CN117925691A - At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用 - Google Patents

At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117925691A
CN117925691A CN202410065656.5A CN202410065656A CN117925691A CN 117925691 A CN117925691 A CN 117925691A CN 202410065656 A CN202410065656 A CN 202410065656A CN 117925691 A CN117925691 A CN 117925691A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
protein
sequence
rsm1
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410065656.5A
Other languages
English (en)
Inventor
董寰
漆小泉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Botany of CAS
Original Assignee
Institute of Botany of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Botany of CAS filed Critical Institute of Botany of CAS
Publication of CN117925691A publication Critical patent/CN117925691A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用。本发明公开的At4g37650为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明发现At4g37650基因对该基因的突变体进行转基因后，盐胁迫下的耐盐性提高，并恢复到野生型水平。因此，At4g37650基因在调节植物根盐胁迫响应中发挥着重要作用，可用于培育耐盐植物。

Description

At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用。
背景技术
土壤盐渍化已成为世界性农业问题。盐胁迫严重影响植物生长发育，导致农作物减产；盐胁迫会引发植物细胞生理水平上的渗透胁迫、离子毒害、氧化胁迫等。根系是植物最先感知盐环境的器官，其形态结构事实上是一个“感知系统”，盐胁迫抑制根分生组织的活性和侧根起始，影响根的生长，植物通过降低根系对盐胁迫的敏感性，形成理想根系构型提高其耐盐能力。因此，研究盐胁迫对植物根系构型的调节，对植物逆境应答有着十分重要的意义。
拟南芥At4g37650基因属于GRAS家族转录因子，其CDS长度为1596bp，编码531个氨基酸的蛋白。已有研究表明，在植物根系发育过程中，At4g37650基因在根的径向构型中起中心调控作用，At4g37650基因的多个突变体都出现主根生长减弱的表型。但是尚未见到有关该基因与盐胁迫调控的根系发育方面的研究报告，更无将该基因用于培育耐盐作物方面的相关研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何培育耐盐植物。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了来源于拟南芥的蛋白质(其名称为At4g37650或RSM1蛋白质)或调控RSM1蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：
D1)调控植物耐盐性；
D2)制备调控耐盐性产品；
D3)培育耐盐植物；
D4)制备培育耐盐植物产品；
D5)调控植物根长；
D6)制备调控植物根长产品；
D7)培育根长增加植物；
D8)制备培育根长增加植物产品；
RSM1蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的RSM1蛋白质，为与序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的RSM1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的RSM1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3所示的RSM1蛋白质。
上述应用中，所述物质可为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码RSM1蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低RSM1蛋白质表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；
b13)序列表中序列1所示的DNA分子；
b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码RSM1蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码RSM1蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码RSM1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的RSM1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码RSM1蛋白质且具有RSM1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B2)所述的含有编码RSM1蛋白质的核酸分子的表达盒(RSM1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达RSM1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动RSM1基因转录的启动子，还可包括终止RSM1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述RSM1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCAMBIA::super1300载体。
