KR20190044866A

KR20190044866A - 벼 흰잎마름병균에 의한 프로모터 인식부위 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190044866A
Application number: KR1020170137337A
Authority: KR
Inventors: 황덕주; 최창현; 안일평; 박상렬; 배신철
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2019-05-02
Also published as: KR102000454B1

Abstract

본 발명은 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Xoo))에 의한 프로모터 인식부위 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와 결합하는, OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편, 상기 OsbZIP73 프로모터 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터, 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 이용한 벼 흰잎마름병 저항성 식물체 선별 방법, 특정 염기가 변이된 상기 OsbZIP73 프로모터 단편을 포함하는 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자와 결합하는 OsbZIP73 프로모터 단편, 즉, 벼 흰잎마름병균에 의한 프로모터 인식부위를 결실(deletion), 삽입(insertion) 또는 치환(substitution) 등의 변이(mutation)를 통해, 벼 흰잎마름병 저항성 작물을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자와 결합하는 OsbZIP73 프로모터 단편을 이용하여 벼 흰잎마름병 저항성 작물을 선별하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

벼 흰잎마름병균에 의한 프로모터 인식부위 및 이의 용도{Promoter recognition site by Xanthomonas oryzae pv. oryzae and uses thereof}

본 발명은 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Xoo))에 의한 프로모터 인식부위 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와 결합하는, OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편, 상기 OsbZIP73 프로모터 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터, 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 이용한 벼 흰잎마름병 저항성 식물체 선별 방법, 특정 염기가 변이된 상기 OsbZIP73 프로모터 단편을 포함하는 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체에 관한 것이다.

식물은 병원체의 공격에 대한 인식이나 내부 면역반응을 활성화시키는데 있어 복잡한 기작을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 식물과 병원체는 각기 적응성과 감염성의 관계를 통해 공진화(coevolution)를 해왔다. 이러한 현상은 병원체와 기주식물의 공격과 방어가 비 병원성 유전자(avr 유전자)와 저항성 유전자(R 유전자) 간의 관계로 나타난다. 병원체는 감염을 통한 기주식물체 내에서의 성공적인 증식과 효율적인 기생을 위해 식물의 이중 방어체계를 무너뜨려야 한다. 1차 방어시스템을 통해 식물은 기본 방어체계를 유도하는 PRRs(Patterns recognition receptors)를 사용하여 병원균의 MAMP(Microbe-associated molecular patterns)를 인식한다. 그러나 이런 1차 방어 체계는 분비성 이펙터에 의해 붕괴되며, 이후 이 분비성 이펙터는 식물 내부의 R 단백질에 의해 인식되어진다. 식물의 병저항성 유전자인 R 유전자는 주로 수용체 단백질을 암호화하고 있으며 박테리아의 감염성 Avr 유전자 산물인 분비성 단백질(effector)과 직접 또는 간접적으로 결합한다.

일반적으로 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)에 의하여 야기되는 벼(Oryza sativa L.) 흰잎마름병은 대부분의 벼 생산국 특히 적도 지역에 심각한 손해를 야기한다. 벼 흰잎마름병(bacterial blight)은 그람 음성 간균인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Xoo)에 의해 발생하는 벼의 주요 병해 중 하나이며, 벼 잎의 수공과 상처를 통해 침입하여 도관을 따라 증식한다. 벼 흰잎마름병균(Xoo)은 T3SS(Type Ⅲ Secretion System)을 통해 TAL 이펙터(transcription activator-like effector)를 포함한 많은 이펙터(effector) 단백질을 분출한다(Annu Rev Microbiol ., 54:735-774, 2000; Biochim Biophys Acta ., 1694(1-3):181-206, 2004).

TAL 이펙터(transcription activator-like effector, TALEs)는 식물 세균 병원균의 구조적 및 기능적으로 독특한 종류의 단백질로서, Xanthomonas 속 세균의 대부분에서 발견되는데 각각의 Xanthomonas 균들은 다양한 수의 TAL 이펙터를 가지고 있다. TAL 이펙터는 전사인자로 작용하여 숙주 세포의 특정 유전자 프로모터 부위에 특이적으로 결합하여 그 유전자의 발현을 조절한다. TAL 이펙터와 식물체와의 상호작용은 병원성을 촉진하는 기주의 유전자를 활성화하거나, TAL 이펙터에 대한 방어 기작을 작동하게 한다(Mol Plant Microbe Interact., 13(12):1322-1329, 2000).

TAL 이펙터는 T3SS에 필요한 N 말단과, C 말단에 핵위치신호(nuclear localization signals; NLSs)와 전사인자 특이적 AAD(acid activation domain)를 가진다. TAL 이펙터는 중앙부위가 다른데 주로 33~34개 아미노산 길이의 도메인들이 반복되어 존재하며 특히 도메인들의 12, 13 잔기에서 다형성이 많이 발생하는데 이를 RVD(repeat-variable di-residue)라 한다.

벼 흰잎마름병균(Xoo)의 주요 병원성 요인인 TAL 이펙터 PthXo1에 의한 벼의 Os8N3 유전자의 전사 촉진이 세균의 증식과 흰잎마름병 발병 촉진에 중요한 역할을 하며, TAL 이펙터 AvrXa7에 의해 벼의 Os11N3 유전자를 활성화시켜서 벼가 벼 흰잎마름병균(Xoo)에 대한 감수성이 높아지게 한다는 보고가 있다(Current Opinion in Plant Biology, 13:394-401, 2010). 한국(Nucleic acid research, 33:577-586, 2005), 일본(Jpn Agric Res Q., 39:275-287, 2005), 필리핀(BMC genomics ., 9:204, 2008)에서 분리된 Xoo 균주의 염기서열이 보고되었는데 놀랍게도 Xoo 균주의 TAL 이펙터 RVD 서열이 분리된 나라에 따라 완전히 달랐다. 각 나라 균주의 공진화가 재배되고 있는 벼 품종에 따라 다르게 진행되었기 때문에 한국 균주의 TAL 이펙터연구가 중요하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 벼 흰잎마름병 저항성 작물을 개발하고 저항성 작물을 용이하게 선별하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 벼 흰잎마름병균 한국균주인 KACC10331에 의해 벼 유래 OsbZIP73 유전자가 활성화됨을 확인하고, 이를 기반으로 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279와 특이적으로 결합하는 OsbZIP73 프로모터의 인식부위를 도출함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

Annu Rev Microbiol., 54:735-774, 2000 Biochim Biophys Acta., 1694(1-3):181-206, 2004 Mol Plant Microbe Interact., 13(12):1322-1329, 2000 Current Opinion in Plant Biology, 13:394-401, 2010 Nucleic acid research, 33:577-586, 2005 Jpn Agric Res Q., 39:275-287, 2005 BMC genomics., 9:204, 2008

