CN116199754A

CN116199754A - 用于提高作物生物量并延长其生育期的SiDTH2蛋白质与其编码基因

Info

Publication number: CN116199754A
Application number: CN202111441245.4A
Authority: CN
Inventors: 姚磊; 李丛丛; 王根平; 魏建华
Original assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-06-02

Abstract

本发明公开了用于提高作物生物量并延长其生育期的SiDTH2蛋白质与其编码基因。本发明公开的SiDTH2蛋白质，其序列为序列表中序列1，其编码基因序列为序列表中序列2。实验证明，与野生型相比，转化SiDTH2基因的转基因植物的株高、穗长、茎节数与抽穗期均显著增加，说明SiDTH2基因及其编码的蛋白质可以提高植物生物量，并可以延长其生育期，可以产生更高大的植株，本发明的SiDTH2基因及其编码的蛋白质具有很好的应用前景。

Description

用于提高作物生物量并延长其生育期的SiDTH2蛋白质与其编码基因

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，用于提高作物生物量并延长其生育期的SiDTH2蛋白质与其编码基因。

背景技术

植物对光周期的反应的调控作用在作物驯化和传播迁徙中起着极其重要的作用。光周期长短的变化在植物发育过程中起着决定性的作用。它控制着植物的萌发、生长、开花时期和其他产量相关性状。植物开花时间的变化与地理纬度密切相关。植物向不同纬度迁移时，常因纬度间光照长短和温度高低的不同，需要用不同的信号机制来诱导开花，以适应不同生长环境的变化。植物自身内部具有生物钟，能够对日长波动及昼夜节律做出反应，从而感知季节变化以调节开花。根据植物开花对日照长短(24小时周期的光周期)的需求，植物可分为长日(LD)、短日(SD)和日中性植物。开花所需光周期超过临界日长时为长日植物，开花所需光周期短于临界日长时为短日植物，而日中性植物开花与昼长无关。

抽穗期是植物由生长阶段进入生殖阶段的重要发育转变过程，是作物适应不同生态区保证产量的重要因素。抽穗期的变化是由多个基因和环境因素决定的，其中光周期起到了主要作用。作物通过自身的改变，降低对光周期敏感性，可以使其适应更广泛的生长环境。作物良种选育的一个重要目标就是培育开花对光周期不敏感的品种，从而提高良种的利用率。

谷子在我国具有一万多年的栽培历史，是我国北方的主要粮饲作物之一，在旱作农业和人们日常饮食中起着重要作用，是世界干旱和半干旱地区的重要粮食作物。尽管谷子是一种重要的谷类作物，但其遗传多样性和性状遗传机制还没得到很好的研究。

谷子是短日照作物。通常长日照条件对谷子抽穗期存在明显的抑制作用。典型的表型是很多谷子品种在中纬度地区表现优良，当引种到北部高纬度地区时表现出抽穗困难；即使经过较长天数的生长勉强可以抽穗，但生育期过长，在北部高纬度寒冷地区终因积温不够，不能正常成熟。这主要应该是北部高纬度地区的长日照对谷子抽穗调节途径中某些关键基因的抑制所引起。然而在谷子的自然进化和人工选育中，北纬高纬度地区仍有部分谷子品种可以正常生长，并完成其整个生活史。谷子在高纬度抽穗性状巨大差异的分子机制目前仍不清楚。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的生物量并延长其生育期。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物生物量与生育期；

D2)制备调控植物生物量与生育期产品；

D3)提高植物生物量与延长植物生育期；

D4)制备提高植物生物量与延长植物生育期产品；

D5)调控植物生育期；

D6)制备调控植物生育期产品；

D7)延长植物生育期；

D8)制备延长植物生育期产品；

所述蛋白质来源于谷子，其名称为SiDTH2，SiDTH2为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的蛋白质。

