CN110551762A

CN110551762A - CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用

Info

Publication number: CN110551762A
Application number: CN201910731794.1A
Authority: CN
Inventors: 王永明; 胡子英; 王大奇; 王帅
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN110551762B

Abstract

本发明属于基因编辑技术领域，具体为一种CRISPR/ShaCas9基因编辑系统以及其应用。本发明基因编辑系统为ShaCas9蛋白与sgRNA形成的复合体，能精确靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；ShaCas9蛋白小，为1055个氨基酸，识别的PAM序列简单，所述ShaCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。

Description

CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种能在细胞中进行基因编辑的CRISPR/ShaCas9系统以及其相关应用。

背景技术

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。在CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)、tracrRNA(trans-activating RNA) 以及Cas9蛋白形成复合体后，识别靶位点的PAM(Protospacer AdjacentMotif)序列，crRNA 会与靶DNA序列形成互补结构，Cas9蛋白行使切割DNA的功能，使DNA发生断裂损伤。其中， tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链指导RNA(singleguide RNA，sgRNA)。当 DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接 (Non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组(homologousrecombination,HR)。NHEJ 修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用 HR修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。

除了基础科研外，CRISPR/Cas9还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas9系统做基因治疗时，需要把Cas9和sgRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。SpCas9因为PAM序列简单(识别NGG)和活性高而得到广泛应用。但是SpCas9蛋白有1367个氨基酸，加上sgRNA和启动子，无法有效的包装到AAV病毒中，限制了其在临床中的应用。为了克服这个问题，几个小的Cas9被发明出来了，包括SaCas9(PAM序列为NNGRRT)；St1Cas9(PAM序列为NNAGAW)；NmCas9(PAM序列为NNNNGATT)； Nme2Cas9(PAM序列为NNNNCC)；CjCas9(PAM序列为NNNNRYAC)，但是这些Cas9或者PAM序列复杂(在基因组中可靶向的DNA序列少)，或者编辑效率低，难以广泛应用。寻找Cas9蛋白小，PAM序列简单CRISPR/Cas9系统是解决上述问题的希望所在。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种编辑活性高、Cas9蛋白小、PAM序列简单的 CRISPR/Cas9新的基因编辑系统及其应用。

本发明提供的CRISPR/Cas9基因编辑系统，为ShaCas9蛋白与sgRNA形成的复合体，记为 CRISPR/ShaCas9基因编辑系统(即ShaCas9蛋白，它和single guide RNA(sgRNA)共同作用实现基因编辑)；能精确靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；ShaCas9蛋白小，为1055个氨基酸，识别的PAM序列简单(NNGRM)，所述ShaCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQ ID NO:2改造的sgRNA序列。

本发明中，所述细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞。

本发明中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人MCF-7细胞或TRI细胞。

本发明中，所述CRISPR/Cas9系统为Staphylococcus haemolyticusCas9(ShaCas9) 蛋白，它和single guide RNA(sgRNA)共同作用实现基因编辑。

本发明中，所述ShaCas9蛋白属于溶血葡萄球菌属(Staphylococcushaemolyticus)，所述ShaCas9蛋白的UniProt的检索号为A0A2T4SLN6。

本发明中，所述ShaCas9蛋白包括无切割活性或仅具有单链切割活性或具有双链切割活性的ShaCas9蛋白。

本发明中，所述精确定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。

本发明中，所述精确定位靶向DNA序列包括ShaCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向DNA 序列上的PAM序列。

本发明中，所述PAM序列为NNGRM，所述靶向DNA序列为：

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGRM(SEQ ID NO:3)。

本发明中，所述ShaCas9蛋白和sgRNA复合体能精确靶向DNA序列指ShaCas9蛋白和sgRNA 复合体可以识别并结合特定DNA序列，或指将与ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别 sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。

本发明中，所述ShaCas9蛋白和sgRNA复合体或与ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控，所述修饰和调控包括但不限定于基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。