본 발명의 목적은 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와 결합하는, 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 OsbZIP73 프로모터 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 도입하는 단계; b) 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터가 도입된 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 벼 흰잎마름병균을 감염시키는 단계; 및 c) 벼 흰잎마름병 저항성 품종을 대조군으로 하여 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체의 OsbZIP73 프로모터 활성 정도를 평가하는 단계;를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 식물체 선별 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기가 변이된 OsbZIP73 프로모터 단편을 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와 결합하는, 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편을 제공한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsbZIP73 프로모터 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 도입하는 단계; b) 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터가 도입된 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 벼 흰잎마름병균을 감염시키는 단계; 및 c) 벼 흰잎마름병 저항성 품종을 대조군으로 하여 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체의 OsbZIP73 프로모터 활성 정도를 평가하는 단계;를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 식물체 선별 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기가 변이된 OsbZIP73 프로모터 단편을 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른, 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자와 결합하는 OsbZIP73 프로모터 단편, 즉, 벼 흰잎마름병균에 의한 프로모터 인식부위를 결실(deletion), 삽입(insertion) 또는 치환(substitution) 등의 변이(mutation)를 통해, 벼 흰잎마름병 저항성 작물을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자와 결합하는 OsbZIP73 프로모터 단편을 이용하여 벼 흰잎마름병 저항성 작물을 선별하는데 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 벼 흰잎마름병균 KACC10331에 의한 OsbZIP73 발현 양상을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 탈 이펙터(TAL effector; transcription activator-like effector)로 분리된 Xoo2279의 유전자 염기서열을 나타낸 도이다. 여기에서, 노란색 박스 표시는 반복서열이 시작되기 전 뉴클레오타이드 서열이며, 녹색 박스 표시는 반복서열이 시작되는 뉴클레오타이드 서열이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 탈 이펙터(TAL effector; transcription activator-like effector)로 분리된 Xoo2279의 아미노산 서열을 나타낸 도이다. 여기에서, 노란색 박스 표시는 반복서열 시작 아미노산 서열이며, 녹색 박스 표시는 전사 활성 도메인의 아미노산 서열이다.
도 4는 본 발명의 일시시예에 따라 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 탈 이펙터(TAL effector) Xoo2279의 DNA 결합 부위인 RVD(repeat variable diresidues) 서열을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 탈 이펙터(TAL effector) Xoo2279의 식물 형질전환용 벡터 지도를 개략적으로 나타낸 도이다. 여기에서, P35S는 Cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promoter이고, DsRed::His는 Discosoma sp. red fluorescent protein::6×histidine이며, Tnos는 nopaline synthase terminator이고, Bar는 bialaphos resistance gene이며, T35S는 CaMV 35S terminator이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 분리된 OsbZIP73 프로모터(Oryza sativa basic-leucine zipper 73 promoter)의 염기서열(서열번호 13)을 나타낸 도이다. 여기에서, 빨간색 표시 부위는 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 탈 이펙터(TAL effector) Xoo2279와의 결합 부위를 추정하여 표시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 OsbZIP73 프로모터를 분리하여 제작한 pOsbZIP73::GFP-GUS 리포터 벡터 지도를 개략적으로 나타낸 도이다. 여기에서, pOsbZIP73은 1.0 kb의 Oryza sativa basic-leucine zipper 73 promoter 영역이고, GFP는 Green Fluorescent Protein이며, GUS는 Beta-glucuronidase reporter gene이고, P35S는 Cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promoter이며, Bar는 bialaphos resistance gene이고, T35S는 CaMV 35S terminator이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 TAL 이펙터 Xoo2279와 OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE(effector binding element) 영역의 결합에 따른 OsbZIP73 프로모터의 활성을 검정한 promoter transient assay 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Xoo))에 의한 프로모터 인식부위 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와 결합하는, OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편, 상기 OsbZIP73 프로모터 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터, 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 이용한 벼 흰잎마름병 저항성 식물체 선별 방법, 특정 염기가 변이된 상기 OsbZIP73 프로모터 단편을 포함하는 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와 결합하는, 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편을 제공한다.

본 발명에서 용어 "벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)"은 그람음성세균으로, 벼에만 병원성이 있는 기주특이적 특성을 가진 병원균이다. 벼에 감염하여 흰잎마름병(Bacterial Blight, BB)을 일으키며, 벼 잎의 수공과 상처를 통해 침입하여 도관을 따라 증식한다. 벼 흰잎마름병균은 T3SS(type Ⅲ secretion system)을 통해 TAL 이펙터(Transcription activator-like effector, TALE)를 포함한 많은 이펙터(effector) 단백질을 분출한다.

본 발명에 있어서, 상기 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)은 한국균주 KACC10331으로, 15개의 이펙터 단백질을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "TAL 이펙터(Transcription activator-like effector, TALE)"는 식물 세균 병원균의 구조적 및 기능적으로 독특한 종류의 단백질로서, Xanthomonas 속 세균의 대부분에서 발견되는데 각각의 Xanthomonas 균들은 다양한 수의 TAL 이펙터를 가지고 있다. TAL 이펙터는 T3SS(type Ⅲ secretion system)에 필요한 N 말단과, C 말단에 핵위치신호(nuclear localization signals; NLSs)와 전사인자 특이적 AAD(acid activation domain)를 가지며, T3SS을 통해 식물 세포 내로 주입된다. 식물 세포 내에서 핵으로 이동하여 TAL 이펙터 특이적 DNA 서열에 결합하여 하위 유전자의 발현에 관여하며, 식물체와의 상호작용은 병원성을 촉진하는 기주의 유전자를 활성화하거나, TAL 이펙터에 대한 방어기작을 작동하게 한다.

본 발명에서 용어 "TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279)"는 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) KACC10331 유래 TAL 이펙터로, TALE 2로도 알려져 있으며, MLA6 protein, Cationic peroxidase 1, OsbZIP30, OsbZIP67과 같은 전사체(transcript)를 유도한다.

TALE 2는 NI H* NI NN NN NN NN NN HD NI NS HG HD NI N* NS NI NI HD N* NS NI N* 23개의 RVD(repeat variable dinucleotide)로 이루어져 있으며, 'RVD 서열'은 TAL 이펙터 결합 도메인 내에서의 RVD의 연속적인 서열로 이해되며, 이 경우 이 서열은 달리 명시되지 않는 한, N-C-방향으로, 즉 N-말단으로부터 C-말단까지로 명시되어 있다.

본 발명에서 용어 "OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73)"은 식물의 성장과 발달, 스트레스 반응을 조절하는 ABRE(abscisic acid(ABA)-responsive element)/ABF(ABRE binding factor) 패밀리(family)에 속하는 벼 유래 전사인자 유전자이다.

본 발명에서 용어 "프로모터(promoter)"는 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향과 관련하여 상류(5')에 위치하고(전사 개시점을 서열의 위치 +1로 나타내고, 그와 관련하여 상류에 있는 임의의 뉴클레오티드는 음수를 사용하여 나타낸다), DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위, 전사 인자 결합 부위, 억제 인자 및 활성 인자 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터 전사량을 직접 또는 간접적으로 조절하는 작용을 하는 것으로 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 다른 DNA 도메인(cis-acting 서열)의 존재에 의해 구조적으로 동정되는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 단편을 나타낸다. 전사 개시점(+1) 상류에 있는 진핵생물의 시스 작용 서열의 일 예로는 TATA 박스, CAAT 박스, 5' 인핸서 또는 침묵 인자 요소 등을 포함한다.

본 발명에서 용어 "OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter)"는 벼 유래 전사인자 OsbZIP73 유전자 프로모터로, 서열번호 13의 염기서열로 이루어지며, 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331에 의해 활성화되는 유도성 프로모터이다.

상기 "유도성 프로모터"는 생리학적으로(예를 들면, 특정 화합물의 외적 작용) 또는 발생학적으로 조절되는 프로모터를 의미한다.