B3)所述重组载体具体可为pCAMBIA::super1300-RSM1。所述pCAMBIA::super1300-RSM1为将pCAMBIA::super1300载体的KpnI和SalI识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述应用中，所述调控植物根长可为增加或降低植物根长。所述调控RSM1蛋白质活性或含量的物质可为提高或降低RSM1蛋白质活性或含量的物质。
本发明还提供了培育耐盐植物的方法，所述方法包括使受体植物中表达RSM1蛋白质，或提高受体植物中RSM1蛋白质的含量，或提高受体植物中RSM1蛋白质的活性，得到耐盐植物。
本发明还提供了培育根长增加植物的方法，包括使受体植物中表达RSM1蛋白质，或提高受体植物中RSM1蛋白质的含量，或提高受体植物中RSM1蛋白质的活性，得到与受体植物相比根长增加的目的植物。
上述方法可通过向所述受体植物中导入RSM1蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。
上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。
上述方法中，其中所述RSM1的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述RSM1的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述RSM1的编码基因可利用含有所述RSM1的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pCAMBIA::super1300-RSM1。
所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。
所述目的植物理解为不仅包含RSM1蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供了具有提高植物耐盐性的产品，所述产品含有RSM1蛋白质或所述调控RSM1蛋白质活性或含量的物质。
本发明中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)十字花科植物；
M3)拟南芥。
RSM1蛋白质或所述调控RSM1蛋白质活性或含量的物质，也属于本发明的保护范围。
本发明发现RSM1基因功能缺失拟南芥植株，对NaCl处理敏感，在NaCl处理时，根系中主根发育受到抑制。除此之外，与野生型相比，突变体叶片颜色深，根毛的密度及长度均显著增大。而将该基因对该基因的突变体进行转基因后，盐胁迫下的耐盐性提高，并恢复到野生型水平。因此，RSM1基因在调节拟南芥根盐胁迫响应中发挥着重要作用，可用于培育耐盐植物。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为野生型和转基因拟南芥的RSM1基因表达量的检测。
图2为转基因拟南芥的耐盐性检测结果。(A)150mM NaCl处理7天后突变体和阳性转基因纯合株系的根表型；(B)不同浓度NaCl处理7d后各植株主根长度统计图。标尺长度为1cm，**P<0.01。MS表示所用培养基不含NaCl。
图3为rsm1与其等位突变体shr-2根表型差异分析。(A)正常情况下，WT、rsm1、shr-2与shr-2/RSM1-1的根生长情况比较；(B)正常情况下，WT、rsm1、rsm1/RSM1-1和rsm1/RSM1-1的根毛生长情况比较；(C,D)正常情况下，根毛长度和密度统计图。白色标尺长度为1cm，黑色标尺长度为0.5mm，**P<0.01。
图4为rsm1与WT根排Na+能力的差异分析。(A)使用NMT系统检测拟南芥根部分生区；(B)rsm1与WT根分生区Na+流速。*P<0.05。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的pCAMBIA::super1300载体为文献(Huan Dong et al,Modulationof Guard Cell Turgor and Drought Tolerance by a Peroxisomal Acetate–
MalateShunt,Molecular Plant 11,1278–1291,October 2018)中的pCAMBIAsuper-1300，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
拟南芥突变体rsm1：EMS诱导突变体，来源于EMS诱变突变体库，其At4g37650基因第1136位核苷酸由G突变为A，该位点的突变造成氨基酸由组氨酸变成了赖氨酸(p.E315K)，蛋白质序列发生了改变。
拟南芥突变体shr-2：来源于拟南芥资源中心(ABRC，Ohio State University)，该突变体为At4g37650基因突变的纯合拟南芥突变体，其At4g37650基因发生10bp的缺失和431bp的插入。
实施例1、At4g37650基因及其编码的蛋白质可以调控拟南芥的耐盐性
本发明发现来源于拟南芥的At4g37650基因(记为RSM1基因)及其编码的蛋白质可以调控拟南芥的耐盐性，在拟南芥中，RSM1基因组序列为序列表中序列1，其CDS序列为序列2，编码序列3所示的RSM1蛋白质。
一、重组载体的构建