本发明中，所述单碱基转换器包括但不限定于碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、或胞嘧啶到胸腺嘧啶、或胞嘧啶到尿嘧啶、或其它碱基之间的转换。

本发明提供的基因编辑系统编辑活性高，与之前的Cas9相比具有明显的优势。

本发明通过基因合成、分子克隆、细胞转染、PCR产物深度测序、生物信息学分析等技术检测CRISPR/ShaCas9系统的编辑效率。

本发明提供的CRISPR/ShaCas9基因编辑系统能够在细胞中进行基因编辑，包括通过 ShaCas9蛋白和sgRNA的复合物识别定位靶向DNA，对DNA进行编辑；最后检测编辑效率。具体步骤为：

(1)合成人源化的ShaCas9基因序列；并克隆到表达载体上，得到pAAV2_ShaCas9_ITR；

(2)合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，退火后连接至质粒pAAV2_ShaCas9_U6_BsaI的BsaI酶切位点，得到pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA；

(3)将表达ShaCas9蛋白、sgRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中；

(4)将编辑后的靶位点进行PCR扩增，T7EI酶切或者二代测序检测编辑效率。

本发明中，可以根据具体需要，针对待编辑的DNA序列设计任意靶向的sgRNA，并一定程度上对sgRNA进行本领域所熟知的修饰，所述修饰包括但不限定于磷酸化、缩短、加长、硫化、甲基化、羟基化。

本发明中，可以根据具体需要，递送至细胞的CRISPR/ShaCas9系统包括但不限定于表达 ShaCas9蛋白或sgRNA的质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体或RNA或ShaCas9蛋白。

本领域技术人员可以理解的是，碱基N表示A、T、C或G四种碱基中的任何一种。

进一步地，步骤(3)中，所述递送的手段包括但不限定于脂质体、阳离子多聚物、纳米颗粒、多功能信封式纳米以及病毒载体。

进一步地，步骤(3)中，所述细胞包括但不限定于人细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。

进一步地，步骤(2)中，所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或与SEQID NO:2所示的核苷酸序列至少80％相同的核苷酸序列，或基于核苷酸序列进行的修饰，修饰包括但不限定于磷酸化、缩短、加长、硫化或甲基化。

更具体地，在一个具体实施例中，合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA序列，即Oligo-F 和Oligo-R，该寡核苷酸单链DNA序列如下：

Oligo-F CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG，(SEQ ID NO:4)

Oligo-R AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC。(SEQ ID NO:5)。

更具体地，在一个具体实施例中，本领域技术人员可以理解的是，Oligo-F和Oligo-R需要进行退火变为双链DNA，退火反应体系为1μL 100μM oligo-F，1μL 100μMoligo-R，28μL 水，震荡混匀后，放置于PCR仪中运行退火程序；退火程序如下：95℃_5min，85℃_1min， 75℃_1min，65℃_1min，55℃_1min，45℃_1min，35℃_1min，25℃_1min， 4℃保存，降温速率0.3℃/s。

更具体地，在一个具体实施例中，所述质粒pAAV2_ShaCas9_ITR需要经过BsaI限制性内切酶(NEB)进行线性化处理。

更具体地，在一个具体实施例中，所述Oligo-F和Oligo-R退火后的产物与线性化处理后的pAAV2_ShaCas9_ITR骨架载体通过DNA连接酶进行连接反应。

更具体地，在一个具体实施例中，将连接产物转化至感受态细胞后，经Sanger测序验证正确的克隆，然后提取质粒备用。

更具体地，在一个具体实施例中，步骤(3)中的细胞为HEK293T，其包含的靶位点具有 SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

