JP2001346590A - 熱ストレスにより誘導されるペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、耐暑性を付与した形質転換植物 - Google Patents
熱ストレスにより誘導されるペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、耐暑性を付与した形質転換植物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 植物に耐暑性を付与するための、新たな手段
を得る。 【解決手段】 本発明により、熱ストレスにより誘導さ
れる新規な遺伝子であるオオムギ由来ペルオキシソーム
結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、及び当
該遺伝子を導入することにより得られた耐暑性を付与し
た形質転換植物が与えられた。
を得る。 【解決手段】 本発明により、熱ストレスにより誘導さ
れる新規な遺伝子であるオオムギ由来ペルオキシソーム
結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、及び当
該遺伝子を導入することにより得られた耐暑性を付与し
た形質転換植物が与えられた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、熱ストレスにより
誘導される新規な遺伝子であるオオムギ由来ペルオキシ
ソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、
及び当該遺伝子を導入することにより得られた耐暑性を
付与した形質転換植物に関する。
誘導される新規な遺伝子であるオオムギ由来ペルオキシ
ソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、
及び当該遺伝子を導入することにより得られた耐暑性を
付与した形質転換植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】環境の変化や人口の増加により、将来の
食糧危機が予想されている。その問題に対応するべく、
農業において効率よく作物を生産するための技術開発が
求められている。農業において、種々の環境ストレスに
より生産量が減少することは大きな問題であり、種々の
環境ストレスに強い植物を作出することが求められてい
る。特に、地球の温暖化は大きな問題であり、植物の耐
暑性を向上させる事の意義は特に大きい。
食糧危機が予想されている。その問題に対応するべく、
農業において効率よく作物を生産するための技術開発が
求められている。農業において、種々の環境ストレスに
より生産量が減少することは大きな問題であり、種々の
環境ストレスに強い植物を作出することが求められてい
る。特に、地球の温暖化は大きな問題であり、植物の耐
暑性を向上させる事の意義は特に大きい。
【０００３】これまで、遺伝子工学的に耐暑性を付与し
た例としては、熱ストレスにより誘導される熱ショック
蛋白質をコードする遺伝子を利用した例がある。また、
適合溶質であるグリシンベタインを少量合成させた例が
ある。また、近年環境ストレス耐性において活性酸素消
去系の遺伝子の重要性が認識されてきている。これらを
導入して光酸化障害、塩ストレス、乾燥ストレス耐性を
付与した例もある。しかし、活性酸素消去系の遺伝子を
導入することにより耐暑性を付与した例はこれまでなか
った。
た例としては、熱ストレスにより誘導される熱ショック
蛋白質をコードする遺伝子を利用した例がある。また、
適合溶質であるグリシンベタインを少量合成させた例が
ある。また、近年環境ストレス耐性において活性酸素消
去系の遺伝子の重要性が認識されてきている。これらを
導入して光酸化障害、塩ストレス、乾燥ストレス耐性を
付与した例もある。しかし、活性酸素消去系の遺伝子を
導入することにより耐暑性を付与した例はこれまでなか
った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】活性酸素消去系の重要
性を示す知見より本発明者らは、従来の熱ショック蛋白
質をコードする遺伝子ではなく、活性酸素消去系の遺伝
子を利用して植物に耐暑性を付与できないか、と考え
た。即ち、酸化ストレスを防御する遺伝子を導入するこ
とにより、植物に耐暑性を付与するという新たな手法を
開発する事を目的として、その様な目的に使用できる新
規の遺伝子を探索し、その塩基配列を決定することが、
本発明の課題である。
性を示す知見より本発明者らは、従来の熱ショック蛋白
質をコードする遺伝子ではなく、活性酸素消去系の遺伝
子を利用して植物に耐暑性を付与できないか、と考え
た。即ち、酸化ストレスを防御する遺伝子を導入するこ
とにより、植物に耐暑性を付与するという新たな手法を
開発する事を目的として、その様な目的に使用できる新
規の遺伝子を探索し、その塩基配列を決定することが、
本発明の課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】熱ストレスは、植物の生
育及び生産性に影響を及ぼす因子の中でも、重要なもの
の１つである。生物は代謝を変化させることにより、高
熱に素早く反応しているが、その様な代謝変化は細胞活
性の複雑な再プログラミングに関与している。これらの
変化は、ストレスにより引き起こされる障害に対して、
細胞の重要な構造及び機能を保護するために働いてい
る。熱ショックの結果として酸化ストレスが引き起こさ
れ、その様な酸化ストレスは酸化ストレス防御に関与し
ている遺伝子を誘導する。熱ストレス下では、過剰な活
性酸素種(AOS:active oxygen species) が生成して、そ
れにより細胞の構成物の酸化障害を引き起こす。その様
な活性酸素種には、スーパーオキシドラジカル、過酸化
水素、ヒドロキシラジカル等がある。
育及び生産性に影響を及ぼす因子の中でも、重要なもの
の１つである。生物は代謝を変化させることにより、高
熱に素早く反応しているが、その様な代謝変化は細胞活
性の複雑な再プログラミングに関与している。これらの
変化は、ストレスにより引き起こされる障害に対して、
細胞の重要な構造及び機能を保護するために働いてい
る。熱ショックの結果として酸化ストレスが引き起こさ
れ、その様な酸化ストレスは酸化ストレス防御に関与し
ている遺伝子を誘導する。熱ストレス下では、過剰な活
性酸素種(AOS:active oxygen species) が生成して、そ
れにより細胞の構成物の酸化障害を引き起こす。その様
な活性酸素種には、スーパーオキシドラジカル、過酸化
水素、ヒドロキシラジカル等がある。
【０００６】植物の葉緑体及び細胞質における、過酸化
水素に対する主要な防御システムは、いわゆるアスコル
ビン酸グルタチオンサイクルであり、そのサイクルにお
いてはアルコルビン酸ペルオキシダーゼ（APXs）が主要
酵素である。APX は光合成された過酸化水素の解毒に関
与していると考えられている。その様なAPX の酵素活性
は、干ばつ、塩害、冷害、大気汚染、過剰な光、紫外
線、有害重金属、微量元素の欠乏の様な、多くのストレ
ス状態に応答して増加することが示されてきた。
水素に対する主要な防御システムは、いわゆるアスコル
ビン酸グルタチオンサイクルであり、そのサイクルにお
いてはアルコルビン酸ペルオキシダーゼ（APXs）が主要
酵素である。APX は光合成された過酸化水素の解毒に関
与していると考えられている。その様なAPX の酵素活性
は、干ばつ、塩害、冷害、大気汚染、過剰な光、紫外
線、有害重金属、微量元素の欠乏の様な、多くのストレ
ス状態に応答して増加することが示されてきた。
【０００７】これまでアルコルビン酸ペルオキシダーゼ
のアイソフォームについては、可溶性の細胞質型アルコ
ルビン酸ペルオキシダーゼ、及び葉緑体型アルコルビン
酸ペルオキシダーゼ（葉緑体結合型、チラコイド結合
型）が知られていた。それらのアイソフォームに加えて
近年、ペルオキシソーム及びグリオキシソームの膜に結
合する、ペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオ
キシダーゼのアイソフォームが、近年においていくつか
報告されるようになってきた。即ち、ペルオキシソーム
結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼが、ワタ（Bunk