将pCAMBIA::super1300载体的KpnI和SalI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的RSM1基因，将得到的重组载体记为pCAMBIA::super1300-RSM1。pCAMBIA::super1300-RSM1能表达序列3所示的RSM1蛋白质。
二、转基因拟南芥的构建与鉴定
将步骤一所得重组载体导入农杆菌菌株GV3101中，以农杆菌介导的遗传转化方法分别转化拟南芥突变体rsm1，转化后的植株收种子半个月后，对其用潮霉素进行筛选，获得阳性转基因植株。以两个T3代阳性转基因纯合株系(rsm1/RSM1-1与rsm1/RSM1-2)进行后续的表型鉴定。
提取野生型Columbia(Col-0，WT)和两个T3代阳性转基因纯合株系的RNA，利用定量PCR进行RSM1基因表达量的分析。所用RSM1的正向引物为5'-GTGGCGGCAAACGGAGCAATC-3'、反向引物为5'-TAGGTGAGGCGTGTCGTCTGA-3'；内参基因Actin8的正向引物为5'-GCAGACCGTATGAGCAAAGA-3'，反向引物为5'-GAGGGAAGCAAGGATAGAAC-3'。
结果如图1所示，rsm1/RSM1-1、rsm1/RSM1-2与野生型相比RSM1的基因表达量分别为3.59±0.23倍和3.74±0.25倍。表明在突变体中转入RSM1基因后，该基因发生了过量表达。
按照上述方法，将步骤一所得重组载体导入农杆菌菌株GV3101中，以农杆菌介导的遗传转化方法转化拟南芥突变体shr-2，得到RSM1的基因表达量显著提高的T3代阳性转基因纯合株系shr-2/RSM1。
三、转基因拟南芥的耐盐性检测
以步骤二所得两个T3代阳性转基因纯合株系、拟南芥突变体rsm1为待测植株，检测各植株的耐盐性，利用野生型拟南芥Columbia(Col-0，WT)作为对照。
将待测拟南芥种子点种在1.2％琼脂的MS培养基上，于光照培养间，光/暗周期为12/12h，温度22℃，相对湿度70％的条件下萌发并竖直生长4天，然后转移到含有不同NaCl浓度的1.2％琼脂的MS培养基上进行NaCl处理，NaCl浓度设置为0、100、150mM，NaCl处理7天后观察根的发育情况，并测量主根长。
结果如图2所示，在NaCl浓度为0时，野生型拟南芥、突变体rsm1、rsm1/RSM1-1与rsm1/RSM1-2的主根长分别为2.95±0.58cm、2.36±0.83cm、2.91±0.36cm、2.93±0.41cm，彼此之间无显著差异；在NaCl浓度为100mM时，野生型拟南芥、突变体rsm1、rsm1/RSM1-1与rsm1/RSM1-2的主根长分别为2.57±0.68cm、1.86±0.53cm、2.54±0.13cm、2.36±0.12cm，rsm1/RSM1-1与rsm1/RSM1-2的主根长均显著高于突变体rsm1，且与野生型无显著差异，根生长均能够回复至野生型水平；在NaCl浓度为150mM时，野生型拟南芥、突变体rsm1、rsm1/RSM1-1与rsm1/RSM1-2的主根长分别为0.84±0.21cm、0.39±0.03cm、0.85±0.36cm、0.95±0.12cm，rsm1/RSM1-1与rsm1/RSM1-2的主根长均显著高于突变体rsm1，且与野生型无显著差异，根生长均能够回复至野生型水平。表明突变体rsm1的根系构型在盐胁迫下的变化确实是由RSM1基因突变引起的，同时表明RSM1基因具有提高拟南芥耐盐性的功能。
实施例2、RSM1基因突变使rsm1表型发生新的改变
以实施例1所得三个T3代阳性转基因纯合株系、拟南芥突变体rsm1、拟南芥突变体shr-2为待测植株，检测各植株的在正常情况下根的生长状况，利用野生型拟南芥Columbia(Col-0，WT)作为对照。
将待测拟南芥种子点种在1.2％琼脂的MS培养基上，于光照培养间，光/暗周期为12/12h，温度22℃，相对湿度70％的条件下萌发并竖直生长，培养10天后观察根的发育情况，并测量主根长与根毛长度、根毛密度。根毛长度是所有根毛的平均长度，根毛密度是指单位长度上根毛的数量。
结果如图3所示，结果显示，在正常情况下，rsm1主根长度与野生型(WT)无显著差异，而其等位突变体shr-2(SHR基因发生10bp的缺失和431bp的插入)主根明显变短，等位突变体shr-2的转基因材料shr-2/RSM1的主根长度恢复至野生型一致的水平(图3中A)。在正常情况下，rsm1根毛长度增加、密度增大(P<0.01)，而转基因株系与WT无差异(图3中B,C,D)。表明RSM1基因突变(p.E315K)导致基因功能发生新的改变，RSM1基因可以调控根的生长，其过表达可以促进根的生长，进一步，该基因可能通过过长和过多的根毛影响盐的吸收，进而表现出盐敏感表型。
实施例3、野生型WT和变体rsm1根的排Na+能力的差异分析
在实施例1基础上，为进一步验证RSM1基因功能，利用非损伤微测系统(Non-invasive Micro-test Technology,NMT,旭月公司)检测根部Na+跨膜转运速率及方向，即流速。明确盐胁迫下野生型WT和变体rsm1两种材料根的排Na+能力的差异。
待测植株为：拟南芥突变体rsm1、野生型拟南芥Columbia(Col-0，WT)。
具体步骤如下：
(1)将在正常1.2％琼脂的MS培养基上生长7天的野生型拟南芥WT和突变体rsm1幼苗分别放入200mM NaCl的MS盐溶液(即向MS液体培养基中添加NaCl得到的溶液，该溶液中NaCl的浓度为200mM)中处理24小时，以未处理的做对照。(2)挑选一棵生长状态良好的拟南芥幼苗，使用滤纸条和树脂块将样品根部进行固定，加入5毫升的测试液浸泡15min。(3)将测试液吸出，重新加入5毫升的测试液。(4)将样品放入NMT系统中检测根部分生区表面Na+流速。在显微镜下将Na+流速传感器定位于根部的待测位点，每组检测6个重复。使用imFluxes V2.0软件(旭月公司)直接读取流速数据，流速单位是pico mol·cm-2·s-1，正值代表外排，负值代表吸收。