본 발명에서 용어 "OsbZIP73 프로모터 단편"은 전사조절인자들(transcription factor)이 결합하는 OsbZIP73 프로모터의 일부 영역으로서, 전사인자로서 작용하는 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279와 특이적으로 결합하는 EBE(effector binding element) 영역이다. OsbZIP73 프로모터 단편은 OsbZIP73 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위 (-300) 내지 (-100) 부위에 포함되어 있으며, 'TATAAAAGGCCCTCACCAACCCAT'(서열번호 14)의 염기서열로 이루어진다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331에 의해 OsbZIP73 유전자의 발현이 현저히 증가함을 확인하였으며, OsbZIP73 프로모터의 단편이 벼 흰잎마름병균 KACC10331 유래 TAL 이펙터 Xoo2279와 특이적으로 결합하여 프로모터 활성을 유도함을 확인하였다(도 1 및 도 8).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331에 의해 활성화되는 OsbZIP73 유도성 프로모터를 포함하는 식물용 병원체 유도성 발현 벡터는 통상적인 식물 발현용 벡터의 구성을 포함할 수 있으며, 식물 발현용 벡터에 필수적인 공지 구성 요소를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 식물용 병원체 유도성 발현 벡터는 인핸서, 본 발명의 병원체 유도성 프로모터, 클로닝 부위, 전사종결부, 선별마커를 포함할 수 있다. 또한, 상기 식물용 병원체 유도성 발현 벡터는 통상의 벡터에 프로모터를 본 발명의 프로모터로 치환시킨 것일 수 있으며, 상기 통상의 벡터로는 pUC 계열의 벡터, 예컨대, pBR322, pBI121, pCAMBIA vector 시리즈, Gateway binery vector, Ti-plasmid 등 이에 파생된 벡터일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV), 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일실시예에 따른 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제(α-Amy1 A) 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 동물세포(예컨대, CHO(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol . Biol . 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/ Technol . 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol . Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 표지 유전자는, 이에 제한되지는 않으나, GUS(β-glucuronidase) 일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 형광 단백질은, 이에 제한되지는 않으나, GFP(green fluorescent protein), 루시퍼라아제(luciferase) 또는 CFP(cyan fluorescent protein) 일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터에는, 이에 제한되지는 않으나, 상기 표지 유전자 및 형광 단백질 유전자가 모두 포함되는 것일 수 있으며, 선택적으로 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자가 각각 포함되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터는 'TATAAAAGGCCCTCACCAACCCAT'(서열번호 14)의 염기서열로 이루어진 OsbZIP73 프로모터 단편, 즉, OsbZIP73 프로모터 인식부위를 필수적으로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 OsbZIP73 프로모터 인식부위(서열번호 14)가 포함되어 있는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 OsbZIP73 프로모터를 포함하는 것일 수 있다. 상기 'TATAAAAGGCCCTCACCAACCCAT'(서열번호 14)의 염기서열로 이루어진 OsbZIP73 프로모터 인식부위를 필수적으로 포함하는 한, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터에 포함되는 OsbZIP73 프로모터 유전자는 일부 특정 염기서열로 한정되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 TAL 이펙터(TAL effector) Xoo2279가 포함되어 있는 35S::Xoo2279-DsRed로 명명한 TAL 이펙터 벡터 및 OsbZIP73 유전자 프로모터 영역(서열번호 13; OsbZIP73 프로모터 인식부위(서열번호 14)가 포함되어 있음)이 포함되어 있는 OsbZIP73::GFP-GUS로 명명한 리포터 벡터를 제작하고, 이를 각각 아그로박테리움 LBA4404(Agrobacterium LBA4404)에 도입한 후 배양하여 담배 식물(Nicotiana benthamiana)에 침투(infiltration) 시키고, promoter transient assay를 수행하여 TAL 이펙터 Xoo2279와 OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE(effector binding element) 영역의 결합에 따른 OsbZIP73 프로모터의 활성을 측정, 즉, 표지 유전자인 GUS 유전자의 발색 반응을 관찰한 결과, 벼 흰잎마름병균 KACC10331 유래 TAL 이펙터 Xoo2279와 벼 유래 OsbZIP73 프로모터의 인식부위가 특이적으로 결합하여 활성을 나타냄을 확인하였다(도 5, 도 7 및 도 8).

따라서, 본 발명의 OsbZIP73 유전자 프로모터의 단편(서열번호 14)이 포함되어 있는 OsbZIP73::GFP-GUS로 명명한 리포터 벡터를 이용하여, 타겟 서열로서 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 TAL 이펙터(TAL effector) Xoo2279 유전자 서열을 인식할 경우, 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자의 발현 유무에 따라 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 감염 여부를 판단할 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로모터 활성 분석은, 이에 제한되지는 않으나, 안정된 유전자 발현을 유도하는 아그로박테리움 매개 형질전환 방법 실험을 통한 형질전환 식물체를 만드는 시스템과 아그로박테리움을 활용한 담뱃잎 형질전환(Agroinfiltration)을 이용한 일시적 발현 분석을 통해 빠르고 손쉽게 분석하는 방법을 이용하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움을 활용한 담뱃잎 형질전환(Agroinfiltration)을 이용한 일시적 발현 분석을 통해 프로모터 활성을 분석할 수 있다.

아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 통해 만들어지는 형질전환 식물체는 식물종마다 배양 조건이 각기 달라 비용과 노동력뿐만 아니라 시간도 다소 낭비일 수 있으나, Agroinfiltration 방법을 이용한 일시적 발현 시스템은 보다 노동력이 절감되며, 그에 따른 비용 절감과 더불어 분석하는 데에 있어 시간 절약도 꾀할 수 있다. 또한 담배, 애기장대뿐만 아니라 토마토 등 다양한 식물 종에 이용이 가능하며, agroinfiltration 방법을 통해 특정 유전자의 발현뿐만 아니라 프로모터 활성 증명 실험도 보다 경제적으로 수행될 수 있다(Yang et al. (2000) The Plant J. 22(6): 543-551).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 도입하는 단계; b) 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터가 도입된 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)을 감염시키는 단계; 및 c) 벼 흰잎마름병 저항성 품종을 대조군으로 하여 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체의 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 활성 정도를 평가하는 단계;를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 식물체 선별 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터는 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73 프로모터 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 전술한 바와 같다.

본 발명의 일실시예에 있어서, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터는 타겟 서열로서 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열과 특이적으로 결합하는 OsbZIP73 유전자 프로모터의 단편(서열번호 14)이 포함되어 있는, OsbZIP73의 개시코돈으로부터 약 1.0 kb의 프로모터(서열번호 13)를 분리, 도입하여 OsbZIP73::GFP-GUS로 명명한 재조합 벡터를 제조하였다(도 7).

상기 단계 a)에서 벼 흰잎마름병 저항성 품종은, 이에 제한되지는 않으나, 종래 벼 흰잎마름병 저항성 품종인 수안벼, 수려진미, 신백벼, 만백, 안백, 수진벼, 또는 일미벼일 수 있다.

상기 단계 a)에서 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 도입하는 방법은, 이에 제한되지는 않으나, 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

상기 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미한다.

상기 단계 b)에서 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 감염시키는 상기 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)은, 이에 제한되지는 않으나, 벼 흰잎마름병균 KACC10331 균주일 수 있으며, 상기 벼 흰잎마름병균 KACC10331 균주는 TALE 2로도 알려져 있는 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 단백질을 분출한다.

