CN110698552B

CN110698552B - 水稻富含WD40重复蛋白OsWD40-141及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110698552B
Application number: CN201911118542.8A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 李全林; 卢家玲
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110698552A

Abstract

本发明公开了一种水稻富含WD40重复蛋白OsWD40‑141及其编码基因和应用。本发明首先公开了如下任一所示的蛋白质在调控植物白叶枯病抗性中的应用：A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；A2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；A3)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。进一步公开了培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物的方法。本发明为创造基于蛋白OsWD40‑141的白叶枯病抗性材料提供高效的育种方式，具有重要应用价值。

Description

水稻富含WD40重复蛋白OsWD40-141及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，涉及水稻富含WD40重复蛋白OsWD40-141及其编码基因和应用。

背景技术

水稻白叶枯病是制约水稻生产的一种重要细菌性病害，对于水稻种植产业危害严重，一般可致水稻减产20％-30％左右，严重可达50％。培育含抗性基因的抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施，然而，目前已报道的42个水稻白叶枯病抗性基因/位点(http：//www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)大部分表现出抗谱较窄或者难以利用，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。

由于黄单胞杆菌水稻致病变种(白叶枯病菌)易于变异，水稻与白叶枯病菌的协同进化导致品种抗性极易丧失。因此，鉴定并敲除白叶枯病易感性基因提高水稻品种的抗病性，对于水稻抗病育种具有重要的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高水稻的白叶枯病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质命名为富含WD40重复蛋白OsWD40-141，来源于水稻(Oryza sativa L.)，是如下任一所示的蛋白质：

A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

A3)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由555个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

本发明还提供上述蛋白OsWD40-141在调控植物白叶枯病抗性中的应用。

上述蛋白OsWD40-141相关生物材料也属于本发明的保护范围，本发明还提供了蛋白质OsWD40-141相关生物材料的新用途。

本发明蛋白OsWD40-141相关生物材料在调控植物白叶枯病抗性中的应用，所述相关生物材料为如下任一所示：

C1)编码蛋白OsWD40-141的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；

C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；

C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组载体的转基因植株；

C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；

C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体；

C11)破坏上述蛋白OsWD40-141的基因的表达量和/或抑制上述蛋白OsWD40-141的活性和/或降低上述蛋白OsWD40-141的含量的核酸分子；

C12)含有C11)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述相关生物材料中，C1)所述核酸分子为如下任一所示：

B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的DNA分子杂交，且编码蛋白OsWD40-141的DNA分子。

其中，SEQ ID No.2由16427个核苷酸组成，编码序列为SEQ ID No.3所示，由1668个核苷酸组成，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述相关生物材料中，C2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白OsWD40-141的DNA，该DNA不但可包括启动OsWD40-141基因转录的启动子，还可包括终止OsWD40-141转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：OsWD40-141基因自身的启动子，组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(″LAP″，Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：OsWD40-141基因自身的终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313：810；Rosenberg等人(1987)Gene，56：125；Guerineau等人(1991)M0l.Gen.Genet，262：141；Proudfoot(1991)Cell，64：671；Sanfacon等人Genes Dev.，5：141；Mogen等人(1990)Plant Cell，2：1261；Munroe等人(1990)Gene，91：151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.，15：9627)。

上述相关生物材料中，C3)所述重组载体可含有SEQ ID No.3所示的用于编码蛋白OsWD40-141的DNA分子。

可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白OsWD40-141基因或所述蛋白OsWD40-141基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用OsWD40-141构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述相关生物材料中，C11)所述核酸分子的核苷酸序列为靶向C1)所述核酸分子的DNA片段，即靶序列。具体的，所述靶序列位于OsWD40-141基因或其自身启动子中任一包括TTTNXXX的核苷酸序列上；其中，XXX为22-24bp的核苷酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。更具体的，所述靶序列为SEQ ID NO.2第12-34位。

上述相关生物材料中，C12)所述重组载体可为利用CRISPR/Cpf1技术制备的可以破坏蛋白OsWD40-141基因的表达量和/或抑制上述蛋白OsWD40-141的活性和/或降低上述蛋白OsWD40-141的含量的重组载体。所述重组载体可含有表达C11)所述核酸分子的表达盒。具体的，所述重组载体为重组表达载体Lb-OsWD40-141-1，即在Lb-CRISPR/Cpf1载体(以pCAMBIA1300为骨架的Lb-CRISPR/Cpf1载体构建)的水稻U6启动子下游插入SEQ ID NO.2第12-34位所示序列得到的重组表达载体。所述重组表达载体Lb-OsWD40-141-1含有C11)所述核酸分子的表达盒。

上述相关生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌EH105。

上述相关生物材料中，所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上述相关生物材料中，所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明进一步提供了调控植物白叶枯病抗性的产品，含有上述蛋白OsWD40-141或其相关生物材料。

上述蛋白OsWD40-141或其相关生物材料在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：

D1)在培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物中的应用；

D2)在制备培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物产品中的应用；

D3)在培育白叶枯病抗性降低的基因突变植物中的应用；

D4)在制备培育白叶枯病抗性降低的基因突变植物产品中的应用；

D5)在植物育种中的应用。

上述应用中，植物育种中的应用具体可为将破坏了上述蛋白OsWD40-141基因的表达和/或抑制了上述蛋白OsWD40-141的活性和/或降低了上述蛋白OsWD40-141的含量的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

本发明还提供了培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物的方法。

本发明培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物的方法，包括破坏目的植物中上述蛋白OsWD40-141基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白OsWD40-141的活性和/或降低上述蛋白OsWD40-141的含量，得到基因突变植物；所述基因突变植物比所述目的植物的白叶枯病抗性增强。

上述方法中，所述破坏目的植物中上述蛋白OsWD40-141基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白OsWD40-141的活性和/或降低上述蛋白OsWD40-141的含量的方法为通过对所述目的植物中上述蛋白OsWD40-141基因或其启动子进行敲除或抑制或改变来实现的。

在本发明中，使用任何生物技术破坏水稻中富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141的表达量和/或抑制蛋白OsWD40-141的活性和/或降低上述蛋白OsWD40-141的含量均能达到增强白叶枯病抗性的目的。

在本发明具体的实施方式中，所述破坏目的植物中上述蛋白OsWD40-141基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白OsWD40-141的活性和/或降低上述蛋白OsWD40-141的含量的方法是利用CRISPR/Cpf1技术对所述目的植物中上述蛋白OsWD40-141基因的启动子进行敲除来实现的。其中，所述蛋白OsWD40-141基因为SEQ ID NO.2所示的DNA分子或SEQID NO.3所示的DNA分子；所述CRISPR/Cpf1为II类V型CRISPR载体系统。

本发明利用CRISPR/Cpf1系统靶向编辑的TTTNXXX形式及在远离TTTN的18-23bp处切割产生5nt粘性末端的技术特征，从而造成该基因的正常表达受到破坏，进而影响该基因编码的蛋白质的含量和/或生物学功能。

在本发明具体的实施方式中，所述CRISPR/Cpf1技术中的靶序列为SEQ ID NO.2第12-34位，即本发明选用具有代表性的SEQ ID NO.2第12-34位作为靶序列，验证TTTNXXX形式(XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基)的序列发生插入或缺失均可以破坏植物基因的正常表达并且表现出白枯病抗性提高的性状。

