩增引物为U₃-F、U_6a-F/gRNA-R)，在94℃下以2min进行预变性处理，将98℃下变性10s、60℃退火30s、68℃延伸20s的反应作为1个循环，进行29个循环后再以68℃下进行7min的补充延伸；

PCR2体系具体为：PCR1体系中各个反应产物为0.5μL、KOD FX 1μL、KOD buffer 25μL、dNTP 8μL、ddH₂O 10μL以及上下游引物各2.5μL(U₃表达盒构建的引物为B1’-M、B2-M，U_6a表达盒构建的引物为B2’–M、BL-M。)，在94℃下以2min进行预变性处理，将98℃下变性10s、60℃退火30s、68℃延伸20s的反应作为1个循环，进行29个循环后再以68℃下进行7min的补充延伸。

PCR3体系与PCR2体系除却引物以及实施对象不相同外，其余步骤、辅助剂等均相同，PCR3体系中的引物为U₃’和U_6a’，实施对象为U₃表达盒、U_6a表达盒；

每完成一个反应体系进行一次电泳检测(如图3所示)，第一次电泳检测结果显示，启动子片段长度在450-550bp之间，gRNA长度为130-150bp之间；第二次电泳中U₃和U_6a表达盒产物的片段长度为650-750bp(如图4所示)，第三次电泳检测中U₃与U_6a连接生成的表达盒产物片段长度为1300-1500bp。

三、连接U₃和U_6a表达盒后与MH质粒连接的重组工序

步骤一：利用天根通用型DNA纯化回收试剂盒对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物纯化；

步骤二：对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物以及MH质粒通过酶切分别露出互补的粘性末端；

酶切反应的总体积为40μL，其中U₃表达盒与U_6a表达盒连接生成的产物/MH质粒34μL、Bsa I 2μL、Cutsmart buffer 4μL，并在37℃的水浴环境下进行3h的连续反应；

步骤三：再次使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒对酶切后的U₃表达盒与U_6a表达盒连接生成的产物以及MH质粒进行纯化；

步骤四：经步骤三纯化后，将露出互补粘性末端的U₃表达盒和U_6a表达盒连接生成的产物以及MH质粒通过T₄连接酶过夜连接，过夜连接的反应体系为：纯化后的表达盒产物8μL、MH质粒8μL、T₄ DNA ligase(NEB)2μL、T₄ DNA ligase buffer(NEB)2μL，并在16℃的环境下进行。

四、重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序

将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，涂布于含有kana抗性的LB固体培养基中，倒置于37℃培养箱过夜培养。然后挑取单克隆做菌落PCR。菌落PCR的反应体系为：PCRMaster Mix(Takara)10μL、上下引物各0.4μL、单克隆菌落、ddH₂0 9.2μL。菌落PCR反应程序为在95℃下以3min预变性处理，将95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min的反应作为1个循环，进行31个循环再以72℃进行10min的补充延伸；然后先电泳鉴定，根据条带的长短初步确定阳性克隆的数量，再利用测序鉴定准确鉴定阳性克隆的数量；

在本具体实施例中，其具体步骤为：

1.将U₃表达盒和U_6a表达盒连接的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞

(1)将DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5min后待菌块融化，加入连接产物并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置25min。

(2)用42℃水浴热激1min，迅速放回冰中并静置2min。

(3)向离心管中加入500μL不含抗生素的LB无菌液体培养基，混匀后37℃200rpm复苏60min。

(4)7000rpm离心1min，弃掉400μL上清液，吸打混匀剩余菌液，涂布到含有kana抗性的LB固体培养基上。

(5)将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

2.菌落PCR鉴定阳性克隆

(1)菌落PCR的鉴定引物有两对，其中SP-ML和U₃-R是鉴定U₃表达盒的，长度在500-600bp之间；SP-ML和SP-R是MH质粒上的通用引物，用来鉴定U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物，长度在1100-1200bp之间。引物的序列分别为：

SP-ML：5’-GCGCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’

SP-R：5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’

(2)菌落PCR反应体系：PCR Master Mix(Takara)10μL、上下引物各0.4μL、单克隆菌落少量、ddH₂0 9.2μL。其中单克隆菌落的挑取方法是用枪头蘸取少量放在反应液中几秒后再取出。