本发明还提供了与SiDTH2相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物生物量与生育期；

D2)制备调控植物生物量与生育期产品；

D3)提高植物生物量与延长植物生育期；

D4)制备提高植物生物量与延长植物生育期产品；

D5)调控植物生育期；

D6)制备调控植物生育期产品；

D7)延长植物生育期；

D8)制备延长植物生育期产品；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码SiDTH2的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SiDTH2的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码SiDTH2的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SiDTH2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SiDTH2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiDTH2蛋白质且具有SiDTH2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有73％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述73％或73％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码SiDTH2蛋白质的核酸分子的表达盒(SiDTH2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SiDTH2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动SiDTH2基因转录的启动子，还可包括终止SiDTH2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(″LAP″,Chao等人(1999)PlantPhysiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述SiDTH2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCUbi1390。

B3)所述重组载体具体可为OX-SiDTH2。所述OX-SiDTH2为将pCUbi1390的KpnI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的SiDTH2基因得到的重组载体。所述OX-SiDTH2能表达序列表中序列1所示的SiDTH2蛋白质，SiDTH2基因的表达由35S启动子驱动。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌EHA105。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了下述任一方法：

X1)培育生物量增加且生育期延长植物的方法，包括使受体植物中表达SiDTH2，或提高受体植物中SiDTH2的含量或活性，得到与所述受体植物相比生物量增加且生育期延长的目的植物；

X2)提高植物生物量并延长植物生育期的方法，包括使受体植物中表达SiDTH2，或提高受体植物中SiDTH2的含量或活性，得到与所述受体植物相比生物量增加且生育期延长的目的植物，实现植物生物量的提高与生育期的延长；

X3)培育生育期延长植物的方法，包括使受体植物中表达SiDTH2，或提高受体植物中SiDTH2的含量或活性，得到与所述受体植物相比生育期延长的目的植物；

X4)延长植物生育期的方法，包括使受体植物中表达SiDTH2，或提高受体植物中SiDTH2的含量或活性，得到与所述受体植物相比生育期延长的目的植物，实现植物生育期的延长。

上述方法中，X1)-X4)所述方法可通过向所述受体植物中导入SiDTH2的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述SiDTH2的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述SiDTH2的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述SiDTH2的编码基因可利用含有所述SiDTH2的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述OX-SiDTH2。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含SiDTH2蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明还提供了具有如下D1)-D4)中任一的功能的产品，所述产品含有SiDTH2或所述生物材料：

D1)调控植物生物量与生育期；

D2)提高植物生物量与延长植物生育期；

D3)调控植物生育期；

D4)延长植物生育期。

上文中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)谷子或水稻。

上文中，所述生物量可体现在株高、穗长和/或茎节数上。所述生育期可体现在抽穗期上。

SiDTH2或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

实验证明，与野生型相比，转化SiDTH2基因的转基因植物的株高、穗长、茎节数以及抽穗期均显著增加，说明SiDTH2基因及其编码的蛋白质可以提高植物生物量，并可延长其生育期，产生更高大的植株，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为SiDTH2基因的相对表达量检测结果。WT、OX1、OX5、OX6分别表示谷子Ci846、Line 1、Line 5和Line 6。

图2为不同株系的株高、穗长、茎节数以及抽穗期的统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、DTH2可以调控作物的株高与抽穗期

本发明发现一个来源于晋谷21的与株高相关的蛋白质，其名称为SiDTH2，其序列为序列表中序列1，在晋谷21中其CDS序列为序列表中序列2，将序列2所示的DNA片段记为SiDTH2基因。

一、重组载体的构建

1.转基因载体：pCUbi1390(可从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心获取，http://www.biovector.net/product/305997.html，货号：pcubi1390)。

2.SiDTH2基因编码区扩增

提取晋谷21叶片总RNA，反转录得到cDNA，以所得cDNA为模板，利用如下扩增引物进行PCR扩增，得到PCR产物。扩增引物：

F：5′-TTACTTCTGCACTAGGTACCATGGGAGGTACCCATCAGCAACCG-3′(加粗部分为与载体同源区段)

R：5′-GAATTCCCGGGGATCCTCATCTATCTCCAGCTCCTTCCCA-3′(加粗部分为与载体同源区段)。

3.重组载体构建

1)线性化载体：用KpnI和BamHI双酶切载体pCUbi1390，用1％琼脂糖胶纯化回收线性化载体骨架。

2)载体连接：将线性化载体骨架与步骤2所得PCR产物用pEASY-uni seamlesscloning and assembly kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行连接，将得到的序列正确的重组载体记为OX-SiDTH2。

