CN112679590A

CN112679590A - 调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用

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Publication number: CN112679590A
Application number: CN202110086348.7A
Authority: CN
Inventors: 李祥; 矫永庆; 付亮; 李晓航; 王士坤; 王映红; 杨丽娟; 蒋志凯; 董昀; 马华平; 任帅; 王稼苜; 魏芳
Original assignee: HENAN XINXIANG ACADEMY OF AGRICULTURE SCIENCES
Current assignee: HENAN XINXIANG ACADEMY OF AGRICULTURE SCIENCES
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: CN112679590B

Abstract

本发明公开了调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用。本发明提供AtMYBS1蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：(A1)调控植物耐热性；(A2)培育耐热或对热敏感的植物；(A3)调控植物中独脚金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量；(A4)调控植物的叶片形状；(A5)调控植物的分枝数；(A6)调控植物的株高；(A7)植物育种。AtMYBS1通过独角金内酯途径实现对高温胁迫的调控，这为植物抵御高温逆境提供新的方法策略。

Description

调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用。

背景技术

植物在高温逆境中进化出了有效的抵抗高温伤害的有效机制。热激蛋白基因和热激转录因子是植物体内存在的两大类参与抵抗高温逆境的基因，在植物受到高温胁迫后通过改变基因表达和清除高温伤害导致的变性蛋白中发挥巨大的作用。HsfA1是热激转录因子里最主要的参与高温防御的基因。HsfA1在高温条件下可以促进HsfA2和HsfA3的表达，并且HsfA1、HsfA2、HsfA3可以激活数量众多的HSPs的表达，而HSPs作为分子伴侣蛋白，协助高温变性蛋白重新折叠成具有功能的高级结构形式；也有报道表明，HSPs还通过泛素化修饰清除植物在高温条件下失活变性的蛋白质。DREB2A是另外一个被报道的在高温条件下被激活用来抵御高温伤害的转录因子，过表达DREB2A能够显著提高植物高温胁迫的耐受性。在高温条件下，DREB2A可以受HsfAs的诱导表达，从而激活下游逆境防御基因，提高植物逆境抵御反应。

MYB结构域转录因子是植物里一类较大的转录因子家族。通常，在一个MYB结构域中会包含几个氨基酸序列重复，这些序列重复形成α-螺旋，使得在三维结构上MYB结构域能识别和结合特定的DNA序列，从而激活或抑制某些基因的表达。根据重复序列的不同，植物里MYB类转录因子可以分为几个亚家族，R2R3类、R1R2R3类以及一个异质类型(不含有序列重复但整体上和MYB结构域同源性很高)。MYB类转录因子在植物里发挥重要的功能，如：初生或次生代谢调控、细胞命运决定、器官形成、侧生分生组织的形成以及在抗生物逆境和非生物逆境中的作用等。

独角金内酯是最近报道的一类新的植物激素。近年来，由于研究的不断深入，独角金内酯已被报道在调控植物株型，促进种子萌发以及逆境防御反应中发挥重要作用。虽然目前关于独角金内酯代谢合成途径、信号传导途径已研究比较透彻，但是对于控制独角金内酯生物合成的基因还没有报道。而且，在生物逆境防御方面，关于独角金内酯参与抵抗高温的研究也未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的耐热性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于拟南芥的蛋白质(其名称为ATMYBS1)或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(A1)调控植物耐热性；

(A2)培育耐热或对热敏感的植物；

(A3)调控植物中独脚金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量；

(A4)调控植物的叶片形状；

(A5)调控植物的分枝数；

(A6)调控植物的株高；

(A7)植物育种；

所述AtMYBS1蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

(a2)将序列表中SEQ ID NO:1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对脱落酸的耐受性相关的由其衍生的蛋白质；

(a3)来源于拟南芥与(a1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(a4)在(a1)或(a2)或(a3)限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

其中，序列表SEQ ID NO:1所示的蛋白质由314个氨基酸残基组成。

上述(a2)中，AtMYBS1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述(a2)中，AtMYBS1蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID NO:2的DNA分子编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质。

上述(a3)中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述(a4)中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

在上述应用中，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，提高所述植物的耐热性；所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，降低所述植物的耐热性。

在上述应用中，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，上调所述植物中独脚金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量；所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，下调所述植物中独脚金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量。

在上述应用中，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，使所述植物叶形变圆。

在上述应用中，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，增加所述植物的分枝数；

在上述应用中，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，降低所述植物的株高。

在上述应用中，所述相关生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

在上述应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)序列表中SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码AtMYBS1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的AtMYBS1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码AtMYBS1蛋白质且具有AtMYBS1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码AtMYBS1蛋白质的核酸分子的表达盒(AtMYBS1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达AtMYBS1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动AtMYBS1基因转录的启动子，还可包括终止AtMYBS1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述AtMYBS1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pJL12，其核苷酸序列如中国发明专利CN107022566B中序列1所示。

B3)所述重组载体具体可为35S：AtMYBS1载体。所述35S：AtMYBS1载体为在载体pJL12的BamHI酶切位点插入了含有AtMYBS1 cDNA片段得到的重组质粒。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐热植物的方法，包括：降低受体植物中AtMYBS1蛋白的活性和/或含量，或，抑制或降低受体植物中AtMYBS1蛋白的编码基因的表达，得到目的植物；所述目的植物的耐热性高于所述受体植物的耐热性。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐热性降低的植物的方法，包括：提高受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白质的活性和/或含量，或，促进受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1编码基因的表达，得到目的植物；所述目的植物的耐热性低于所述受体植物。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种改变植株表型的方法，包括：提高受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白质的活性和/或含量，或，促进受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1编码基因的表达，得到目的植物；所述目的植物的分枝数多于受体植物；和/或，所述目的植物的株高低于受体植物；和/或，所述目的植物的叶形比受体植物圆。

上述方法中，所述提高受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白质的活性和/或含量，或，促进受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1编码基因的表达是通过将权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的编码基因导入所述受体植物实现的。

