CN109486854A - 一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，其是对稻瘟病感病水稻品种作为受体材料进行Bsr‑d1基因的启动子区域‑618位点的定点替换（A→G)，在进行Bsr‑d1基因的启动子区域的定点替换(A→G)时是通过农杆菌介导转基因手段实现对受体品种Bsr‑d1基因的启动子区域‑618位点的定点替换(A→G)，并筛选获得该位点的双突变植株；采用CRISPR/Cas9基因替换以及基因定点插入体系，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。

Description

一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法
技术领域：
本发明农业生产技术领域，具体涉及一农业生产的水稻种质资源生产领域，特别是一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法。
背景技术：
水稻，是全世界最重要的粮食作物之一，在世界约一半人口是水稻作为口粮，稻瘟病是水稻主要病害之一，在业界被称为“水稻癌症”，可造成水稻大幅度减产，情况严重时，减产量可达30%～50%，甚至颗粒无收，据不完全统计全世界因稻瘟病而至水稻减产损失在1.6亿吨以上。因此提高水稻对稻瘟菌的抗性一直以来都是水稻抗病育种工作的重要问题。
水稻对稻瘟病菌的抗性主要分为特异性抗性和非特异性抗性两种。特异性抗性，即利用水稻稻瘟病抗病（R）基因介导的对含有对应无毒基因的稻瘟菌生理小种所产生的抗性，这种抗性具有抗病效果强的特点，然而该抗性的局限在于范围狭窄且难以持久。由于稻瘟菌的毒性发生变异和优势小种的产生，通常抗病品种在推广3-5 年后就丧失其抗性，也因此该抗性在农业生产上受到较大限制。非特异性抗性又称广谱抗性，能使水稻对几乎所有稻瘟病菌均具有良好的抗病效果，与特异性抗性相比具有不易被克服，田间效果持久的特点，具有更大应用价值。虽然人类在长期的农业生产中选择出少量具有广谱抗性的水稻材料，然而这类抗性背后的作用机制一直不清楚。最近，四川农业大学陈学伟教授课题组在Cell杂志发表研究论文，报道了利用广谱高抗水稻地谷与基因组已经测序的66份非广谱抗病水稻进行GWAS（全基因组关联）分析，并应用高抗水稻地谷与高感材料丽江新团黑谷为亲本构建的重组自交系，抗病性经多年田间自然诱发和苗期接种鉴定，进行共相关分析，鉴定到一个与广谱抗病表型高度关联单核苷酸替换SNP位点（A→G）（距离起始密码子-618），该位点位于一个编码C2H2类转录因子基因Bsr-d1（LOC_Os03g32230）的启动子区。围绕这一SNP位点巧妙地开展了一系列实验，揭示了该转录因子正调控下游过氧化物酶基因表达，以及上游受MYBS1转录因子负调控该C2H2转录因子表达的一条完整的调控途径。地谷与其它感病水稻品种相比，Bsr-d1启动子区域中的MYBS1结合位点存在差异，进而导致MYBS1对地谷Bsr-d1的启动子具有更强的结合能力。该研究成果揭示一个崭新的水稻免疫转录调控网络：稻瘟菌通过某种未知机制诱导水稻中Bsr-d1转录因子的表达，从而导致水稻体内过氧化物酶水平的升高，这将有助于清除由于宿主PTI通路激活所产生的H2O2累积，进而为稻瘟菌的侵染减小压力；而Bsr-d1的启动子区域发生突变使得Bsr-d1的负调控转录因子MYBS1对其拥有更强的结合能力，从而降低了Bsr-d1和其所调控的过氧化物酶的表达，促进了水稻在受到稻瘟菌侵染时H2O2的累积，提高水稻对稻瘟菌的广谱抗性。若应用到实际生产中，可培育具有广谱抗病能力的品种，将大幅度提高水稻对稻瘟病的抵抗力，并将有效避免病源菌进化导致的抗病能力失效的问题，有效减少农药使用，非常符合生态绿色环保的需求。且这一变异位点在提高抗病性的同时，对水稻产量性状和稻米品质没有明显影响，因而具有十分重要的应用价值。
CRISPR/Cas9技术自诞生以来在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命，该技术已经广泛应用于包括农作物在内的各种生物体的基因组编辑。科学工作者利用该技术，创造了大量的植物内源基因功能缺失的突变体，为植物的功能基因组学研究和应用研究做出了巨大的贡献。然而对植物内源基因进行更为精确地修饰，如基因定点替换以及基因的定点插入等，仍然不是很清楚。近年，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组和李家洋研究组合作在Nature Plants杂志上在线发表文章，报道利用在修复途径中占主导地位的非同源末端连接（NHEJ）修复方式在水稻中建立了基于CRISPR/Cas9技术的基因替换以及基因定点插入体系。该研究通过在水稻5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因（OsEPSPS)）的第一内含子和第二内含子中分别设计一个有活性的靶位点并将两个靶位点构建到一个敲除载体中，同时构建了含有碱基定点替换（C518-T、C529-T和A531-G）的片段作为供体载体，且替换片段两端含有与敲除载体中相同的靶位点；利用基因枪法将敲除载体与供体载体共同转化水稻愈伤组织，由于水稻基因组和供体载体中都含有上述靶位点，敲除载体在基因组上切割产生两个DNA双链断裂、同时切割供体载体产生含有碱基定点替换的DNA片段；利用NHEJ修复方式，含有碱基定点替换的DNA片段替换原来基因组中位于两个靶位点之间的DNA片段，在水稻基因组中实现了基因的定点替换和定点插入。利用建立的基因定点替换和定点插入两种策略，实现对水稻内源OsEPSPS基因保守区两个氨基酸的定点替换（T102I和P106S, TIPS），在T0代获得了对草甘膦具有抗性转基因植株，且能够稳定遗传到下一代。该研究利用修复途径中占主导地位的NHEJ修复方式，在植物中建立的基因定点替换及定点插入策略具有简单、高效以及广适性的优点，大大拓展了CRISPR/Cas9技术在植物中的应用，尤其为植物种质资源创新提供了参考。