(3)菌落PCR反应程序为95℃下进行3min的预变性处理，将95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min的反应为一个循环，进行31个循环再以72℃的进行10min的补充延伸，菌落PCR反应完以后用琼脂糖凝胶电泳检测。

3.测序进一步鉴定阳性克隆

(1)根据电泳条带的长度初步确定阳性克隆，挑取其单克隆群落于1.5mL LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌至浑浊，取1mL菌液、通用引物SP-ML和U₃-F进行正向测序，SP-ML测出的是U₃段序列，U₃-F测出的是U_6a段序列。

(2)将测序结果(如图5-6所示)分别与U₃(如SEQ ID NO：2所示)和U_6a(如SEQ IDNO：3所示)的序列进行比对，观察水稻基因组的两个靶位点是否分别插入到U₃表达盒和U_6a表达盒当中，其中，图5与图6中采用框体包围的序列为靶序列。

由此得知，在PCR2后添加了一轮将U₃和U_6a的gRNA表达盒连接的PCR反应，然后再进行酶切连接，得到重组质粒；具体为，优先对U₃表达盒与U_6a表达盒连接，U₃表达盒与U_6a表达盒连接后的产物再与MH质粒连接，相对于现有技术同时将U₃表达盒、U_6a表达盒、MH质粒一起连接，本发明连接的难度远低于现有技术的连接难度，克隆难度大大增加，实现上述U₃表达盒和U_6a表达盒连接，重新设计了U₃表达盒的下引物B2-M和U_6a表达盒的上引物B2’-M，使B2-M与B2’-M的序列部分互补，这样可以使U₃表达盒和U_6a表达盒产物在第三轮PCR反应中通过碱基互补连接起来；

参阅图1所示，现有技术的多靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体系统中虽然也有B2和B2’也相互互补，但是其中含有BsaⅠ酶切位点，如果还是用以前的引物，在下一步酶切当中会被酶切掉。同时，由于原系统中B2和BL引物很相似，最后19个碱基一模一样，如果用B2和BL做新一轮PCR的话,扩出来的多是U₃表达盒片段，而不是U₃表达盒与U_6a表达盒连接生成的产物；

因此，重新设计了B1’-M和BL-M，替换到原来的B1’和BL，保证能扩增出U₃表达盒与U_6a表达盒连接的质粒。此外，还重新设计了一对引物U₃’和U_6a’，使上述质粒两端重新带上BsaⅠ酶切位点，便于下一步进行酶切。通过这样的方式，大大提高了阳性克隆的比例，从而提高了基因编辑的效率，