更具体地，在一个具体实施例中，步骤(3)中的递送手段为脂质体，包括2000或PEI。

更具体地，在本发明第一方面的一个具体实施例中，所述实验步骤(4)中PCR的模板为编辑后的HEK293T基因组DNA。

更具体地，在一个具体实施例中，步骤(4)中PCR扩增的引物序列为：

F1-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGCGAGAAAAGCCTTGTTT(SEQ ID NO:7)

R1-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAACTTGTGGCCGTTTAC(SEQ ID NO:8)

F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(SEQ ID NO:9)

R2-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(SEQ ID NO:10)。

本发明还提供一种用于基因编辑的CRISPR/ShaCas9系统试剂盒，该试剂盒包括ShaCas9 蛋白或靶向DNA序列的sgRNA或靶向的DNA。

本发明还提供CRISPR/ShaCas9基因编辑系统的应用，包括基因敲除、定点碱基的改变、定点插入、基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。

附图说明

图1为CRISPR/ShaCas9基因编辑系统切割靶向DNA示意图。其中，灰色椭圆形表示ShaCas9 蛋白，黑色弯曲状表示sgRNA序列，基因组上链中加深区域表示PAM序列NNGG。

图2为质粒pAAV2_ShaCas9_U6_BsaI图谱示意图。其中，包括AAV2 ITR、CMV增强子、CMV 启动子、SV40 NLS、ShaCas9、nucleoplasmin NLS、3x HA、bGH poly(A)、人U6启动子(hU6)、BsaI内切酶位点、sgRNA scaffold序列等元件。

图3为靶位点DNA序列被编辑后的部分二代测序结果。其中编辑结果有缺失、插入或错配，最后5bp表示PAM序列NNGRM。

图4为内源位点的T7 Endonuclease I酶切结果。其中，箭头表示切开的片段大小。

具体实施方式

以下将通过实施例进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。

在一具体实施方式中，本发明提供的CRISPR/ShaCas9系统为一种新的基因编辑系统、方法、试剂盒及其应用。

在本发明一具体实施例中，CRISPR/ShaCas9系统能够在细胞中进行基因编辑，所述方法包括如下步骤：

1、构建质粒pAAV2_ShaCas9_ITR

步骤(1)，根据ShaCas9基因在UniProt上的检索号A0A2T4SLN6，下载其氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示。

步骤(2)，将ShaCas9的氨基酸序列进行密码子优化，获得了ShaCas9在人细胞中高表达的编码序列，如SEQ ID NO:11所示。

步骤(3)，将获得基因ShaCas9的编码序列在公司进行基因合成，并构建至pAAV2_ITR 骨架质粒上，得到质粒pAAV2_ShaCas9_ITR，如图2所示。

2、制备线性化质粒pAAV2_ShaCas9_ITR

步骤(1)，用BasI限制性内切酶将质粒pAAV2_ShaCas9_ITR进行酶切线性化，酶切体系： 1μg质粒pAAV2_ShaCas9_ITR，5μL 10xCutSmart缓冲液，1μLBasI内切酶，水补足至50μl， 37℃反应1小时。

步骤(2)，将酶切后的产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，120V电泳30分钟。

步骤(3)，切除7430bp大小的DNA片段，用胶回收试剂盒依据厂家提供的步骤进行回收，最终用超纯水进行洗脱。

步骤(4)，将回收的线性化质粒pAAV2_ShaCas9_ITR用NanoDrop测定DNA浓度，备用或置于-20℃进行长期保存。

3、构建质粒pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA

步骤(1)，设计sgRNA序列。

步骤(2)，在设计的sgRNA序列对用的正义链和反义链上分别加上线性化质粒pAAV2_

ShaCas9_ITR两侧对应的粘性末端序列，并在公司合成两条寡核苷酸单链DNA，具体序列为：

Oligo-F CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG(SEQ ID NO:4)，

Oligo-R AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC(SEQ ID NO:5)。

步骤(3)，寡核苷酸单链DNA进行退火变为双链DNA，退火反应体系：1μL 100μMoligo-F， 1μL 100μMoligo-R，28μL水，震荡混匀后，放置于PCR仪中运行退火程序：95℃_5min， 85℃_1min，75℃_1min，65℃_1min，55℃_1min，45℃_1min，35℃_1min， 25℃_1min，4℃保存，降温速率0.3℃/s。

