CN111690660A - 水稻转录因子基因OsMYBS1及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及水稻转录因子基因OsMYBS1及其编码蛋白与应用；所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2的多核苷酸所示；编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；通过过表达载体构建和农杆菌介导的遗传转化，将其转入到粳稻品质合江19(H1493)中，过表达的植株出现植株发育异常和对褐飞虱的抗性增强效应，主要表现在：叶片发黄、株高变矮、叶片变宽、叶片变短，OE‑OsMYBS1上生长的褐飞虱跟WT上生长的相比蜜露量减少；本发明的基因研究基因分子功能和在水稻抗褐飞虱分子辅助育种或水稻种质资源改良中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及水稻转录因子基因OsMYBS1及其编码蛋白与应用。
背景技术
水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食，同时水稻也是目前农业生产和科学研究的热点植物，作为科学研究的模式植物，在完成水稻全基因组计划之后，其功能基因组的研究得到越来越多的广泛关注，特别是对一些调控水稻重要农业性状基因的研究日益受到研究人员的重视。
转录因子在植物的生长发育中起重要作用，例如OsMADS57可以调控水稻的分蘖(Guo等，2013，The interaction between OsMADS57 and Os TB1 modulates ricetillering via DWARF14.Nat Commun.doi:10.1038/ncomms2542)；OsMYB103L可以引起水稻叶片的卷曲(Yang等，2014,OsMYB103L,an R2R3-MYB transcription factor,influences leaf rolling and mechanical strength in rice(Oryza sativa L.).BMCPlant Biol 14:158)。转录因子对水稻的生长发育起到各个方面的影响，而作为转录因子的OsMYBS1,对水稻哪些方面的影响是本发明要说明的问题。
褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal,简称BPH)属于同翅目飞虱科昆虫,是水稻的主要害虫。褐飞虱在我国分布广泛，有极强的季节性、迁飞性和繁殖能力，爆发时常造成稻株枯萎、减产甚至绝收。稻飞虱在取食水稻的同时还传播水稻病害，加重了对水稻的危害，从而对水稻种植造成更大的损失。已有研究表明，利用水稻自身抗性培育抗褐飞虱水稻品种是防治褐飞虱最有效、最经济、最安全的措施之一。然而由于褐飞虱的迁飞性以及具有不同生物型等特点，含有单一抗性基因的水稻品种在种植几年后会逐渐丧失其抗性。因此挖掘和利用广谱性基因、聚合多个抗性基因或采用含有不同抗性基因的品种进行轮作等措施，是获得具有持久、广谱抗褐飞虱性状的水稻品种的重要途径。
近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，水稻的褐飞虱抗性基因陆续被定位、克隆。目前已经定位了30个以上的抗褐飞虱主效基因，其中大部分基因在染色体上成簇分布，其中，在水稻的第12号染色体上分布着最大的抗褐飞虱基因簇，包括BPH1、BPH2、BPH7、BPH9、BPH10、BPH18、BPH21、BPH26共8个基因。
因此，发现高效的抗褐飞虱的水稻转录因子OsMYBS1的基因具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻转录因子OsMYBS1的基因及其功能研究。
本发明的另一个目的是提供OsMYBS1超表达的转基因材料以及改良植物品质的应用。
本发明还提供了所述基因在水稻选育中的应用，所述水稻选育为降增强对褐飞虱的抗性。
本发明的具体技术方案为：
水稻转录因子基因OsMYBS1，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
所述水稻转录因子基因OsMYBS1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸。
所述水稻转录因子基因OsMYBS1的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
含有所述水稻转录因子基因OsMYBS1的cDNA序列所述多核苷酸的载体。
含有所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
一种如SEQ ID NO.2所示的所述的多核苷酸或所述多核苷酸的载体在制备转基因植物中的应用。
一种含有权利要求1所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段在水稻抗褐飞虱分子辅助育种或水稻种质资源改良中的应用。