上述方法中，所述AtMYBS1蛋白质的编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述AtMYBS1的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据目的植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述AtMYBS1的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述AtMYBS1的编码基因可利用含有所述AtMYBS1的编码基因的重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体具体可为所述35S：AtMYBS1。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含AtMYBS1蛋白或其编码基因被改变的第一代转基因植物，也包括其子代。对于目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗冷植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明中，所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)十字花科植物；

M3)拟南芥。

本发明还保护AtMYBS1蛋白质或其生物材料。

本发明通过实验证明，下调AtMYBS1基因的表达量能够提高植物耐热性，而过表达AtMYBS1基因能够降低植物的耐热性，并且能够增加植物的分枝，使植株矮化、叶子变圆。进一步研究发现，AtMYBS1阻止MAX1基因的表达，通过独角金内酯途径实现对高温胁迫的调控。酵母单杂交和Chip-qPCR以及点突变和不含点突变的转基因验证均证明了AtMYBS1通过结合MAX1启动子上MYB结合位点实现对MAX1的表达调控。AtMYBS1还通过独角金内酯途径调控HSP70、HSP90、DREB2A和HsfA3的表达量从而调控了植物高温反应。本发明可以拓宽我们对独角金内酯以及AtMYBS1的认识，也可以为植物抵御高温逆境提供新的方法策略。

附图说明

图1为AtMYBS1过表达和atmybs1突变体植株表型分析。其中，A、半定量PCR鉴定AtMYBS1过表达和突变体植株中AtMYBS1基因表达量情况；B、atmybs1-1与atmybs1-2 T-DNA插入位置示意图；C、tMYBS1过表达和atmybs1突变体植株的叶形变化；D、Col-0、AtMYBS1过表达植株以及atmybs1突变体叶形统计结果；E、Col-0、AtMYBS1过表达植株以及atmybs1突变体植株株高及分枝表型；F、Col-0、AtMYBS1过表达植株和atmybs1突变体分枝、株高表型统计结果。

图2为高温处理后野生型Col-0、AtMYBS1过表达植株、atmybs1突变体的表型及死亡率统计结果。

图3为独角金内酯信号传导相关基因MAX1、MAX2、MAX3和MAX4在Col-0、atmybs1突变体植株和转AtMYBS1基因植株中的表达水平。

图4为高温条件下，GR24处理前后不同植株的表型及死亡率统计结果。其中，A、不同材料高温处理布局；B、A中材料高温处理表型；C、A中材料高温处理后存活率统计结果。

图5为GR24处理不同植株前后的分枝表型及分枝表型统计结果。其中，a、不同植株GR24处理前与处理后分枝表型；b、不同植株GR24处理前与处理后分枝表型统计结果。

图6为正常条件下不同植株的分枝表型及分枝表型统计。其中，A-C为各种不同植株的分枝表型；D-E为A-C中植株分枝数目和株高的统计结果。

图7为酵母杂交实验。其中，A、不同载体构建示意图(通过逐步缩短MAX1启动子，并用酵母单杂交检测，找出AtMYBS1结合MAX1启动子的具体位置和序列)；B、MAX1不同区段酵母单杂交结果。

图8为高温处理后不同植株的表型及死亡率统计结果。其中，每个图中上方为材料布局，下方图片为高温处理结果，右方柱状图为高温处理后死亡率统计结果。

图9为正常条件下不同植株的分枝表型及分枝表型统计。其中，各种不同植物材料分枝表型；b、各种不同植株的分枝数目统计结果。

图10为不同植株中HSP70、HSP90、HsfA1～HsfA3以及DREB2A基因表达量变化。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中拟南芥Col-0生态型、拟南芥突变体max1(CS9564)、拟南芥突变体max2(CS9565)、拟南芥突变体atmybs1-1(cs843799)和拟南芥突变体atmybs1-2(cs806410)从SALK突变体库中订购(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)获得，公众可以从河南省新乡市农业科学院获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

哥伦比亚生态型拟南芥，又称野生型拟南芥，用Col-0或WT表示。哥伦比亚生态型拟南芥中，AtMYBS1蛋白如序列表的序列1所示(由314个氨基酸残基组成)。哥伦比亚生态型拟南芥的cDNA中，编码AtMYBS1蛋白的基因如序列表的序列2所示(由942个核苷酸组成)。

实施例1、突变体植株、转基因植株的获得及鉴定

一、突变体atmybs1-1和atmybs1-2的获得

从拟南芥SALK突变体库中(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)商购编号为cs843799和cs806410的拟南芥种子(背景为哥伦比亚生态型拟南芥，为T-DNA插入突变体)，培育成植株。提取幼苗期植株的基因组DNA。鉴定cs843799纯和突变：分别用RP1和LB组成的引物对以及LP1和RP1组成的引物对进行PCR扩增。如果采用引物对RP1与LB能够扩增出产物，而采用引物对RP1和LP1不能够扩增出产物，则证明突变体cs843799为纯和突变。鉴定cs806410纯和突变：用RP2和LB组成的引物对以及LP2和RP2组成的引物对进行PCR扩增。如果采用引物对RP2与LB能够扩增出产物，而引物对RP2和LP2不能够扩增出产物，则证明突变体cs843799为纯和突变。将纯合突变体进行测序验证。

LP1:5’-TTATTATTTGCCGCAGTTTCG-3’；

LP2:5’-CAAGCTCCTTATCGCGAAAG-3’；

RP1：5’-TTACCTCGTTATCATCACCGC-3’；

RP2：5’-ACCACACTCTCCATTCGATTG-3’；

LB：5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’；

经过上述步骤，筛选到一株cs843799纯和突变体植株和一株cs806410纯合突变体植株，分别命名为突变体atmybs1-1和突变体atmybs1-2。与哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA相比，突变体atmybs1-1的差异仅在于在AtMYBS1基因的启动子区域插入了T-DNA，突变体atmybs1-2的差异仅在于在AtMYBS1基因的第一个外显子区域插入了T-DNA(图1)。

二、转AtMYBS1基因株系的获得

1、构建35S：AtMYBS1过表达载体。

将野生型Col-0拟南芥种子播种于1/2MS平板，放置于23℃光照培养箱生长。2周后取样，利用试剂盒(天根公司产品，产品编号为DP424)提取RNA，反转录(反转录试剂盒TAKARA产品，Code No.RR037Q/A/B，操作步骤具体参照说明书)，获得Col-0拟南芥的cDNA。