其中，SEQ ID NO：1序列如下：

ttgaaatgaaaaagattaactgaaaaacagttttaagggcaaactaaacgggaaaaaaatgaacatatgatgttgataaagaaataggagtacttacggaggaagcaagcaaaccatgatccaatagccaaatagaagaacttcaggcacacctgaaacaacactgtcagattagctaaggccgaattccagctgttttgataaatagatagatgaaaaaacaattcatgagcagtaccacacacacataggcatcaatgtttcatacatttcatgagcaatattagaaatcacactttaaatgactacacattgttgtgcagtacatttttaccagaataactgaactactgatgtaaaacttgactccagtgaagattgggaatggaacatgctacagtaaacagtaaaagagaaaatcgctgctcctttgccacaaagtgttgtggcatagtcaattttttgccacaaagttgtattttatcgttaatttgagtatgccacaaaattcttcgtgcatgccacacaactttgtggcgaaggaggagaaatttcctcacagtaaaaatgaattcagttcaatcactgtgcgttaatccagtgtgcttctaccacttccacgcatcaatcggccgcgacgtggccgcgcgtcgtagaaaccaaacttctgctgctgcaatcaaatcaaagctagaaacaacaacggaactcgagctgcggggtttgacttggggagagacgtgccttggagacgcggtggaggacgtcgtcgcgggagccggagccgaaggcgtcgacgacctcgccgaagacgaggttcatgagcggctgcgcagcgccgctcgcggccgcccctgccgcgccggccgccatgagcagcgcgtccaccccgtccgcgtacctgaacagccggtgcagccccgccttcccctccacctccgcctcctcccctccctcgctgcctcgcgcggccatacctctcctccacctcgcgacgacgacgatgggggcctcgcattgcggcggctggcctccgttttgtaggtgaggaattccgccgcgggagaggcgattccggcggcgggagggagaagcagccgctgggttgggtcgtgtttggttttggttgccaacttgaaaatgaaaaatatttcagttcaagagggaaaaaaattcagatagttgaagcttcgaaaagttgacttgcaattaatcaaagactcgaagagtttccatggcataatttttcagcatatacctagactggtactgtacgaaaatataagagcagtaatagcatcttaactctactacatgaatcaatgttcatgctaattaggacttcttcaaaacatatcatattgtgtaaactagtatcaagaatgctcactcaacgtttgaactataaaaattttgtagtgtagtctagttttataatctactccctctatcatataatataagacgtggttcaagttggcacagtctttaaaactaatttttaacttataatttcttatatactataagttttgtagcaataaaattataaccatatgaaaagtaaatttaaatcttaatgatataattttaaacaaataaaattcatttcatattatactaagtgttgcataaaatattaatcatgttttatcatctaacaacaatgaaaatacgaattataaaaaaaattcatataagacggacagtcaaagttgaacacagaaacacagggtttgcttttttttttgagacggagggagtataatactcctttggaacacatgagctttataaaaaggaaattcaaggccatgtactacgaatttccaaacgttccatattttgcagagagctttgaggaaaatccaattgcaattgcaaatattggttccaatagaaactgccgtgtccgactccgactccgatccccttactacccctgcaccgacctaatcgtctataaatacacagcccacactccccaaggcctcctcttttcagtttccccaactcaactcaactcgtctcctccccgcacccgccgccgcgatcgcgcgcgagagagagaaaaaaagagaaaaaccgagcagctaagcaagagcaaatgcacgacgcggcggcgaacgacggggcctactgcccggactgccggcgcgcgacggcggtggtgctcgaccacaccaccggcgacaccatctgcaccgagtgcgcgctcgtcctcgacgcgcgctacatcgacgagacgtccgagtggcgcaccttcgccaacgacggcgccagcgacgaccgcgaccccaaccgcgtcggcgaccgcgccgaccccttcctccccgaccacgtcggcggcaccaccatcgcctactcctccgccccgcccaagtccgccgacgccgccccgctgctgacgaggaggagggtcgacgtcgtcggcccgtccccggagaacgcgctcgtcgccgcgttcaggggcatcgccgacatggccgaccgcctcggcctcgtcgccaccatccgcgaccgcgccaaggaggtgttcaagaagctcggcgaggcgcccaccaaggggttaccgcgcggccggaaccgcgacgccgtctacgccgcctgcctcttcatcgcgtgccgcaacgaggggatgccgcggacgtacaaggagctcgcctccgtcaccgccgagggcgccgccgccaagaaggagatcggcaggctcaccaccctcatcaagaagcacctcggcgaccagggcgaggggcgggcgatggacatcggcgtcgtgcgctccaccgactacctccgccgcttctgctccaggctcggcctgggccaccaggacgtgcgcgccgccggggacgcggtgcgccgcctcgaggagcgcctcgacgtgcgccgcaacccggagtccatcgccgccgccatcatctacatggtcgtgcagcgcgccggcggcagcaagtccgtgcgcgacgtctccacggccaccggcgtcgccgagggcaccatcacggcggcgcacaaggagctggctccccacgccagcgtcctcttcggtggctagggctgcacgccgccgtgccccgccattgattcttgggttcttggcatgtgttcgacgacatgccaatgtctttcgacttggacatgtggagttcatgtgaacttcgtttcgttaatccgtgcttgattcgttctgtttcaagctgacgaaccgaatttggacttggtttcgttaatccgtgcttgattcattcggtctcaagctgacgaaccggatttggacctggtttcgttaatccgtgcttgattcgttcggtttcaagctgacgaacctaatagatagagatgctgttgctcattgctcgtattcgggaatgagctgattaacgttagaggcatctgttgcatgacctcggaaacgtgaagcctgttcttgcgagacaatctgacaattattcagatttttagcaatgagattagtgccgtactacgtaca