上述方法中，所述CRISPR/Cpf1技术具体为在Lb-CRISPR/Cpfl载体(以pCAMBIA1300为骨架的Lb-CRISPR/Cpf1载体构建)的水稻U6启动子下游插入核苷酸序列是SEQ ID NO.2第12-34位的DNA片段获得重组表达载体Lb-OsWD40-141-1；将含重组表达载体Lb-OsWD40-141-1的根癌农杆菌转入水稻中，实现水稻中SEQ ID NO.2所示序列第12-34位发生插入或缺失，使得水稻的OsWD40-141基因失去原有的表达，获得白叶枯病抗性增强的基因突变水稻材料。

本发明中，所述植物为M1)或M2)或M3)或M4)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)稻属植物；

M4)水稻。

本发明中，所述水稻具体可为日本晴以及OsWD40-141等位基因与日本晴相同的其它水稻品种。

本发明中，所述白叶枯病抗性为对白叶枯病菌IV的抗性。

本发明利用OsWD40-141及其编码的蛋白参与调控水稻对白叶枯病菌免疫响应的特点及CRISPR/Cpf1技术的基因组靶向修饰作用，将含有靶序列的重组表达载体Lb-OsWD40-141-1导入到水稻品种中获得的OsWD40-141基因突变植株的突变率为100％，同时在所述水稻品种中定点敲除诱导产生的纯合突变体植株表现出对白叶枯病菌IV的抗性水平增强的特征，水稻白枯病IV病斑长度缩短16.5％～33.9％，即通过定点敲除创制水稻白叶枯抗病材料，为创造基于蛋白OsWD40-141的白叶枯病抗性材料提供一种高效的育种方式，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1提供的基于CRISPR/Cpf1技术水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141定点敲除方法的载体活性检测测序峰图。

图2为实施例2提供的水稻日本晴背景下不同cpf1-oswd40-141纯合突变植株中OsWD40-141基因核苷酸序列的突变类型，黑色框内核苷酸序列为发生缺失的核苷酸序列；其中，3种不同纯合突变体cpf1-oswd40-141分别为cpf1-oswd40-141-1、cpf1-oswd40-141-2和cpf1-oswd40-141-3。

图3为实施例2提供的水稻日本晴背景下3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22植株接种白叶枯病菌IV后病斑表型及长度统计；其中，A为不同纯合突变体cpf1-oswd40-141植株接种白叶枯病菌IV后病斑表型，B为不同纯合突变体cpf1-oswd40-141植株接种白叶枯病菌IV后的病斑长度统计。3种不同纯合突变体cpf1-oswd40-141分别为cpf1-oswd40-141-1、cpf1-oswd40-141-2和cpf1-oswd40-141-3，标尺＝2厘米，***表示P＜0.01。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Lb-CRISPR/Cpf1载体：记载过该材料的非专利文献是“Mugui Wang，Yanfei Mao，Yuming Lu，Xiaoping Tao and Jian-kang Zhu.Multiplex Gene Editing in Rice Usingthe CRISPR-Cpf1 System.Molecular Plant，2017，10，1011-1013”。经中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康老师同意后，公众可从申请人处获得该载体。

日本晴(Nipponbare，Oryza sativa ssp.japonica：记载过该材料的非专利文献是Yongqing Jiao，Yonghong Wang，Dawei Xue，Jing Wang，Meixian Yan，Guifu Liu，Guojun Dong，Dali Zeng，Zefu Lu，Xudong Zhu，Qian Qian and Jiayang Li.Regulationof OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice.NatureGenetics，2010，42，541-544。公众可从中国农业科学作物科学研究所获得。

水稻白叶枯病菌菌株IV：记载在“曾列先，黄少华，伍尚忠.IRBB21(Xa21)对广东稻白叶枯病菌5个小种的抗性反应.植物保护学报，2002，29(2)：97-100”一文中，经广东省农业科学院曾列先老师同意后，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

根癌农杆菌EHA105购自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

本发明通过对1440份国内外水稻材料接种白叶枯病菌IV后病斑长度的全基因组关联分析(Genome-wide associated study，GWAS)鉴定到与水稻白叶枯抗病性相关的候选基因OsWD40-141(LOC_Os07g22220)，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，由16427个核苷酸组成，其编码序列如SEQ ID No.3所示，编码SEQ ID No.1所示的富含WD40重复的蛋白，由555个氨基酸残基组成，将所述蛋白命名为OsWD40-141。

实施例1、基于Lb-CRISPR/Cpf1系统的水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141定点敲除方法

1、水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141的序列及分析

水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141的序列如SEQ ID No.2所示，序列分析显示，该基因共包括14个外显子，分别为SEQ ID No.2序列的第144-204位(第一外显子)、第2093-2238位(第二外显子)、第2313-2659位(第三外显子)、第4910-5022位(第四外显子)、第5092-5138位(第五外显子)、第6715-6865位(第六外显子)、第7015-7078位(第七外显子)、第7255-7413位(第八外显子)、第7527-7648位(第九外显子)、第8570-8644位(第十外显子)、第14371-14424位(第十一外显子)、第14505-14578位(第十二外显子)、第15650-15724位(第十三外显子)、第15885-16104位(第十四外显子)。

本发明以水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141启动子上的序列为基于CRISPR/Cpf1技术的水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141定点敲除方法的OsWD40-141-T1靶序列。

2、Lb-CRISPR/Cpf1载体引物设计及其重组表达载体的构建

2.1Lb-CRISPR/Cpfl技术靶序列的选择

Lb-CRISPR/Cpf1技术靶向水稻OsWD40-141基因的启动子上的正义链，选择如SEQID No.2第12-34位所示的OsWD40-141-T1靶序列。

2.2Lb-CRISPR/Cpf1技术靶序列引物的设计与合成

基于Lb-CRISPR/Cpf1技术设计靶向OsWD40-141基因的靶序列引物，OsWD40-141-T1靶序列引物OsWD40-141-T1F(如SEQ ID No.4所示)和OsWD40-141-T1R(如SEQ ID No.5所示)。

2.3Lb-CRISPR/Cpf1技术重组表达载体的构建

将OsWD40-141-T1靶序列引物OsWD40-141-T1F和OsWD40-141-T1R通过引物退火方法合成双链靶序列，并通过BsaI-HF酶切、连接方法插入到Lb-CRISPR/Cpf1载体的水稻U6启动子下游，获得重组表达载体Lb-OsWD40-141-1；经测序证实，重组表达载体Lb-OsWD40-141-1的水稻U6启动子下游插入如SEQ ID No.2第12-34位所示序列，该质粒含有如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

3、Lb-OsWD40-141-1重组表达载体的活性检测

将步骤2.3中的重组表达载体Lb-OsWD40-141-1通过PEG介导导入水稻原生质体，获得重组表达载体Lb-OsWD40-141-1的瞬时表达结果；经测序验证，获得基于CRISPR/Cpf1技术水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141定点敲除方法的重组表达载体Lb-OsWD40-141-1的活性检测测序峰图(图1)。

4、重组根癌农杆菌的获得

将步骤2.3中重组表达载体Lb-OsWD40-141-1热激转化农杆菌EH105，获得含有重组表达载体Lb-OsWD40-141-1的重组农杆菌，命名为EH105-Lb-OsWD40-141-1。