一种含有所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段的表型，包括叶片发黄、株高变矮、叶片变宽、叶片变短、对褐飞虱的抗性增强。所述叶片变黄的原因包括叶绿素含量降低。
一种培育抗褐飞虱植物的方法，包括如下步骤：
1)用多核苷酸转化植物细胞，所述多核苷酸所述水稻转录因子OsMYBS1的ORF，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
2)将被转化的植物细胞再生为植物；
3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到过量表达。
一种水稻转录因子基因OsMYBS1转基因植株的检测试剂盒，含有引物Hyg-L和Hyg-R序列如下所示：
Hyg-L：GCTCCATACAAGCCAACCAC(5'-3')
Hyg-R：GAAAAAGCCTGAACTCACCG(5'-3')
PCR扩增出728bp的扩增片段，则说明是转基因阳性植株，若没有扩出这个片段则说明是转基因阴性植株。
本发明的基因来源于粳稻品质合江19(H1493)的基因组以及cDNA。通过定量PCR分析，OsMYBS1基因在生长发育的各个时期都有表达，呈组成型表达模式，但是在抽穗期叶鞘中表达量最高，其次是二分蘖期的叶片和抽穗期的剑叶和倒二叶，幼芽幼根以及二分蘖期的根中表达量非常低，茎和幼穗的表达量相对居中。
本发明提供水稻转录因子OsMYBS1，根据NCBI中日本晴的分析，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因全长1976bp，具有1个内含子和2个外显子，其CDS区段分别为1-918和1040-1976，cDNA全长1855bp，ORF全长909bp。
本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，对其替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的氨基酸序列，例如，在不同水稻背景下的序列，替换或者缺失一个或几个核苷酸，编码的氨基酸序列没有移码突变，仅仅出现部分氨基酸的缺失或者点突变。因此，本发明所述的基因还包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，编码302个氨基酸，其ORFSEQ ID NO.4所示。
应该理解为，在不影响OsMYBS1蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还包括基于所述多核苷酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
本发明的有益效果：
1.水稻转录因子基因OsMYBS1是转录因子参与水稻生长发育过程的一个很好的实例，这对理解转录因子功能以及对生长发育调控具有一定的参考价值。
2.由于OsMYBS1基因的具有很好的多效性，基因过量表达后对褐飞虱的抗性增强，此基因可以用于育种工作中。
3.由于植物细胞中，转录因子是一个很大的家族，因此OsMYBS1基因的研究对于研究工作者以后研究其他的转录因子具有很好的参考价值。
附图说明
图1为OsMYBS1基因的组织表达模式，呈现组成型表达模式，在各个时期都有表达，但是在叶鞘中表达量最高；
图2为亚细胞定位，定位在细胞核中；
图3为转基因材料的Southern杂交结果；
图4为转基因材料的定量PCR结果；
图5为转基因株系OE-1的植株表型，与对照H1493相比，植株变矮、叶片发黄明显、叶片变短变宽(标尺代表10厘米长度)；
图6为不同转基因株系剑叶长和宽的测定；
图7为不同转基因株系叶绿素含量测定；
图8为不同转基因株系褐飞虱蜜露量的测定。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明进行详细描述，以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
水稻转录因子基因OsMYBS1，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
所述水稻转录因子基因OsMYBS1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸。
所述水稻转录因子基因OsMYBS1的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
含有所述水稻转录因子基因OsMYBS1的cDNA序列所述多核苷酸的载体。
含有所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
一种如SEQ ID NO.2所示的所述的多核苷酸或所述多核苷酸的载体在制备转基因植物中的应用。
一种含有权利要求1所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段在水稻抗褐飞虱分子辅助育种或水稻种质资源改良中的应用。