elmann J.R.and Trelease R.N. (1996) Plant Physiolo
gy 110,589-598）、シロイヌナズナ（Zhang et al. (19
97) Plant Molecular Biology 34,967-971）及びホウレ
ンソウ（Ishikawa T., et al. (1998) Plant and Cell
Physiology 39,23-34 ）よりクローニングされた。な
お、本発明においては、これらの既知の配列を基にして
遺伝子を採取した訳ではない。
のアイソフォームについては、可溶性の細胞質型アルコ
ルビン酸ペルオキシダーゼ、及び葉緑体型アルコルビン
酸ペルオキシダーゼ（葉緑体結合型、チラコイド結合
型）が知られていた。それらのアイソフォームに加えて
近年、ペルオキシソーム及びグリオキシソームの膜に結
合する、ペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオ
キシダーゼのアイソフォームが、近年においていくつか
報告されるようになってきた。即ち、ペルオキシソーム
結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼが、ワタ（Bunk
elmann J.R.and Trelease R.N. (1996) Plant Physiolo
gy 110,589-598）、シロイヌナズナ（Zhang et al. (19
97) Plant Molecular Biology 34,967-971）及びホウレ
ンソウ（Ishikawa T., et al. (1998) Plant and Cell
Physiology 39,23-34 ）よりクローニングされた。な
お、本発明においては、これらの既知の配列を基にして
遺伝子を採取した訳ではない。
【０００８】ペルオキシソームはグリオキシソームと共
に総称的にミクロボディーと呼ばれ、分子状酸素を用い
る酸化反応を専門に行う小器官である。ペルオキシソー
ムという名前は、ペルオキシソームに存在する酵素が分
子状酸素を用いて、有機物質である基質から水素原子を
奪う酸化反応を行い、過酸化水素（hydrogen peroxide
）を生じる反応が行われていることに由来している。
また、ペルオキシソームにはカタラーゼも存在し、生じ
た過酸化水素を用いて、フェノール類、ホルムアルデヒ
ド、アルコールなどを「過酸化反応」により酸化する反
応も行われている。この様な酸化反応は有害分子の解毒
にも関わっており、そのために肝臓や腎臓の細胞におい
ては特に重要である。
に総称的にミクロボディーと呼ばれ、分子状酸素を用い
る酸化反応を専門に行う小器官である。ペルオキシソー
ムという名前は、ペルオキシソームに存在する酵素が分
子状酸素を用いて、有機物質である基質から水素原子を
奪う酸化反応を行い、過酸化水素（hydrogen peroxide
）を生じる反応が行われていることに由来している。
また、ペルオキシソームにはカタラーゼも存在し、生じ
た過酸化水素を用いて、フェノール類、ホルムアルデヒ
ド、アルコールなどを「過酸化反応」により酸化する反
応も行われている。この様な酸化反応は有害分子の解毒
にも関わっており、そのために肝臓や腎臓の細胞におい
ては特に重要である。
【０００９】種々のストレス状態下においては、ミクロ
ボディー基質における過酸化水素の産生が増加し、細胞
質に拡散する。ペルオキシソーム結合型のアルコルビン
酸ペルオキシダーゼはペルオキシソーム膜の外部に結合
していると考えられており、過酸化水素の分解をおこな
うことにより細胞の障害を防ぐのに重要な役割を果たし
ている。そのために、従来知られていた細胞質型又は葉
緑体型アルコルビン酸ペルオキシダーゼと比較して、本
発明のペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキ
シダーゼは、ペルオキシソームにおいて生成した上述の
活性酸素種を、細胞質に移行する前の早い時期に消去で
きる、という利点を有する。
ボディー基質における過酸化水素の産生が増加し、細胞
質に拡散する。ペルオキシソーム結合型のアルコルビン
酸ペルオキシダーゼはペルオキシソーム膜の外部に結合
していると考えられており、過酸化水素の分解をおこな
うことにより細胞の障害を防ぐのに重要な役割を果たし
ている。そのために、従来知られていた細胞質型又は葉
緑体型アルコルビン酸ペルオキシダーゼと比較して、本
発明のペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキ
シダーゼは、ペルオキシソームにおいて生成した上述の
活性酸素種を、細胞質に移行する前の早い時期に消去で
きる、という利点を有する。
【００１０】そこで本発明者らは、オオムギの葉より作
製したcDNAライブラリーよりペルオキシソーム結合型ア
ルコルビン酸ペルオキシダーゼを、ディファレンシャル
ディスプレイの手法により単離し、その遺伝子塩基配列
を決定した。上で述べた様に、これまでに配列が得られ
たペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダ
ーゼは、ワタ、シロイヌナズナ及びホウレンソウは全て
双子葉植物であり、単子葉植物からペルオキシソーム結
合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼが得られた例は、
本発明が初めてである。ここで用いたディファレンシャ
ルディスプレイ法とは、真核細胞の遺伝子上で高頻度で
出現する任意の配列を持つ一種の短いプライマーを用い
てRT-PCRを行い、放射性同位元素でラベルした後、シー
クエンスゲルで分離、比較をする方法であり、非常に感
度が高いという利点を有する。そのようにして塩基配列
を決定した後、当該遺伝子の発現が熱ストレスにより誘
導されることを示した。また、シロイヌナズナにおい
て、当該遺伝子を過剰発現させた際に耐暑性が上昇する
ことを示した。
製したcDNAライブラリーよりペルオキシソーム結合型ア
ルコルビン酸ペルオキシダーゼを、ディファレンシャル
ディスプレイの手法により単離し、その遺伝子塩基配列
を決定した。上で述べた様に、これまでに配列が得られ
たペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダ
ーゼは、ワタ、シロイヌナズナ及びホウレンソウは全て
双子葉植物であり、単子葉植物からペルオキシソーム結
合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼが得られた例は、
本発明が初めてである。ここで用いたディファレンシャ
ルディスプレイ法とは、真核細胞の遺伝子上で高頻度で
出現する任意の配列を持つ一種の短いプライマーを用い
てRT-PCRを行い、放射性同位元素でラベルした後、シー
クエンスゲルで分離、比較をする方法であり、非常に感
度が高いという利点を有する。そのようにして塩基配列
を決定した後、当該遺伝子の発現が熱ストレスにより誘
導されることを示した。また、シロイヌナズナにおい
て、当該遺伝子を過剰発現させた際に耐暑性が上昇する
ことを示した。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は、配列表の配列番号２に
示す、塩基番号１−１０８９で示される塩基配列からな
ることを特徴とする、オオムギ由来のペルオキシソーム
結合型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子である。
当該遺伝子は植物の耐暑性に関与している遺伝子であ
り、熱ストレスにより発現が誘導されるという性質を有
する。
示す、塩基番号１−１０８９で示される塩基配列からな
ることを特徴とする、オオムギ由来のペルオキシソーム
結合型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子である。
当該遺伝子は植物の耐暑性に関与している遺伝子であ
り、熱ストレスにより発現が誘導されるという性質を有
する。
【００１２】遺伝子組み換え技術によれば、基本となる
DNA の特定の部位に、当該DNA の基本的な特性を変化さ
せることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為
的に変異を起こすことができる。本発明により提供され