因此如何来利用一种以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，进行Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换（A→G），通过转基因手段，利用CRISPR/Cas9技术的基因替换以及基因定点插入体系，通过农杆菌介导实现对受体品种Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换（A→G），并筛选获得该位点的双突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，从而制备得到改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻改良新材料。为水稻稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创新方法开辟新途径，大大推动水稻稻瘟病抗病育种进程，这对于保障稻米的高产、稳产有着重要意义。
发明内容：
本发明针对传统杂交方法和直接通过转基因导入目的基因方法在水稻稻瘟病抗性改良方面存在的不足，提供一种崭新的稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法。以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，利用CRISPR/Cas9介导定点替换技术进行Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换（A→G），从而制备得到改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的改良水稻新材料，为水稻稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制提供了新方法，大大推动水稻稻瘟病抗病育种水平。
本发明公开一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，其是对稻瘟病感病水稻品种作为受体材料进行Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换（A→G)，在进行Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换(A→G)时是通过农杆菌介导转基因手段实现对受体品种Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换(A→G)，并筛选获得该位点的双突变植株；采用CRISPR/Cas9基因替换以及基因定点插入体系，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
所述的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，其所述创制方法包括如下方法步骤：
（1）CRISPR/Cas9介导定点替换靶位点的确定，
在受体材料水稻Bsr-d1基因的启动子区域突变位点两侧各选取一个特异靶标片段，靶标片段的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N为A、G、C、T中的任意一个；
（2）构建两靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，
按照（1）步所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻Bsr-d1基因的启动子区域打靶的两靶点CRISPR-Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述两个靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；
（3）构建替换片段供体载体，
通过化学合成方法获得的与地谷启动子序列一致的替换DNA片段，而后连接到pCAMBIA1300载体上，为替换片段供体载体；
（4）遗传转化
利用基因枪介导法将（2）步已构建好的两靶点CRISPR基因编辑载体和（3）步替换片段供体载体共同转入受体材料水稻品种，获得不少于200株独立转化植株；
（5）基因定点替换突变体植株检测
CRISPR基因编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在目标靶位点侧翼设计特异引物扩增转基因植株靶位点，而后送样PCR产物和T载体克隆质粒进行测序，最终筛选出完成目标靶位点定点替换的双等位突变植株，为基因定点替换突变体植株；
（6）筛选不携带转基因成分的双等位突变水稻
对于转基因手段获得的基因定点替换突变体植株，选择双等位突变水稻T0再生株系，种植结实收获T1代种子，根据Cas9 和潮霉素基因序列设计特异引物，筛选出T1代转基因阴性植株，即不携带Cas9 和潮霉素基因序列的双等位突变水稻植株，从而实现通过基因组编辑技术获得最终不携带任何转基因成分的水稻，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
优选的，是所述构建两靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，包括如下方法步骤，
1）根据靶位点序列合成两条携带接头引物TE，将合成好的两条携带接头引物TE分别各溶解成50-150 μM的母液，各取1μL加入到88-108 μL 0.5×TE混合稀释到1 μM；控制温度为85-95℃ ，时间25-45 Sec ，移至室温冷却完成退火；