以拟南芥Col-0cDNA为模板，利用引物F(5’-TCTGATCAAGAGACAGATGGAGAGTGTGGTGGCAACATGGAGC-3’)和R(5’-GCTCTAGAACTAGTGTCAGTGCATTGTCGACGGAG-3’)进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳并回收纯化，得到纯化后的含有AtMYBS1 cDNA的片段。

用核酸内切酶BamHI酶切载体pJL12(其核苷酸序列如中国发明专利CN107022566B中序列1所示)回收线性化后的载体pJL12片段。

利用南京诺唯赞公司试剂盒(诺唯赞(Vazyme)公司产品，产品编号C113)将纯化后的AtMYBS1 cDNA片段连接到线性化的载体pJL12上，得到重组表达载体，将其命名为35S：AtMYBS1。该重组表达载体35S：AtMYBS1含有核苷酸序列如序列2所示的AtMYBS1基因，表达氨基酸序列如序列1所示的AtMYBS1蛋白。

2、将步骤1制备的35S：AtMYBS1过表达载体导入农杆菌GV3101，得到重组杆菌GV3101-35S：AtMYBS1。

3、采用蘸花法(方法参照文献：Clough S.J.&Bent A.F.,1998.Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.The Plant Journal 16,735-743)用步骤2得到的重组农杆菌GV3101-35S：AtMYBS1侵染拟南芥Col-0，得到T₀代种子。在含Basta的MS培养基平板上进行筛选，在T₃代得到转AtMYBS1基因的纯合株系AtMYBS1ox-2、AtMYBS1ox-5和AtMYBS1ox-6。

4、采用空载体pJL12为对照转化拟南芥野生型Col-0，按照步骤2-3进行操作，得到转空载体拟南芥作为对照。

三、AtMYBS1基因的表达水平检测及表型分析

1、AtMYBS1基因的表达水平检测

供试植株分别为：哥伦比亚生态型拟南芥植株，突变体atmybs1-1、突变体atmybs1-2、转AtMYBS1基因的T₃代株系AtMYBS1ox-2、AtMYBS1ox-5、AtMYBS1ox-6。

每种供试植株均设置3个生物学重复。

提取供试植株(在培养基中生长14天的幼苗)的总RNA，反转录得到cDNA，采用半定量RT-PCR方法检测野生型、AtMYBS1过表达转基因植株以及atmybs1-1、atmybs1-2突变体中AtMYBS1基因表达水平，ACTIN2基因表达水平作为参考内参。

用于检测AtMYBS1基因的引物如下：

AtMYBS1-RT-F1：5’-ATGGAGAGTGTGGTGGCAAC-3’；

AtMYBS1-RT-R1：5’-CCTTTGCGGTGATGATAACG-3’。

用于检测内参基因的引物如下：

Actin-F：5’-CTCAGCACCTTCCAACAGATGTGGA-3’；

Actin-R：5’-CCAAAAAAATGAACCAAGGACCAAA-3’。

半定量RT-PCR的反应体系见表1。

表1

试剂	用量
		2×Ex Taq(TAKARA)	10ul
正向引物(20μM)	1ul
		反向引物(20μM)	1ul
cDNA模板	1ul
		ddH<sub>2</sub>O	7ul

半定量RT-PCR的反应程序见表2。

表2

将半定量RT-PCR反应产物进行凝胶电泳。当内参ACTIN2的电泳条带接近一致时，再按照所用的体系进行PCR反应扩增AtMYBS1基因，将扩增产物电泳后比较条带亮度即得AtMYBS1基因在各个材料中的表达强度。

结果(图1)表明：atmybs1-1、atmybs1-2为完全敲除的突变体；AtMYBS1ox-2、AtMYBS1ox-5、AtMYBS1ox-6植株中AtMYBS1表达量比野生型明显增高2倍以上，为AtMYBS1的过表达转基因植株。

2、突变体植株、转基因植株的表型分析

正常培育突变体atmybs1-1、突变体atmybs1-2、过表达AtMYBS1基因T₃代株系AtMYBS1ox-2、AtMYBS1ox-5、AtMYBS1ox-6和野生型拟南芥Col-0，在拟南芥整个生育期进行表型比较。

结果如图1所示，转AtMYBS1基因的纯合株系AtMYBS1ox-2、AtMYBS1ox-5、AtMYBS1ox-6与野生型拟南芥Col-0相比分枝增多、植株矮化，且叶形变圆。而突变体atmybs1-1和突变体atmybs1-2在表型上与拟南芥Col-0没有显著差异。

实施例2突变体植株和转基因植株对高温的耐受性鉴定

一、atmybs1突变体植株和转AtMYBS1基因植株对高温的耐受性的表型鉴定

待测材料：哥伦比亚生态型拟南芥种子，突变体atmybs1-1的种子、突变体atmybs1-2的种子、过表达AtMYBS1基因的株系AtMYBS1ox-5。

取待测种子(每个株系60粒)消毒处理后，播种于1/2MS培养基上，22-23℃培养2天(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，2周后于人工气候箱中42℃处理1小时，然后23℃中恢复6小时，统计存活率。

结果如图2：高温处理后，野生型拟南芥Col-0的存活率为55.26％；AtMYBS1过表达转基因株系AtMYBS1ox-2的存活率为1.47％；过表达转基因株系AtMYBS1ox-5的存活率为1.32％；过表达转基因株系AtMYBS1ox-6的存活率为1.56％；突变体atmybs1-1的存活率为78.49％；突变体atmybs1-2的存活率为79.32％。结果表明：AtMYBS1过表达株系AtMYBS1ox-2、AtMYBS1ox-5和AtMYBS1ox-6均表现出对高温敏感，而突变体atmybs1和突变体atmybs2均表现出耐高温，野生型Col-0居于两者之间。可见，AtMYBS1可以调控植物对高温的耐受性，是植物高温防御反应的负调节因子。