る天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のもの
とは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に
人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝
子と同等のあるいは改善された特性を有するものとする
ことが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含
むものである。即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子
の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配
列番号２に示す塩基配列において２０個以下、好ましく
は１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換若
しくは付加された配列を有する遺伝子である。その様な
遺伝子も、熱ストレスにより誘導されるというペルオキ
シソーム結合型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子
の特徴を有する限り、本発明の範囲内である。
DNA の特定の部位に、当該DNA の基本的な特性を変化さ
せることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為
的に変異を起こすことができる。本発明により提供され
る天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のもの
とは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に
人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝
子と同等のあるいは改善された特性を有するものとする
ことが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含
むものである。即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子
の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配
列番号２に示す塩基配列において２０個以下、好ましく
は１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換若
しくは付加された配列を有する遺伝子である。その様な
遺伝子も、熱ストレスにより誘導されるというペルオキ
シソーム結合型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子
の特徴を有する限り、本発明の範囲内である。
【００１３】更に本発明は、配列表の配列番号１に示
す、アミノ酸番号１−２９１で示されるアミノ酸配列か
らなることを特徴とする、オオムギ由来のペルオキシソ
ーム結合型アスコルビン酸ペリオキシダーゼポリペプチ
ドである。当該ポリペプチドは、配列表の配列番号２記
載の塩基配列のオープンリーディングフレーム部分によ
りコードされるポリペプチドである。配列番号１に示す
ポリペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されたポ
リペプチドとは、配列番号１に示すアミノ酸配列におい
て２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは
５個以下のアミノ酸が置換若しくは付加された配列を有
するポリペプチドである。その様なポリペプチドも、熱
ストレスにより誘導されるというペルオキシソーム結合
型アスコルビン酸ペルオキシダーゼの特徴を有する限
り、本発明の範囲内である。
す、アミノ酸番号１−２９１で示されるアミノ酸配列か
らなることを特徴とする、オオムギ由来のペルオキシソ
ーム結合型アスコルビン酸ペリオキシダーゼポリペプチ
ドである。当該ポリペプチドは、配列表の配列番号２記
載の塩基配列のオープンリーディングフレーム部分によ
りコードされるポリペプチドである。配列番号１に示す
ポリペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されたポ
リペプチドとは、配列番号１に示すアミノ酸配列におい
て２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは
５個以下のアミノ酸が置換若しくは付加された配列を有
するポリペプチドである。その様なポリペプチドも、熱
ストレスにより誘導されるというペルオキシソーム結合
型アスコルビン酸ペルオキシダーゼの特徴を有する限
り、本発明の範囲内である。
【００１４】ペルオキシソーム結合型アスコルビン酸ペ
ルオキシダーゼ遺伝子を植物に導入して形質転換を行う
方法、当該ペルオキシソーム結合型アスコルビン酸ペル
オキシダーゼ遺伝子を導入して得た形質転換植物もま
た、本発明の範囲内である。本発明のアスコルビン酸ペ
ルオキシダーゼ遺伝子は、熱ストレスにより誘導される
遺伝子であり、植物の自己防御に関与している。そのた
めに、当該遺伝子を植物に導入する事により、植物に耐
暑性を付与する事ができる。本発明の熱ストレス誘導遺
伝子を導入する植物の例としては、オオムギ、コムギ、
ユリ、イネ、トウモロコシ、アスパラガス等の単子葉植
物、またシロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、
トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。
ルオキシダーゼ遺伝子を植物に導入して形質転換を行う
方法、当該ペルオキシソーム結合型アスコルビン酸ペル
オキシダーゼ遺伝子を導入して得た形質転換植物もま
た、本発明の範囲内である。本発明のアスコルビン酸ペ
ルオキシダーゼ遺伝子は、熱ストレスにより誘導される
遺伝子であり、植物の自己防御に関与している。そのた
めに、当該遺伝子を植物に導入する事により、植物に耐
暑性を付与する事ができる。本発明の熱ストレス誘導遺
伝子を導入する植物の例としては、オオムギ、コムギ、
ユリ、イネ、トウモロコシ、アスパラガス等の単子葉植
物、またシロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、
トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。
【００１５】形質転換体の作製方法としては、本技術分
野において知られている通常の方法を用いる事ができ
る。本発明において使用可能なベクターはプラスミドベ
クターであり、例えば実施例において使用しているｐＢ
Ｉ１２１、その他にはｐＢＩ２２１等が挙げられるが、
それらに限定されるものではない。そのようなベクター
を、例えばアグロバクテリウム菌に導入して、当該アグ
ロバクテリウム菌を目的とする植物に感染させることに
より、形質転換植物を作製し、プラスミドベクターに組
み込んだカナマイシン耐性等により、形質転換したもの
を選抜する事が可能である。更に、そのような形質転換
植物に由来する種子を得る事が可能である。本発明の植
物遺伝子を植物に導入する形質転換法はアグロバクテリ
ウム法に限定されるものではなく、パーティクルガン
法、電気穿孔法等の方法を用いる事も可能である。
野において知られている通常の方法を用いる事ができ
る。本発明において使用可能なベクターはプラスミドベ
クターであり、例えば実施例において使用しているｐＢ
Ｉ１２１、その他にはｐＢＩ２２１等が挙げられるが、
それらに限定されるものではない。そのようなベクター
を、例えばアグロバクテリウム菌に導入して、当該アグ
ロバクテリウム菌を目的とする植物に感染させることに
より、形質転換植物を作製し、プラスミドベクターに組
み込んだカナマイシン耐性等により、形質転換したもの
を選抜する事が可能である。更に、そのような形質転換
植物に由来する種子を得る事が可能である。本発明の植
物遺伝子を植物に導入する形質転換法はアグロバクテリ
ウム法に限定されるものではなく、パーティクルガン
法、電気穿孔法等の方法を用いる事も可能である。
【００１６】
【実施例】（植物材料）オオムギ（Hordeum vulgare L.