한편, 상기 단계 a)에서 도입된 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73 프로모터 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터와, 상기 단계 b)에서 감염시킨 벼 흰잎마름병균 KACC10331 유래의 TAL 이펙터 Xoo2279와의 상호작용, 즉 OsbZIP73 프로모터 단편과 TAL 이펙터 Xoo2279와의 특이적 결합을 통한 전사촉진활성에 의해 표지 유전자 또는 형광 단백질의 발현이 유도된다.

이에 따라, 상기 단계 c)에서 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터 활성 정도 평가는, 벼 흰잎마름병 저항성 품종을 대조군으로 하여 표지 유전자 또는 형광 단백질의 발현 정도, 즉 발색 반응 정도 또는 형광 세기에 따라 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체의 벼 흰잎마름병균에 대한 저항성 정도를 판단하여 벼 흰잎마름병 저항성 식물체를 선별할 수 있다. 예컨대, 발색 반응 정도 또는 형광 세기가 벼 흰잎마름병 저항성 품종과 유사한 경우, 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체를 벼 흰잎마름병 저항성 품종인 것으로 판단, 선별할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기가 변이된 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편을 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

상기 "OsbZIP73 프로모터 단편"은 전술한 바와 같이, 전사조절인자들(transcription factor)이 결합하는 OsbZIP73 프로모터의 일부 영역으로서, 전사인자로서 작용하는 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279와 특이적으로 결합하는 EBE(effector binding element) 영역이며, OsbZIP73 프로모터 단편은 OsbZIP73 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위 (-300) 내지 (-100) 부위에 포함되어 있고, 'TATAAAAGGCCCTCACCAACCCAT'(서열번호 14)의 염기서열로 이루어진다.

본 발명에서 용어 "특정 염기가 변이된"은, 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73 프로모터 단편의 염기서열 내에서 특정 염기가 결실(deletion), 삽입(insertion) 또는 치환(substitution) 된 것일 수 있다. 한편, 상기 "변이"는 서열번호 14의 염기서열 내에서 TATA 박스(TATAAA)는 변이되지 않은 것일 수 있다.

상기 "재조합 벡터"는 전술한 바와 같으며, 본 발명에 따른 서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기가 변이된 OsbZIP73 프로모터 단편을 포함하는 재조합 벡터는, 상기 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73 프로모터 단편의 염기서열 내에서 특정 염기의 변이에 의해, OsbZIP73 프로모터 단편, 즉, OsOsbZIP73 프로모터 인식부위와 벼 흰잎마름병균의 TAL 이펙터 Xoo2279와의 결합이 저해 또는 차단될 수 있다. 이에 따라, 벼 흰잎마름병균에 의해 유도되는 OsbZIP73 프로모터의 전사활성이 저해되고, 벼 흰잎마름병균에 대한 식물체의 저항성을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자가 포함되어 있는 이펙터 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 배양한 세균 배양액과 변이형(mutant)의 OsbZIP73 프로모터 영역(서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기 변이(밑줄 표시); TATAAAAGGATTGTGCCAACCCAT)이 포함되어 있는 리포터 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 배양한 세균 배양액을 1:1로 섞어서 침투시킨 담배 식물을 이용하여, TAL 이펙터 Xoo2279와 OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE(effector binding element) 영역의 결합에 따른 OsbZIP73 프로모터의 활성을 promoter transient assay를 수행하여 측정한 결과, 활성이 전혀 확인되지 않았다(도 8).

이에 따라, 상기 OsbZIP73 프로모터의 인식부위 변이를 통해 TAL 이펙터 Xoo2279와 OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE 영역의 결합이 차단됨을 알 수 있었으며, 벼 흰잎마름병균 KACC10331 유래 TAL 이펙터 Xoo2279와 특이적으로 결합하는 OsbZIP73 프로모터의 인식부위를 변이(mutation)시켜 TAL 이펙터와 식물체와의 상호작용을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기가 변이된 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편을 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 "서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기가 변이된 OsbZIP73 프로모터 단편을 포함하는 재조합 벡터"는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 식물의 숙주세포 내에 도입하고자 하는 이종 유전자를 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하고 통합시켜, 유전적으로 안정한 유전을 생성시키는 것을 지칭하며, "형질전환 식물체"는 상기 이종 유전자가 도입 및 유전적으로 안정하게 통합되어 원하는 표현형을 얻게 된 식물체를 의미한다.

형질전환 식물체를 생산하는 것과 관련하여, 식물의 유전공학 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍떡잎 식물 뿐만 아니라 외떡잎 식물에 대한 생물학적 및 생리적 형질전환 프로토콜을 포함한, 식물 형질전환을 위한 수많은 방법이 개발되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999)]; [Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)]). 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환, 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법은, 예를 들어 다음 문헌에서 이용 가능하다 [Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)].

예를 들어, 원하는 유전자를 식물 숙주세포 내로 형질전환시키기 위한 다수의 기술이 이용 가능하다. 이들 기술은 형질전환 작용제로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스를 사용하여 비-아암 T-DNA로 형질전환시키는 것, 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법(예를 들어, 소노포레이션), 리포솜 형질전환, 미세주사, 있는 그대로의 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터, 바이오리스틱스(극미립자 충격), 탄화규소 WHISKERS 매개된 형질전환, 에어로솔 비밍, 또는 PEG 형질전환뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류일 수 있으며, 바람직하게는 벼일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼 흰잎마름병균 KACC10331에 의한 OsbZIP73 발현 양상 분석

일미벼 종자를 3일간 발아시켜, 파종 후 3주가 된 벼를 온실에 확보하였다. 또한, 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331(한국농업미생물자원센터; http://kacc.rda.go.kr)을 PSA 배지(1.0% bacto-peptone, 1.0% sucrose, 0.1% monosodium glutamate, 1.5% agar)에서 2일간 배양하고 10mM MgCl₂에 현탁시켜 OD₆₀₀에서 0.5로 조정한 뒤 벼에 이쑤시개로 접종하였다. 이후 벼 잎으로부터 총(total) RNA를 트리졸 시약 키트(Trizol reagent kit)(Invitrogen, 미국)를 이용하여 분리하고, 올리고 dT 프라이머(oligo dT primer)와 MMLV 역전사효소(reverse transcriptase)(Promega, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. OsbZIP73 qRT-PCR(Quantitative real-time PCR) 프라이머-F(5'-tcccactaccacagcaacat-3'; 서열번호 1) 및 OsbZIP73 qRT-PCR 프라미어-R(5'-catctggtaggcgtcatctg-3'; 서열번호 2), 대조군인 액틴(actin)에 대한 Osactin qRT-PCR 프라이머-F(5'-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3'; 서열번호 3) 및 Osactin qRT-PCR 프라이머-R(5'-ATCCAACCGGAGGATAGCATG-3'; 서열번호 4)를 사용하는 qPCR을 MyIQ(BioRad, 미국)를 이용하여 수행하였다.

qRT-PCR을 수행하여 벼 흰잎마름병균 KACC10331에 의해 벼에서 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73)의 발현 양상을 분석해 본 결과, 하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 벼 흰잎마름병균 KACC10331 접종 3시간째, OsbZIP73의 발현이 유도되어 현저히 증가한 것을 확인하였다.