步骤(4)，将退火后的产物与线性化质粒pAAV2_ShaCas9_ITR在DNA连接酶的作用下依据产品提供的步骤进行连接。

步骤(5)，取1μL连接产物进行化学感受态转化，将生长的细菌克隆进行Sanger测序验证。

步骤(6)，将测序验证连接正确的克隆摇菌，提取质粒pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA备用。

4、转染表达ShaCas9蛋白和sgRNA的质粒pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA

步骤(1)，第0天，根据转染所需，将含有sgRNA靶向位点的HEK293T细胞系在6孔板进行铺板，细胞密度约30％左右，靶位点序列如SEQ ID NO:6所示。

步骤(2)，第1天，进行转染，转染体系如下，

i.取2μg待转染质粒pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA加入至100μlOpti-MEM培养基中，轻轻吹打混匀；

ii.将2000轻弹混匀，吸取5μl加入至100μlOpti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5min；

iii.将稀释的2000和稀释的质粒进行混合，轻轻吹打混匀，室温静置20min，然后加入至待转染细胞的培养基中。

步骤(3)，将细胞置于37℃，5％的CO2培养箱中继续培养。

5、制备二代测序文库

步骤(1)，收集编辑3天后的HEK293T细胞，用DNA试剂盒依据产品提供的步骤提取基因组DNA。

步骤(2)，进行PCR建库第一轮PCR，用2xQ5 Mastermix进行PCR反应，PCR引物如SEQID NO:7-SEQ ID NO:8所示，反应体系如下：

PCR运行程序如下：

步骤(3)，进行PCR建库第二轮PCR，用2xQ5 Mastermix进行PCR反应，PCR引物如SEQID NO:9--SEQ ID NO:10所示，反应体系如下：

PCR运行程序如下：

步骤(4)，将第二轮的PCR产物用胶回收试剂盒依据厂家提供的步骤，纯化366bp大小的 DNA片段，二代测序文库制备完毕。

6、二代测序结果分析

步骤(1)，将制备好的二代测序文库交由公司在HiseqXTen上进行双端测序。

步骤(2)生物信息学分析二代测序结果，部分编辑结果如图2和图3所示。

7、内源位点验证

步骤(1)，将表达ShaCas9和sgRNA的质粒pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA通过 2000依据厂家提供的步骤转染至HEK293T细胞中，其中，

sgRNA序列为：AGATGCGGGTGATGATGCTCT，(SEQ ID NO:12)

靶位点的具体序列为：AGATGCGGGTGATGATGCTCTTTGG；(SEQ ID NO:13)

步骤(2)，提取编辑5天后的细胞基因组DNA，通过2x Q5 Master mix，用引物Test-F 和Test-R将靶向DNA序列进行扩增；其中：

Test-F的具体序列为：CAGGGAGTCGACGAGTTGAA，(SEQ ID NO:14)

Test-R的具体序列为：TAATTGCTGGCCTATCCACGC；(SEQ ID NO:15)

步骤(3)，将PCR产物通过琼脂糖凝胶回收，纯化570bp大小的DNA片段；

步骤(4)，依照T7 Endonuclease I的说明书对纯化的DNA片段进行酶切，然后跑胶检测，结果如图4所示，左侧为阴性对照组，转染时无sgRNA，T7 Endonuclease I切靶向序列后无切开的片段，说明未发生编辑；右侧为实验组，转染时有sgRNA，T7 Endonuclease I切靶向序列后出现切开的片段，说明发生了编辑。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用

<130> 1118

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1055

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Thr Asp Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Ile Ile Asn Tyr Asn Asp Lys Ser Ile Ile Asp Ala Gly