实施例2、基于Lb-CRISPR/Cpf1技术定点敲除方法在水稻品种的应用

将重组农杆菌EH105-Lb-OsWD40-141-1侵染水稻品种日本晴成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的水稻转化植株分别命名为NIP-Lb-OsWD40-141-1。

具体方法如下：

1、将重组农杆菌EH105-Lb-OsWD40-141-1接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平)中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以5000rpm、4℃离心5min，用AAM液体培养基(乙酰丁香酮浓度为200μM/L，pH 5.2)重悬菌体沉淀浓度至OD600为0.6-0.8，得到重组农杆菌重悬液。

2、将水稻品种日本晴的成熟种子除去颖壳，在75％乙醇中浸泡1min，然后在NaClO溶液中(与水1∶2混合，加1滴吐温20)振荡消毒20min，重复2次。经无菌水冲洗数次至无异味，将消毒后的水稻日本晴种子接种于NBD2培养基上诱导愈伤组织，26℃黑暗培养8-10天，切除根和残留胚乳，继代培养10天，获得成熟胚愈伤组织。

3、将步骤2获得的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1获得的重组农杆菌重悬液中，30min后移出水稻材料，接种于含有两层滤纸的共培养培养基(乙酰丁香酮浓度为100μM/L，pH 5.2)上，26℃黑暗条件下共培养3天。

4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基(潮霉素浓度为50mg/L，pH5.8)中，28℃黑暗条件下筛选培养12天，转移抗性愈伤组织至含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。

5、重复筛选2次后，转移抗性愈伤组织至分化培养基上(24小时光照/天)诱导分化；待新的无根幼苗生成，转移再生幼苗至1/2MS培养基上诱导生根；待小苗茁壮后移入人工气候室进行营养液栽培，栽培成活后得到再生植株。

6、提取再生植株的叶片总DNA，分别以基于重组表达载体Lb-OsWD40-141-1的自身引物(如SEQ ID No.6所示序列)和Lb-OsWD40-141-T1R靶序列引物(如SEQ ID No.5所示序列)进行PCR扩增筛选，若再生植株的基因组中可以扩增出284bp的特异性条带，则表明该再生植株为阳性转化植株。

统计检测的再生植株数、阳性转化植株数及阳性转化植株数占检测的再生植株数的百分比即阳性率(％)，结果如表1所示，阳性率达到100％。

表1.Lb-OsWD40-141-1转化水稻品种的阳性率检测结果

再生植株	再生植株数	阳性转化植株数	阳性率(％)
				NIP-Lb-OsWD40-141-1	23	23	100.0

7、以阳性转化植株的基因组为模板，用水稻富含WD40重复蛋白基因OsWD40-141特异性引物OsWD40-141-F(如SEQ ID No.7所示序列)和OsWD40-141-R(如SEQ ID No.8所示序列)进行PCR扩增，将所获得493bp扩增产物进行测序验证，统计检测的阳性转化植株数、发生突变转化植株数及发生突变转化植株数占检测的阳性转化植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表2所示，显示23株阳性转化植株中共有23株的OsWD40-141基因发生杂合突变，突变效率达到了100％。

表2.Lb-OsWD40-141-1诱导基因OsWD40-141发生突变的检测结果

8、收集突变转化植株的种子，以自主分离的方式筛选纯合突变体cpf1-oswd40-141，筛选后得到3种不同纯合突变类型，分别命名为cpf1-oswd40-141-1、cpf1-oswd40-141-2和cpf1-oswd40-141-3，三种纯合突变体的核苷酸序列如图2所示。与野生型日本晴相比，cpf1-oswd40-141-1突变体中的OsWD40-141基因的启动子靶位点处存在8bp核苷酸序列的缺失，破坏了该基因的正常表达水平；cpf1-oswd40-141-2突变体中的OsWD40-141基因的启动子靶位点处存在14bp核苷酸序列的缺失，破坏了该基因的正常表达水平；cpf1-oswd40-141-3突变体中的OsWD40-141基因的启动子靶位点处存在15bp核苷酸序列的缺失，破坏了该基因的正常表达水平。

对野生型日本晴、3种不同纯合突变型植株对白叶枯病的抗性进行评价，具体步骤如下：采用剪叶法对处于分蘖盛期的日本晴、3种不同纯合突变型植株接种白叶枯病菌IV，日本晴或不同突变类型植株均接种15个独立植株且每株接种3个叶片；待病情发展稳定(一般为接种白叶枯病菌14天)后，测量每个叶片的病斑长度，并以不同突变类型植株接种特定白叶枯病菌后的平均病斑长度与野生型日本晴进行比较，从而完成突变体的抗病评价。

结果如图3所示，与野生型日本晴相比，3种不同纯合突变体cpf1-oswd40-141(即cpf1-oswd40-141-1、cpf1-oswd40-141-2和cpf1-oswd40-141-3)均表现出白叶枯病斑变短的表型，IV病斑长度缩短16.5％～33.9％，这说明利用CRISPR/Cpf1技术创制的突变体cpf1-oswd40-141增强了水稻对白叶枯病菌IV的抗病性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 水稻富含WD40重复蛋白OsWD40-141及其编码基因和应用

<130> GNCFY192312

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 555

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

Met Gly Ala Ile Thr Ser Ala Glu Leu Asn Phe Leu Ile Phe Arg Tyr

1 5 10 15

Leu Gln Glu Ser Gly Phe Ile His Ala Ala Phe Thr Leu Gly Tyr Glu

20 25 30

Ala Gly Ile His Lys Gly Gly Ile Asp Gly Asn Leu Val Pro Pro Gly

35 40 45

Ala Leu Ile Thr Ile Val Gln Lys Gly Leu Gln Tyr Ile Glu Leu Glu

50 55 60

Ala Asn Thr Asp Glu Asn Asp Glu Asp Leu Ala Lys Asp Phe Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Pro Leu Glu Ile Ile Thr Lys Asn Val Glu Glu Leu Gln Gln

85 90 95

Ile Val Lys Lys Arg Lys Arg Glu Lys Thr Gln Ser Asp Arg Asp Lys

100 105 110

Asp Lys Gly Lys Glu Lys Glu Arg Met Glu Glu His Glu Arg Arg Pro

115 120 125

Gly Gly Glu Arg Glu Arg Glu Arg His Asp Gln Glu Lys Glu Leu Glu

130 135 140

Lys Glu Lys Asp Arg Ala Glu Arg Asp Arg Asp Gln Asp Lys Glu Lys

145 150 155 160

Glu Lys Leu His Thr Glu Arg Ile Asp Lys Val Lys Ala Glu Glu Asp

165 170 175

Ser Leu Ala Gly Gly Gly Pro Thr Pro Met Asp Val Ser Thr Thr Ala

180 185 190

His Glu Ile Ser Ser Ala Asp Val Thr Val Leu Glu Gly His Ser Ser

195 200 205

Glu Val Phe Ala Cys Ala Trp Ser Pro Ala Gly Ser Leu Leu Ala Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Asp Ser Thr Ala Arg Ile Trp Thr Ile Pro Asp Gly Pro

225 230 235 240

Cys Gly Ser Ile Thr Gln Ser Ser Pro Pro Gly Val His Val Leu Lys

245 250 255

His Phe Lys Gly Arg Thr Asn Glu Lys Ser Lys Asp Val Thr Thr Leu

260 265 270

Asp Trp Asn Gly Glu Gly Thr Leu Leu Ala Thr Gly Ser Tyr Asp Gly

275 280 285

Gln Ala Arg Ile Trp Asn Ser Asp Gly Glu Leu Lys Gln Thr Leu Phe

290 295 300

Lys His Lys Gly Pro Ile Phe Ser Leu Lys Trp Asn Lys Lys Gly Asp

305 310 315 320

Phe Leu Leu Ser Gly Ser Val Asp Lys Thr Ala Ile Val Trp Asp Thr

325 330 335

Lys Thr Trp Glu Cys Lys Gln Gln Phe Glu Phe His Ser Ala Pro Thr

340 345 350

Leu Asp Val Asp Trp Arg Asn Asn Asn Ser Phe Ala Thr Cys Ser Thr

355 360 365

Asp Asn Met Ile Tyr Val Cys Lys Ile Gly Asp Gln Arg Pro Val Lys

370 375 380

Ser Phe Ser Gly His Gln Ser Glu Val Asn Ala Ile Lys Trp Asp Pro

385 390 395 400

Thr Gly Ser Leu Leu Ala Ser Cys Ser Asp Asp Trp Thr Ala Lys Ile

405 410 415

Trp Ser Met Lys Gln Asp Lys Cys Val Tyr Asp Phe Lys Glu His Thr

420 425 430

Lys Glu Ile Tyr Thr Ile Arg Trp Ser Pro Thr Gly Pro Gly Thr Asn

435 440 445

Asn Pro Asn Gln Gln Leu Leu Leu Ala Ser Ala Ser Phe Asp Ser Thr

450 455 460

Ile Lys Leu Trp Glu Val Glu Gln Gly Arg Leu Leu Tyr Ser Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Arg Gln Pro Val Tyr Ser Val Ala Phe Ser Pro Gly Gly Glu

485 490 495

Tyr Leu Ala Ser Gly Ser Leu Asp Gln Cys Leu His Ile Trp Ser Val

500 505 510

Lys Glu Gly Arg Ile Leu Lys Thr Tyr Arg Gly Ser Gly Gly Ile Phe

515 520 525

Glu Val Cys Trp Asn Lys Glu Gly Ser Lys Ile Ala Ala Cys Phe Ser

530 535 540

Asn Asn Thr Val Cys Leu Met Asp Phe Arg Met

545 550 555

<210> 2

<211> 16427

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcaattttt cctataccca caccatccat cccttcgccg gtttcgtccc cttggccact 60