二、atmybs1突变体植株和转AtMYBS1基因植株中独角金内酯信号传导相关基因MAX1、MAX2、MAX3和MAX4的表达特性分析

待测材料：哥伦比亚生态型拟南芥，突变体atmybs1-1、过表达AtMYBS1基因AtMYBS1ox-5T₃代株系。

取待测种子(每个株系300粒)消毒处理后，播种于1/2MS培养基上，22-23℃培养15天(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，提取各个材料总RNA，反转录得到cDNA，利用实时荧光定量PCR检测待测材料中MAX1、MAX2、MAX3和MAX4基因的表达水平(以ACTIN2作为内参基因；采用484ABI7500 real-time荧光定量PCR仪)。

用于检测MAX1基因的引物如下：

MAX1-F1：5’-ATGAAGACGCAACATCAATG-3’；

MAX1-R2：5’-ATCTTTGAACTTCTTTATCC-3’。

用于检测MAX2基因的引物如下：

MAX2-F1：5’-ATGGCTTCCACTACTCTCTC-3’；

MAX2-R1：5’-GTGTGTAGACGTTTAGAGAC-3’。

用于检测MAX3基因的引物如下：

MAX3-F1：5’-ATGTCTCTCCCTATCCCGCC-3’；

MAX3-R1：5’-GGTTCGATAGTCTCGGAACG-3’。

用于检测MAX4基因的引物如下：

MAX4-F1：5’-ATGGCTTCTTTGATCACAAC-3’；

MAX4-R1：5’-TTGTTGTACACTTGTCCACG-3’。

用于检测内参基因的引物如下：

Actin-F：5’-CTCAGCACCTTCCAACAGATGTGGA-3’；

Actin-R：5’-CCAAAAAAATGAACCAAGGACCAAA-3’。

荧光定量PCR反应体系见表3。

表3

荧光定量PCR反应程序见表4。

表4

以2^-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。

以哥伦比亚生态型拟南芥植株中MAX1、MAX2、MAX3和MAX4基因的mRNA相对表达水平为1.0。突变体atmybs1-1、过表达转基因株系AtMYBS1ox-5中MAX1、MAX2、MAX3和MAX4基因的mRNA相对表达水平为比较值进行比较分析。

结果如图3所示，独角金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量在AtMYBS1过表达植株AtMYBS1ox-5中降低，而在突变体atmybs1-1中升高；MAX2的表达量在这三种植株中没有变化；MAX3、MAX4的表达量在AtMYBS1过表达植株AtMYBS1ox-5中上升，在突变体atmybs1-1中表达量和野生型Col-0一致。由于MAX3和MAX4表达量会受到MAX1、MAX2反馈抑制，所以推测AtMYBS1抑制MAX1基因的表达。

实施例3、AtMYBS1与独角金内酯生物合成相关基因MAX1相互作用分析

一、AtMYBS1通过抑制MAX1基因表达负调控高温防御

1.atmybs1-1max1双突变体与atmybs1-1max2双突变体的获得

将突变体atmybs1-1与突变体max1杂交，得到F₁代杂交种。将F₁代播种自交，收获F₂代种子。种植F₂代种子，得到F₂代植株，提取F₂代植株DNA。

以F₂代植株DNA为模板，利用RP1(5’-TTACCTCGTTATCATCACCGC-3’)与LP(5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’)组成的引物对和RP1与LB(5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’)组成的引物对分别进行PCR扩增，如果采用RP1与LP组成的引物对不能成功扩增出产物，而RP1与LB组成的引物对能扩增出产物，则表明待检测的植株中AtMYBS1位点为突变纯和。

以F₂代植株DNA为模板，用引物MAX1-F1(5’-ATGAAGACGC AACATCAATG GTG-3’)和MAX1-R2(5’-TCAGAATCTTTTGATGGTTCTGA-3’)进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，如果测序结果与MAX1参考基因组序列存在点突变，并且后代不再分离，则表明待检测的植株中MAX1位点为突变纯和。

筛选同时满足上述条件的AtMYBS1、MAX1都突变的植株，将其命名为atmybs1-1max1双突变体。

按照同样的方法获得atmybs1-1max2双突变体

2.35S:MAX1 AtMYBS1ox-5植株的获得：

以野生型Col-0cDNA为模板，利用引物MAX1FP(5’-TTCTAGAGTCGAGGTCCATGAAGACGCAACATCAATG-3’)和MAX1RP(5’-CGGTAGAAAAAATGAGAATCTTTTGATGGTTCTGA-3’)进行扩增，获得扩增产物。将扩增产物替换载体pMDC85上SpeI和KpnI识别位点之间的片段，并保持载体pMDC85的其它核苷酸不变得到的重组载体35S:MAX1。将重组载体35S:MAX1转化AtMYBS1ox-5植株得到MAX1基因过表达的转基因植株，将其命名为35S:MAX1 AtMYBS1ox-5。

3.将供试材料：Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1、atmybs1-1max1、35S:MAX1AtMYBS1ox-5、max2、atmybs1-1max2、35S:MAX1AtMYBS1ox-5。

取供试材料种子(每个株系60粒)消毒处理后，播种于1/2MS培养基上，22-23℃培养2天(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，2周后于人工气候箱中42℃处理1小时，然后23℃中恢复6小时，统计存活率。

结果如图4示，高温处理后，atmybs1-1max1双突变体逆转了atmybs1-1抗高温表型。另外，在AtMYBS1过表达植株AtMYBS1ox-5中过表达MAX1，发现也能逆转AtMYBS1ox-5高温敏感表型。

同时，独角金内酯(GR24)处理Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1以及max2突变体植株后，AtMYBS1ox-5和max1分枝数都减少，而max2突变体的分枝数不变(图5)。并且，MAX1在AtMYBS1ox-5中过表达也减少了AtMYBS1ox-5的分枝数，而MAX2的过表达不能减少AtMYBS1ox-5分枝数目(图6)。由此可知，AtMYBS1抑制了MAX1的表达。