Haruna-nijyo ）を、水道水で1000倍希釈したハイポネ
ックスを用いて、生育チャンバー中において、１日の中
で13時間を25℃で100 μE.M -2 .S -1の光条件下で、11
時間を23℃の暗条件下で、70％の湿度において２−３週
間水耕栽培を行った。塩ストレス処理のために、培養培
地中のNaCl濃度を１日おきに100mM ずつ上昇させて、30
0mM まで上昇させて二日間保持した。熱ストレスは、全
植物体を光条件下においてチャンバー内で37℃に24時間
曝すことにより処理された。50μM のABA （アブシジン
酸）及び1.5%（およそ440mM ）の過酸化水素を、培養溶
液に直接添加した。
Haruna-nijyo ）を、水道水で1000倍希釈したハイポネ
ックスを用いて、生育チャンバー中において、１日の中
で13時間を25℃で100 μE.M -2 .S -1の光条件下で、11
時間を23℃の暗条件下で、70％の湿度において２−３週
間水耕栽培を行った。塩ストレス処理のために、培養培
地中のNaCl濃度を１日おきに100mM ずつ上昇させて、30
0mM まで上昇させて二日間保持した。熱ストレスは、全
植物体を光条件下においてチャンバー内で37℃に24時間
曝すことにより処理された。50μM のABA （アブシジン
酸）及び1.5%（およそ440mM ）の過酸化水素を、培養溶
液に直接添加した。
【００１７】（ディファレンシャルディスプレイ）SDS-
フェノール法を用いて、オオムギよりRNA を単離した。
第一鎖cDNAを、ランダムプライマー（6mer）を用いて、
逆転写酵素により合成した。PCR 条件は、村本らの方法
に従った（Muramoto Y.et al.,Photosynthesis Mechani
sms and Effects volume IV (eds Garab), pp. 3043-30
46. Academic Publishers ）。塩ストレスにより誘導さ
れたPCR 断片を、pGEM-Tベクター（プロメガ）にクロー
ン化した。DNA 配列は、DNA シークエンサー（ABI:373
A）を用いた色素−プライマーシークエンシング法によ
り決定した。BLAST ホモロジーサーチにより、APX の一
部分をコードする部分配列を得た。
フェノール法を用いて、オオムギよりRNA を単離した。
第一鎖cDNAを、ランダムプライマー（6mer）を用いて、
逆転写酵素により合成した。PCR 条件は、村本らの方法
に従った（Muramoto Y.et al.,Photosynthesis Mechani
sms and Effects volume IV (eds Garab), pp. 3043-30
46. Academic Publishers ）。塩ストレスにより誘導さ
れたPCR 断片を、pGEM-Tベクター（プロメガ）にクロー
ン化した。DNA 配列は、DNA シークエンサー（ABI:373
A）を用いた色素−プライマーシークエンシング法によ
り決定した。BLAST ホモロジーサーチにより、APX の一
部分をコードする部分配列を得た。
【００１８】（オオムギpAPXのクローニング及び配列決
定）塩ストレスを受けたオオムギの葉の相補的なDNA ラ
イブラリーを調製した（Ishitani M.et al. (1995) Pla
nt Molecular Biology 27,307-315 ）。そのライブラリ
ーを、［α-32P］dCTPにより、メガプライムDNA ラベリ
ングシステム（アマシャム）によりラベルしたPCR フラ
グメントにより、スクリーニングした。ポシティブクロ
ーンをZAPII ベクターより切除し、製造者のプロトコー
ルに従ってpBluscript中へ挿入した。DNA 配列は、上述
の様にして決定された。
定）塩ストレスを受けたオオムギの葉の相補的なDNA ラ
イブラリーを調製した（Ishitani M.et al. (1995) Pla
nt Molecular Biology 27,307-315 ）。そのライブラリ
ーを、［α-32P］dCTPにより、メガプライムDNA ラベリ
ングシステム（アマシャム）によりラベルしたPCR フラ
グメントにより、スクリーニングした。ポシティブクロ
ーンをZAPII ベクターより切除し、製造者のプロトコー
ルに従ってpBluscript中へ挿入した。DNA 配列は、上述
の様にして決定された。
【００１９】（サザン及びノザンブロット解析）オオム
ギから、ゲノムDNA を常法により単離した。ゲノムDNA
を制限酵素であるBamHI,BglII,EcoRI,EcoRV およびHind
III により分解し、0.8%アガロースゲルで分離した。ナ
イロン膜（Hybond-N+ 、アマシャム）に転写した後、6X
SSC, 5XDenhardt's, 0.1% SDS, 及び0.1mg/mlの変性ニ
シン精子DNA を含む溶液でハイブリダイゼーションを行
った。膜を2XSSC 及び0.1% SDS中で洗浄し、その後1XSS
C及び0.1% SDS中で洗浄した。全てのハイブリダイゼー
ション及び洗浄は65℃で行った。20日目の植物を、上述
した様なストレス温度に曝し、その後回収してRNAを抽
出するために-80 ℃で貯蔵した。RNA は、ATA （aurine
tricarboxylic acid ）法により単離した。20μg の全
RNA を、0.66M のホルムアルデヒドを含む1.2%アガロー
スゲルで分離し、ナイロン膜（Hybond-N+ 、アマシャ
ム）に転写した。全てのハイブリダイゼーション及び洗
浄は、65℃で行った。シグナルの解析は、BAS2000 イメ
ージアナライザーを用いて行った（Fuji）。
ギから、ゲノムDNA を常法により単離した。ゲノムDNA
を制限酵素であるBamHI,BglII,EcoRI,EcoRV およびHind
III により分解し、0.8%アガロースゲルで分離した。ナ
イロン膜（Hybond-N+ 、アマシャム）に転写した後、6X
SSC, 5XDenhardt's, 0.1% SDS, 及び0.1mg/mlの変性ニ
シン精子DNA を含む溶液でハイブリダイゼーションを行
った。膜を2XSSC 及び0.1% SDS中で洗浄し、その後1XSS
C及び0.1% SDS中で洗浄した。全てのハイブリダイゼー
ション及び洗浄は65℃で行った。20日目の植物を、上述
した様なストレス温度に曝し、その後回収してRNAを抽
出するために-80 ℃で貯蔵した。RNA は、ATA （aurine
tricarboxylic acid ）法により単離した。20μg の全
RNA を、0.66M のホルムアルデヒドを含む1.2%アガロー
スゲルで分離し、ナイロン膜（Hybond-N+ 、アマシャ
ム）に転写した。全てのハイブリダイゼーション及び洗
浄は、65℃で行った。シグナルの解析は、BAS2000 イメ
ージアナライザーを用いて行った（Fuji）。
【００２０】（発現プラスミドの構築と形質転換）全長
pAPX蛋白質をコードするpAPX配列を、CaMV 35Sプロモー
ターの制御下にバイナリーベクターpBI121に結合した
（図１）。図１において、RBとLBはそれぞれ、右ボーダ
ー配列、左ボーダー配列を、それぞれ示す。その後、エ
レクトロポレーションにより、プラスミドをアグロバク
テリウムツメファシエンスに導入した。アグロバクテリ
ウムを介したインプランタトランスフォーメーション
（Shimamoto K. and Okada K. ed. Experimental Proto
col for Model Plants:Rice andArabidopsis,SHUJUNSHA
Co.Ltd,Tokyo,1996 ）により、シロイヌナズナ（エコ