OX-SiDTH2为将pCUbi1390的KpnI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的SiDTH2基因得到的重组载体，该重组载体能表达序列表中序列1所示的SiDTH2蛋白质，SiDTH2基因的表达由35S启动子驱动。

4.转化农杆菌：将OX-SiDTH2导入农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105/OX-SiDTH2。

二、谷子遗传转化与表型鉴定

以谷子Ci846为受体植物，采用农杆菌介导的遗传转化方法，利用步骤一所得重组菌EHA105/OX-SiDTH2转化谷子Ci846，获得24个独立转化事件。

将T1代转基因苗种植于温室，取8个转基因植株利用定量PCR检测SiDTH2基因在叶片中的相对表达量，结果显示6个不同转化事件SiDTH2基因表达量显著增加。表达量增加的转化株自交留种，得到T2代种子，其中三个株系为Line 1、Line 5和Line6(图1)。并选择SiDTH2基因表达量没有明显变化的作为阴性对照。

定量PCR所用引物为：5’-TGATGTCACCCTCAGCTATTAAGG-3’和5’-ATTCTCCCGGGACACATCAAAAT-3’；利用SiACTIN基因为内参，内参引物为5’-TATCGTTCAAACAGATTTACGGCCT-3’和5’-TAGAGAAGAAGTGACGAAGCCTTG-3’。

将Line 1、Line 5和Line 6的T2代种子于5月初播种于大田，每个株系不少于30个植株，并利用谷子Ci846(WT)与阴性对照作为对照，调查抽穗期、株高、茎节数和穗长等表型数据。

抽穗期是指出苗的第二天起到该家系一半植株抽穗当天的天数。

株高是指成熟期主茎基部至穗基部的长度。

茎节数是成熟期主茎基部第一伸长节至穗茎节节间数。

穗长是成熟期主茎穗从基部第一码到尖端的长度。

部分结果如表1、图2所示。结果显示，谷子Ci846与阴性对照的株高、穗长、茎节数以及抽穗期均无显著差异；对于株高，Line 1、Line 5和Line 6的株高均显著高于谷子Ci846；对于穗长，Line 1、Line 5和Line 6的穗长均显著高于谷子Ci846；对于茎节数，Line1、Line 5和Line 6的茎节数均显著大于谷子Ci846；对于抽穗期，Line1、Line 5和Line 6的抽穗期均显著大于谷子Ci846。表明，SiDTH2基因及其编码的SiDTH2蛋白质可以同时提高谷子的株高、穗长与茎节数，并可同时延长其抽穗期。

表1、表型检测结果

植株	株高(cm)	穗长(cm)	茎节数(个)	抽穗期(天)
					WT	138.57±7.25	7.09±0.70	12.00±0.82	53.71±2.69
Line 1	158.08±9.20*	7.53±0.77*	13.92±1.56*	63.00±3.05*
					Line 5	161.75±7.80*	7.35±0.72*	14.25±0.96*	61.25±1.71*
Line 6	157.80±7.19*	7.62±0.64*	14.00±1.00*	63.80±2.77*

表1中，*表示与WT相比具有显著性差异，p＜0.05。

三、转基因水稻的构建及表型鉴定

以水稻Kitaake为受体植物，采用农杆菌介导的遗传转化方法，利用步骤一所得重组菌EHA105/OX-SiDTH2转化水稻Kitaake，获得128个转基因株系。

按照步骤二中的定量PCR方法检测SiDTH2基因在转基因株系中的相对表达量，选择与水稻Kitaake相比SiDTH2基因表达量显著提高的SiDTH2基因过表达株系，统计T0代过表达株系的抽穗期与株高。

抽穗期是指是指出苗的第二天起到该家系一半植株抽穗当天的天数，株高是指是指成熟期主茎基部至穗基部的长度。

结果显示，水稻Kitaake的抽穗期为53天，SiDTH2基因过表达株系的抽穗期为58天，二者具有显著差异；水稻Kitaake的平均株高为53cm，SiDTH2基因过表达株系的株高为62cm，二者具有显著差异。即SiDTH2基因过表达株系出现晚抽、株高升高的表型。说明，SiDTH2基因及其编码的SiDTH2蛋白质可以提高水稻的株高，并可同时延长其抽穗期。