一种含有所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段的表型，包括叶片发黄、株高变矮、叶片变宽、叶片变短、对褐飞虱的抗性增强。所述叶片变黄的原因包括叶绿素含量降低。
一种培育抗褐飞虱植物的方法，包括如下步骤：
1)用多核苷酸转化植物细胞，所述多核苷酸所述水稻转录因子OsMYBS1的ORF，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
2)将被转化的植物细胞再生为植物；
3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到过量表达。
一种水稻转录因子基因OsMYBS1转基因植株的检测试剂盒，含有引物Hyg-L和Hyg-R序列如下所示：
Hyg-L：GCTCCATACAAGCCAACCAC(5'-3')
Hyg-R：GAAAAAGCCTGAACTCACCG(5'-3')
PCR扩增出728bp的扩增片段，则说明是转基因阳性植株，若没有扩出这个片段则说明是转基因阴性植株。
若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述得重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
【实施例1】水稻OsMYBS1基因的获得
通过对类凝集素受体蛋白激酶OsLecRK在水稻9311文库筛选互作蛋白找到一个转录因子OsMYBS1蛋白，通过设计引物在籼稻9311的cDNA中扩增得到基因的ORF序列，通过与数据库中的日本晴序列比对，发现只有12个核苷酸缺失，并且不引起移码突变，在本发明中可理解为同一个基因的不同水稻品种的差异，然后通过网站上日本晴序列作参考，将ORF序列两端各截取一段设计引物，扩增籼稻9311的cDNA得到的序列即是OsMYBS1基因的909个bp的ORF序列。
【实施例2】水稻OsMYBS1基因组织表达模式
为了了解OsMYBS1基因的表达情况，取H1493(本发明用到的转基因受体材料，来自武汉大学何光存教授实验室)不同时期的样品做组织表达模式，结果此基因在抽穗期的叶鞘中表达量最高，其次是二分蘖期以及抽穗期的叶片(图1)，因为抽穗期的剑叶相对比较稳定，相对表达量也比较高，因此后续的取样和检测一般选用剑叶。
其中所用定量PCR的引物为：
OsMYBS1Q-F:GGCTGGACAAGTTCGGCAAGG(5'-3')
OsMYBS1Q-R:CGGTCGCGGTTCATGGAGT(5'-3')
组织表达模式分析包括提取RNA，反转录，然后定量PCR。
1.1植物总RNA的提取：外界环境中存在较多降解mRNA的RNAase，因此mRNA非常容易降解，在提取时要格外小心和注意，做好充分的准备工作，准备工作主要包括以下几个方面：
DEPC水准备：将300μl的DEPC水加入到含300ml蒸馏水的试剂瓶中，使得DEPC水终浓度为0.1％(V/V)，拧紧盖子，在150rpm摇床中振荡过夜，再在121℃灭菌锅中高温灭菌20min后，置于室温下保存备用。
准备：1.5ml离心管、带盖PCR管、各种型号的枪头(10μl、100μl、1ml)等用氯仿或者是经121℃灭菌的0.1％的DEPC水侵泡15-20min，121℃高温高压灭菌20min，以灭活RNAase，55℃烘箱烘干备用。
同时将研钵、研杵、药勺、镊子等洗净后于55℃烘箱中烘干，在通风橱中用氯仿浸泡30min以上备用，使用前加液氮预冷。
采用TRIzol试剂(Invitrogen,USA)抽提水稻各组织mRNA，具体操作步骤如下：
第一步，先带好口罩和手套，然后将新鲜的保存在液氮中的样品材料放入到已倒入液氮的研钵中，研磨4次以上，磨成极细的粉末(研磨过程中不能让液氮完全挥发，使样品一直处在液氮低温环境中)，在粉末解冻前用小勺分装到预先加有1ml RNAiso Plus的EP管中，每管50～100mg，抖动离心管以便液氮挥发完后立即盖紧盖子(液氮没有挥发完时盖子会爆开，如果TRIzol溅到皮肤上，会严重伤害皮肤)，上下颠倒混匀，用力振荡，使样品与试剂充分混匀，室温放置5min，然后放到冰中等待进行后续操作。
第二步：A，加入氯仿200μl，用力振荡15sec，室温孵育2-5min。B，4℃，12,000g，离心15min。离心后混合液分为3层，下层红色的酚-氯仿相、中间半固体相和上层无色水相。上层水相含RNA，中间半固定相为DNA，下层是有机溶剂。C，转移500μl上清至新的EP管中，加入2倍体积即1ml预冷的无水乙醇沉淀RNA，上下颠倒混匀，静置于-20℃中1h以上或者过夜。D，4℃，12,000g，离心10min，离心管底部有可见的白色沉淀，即是所提取的RNA。E，弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀(先加750μl无水乙醇，再加250μl DEPC水或RNase-free水，顺序不能反，否则RNA会溶解于水中)，上下颠倒离心管数次，4℃，12,000g，离心5min。F，倒掉上清，用枪头吸干残留液，在超净台上吹大约5min(观察管内已经没有液体，并且RNA沉淀边缘已经透明)，每管加入30-50μl DEPC水或RNase-free水溶解RNA，立即使用或者在-80℃冰箱中保存。