结果显示，在正常条件下突变体rsm1与野生型WT外排Na+能力无差别，而在处理24小时情况下，突变体rsm1外排Na+能力显著下降，说明RSM1基因突变导致根细胞的排Na+的能力降低，进而抑制主根的生长，无法形成有效的耐盐调节。
综上，RSM1基因可以调控植物的耐盐性，可用于培育具有耐盐性的植物新品种。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：
D1)调控植物耐盐性；
D2)制备调控耐盐性产品；
D3)培育耐盐植物；
D4)制备培育耐盐植物产品；
D5)调控植物根长；
D6)制备调控植物根长产品；
D7)培育根长增加植物；
D8)制备培育根长增加植物产品；
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；
b13)序列表中序列1所示的DNA分子；
b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
4.下述任一方法：
X1)培育耐盐植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到耐盐植物；
X2)培育根长增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与受体植物相比根长增加的目的植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。
7.具有提高植物耐盐性的产品，含有权利要求1中所述蛋白质或权利要求1-3中任一所述物质。
8.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求7所述的产品，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)十字花科植物；
M3)拟南芥。
9.权利要求1中所述蛋白质或权利要求1-3中任一所述物质。
CN202410065656.5A 2023-01-17 2024-01-17 At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用 Pending CN117925691A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310062375 2023-01-17
CN202310062375X 2023-01-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117925691A true CN117925691A (zh) 2024-04-26

Family

ID=90756956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410065656.5A Pending CN117925691A (zh) 2023-01-17 2024-01-17 At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117925691A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113563442A (zh) 抗旱相关蛋白IbSPB1及其编码基因与应用
CN113980106B (zh) 调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用
CN109971766B (zh) 一种与植物耐逆相关蛋白PwRBP1及其编码基因与应用
CN111850030B (zh) 蛋白GmULT1在调控植物种子重量中的应用
CN114276428B (zh) 与水稻氮吸收与转化相关的蛋白质及其编码基因与应用
CN111574606B (zh) 小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用
CN114276426B (zh) 与水稻产量相关的蛋白质与生物材料及二者在提高水稻产量中的应用
WO2022188290A1 (zh) OsFTL1及其编码基因在缩短水稻的抽穗期中的应用
CN114277052B (zh) 用于缩短水稻抽穗期的蛋白质及其编码基因与应用
CN110698552B (zh) 水稻富含WD40重复蛋白OsWD40-141及其编码基因和应用
CN111620933B (zh) 蛋白GmNAC2在调控植物耐盐性中的应用
CN108611365B (zh) 种子相关蛋白在调控植物种子产量中的应用
CN117925691A (zh) At4g37650及其编码基因在培育耐盐作物方面的应用
CN114644693B (zh) ZmWRKY44蛋白及其编码基因与调控植物抗旱的应用
CN114644695B (zh) 用于调控玉米抗旱性的蛋白质及其应用
CN112679590B (zh) 调控植物耐热性的相关蛋白AtMYBS1及其编码基因与应用
CN112979775B (zh) 抗穗发芽转基因小麦的培育方法及其相关生物材料
CN114196644B (zh) 一种蛋白棕榈酰化转移酶dhhc16及其在提高水稻耐盐方面的应用
CN110819606B (zh) 水稻受体胞质激酶OsRLCK22及其编码基因和应用
CN114276425B (zh) OsDREB1C及其编码基因在提高水稻光合效率中的应用
CN114644691B (zh) Eip1蛋白及其编码基因与抗旱应用
CN114645064B (zh) 抗旱相关蛋白ZmSHH2c在提高玉米抗旱性中的应用
CN114645026B (zh) 苹果酸脱氢酶mdh及其编码基因与应用
CN117209575A (zh) 蛋白质及其编码基因在调控玉米大斑病和小斑病中的应用
CN116199754A (zh) 用于提高作物生物量并延长其生育期的SiDTH2蛋白质与其编码基因

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination