CN118048386A

CN118048386A - OsMAK7基因及其编码蛋白在提高水稻耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN118048386A
Application number: CN202410241804.4A
Authority: CN
Inventors: 路凯; 张亚东; 陈涛; 朱镇; 赵庆勇; 梁文化; 赫磊; 李程; 王才林
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2024-03-04
Filing date: 2024-03-04
Publication date: 2024-05-17

Abstract

本发明公开了OsMAK7基因及其编码蛋白在提高水稻耐盐性中的应用。解决的技术问题是如何提高水稻的耐盐性。具体公开了蛋白质、上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种；A1)提高禾本科植物耐盐性中的应用；A2)制备提高禾本科植物耐盐性产品中的应用；B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。提高禾本科植物中OsMAK7基因的表达量可提高其耐盐性，可用农业生产。

Description

OsMAK7基因及其编码蛋白在提高水稻耐盐性中的应用

技术领域

本发明具体涉及遗传工程领域中OsMAK7基因及其编码蛋白在提高水稻耐盐性中的应用。

背景技术

水稻是人类重要的粮食作物，全球一半以上的人以稻米作为主食。水稻的生长发育过程受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响，其中盐胁迫是影响水稻产量的主要因素之一。盐碱地作为一种后备资源对于保障国家耕地和粮食安全具有重要作用。盐碱地土壤含盐量较高，一般都在10％以上，高浓度的盐分对水稻幼苗生长及开花、抽穗以及穗粒结构都产生严重影响。通过灌水压盐等栽培技术手段可以使在盐碱地上种植水稻成为可能。通过杂交以及基因工程技术改良水稻耐盐性也是提高盐碱地利用效率的有效方法之一。

高浓度的盐分通过渗透胁迫、离子毒害和氧化损伤等对植物细胞造成伤害。高浓度的盐分造成土壤中较低的水势，导致植物细胞吸水困难。Na⁺和Cl^-毒害主要通过影响代谢过程中的酶活性产生抑制作用。盐胁迫条件下植物细胞产生较多的活性氧，且活性氧清除酶的活性降低，导致细胞内过氧化氢等活性氧的积累，从而对细胞结构及蛋白质产生损伤。植物对抗高盐胁迫是通过复杂的的基因调控网络实现的。在水稻中，有许多跟盐胁迫相关的基因被鉴定出来，并且广泛参与到植物对逆境胁迫的响应。这些响应基因包括：转录因子、E3连接酶、蛋白磷酸酶、各种酶类、类受体蛋白激酶，离子通道蛋白等。如何找到一种耐盐相关基因，并应用于该领域是本领域人员待解决的技术问题。

发明内容

本发明解决的技术问题是如何提高水稻耐盐性。

为了解决上述问题，本发明提供了下述应用。

蛋白质、上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种；

A1)提高禾本科植物耐盐性中的应用；

A2)制备提高禾本科植物耐盐性产品中的应用；

B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，序列3(SEQ ID No.3)由个517个氨基酸残基组成。将其命名为OsMAK7蛋白。其编码基因为OsMAK7基因。

本申请中，所述调控可为过上调或增强或提高，和/或，敲除或降低或减少。

本申请中，所述过上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或所述蛋白质的活性或含量可提高植物耐盐性。敲除或降低或减少所述蛋白质的编码基因表达的物质或所述蛋白质的活性或含量可降低植物耐盐性。

上述的应用中，所述蛋白来源于水稻。

上文中，所述水稻可为品种南粳9108。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述的应用中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：

B1)、编码利上述蛋白质的核酸分子；

B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。

B1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质OsMAK7的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质OsMAK7的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsMAK7且具有蛋白质OsMAK7功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pMDC85载体；

上述生物材料中，B2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和水稻beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

上述B3)中，所述重组载体可为用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、pMDC85或pCAMBIA1391-Xb。使用OsMAK7构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。作为一个具体实施例，本申请使用pMDC85载体作为表达载体。

作为一个具体实施例，所述重组微生物中的微生物菌株可为农杆菌GV3101。

上述的应用中，B3)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列2的第1-1551位所示的DNA分子。

为了解决上述问题，本发明还提供了一种培育高耐盐性禾本科植物的方法。

包括上调或增强或提高目的禾本科植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量，得到高耐盐性禾本科植物，所述高耐盐性禾本科植物的耐盐性高于所述目的禾本科植物。