20 25 30

Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg

35 40 45

Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu

50 55 60

Glu Arg Val Lys Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Lys Leu Leu Asp Ser Ile

65 70 75 80

Asp Val Ile Pro Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Glu Ile Arg Val Arg Gly

85 90 95

Leu Arg Glu Lys Leu Thr Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His

100 105 110

Leu Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Ile Asp Val Ile Asp Gln Glu

115 120 125

Glu Asp Ala Ser Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Leu Ser Lys Asn

130 135 140

Asn Leu Leu Leu Arg Asp Lys Ser Ile Cys Glu Val Leu Leu Glu Arg

145 150 155 160

Tyr Asn Glu Gly Lys Val Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Ser

165 170 175

Asp Ile Val Asn Glu Ile Arg Gln Ile Leu Glu Thr Gln Lys Glu Val

180 185 190

His His Leu Asp Asp Ser Phe Ile Asp Lys Tyr Ile Glu Leu Val Glu

195 200 205

Thr Arg Arg Glu Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Tyr Gly

210 215 220

Trp Gly Ala Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu His Leu Met Gly Arg Cys

225 230 235 240

Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala

245 250 255

Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Gln Arg

260 265 270

Asp Gly Leu Asn Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu

275 280 285

Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ser Asn

290 295 300

Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys

305 310 315 320

Ser Gly Lys Glu Asn Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp Leu Lys

325 330 335

Lys Ile Leu Lys Asp Gln Ser Ile Leu Glu Asn Ile Gln Leu Leu Asp

340 345 350

Gln Ile Ala Glu Ile Ile Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Glu Ser Ile Lys

355 360 365

Lys Glu Leu Glu Gln Leu Thr Glu Pro Ile Asn Glu Ile Asp Lys Glu

370 375 380

Ser Ile Ser Asp Leu Ala Gly Tyr Asn Gly Thr His Arg Leu Ser Leu

385 390 395 400

Lys Cys Ile Asn Leu Val Leu Glu Glu Leu Trp His Thr Ser Arg Asn

405 410 415

Gln Met Glu Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Ile Lys Pro Arg Lys Ile Asp

420 425 430

Leu Gln Lys Ala Asn Lys Ile Pro Lys Asp Met Ile Asp Glu Phe Ile

435 440 445

Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Gly Gln Ala Ile Asn Val Ile

450 455 460

Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Val Pro Lys Asp Ile Ile Ile Glu

465 470 475 480

Leu Ala Arg Glu Asn Asn Thr Lys Asp Lys Gln Lys Phe Ile Asn Glu

485 490 495

Leu Gln Lys Lys Asn Glu Lys Thr Arg Gln Arg Ile Asn Glu Ile Ile

500 505 510

Gly Lys Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Leu Val Glu Lys Ile Arg

515 520 525

Leu His Asp Glu Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile

530 535 540

Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val Asp His

545 550 555 560

Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr Gln Asn Lys Val

565 570 575

Leu Val Lys Gln Thr Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Tyr

580 585 590

Gln Tyr Leu Asn Ser Gly Glu Ala Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys

595 600 605

Gln His Val Leu Asn Leu Ser Lys Ser Lys Asp Arg Ile Ser Lys Lys

610 615 620

Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val

625 630 635 640

Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr

645 650 655

Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asp Met

660 665 670

Asp Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asn His Leu Arg

675 680 685

Lys Val Trp Asp Phe Asn Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys His His

690 695 700

Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu

705 710 715 720

Asn Lys Lys Leu Lys Ala Ala Asn Lys Val Leu Glu Gln Pro Glu Arg

725 730 735

Lys Glu Ile Glu Thr Lys Ile Glu Val Asn Ser Asp Glu Asn Tyr Gln

740 745 750

Asp Leu Phe Val Ile Pro Gln Gln Val Lys Glu Ile Lys Glu Phe Arg

755 760 765

Asp Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Gln Leu

770 775 780

Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Val Lys Asp Asp Asp Leu Tyr

785 790 795 800

Ile Ile Ser Pro Ile Lys Asn Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Thr Asp Leu