タイプコロンビア）にpAPXを導入した。回収した後、カ
ナマイシンを含むMS培地に種子を蒔き、カナマイシン耐
性植物（T1）を回収した。形質転換した苗を、バーミキ
ュライトの入ったポットに蒔き、それらを1000倍に希釈
した水道水を含む水槽に移し、ポットの下部から水を供
給できるようにし、T2の種子を得るために通常の条件で
生育させた。
pAPX蛋白質をコードするpAPX配列を、CaMV 35Sプロモー
ターの制御下にバイナリーベクターpBI121に結合した
（図１）。図１において、RBとLBはそれぞれ、右ボーダ
ー配列、左ボーダー配列を、それぞれ示す。その後、エ
レクトロポレーションにより、プラスミドをアグロバク
テリウムツメファシエンスに導入した。アグロバクテリ
ウムを介したインプランタトランスフォーメーション
（Shimamoto K. and Okada K. ed. Experimental Proto
col for Model Plants:Rice andArabidopsis,SHUJUNSHA
Co.Ltd,Tokyo,1996 ）により、シロイヌナズナ（エコ
タイプコロンビア）にpAPXを導入した。回収した後、カ
ナマイシンを含むMS培地に種子を蒔き、カナマイシン耐
性植物（T1）を回収した。形質転換した苗を、バーミキ
ュライトの入ったポットに蒔き、それらを1000倍に希釈
した水道水を含む水槽に移し、ポットの下部から水を供
給できるようにし、T2の種子を得るために通常の条件で
生育させた。
【００２１】（形質転換植物による熱耐性試験）野生型
の種子及び選別された同遺伝子形質のT3形質転換株の種
子を、水道水で1000倍に希釈したハイポネックスで潅水
したバーミキュライト上に播種し、生育チャンバー中に
おいて、23℃で100 μE.M -2 .S -1の光条件で16時間、
および23℃の暗条件下で8 時間のサイクルで、50% の湿
度でチャンバー中で３週間生育した。植物をチャンバー
中で５日間35℃に曝し、通常状態のチャンバーに移植し
回復させた。５日後に植物を回収し、緑色部分と黄色部
分の新鮮重量を別々に秤量した。それぞれの実験は、５
回繰り返して行った。
の種子及び選別された同遺伝子形質のT3形質転換株の種
子を、水道水で1000倍に希釈したハイポネックスで潅水
したバーミキュライト上に播種し、生育チャンバー中に
おいて、23℃で100 μE.M -2 .S -1の光条件で16時間、
および23℃の暗条件下で8 時間のサイクルで、50% の湿
度でチャンバー中で３週間生育した。植物をチャンバー
中で５日間35℃に曝し、通常状態のチャンバーに移植し
回復させた。５日後に植物を回収し、緑色部分と黄色部
分の新鮮重量を別々に秤量した。それぞれの実験は、５
回繰り返して行った。
【００２２】（ペルオキシソーム結合型アスコルビン酸
ペルオキシダーゼのクローニング）RAPDプライマー（5'
-CTTGAGCGTATT-3'）を用いたDDRT-PCR（differential d
isplay reverse transcriptase PCR）により、塩ストレ
スをかけた葉より調製したmRNAが選択的に増幅された。
配列決定をし、BLAST の相同性検索をしたところ、この
断片はAPX 遺伝子と高い相同性を有することが見出され
た。この断片をプローブとして用いて、塩ストレスをか
けたオオムギの葉より調製したcDNAライブラリーより全
長cDNAクローンを単離した。そのクローンは長さが1089
bpであり、291 個のアミノ酸から成るポリペプチドをコ
ードする読み枠を含んでいた（図２）。図２において、
膜貫通部位を下線で、長いC 末端領域をイタリックで、
それぞれ示す。その推定アミノ酸配列はワタ由来のミク
ロボディ型gmAPX 蛋白質と75.3% の相同性を、シロイヌ
ナズナ由来のペルオキシソーム型APX3蛋白質と72.1% の
相同性を有していた。（図３）。特徴的な長いＣ末端部
位及び膜貫通領域は共に保存されていることが見出され
た。単離されたクローンはペルオキシソーム結合型のア
スコルビン酸ペルオキシダーゼをコードしており、それ
をpAPXと名づけた。
ペルオキシダーゼのクローニング）RAPDプライマー（5'
-CTTGAGCGTATT-3'）を用いたDDRT-PCR（differential d
isplay reverse transcriptase PCR）により、塩ストレ
スをかけた葉より調製したmRNAが選択的に増幅された。
配列決定をし、BLAST の相同性検索をしたところ、この
断片はAPX 遺伝子と高い相同性を有することが見出され
た。この断片をプローブとして用いて、塩ストレスをか
けたオオムギの葉より調製したcDNAライブラリーより全
長cDNAクローンを単離した。そのクローンは長さが1089
bpであり、291 個のアミノ酸から成るポリペプチドをコ
ードする読み枠を含んでいた（図２）。図２において、
膜貫通部位を下線で、長いC 末端領域をイタリックで、
それぞれ示す。その推定アミノ酸配列はワタ由来のミク
ロボディ型gmAPX 蛋白質と75.3% の相同性を、シロイヌ
ナズナ由来のペルオキシソーム型APX3蛋白質と72.1% の
相同性を有していた。（図３）。特徴的な長いＣ末端部
位及び膜貫通領域は共に保存されていることが見出され
た。単離されたクローンはペルオキシソーム結合型のア
スコルビン酸ペルオキシダーゼをコードしており、それ
をpAPXと名づけた。
【００２３】（サザンブロット解析）遺伝子のコピー数
を決定するために、3'-UTRに150bp のＣ末端をコードす
る領域を含むDNA 断片をプローブとして用いて、サザン
ブロット解析を行った。pAPXのcDNAは、一つの内部Hind
II制限酵素部位を有するが、BamHI,BglII,EcoRI 及びEc
oRV 制限酵素部位を有していなかった。図４において、
レーン１はBamHI 、レーン２はBglII 、レーン３はEcoR
I 、レーン４はEcoRV 、レーン５はHindIII により分解
を行った結果を示す。図４に見られる様に、厳しいハイ
ブリダイゼーション条件下においては、BamHI,BglII,Ec
oRI 及びEcoRV 中の消化物の１つのバンド、およびHind
III 分解産物の２つのバンドのみが検出された。これ
は、オオムギのゲノムにおいて、pAPXは単一コピーによ
りコードされることを示している。
を決定するために、3'-UTRに150bp のＣ末端をコードす
る領域を含むDNA 断片をプローブとして用いて、サザン
ブロット解析を行った。pAPXのcDNAは、一つの内部Hind
II制限酵素部位を有するが、BamHI,BglII,EcoRI 及びEc
oRV 制限酵素部位を有していなかった。図４において、
レーン１はBamHI 、レーン２はBglII 、レーン３はEcoR
I 、レーン４はEcoRV 、レーン５はHindIII により分解
を行った結果を示す。図４に見られる様に、厳しいハイ
ブリダイゼーション条件下においては、BamHI,BglII,Ec
oRI 及びEcoRV 中の消化物の１つのバンド、およびHind
III 分解産物の２つのバンドのみが検出された。これ
は、オオムギのゲノムにおいて、pAPXは単一コピーによ
りコードされることを示している。
【００２４】（熱及び他のストレス下におけるpAPX遺伝
子の発現）図５に種々のストレス処理を行った際のpAPX
の発現を、ノザンブロットで解析した結果を示す。図５
において、C のレーンはコントロールを、Saltのレーン
は300mM のNaClの高塩処理を、ABA のレーンは50μM ア
ブシジン酸（ABA ）処理を、H2O2のレーンは1.5%過酸化
水素処理を、Heatのレーンは37℃で24時間の処理を、そ