2）分别将制备好靶点接头与经BsaI酶切后回收的CRISPR-Cas9克隆载体pYLgRNA-U3/U6a-c进行连接，连接程序为20-25℃ ，时间2-4h，于15-18℃下过夜连接；鉴定获得阳性克隆；
3）设计5’末端携带BsaI识别序列的引物，PCR扩增分别获得包含启动子和靶位点sgRNA的两个DNA片段，与经BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9-MH表达载体作3片段连接，获得同时携带两个不同靶位点引导RNA的重组载体，即两靶点CRISPR/Cas9重组载体。
所述向导RNA表达框包括CRISPR RNA(crRNA)和sgRNA，CRISPR RNA的序列为所述靶标区段的5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X或与之互补的序列。
所述根据Cas9 和潮霉素基因序列设计特异引物，是扩增Cas9基因的上游引物Cas9-F序列为GACAACAGCGACGTGGAC，扩增Cas9基因的下游引物Cas9-R序列为CTGGTGGTGCTCGTCGTATC；扩增潮霉素基因的上游引物HPT-F序列为GCTTCTGCGGGCGATTTGTG，下游引物HPT-R序列为CTGAACTCACCGCGACGTCTG。
优选的，是所述引物是根据定点替换片段侧翼序列的核苷酸序列特点，应用Primer Premier 5.0 设计软件，设计用于扩增定点替换区段的PCR特异引物；引物序列如下：上游引物TB-BSR-F序列为TAGCATCCACCGTTCCACAC；下游引物TB-BSR-R序列为GCGACGTGAGTACTTGGCTG。
本发明公开的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，具有如下有益特点：
一是，大幅度的缩短了水稻的育种周期，整个水稻种质资源材料定向创制过程耗时约7个月左右；而传统的杂交-回交方法至少需要3～5年时间。
二是，只改变了受体品种中一个基因启动子，所获水稻种质资源材料除稻瘟病抗性外其他农艺性状不变，而传统回交方法会导入与Bsr-d1基因连锁的其他基因，可能影响受体品种的农艺性状；
三是，本发明方法虽然借助转基因技术来完成实验方法，但最终获得的成果是不携带任何转基因成分的稻瘟病广谱抗性水稻，这样一种新型稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创新方法在国内外还未见相关报道；
四是， 思路创新，
本发明一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，利用CRISPR/Cas9介导基因替换，实现对水稻品种Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换（A→G），从而获得具有稻瘟病广谱抗性的改良水稻种质资源材料
附图说明：
图1为本发明的两个靶位点CRISPR/Cas9敲除克隆载体构建流程图；
图2 CRISPR/Cas9表达载体pYLCRISPR/cas9-MH图；
图1中5’末端携带BsaI识别序列的引物，PCR扩增分别获得包含启动子和靶位点sgRNA的两个DNA片段和图2中经BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9-MH表达载体作3片段连接，获得同时携带两个不同靶位点引导RNA的重组载体，其中，B1’ and B3 末端分别与 pYLCRISPR/Cas9-MH的 B1和 BL’末端互补，B2与B2’末端互补；
A: 靶位点一克隆载体构建及sgRNA扩增；B: 靶位点二克隆载体构建及sgRNA扩增。
具体实施方式：
下面结合附图及具体实施方式对本发明的具方方法作进一步的详细说明，本发明具体实施方法中使用材料如植物表达载体pCAMBIA1300、CRISPR/Cas9克隆载体，pYLgRNA-U3/U6a-c如图1中所示，用于单子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9双元载体，pYLCRISPR/Cas9-MH及大肠杆菌DH10B和DH5α以及农杆菌菌株EHA105。均可市售或现有技术方法制备获得且发明人所制备拥有。
实施例，
本发明一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，进行Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换（A→G），通过转基因手段，按照CRISPR/Cas9技术的基因替换以及基因定点插入体系，通过农杆菌介导实现对受体品种Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换（A→G），并筛选获得该位点的双突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻改良新材料。本发明的方法具体为一是转基因水稻受体材料Bsr-d1基因的启动子区域序列分析；二是敲除靶点选择及CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建。三是转基因水稻受体材料愈伤组织诱导。四是完成CRISPR/Cas9定点敲除后的T0代转基因植株突变检测筛选出T1代转基因阴性植株为不携带转基因成份且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
本明是以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，进行Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换（A→G），包括如下方法步骤：
（1) 稻瘟病感病水稻品种确定，
（2）Bsr-d1启动子突变位点侧设计两个靶标位点，重叠PCR扩增获得两个DNA片段