ctcccctctc ccctctcccc tctcccctct cctccggagc cttcccgtct cggcggcggc 120

cacgcgttcg tcgaccggcg cctatggggg caatcacctc ggccgagctc aacttcctca 180

tcttccggta tctccaggag tccggttcgt ccactctcga attcttctcc ctagttcttt 240

tgtttgtggt tacgttgcga ggattttcgt gtggattgga gatttacctc tgctgctcta 300

gtggttcggt tctgttgtgg tgatgtgcgg cgctggggaa actaggttct tttgtttgtg 360

tttagattga gaggattttc gtgtggattg gagatttact gctgctgtat gtttagtagc 420

tctagtgtgg ttcggttcta ttgtggtgga gatgtggggc gttggggata ttaggttctt 480

ttgtttgtgt ttatttacgt tgagaggatt ttcgtgtggg ttggagattt accgctgctg 540

gatgtttagt agctctagtg tggttcggtg ctattgtggt ggagatgtgc ggccctgggg 600

aaaatagggt ctgctagggc acaatcttgg gatctgatgt gtccagggaa acatagggct 660

gttttggttt tagtgccaaa tcttgcacta ccaacaggta gtctaaatag tacttgtgtg 720

atgtttggat tgattccata acttgccaaa tcaatagaaa tctctcccta gaaatctcta 780

acaaaatgtt gatagtaata aaacttgccc aagatttggc actaccactg gtagggtagc 840

aatccaaaca tgcccatata tataataggg ttcgatgttg tctgtttctt ttactaactt 900

ccgtttcatt ccttttagtt ggacccgagg attttaataa ccgttggtgc atgggaagtt 960

gttgtttttg ttggttttgg ggttgaaatt gtagtggtaa ctggtaattt gcgggagaga 1020

attgcgtttg gtgcctgttc actgatcact gtagcactgc tggcttccat atttctaact 1080

gtcctcaatt gcagagagta aaatatggct cagaactcag agttcagaac caagctatag 1140

ggagttcgtg ctactatggt gcctttttgt tctagaagtg cctaacgagt caagaagaat 1200

attatgccat attctctcat ttatctgtta cccacagttg atatatatgg ttccacgggc 1260

atgaatacga tacatagact ccaagagagg gattgccatt tttgcaaaca agacaacatg 1320

acgatatgtc tctctatgca cattatttcc catttcagta tttgtctttt tcaacaattc 1380

aacataggaa gccttgatga tagtatgtgc tccttcttgg aatacttgta ttattcgttt 1440

ctattttcta aaatatgaaa gtggaagtaa gaagaacaaa tccaaaactc atccagtttt 1500

gctccatgta acctaactta gagaagaact taataattca gaaggaactg atgaaaggaa 1560

ctaataagaa cccaccagtg agcttgacat ggcttaactg agcttgacat gggggcatgt 1620

ccagagaggt gcatggtctg gatgacgagg agaaaaccta tggagggagg ctggtctagc 1680

actctagcga taagcttata tcattctttt gttgacgtgg cagggttgtg ttgtggatgt 1740

gataaatttt tgcatgcgtc caatgaagtt ccaaagctgt atcaaagaat aatatcattt 1800

actttagttg tctgtttcta gtgataggct tttcactttt tgttgaagtg gcagggttgt 1860

gttgcatgtg cgataaattt ttgcatgctt gtcaatgaag ttccaaagct gtatcggaaa 1920

aaaaaaacat catctatttt agctgacttt ttcctgatac ataactgaca tgtgatctgt 1980

gtcagtgtcc aatgatgtag ctgcaactac tttatgctgc acccgactta tatatatatt 2040

tggttatata tgactatgac agttattgct gatggtttct caacctttcc aggtttcatt 2100

catgccgcat tcacattagg gtatgaagca gggatccata agggtgggat tgatggaaat 2160

ctagttccac ctggtgctct tatcactatc gtgcagaaag gcctccaata catagaacta 2220

gaagcaaata cggatgaagt aagtttgttt gtcttctagt gttcattacc ttttctgatg 2280

catgctacat catgctcttt atcttgttgc agaatgatga agatcttgcg aaggattttg 2340

cccttcttga acctcttgaa ataatcacaa aaaatgttga agagttgcaa cagattgtta 2400

agaaaaggaa aagggagaag actcaaagtg accgtgacaa ggacaaggga aaagaaaagg 2460

aacgtatgga ggagcatgaa cgacgccctg ggggtgaacg ggagagggag cgccatgacc 2520

aagaaaaaga gttagagaag gagaaagaca gagctgaaag agacagggat caagataaag 2580

agaaagaaaa gctgcacaca gagcgtattg ataaggttaa ggctgaagaa gattctcttg 2640

ctggtggagg taattaacta atatctgttt gctgcatttc ccttacgatt ccatcttaca 2700

gttttcagca tactgtgagt aaactttagt agctacagtc tacagatgat tgaatcttga 2760

taactttatt tgttaacttg agaaatgttt ttgtgacagt tgtttgatat gtgcgtgtct 2820

tttctttgcg ataaatatgt taattactga ttattttaca atgttgacaa gttttcattt 2880

gttgcggatc agcagagcat ttgcaagata atgcttgaaa atgtccttat gtaattatgt 2940

ccatcggttt tctgtatgtt ttactataaa tattacagtc aaagcaacat gcaaattaat 3000

atgatgattt gacgaattat gcaagagtta ccacatttat ctttcacttg gttcgcgaaa 3060

gttttgggta acatgccaca ttagctctcc agttcattta tgaagacata cttaccaaac 3120

tggttacctt tttttttggt aatgtcaagt tttttgactt ggttttcttt gtgtaatagc 3180

caatattagc ccgaaaccaa acaggaccat caaagaatta tcttattgca tctaaaagcg 3240

tgagattgct caatttaata taacacttgt gcttgcaaag aatgcagaca ccagaatgac 3300

aattgaacat gcatttggtg tattttggaa gtcggagaat gacaattgcg acttgagaaa 3360

tgtggacaaa gtactaagta tcattttcag cttataaatt ttcttagtta aaatccaata 3420

tattgtcaca gtagggattt gattgtatgg aagcaattca ataagctttc caattccagg 3480

atatgccact ccgcagaatt gaatcggttt ttttgctcgt catcagatgt gattagtatg 3540

agctcccact tttgaccaac tagtttcatg cccgtatgtt gtaacgggtc aggcccccat 3600

ataattaggg ataaactggg agcccgtatg ttaatgggcc aagcccatat aattaggaag 3660

tgatggtggt tatttttcgc atacggacat gccgcatgcg ttggatgagg ggatggaagg 3720

agatggaagg agaactactc gacttttaag atagtagaga tcacatttct tgtacccttt 3780

tgctcttctt ccttccctca tatttctcca cctccggtct ctttgtgcct ggcgatggct 3840

agtggtgtgg agctttgagt ggaggagggg atggatccct tgggaggcga ggcgggcaag 3900

caagagcgca tggagccaga gcagcactgg cacacggaag tggatgcaat accgccctgc 3960

aggggagaca aggtcagtga ggggaggcaa cacgcagtgc agaggagttg gagaacacag 4020

tacacggctg cggcatggct attcctgtca gtgctttcac acagcaatgc ccaggcactt 4080

gtgtccttgc tctgctgttt taacgtggcg gttgaggata gacctccaca acagatccac 4140

cctggtggag tttatcctgg tgtagtgctg gaggagagga gagacatcac ttagctcccc 4200

ttgccaactg acttttcctt ctcaccatcc agccatccat gctcctgttc agtcatgcat 4260

cgtgctggag aaaccattgg gctaccatgg gcaaaactgg aaaagaaagt agggtctagg 4320

tcatgtaatc actgaaatag aaatcgaaaa aaccaaaata attttaacat ggcaattcct 4380

aaagcatttt tatctaacag gtggcaaata atcaattagc ttctctggag tgacatatcc 4440

tagagcccgt gacttatggg tggtgtatga tcaattatcc ctgccaaaaa ctccataata 4500

tccttgtggt acgtgtcata tgttctagta acacgaacat acatttctat tacatttgtg 4560

agtgtgtatt actattgtgt ttcctgatgg caataaatcg ctaaaactgt gttcttaggt 4620

gcattaatgc ttgataataa ccatgatttt aacctcctgt atgaaccaat atattgtttg 4680

atttctgata tttgatttac ataagtgaaa tgacatgaat ggtcatggaa ctgatttagg 4740

atattgtgct ttaatttcct tatgtagaat tagtgtgctt cttggagtag caacctcctt 4800

gtggaattag ttgtcacttg tatggagcct tcataatatt ttttggatat ttttgtgtct 4860

atcagtttaa cgctaccatg ccagggtgta ctaaatctta ttgctacagg tcccacacca 4920

atggatgtaa gcacaactgc tcatgaaatt tctagtgctg atgtgactgt tttggaagga 4980