RNA浓度的测定：在Nanodrop 2000C分光光度计上进行，打开软件，选择“NucleicAcid”，RNA，取2μl DEPC水或RNase-free水加入到基座上，清洗2次，Blank，取2μl RNA样品进行测定，仪器半小时左右要Blank一次，得到RNA的浓度，OD260/280和OD260/230等指标。
电泳检测：1％琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的质量和浓度。即取1-2μl RNA加入7-8μl RNase-free水，再加入1μl loadingbuffer后电泳，条带为28S和18S两条主带，28S的亮度是18S的两倍且无拖尾，则表明RNA没有降解，可进行后续实验。
1.2反转录成cDNA
RNA的反转录按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)的操作步骤进行。
总RNA中gDNA的去除。根据分光光度计所测浓度用RNase-free H2O将提取的RNA稀释到1000ng/μl，按如下配制反应体系：
置PCR仪中在37℃孵育30min，然后再加入EDTA终止反应，每管加入2μl 25mMEDTA，65℃，10min终止反应，此时的RNA可作为cDNA第一链合成的模板。
在上述PCR管中加入1μl oligo(dT)18primer(0.5μg/μl)，混匀后置PCR仪中65℃变性5min，冰上放置2min。冰上配制Mix后加入PCR管中并混匀，体系如下：
5x reactionbuffer 4μl
10mM dNTPmix 2μl
RiboLockTM RNase Inhibior(20U/μl)1μl
RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μl)1μl
置PCR仪中42℃反应60min，70℃反应10min以便终止反应。按1:10的比例稀释后则可用作定量PCR分析的模板，反应原液保存于-20℃中。
1.3荧光定量PCR分析：
本实验室使用的荧光定量PCR仪和荧光定量PCR反应仪器。
反应体系如下:
反应程序为：
1)95℃变性2min
2)95℃变性5-10s
3)TM(50-65℃)退火延伸10-60s(100bp,10s；250bp,30s；大于250bp,60s)
重复2)、3)步骤40个循环
65℃-95℃，每步增加0.5℃，5s做溶解曲线以确定扩增产物的特异性。
首先对不同引物做50-65℃梯度PCR以确定最适退火延伸温度(起峰早，峰单一并且峰值较高，溶解曲线特异，依据这些指标选择合适的退火温度)，取PCR产物稀释105后作为第一个梯度，然后再10倍稀释3个梯度，即分别是稀释105、106、107、108倍。通常以这四个模板作标准曲线来筛选扩增效率高的引物作为基因的定量引物。每一个样品做3次技术重复，原则上来说每一板PCR都必须要求做扩增效率。定量的结果采用Bio-Rad CFX Manager来分析，首先对其溶解曲线，QC(质控)等进行分析，去除不达标数据，用软件自带GeneStudy功能按(1+E)-ΔΔCt算法分析目的基因的表达。
【实施例3】水稻OsMYBS1基因的亚细胞定位
将OsMYBS1基因全长ORF两端设计引物，加入NcoI的酶切位点和保护碱基，扩增片段回收后用NcoI酶进行酶切，连入到用同样酶酶切的载体HBT95:sGFP(S65T)-NOS中，将阳性克隆送测序，确定是没有突变的正向连接的进行提质粒，载体即构建成功，然后利用基因枪将构建好的载体转化到洋葱表皮细胞。具体流程如下：
首先，称取30mg直径为1μm的金粉，放入1.5ml的离心管中，加入1ml 75％乙醇涡旋震荡洗涤15分钟，离心去上清，重复此过程两次，然后1ml无菌水洗一次，最后加入500μl无菌水重悬，存于-20℃备用。将洋葱表皮细胞剥离并放置在MS培养基或者灭菌水润湿的滤纸上备用。然后将5μl的OsMYBS1-GFP融合蛋白表达质粒(浓度1μg/μl)与10μl上述金粉悬浮液在涡旋状态下依次加入12.5μl 2.5M CaCl2和5μl 0.1M亚精胺充分震荡3分钟，再静置10分钟，离心去上清，用无水乙醇清洗并加入15μl无水乙醇重悬。最后利用基因枪(PDS-1000/HeBiolistic Particle Delivery System，Bio-Rad，加拿大)将包被好的金粉打入事先准备好的洋葱表皮细胞中。轰击后，将培养皿至于28℃黑暗下培养过夜。培养后的细胞用DAPI(4’6-diamidino-2-phenylindole)染色。再在共聚焦显微镜下进行观察。发现对照35S::GFP核质中都有大量表达，而阳性质粒35S::OsMYBS1-GFP只在核中表达(图2)，这与其是个转录因子，在核中发挥生物学功能是相符的。