れぞれ示す。また、上段のＡにおいてはpAPX cDNA の3'
-UTRを含む特異的プローブを用いて検出を行った結果
を、下段のＢにおいてはEtBrにより変化しないコントロ
ールである25S rRNAを可視化した結果を、それぞれ示
す。RNA ブロット解析（図５）の結果は、pAPX転写レベ
ルは塩と熱ストレス下において明らかに上昇することを
示唆している。ABA の添加により、より高度なpAPX遺伝
子発現の誘導が引き起こされた。しかしながら、過酸化
水素を植物根の生育培地に直接添加しても、発現誘導は
起こらなかった。
子の発現）図５に種々のストレス処理を行った際のpAPX
の発現を、ノザンブロットで解析した結果を示す。図５
において、C のレーンはコントロールを、Saltのレーン
は300mM のNaClの高塩処理を、ABA のレーンは50μM ア
ブシジン酸（ABA ）処理を、H2O2のレーンは1.5%過酸化
水素処理を、Heatのレーンは37℃で24時間の処理を、そ
れぞれ示す。また、上段のＡにおいてはpAPX cDNA の3'
-UTRを含む特異的プローブを用いて検出を行った結果
を、下段のＢにおいてはEtBrにより変化しないコントロ
ールである25S rRNAを可視化した結果を、それぞれ示
す。RNA ブロット解析（図５）の結果は、pAPX転写レベ
ルは塩と熱ストレス下において明らかに上昇することを
示唆している。ABA の添加により、より高度なpAPX遺伝
子発現の誘導が引き起こされた。しかしながら、過酸化
水素を植物根の生育培地に直接添加しても、発現誘導は
起こらなかった。
【００２５】（pAPXを過剰発現した形質転換シロイヌナ
ズナの耐暑性）アグロバクテリウムツメファシエンスで
感染させたシロイヌナズナ植物より回収したT0種子のプ
ールより、全部で８つの独立した形質転換系（T1）を、
カナマイシン耐性培地からスクリーニングした。自家受
粉をした後、T2子孫をカナマイシン含有培地に再び置い
て、分離解析を行った。分離解析の結果、単一のT-DNA
が６つの系統で挿入されていることが見出された。野生
型及びT2形質転換系統よりゲノムDNA が単離され、131-
916bp 及び131-511bp を示すpAPXの２セットのプライマ
ーを用いて、PCR により更に解析した。図６にその結果
を示す。図６において、左側はpAPX配列の131-916bp の
部位を表すPCR 産物を示し、右側はpAPX配列の131-511b
p の部位を表すPCR 産物を示す。また、WTは野生型のシ
ロイヌナズナ株を、pAPX1,pAPX2,pAPX3,pAPX5,pAPX7,pA
PX8 はそれぞれ独立した形質転換シロイヌナズナ株を示
す。図６の結果より、野生型の植物体からDNA 断片は増
幅されなかったが、一方試験した全ての形質転換株のDN
A から、380bp 又は785bp の予想された長さの断片が増
幅された。それは、これらの系統がオオムギのpAPX遺伝
子を外来遺伝子として含んでいることを示している。T3
の形質転換系は、T2を再び自家受粉することにより作製
された。これらから得た50-60 個の種子を、カナマイシ
ンを含有するMS培地に植えて同遺伝子形質の系統の選抜
を行ったところ、その系統の子孫は全てカナマイシン耐
性を示した。それらの同遺伝子形質の系統のみ、更なる
解析及び耐暑性試験に用いた。
ズナの耐暑性）アグロバクテリウムツメファシエンスで
感染させたシロイヌナズナ植物より回収したT0種子のプ
ールより、全部で８つの独立した形質転換系（T1）を、
カナマイシン耐性培地からスクリーニングした。自家受
粉をした後、T2子孫をカナマイシン含有培地に再び置い
て、分離解析を行った。分離解析の結果、単一のT-DNA
が６つの系統で挿入されていることが見出された。野生
型及びT2形質転換系統よりゲノムDNA が単離され、131-
916bp 及び131-511bp を示すpAPXの２セットのプライマ
ーを用いて、PCR により更に解析した。図６にその結果
を示す。図６において、左側はpAPX配列の131-916bp の
部位を表すPCR 産物を示し、右側はpAPX配列の131-511b
p の部位を表すPCR 産物を示す。また、WTは野生型のシ
ロイヌナズナ株を、pAPX1,pAPX2,pAPX3,pAPX5,pAPX7,pA
PX8 はそれぞれ独立した形質転換シロイヌナズナ株を示
す。図６の結果より、野生型の植物体からDNA 断片は増
幅されなかったが、一方試験した全ての形質転換株のDN
A から、380bp 又は785bp の予想された長さの断片が増
幅された。それは、これらの系統がオオムギのpAPX遺伝
子を外来遺伝子として含んでいることを示している。T3
の形質転換系は、T2を再び自家受粉することにより作製
された。これらから得た50-60 個の種子を、カナマイシ
ンを含有するMS培地に植えて同遺伝子形質の系統の選抜
を行ったところ、その系統の子孫は全てカナマイシン耐
性を示した。それらの同遺伝子形質の系統のみ、更なる
解析及び耐暑性試験に用いた。
【００２６】野生型（WT）及び形質転換したシロイヌナ
ズナの苗の両者につき、pAPX転写産物レベルをノーザン
ブロット解析によりチェックした。図７にpAPXを過剰発
現させた形質転換T2株を、pAPXをプローブとして用いて
ノザンブロット解析した結果を示す。図７のＡは、全長
の野生型及び形質転換株であるpAPX1,pAPX2,pAPX3,pAPX
5,pAPX7,pAPX8 についてオオムギ特異的なpAPXプローブ
とハイブリダイズする転写産物を検出した結果を、図７
ＢはEtBrを用いて可視化した変化しないコントロールで
ある25S rRNAを検出した結果を、それぞれ示す。図７に
示す様に、野生型植物体はpAPXプローブとハイブリダイ
ズする転写産物を含有しないが、全ての形質転換系統は
多量のpAPX転写産物を含んでいた。それらの中で、pAPX
1, pAPX2及びpAPX3 は高いレベルを有していたが、一方
pAPX5 及びpAPX7 は比較的低いレベルであった。pAPX8
においては、pAPXの発現は非常に低かった。
ズナの苗の両者につき、pAPX転写産物レベルをノーザン
ブロット解析によりチェックした。図７にpAPXを過剰発
現させた形質転換T2株を、pAPXをプローブとして用いて
ノザンブロット解析した結果を示す。図７のＡは、全長
の野生型及び形質転換株であるpAPX1,pAPX2,pAPX3,pAPX
5,pAPX7,pAPX8 についてオオムギ特異的なpAPXプローブ
とハイブリダイズする転写産物を検出した結果を、図７
ＢはEtBrを用いて可視化した変化しないコントロールで
ある25S rRNAを検出した結果を、それぞれ示す。図７に
示す様に、野生型植物体はpAPXプローブとハイブリダイ
ズする転写産物を含有しないが、全ての形質転換系統は
多量のpAPX転写産物を含んでいた。それらの中で、pAPX
1, pAPX2及びpAPX3 は高いレベルを有していたが、一方
pAPX5 及びpAPX7 は比較的低いレベルであった。pAPX8
においては、pAPXの発現は非常に低かった。
【００２７】３週齢の植物を熱ストレスに曝した時、全
ての形質転換系統は野生株と比較して、高熱ストレスに
耐性を示す傾向を示した。図８に、３週齢のシロイヌナ
ズナを37℃の熱ストレスに５日間曝して、更に５日間通
常の条件に移した植物体につき、全葉のうち緑色部分の
パーセンテージを評価した結果を示す。pAPX5 及びpAPX
1 系統において、全体に占める緑色部分のパーセンテー
ジは、野生株と比較して有意に（5%レベルで）高かった
（図８）。しかしながら、形質転換系統の中では耐暑性
はpAPX転写産物レベルと相関しなかった。なぜならば、