OsbZIP73 발현 분석용 프라이머 세트

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 방향	서열(5'→3')
1	OsbZIP73 qRT-PCR-F	정방향	5'-aaaaagcaggcttgATGGCGGCGGCGGCGTTG-3'
2	OsbZIP73 qRT-PCR-R	역방향	5'-agaaagctgggtaGCTTGAAGTGCATCCTAC-3'
3	Osactin qRT-PCR-F	정방향	5'-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3'
4	Osactin qRT-PCR-R	역방향	5'-ATCCAACCGGAGGATAGCATG-3'

상기 결과를 통해, OsbZIP73 프로모터 유전자가 벼 흰잎마름병균에 대해 감수성(susceptibility)을 보임을 알 수 있었다.

실시예 2: OsbZIP73 프로모터 결합 이펙터 탐색 및 분리

상기 실시예 1에서 벼 흰잎마름병균 KACC10331에 의해 벼에서 OsbZIP73의 발현이 증가함을 확인하였다.

이에, OsbZIP73의 발현을 증가시키는 이펙터(effectors)를 탐색하고자, 웹프로그램(https://tale-nt.cac.cornell.edu) TAL effector nucleotide targeter 2.0을 이용하여 도출하였다.

그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 한국에서 분리된 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 TAL 이펙터(TAL effector; transcription activator-like effector)들 중에서 Xoo2279가 OsbZIP73 프로모터와 결합할 가능성이 있음을 확인하였다.

TAL effector	score	effector binding element sequence	서열번호
Xoo2279	15.94	TATAAAAGGCCCTCACCAACCCAT	14

상기 결과를 통해, 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331 유래의 TAL 이펙터 Xoo2279에 대해 벼 유래 OsbZIP73 프로모터의 EBE(effector binding element) 영역이 특이적으로 결합하여 벼 흰잎마름병을 조절할 가능성이 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: TAL 이펙터 Xoo2279에 대한 인식부위를 포함한 OsbZIP73 프로모터의 활성 검정

상기 실시예 1에서 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331에 의해 OsbZIP73 프로모터의 발현이 현저히 증가함을 확인하였으며, 상기 실시예 2에서는 상기 OsbZIP73 프로모터의 EBE(effector binding element) 영역과 TAL 이펙터 Xoo2279가 결합할 가능성이 있음을 확인하였다.

이에, 벼 흰잎마름병균 KACC10331 유래 TAL 이펙터 Xoo2279와, OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE(effector binding element) 영역이 특이적으로 결합하여 벼 흰잎마름병을 조절할 수 있는지 확인하고자 하였다.

이를 위해, TAL 이펙터 Xoo2279를 분리하여 식물 형질전환용 발현 벡터 35S::Xoo2279-DsRed를 제작하고, OsbZIP73 프로모터의 EBE(effector binding element) 영역이 포함되어 있는 OsbZIP73 프로모터를 분리하여 pOsbZIP73::GFP-GUS 리포터 벡터를 제작하였다. 상기 제작한 벡터를 이용하여 promoter transient assay를 수행하고, 이를 통해 TAL 이펙터 Xoo2279와 OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE(effector binding element) 영역의 결합에 따른 OsbZIP73 프로모터 활성을 검정하였다.

실시예 3-1: TAL 이펙터 Xoo2279 분리 및 식물 발현용 벡터 작성

벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하여 BamHI으로 절단한 후 2~4kb 영역을 분리하여 pBluscript로 클로닝(cloning)하였다. 이후, 염기서열결정에 의해 Xoo2279임을 확인하였다. 이때, BamHI 단편(fragment)은 C-말단 도메인(C-terminal domain)이 결실되어 있으므로, 하기 표 3의 프라이머 세트(서열번호 5 및 서열번호 6)를 이용한 게놈 PCR(genomic Polymerase Chain Reaction)에 의해 형성된 PCR 증폭 산물(PCR product)을 BamHI 사이트(site)를 이용하여 도입하였다.

염기서열결정에 의해 확인된 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 TAL 이펙터(TAL effector; transcription activator-like effector) Xoo2279의 유전자 염기서열(서열번호 11) 및 아미노산 서열(서열번호 12)은 하기 도 2 및 도 3에 나타내었다.

한편, 벼 흰잎마름병균 KACC10331의 TAL 이펙터(TAL effector) Xoo2279의 DNA 결합 부위인 RVD(repeat variable diresidue) 서열은 하기 도 4에 나타내었다.

식물 발현용 벡터 작성을 위해, EcoRV와 SacI으로 절단하여 pCambia3300의 SmaI과 SacI 사이트(site)에 결합하여 중간벡터를 만들고, Xoo2279의 SacI 절단에 의해 C-말단(C-terminal) 부분을 얻어 중간벡터 SacI 사이트(site)로 도입하여 최종적으로 35S::Xoo2279-DsRed로 명명한 TAL 이펙터 Xoo2279의 식물 형질전환용 발현 벡터를 제작하였다(도 5).

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 방향	서열(5'→3')
5	Xoo2279 C genomic PCR-F	정방향	5'-aggcgtctttgcatgcattcgccgattcgct-3'
6	Xoo2279 C genomic PCR-R	역방향	5'-tcagatcgtccctccgactgagcctgact-3'

실시예 3-2: OsbZIP73 프로모터 분리 및 리포터 벡터 작성

게이트웨이(Gateway) 클로닝 방법에 따라, OsbZIP73(Os09g29820)의 개시코돈으로부터 약 1.0 kb의 프로모터(서열번호 13 및 도 6)를 분리하여 pOsbZIP73::GFP-GUS로 명명한 리포터 벡터를 제작하였다. 한편, 대조군으로서 변이형(mutant) OsbZIP73 프로모터 영역(서열번호 14)이 포함되어 있는 리포터 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 하기 표 4의 OsbZIP73 promoter 프라이머-F(5'-aaaaagcaggctCCACAATTAGGAATTGCAGG-3'; 서열번호 7) 및 OsbZIP73 promoter 프라이머-R(5'-agaaagctgggtAGGCTGTTTTCGCTTGCTTAG-3'; 서열번호 8)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 95℃에서 변성(denaturation)시키고, 어닐링(annealing) 및 연장(extension)은 각각 57℃ 및 72℃로 30회(cycle) 수행하는 조건으로 하였다.

PCR을 통해 증폭된 PCR 산물은 하기 표 4의 attB1 프라이머-F(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'; 서열번호 9)와 attB2 프라이머-R(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'; 서열번호 10)을 사용하여 PCR 과정을 반복하였다. attB1과 attB2 어뎁터 프라이머가 부착된 프로모터(promoter) 벡터용 OsbZIP73 PCR 산물들은 BP 재조합 반응(BP clonase reaction)을 통해 pDNOR221 벡터로 클로닝하여 엔트리 클론(Entry clone)을 제조하였다. 상기 엔트리 클론으로부터 식물 프로모터 클로닝 목적(destination) 벡터인 pBGWFS7에 LR 반응((LR clonase reaction)에 의해 식물 프로모터 활성 검정용 pOsbZIP73::GFP-GUS 리포터 벡터를 최종적으로 제작하였다(도 7).