【实施例4】OsMYBS1基因过表达载体构建和农杆菌介导的遗传转化
1.OsMYBS1过表达载体构建
发明人将OsMYBS1的ORF两端各截取一段设计引物，序列如下：
OEV-F:ATGACCTCCCAGGCGG(5'-3')
OEV-R:TCATTGGTGCATCTTGGC(5'-3')
所用载体为pCXUN(购自武汉禾泰青生物科技有限公司)，采用XcmI酶切pCXUN载体。根据SEQ ID No.2的系列情况，以籼稻9311的cDNA为模板进行扩增得到OsMYBS1的全长，用XcmI酶酶切，然后DNA连接酶把酶切后的载体和片段进行连接，转化大肠杆菌Top10。测序验证无误后，所得载体即为OsMYBS1基因过表达载体，然后提质粒，将其电转入农杆菌EHA105中。挑取单克隆扩大培养，进行PCR验证无误后，加等体积的50％甘油混匀，－70℃保存备用。载体构建时要使用高保真酶KOD-Plus-Neo(TOYOBO，日本)扩增以降低所扩增序列碱基突变的可能性。PCR条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火延伸30s/kb，35个循环；16℃保存。
2.遗传转化
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedbyAgrobacterium and sequenceanalysis ofthe boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6:271-282)将上述OsMYBS1基因过表达载体导入粳稻品种H1493。
将上述OsMYBS1基因过表达载体导入粳稻品种H1493，包括将载体质粒转入农杆菌菌株EHA105，愈伤组织的诱导，继代，前培养，农杆菌的培养和悬浮，感染和共培养，农杆菌的去除，愈伤组织的筛选，分化与移栽，炼苗及移植，检测。具体如下：
2.1愈伤组织的筛选
1)将干燥的愈伤转入N6固体培养基(含400mg/L的头孢霉素)进行第一次筛选，28℃暗培养箱中培养7-10天。2)将没有被农杆菌污染的愈伤转入含有头孢霉素(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的N6固体培养基中，28℃暗培养箱中培养15-20天。
3)将愈伤转入仅含有潮霉素(50mg/L)的N6固体培养基中，28℃暗培养箱中培养15-20天。4)第二次将愈伤转入仅含有潮霉素(50mg/L)的N6固体培养基中，28℃暗培养15-20天。
2.2分化与移栽
1)将筛选后的愈伤组织移入含有潮霉素(50mg/L)的MS培养基中，28℃暗培养箱中培养，进行预分化7-10天。2)选出长势良好的淡黄色愈伤，移入MS培养基中，光培养箱中培养15-30天，可看到有绿芽长出，期间可换一次培养基。3)当绿芽的长度达到2cm左右时，剥去周围多余的愈伤，剪去根，移入1/2MS生根培养基中。
2.3炼苗及移植
当绿苗长至三叶期(约15天)，根系发达时，打开试管口，使幼苗适应外界环境2-3天，洗掉幼苗根部的固体培养基，将根部修剪至3cm左右，剪掉蒸叶，浸泡于自来水中炼苗3-5天，然后可将幼苗移植到土壤中。
2.4转基因植株的PCR检测
2.4.1T0代阳性检测
小量DNA抽提：取长2cm左右的幼嫩水稻叶片，放入到2ml的离心管中(圆底)，每管中加入1个铁珠和700μl的1.5×CTAB，用植物研磨仪(MP)研磨至浆状。吸出铁珠，65℃温育1h左右，中间上下颠倒震荡几次。冷却至室温后，加入等体积氯仿：异戊醇(体积比24：1)。在离心机转速13,200rpm条件下室温离心10min。取上清500μl，加入1ml的冰冷的无水乙醇(或者500μl的异丙醇)，上下颠倒混匀后置-20℃冰箱1h以上。13,200rpm，室温离心15min。倒掉上清，注意倒的时候要慢，放置底部的沉淀被倒出，加入800μl的75％的乙醇洗涤沉淀。倒掉上清，自然风干或者放置在37℃的烘箱中30min以上干燥，如果管内没有液体，说明干燥完成，加入100μl TE或者ddH2O溶解沉淀。
2.4.2PCR检测本研究是以转基因植株DNA为模板，潮霉素基因上面设计的引物进行检测，或者用载体上的序列设计的引物进行扩增检测。
检测转基因植株表型
获得转基因植株10株，用引物Hyg-L和Hyg-R进行PCR扩增检测，其中阳性植株5株，后取T1代混合植株样品提DNA，用Southern检测，单拷贝有4株(图3)。
将T1代阳性植株，取剑叶提RNA，反转成cDNA，用定量PCR检测其表达量(图4)，三个不同转基因株系的过表达效果明显，出现植株变矮，叶片发黄，叶片变宽变短等生物学特征(图5)。
对所有的转基因材料进行扩繁，得到稳定遗传的T1代和T 2代材料。
将各个水稻植株从培养基移出，水培到五叶期，种到实验田中繁种。
【实施例5】OsMYBS1基因过表达植株的表型分析
田间水稻表型
待水稻抽穗期时，取OE-1(实验株)和WT(H1493株)一起拍照(图5)。
剑叶宽和剑叶长的测定:待水稻生长到抽穗期时，随机分组测量转基因植株3个不同株系(OE-1，OE-2，OE-3)和H1493各30个剑叶的长度和宽度，求平均值进行分析(图6)。