二、AtMYBS1通过独角金内酯途径降低高温防御反应

将供试材料Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1、atmybs1-1max1、35S:MAX1AtMYBS1ox-5、max2、atmybs1-1max2、35S:MAX1AtMYBS1ox-5。取供试材料种子(每个株系60粒)消毒处理后，播种于1/2MS培养基上，22-23℃培养2天(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，2周后于人工气候箱中42℃处理1小时，然后23℃中恢复6小时，统计存活率。另外，在1/2MS培养基上添加20um GR24，和上一份做相同的高温处理，并统计存活率。

结果如图4所示，高温处理后，max2以及atmybs1-1max2双突变体都表现出对高温敏感的，并且35S:MAX2AtMYBS1ox-5植株也对高温敏感。

用GR24处理后，Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1、atmybs1-1max1、35S:MAX1AtMYBS1ox-5、35S:MAX2AtMYBS1ox-5都显著提高了植株高温存活率，只有max2、atmybs1-1max2对GR24处理不敏感，说明AtMYBS1通过独角金内酯途径调控高温反应(图4)。

三、AtMYBS1通过结合MAX1启动子直接调控MAX1表达调控高温防御反应

1、酵母杂交实验

酵母单杂交参照clontech公司试剂盒(clontech,Cat.Nos.630491,630466,630499)。首先将MAX1启动子划分为区段(图7)，每个区段用PCR扩增后构建到pAbAi载体上。具体过程如下：选用pAbAi载体，用smaI内切酶切开后回收待用。用引物扩增MAX1启动子的各个片段，电泳后回收分别与回收的pAbAi载体重组连接。将构建好的载体转化到酵母菌株Y1HGold，SD-Ura培养基作为筛选培养基。挑选长出的酵母菌落用菌落PCR进行进一步确认转化无误。获得的菌落涂于含有不同浓度梯度的Aureobasidin A抗生素(AbA,0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml,200ng/ml)的SD-Ura平板上，筛选不能长出菌落的AbA浓度(浓度为50ng/ml，因为所有的MAX1启动子区段加了AbA后都不能长出)。同时构建pGADT7-AtMYBS1载体。具体过程如下：选用pGADT7载体，用EcoRI内切酶切开后回收待用。用引物扩增AtMYBS1 CDS(编码区段)，电泳回收后与回收的p GADT7载体重组连接。将此载体转化到含有上述MAX1启动子区段的酵母细胞里，用SD-Leu培养基进行筛选，随后用菌落PCR确认。最后将获得转化了MAX1启动子区段和pGADT7-AtMYBS1载体的酵母细胞培养于含有50ng/mlAbA的SD-Ura-Leu平板上，鉴定AtMYBS1与MAX1启动子区段的相互作用(长出酵母菌落的即为存在相互作用)。

酵母单杂交构建载体所用引物序列如下：

pMAX1-1-F：5’-GCTTGAATTCGAGCT CGGTGATAAACTAATCCACCA-3’；

pMAX1-1-R：5’-AGCACATGCCTCGAGG TTCCTTCCTCCAACAAGATG-3’；

pMAX1-2-F：5’-GCTTGAATTCGAGCT CGGTGATAAACTAATCCACCA-3’；

pMAX1-2-R：5’-AGCACATGCCTCGAGG GGGAGAGACGAAATTTCATC-3’；

pMAX1-3-F：5’-GCTTGAATTCGAGCT CGGTGATAAACTAATCCACCA-3’；

pMAX1-3-R：5’-AGCACATGCCTCGAGG GCTTCTACTTTTGGTCTCCT-3’；

pMAX1F-1-F：5’-GCTTGAATTCGAGCT CGGTGATAAACTAATCCACCA-3’；

pMAX1F-1-R：5’-AGCACATGCCTCGAGG GAAACTATTTAACTATATTT-3’；

pMAX1F-2-F：

5’-GCTTGAATTCGAGCTGAATTAAACACTAAATAATTAAATGTTGAC-3’；

pMAX1F-2-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGCTCTCTAACCTCTAAAGTTC-3’；

pMAX1NMF-F：5’-AGCACATGCCTCGAGGCTCTCTAACCTCTAAAGTTC-3’；

pMAX1NMF-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGTACTATCTTTTGAGTATGGG-3’；

pMAX1MF1-F：5’-GCTTGAATTCGAGCTGTGGTTTACTCCAATTGACGG-3’；

pMAX1MF1-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGAAATAAACAGAATACTATCT-3’；

pMAX1MF2-F：5’-GCTTGAATTCGAGCTGTGGTTTACTCCAATTGACGG-3’；

pMAX1MF2-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGAAATATATGATTATAAATAA-3’；

pMAX1MF3-F：5’-GCTTGAATTCGAGCTGTGGTTTACTCCAATTGACGGT-3’；

pMAX1MF3-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGATTTTTATATTCTGAATGTT-3’；

pMAX1MF4-F：

5’-GCTTGAATTCGAGCTGTGGTTTACTCCAATTGACGGTAAA-3’；

pMAX1MF4-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGAAATTTACATATTCTAATAT-3’；

pMAX1MF5-F：5’-GCTTGAATTCGAGCTGTGGTTTACTCCAATTGACGG-3’；

pMAX1MF5-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGATATTTAATACTCCTCTATG-3’；

pMAX1MF6-F：5’-GCTTGAATTCGAGCTTGGTTTACTCCAATTGACGGTAA-3’；

pMAX1MF6-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGATATTTAATACTCCTCTATG-3’；

pMAX1MF7-F：

5’-GCTTGAATTCGAGCTTGACAAGTAGAGGCACTTGATAGTAGTGT-3’；

pMAX1MF7-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGATATTTAATACTCCTCTATG-3’；

pMAX1MF8-F：5’-GCTTGAATTCGAGCTGATAGTAGTGTAACAAAAGT-3’；

pMAX1MF8-R：5’-AGCACATGCCTCGAGGATATTTAATACTCCTCTATG-3’；

pMAX1NM:MAX1-F：5’-GAGCTCGGTACCCGGGCGGTGATAAACTAATCCACCAA-3’；

pMAX1NM:MAX1-R：

5’-AGGTCGACTCTAGAGCTCTCTAACCTCTAAAGTTC-3’。

酵母单杂交实验(图7)表明，AtMYBS1可以直接结合MAX1启动子，进一步点突变酵母单杂交实验表明，AtMYBS1可以和MAX1启动子中的MYB结构域结合位点结合。