805 810 815

Lys Lys His Phe Asn Lys Asn Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln Lys

820 825 830

Asp Pro Lys Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala

835 840 845

Asn Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr

850 855 860

Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Thr Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Ile

865 870 875 880

Lys Met Phe Gly Lys Lys Val Gly Asn His Leu Asp Val Thr Asn Gln

885 890 895

Tyr Asn Asn Ser Arg Asn Lys Leu Val Lys Leu Ser Phe Lys Ser Tyr

900 905 910

Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Val Ser Ile

915 920 925

Thr Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Tyr Ile Ser Glu

930 935 940

Ala Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Asn Lys Gly Ile Asp Asp Lys Ala

945 950 955 960

Lys Phe Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Asn Asp Leu Ile Glu Leu Asp Gly

965 970 975

Glu Val Tyr Thr Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Lys Asn Asn Val Ile

980 985 990

Glu Leu Asn Leu Pro Glu Ile Arg Tyr Lys Glu Tyr Cys Glu Ile Asn

995 1000 1005

Asn Ile Lys Gly Ser Gly Arg Leu Arg Ile Thr Ile Gly Lys Lys

1010 1015 1020

Val Asn Ser Ile Arg Lys Leu Ser Thr Asp Val Leu Gly Asn Arg

1025 1030 1035

Tyr Tyr Gln Ser Phe Ala Lys Lys Pro Gln Leu Val Phe Lys Lys

1040 1045 1050

Gly Ile

1055

<210> 2

<211> 101

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 2

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60

aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu u 101

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngrm 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccgctcgg agatcatcat tgcg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaccgcaat gatgatctcc gagc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(25)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

gctcggagat catcattgcg nnnnn 25

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(37)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngcg agaaaagcct tgttt 55

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc tctgaacttg tggccgttta c 51

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caagcagaag acggcatacg agatcactgt gtgactggag ttcagacgtg tg 52

<210> 11

<211> 3165

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgaagacag attacatcct gggcctggat atcggcatca ccagcgtggg ctatggcatc 60