其中，SEQ ID NO：2序列如下：

ttcagaggtctctnnnnctctggaatcggcagcaaaggacgcgttgacattgtaggactatattgctctaataaaggaggcagctatgctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggctaaaaggaatctttaaacatacgaacagatcacttaaagttcttctgaagcaacttaaagttatcaggcatgcatggatcttggaggaatcagatgtgcagtcagggaccatagcacaagacaggcgtcttctactggtgctaccagcaaatgctggaagccgggaacactgggtacgttggaaaccacgtgtgatgtgaaggagtaagataaactgtaggagaaaagcatttcgtagtgggccatgaagcctttcaggacatgtattgcagtatgggccggcccattacgcaattggacgacaacaaagactagtattagtaccacctcggctatccacatagatcaaagctggtttaaaagagttgtgcagatgatccgtggcagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttcaagagcttggagtggatggaccnnnncgagacccacgct

其中，SEQ ID NO：3序列如下：

ttcagaggtctctnnnnctctggaatcggcagcaaaggattttttcctgtagttttcccacaaccattttttaccatccgaatgataggataggaaaaatatccaagtgaacagtattcctataaaattcccgtaaaaagcctgcaatccgaatgagccctgaagtctgaactagccggtcacctgtacaggctatcgagatgccatacaagagacggtagtaggaactaggaagacgatggttgattcgtcaggcgaaatcgtcgtcctgcagtcgcatctatgggcctggacggaataggggaaaaagttggccggataggagggaaaggcccaggtgcttacgtgcgaggtaggcctgggctctcagcacttcgattcgttggcaccggggtaggatgcaatagagagcaacgtttagtaccacctcgcttagctagagcaaactggactgccttatatgcgcgggtgctggcttggctgccggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttcaagagcttggagtggatggaccnnnncgagacccacgct

以上实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3493

<212> DNA

<213> 日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)