2、转MAX1启动子的转基因植株表型鉴定

构建pMAX1NM:gMAX1(MAX1启动子驱动MAX1基因组序列)以及pMAX1M:gMAX1(MAX1启动子中MYB结合位点点突变驱动MAX1基因组序列)载体，并将这两种载体分别转化max1突变体和AtMYBS1ox-5max1植株。

(1)pMAX1NM:gMAX1转基因植株的获得

以野生型Col-0基因组DNA为模板，利用引物用引物pMAX1NM:gMAX1-F1：(5’-GAGCTCGGTACCCGGGCGGTGATAAACTAATCCACCAA-3’)和pMAX1NM:gMAX1-F1：(5’-AGGTCGACTCTAGAGCTCTCTAACCTCTAAAGTTC-3’)进行扩增，获得扩增产物。将扩增产物替换载体pCAMBIA1300上smaI和SalI识别位点之间的片段，并保持载体pCAMBIA1300的其它核苷酸不变得到的重组载体pMAX1NM:gMAX1。将重组载体pMAX1NM:gMAX1分别转化max1和AtMYBS1ox-5max1植株，得到pMAX1NM:gMAX1转化max1的转基因植株和pMAX1NM:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1的转基因植株。

(2)pMAX1M:gMAX1转基因植株的获得

人工合成序列表中序列3所示的DNA片段。并将该DNA片段替换载体pCAMBIA1300上smaI和SalI识别位点之间的片段，并保持载体pCAMBIA1300的其它核苷酸不变得到的重组载体pMAX1M:gMAX1。将重组载体pMAX1M:gMAX1分别转化max1和AtMYBS1ox-5max1植株，得到pMAX1M:gMAX1转化max1的转基因植株和pMAX1M:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1的转基因植株。

(3)高温反应处理

材料：Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1、AtMYBS1ox-5max1、pMAX1M:gMAX1转化max1的转基因株系T₃代(pMAX1M:gMAX1/max1-3，pMAX1M:gMAX1/max1-5，pMAX1M:gMAX1/max1-6)、pMAX1M:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1的转基因株系T₃代(pMAX1M:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-4，pMAX1M:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-7，pMAX1M:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-10)、pMAX1NM:gMAX1转化max1的转基因株系T₃代(pMAX1NM:gMAX1/max1-2，pMAX1NM:gMAX1/max1-4，pMAX1NM:gMAX1/max1-6)、pMAX1NM:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1的转基因株系T₃代(pMAX1NM:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-3，pMAX1NM:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-4，pMAX1NM:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-8)。

处理过程：每材料选取60粒种子，消毒处理后，播种于1/2MS培养基上，22-23℃培养2天(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，2周后于人工气候箱中42℃处理1小时，然后23℃中恢复6小时，统计存活率。

实验结果(图8)表明：pMAX1NM:gMAX1转化max1突变体后，回复了max1突变体高温敏感表型；pMAX1M:gMAX1转化max1突变体后，转基因植株比Col-0野生型更耐高温；pMAX1NM:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1植株后，转基因植株表现出和AtMYBS1ox一样的高温敏感表型；pMAX1M:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1植株后，转基因植株表现比野生型更耐高温的表型，这一结果说明，AtMYBS1通过结合MAX1启动子MYB结构域结合位点负调控MAX1的表达从而降低拟南芥对高温的抵抗。

(4)表型分析

将Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1、AtMYBS1ox-5max1、pMAX1M:gMAX1转化max1的转基因株系T₃代(pMAX1M:gMAX1/max1-3，pMAX1M:gMAX1/max1-5，pMAX1M:gMAX1/max1-6)、pMAX1M:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1的转基因株系T₃代(pMAX1M:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-4，pMAX1M:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-7，pMAX1M:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-10)、pMAX1NM:gMAX1转化max1的转基因株系T₃代(pMAX1NM:gMAX1/max1-2，pMAX1NM:gMAX1/max1-4，pMAX1NM:gMAX1/max1-6)、pMAX1NM:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1的转基因株系T₃代(pMAX1NM:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-3，pMAX1NM:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-4，pMAX1NM:gMAX1/AtMYBS1ox-5max1-8)种植于温室(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，40天后观察统计植株分枝表型。结果(图9)发现，pMAX1NM:gMAX1转化max1、pMAX1M:gMAX1转化max1、pMAX1M:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1后，转基因植株都表现分枝减少的表型，而pMAX1NM:gMAX1转化AtMYBS1ox-5max1后，分枝数仍然和AtMYBS1ox-5max1没有差别，这也说明了AtMYBS1是通过结合MAX1结合位点进而调控MAX1表达。

实施例四、AtMYBS1通过独角金内酯途径调控DREB2A、HsfA3和HSPs实现对高温防御反应的调控

供试植株：Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1、35S:MAX1AtMYBS1ox-5、max2、35S:MAX2AtMYBS1ox-5。

取待测种子(每个株系300粒)消毒处理后，播种于1/2MS培养基上，22-23℃培养15天(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，提取各个材料总RNA，反转录得到cDNA，利用实时荧光定量PCR检测HSP70、HSP90、HsfA1、HsfA2、HsfA3和DREB2A基因的表达水平。(以ACTIN2作为内参基因；采用484ABI7500 real-time荧光定量PCR仪)。

荧光定量PCR所用引物如下：

ACTIN2-qPCR-F：5’-CTCAGCACCTTCCAACAGATGTGGA-3’

ACTIN2-qPCR-R：5’-CCAAAAAAATGAACCAAGGACCAAA-3’

HSP70-qPCR-F：5’-ATGGCGGGTAAAGGTGAAGG-3’

HSP70-qPCR-R：5’-GAACAGAGGGATCACTGTAT-3’

HSP90-qPCR-F：5’-ATGAGGAAGAGGACGCTCGT-3’

HSP90-qPCR-R：5’-CTCAAACTTCTCCGCGTTAC-3’

HsfA1A-qPCR-F：5’-ATGTTTGTAAATTTCAAATACTTCTCTT-3’