atcaactaca atgacaagag catcatcgac gccggagtgc ggctgttccc cgaggccaat 120

gttgaaaaca acgagggcag aagaagcaag agaggcgcca gaaggctgaa gagacggcgg 180

attcaccggc tggaaagagt gaagcagctt ctgctggact acaagctgct ggacagcatc 240

gacgtgatcc ctcagtctac caacccctac gagatccggg tgcggggcct gagagagaag 300

ctgaccaaag acgagctggt gatcgcgctg ctccatttgg ctaagcgccg tggaattcac 360

aacatcgacg tgatcgacca ggaggaggat gccagcaacg agctgagtac aaaggagcag 420

ctgagcaaga acaatctgct gctgagagat aagagcatct gtgaagtcct gctggaacgg 480

tacaacgagg gcaaggtgcg cggagagaaa aacagattca aaacatctga tatcgtgaac 540

gagatcagac agattctgga gacacagaag gaagtgcacc acctggacga tagcttcatc 600

gacaagtaca tcgaactggt ggaaacccga agagaatatt acgagggccc tggcgaagga 660

agtccttacg gctggggagc cgatctgaag aagtggtacg agcacctgat gggccggtgc 720

acctacttcc ctgaggaact gagatccgtg aagtacgcct actcagccga cctgttcaat 780

gccctgaacg acctgaacaa cctggttatc cagagagacg gcctgaacaa gctggaatat 840

cacgagaagt accacatcat tgaaaacgtg ttcaagcaga aaaagaaacc tacactgaag 900

cagatcagca acgagatcgg cgtgaaccct gaagacatca agggctaccg gatcaccaaa 960

tctggcaagg agaatttcac cgagttcaag ttgtaccacg atctcaagaa gatcctgaaa 1020

gaccagagca tcctagaaaa tatccagctg ctggaccaga tcgccgagat catcacaatc 1080

taccaggaca aggagagcat taaaaaagaa ctggaacagc tcaccgagcc tataaatgaa 1140

atcgacaagg aatctatttc tgacctggct ggatacaacg gcacccacag actttctctg 1200

aagtgcatca acctggtgct ggaagaactg tggcacacca gcagaaatca aatggaaatc 1260

ttcgcctacc tgaacatcaa acccagaaag atcgacctgc agaaagctaa taaaatcccc 1320

aaggacatga tcgacgaatt catcctgagc cctgtggtga agcgaacatt cggccaggcc 1380

atcaacgtga ttaacaaggt gattgagaag tacggcgttc ctaaggacat catcatcgag 1440

ctcgccagag agaacaacac caaggacaag cagaaattca ttaacgaact ccagaagaaa 1500

aacgagaaaa ccagacagcg gatcaatgag atcatcggaa agaccggcaa ccagaacgcc 1560

aagagactgg tggaaaagat cagactgcac gacgagcagg agggaaaatg cctgtacagc 1620

ctggagagca tcccactgga ggacctcctc aacaacccca accactacga ggtggaccac 1680

atcataccta gaagcgtgtc ttttgataac agttatcaaa acaaggtgct cgtcaagcaa 1740

acagaaaaca gcaagaaggg gaatagaaca ccttaccagt acctgaacag cggcgaggct 1800

aagctgagct acaaccagtt caagcaacac gtgctgaacc tgagcaagag caaggataga 1860

atttccaaga agaagaaaga gtacctcctg gaggaacggg acattaacaa gttcgaggtg 1920

cagaaggaat tcatcaacag aaacctggtc gacacccgat atgccacccg cgagctgacc 1980

aattacctga aggcctattt cagcgctaac gatatggacg tgaaggtcaa gaccatcaat 2040

ggaagcttta ccaaccacct gcggaaggtt tgggacttca acaaggaaag aaaccacggc 2100

tacaaacacc acgccgagga tgccctgatc atcgccaatg ccgacttcct gtttaaggag 2160

aacaagaagc tgaaggccgc caacaaagtg ctggaacagc ctgagagaaa ggaaattgaa 2220

acgaagatcg aggtgaattc cgatgagaat taccaagatc tctttgtgat cccccagcag 2280

gtgaaagaaa tcaaggagtt tagagatttt aagtacagcc acagagtgga caaaaaacct 2340

aatagacagc tgatcaacga tacactgtac tccacaagag tgaaggacga cgacctgtac 2400

atcatatctc ctatcaagaa catctacagc aaagacaaca cagatctgaa gaagcacttc 2460

aacaaaaacc cagagaagtt cctgatgtac cagaaagacc ccaagacctt cgagaaactg 2520

gaagttatta tgaagcagta cgccaacgag aagaatcctc tggccaaata ccacgaggaa 2580

acaggcgagt acctgacgaa gtacagcaag accaacaacg ggccaatcgt gaaaagcatt 2640

aagatgttcg gcaagaaagt gggcaatcac ctggatgtga ccaaccagta caacaatagc 2700

cggaacaagc tggtgaagct gagcttcaaa agctacagat tcgacgtgta cctgacagac 2760

aagggctaca agttcgtgtc catcacctac ctggacgtgc tgaagaaaga gaattactac 2820

tacatcagcg aggccaagta cgacaaactg aaactaaaca agggcatcga tgacaaggcc 2880

aagttcatcg gcagcttcta ctacaacgac ctgatcgagc tggacggcga ggtgtacacc 2940

gtgatcggcg tgaataatga caagaacaac gtcatcgagc tcaatctccc cgaaattaga 3000

tacaaggaat actgcgagat taacaacatc aagggctccg gcagactccg gatcaccatc 3060

ggcaagaagg tgaactccat tcggaagctg tccaccgacg tgctcggcaa ccggtactac 3120

cagtctttcg ccaaaaagcc tcagctcgtg ttcaagaagg gaata 3165

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agatgcgggt gatgatgctc t 21

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agatgcgggt gatgatgctc tttgg 25