为了解决上述问题，本发明还提供了一种提高禾本科植物耐盐性的方法。

包括将通过上调或增强或提高禾本科植物中上述蛋白质的编码基因的表达，和/或，所述上述蛋白质的活性和/或含量来提高禾本科植物耐盐性。

本申请中，所述植物可为水稻。所述水稻可为水稻品系南粳9108。

上述的方法中，所述上调或增强或提高禾本科植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的禾本科植物中导入上述B1)所述的核酸分子、B2)所述的表达盒或B3)所述的重组载体。

上文中，所述核酸分子可为序列2的第1-1551位所述的核酸分子。

如上任一所述的应用或如上任一所述的方法，所述禾本科植物为如下任一种：

J1)稻植物；

J2)水稻。

本申请中，所述水稻可为水稻品系南粳9108。

上述的蛋白质或上述的物质。

为了解决上述问题，本发明还提供了试剂盒。

所述试剂盒包括上述的核酸分子和/或表达盒和/或重组载体和/或重组微生物和/或转基因植物细胞系和/或转基因植物组织和/或转基因植物器官。

有益效果

水稻类受体蛋白激酶(Receptor-like kinases，RLKs)家族基因是植物最大的基因家族之一，RLK蛋白主要定位于细胞质膜，负责感受外界细胞信号并将信号传递至细胞内。类受体蛋白激酶参与调控植物多种生长发育过程，包括根的伸长、植物花器官和胚胎的发育、参与植物的抗病性以及多种细胞信号转导过程等。水稻RLK家族有1100多个成员，RLK典型结构特点包括典型的类受体蛋白激酶的结构由胞外结构域(Extracellular domain)、单次跨膜结构域(Transmembrane domain)和胞内激酶结构域(Cytoplasmic kinasedomain)三部分组成。OsMAK7(membrane-associated kinase 7)属于RLKs基因家族，OsMAK7在RAP-DB(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)水稻参考基因组上基因号为OS06G0551800。随着植物功能基因组学的研究的不断深入，RLK蛋白在调控水稻耐盐性中的功能也逐步得到阐释。

本发明发现了一个与耐盐性相关联的基因，将其命名为OsMAK7基因。

本发明构建了OsMAK7基因过表达载体，将其通过农杆菌GV3101导入野生南粳9108，获得OsMAK7基因表达植株T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株。

将南粳9108和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株的幼苗在盐胁迫下进行培养，结果表明，OsMAK7基因过表达植株在干旱胁迫的生长表型和生存率均高于野生型对照(南粳9108)说明GNP3基因的表达在耐盐中发挥重要作用。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测过表达材料中OsMAK7mRNA的表达情况。

图2为OsMAK7高表达植株的耐盐表型鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

pMDC85载体记载于下述文献中：Valencia-Lozano E,et al.Development of anEfficient Protocol to Obtain Transgenic Coffee,Coffea arabica L.,Expressingthe Cr y10Aa Toxin of Bacillus thuringiensis.Int J Mol Sci.2019,20(21):5334.)或A Gate way Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis ofGenes in Planta(Plant Physiology,October 2003,Vol.133,pp.462–469)或https://www.arabidopsi s.org/中；Stock Number为CD3-744，Name为PMDC85；Tair Accession为Vector:1009003747；Date last modified为2005-09-06；具体相关信息记载下述网站：https://ww w.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝vector&id＝501100112，由清华大学提供。在pMDC85载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pMDC85载体中，含有GFP基因。

水稻品种：选用南粳9108品种作为野生型对照，为江苏省农业科学院培育品种。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres，L.otten，B.Tinland et al.Transformation of vitis tissueby different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6bgene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)。

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。

下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

实施例1、OsMAK7转基因植物的获得及鉴定

本实施例中所涉及的OsMAK7基因来源于水稻(Oryza sativa)，其在水稻基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由1554个核苷酸组成，为所述OsMAK7基因在水稻基因组中序列，无内含子序列；所述OsMAK7基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由1554个核苷酸组成，为所述OsMAK7基因的cDNA序列，其中第1-1551位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由517个氨基酸残基组成。

序列1具体如下：

ATGTCAGCTTACGTTGCACTCAAGAATGGTAGCCTTGAGGTGTTCACTTCTTTCCAGGAGACAAAGGCGCCTGATTACCACATCCAGCTGCCTGAGAATTCCTTTGGGCTGGAGTTTGCAAGGCTAGATTGGGATGGGCACATGAGACTATATCAGTGGATCAATTACAGTGCCTGGGTGCCTTCAGATATTTTTGACATAACTGACCCTTGTGCTTATCCTCTAGCTTGTGGAGAGTATGGTATTTGCTCGCATGGACAGTGCAGCTGCCCAGATGTAGCCATTGGGCAATCAGGATTGTTTGAGCTGGTCGATGCCAAGGGAGTTAACCATGGCTGCTTTCTGACGTCTTCATTGACTTGTGGGTCAGCCAGGAAGACTAGGTTTCTTGCTGTTCCCAATGTCACCCACTTCAATTTTGTCTACAATTGGACAACAAATGAAGATCATTGCAAACTATCATGCATGGATGATTGTTCTTGTCGGGCTTCATTTTTCCAGCATAAGGACATTTCTTCTGGTTTCTGTTTTCTTGCATTCAACATATTTTCGATGATAAATTTTAGTGCACAAAGTTATTCAAGTAACTTTAGTTCTTCTGCTTTTCTCAAAATTCAGGACTCTACCCACAAATCCTTATTATCTAAAGAGAAAAGAGCAATCGTTTTGGTTGCTGGTTCTTTGAGTTTTGTTACTTCAGTTATTGTTGCAGTGCTTATAGTTCTGAGAAGAAAGAGAGACGAACCATTAGAAGATGAATATTTTATTGATCAGCTTCCAGGGCTACCCACAAGATTTTCTTTTGTGGATTTGAAATCAGCAACAGGAGATTTCTCAAGAAAGATTGGGGCAGGGGGATTTGGTTCTGTTTTTGAAGGACAGATCGGTGATAAGCATGTTGCTGTCAAGAGATTGGATAGCATAGGTCAGGGGAAAAGAGAATTCTTAGCAGAGGTTCAGACAATTGGAAGCATTAACCACATACACCTGGTGAGGCTAATCGGATTTTGTGTTGAAAAAACTCATAGGCTTCTTGTCTATGAGTACATGCCTAATGGATCTTTGGATAAATGGATTTTTCAGAATCACCAAGCTGATCCACTTGATTGGAAAACCAGATTGAAGATTATCTCTGATGTAGCCAAGGCATTAGCTTATCTTCATAGTGATTGCCGACAAACAATAGCTCATCTGGACATCAAGCCAGAAAATATACTTTTGGATGAGGTGTTCACTGCAAAGATATCTGACTTTGGACTTGCCAAACTGATTGACCGTGAGCAAAGCAGTGTCATGACTAGATTAAGAGGCAGACTGGGTTACTTAGCCCCTGAGTGGTTGACATCTGTGATCACTGAAAAGGTTGATGTGTATAGCTTTGGCGTTGTGATAATGGAAATTTTATGCAGCAGAAGGAATTTGGACTACTCGCAGCCTGAAGAAAGCTGCCATCTCATCAGCATGTTGCAGGAGAAGGCCAAAAATAACCAGTTGATGGACCTTATCGATCCATGTTTCTTTGATATGGAATTACATATGGATGATGTTTTATGA。

序列2具体如下：

序列3具体如下：

MSAYVALKNGSLEVFTSFQETKAPDYHIQLPENSFGLEFARLDWDGHMRLYQWINYSAWVPSDIFDITDPCAYPLACGEYGICSHGQCSCPDVAIGQSGLFELVDAKGVNHGCFLTSSLTCGSARKTRFLAVPNVTHFNFVYNWTTNEDHCKLSCMDDCSCRASFFQHKDISSGFCFLAFNIFSMINFSAQSYSSNFSSSAFLKIQDSTHKSLLSKEKRAIVLVAGSLSFVTSVIVAVLIVLRRKRDEPLEDEYFIDQLPGLPTRFSFVDLKSATGDFSRKIGAGGFGSVFEGQIGDKHVAVKRLDSIGQGKREFLAEVQTIGSINHIHLVRLIGFCVEKTHRLLVYEYMPNGSLDKWIFQNHQADPLDWKTRLKIISDVAKALAYLHSDCRQTIAHLDIKPENILLDEVFTAKISDFGLAKLIDREQSSVMTRLRGRLGYLAPEWLTSVITEKVDVYSFGVVIMEILCSRRNLDYSQPEESCHLISMLQEKAKNNQLMDLIDPCFFDMELHMDDVL。

一、重组表达载体pMDC85-OsMAK7的构建

提取受体品种南粳9108的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1500bp片段，测序表明，该片段的序列是序列2自5’端起第1-1551位核苷酸序列。

引物1：5’-CCTTAATTAAATGTCAGCTTACGTTGCACTC-3’(下划线部分为PacI的识别位点，该序列的第11-31位为序列2的第1-21位)；

引物2：5’-TTGGCGCGCCTAAAACATCATCCATATGTAATTC-3’(下划线部分为Asc I的识别位点，该序列的第11-34位为序列2的第1528-1551位的反向互补序列)。

用限制性内切酶Pac I和Asc I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pMDC85载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将测序正确的质粒命名为pMDC85-OsMAK7(又称重组质粒pMDC85-OsMAK7或重组载体pMDC85-OsMAK7)。pMDC85-OsMAK7是将pMDC85载体的限制性内切酶Pac I和Asc I识别位点之间小片段替换为序列2的第1-1551位所示DNA片段，保持pMDC85载体其它序列不变，得到的重组载体，将其命名为pMDC85-OsMAK7(又称重组质粒pMDC85-OsMAK7或重组载体pMDC85-OsMAK7或重组表达载体pMDC85-OsMAK7)。

在重组载体pMDC85-OsMAK7中，启动所述OsMAK7基因转录的启动子为35S启动子。

在重组表达载体pMDC85-OsMAK7的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的OsMAK7基因为模板。

二、OsMAK7转基因水稻的获得及鉴定

1、OsMAK7转基因水稻植株的获得

将步骤一构建的重组表达载体pMDC85-OsMAK7导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有OsMAK7基因(PCR目的条带大小为1500bp左右)的农杆菌GV3101命名为GV3101/重组表达载体pMDC85-OsMAK7。GV3101/重组表达载体pMDC85-OsMAK7是含有重组表达载体pMDC85-OsMAK7的农杆菌GV3101。

采用用农杆菌侵染水稻愈伤的方法(NishimuraA,Aichi I,Matsuoka M，Aprotocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.Nat Protoc 2006,1(6):2796-2802.)将上述所得的GV3101/重组表达载体pMDC85-OsMAK7转化水稻品种南粳9108。获得20株阳性植株转重组表达载体pMDC85-OsMAK7的阳性植株。

2、OsMAK7转基因水稻鉴定

(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数

根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基(含50mg/L潮霉素MS培养基)上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝OsMAK7转基因水稻)，从而用于纯合体的筛选。

(2)转基因水稻OsMAK7-OE1和OsMAK7-OE2纯合系的筛选

使用步骤(1)的鉴定方法对上述20株阳性植株转重组表达载体pMDC85-OsMAK7的阳性植株进行鉴定，经上述鉴定分析后，选择其中二个具有代表性的单拷贝OsMAK7转基因水稻株系，分别记为OsMAK7-OE1和OsMAK7-OE2。播种于含50mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1和OsMAK7-OE2纯合系植株，作为实验材料进行后续实验分析。

三、转基因水稻OsMAK7-OE1和OsMAK7-OE2纯合系中OsMAK7基因表达量分析

提取野生型品种南粳9108和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中OsMAK7基因在转录水平上表达情况。具体如下：

1、转录水平分析(RNA表达量)

以上述获得的T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株及野生型南粳9108为实验材料。取水培生长2周左右的水稻幼苗，提取RNA并且反转录cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析OsMAK7基因在各实验材料中的表达情况。

其中，扩增OsMAK7基因的引物序列为：

OsMAK7RT-F1：5’-TTGAGGTGTTCACTTCTTTCC-3’(序列2的第35-55位)；

OsMAK7RT-R1：5’-CCAGGCACTGTAATTGATC-3’(序列2的第159-177位的反向互补序列)。

以Actin1作为内参基因，扩增内参Actin1的引物序列为：

Actin-F：5’-GATGACCCAGATCATGTTTG-3’；

Actin-R：5’-GGGCGATGTAGGAAAGC-3’。

上述引物的反应条件如下:

(1)反应体系的建立

实时荧光定量PCR反应体系

试剂	用量
		2×SYBR Premix Ex Taq(TAKARA)	5μL
正向引物(20μM)	0.25μL
		反向引物(20μM)	0.25μL
cDNA模板	0.5μL
		ddH₂O	补至10μL