HsfA1A-qPCR-R：5’-ATCACGAGAAAACTCCGGTG-3’

HsfA2-qPCR-F：5’-ATGGAAGAACTGAAAGTGGA-3’

HsfA2-qPCR-R：5’-AGAGTTGTTGAGAACTTATG-3’

HsfA3-qPCR-F：5’-ATGAGCCCAAAAAAAGATGCTGTTT-3’

HsfA3-qPCR-R：5’-ATCCCAAACTACGAAGCTAG-3’

DREB2A-qPCR-F：5’-ATGGCAGTTTATGATCAGAG-3’

荧光定量PCR反应体系见实施例2中表3。

荧光定量PCR反应程序见表5。

表5

以哥伦比亚生态型拟南芥植株中MAX1、MAX2、MAX3和MAX4基因的mRNA相对表达水平为1.0。突变体atmybs1-1、过表达转基因株系AtMYBS1ox-5T₃代株系中MAX1、MAX2、MAX3和MAX4基因的mRNA相对表达水平为比较值进行比较分析。

结果(图10)显示：在高温敏感植株AtMYBS1ox-5、max1中，HSP70和HSP90表达量下调；同时，在max2突变体以及35S：MAX2AtMYBS1中，HSP70和HSP90的表达量也下调，说明AtMYBS1通过独角金内酯途径下调了HSP70和HSP90的表达。

同时，HsfA1、HsfA2在Col-0、AtMYBS1ox-5、atmybs1-1、max1、35S:MAX1AtMYBS1ox-5、max2以及35S:MAX2 AtMYBS1ox-5植株中表达量没有变化，而HsfA3在atmybs1-1和35S:MAX1 AtMYBS1ox-5里表达量上升，在AtMYBS1ox-5、max1、max2、35S:MAX2 AtMYBS1ox-5里表达量下降，表明AtMYBS1通过独角金内酯途径降低HsfA3的表达。

DREB2A可以诱导HsfA3表达来提高植物高温抵抗能力，在atmybs1-1和35S:MAX1AtMYBS1ox-5中，DREB2A的表达提高，而在AtMYBS1ox-5、max1、max2、35S:MAX2AtMYBS1ox-5里表达量降低，表明AtMYBS1负向调控了DREB2A；DREB2A抑制HsfA3表达，HsfA3阻止HSP70和HSP90的表达从而降低植物对高温环境的耐受能力。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 河南省新乡市农业科学院

<120> 调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用

<130> GNCRJ210159

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

Met Glu Ser Val Val Ala Thr Trp Ser Arg Glu Glu Glu Lys Ala Phe

1 5 10 15

Glu Asn Ala Ile Ala Leu His Cys Val Glu Glu Glu Ile Thr Glu Asp

20 25 30

Gln Trp Asn Lys Met Ser Ser Met Val Pro Ser Lys Ala Leu Glu Glu

35 40 45

Val Lys Lys His Tyr Gln Ile Leu Leu Glu Asp Val Lys Ala Ile Glu

50 55 60

Asn Gly Gln Val Pro Leu Pro Arg Tyr His His Arg Lys Gly Leu Ile

65 70 75 80

Val Asp Glu Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ser Pro Ala Asn Arg Asp Ser

85 90 95

His Ser Ser Gly Ser Ser Glu Lys Lys Pro Asn Pro Gly Thr Ser Gly

100 105 110

Ile Ser Ser Ser Asn Gly Gly Arg Ser Gly Gly Ser Arg Ala Glu Gln

115 120 125

Glu Arg Arg Lys Gly Ile Pro Trp Thr Glu Glu Glu His Arg Leu Phe

130 135 140

Leu Leu Gly Leu Asp Lys Phe Gly Lys Gly Asp Trp Arg Ser Ile Ser

145 150 155 160

Arg Asn Phe Val Ile Ser Arg Thr Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala

165 170 175

Gln Lys Tyr Phe Ile Arg Leu Asn Ser Met Asn Arg Asp Arg Arg Arg

180 185 190

Ser Ser Ile His Asp Ile Thr Thr Val Asn Asn Gln Ala Pro Ala Val

195 200 205

Thr Gly Gly Gly Gln Gln Pro Gln Val Val Lys His Arg Pro Ala Gln

210 215 220

Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Gln His His Pro Pro Thr

225 230 235 240

Met Ala Gly Leu Gly Met Tyr Gly Gly Ala Pro Val Gly Gln Pro Ile

245 250 255

Ile Ala Pro Pro Asp His Met Gly Ser Ala Val Gly Thr Pro Val Met

260 265 270

Leu Pro Pro Pro Met Gly Thr His His His His His His His His Leu

275 280 285

Gly Val Ala Pro Tyr Ala Val Pro Ala Tyr Pro Val Pro Pro Leu Pro

290 295 300

Gln Gln His Pro Ala Pro Ser Thr Met His

305 310

<210> 2

<211> 945

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

atggagagtg tggtggcaac atggagcaga gaagaagaga aagcattcga gaacgcaatt 60

gcgttgcatt gtgtagagga agagataaca gaggatcaat ggaacaaaat gtcgtcaatg 120

gtaccaagca aagccttaga agaagtaaag aaacattacc aaatcctttt agaagatgtc 180

aaagcaatcg agaatggtca agttccttta cctcgttatc atcaccgcaa aggtctcatc 240

gtagatgaag cagcagcagc agctacttct cctgccaaca gagactctca ttcctctgga 300

tcatctgaga agaaaccaaa tcctggcacc tccgggataa gtagctccaa tggaggaaga 360

agtggtggct cgagagctga gcaagagaga agaaaaggga ttccatggac tgaagaagag 420

catcggttgt ttcttttggg tttggacaag tttgggaaag gagattggag aagcatttca 480

aggaactttg tgatctcaag aactccaaca caagttgcaa gtcatgctca aaaatacttc 540

atcaggctta actcgatgaa ccgagataga aggcggtcta gcattcacga catcaccact 600

gtgaacaatc aagctcctgc ggttacagga ggaggacaac aaccgcaagt ggttaaacat 660

agaccagctc agccacaacc acagccacaa ccgcaaccac aacaacatca tcccccaaca 720

atggctggat tagggatgta tggtggtgcg ccagtgggac aaccgatcat cgcaccacct 780

gatcatatgg gttcagctgt tggaacacct gtgatgcttc cacctccaat gggaactcat 840

catcatcacc atcaccatca tcttggagtt gctccttatg ctgtaccggc ttatccggta 900

ccgccattac cgcagcaaca tccagctccg tcgacaatgc actga 945

<210> 3

<211> 2066

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gagctcggta cccgggcggt gataaactaa tccaccaaat tgcgccggtt aggtctaagg 60