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 방향	서열(5'→3')
7	OsbZIP73 promoter primer-F	정방향	5'-aaaaagcaggctCCACAATTAGGAATTGCAGG-3'
8	OsbZIP73 promoter primer-R	역방향	5'-agaaagctgggtAGGCTGTTTTCGCTTGCTTAG-3'
9	AttB1 primer-F	정방향	5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'
10	AttB2 primer-R	역방향	5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'

실시예 3-3: 아그로박테리움을 이용한 OsbZIP73 프로모터 활성 측정

상기 실시예 3-1에서 제작한 이펙터 벡터(TAL 이펙터 Xoo2279의 식물 형질전환용 발현 벡터 35S::Xoo2279-DsRed)와 상기 실시예 3-2에서 제작한 리포터 벡터 (OsbZIP73::GFP-GUS)를 아그로박테리움 LBA4404(Agrobacterium LBA4404)에 각각 도입한 후 배양하였다. 상기 각각의 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 배양한 세균 배양액을 1:1로 섞어서 6주 이상 키운 담배 식물(Nicotiana benthamiana)에 침투(infiltration) 시켰다. 이후, 24시간째 담배 잎을 수확하여 디스크(disc)로 잘라 X-glu(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide)로 염색하고 70% 알코올로 탈색하였다.

한편, 야생형(native)의 OsbZIP73 프로모터 영역(서열번호 13; OsbZIP73 프로모터 인식부위(서열번호 14)가 포함되어 있음)이 포함되어 있는 리포터 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 배양한 세균 배양액만을 침투시킨 담배 식물, 변이형(mutant)의 OsbZIP73 프로모터 영역이 포함되어 있는 리포터 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 배양한 세균 배양액만을 침투시킨 담배 식물, 및 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자가 포함되어 있는 이펙터 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 배양한 세균 배양액과 변이형(mutant)의 OsbZIP73 프로모터 영역이 포함되어 있는 리포터 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 배양한 세균 배양액을 1:1로 섞어서 침투시킨 담배 식물을 대조군으로 사용하였다.

상기 실시예 3-1 및 3-2를 통해 제작한 벡터로 형질전환시킨 아그로박테리움을 이용하여, TAL 이펙터 Xoo2279와 OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE(effector binding element) 영역의 결합에 따른 OsbZIP73 프로모터의 활성을 promoter transient assay를 수행하여 측정한 결과, 하기 도 8에 나타낸 바와 같이, 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331 유래 TAL 이펙터 Xoo2279와 벼 유래 OsbZIP73 프로모터의 인식부위가 특이적으로 결합하여 활성을 나타냄을 확인하였다. 한편, 대조군에서는 활성이 전혀 확인되지 않았다.

상기 결과를 통해, 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) KACC10331 유래 TAL 이펙터 Xoo2279와 벼 유래 OsbZIP73 프로모터의 인식부위가 특이적으로 결합하여, 벼 흰잎마름병균에 대해 OsbZIP73 프로모터가 활성화됨을 알 수 있었으며, 상기 OsbZIP73 프로모터의 인식부위 변이를 통해 TAL 이펙터 Xoo2279와 OsbZIP73 프로모터의 인식부위인 EBE(effector binding element) 영역의 결합이 차단됨을 알 수 있었다.

이에 따라, 벼 흰잎마름병균 KACC10331 유래 TAL 이펙터 Xoo2279와 특이적으로 결합하는 OsbZIP73 프로모터의 인식부위를 변이(mutation)시켜 TAL 이펙터와 식물체와의 상호작용을 조절함으로써, 벼 흰잎마름병 저항성 작물을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, OsbZIP73 프로모터의 인식부위를 이용하여 TAL 이펙터 Xoo2279를 타겟으로 벼 흰잎마름병 저항성 작물 또한 용이하게 선별할 수 있다.

<110> Republic of Korea <120> Promoter recognition site by Xanthomonas oryzae pv. oryzae and uses thereof <130> P17R12C0752 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsbZIP73 qRT-PCR-F <400> 1 aaaaagcagg cttgatggcg gcggcggcgt tg 32 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsbZIP73 qRT-PCR-R <400> 2 agaaagctgg gtagcttgaa gtgcatccta c 31 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osactin qRT-PCR-F <400> 3 atccttgtat gctagcggtc ga 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osactin qRT-PCR-R <400> 4 atccaaccgg aggatagcat g 21 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xoo2279 C genomic PCR-F <400> 5 aggcgtcttt gcatgcattc gccgattcgc t 31 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xoo2279 C genomic PCR-R <400> 6 tcagatcgtc cctccgactg agcctgact 29 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsbZIP73 promoter primer-F <400> 7 aaaaagcagg ctccacaatt aggaattgca gg 32 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsbZIP73 promoter primer-R <400> 8 agaaagctgg gtaggctgtt ttcgcttgct tag 33 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AttB1 primer-F <400> 9 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AttB2 primer-R <400> 10 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 11 <211> 4500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xoo2279 <400> 11 ttgggccggt tttggttttc agggacatcg attcttcaca ccagaaaatt acgacatcga 60 gccctgcggc atgcggtact gggcgctgac ctgcgccatc gcacgggagt ggtcgctgat 120 gatgtccgaa gaacgcaata cgcgctcggc gaccccgcga acgcctactg ccaccaggtc 180 tccgggggcg cgtttgtctc aaggcgcaga aatgatctac ctgcgggacg tactcgaggg 240 ttggcaggga ttcgtataaa aaaacagcca aaagtgggtt cactcgctgt cagcacagaa 300 atttttcaca accttctgcc gatcctccat gcgggtccgg gatcgccttc atgtctgcgc 360 ctcaccctgg tcgtcgaggg ttgccaggat cacccgaagt tgtgtactgc catgcggcct 420 cggaagctat gtagggacca cagaccgcta gtctggaggc aaccatgtaa agaggtatgc 480 ctgatggatc ccattcgttc acgcacgcca agtcctgccc gcgagcttct gcccggcccc 540 caaccggata gggttcagcc gactgcagat cggggggggg ctccgcctgc tggcggcccc 600 ctggatggct tgcccgctcg gcggacgatg tcccggaccc ggctgccatc tccccctgcg 660 ccctcgcctg cgttctcggc gggcagcttc agcgatctgc tccgtcagtt cgatccgtcg 720 cttcttgata catcgcttct tgattcgatg cctgccgtcg gcacgccgca tacagcggct 780 gccccagcag agtgcgatga ggtgcaatcg ggtctgcgtg cagccgatga cccgccaccc 840 accgtgcgtg tcgctgtcac tgccgcgcgg ccgccgcgcg ccaagccggc cccgcgacgg 900 cgtgcggcgc aaccctccga cgcttcgccg gccgcgcagg tggatctacg cacgctcggc 960 tacagtcagc agcagcaaga gaagatcaaa ccgaaggtgc gttcgacagt ggcgcagcac 1020 cacgaggcac tggtgggcca tgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgct cagccaacac 1080 ccggcagcgt tagggaccgt tgctgtcacg tatcaggaca taatcagggc gttgccagag 1140 gcgacacacg aagacatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgccctggag 1200 gccttgctca cggaggcgag ggagttgaga ggtccgccgt tacagttgga cacaggccaa 1260 cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc 1320 aatgcactga cgggtgcccc cctgaacctg accccggacc aagtggtggc catcgccagc 1380 aatattggcg gcaaccaggc gctggagacg gtacagcggc tgttgccggt actgtgccag 1440 gaccatggcc tgaccccgga ccaggtcgtg gccatcgcca gccatggcgg caagcaggcg 1500 ctggagacgg tgcagcggct gttgccggtg ctgtgccagg accatggcct gaccccggac 1560 caggtggtgg ccatcgccag caatattggc ggcaagcagg cgctggagac ggtgcagcgg 1620 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccatggc ctgaccccgg cccaggtggt ggccatcgcc 1680 agcaataacg gcggcaagca ggcgctggag acggtgcagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1740 caggcccatg gcctgacccc ggcccaggtg gtggctatcg ccagcaataa cggcggcaag 1800 caggcgctgg agacggtgca acggctgttg ccggtgctgt gccaggccca tggcctgacc 1860 ccggaccaag tggtggccat cgccaacaat aacggcggca agcaggcgct ggagacggtg 1920 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggac catggcctga gtccggacca ggtggtggcc 1980 atcgccaaca ataacggcgg caagcaggcg ctggagacgc tgcagcggct gttgccggtg 2040 ctgtgccaga cccatgccct gaccccggac caggtggtgg ccatcgccaa caataacggc 2100 ggcaagcagg cgctggagac ggtgcagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggaccatggc 2160 ctgaccccgg accaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 2220 acggtgcagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggaccatg gcctgacccc ggaccaggtg 2280 gtggccatcg ccagcaatat tggcggcaag caggcgctgg agacggtgca gcggctgttg 2340 ccggtgctgt gccaggacca tggcctgacc ccggaccagg tggtggccat cgccagcaat 2400 agtggcggca agcaggcgct ggagacggtg cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggac 2460 catggcctga ccccggccca ggtggtggcc atcgccagcc atggcggcgg caagcaggcg 2520 ctggagacgg tgcagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccatggcct gaccccagac 2580 caggtcgtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtgcagcgg 2640 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccatggc ctgaccccga accaggtggt ggccatcgcc 2700 agcaatattg gcggcaagca ggcgctggag acggtgcaac ggctgttgcc ggtgctgtgc 2760 caggaccatg gcctgacccc ggcccaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggcaagcag 2820 gcgctggaga cggtgcagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggctcatgg cctgaccccg 2880 gaccaagtgg tggccatcgc cagtaatagt ggcggcaagc aggcgctgga gacggtgcag 2940 cggctgttgc cggtgctgtg ccaggaccat ggcctgaccc cgaaccaagt ggtggccatc 3000 gccagcaata ttggcggcaa gcaggcgctg gagacggtgc agcggctgtt gccggtgcta 3060 tgccaggacc atggcctgac cccggaccag gtggtggcca tcgccagcaa tattggcggc 3120 aagcaggcgc tggagacggt gcagcggctg ttgccggtgc tgtgccagga ccatggcctg 3180 accctggacc aggtggtggc catcgccagc cacgatggcg gcaaacaggc gctggagacg 3240 gtgcaacggc tgttgccggt gctgtgccag gcccatggcc tgaccccgta ccaggtggtg 3300 gccatcgcca gcaatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tgcagcggct gttgccggtg 3360 ctgtgccagg cccatggcct gaccccgaac caggtggtgg ccatcgccag caatagtggc 3420 ggcaagcagg cgctggagac ggtgcagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggaccatggc 3480 ctgaccccga accaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gcggcaagca ggcgctggag 3540 acggtgcagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggaccatg gcctgacccc gaaccaggtg 3600 gtggccatcg ccagcaatgg cggcaagcag gcgctggaga gcattgttgc ccagttatct 3660 cgccctgatc cggcgttggc cgcgttgacc aacgaccacc tcgtcgcctt ggcctgcctc 3720 ggcggacgtc ctgccctgga tgcagtgaaa aagggattgc cgcacgcgcc ggaattgatc 3780 agaagaatca atcgccgtat tcccgaacgc acgtcccatc gcgttcccga cctcgcgcac 3840 gtggttcgcg tgcttggttt tttccagagc cactcccacc cagcgcaagc attcgatgac 3900 gccatgacgc agttcgggat gagcaggcac ggcttggtac agctctttcg cagagtgggc 3960 gtcaccgaat tcgaagcccg ctacggaacg ctccccccag cctcgcagcg ttgggaccgt 4020 atcctccagg catcagggat gaaaagggcc aaaccgtccc ctacttcagc tcaaacaccg 4080 gatcaggcgt ctttgcatgc attcgccgat tcgctggagc gtgaccttga tgcgctcagc 4140 ccaatgcacg agggagatca gacgcgggca agcagccgta aacggtcccg atcggatcgt 4200 gctgtcaccg gcccctccgc acagcaatct ttcgaggtgc gcgttcccga acagcgcgat 4260 gcgctgcatt tgcccctcag ctggagggta aaacgcccgc gtaccaggat cgggggcggc 4320 ctcccggatc ctggtacgcc catcgctgcc gacctggcag cgtccagcac cgtgatgtgg 4380 gaacaagatg cggccccctt cgcaggggca gcggatgatt tcccggcatt caacgaagag 4440 gaactcgcat ggttgatgga gctattgcct cagtcaggct cagtcggagg gacgatctga 4500 4500 <210> 12 <211> 1499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xoo2279 amino acid <400> 12 Met Gly Arg Phe Trp Phe Ser Gly Thr Ser Ile Leu His Thr Arg Lys 1 5 10 15 Leu Arg His Arg Ala Leu Arg His Ala Val Leu Gly Ala Asp Leu Arg 20 25 30 His Arg Thr Gly Val Val Ala Asp Asp Val Arg Arg Thr Gln Tyr Ala 35 40 45 Leu Gly Asp Pro Ala Asn Ala Tyr Cys His Gln Val Ser Gly Gly Ala 50 55 60 Phe Val Ser Arg Arg Arg Asn Asp Leu Pro Ala Gly Arg Thr Arg Gly 65 70 75 80 Leu Ala Gly Ile Arg Ile Lys Lys Gln Pro Lys Val Gly Ser Leu Ala 85 90 95 Val Ser Thr Glu Ile Phe His Asn Leu Leu Pro Ile Leu His Ala Gly 100 105 110 Pro Gly Ser Pro Ser Cys Leu Arg Leu Thr Leu Val Val Glu Gly Cys 115 120 125 Gln Asp His Pro Lys Leu Cys Thr Ala Met Arg Pro Arg Lys Leu Cys 130 135 140 Arg Asp His Arg Pro Leu Val Trp Arg Gln Pro Cys Lys Glu Val Cys 145 150 155 160 Leu Met Asp Pro Ile Arg Ser Arg Thr Pro Ser Pro Ala Arg Glu Leu 165 170 175 Leu Pro Gly Pro Gln Pro Asp Arg Val Gln Pro Thr Ala Asp Arg Gly 180 185 190 Gly Ala Pro Pro Ala Gly Gly Pro Leu Asp Gly Leu Pro Ala Arg Arg 195 200 205 Thr Met Ser Arg Thr Arg Leu Pro Ser Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala 210 215 220 Phe Ser Ala Gly Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Gln Phe Asp Pro Ser 225 230 235 240 Leu Leu Asp Thr Ser Leu Leu Asp Ser Met Pro Ala Val Gly Thr Pro 245 250 255 His Thr Ala Ala Ala Pro Ala Glu Cys Asp Glu Val Gln Ser Gly Leu 260 265 270 Arg Ala Ala Asp Asp Pro Pro Pro Thr Val Arg Val Ala Val Thr Ala 275 280 285 Ala Arg Pro Pro Arg Ala Lys Pro Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln 290 295 300 Pro Ser Asp Ala Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly 305 310 315 320 Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr 325 330 335 Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala 340 345 350 His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala 355 360 365 Val Thr Tyr Gln Asp Ile Ile Arg Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu 370 375 380 Asp Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu 385 390 395 400 Ala Leu Leu Thr Glu Ala Arg Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu 405 410 415 Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala 420 425 430 Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu 435 440 445 Asn Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 450 455 460 Asn Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 465 470 475 480 Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Gly 485 490 495 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 500 505 510 Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 515 520 525 Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 530 535 540 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala 545 550 555 560 Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 565 570 575 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala 580 585 590 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 595 600 605 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val 610 615 620 Val Ala Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 625 630 635 640 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Ser Pro Asp 645 650 655 Gln Val Val Ala Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 660 665 670 Thr Leu Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Thr His Ala Leu Thr 675 680 685 Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 690 695 700 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly 705 710 715 720 Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 725 730 735 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp 740 745 750 His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly 755 760 765 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 770 775 780 Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 785 790 795 800 Ser Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 805 810 815 Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala 820 825 830 Ser His Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 835 840 845 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala 850 855 860 Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 865 870 875 880 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asn Gln Val 885 890 895 Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 900 905 910 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala 915 920 925 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 930 935 940 Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 945 950 955 960 Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ser Gly Gly Lys Gln Ala Leu 965 970 975 Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu 980 985 990 Thr Pro Asn Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln 995 1000 1005 Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His 1010 1015 1020 Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 1025 1030 1035 1040 Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 1045 1050 1055 Asp His Gly Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp 1060 1065 1070 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 1075 1080 1085 Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Tyr Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 1090 1095 1100 Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 1105 1110 1115 1120 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asn Gln Val Val Ala Ile Ala 1125 1130 1135 Ser Asn Ser Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 1140 1145 1150 Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asn Gln Val Val Ala 1155 1160 1165 Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 1170 1175 1180 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asn Gln Val 1185 1190 1195 1200 Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val 1205 1210 1215 Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp 1220 1225 1230 His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala 1235 1240 1245 Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro Glu Leu Ile Arg Arg Ile Asn 1250 1255 1260 Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser His Arg Val Pro Asp Leu Ala His 1265 1270 1275 1280 Val Val Arg Val Leu Gly Phe Phe Gln Ser His Ser His Pro Ala Gln 1285 1290 1295 Ala Phe Asp Asp Ala Met Thr Gln Phe Gly Met Ser Arg His Gly Leu 1300 1305 1310 Val Gln Leu Phe Arg Arg Val Gly Val Thr Glu Phe Glu Ala Arg Tyr 1315 1320 1325 Gly Thr Leu Pro Pro Ala Ser Gln Arg Trp Asp Arg Ile Leu Gln Ala 1330 1335 1340 Ser Gly Met Lys Arg Ala Lys Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gln Thr Pro 1345 1350 1355 1360 Asp Gln Ala Ser Leu His Ala Phe Ala Asp Ser Leu Glu Arg Asp Leu 1365 1370 1375 Asp Ala Leu Ser Pro Met His Glu Gly Asp Gln Thr Arg Ala Ser Ser 1380 1385 1390 Arg Lys Arg Ser Arg Ser Asp Arg Ala Val Thr Gly Pro Ser Ala Gln 1395 1400 1405 Gln Ser Phe Glu Val Arg Val Pro Glu Gln Arg Asp Ala Leu His Leu 1410 1415 1420 Pro Leu Ser Trp Arg Val Lys Arg Pro Arg Thr Arg Ile Gly Gly Gly 1425 1430 1435 1440 Leu Pro Asp Pro Gly Thr Pro Ile Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ser Ser 1445 1450 1455 Thr Val Met Trp Glu Gln Asp Ala Ala Pro Phe Ala Gly Ala Ala Asp 1460 1465 1470 Asp Phe Pro Ala Phe Asn Glu Glu Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu Leu 1475 1480 1485 Leu Pro Gln Ser Gly Ser Val Gly Gly Thr Ile 1490 1495 <210> 13 <211> 989 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsbZIP73 <400> 13 gaagcacacc actaattctt tttggaactg ctcaagtaag atgaaaattg ttctgtctta 60 acctgctttc atattaattg ttaaagttgt catcatccaa attgttatag caacacgcca 120 tgcctttata tttcaaaata gaaaggcagg ggatacacac attaatctat ctcttaggtg 180 ccatacctct atgctagaga tgaaaagctg attactgacc acttgtgaac aaacccttag 240 gtgtcttgct tccacagtgc gtgctgccat atgtaatcta aattgtcatg cccaatctga 300 tctacttcat tctctagtgg cctaacaatc tctgttcgtt tattcccaca gtggctacca 360 gtaggtaaag ctgtgtgttt atccagagat ttcatgccac tctaaccagg tacaagattt 420 taataagtaa actagcttga gtgatgagaa aagccaaaaa caaaggccga gcatctttga 480 ggggagaatg cattacaagg taaaaagcaa ggtttggcat ggatgaactg gaataaattt 540 accttagaca agactactcg cgcaagtcaa gtcatggatg caaacgaagg gaaaagaaaa 600 tgacaaatgt tctctaaaaa aataaaagca aagataggga ggtagtagaa gattaatgag 660 ccacaactat tgtaggcata tattgtttgg atattgttgg cgaaaagctc accgtcatgg 720 ccatgtacca aatcgacaaa attaaagcta ccaaattcta caaaaacaag gaggggtgga 780 gagggagaga aagaaggtgg tctctctcta gtctctagcc ataggcaatc aaaagcacct 840 tttctcaccc tataaaaggc cctcaccaac ccatcgcctc ctccgctcag agagagcaaa 900 ttcttcagta agcagaatca aagcagatta accctcatct acttctggcc ctctaagagt 960 tctccactaa gcaagcgaaa acagccatg 989 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xoo2279 EBE <400> 14 tataaaaggc cctcaccaac ccat 24