cacagctcag aggtttaaat agccttctgc catacagcta tttgacctat catggattag 5040

tactagaaag catgttctct tactgcttct ttcaaatttc tttgtattta ggtgttcgct 5100

tgtgcatgga gtccagctgg ttcccttcta gcgtctgggt gagtccttat tatctctgca 5160

tcgatgtttg tgttcttcca ttgatattgt ttgtgctcct gtagccttat gatctcattt 5220

tgtatttgac atagacatca aactgctagt ctgtgtatat gtgaacgatt gtcaggtgtg 5280

ttgcaccata ttttaatact ttttgagata tgcctagagg gctggaactt agacttgtta 5340

agataaaatt tttggatttt tctctcttat tattcacact agtaaattgt ccacttatag 5400

caacggaaat ataattttta caattttaca tcatgtcaat tttgaagctt ttaaaattaa 5460

ttttctatta tacattattc gatcatactt gagccatttt gaccatagtt tttagcaaca 5520

gtcattaggg tcatttgacc caggttctag cactgtaggt ctgccccccg cgcacagatg 5580

cttgatttgg aaagaacata ataggaaata atctaacact ggaattaatt tgacaacata 5640

atgtgagttt tctactatta gtgtaatatt gttctaaata acatttacac acttgttggg 5700

tgaaaattct aggcacaatg tgagaatatt taactcaact aactcttagt tggattggag 5760

caacaacaac aggcagcgct atagctatca gcaactggac agtatgtgca gtcatcattg 5820

aacccaccaa atcaagtagc ctcaccataa cagataaaca atacaatact agcagggagg 5880

attgagcaat cgtgctagag ggagatcgag gggtacaccg ggaatgtatt tcatgagcac 5940

accaccagat cagaggggag caaacagatg gacccaacta ccacaatccc tctatagagc 6000

acctctcctg taggacgtgg caaaaatact gccgcactct ttaagggcat agctgtgcca 6060

caatttggtc ctcgtcactg accagaggat gtctttggcc tgcaaggatg atgagggatg 6120

atgatggaag aaatgcaatt aggagagtct gagagtgaca catgcttgca gtttgcagtt 6180

tggggaggga gaggttggcg aggcagcccc atagggccat aattcgccat gatggtgtgt 6240

gcgggcaagg acatggggtg cacagcgcaa ttccttggga ggggaagtcc atgcagcccg 6300

cttggttttc tttcggtatc cggttttctc aaggggtggg atggttttca ggcagtgtcc 6360

accaggtttt tcttgtggta ttcgtttttt aggtggggtg gttttcatgc tggattttct 6420

tggaagccca atgtttccaa gagggtgcag tttccatgca tgtctgggtg gtgcgctgtg 6480

cgccgcgtgg gacaaacaaa caggacaaac tacgctttta tagtactaga gatagagata 6540

tgtcagcctg tcaaaacttt catgctcata ttttactctt tatacagtta ttcctattgc 6600

atcccttcta taaattgttg caaattatat ttatatacgt gcttaacacc aatgctttct 6660

gtccttatct atcctctttg atgactcaca ttactatttt gtacatgctg ctaggtcagg 6720

agactcgaca gctagaatct ggacaattcc agatggacca tgtggttcca tcacacaatc 6780

atctcctcca ggtgttcatg ttttgaaaca ttttaagggt cgaactaatg agaagagcaa 6840

ggatgtcacc acacttgact ggaatgtgag ttttataata ggcttgctat tgacggtcgt 6900

ctgtaccagc ccacttgttt attttacatt tcgcaaaata cttgtttttg catctatgtt 6960

cttccacttt gacatgttca tctttggatt tgttttgcct gttgtctctt ctagggggaa 7020

ggaactctat tggctactgg ttcctatgat gggcaggcaa gaatatggaa tagcgatggt 7080

aaggaaatta ctatcttgct atgcattttt tttgtggctt tgtatattag ttcatagttt 7140

tgcatggtaa ctgtattaga tttgcaaatt gggaggtact gcatagctta gaacgactta 7200

ttatgcattt aaacttttcc caaaaatcag ccctgatgat attgaattta tcaggagagt 7260

tgaagcagac tttgttcaaa cacaagggac ctatattttc cttgaaatgg aataagaaag 7320

gagatttcct cctaagtgga agtgttgata aaactgctat tgtgtgggat acaaagacat 7380

gggagtgtaa gcagcaattt gaatttcatt caggtatgct tgcatgccac aacagtgctg 7440

atttttacat tataattatc tttattgcat tggatgcatt tctatccagc acaataaact 7500

gtaaactgcc tctatttttc atacagctcc aacactggat gttgactgga gaaacaataa 7560

ttcttttgca acatgctcaa ctgataatat gatctatgtt tgcaagattg gggatcagcg 7620

cccagttaaa tccttcagtg gtcatcaggt tggtgttctc caagcagtac atgttttcga 7680

tatgtgctgt ccttcaaaat gcattgaatt ccctttattt tggagtttag aggtgatttc 7740

tggaatcaga agcaagttaa agatggggat atggggagaa gtggagttaa cacttgacag 7800

aaataaaaga ttctagattt taaaaataca aaacaaatcc tcttgcatag aagttctaag 7860

tataatacac atcagatcaa ccagccatta gtagagagaa ggtagtaaac tgtacttttc 7920

atggctgaga tctttagctc tagttggagc tgggcccaat tagcccaaca actcaaattt 7980

attatagagt tagcaaacaa gaagttcctt gcattcagtc tatctagttc cttctattta 8040

ttctatttga ttcagttgac tgtcttccat tatccagtca tacgttggtt ggctgcaaaa 8100

ttgttgatgc tgcaggatgt attgaatgaa tgtgaacact gttcagttga atgctgtgat 8160

attatttgtg ttcaaacatt gagtcatgct ttctgtttgc ccatgcaaat atcatgtgtt 8220

tcaatgtaac atccaaacat catggagatt ctgcgggcag tgtcaacaga agctaggctt 8280

tggtgcccgg ctggagctct tgtgctccaa gttttccttt gtaggtcaat aactcaaggg 8340

cactaggctg tcgtagggtg gtttttggtc atgggttgcc ttgtgtgatg ctatttgtgg 8400

atgtgttttg ggcgaagggc tcgtgagccc ttggttgtat gtgtgatttt tttttcctta 8460

atgaaatgaa gcacagctct cctgcatttt ctaaaaagaa tgtaagcgaa attggaaaag 8520

gtggcaacca atgtgatctt ctgattgtga caattaagct tgtttccaga gtgaagttaa 8580

tgctatcaag tgggatccaa ctggttctct gctggcttca tgttcagatg attggactgc 8640

taaggtaatt aatatacaac aatagtttca tctttgtcat tcaatcttcc atttataaat 8700

atacgaaggt cccccatact ttagggggtc tgatgcccag tttcatactt gtttattaga 8760

caaaccccca ctttcgaggg ctaaatagac tttcttcgtt gtaatatatt gacatctgtg 8820

tacttttgta ctgtatatag tcttacattt tgtacctgct cgatatgcaa ttgagttgat 8880

ataatatctt gagatgtttt tcttagtaaa tttactacct ccatcccaaa atataccttg 8940

gactggatga gacataacct agacgtctgg acagccctgt ccagattcgt tgtactaggt 9000

tgtcttatac agtccaaggt tgcaatattt tggaacggag ggagtagttt ctttgtccta 9060

gtacagtgtt atgattctgt agactgtatc agtcatgact ttttacacta accccatccc 9120

atcagtagta cagtcatatt ttattttgag tcttggtggc gtaagtaagt ctagttgccc 9180

caaatgcata catgaaaaac cttgttacca cagtttggaa ataaacctct gactgcaaaa 9240

ttatcgattt tacccttaaa tgtcaatcac agttagatat gtgttatttt tcattttcgt 9300

gatcacatca attgtttgtc tgcataagcc agaacatcac ataagcgatg tggcaaccaa 9360

tcaagggtag agttttgctt gtggaatgga agtgactttg tttcgagttg gttgctaaaa 9420

cactttgctc tataccttgc atggtactac gcttttctgt aagtaagttt tttttttcct 9480

aaatacacat gagatctgca tatcgtttca tcaagagacg gaagaagcaa aaacacccct 9540

caccaaaaca agtcttacat ttacaagaaa acccgactca aaaagacctt acctaagcga 9600

ggttaccgac ctactaagga attcgctgag cttagaagct gcagccatgc accaaagacc 9660

acattcatta accacaattt ggatgacagt caatacacta ggattgacgc cattaaatat 9720

gtggtcattc ctatacttct aaatctccca tgccgcaagc atgataagcg agttgagccc 9780

tttcttggaa tccttatcga cgcctcttac agccttggac caccacctgg agaaatgctt 9840