(2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。

(3)反应程序的设定：

实时荧光定量PCR反应程序

(4)数值分析，以2^-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各株系中OsMAK7基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。

OsMAK7相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图1所示(图1中，WT为野生型品种南粳9108，OsMAK7-OE1为T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株，OsMAK7-OE2为T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株；纵坐标为OsMAK7基因相对表达量)，OsMAK7基因的表达均为相对值，以野生型品种南粳9108中的OsMAK7基因的表达为1。从图中可以看出，相比野生型品种南粳9108，步骤二获得的T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株OsMAK7基因mRNA表达量均显著高于野生型品种。

实施例2、OsMAK7转基因水稻幼苗耐盐性试验分析

本实验使用的MS(Murashige and Skoog)培养基购自PhytoTechnologyLaboratories^TM公司生产，货号为M524。

1/2MS(Murashige and Skoog)培养基(1/2MS盐溶液)配方如下：

用KOH调pH至5.8-6.0。

含有140mM NaCl的1/2MS(Murashige and Skoog)培养基(含有140mM NaCl的1/2MS盐溶液)配方如下：

用KOH调pH至5.8-6.0。

将野生型南粳9108、实施例1得到的单拷贝插入的T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株种子现在水中萌发3天，然后选取萌发一致的种子放在96孔板上，实验分为两组，即OsMAK7-OE1组和OsMAK7-OE2组，OsMAK7-OE1组中96孔板上一半种T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株，一半种植野生型南粳9108作为对照；OsMAK7-OE2组中96孔板上一半种T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株，一半种植野生型南粳9108作为对照；将OsMAK7-OE1组和OsMAK7-OE2组放置在1/2MS盐溶液中，在光照培养箱中培养(培养温度为30℃，光照强度为300μmol photons m^-2s^-1，光照时间为14小时，空气湿度为70％)11天左右，拍照，记作处理前盐胁迫前(结果如图2上半部分盐胁迫前所示；WT为野生型品种南粳9108，OsMAK7-OE1为T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株，OsMAK7-OE2为T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株)，然后用转入含有140mM NaCl的1/2MS盐溶液中继续处理8天，拍照，记作盐胁迫后(结果如图2下半部分盐胁迫后所示；WT为野生型品种南粳9108，OsMAK7-OE1为T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株，OsMAK7-OE2为T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株)记录苗子生长状况。实验重复3次，结果一致。

结果如图2所示，在用NaCl处理之前(处理前)，T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株以及野生型南粳9108的生长状态没有明显差异。当用NaCl处理8天后，T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株相比野生型(野生型南粳9108)叶片更绿，叶片萎蔫较少，高表达植株的生长状态比野生型好，即OsMAK7高表达植株受NaCl抑制的程度更低。

综合以上结果，相对于野生型水稻品种南粳9108，实施例1得到的T₃代转基因水稻OsMAK7-OE1纯合系植株和T₃代转基因水稻OsMAK7-OE2纯合系植株在NaCl抑制幼苗生长方面更加顿感，表现出较强的耐盐特性，这在农业生产上可应用与提高水稻耐盐性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.蛋白质、上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种；

A1)提高禾本科植物耐盐性中的应用；

A2)制备提高禾本科植物耐盐性产品中的应用；

B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白来源于水稻。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：

B1)、编码利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B3)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列2的第1-1551位所示的DNA分子。

5.一种培育高耐盐性禾本科植物的方法，其特征在于，包括上调或增强或提高目的禾本科植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量，得到高耐盐性禾本科植物，所述高耐盐性禾本科植物的耐盐性高于所述目的禾本科植物。

6.一种提高禾本科植物耐盐性的方法，其特征在于，包括将通过上调或增强或提高禾本科植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达，和/或，所述权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量来提高禾本科植物耐盐性。

7.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高禾本科植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的禾本科植物中导入权利要求3中B1)所述的核酸分子、B2)所述的表达盒或B3)所述的重组载体。

8.如权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述禾本科植物为如下任一种：

J1)稻植物；

J2)水稻。

9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求3中所述的物质。

10.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的核酸分子和/或表达盒和/或重组载体和/或重组微生物和/或转基因植物细胞系和/或转基因植物组织和/或转基因植物器官。