（3）两靶点CRISPR/Cas9重组载体及供体载体构建，
（4）完成CRISPR/Cas9定点敲除后的T0代转基因植株，
（5）筛选双等位突变体，
（6）自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
本发明公开一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，进行Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换A→G，包括如下方法步骤：
（1）CRISPR/Cas9介导定点替换靶位点的确定
在水稻Bsr-d1基因的启动子区域突变位点两侧各选取一个特异靶标片段，靶标片段的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N为A、G、C、T中的任意一个；
（2）两靶点CRISPR基因编辑载体构建
按照所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻Bsr-d1基因的启动子区域打靶的两靶点CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述两个靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框包括CRISPR RNA(crRNA)和sgRNA，CRISPR RNA的序列为所述靶标区段的5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X或与之互补的序列；
（3）替换片段供体载体构建
通过化学合成方法获得的与地谷启动子序列一致的替换DNA片段，而后连接到pCAMBIA1300载体上；
（4）遗传转化
一方面，利用基因枪介导法将已构建好的两靶点CRISPR基因编辑载体和替换片段供体载体共同转入受体水稻品种，获得不少于200株独立转化植株；
（5）基因定点替换突变体植株检测
CRISPR基因编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在目标靶位点侧翼设计特异引物扩增转基因植株靶位点，而后送样PCR产物和T载体克隆质粒进行测序，最终筛选出完成目标靶位点定点替换的双等位突变植株；
（6）不携带转基因成分的双等位突变水稻筛选即不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻；
对于转基因手段获得的再生植株，选择双等位突变水稻T0再生株系，种植结实收获T1代种子，根据Cas9 和潮霉素基因序列设计特异引物，即扩增Cas9基因的上游引物Cas9-F序列为GACAACAGCGACGTGGAC，扩增Cas9基因的下游引物Cas9-R序列为CTGGTGGTGCTCGTCGTATC；扩增潮霉素基因的上游引物HPT-F序列为GCTTCTGCGGGCGATTTGTG,下游引物HPT-R序列为CTGAACTCACCGCGACGTCTG，筛选出T1代转基因阴性植株，从而实现通过基因组编辑技术获得最终不携带任何转基因成分的具有广谱稻瘟病抗性改良水稻。自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
如图1、2所示，本项目的研究目标为最终获得Bsr-d1基因启动子区域-618位点定点替换（A→G）成功且具有稻瘟病光谱抗性的水稻改良新材料，
（1）两靶点CRISPR/Cas9敲除表达载体构建
1）根据靶位点序列合成两条携带接头的寡聚引物，将合成好的接头引物TE溶解成100μM母液，各取1μL加入到98 μL 0.5×TE混合稀释到1 μM。约90℃ 30 Sec ，移至室温冷却完成退火。
2）分别将制备好靶点接头与经BsaI酶切后回收的CRISPR/Cas9克隆载体pYLgRNA-U3/U6a-c（图1）进行连接，连接程序为22℃ 3h，16℃过夜连接，所谓过夜连接是指10-24小时连接，鉴定获得阳性克隆。
3）设计5’末端携带BsaI识别序列的引物，PCR扩增分别获得包含启动子和靶位点sgRNA的两个DNA片段如图1所示，与经BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9-MH表达载体如图2所示，作3片段连接，其中，B1’ and B3 末端分别与 pYLCRISPR/Cas9-MH的 B1和 BL’末端互补，B2与B2’末端互补，获得同时携带两个不同靶位点引导RNA的重组载体，如图1、图2所示；
（2）引物设计
根据定点替换目标位点侧翼序列的核苷酸序列特点，应用Primer Premier 5.0 设计软件，设计用于扩增定点替换区段的PCR特异引物。上游引物TB-BSR-F序列为TAGCATCCACCGTTCCACAC；下游引物TB-BSR-R序列为 GCGACGTGAGTACTTGGCTG。
本项目研究中，利用CRISPR/Cas9介导基因替换，实现对水稻品种Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换A→G，从而获得具有稻瘟病广谱抗性的改良新材料即改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。这在创制水稻稻瘟病抗性材料的研究方面均还有的创新。
完成CRISPR/Cas9定点敲除后的T0代转基因植株突变检测筛选出T1代转基因阴性植株。
需要说明的是：以上本发明所公开的上述的技术方案，非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。都应属于本发明技术方案保护的范围。

Claims (6)