転写産物レベルが低いpAPX5 系統の方が、高い転写産物
レベルを有するpAPX1-3 系統と比較して、高熱ストレス
に対する耐性がより高かった。また図９に、野生型とpA
PXで形質転換した植物体につき、熱ストレスを与えた後
の生育状態の写真を示す。従って、mRNAをそこそこに発
現させた形質転換体が強い耐暑性を示すことが判明し
た。このことは、活性酸素消去系の他の遺伝子産物との
バランスが重要であることを示唆している。図９より、
形質転換したシロイヌナズナは野生株と比較して熱スト
レス後も良い生育を示し、耐暑性が向上していることが
示された。
ての形質転換系統は野生株と比較して、高熱ストレスに
耐性を示す傾向を示した。図８に、３週齢のシロイヌナ
ズナを37℃の熱ストレスに５日間曝して、更に５日間通
常の条件に移した植物体につき、全葉のうち緑色部分の
パーセンテージを評価した結果を示す。pAPX5 及びpAPX
1 系統において、全体に占める緑色部分のパーセンテー
ジは、野生株と比較して有意に（5%レベルで）高かった
（図８）。しかしながら、形質転換系統の中では耐暑性
はpAPX転写産物レベルと相関しなかった。なぜならば、
転写産物レベルが低いpAPX5 系統の方が、高い転写産物
レベルを有するpAPX1-3 系統と比較して、高熱ストレス
に対する耐性がより高かった。また図９に、野生型とpA
PXで形質転換した植物体につき、熱ストレスを与えた後
の生育状態の写真を示す。従って、mRNAをそこそこに発
現させた形質転換体が強い耐暑性を示すことが判明し
た。このことは、活性酸素消去系の他の遺伝子産物との
バランスが重要であることを示唆している。図９より、
形質転換したシロイヌナズナは野生株と比較して熱スト
レス後も良い生育を示し、耐暑性が向上していることが
示された。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、熱ストレスにより誘導さ
れる新規な遺伝子であるオオムギ由来ペルオキシソーム
結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、及び当
該遺伝子を導入することにより得られた耐暑性を付与し
た形質転換植物が与えられた。本発明の方法は、植物に
耐暑性を付与するための新たな手段を与えるものであ
る。
れる新規な遺伝子であるオオムギ由来ペルオキシソーム
結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、及び当
該遺伝子を導入することにより得られた耐暑性を付与し
た形質転換植物が与えられた。本発明の方法は、植物に
耐暑性を付与するための新たな手段を与えるものであ
る。
【００２９】
【配列表】 ＜１１０＞出願人氏名：名古屋大学長 ＜１２０＞発明の名称：熱ストレスにより誘導されるペルオキシソーム結合型ア ルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、耐暑性を付与した形質転換植物 ＜１６０＞配列の数：２ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：２９１ ＜２１２＞配列の型：アミノ酸 ＜２１３＞起源：オオムギ葉由来ペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオ キシダーゼ ＜４００＞配列 MAAPVVDAEY LRQVDRARRA FRALIASKGC APIMLRLAWH DAGTYDVNTR TGGANGSIRY 60 EEEYTHGSNA GLKIAIDLLE PIKAKHPKIT YADLHQLAGV VAVEVTGGPT VEFIPGRRDS 120 SVCPREGRLP DAKKGAPHLR DIFYRMGLTD KDIVALSGGH SLGKAHPERS GFDGAWTRDP 180 LKFDNSYFLE LLKGESEGLL KLPTDKALLD DPEFRRYVEL YAKDEDVFFK DYAESHKKLS 240 ELGFTPRSSG PASTKSDVST AVVLAQSAVG VAVAAAVVIA GYLYEASKRS K 291 ＜２１０＞配列番号：２ ＜２１１＞配列の長さ：１０８９ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：オオムギ葉由来ペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオ キシダーゼ ＜４００＞配列 CTTCTAGGGT CGTCCGCGAT GGCGGCTCCG GTGGTGGACG CCGAGTACCT GCGCCAGGTC 60 GACAGGGCGC GCCGCGCCTT CCGTGCCCTC ATCGCCTCCA AGGGATGCGC CCCCATCATG 120 CTCCGCCTCG CATGGCATGA TGCTGGCACC TATGATGTGA ACACAAGAAC TGGTGGTGCA 180 AATGGTTCAA TTAGATACGA GGAAGAGTAC ACCCATGGTT CAAATGCTGG CTTAAAAATT 240 GCTATTGATC TCCTTGAGCC TATTAAAGCG AAGCATCCAA AGATTACATA TGCAGACCTT 300 CATCAGCTTG CCGGAGTAGT TGCAGTTGAA GTCACCGGGG GTCCAACCGT TGAGTTCATC 360 CCTGGAAGAC GTGATTCGTC AGTTTGTCCC CGTGAAGGAC GCCTTCCTGA TGCTAAGAAA 420 GGTGCACCAC ATCTAAGGGA CATCTTTTAT CGAATGGGGT TAACAGACAA AGATATTGTA 480 GCACTATCTG GGGGGCACAG CCTGGGAAAG GCGCATCCTG AAAGGTCTGG GTTTGACGGT 540 GCATGGACTC GTGACCCTCT GAAATTTGAC AACTCATACT TTCTTGAGCT ACTGAAGGGG 600 GAATCTGAGG GTCTTCTGAA GCTCCCTACT GATAAGGCAT TGTTGGATGA TCCTGAATTT 660 CGACGCTATG TGGAGCTTTA TGCAAAGGAT GAGGATGTTT TCTTCAAGGA CTACGCTGAA 720 TCACACAAAA AACTTTCTGA ACTTGGCTTC ACACCACGGA GCAGTGGCCC AGCATCTACA 780 AAATCAGATG TTTCAACTGC TGTTGTACTT GCACAGAGTG CAGTCGGGGT AGCAGTTGCT 840 GCAGCTGTAG TTATCGCGGG CTACCTGTAC GAAGCTTCCA AGAGGAGCAA GTAAGGGGTT 900 CGTGAGTTCT TGGATGACAT TCCCTTATTT AGTAAGTATC AAGTTATTAT TCTAAAAAAA 960 TAAGTGCCAA GTGCAAATAA CAGAACTCTA GTGATGAACA ACCAACAGTA GTCTCAAAAT 1020 ATTTCATACA TTCTTGAGGA CATCTCCTTC ATATATATAC ATCATACTTG AATAAAAAAA 1080 AAAAAAAAA 1089
【図１】 図１は、シロイヌナズナの形質転換のために
構築されたオオムギ由来pAPX過剰発現ベクターの模式図
である。
構築されたオオムギ由来pAPX過剰発現ベクターの模式図
である。
【図２】 図２は、オオムギ由来ペルオキシソーム結合