catagacttg tcctttatga agtataatgt ccaagaaatc ttcaacttgg tttttgattt 120

ttgtccatat tctactactc tcttctccac tcttgcagca ccagattttg tcatcctgtc 180

cgactgcgaa aatcagattg tctaggaaaa caactctaga caatatatgt gatggtcctt 240

ctttacctat cacgccttgt attaaatact tatcaaatat atgaatctcg taagattggc 300

gaatctctga aacctcaaat ttcaaaaggt ctagggtttg ttgtgaaggg gttaggagct 360

ggcgaaagaa aggagacaag agattaatct tactggattc agagacttgt ttggttctga 420

tcagccatcc tttgtaagaa catgaagaag ggccagttac acggaagaaa gtggtgggag 480

agagaacagt ctctatcatc ttgttggagg aaggaaggtt gcattgaaag ctcttcggtg 540

tcgcagccgc cgaacgccag ggtttacaga tgctacgtac acggaggacg tcactaatgg 600

aggagaaacg gtttgcggtt aaattgatga ggtctccagg taattcagac cactcaggtt 660

tttccatctt tgaatcaatc gacgatgtga gagcgtgatc aacatcggct cgccctctct 720

gttataactc catatatata cacaacaaaa cttaaaccct agatacttga ggacttacgt 780

gggctggact agaatccatc caattcctag ttggattttc gattagctat tatcacgtga 840

gtaatatctg cattacatgt attgacttag tattattgtt ggagcaatgt tttttttttg 900

ttaaaaatta ttattggagc aatgttttgt ttttgttaaa aattatttga gcaaaccaaa 960

aaatcgcaga atgaattata aaacagttcg tatttcgatg aaatttcgtc tctccctctc 1020

aatagctttg gtgcaaatta atacccttac tacatacatg tcaacttaac tctaattcta 1080

acaaatagaa cagaaaatct ggagagagaa aaaaaacgta actagatgaa agaaaagaaa 1140

aaaaaaaaga cttcaaaatt tgtataaaaa tatagaaatg ttgaacaaaa attattaact 1200

ctaaaccaaa aattaagaca atgatctaat attctaatat catgaatcat gatagaaaag 1260

gaacacctaa ctccataaat gatggtcatg caatgatcaa atttctcctt tatcaattat 1320

tggtttatat tccaatgtcc aaactcgaaa gtcgaaacaa tctcctccat atatagccat 1380

ttctttccct aacccattaa aatacaaaac taaagaacca tcaataattt tttcaactga 1440

aaaaggaaga acaatttgtg atccaaaata aaagagagaa aaaaaaaagt ggagaaagga 1500

gaccaaaagt agaagcgtgg tttactccaa ttgacggtaa acccctttga caagtagagg 1560

cacttgatag tagtgtaaca aaagtacaac gatgggtgaa gattggtcaa acatcaaaag 1620

gaccccatac tcaaaagata gtattctgtt tatttataat catatattta caaaaaacta 1680

aaattcagaa tataaaaata ttagaatatg taaattttgc aaacatagag gagtattaaa 1740

tatagttaaa tagtttcgaa ttaaacacta aataattaaa tgttgacaag aaaaaaaaac 1800

ataaaaatta atacggattc cgtgcgttac aataacttag caatattact ctctagtaga 1860

gatgagaact tgagtacttg actaataatt tcaacgcatg ttgtcttctt gcgaaatagt 1920

cccacgctat tctaaaggtg ggctagtgga aagagtgtag aacccacttt tcaaaagcac 1980

atcaactact atataaatta atgaaccacc taacaaacaa acccacacat taaactaaag 2040

aagagagaac tttagaggtt agagag 2066

Claims

1.AtMYBS1蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(A1)调控植物耐热性；

(A2)培育耐热或热敏感的植物；

(A3)调控植物中独脚金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量；

(A4)调控植物的叶片形状；

(A5)调控植物的分枝数；

(A6)调控植物的株高；

(A7)植物育种；

所述AtMYBS1蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，提高所述植物的耐热性；

和/或，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，降低所述植物的耐热性；

和/或，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，上调所述植物中独脚金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量；

和/或，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，下调所述植物中独脚金内酯生物合成相关基因MAX1的表达量；

和/或，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，使所述植物叶形变圆；

和/或，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，增加所述植物的分枝数；

和/或，所述AtMYBS1蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，降低所述植物的株高。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述相关生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)序列表中SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

5.一种培育耐热植物的方法，包括：降低受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的活性和/或含量，或，抑制或降低受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的编码基因的表达，得到目的植物；所述目的植物的耐热性高于所述受体植物的耐热性。

6.一种培育耐热性降低的植物的方法，包括：提高受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白质的活性和/或含量，或，促进受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1编码基因的表达，得到目的植物；所述目的植物的耐热性低于所述受体植物。

7.一种改变植株表型的方法，包括：提高受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白质的活性和/或含量，或，促进受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1编码基因的表达，得到目的植物；

所述目的植物的分枝数多于受体植物；

和/或，所述目的植物的株高低于受体植物；

和/或，所述目的植物的叶形比受体植物圆。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1蛋白质的活性和/或含量，或，促进受体植物中权利要求1中所述AtMYBS1编码基因的表达是通过将权利要求1中所述AtMYBS1蛋白的编码基因导入所述受体植物实现的。

9.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)十字花科植物；

M3)拟南芥。

10.权利要求1中所述AtMYBS1蛋白质或权利1-4任一所述应用中所述生物材料。