谷子与水稻的转基因实验表明，SiDTH2基因及其编码的SiDTH2蛋白质可以延长作物的生育期，提高生物量，产生更高大的植株。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 北京农业生物技术研究中心

<120> 用于提高作物生物量并延长其生育期的SiDTH2蛋白质与其编码基因

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 755

<212> PRT

<213> 谷子（Setaria italica）

<400> 1

Met Gly Gly Thr His Gln Gln Pro Gly Val Asp Gly Gln Ser Val Arg

1 5 10 15

Arg Asp Ala Arg Leu Leu Gly Asn Ser Ala Val Asp Val Ala Glu Gly

20 25 30

Asn Gly Leu Gln Gln Gly Asp Ser Asp Leu Arg Ser Ser Asp Pro Asp

35 40 45

Gly Leu Leu Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Gln Gln Gly Asp Thr Glu

50 55 60

Asn Gln Gln Gln Gln Gln Val Cys Trp Glu Arg Phe Leu Gln Lys Lys

65 70 75 80

Thr Ile Lys Val Leu Leu Val Glu Ser Asp Asp Ser Thr Arg Gln Val

85 90 95

Val Ser Ala Leu Leu Arg His Cys Met Tyr Glu Val Ile Pro Ala Glu

100 105 110

Asn Gly Gln Gln Ala Trp Ser Tyr Leu Glu Asp Met Gln Asn Ser Ile

115 120 125

Asp Leu Val Leu Ala Glu Val Phe Met Pro Gly Val Ser Gly Ile Ser

130 135 140

Leu Leu Ser Arg Ile Met Ser His Asn Ile Cys Lys Asn Ile Pro Val

145 150 155 160

Ile Met Met Ser Ser Asn Asp Ala Met Gly Thr Val Phe Lys Cys Leu

165 170 175

Ser Lys Gly Ala Val Asp Phe Phe Val Lys Pro Ile Arg Lys Asn Glu

180 185 190

Leu Lys Asn Leu Trp Gln His Val Trp Arg Arg Cys His Ser Ser Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Ser Glu Ser Gly Ile Gln Arg Gln Lys Cys Ala Lys Ser

210 215 220

Lys Ser Gly Asp Glu Ser Asp Asn Ser Gly Ser Asn Asp Asn Asp Glu

225 230 235 240

Asp Asp Glu Ala Ser Met Gly Leu Asn Ala Arg Asp Gly Ser Asp Asn

245 250 255

Gly Ser Gly Thr Gln Ala Arg Ser Ser Trp Thr Lys Arg Ala Val Glu

260 265 270

Ile Asp Ser Pro Gln Ala Met Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Pro Pro