【实施例6】叶片变黄的机理分析，叶绿素含量降低
等水稻长到抽穗期时，每个实验株系取3片剑叶，分别用80％的丙酮萃取，离心后的上清液测几个不同波长分光光度计下的值，用公式：
叶绿素a的计算公式是Ca＝12.21A663-2.59A646
叶绿素b的计算公式是Cb＝20.13A646-5.03A663
(其中A663是波长在663nm时分光光度计测的值，A646是波长在646nm时分光光度计测的值)
结果发现，过表达植株OE株系的叶绿素含量与对照H1493相比明显降低(图7)，具有显著性或者极显著性差异，这与叶片颜色发黄有一定的关系，从而降低了光合作用导致结实率下降。
【实施例7】OsMYBS1抗褐飞虱的鉴定
为了验证OsMYBS1基因是否参与对褐飞虱的抗性，我们将OE-OsMYBS1植株和WT长至抽穗期时进行抗虫实验。
具体过程是放虫2天后对其蜜露量进行测量。方法：将两块边长约为5cm的parafilm膜重叠，制成小袋(简称蜡袋)，制作完成后称重并记录。将一头刚羽化的褐飞虱雌成虫放入袋中并与待测水稻植株粘合，2天后取出褐飞虱，称虫重以及蜡袋重量。2次蜡袋重量之间的差值即蜜露量。结果发现在OE-OsMYBS1上生长的褐飞虱跟WT上生长的相比蜜露量减少，表明OsMYBS1基因参与了对褐飞虱的抗性并且OE-1，OE-3上具有极显著差异，OE-2上具有显著差异(图8)。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.水稻转录因子基因OsMYBS1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的水稻转录因子基因OsMYBS1，其特征在于，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的水稻转录因子基因OsMYBS1，其特征在于，所述基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.含有权利要求2所述多核苷酸的载体。
5.含有权利要求1所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
6.一种包含权利要求2所述的多核苷酸或权利要求4所述载体在制备转基因植物中的应用。
7.一种含有权利要求1所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段在水稻抗褐飞虱分子辅助育种或水稻种质资源改良中的应用。
8.一种含有所述水稻转录因子基因OsMYBS1的核苷酸序列或其片段的表型，其特征在于，包括叶片发黄、株高变矮、叶片变宽、叶片变短、对褐飞虱的抗性增强；所述叶片变黄的原因包括叶绿素含量降低。
9.一种培育抗褐飞虱植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)用多核苷酸转化植物细胞，所述多核苷酸所述水稻转录因子OsMYBS1的ORF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
2)将被转化的植物细胞再生为植物；
3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到过量表达。
10.一种水稻转录因子基因OsMYBS1转基因植株的检测试剂盒，其特征在于：含有引物Hyg-L和Hyg-R序列如下所示：
Hyg-L：GCTCCATACAAGCCAACCAC(5'-3')
Hyg-R：GAAAAAGCCTGAACTCACCG(5'-3')
PCR扩增出728bp的扩增片段，则说明是转基因阳性植株，若没有扩出这个片段则说明是转基因阴性植株。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (10)
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112679590A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-04-20 | 河南省新乡市农业科学院 | 调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用 |
| CN112679590B (zh) * | 2021-01-22 | 2024-04-19 | 河南省新乡市农业科学院 | 调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用 |
| CN112813188A (zh) * | 2021-03-01 | 2021-05-18 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种基于水稻褐飞虱抗性基因Bph26的PARMS标记与应用 |
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