型アルコルビン酸ペルオキシダーゼの塩基配列及びアミ
ノ酸配列を示す図である。
型アルコルビン酸ペルオキシダーゼの塩基配列及びアミ
ノ酸配列を示す図である。
【図３】 図３は、オオムギ由来ペルオキシソーム結合
型アルコルビン酸ペルオキシダーゼのアミノ酸配列をワ
タ、シロイヌナズナの配列と比較した図である。
型アルコルビン酸ペルオキシダーゼのアミノ酸配列をワ
タ、シロイヌナズナの配列と比較した図である。
【図４】 図４は、オオムギ由来ペルオキシソーム結合
型アルコルビン酸ペルオキシダーゼを、オオムギpAPX特
異的DNA 配列をプローブとして用いて、サザンブロット
により検出した図である。
型アルコルビン酸ペルオキシダーゼを、オオムギpAPX特
異的DNA 配列をプローブとして用いて、サザンブロット
により検出した図である。
【図５】 図５は、オオムギ緑葉における熱ストレス及
び他の種々のストレス処理によるpAPX遺伝子の誘導を、
オオムギpAPX特異的DNA 配列をプローブとして用いて、
ノザンブロットにより検出した図である。
び他の種々のストレス処理によるpAPX遺伝子の誘導を、
オオムギpAPX特異的DNA 配列をプローブとして用いて、
ノザンブロットにより検出した図である。
【図６】 図６は、野生株及び形質転換植物につき、オ
オムギ由来pAPX遺伝子の存在をPCR で解析した図であ
る。
オムギ由来pAPX遺伝子の存在をPCR で解析した図であ
る。
【図７】 図７は、野生型及びオオムギ由来pAPX遺伝子
を過剰発現した形質転換植物のT2世代につき、ノザンブ
ロット解析を行った図である。
を過剰発現した形質転換植物のT2世代につき、ノザンブ
ロット解析を行った図である。
【図８】 図８は、野生型及びpAPXで形質転換した植物
体につき、全葉の中における緑色の部分の新鮮重量によ
り耐暑性を比較したグラフである。
体につき、全葉の中における緑色の部分の新鮮重量によ
り耐暑性を比較したグラフである。
【図９】 図９は、野生型及びpAPXで形質転換した植物
体につき、熱ストレス後の生育を比較した写真である。
体につき、熱ストレス後の生育を比較した写真である。
Claims (5)
- 【請求項１】 オオムギに由来し、以下の（ａ）または
（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、
ペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダー
ゼポリペプチド。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−２
９１で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、ペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシ
ダーゼポリペプチド。 （ｂ）熱ストレスにより発現が誘導され、（ａ）のアミ
ノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された、ペル
オキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼポ
リペプチド。 - 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
る、遺伝子。 - 【請求項３】 オオムギに由来し、以下の（ｃ）または
（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
子。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１０８
９で示される塩基配列からなることを特徴とする、ペル
オキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺
伝子。 （ｄ）熱ストレスにより発現が誘導され、（ｃ）の塩基
配列の一部が欠失、置換若しくは付加された、ペルオキ
シソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝
子。 - 【請求項４】 請求項２又は請求項３記載のペルオキシ
ソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子を
植物に導入することにより、植物に耐暑性を付与する方
法。 - 【請求項５】 請求項２又は請求項３記載のペルオキシ
ソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子を
植物に導入した、形質転換植物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000172850A JP3479678B2 (ja) | 2000-06-09 | 2000-06-09 | 熱ストレスにより誘導されるペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、耐暑性を付与した形質転換植物 |
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| FR0107506A FR2810338B1 (fr) | 2000-06-09 | 2001-06-08 | Ascorbate peroxydase, gene la codant, procede de transgenese l'utilisant et plante transgenique obtenue par ce procede |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2000172850A JP3479678B2 (ja) | 2000-06-09 | 2000-06-09 | 熱ストレスにより誘導されるペルオキシソーム結合型アルコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子、耐暑性を付与した形質転換植物 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN112779234A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-05-11 | 国际竹藤中心 | 毛竹PeAPX5基因及应用 |
| CN113046371A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-29 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种烟草过氧化物酶相关的基因及其应用 |
| CN116814658A (zh) * | 2023-05-24 | 2023-09-29 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种与耐盐碱胁迫相关的抗坏血酸过氧化物酶基因及其用途 |
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2001
- 2001-06-01 US US09/870,501 patent/US6812338B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-08 FR FR0107506A patent/FR2810338B1/fr not_active Expired - Fee Related
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