275 280 285

Asp Ser Thr Cys Ala Gln Val Val His Pro Lys Ser Glu Ile Cys Ser

290 295 300

Asn Arg Trp Leu Pro Gly Thr Asn Asn Arg Asn Cys Lys Lys Gln Lys

305 310 315 320

Asp Thr Asn Asp Asp Phe Lys Glu Lys Asp Leu Asp Ile Gly Ala Pro

325 330 335

Arg Lys Leu Asn Thr Asp Ser Gln Cys Ser Pro Asn Glu Arg Pro Met

340 345 350

Lys Pro Ala Asp Gly Arg Arg Glu Tyr Pro Pro Glu Asn Asn Ser Asn

355 360 365

Glu Ser Met Met Glu Asn Leu Glu Glu Ala Thr Val Arg Ala Ala Asp

370 375 380

Leu Ile Gly Ser Met Ala Lys Asn Met Asp Ala Gln Gln Ala Ala Arg

385 390 395 400

Gly Ala Asp Ala Pro Asn Cys Ser Ser Lys Val Pro Glu Gly Lys Asp

405 410 415

Met Asn Arg Gly Asn Val Leu Pro Leu Leu Glu Leu Ser Leu Lys Arg

420 425 430

Ser Arg Ser Ser Ala Asp Gly Ala Asn Thr Ile Gln Asp Glu Gln Arg

435 440 445

Asn Val Leu Arg Arg Ser Asp Pro Ser Ala Phe Thr Arg Tyr His Thr

450 455 460

Ser Ala Val Ser Asn Gln Gly Gly Thr Gly Phe Val Gly Ser Cys Ser

465 470 475 480

Pro His Asp Asn Ser Ser Glu Ala Met Lys Thr Asp Ser Thr Tyr Asn

485 490 495

Met Lys Ser Asn Ser Asp Ala Ala Met Ile Lys Gln Gly Ser Asn Gly

500 505 510

Ser Ser Asn Asn Asn Asp Met Gly Ser Thr Thr Lys Asn Val Val Thr

515 520 525

Lys Pro Thr Thr Asn Lys Glu Arg Val Met Ser Pro Ser Ala Ile Lys

530 535 540

Ala Asn Ala His Thr Ser Ala Phe His Pro Val Gln His Trp Thr Val

545 550 555 560

Pro Ala Asn Ala Ala Gly Lys Ala Lys Ala Asp Glu Met Val Asn Asn

565 570 575

Ala Thr Lys Asn Gly His Pro Gly Glu Val Gln Ser Asn Leu Val Gln

580 585 590

His Pro Arg Pro Ile Leu Tyr Val His Phe Asp Val Ser Arg Glu Asn

595 600 605

Gly Gly Ser Gly Ala Pro Gln Cys Gly Ser Ser Asn Val Phe Asp Pro

610 615 620

Pro Leu Glu Gly Gln Ala Ala Asn Tyr Gly Met His Gly Ser Asn Ser

625 630 635 640

Gly Ser Asn Asn Gly Thr Asn Gly Gln Asn Arg Ser Thr Ala Ala Ala

645 650 655

Asn Ala Glu Arg Thr Asn Thr Glu Ile Ala Asn Gly Ala Ile Asn Lys

660 665 670

Ser Gly Pro Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Gly Asn Asp

675 680 685

Thr Tyr Val Lys Arg Met Ala Pro Thr Pro Arg Glu Ala Gln Leu Met

690 695 700

Lys Tyr Arg Glu Lys Lys Lys Asp Arg Asn Phe Gly Lys Lys Val Arg

705 710 715 720

Tyr Gln Ser Arg Lys Arg Leu Ala Asp Gln Arg Pro Arg Val Arg Gly

725 730 735

Gln Phe Val Lys Gln Ala Val Gln Asp Gln Gly Gly Trp Glu Gly Ala

740 745 750

Gly Asp Arg

755

<210> 2

<211> 2268

<212> DNA

<213> 谷子（Setaria italica）

<400> 2

atgggaggta cccatcagca accgggtgtg gatggacaat ccgttagaag agatgccaga 60

ctgcttggga acagcgcggt ggatgtggct gagggcaatg ggctccagca aggggacagc 120

gacttgagga gcagtgaccc tgatggcctg ctcagcgggc caaccactgg tctgcagcag 180

ggtgacacgg aaaatcagca gcagcaacag gtctgctggg agcgcttcct ccagaagaag 240

actatcaaag tcttgctcgt ggagagtgat gattcaacca ggcaggtggt cagtgccctg 300

ctacgtcact gcatgtacga agttatccct gccgaaaatg gtcagcaagc atggagttat 360

cttgaagata tgcaaaacag catagatctt gttttggctg aggtttttat gcctggtgtt 420

tctggaattt ctctgctaag taggatcatg agccacaata tttgcaagaa tattccagtg 480

attatgatgt cttcgaatga tgctatgggt actgtcttta aatgtttgtc aaaaggtgct 540

gttgactttt ttgtcaagcc tatacgtaag aatgaactta agaacctttg gcagcatgtg 600

tggagacggt gccacagctc cagtggtagt ggaagtgaaa gtggcattca gagacagaag 660

tgtgccaaat caaaaagtgg tgatgaatct gataacagtg gtagcaatga caacgacgag 720