<400> 1

ttgaaatgaa aaagattaac tgaaaaacag ttttaagggc aaactaaacg ggaaaaaaat 60

gaacatatga tgttgataaa gaaataggag tacttacgga ggaagcaagc aaaccatgat 120

ccaatagcca aatagaagaa cttcaggcac acctgaaaca acactgtcag attagctaag 180

gccgaattcc agctgttttg ataaatagat agatgaaaaa acaattcatg agcagtacca 240

cacacacata ggcatcaatg tttcatacat ttcatgagca atattagaaa tcacacttta 300

aatgactaca cattgttgtg cagtacattt ttaccagaat aactgaacta ctgatgtaaa 360

acttgactcc agtgaagatt gggaatggaa catgctacag taaacagtaa aagagaaaat 420

cgctgctcct ttgccacaaa gtgttgtggc atagtcaatt ttttgccaca aagttgtatt 480

ttatcgttaa tttgagtatg ccacaaaatt cttcgtgcat gccacacaac tttgtggcga 540

aggaggagaa atttcctcac agtaaaaatg aattcagttc aatcactgtg cgttaatcca 600

gtgtgcttct accacttcca cgcatcaatc ggccgcgacg tggccgcgcg tcgtagaaac 660

caaacttctg ctgctgcaat caaatcaaag ctagaaacaa caacggaact cgagctgcgg 720

ggtttgactt ggggagagac gtgccttgga gacgcggtgg aggacgtcgt cgcgggagcc 780

ggagccgaag gcgtcgacga cctcgccgaa gacgaggttc atgagcggct gcgcagcgcc 840

gctcgcggcc gcccctgccg cgccggccgc catgagcagc gcgtccaccc cgtccgcgta 900

cctgaacagc cggtgcagcc ccgccttccc ctccacctcc gcctcctccc ctccctcgct 960

gcctcgcgcg gccatacctc tcctccacct cgcgacgacg acgatggggg cctcgcattg 1020

cggcggctgg cctccgtttt gtaggtgagg aattccgccg cgggagaggc gattccggcg 1080

gcgggaggga gaagcagccg ctgggttggg tcgtgtttgg ttttggttgc caacttgaaa 1140

atgaaaaata tttcagttca agagggaaaa aaattcagat agttgaagct tcgaaaagtt 1200

gacttgcaat taatcaaaga ctcgaagagt ttccatggca taatttttca gcatatacct 1260

agactggtac tgtacgaaaa tataagagca gtaatagcat cttaactcta ctacatgaat 1320

caatgttcat gctaattagg acttcttcaa aacatatcat attgtgtaaa ctagtatcaa 1380

gaatgctcac tcaacgtttg aactataaaa attttgtagt gtagtctagt tttataatct 1440

actccctcta tcatataata taagacgtgg ttcaagttgg cacagtcttt aaaactaatt 1500

tttaacttat aatttcttat atactataag ttttgtagca ataaaattat aaccatatga 1560

aaagtaaatt taaatcttaa tgatataatt ttaaacaaat aaaattcatt tcatattata 1620

ctaagtgttg cataaaatat taatcatgtt ttatcatcta acaacaatga aaatacgaat 1680

tataaaaaaa attcatataa gacggacagt caaagttgaa cacagaaaca cagggtttgc 1740

tttttttttt gagacggagg gagtataata ctcctttgga acacatgagc tttataaaaa 1800

ggaaattcaa ggccatgtac tacgaatttc caaacgttcc atattttgca gagagctttg 1860

aggaaaatcc aattgcaatt gcaaatattg gttccaatag aaactgccgt gtccgactcc 1920

gactccgatc cccttactac ccctgcaccg acctaatcgt ctataaatac acagcccaca 1980

ctccccaagg cctcctcttt tcagtttccc caactcaact caactcgtct cctccccgca 2040

cccgccgccg cgatcgcgcg cgagagagag aaaaaaagag aaaaaccgag cagctaagca 2100

agagcaaatg cacgacgcgg cggcgaacga cggggcctac tgcccggact gccggcgcgc 2160

gacggcggtg gtgctcgacc acaccaccgg cgacaccatc tgcaccgagt gcgcgctcgt 2220

cctcgacgcg cgctacatcg acgagacgtc cgagtggcgc accttcgcca acgacggcgc 2280

cagcgacgac cgcgacccca accgcgtcgg cgaccgcgcc gaccccttcc tccccgacca 2340

cgtcggcggc accaccatcg cctactcctc cgccccgccc aagtccgccg acgccgcccc 2400

gctgctgacg aggaggaggg tcgacgtcgt cggcccgtcc ccggagaacg cgctcgtcgc 2460

cgcgttcagg ggcatcgccg acatggccga ccgcctcggc ctcgtcgcca ccatccgcga 2520

ccgcgccaag gaggtgttca agaagctcgg cgaggcgccc accaaggggt taccgcgcgg 2580

ccggaaccgc gacgccgtct acgccgcctg cctcttcatc gcgtgccgca acgaggggat 2640

gccgcggacg tacaaggagc tcgcctccgt caccgccgag ggcgccgccg ccaagaagga 2700

gatcggcagg ctcaccaccc tcatcaagaa gcacctcggc gaccagggcg aggggcgggc 2760

gatggacatc ggcgtcgtgc gctccaccga ctacctccgc cgcttctgct ccaggctcgg 2820

cctgggccac caggacgtgc gcgccgccgg ggacgcggtg cgccgcctcg aggagcgcct 2880

cgacgtgcgc cgcaacccgg agtccatcgc cgccgccatc atctacatgg tcgtgcagcg 2940

cgccggcggc agcaagtccg tgcgcgacgt ctccacggcc accggcgtcg ccgagggcac 3000

catcacggcg gcgcacaagg agctggctcc ccacgccagc gtcctcttcg gtggctaggg 3060

ctgcacgccg ccgtgccccg ccattgattc ttgggttctt ggcatgtgtt cgacgacatg 3120

ccaatgtctt tcgacttgga catgtggagt tcatgtgaac ttcgtttcgt taatccgtgc 3180

ttgattcgtt ctgtttcaag ctgacgaacc gaatttggac ttggtttcgt taatccgtgc 3240

ttgattcatt cggtctcaag ctgacgaacc ggatttggac ctggtttcgt taatccgtgc 3300

ttgattcgtt cggtttcaag ctgacgaacc taatagatag agatgctgtt gctcattgct 3360

cgtattcggg aatgagctga ttaacgttag aggcatctgt tgcatgacct cggaaacgtg 3420

aagcctgttc ttgcgagaca atctgacaat tattcagatt tttagcaatg agattagtgc 3480

cgtactacgt aca 3496

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttcagaggtc tctnnnnctc tggaatcggc agcaaaggac gcgttgacat tgtaggacta 60