ggtgtcctga tttggagaga tggatatcag ccctaacctt tgagaataag agaccatata 9900

cttgttggga aaagacacaa gtaactagga ggtgatgtat cccccagcct ggtcaaaaag 9960

cggacaagcg atgagatgtg gcggccctcg cttggcaagg cgatcagtga tccaaatgct 10020

gttattaatt atggccacac acaaagaact tgcaccttag ggatgcccag ctcttccaag 10080

tttctttcca aggggcgaat ccgattgtgc caacaaaaaa tgactcgtag actgatttgg 10140

aggtatgcga ctcagacttt gggagcttcc aacggtgctg atctggtaca ccgttctgaa 10200

gggccacact ggccactaag tcccaaattc gcacatactc tataataact tggacagtga 10260

gtgctccttt gatatcagca acccatcttt ggttttctaa ggcttgtgtc atagtgcgac 10320

gttcgataat ccttttaggc atcaacttga tcagattaag agcttatctc caccacggtt 10380

ttgttttgca accatccacc tgaccaaaac aaaatacact acccatttct aactatggat 10440

ccaacggcca tattaaaaag agtatgagca ttatgtggaa cttgtagagg taacccttcc 10500

caagcatggg cattgccagt tttttccaac caaagccatc aaatgcgcat agctcaactc 10560

ttatattcca aattgtggat tctcaaacca ccgtacataa gggaccaaca aacctgctcc 10620

caagcaacca aacaatttgc caccgttagc cttttcatga cctgcccaaa gaaagcctct 10680

tcgtatcttg tcaatagcct tgattactgt tagggttgga attgtgttcc accgaagggg 10740

gaaggatgcg gaacgacggg gaacacaagc gcgcgaaggc gatgggaacg caaagccagt 10800

gggcgcgagt tgcgcgtgcc agattgctac aggactttag cttcatctca attagttagg 10860

attcactctc aagttattta gcaaatatta tccattttct tcagctaaat tagttacaaa 10920

tgtttgttct tgtaagggca gactcaagga ataaagcaag ccgaattaat ctcatctact 10980

attttccatt tcctcgtctc cttccgattg cattcatcag cgccctgggt cgccgatcta 11040

ccaagctccc taagcgtcgg ctgcctacat ctcattcata tcctattcga tcattgccag 11100

gagctcgtga caactttgta tcagaccatg gaagaaacct ccactgccaa acaaccgctt 11160

ctggaaccct ggtcccctcg acaagctgca ggacaatggt ggatgtcctc gccagcattt 11220

cgctgctcgc gtccaagatt gatatggttg atctcagtcg atcggtcgcc gttgcgactt 11280

ctcgcatcac tgcacttgag cagttccagg ttgcgtcgtc tacatctacg tccaacaacg 11340

cgccctggct tcccacccgt caacccacac ccgcaaccat tgagctctgg cgcactgcag 11400

gactccaaca cggtgatgcc gggggcaacg ttcctcgttt ctataaactt gaatttccca 11460

aatttgatgg caaggacgac tccctgaaga ccattgcgag cagttcttcc agggccaaaa 11520

gaccgacaac agtgaccgtg tctggctggc aacttaccat ctcatcggtg aggcgcaaga 11580

ctggtacttc cactacgagc agcagtaggg accgccggat cgggacacgt tcaaggagct 11640

ctgtcatggt caattcggtc ctcccatacg caataatcct ctcggtgaga tcaggcgttt 11700

gttgcaaacc tccacggtgg cggtgtacca atccaaattt ctcacgcttg ccagccgcat 11760

cactgaacca cttaccgata gctagcaggt taagttctcc acggccgggc tccacgacga 11820

cctcgccgtc gacgacgagc tcaaaaagcc cgatcttcag gaggccatga gtcttgctcg 11880

tgcatgagtg caaggtggtc aagcacgatg ggcaggcaca aggtcctcag ctcagcccta 11940

cttctgcgac gtggcgctag cagcgtcacc tgtgcccgca ccagcaacca gggctcagcc 12000

agccgaaacc ctagccgatg cgcgccgcaa caacaatttc gtcgcctttc tccggcagag 12060

ttggtggaac gttgtctcca agggctctat taccattgcg acgagaagtt tgtatgcgga 12120

cacaagtgtg cacggttgtt ctacattgag tatgatgact ccacggatga tgacggagcc 12180

aacgacgatg cggtgccaca agtgaacacg ctatcaggca ttgacggagc tagcaccatg 12240

aggcttccgg ttacaatagc cgacatacgt gttgtgggct tgtggcactc gtcgactccg 12300

gctcgacgca caggtggtgc atcacctcct ccatcttgag ccggtgtgct agggacttcg 12360

ctttgtcatg gccaatggtg atcgccttgt cagcccgggc ctgtgtcgca acctcgcgct 12420

caacatcgat ggcgaggcct tctcggtcga ctgcttcgcc cttgacttgt gtgctgtcga 12480

catcatccta ggcatgcaat ggttgcaaac gttggggcca atactgtggg atttcaagaa 12540

catgcgcatg gccatatggc gcagcacacg cgaggtcatg ttctacagcc tcgctgatca 12600

gggcccgatg tgatgagtgg cgatcgacat cgacgatatt ttgcagcatc tcctggcgga 12660

attagaggac ctcttcgccg aaccccaagg cttgctgtcg gcacgggcta tcgactaccg 12720

catccacctc aagcctgggg ccacatcagt cgccgttcgt ccctaccgct accgctatcc 12780

ctcaaggcat accatggtac ataatatggc tcatggttgt gttcttccta ttccggccaa 12840

ggcaatatag ggtcgtttgg cttgcggtgt tcctgaaacc cttgttcagt gggaaggtaa 12900

ggcaccggca gatgcaactt gggaaattga atcggatttt cgtcaccgtt tccctgcatt 12960

ctggctcgag gatgagctgt ttctgaagga tgggagagat gttagggtcg gaattgtgtt 13020

ccaccgaagg ggcaaacgcg caaaagcgat gggagcgtga agccggcagg catgagttga 13080

gctacgcatc ccggattgct gcaggtcttc ggcttcatct caattagtta ggatttactc 13140

tcaagtttgt tagcaaatat tatccctttt cttcagctaa attagttaca attgtaagct 13200

cttataaggg catagattca aggaataaag caagctgaat taatctatca atctcatcta 13260

ctattctttg gtttctcatc tccttccggt tgcatttgtc agcgccacgg gtcgcgatct 13320

accaagctcc ctaagccctg gccgcctaca tctcattcat atcctattct ataattgcct 13380

ggagcttgtg acaaactacc cattttggtg tatcaattgc aatcataaga tgaattggga 13440

tgggcagcaa aaccactctt actatgatga gatgctcagc gtgattcatt agagaagctt 13500

tccaacctgt gagattgtca gccaccttat ccactagagc tcacaactta gtttttagta 13560

ggctttcgaa tattgagcgg gagaccaaga gaggtacaag gaaaatcctc actcacatga 13620

aagcatacta gagatgaact ccaaatcatc ctcttggcac tgaataggtg tcactgagct 13680

cttttccaag ttggtcacaa gcctagatgc atgaccaaag accttcaaca attgcttgat 13740

aatagagata acattcaccg gcattaggaa cataaccgca tcatcctcat agaaggagca 13800

aaaatgttgg gcagcgacgc acaattcacc aataaatcta gaacgtccat gaccaatatg 13860

tataacatgg gggagagggg gtcaccttgt cggagaccat atgacgatga aagattacct 13920

ccctggcttc accattaacc agtattcgag tagaagtaga gaggaccaaa cacaaaaggt 13980

tacaacaaca atgacgaaaa cccagctgct gcatgacctc cacatgaaaa gaccaagaaa 14040

ctgaatcaaa agcctttgag atatccaatt tgagtaggac atggggttct ttcctcccac 14100

tgagacattt ggcaatctgt tggacaagga aataatatca tggatgcttc ttccttggag 14160

atgatttttt gataaaacaa caaaaaccag taatgtggag ttgataatgt gtcaaaaaca 14220

atttgatgaa accgatagtt gagggggcca atgaacttac tcctttaaac aacgctatgg 14280

gtttgcagtt acaatccttg ggaagtgctg gtgctatatc gtccattgtg aagccttttc 14340

ccacttttgt tgccttcttt ttttttgcag atatggagta tgaagcagga taaatgtgtt 14400

tatgatttta aggagcatac taaggtttga gaaatctacc ctcatttttt atgatcccta 14460

gaacctgttc tactgtctat catatgctta attatatttt gcaggaaata tacactatta 14520

gatggagccc aacaggacca ggaacaaata atcccaatca acagttgctt ttggcaaggt 14580

aaataatttg tgcaaataat taaataccta gaagctatat ttttaattat aattaaatac 14640

tagaagctat acctagattc atattgggta tctgatggtt gataattgat agctcaccct 14700