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cagggagtcg acgagttgaa 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

taattgctgg cctatccacg c 21

Claims

1. 一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统为ShaCas9蛋白和sgRNA复合体，能精确定位靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述ShaCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQ ID NO:2改造的sgRNA序列。

2. 根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞；所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo 大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40 转化的猴肾CVI 系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3 细胞、人U2-OS 骨肉瘤细胞、人A549 细胞、人K562 细胞、人HEK293 细胞、人HEK293T 细胞、人HCT116 细胞或人MCF-7 细胞或TRI 细胞。

3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述ShaCas9蛋白包括无切割活性或仅具有单链切割活性或具有双链切割活性的ShaCas9蛋白。

4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述精确定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。

5.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述精确定位靶向DNA序列包括ShaCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向DNA序列上的PAM序列。

6. 根据权利要求5所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述PAM序列为NNGRM，所述靶向DNA序列为SEQ ID NO3所示。

7.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA可以进行磷酸化、缩短、加长、硫化、甲基化或羟基化修饰。

8.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述ShaCas9蛋白和sgRNA复合体能精确靶向DNA序列指ShaCas9蛋白和sgRNA复合体可以识别并结合特定DNA序列，或指将与ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。

9.根据权利要求8所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述ShaCas9蛋白和sgRNA复合体或与ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控，所述修饰和调控包括基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。

10.根据权利要求9所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基转换器包括碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、胞嘧啶到胸腺嘧啶、胞嘧啶到尿嘧啶或其它碱基之间的转换。

11.如权利要求1-10之一所述的CRISPR/ShaCas9基因编辑系统在细胞中进行基因编辑的方法，包括通过ShaCas9蛋白和sgRNA的复合物识别定位靶向DNA，对DNA进行编辑；最后检测编辑效率；具体步骤为：

（1）合成人源化的ShaCas9基因序列；并克隆到表达载体上，得到pAAV2_ShaCas9_ITR；

（2）合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，退火后连接至质粒pAAV2_ShaCas9_U6_BsaI的BsaI酶切位点，得到pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA；

（3）将表达ShaCas9蛋白、sgRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中；

（4）将编辑后的靶位点进行PCR扩增，T7EI酶切或者二代测序检测编辑效率。

12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述pAAV2_ShaCas9-hU6-sgRNA为腺相关病毒骨架质粒，其包括AAV2 ITR、CMV增强子、CMV启动子、SV40 NLS、ShaCas9、nucleoplasmin NLS、3x HA、bGH poly(A)、人U6 启动子、BsaI内切酶位点、sgRNA scaffold序列。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，递送至细胞的CRISPR/ShaCas9系统包括表达ShaCas9蛋白或sgRNA的质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体或RNA或ShaCas9蛋白。

14. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA序列，即Oligo-F和Oligo-R序列为SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示。

15. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的细胞的靶位点具有SEQ IDNO6所示的核苷酸序列。

16. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤（4）中PCR的模板为编辑后的DNA；PCR扩增的引物序列为：SEQ ID NO7、SEQ ID NO8，SEQ ID NO9、SEQ ID NO10。

17.如权利要求1-10之一所述CRISPR/ShaCas9基因编辑系统的试剂盒，该试剂盒包括ShaCas9蛋白或靶向DNA序列的sgRNA或靶向DNA。

18.如权利要求1-10之一所述CRISPR/ShaCas9基因编辑系统的应用，包括基因敲除、定点碱基的改变、定点插入、基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。