tattgctcta ataaaggagg cagctatgct ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 120

aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 180

taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcta 240

aaaggaatct ttaaacatac gaacagatca cttaaagttc ttctgaagca acttaaagtt 300

atcaggcatg catggatctt ggaggaatca gatgtgcagt cagggaccat agcacaagac 360

aggcgtcttc tactggtgct accagcaaat gctggaagcc gggaacactg ggtacgttgg 420

aaaccacgtg tgatgtgaag gagtaagata aactgtagga gaaaagcatt tcgtagtggg 480

ccatgaagcc tttcaggaca tgtattgcag tatgggccgg cccattacgc aattggacga 540

caacaaagac tagtattagt accacctcgg ctatccacat agatcaaagc tggtttaaaa 600

gagttgtgca gatgatccgt ggcagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 660

agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcaa gagcttggag 720

tggatggacc nnnncgagac ccacgct 747

<210> 3

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ttcagaggtc tctnnnnctc tggaatcggc agcaaaggat tttttcctgt agttttccca 60

caaccatttt ttaccatccg aatgatagga taggaaaaat atccaagtga acagtattcc 120

tataaaattc ccgtaaaaag cctgcaatcc gaatgagccc tgaagtctga actagccggt 180

cacctgtaca ggctatcgag atgccataca agagacggta gtaggaacta ggaagacgat 240

ggttgattcg tcaggcgaaa tcgtcgtcct gcagtcgcat ctatgggcct ggacggaata 300

ggggaaaaag ttggccggat aggagggaaa ggcccaggtg cttacgtgcg aggtaggcct 360

gggctctcag cacttcgatt cgttggcacc ggggtaggat gcaatagaga gcaacgttta 420

gtaccacctc gcttagctag agcaaactgg actgccttat atgcgcgggt gctggcttgg 480

ctgccggttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 540

aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttc aagagcttgg agtggatgga ccnnnncgag 600

acccacgct 609

Claims (8)

1.一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：

利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序、基于U₃表达盒和U_6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序以及重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序，其中，利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序的具体步骤为：

采用Overlapping PCR法分别得到U₃表达盒SEQ ID NO：2片段和U_6a表达盒SEQ ID NO：3片段,并将U₃表达盒和U_6a表达盒连接起来。包括Overlapping PCR法的三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1的上下游引物分别为：U-F、gRNA-R；PCR2的上游引物为B1’-M、B2’-M，下游引物为B2-M、BL-M；PCR3的引物为U₃’、U_6a’，所述引物序列为：

B1’-M：5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

B2-M：5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’，

B2’-M：5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

BL-M：5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’，

U₃’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’，

U_6a’：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’；

PCR1:将靶点序列引入到启动子的下游和gRNA序列的上游，此轮PCR包括四个PCR反应；

PCR2:将启动子片段和gRNA片段连接在一起，得到U₃表达盒和U_6a表达盒，此轮PCR包括两个PCR反应；

PCR3:将U₃和U_6a表达盒产物连接起来，同时使U₃片段的5’端和U_6a片段的3’端带上BsaⅠ酶切位点，此轮PCR包括一个PCR反应。

2.根据权利要求1所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：在利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序前，还具有对质粒的定点工序。

3.根据权利要求2所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：每完成一个反应体系进行一次电泳检测。

4.根据权利要求1所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：所述限制性内切酶为KOD FX高保真酶。

5.根据权利要求1所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：基于U₃表达盒和U_6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序为对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物进行纯化，再通过酶切使U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物与MH质粒分别露出互补的粘性末端，酶切后再利用天根通用型DNA纯化回收试剂盒对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物与MH质粒进行纯化，最后通过T₄连接酶将露出互补粘性末端的U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物和MH质粒连接起来。

6.根据权利要求5所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：所述酶切为通过BsaⅠ限制性内切酶进行双酶切。

7.根据权利要求1所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：在重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序后，还需利用菌落PCR鉴定阳性克隆。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：位于PCR1反应体系中的上下游引物，所述引物序列分别为：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’

gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。

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