ctagctttta tgtcctttga aatttgtcaa atgaagtaaa gtgcatattg ttttatgttt 14760

ttagcaagag cagtacaaat tttatcattt tagttcccac tgtcctacat gtaaaatgga 14820

gtaaattaca ttaaattaca cttgtactgc aaaaactata tattcaagaa aatatagttg 14880

ttctgactta tgtatggctt tctgaaattc gaatagttgt caaaaagaag acacaagcct 14940

acctgcaaca aattcttagt aggatcataa tcgcctttgt aacatgtcta aatatggaag 15000

atgttgttga tgactaatca gactcacaag tttgtttatc tcggatatca tgatttatga 15060

gtgacttctg tgtatttatg gttctgtgaa tttatggttc tgtgaattca ttcttctaag 15120

atagttttag tcgattctca atgttgggtt cactgcaacc tactattgtg cttcctgtgc 15180

atggtatact tggcatcctc ccttttttgt ttaaaatatc tcatgaacat agctcatttt 15240

tttaatgtgg atatgctgga acccagggat ctctgttgca catcaatgta ttagtaagtc 15300

ggcatctaat tttgaaaggt tctaaagcag taaccattgt ttgtgctgcc accaacctta 15360

tatcgcttac atggcccaac cagccgcttg tgctacctac ctaagcagta catggttgga 15420

cgctgattcc ccttgtttgt gacctagtag atcaccaaat ttcagccaat ttgccatttt 15480

cattattttc tgacaccatt gctggttcct catatacata gttattggag atgtaagtag 15540

ggttgcttag ttacctggag tatgattctt gcttcttagg aattctggta gcttcacctt 15600

ttccagcgga tgtttttggc aacgattgac tattttgttt catgtgcagt gcctcttttg 15660

attcgactat caagctatgg gaagttgagc aaggacgcct tctgtacagc ttggctggcc 15720

acaggtattt gataccagga gaaaaaaaat acaccttttc aaaatacaag gcatattttg 15780

agtattaaat caagggaaag atgggttgac ttataaaaga aacggatgga gttctttctt 15840

ttggttgctt gcaatggctg aactcaactt attcgtgatt gcaggcaacc tgtgtattcg 15900

gtcgcattta gccctggtgg tgagtactta gcaagtggtt cccttgatca atgcctacac 15960

atatggtccg ttaaagaagg gaggatcttg aagacataca gagggagtgg tggcattttt 16020

gaagtgtgct ggaataaaga aggcagcaag attgcagcat gtttctcgaa caacacagtc 16080

tgtctcatgg atttcaggat gtagtttaaa ccagtggatg gatgaagtaa tacaagcaga 16140

tgcttggcta tctgttcttc cgtgatcagc tggggagaac aggattattg ccttaactct 16200

aggttttagg tacctttagt ttgccagtgc ttgtacagtt atttccttgc ggagaaactg 16260

accataggat atagttatgt gtagagcgaa atctttccaa catcatgtct tcgcaatgct 16320

catcgtattt agtactatat tagtaacaat tgtttattcg agattatctt tgtcattacc 16380

ataacaaatg cttaattgct atggtaccat ttgactgagt tgctatg 16427

<210> 3

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggggcaa tcacctcggc cgagctcaac ttcctcatct tccggtatct ccaggagtcc 60

ggtttcattc atgccgcatt cacattaggg tatgaagcag ggatccataa gggtgggatt 120

gatggaaatc tagttccacc tggtgctctt atcactatcg tgcagaaagg cctccaatac 180

atagaactag aagcaaatac ggatgaaaat gatgaagatc ttgcgaagga ttttgccctt 240

cttgaacctc ttgaaataat cacaaaaaat gttgaagagt tgcaacagat tgttaagaaa 300

aggaaaaggg agaagactca aagtgaccgt gacaaggaca agggaaaaga aaaggaacgt 360

atggaggagc atgaacgacg ccctgggggt gaacgggaga gggagcgcca tgaccaagaa 420

aaagagttag agaaggagaa agacagagct gaaagagaca gggatcaaga taaagagaaa 480

gaaaagctgc acacagagcg tattgataag gttaaggctg aagaagattc tcttgctggt 540

ggaggtccca caccaatgga tgtaagcaca actgctcatg aaatttctag tgctgatgtg 600

actgttttgg aaggacacag ctcagaggtg ttcgcttgtg catggagtcc agctggttcc 660

cttctagcgt ctgggtcagg agactcgaca gctagaatct ggacaattcc agatggacca 720

tgtggttcca tcacacaatc atctcctcca ggtgttcatg ttttgaaaca ttttaagggt 780

cgaactaatg agaagagcaa ggatgtcacc acacttgact ggaatgggga aggaactcta 840

ttggctactg gttcctatga tgggcaggca agaatatgga atagcgatgg agagttgaag 900

cagactttgt tcaaacacaa gggacctata ttttccttga aatggaataa gaaaggagat 960

ttcctcctaa gtggaagtgt tgataaaact gctattgtgt gggatacaaa gacatgggag 1020

tgtaagcagc aatttgaatt tcattcagct ccaacactgg atgttgactg gagaaacaat 1080

aattcttttg caacatgctc aactgataat atgatctatg tttgcaagat tggggatcag 1140

cgcccagtta aatccttcag tggtcatcag agtgaagtta atgctatcaa gtgggatcca 1200

actggttctc tgctggcttc atgttcagat gattggactg ctaagatatg gagtatgaag 1260

caggataaat gtgtttatga ttttaaggag catactaagg aaatatacac tattagatgg 1320

agcccaacag gaccaggaac aaataatccc aatcaacagt tgcttttggc aagtgcctct 1380

tttgattcga ctatcaagct atgggaagtt gagcaaggac gccttctgta cagcttggct 1440

ggccacaggc aacctgtgta ttcggtcgca tttagccctg gtggtgagta cttagcaagt 1500

ggttcccttg atcaatgcct acacatatgg tccgttaaag aagggaggat cttgaagaca 1560

tacagaggga gtggtggcat ttttgaagtg tgctggaata aagaaggcag caagattgca 1620

gcatgtttct cgaacaacac agtctgtctc atggatttca ggatgtag 1668

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agatctatac ccacaccatc catccct 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaagggat ggatggtgtg ggtatag 27

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcatgaac caacggcctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgccttgtg tgacgaacag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acacgaaaat cctcgcaacg 20

Claims

1.一种蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的应用；

所述蛋白质为如下A1）或A2）：

A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

A2）在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

所述相关生物材料为如下任一所示：

C11）破坏所述蛋白质的基因的表达和/或降低所述蛋白质的含量的核酸分子；

C12）含有C11）所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C11）所述基因为如下任一所示：

B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

B2）编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。

3.权利要求1中所述相关生物材料在如下任一中的应用：

D1）在培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻中的应用；

D2）在制备培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻产品中的应用。

4.一种培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的方法，其特征在于：所述方法包括破坏目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达和/或降低权利要求1中所述蛋白质的含量，得到基因突变水稻；所述基因突变水稻比所述目的水稻的白叶枯病抗性增强。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述破坏目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达和/或降低权利要求1中所述蛋白质的含量的方法为通过对所述目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的基因或其启动子进行敲除或抑制来实现的。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述破坏目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达和/或降低权利要求1中所述蛋白质的含量的方法为利用CRISPR/Cpf1技术对所述目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的基因的启动子进行敲除来实现的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1技术中的靶序列为SEQID NO.2第12-34位。