Claims

벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와 결합하는, 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편.
제1항에 있어서, 상기 OsbZIP73 프로모터 단편은 벼 유래 OsbZIP73 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위 (-300) 내지 (-100) 부위에 포함되는 것인 단편.
서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편 및 상기 프로모터 단편에 연결된 표지 유전자 또는 형광 단백질 유전자를 포함하는, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터.
제3항에 있어서, 상기 표지 유전자는 GUS(β-glucuronidase) 유전자인 것인, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터.
제3항에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP(green fluorescent protein), 루시퍼라아제(luciferase) 또는 CFP(cyan fluorescent protein)인 것인, TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터.
a) 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터를 도입하는 단계;
b) 상기 TAL 이펙터 Xoo2279 유전자 서열 인식용 재조합 벡터가 도입된 벼 흰잎마름병 저항성 품종 또는 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체에 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)을 감염시키는 단계; 및
c) 벼 흰잎마름병 저항성 품종을 대조군으로 하여 벼 흰잎마름병 저항성 후보 식물체의 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 활성 정도를 평가하는 단계;를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 식물체 선별 방법.
서열번호 14의 염기서열 내에서 특정 염기가 변이된 OsbZIP73(Oryza sativa basic-leucine zipper 73) 프로모터(promoter) 단편을 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터.
제7항에서 있어서, 상기 변이는 특정 염기가 결실(deletion), 삽입(insertion) 또는 치환(substitution)된 것인, 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 변이는 서열번호 14의 염기서열 내에서 TATA 박스(TATAAA)는 변이되지 않은 것인, 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 특정 염기 변이에 의해 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)의 TAL 이펙터 Xoo2279(Transcription activator-like effector Xoo2279) 유전자와의 결합이 저해되는 것인, 벼 흰잎마름병 저항성 증진용 재조합 벡터.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
제11항에 따른 방법으로 제조된 벼 흰잎마름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체.