gacgatgagg caagcatggg acttaatgca agggatggca gtgataatgg cagtggcact 780

caagcgcgga gctcgtggac taagcgtgct gtggagatcg acagtccaca ggctatgtct 840

ccagatcagt tagctgatcc accagatagc acatgtgcac aagtggtcca cccaaaatca 900

gagatatgta gcaacagatg gctaccaggt acaaacaaca gaaactgcaa gaagcaaaaa 960

gacactaatg atgactttaa ggagaaggac ttggatatag gtgcccctag aaaattaaat 1020

acggatagtc aatgttcccc aaatgagagg cccatgaagc cagcagatgg tcgtcgcgag 1080

tacccaccag aaaacaattc caatgagtca atgatggaaa atttagagga ggctactgtt 1140

cgagctgctg atctgattgg ttcaatggcc aaaaacatgg atgcccagca ggcagcaaga 1200

ggtgcagatg cccctaattg ctcttccaaa gtgccagaag ggaaagatat gaaccgtggt 1260

aatgttttgc cattacttga attgagtttg aagaggtcaa gatcatctgc agatggtgcc 1320

aatacaatcc aagatgaaca gcggaatgta ttaagacgat cagatccctc agcattcaca 1380

aggtaccata catctgcggt ttccaatcaa ggcgggacag gatttgtggg gagctgttca 1440

ccgcatgata acagctctga ggctatgaaa acggactcta cttacaacat gaagtcaaat 1500

tcagatgctg ctatgataaa acaaggctcc aatggcagta gcaataacaa tgacatgggt 1560

tccactacaa agaatgttgt gacaaaacct actacaaata aggagagagt gatgtcaccc 1620

tcagctatta aggctaatgc acacacatca gcatttcatc ctgtgcagca ctggacggtt 1680

ccagctaatg ctgcaggaaa agcaaaggct gatgaaatgg tcaacaatgc aactaagaat 1740

ggtcaccctg gtgaagtgca gagcaacctc gtgcaacacc ctcgtccaat tctctacgtc 1800

cattttgatg tgtcccggga gaatggtggg tcaggagcac cgcaatgtgg ttcctccaac 1860

gtatttgatc ctccacttga aggtcaagct gccaactatg gtatgcacgg gagcaactca 1920

ggcagtaaca atggaaccaa tgggcagaat agaagcacag ctgctgcaaa tgctgaacgg 1980

acaaacacgg agattgctaa tggggccatc aacaaaagtg gacctggagg tggcaatggg 2040

agtggaagtg tcagcggcaa tgacacatat gtgaaacgga tggccccgac accacgagaa 2100

gcacagctga tgaaatatag agagaaaaag aaagatcgga actttgggaa aaaggtgcgg 2160

taccagagca gaaagaggtt ggccgatcag cggccccggg tccgaggaca gtttgtgaag 2220

caagctgtgc aagatcaggg cggatgggaa ggagctggag atagatga 2268

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物生物量与生育期；

D2)制备调控植物生物量与生育期产品；

D3)提高植物生物量与延长植物生育期；

D4)制备提高植物生物量与延长植物生育期产品；

D5)调控植物生育期；

D6)制备调控植物生育期产品；

D7)延长植物生育期；

D8)制备延长植物生育期产品；

所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物生物量与生育期；

D2)制备调控植物生物量与生育期产品；

D3)提高植物生物量与延长植物生育期；

D4)制备提高植物生物量与延长植物生育期产品；

D5)调控植物生育期；

D6)制备调控植物生育期产品；

D7)延长植物生育期；

D8)制备延长植物生育期产品；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

4.下述任一方法：

X1)培育生物量增加且生育期延长植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比生物量增加且生育期延长的目的植物；

X2)提高植物生物量并延长植物生育期的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比生物量增加且生育期延长的目的植物，实现植物生物量的提高与生育期的延长；

X3)培育生育期延长植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比生育期延长的目的植物；

X4)延长植物生育期的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比生育期延长的目的植物，实现植物生育期的延长。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：X1)-X4)所述方法通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。

7.具有如下D1)-D4)中任一的功能的产品，含有权利要求1中所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料：

D1)调控植物生物量与生育期；

D2)提高植物生物量与延长植物生育期；

D3)调控植物生育期；

D4)延长植物生育期。

8.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求7所述的产品，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)谷子或水稻。

9.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求7所述的产品，或权利要求8所述的应用、方法或产品，其特征在于：所述生物量体现在株高、穗长和/或茎节数上；

和/或，所述生育期体现在抽穗期上。