1.一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料，其特征是对稻瘟病感病水稻品种作为受体材料进行Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换（A→G)，在进行Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换(A→G)时，是通过农杆菌介导转基因手段实现对受体品种Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换(A→G)，并筛选获得该位点的双突变植株；采用CRISPR/Cas9基因替换以及基因定点插入体系，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
2.根据权利要求1所述的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，其特征是所述创制方法包括如下方法步骤：
（1）CRISPR/Cas9介导定点替换靶位点的确定，
在受体材料水稻Bsr-d1基因的启动子区域突变位点两侧各选取一个特异靶标片段，靶标片段的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N为A、G、C、T中的任意一个；
（2）构建两靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，
按照（1）步所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻Bsr-d1基因的启动子区域打靶的两靶点CRISPR-Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述两个靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；
（3）构建替换片段供体载体，
通过化学合成方法获得的与地谷启动子序列一致的替换DNA片段，而后连接到pCAMBIA1300载体上，为替换片段供体载体；
（4）遗传转化
利用基因枪介导法将（2）步已构建好的两靶点CRISPR基因编辑载体和（3）步替换片段供体载体共同转入受体材料水稻品种，获得不少于200株独立转化植株；
（5）基因定点替换突变体植株检测
CRISPR基因编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在目标靶位点侧翼设计特异引物扩增转基因植株靶位点，而后送样PCR产物和T载体克隆质粒进行测序，最终筛选出完成目标靶位点定点替换的双等位突变植株，为基因定点替换成功的突变体植株；
（6）筛选不携带转基因成分的双等位突变水稻
对于转基因手段获得的再生植株，选择双等位突变水稻T0再生株系，种植结实收获T1代种子，根据Cas9 和潮霉素基因序列设计特异引物，筛选出T1代转基因阴性植株，为不携带Cas9 和潮霉素基因序列的双等位突变水稻植株，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
3.根据权利要求2所述的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，其特征是步骤（2）所述构建两靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，包括如下方法步骤，
1）根据靶位点序列合成两条携带接头引物TE，将合成好的两条携带接头引物TE分别各溶解成50-150 μM的母液，各取1μL加入到88-108 μL 0.5×TE混合稀释到1 μM；控制温度为85-95℃ ，时间25-45 Sec ，移至室温冷却完成退火；
2）分别将制备好靶点接头与经BsaI酶切后回收的CRISPR-Cas9克隆载体pYLgRNA-U3/U6a-c进行连接，连接程序为20-25℃ ，时间2-4h，于15-18℃下过夜连接；鉴定获得阳性克隆；
3）设计5’末端携带BsaI识别序列的引物，PCR扩增分别获得包含启动子和靶位点sgRNA的两个DNA片段，与经BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9-MH表达载体作3片段连接，获得同时携带两个不同靶位点引导RNA的重组载体，即两靶点CRISPR/Cas9重组载体。
4.根据权利要求2所述的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，其特征是所述向导RNA表达框包括CRISPR RNA(crRNA)和sgRNA，CRISPR RNA的序列为所述靶标区段的5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X或与之互补的序列。
5.根据权利要求2所述的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，其特征是步骤（6）所述根据Cas9 和潮霉素基因序列设计特异引物，是扩增Cas9基因的上游引物Cas9-F序列为GACAACAGCGACGTGGAC，扩增Cas9基因的下游引物Cas9-R序列为CTGGTGGTGCTCGTCGTATC；扩增潮霉素基因的上游引物HPT-F序列为GCTTCTGCGGGCGATTTGTG,下游引物HPT-R序列为CTGAACTCACCGCGACGTCTG。
6.根据权利要求3所述的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法，其特征是所述引物是根据定点替换片段侧翼序列的核苷酸序列特点，应用Primer Premier 5.0 设计软件，设计用于扩增定点替换区段的PCR特异引物；引物序列如下：上游引物TB-BSR-F序列为TAGCATCCACCGTTCCACAC；下游引物TB-BSR-R序列为 GCGACGTGAGTACTTGGCTG。
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