CN111849970A - 一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法 - Google Patents

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crispr
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刘巧泉
黄李春
李钱峰
张昌泉
范晓磊
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Abstract

本发明提供一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，包括步骤：对稻米Wx基因启动子进行改造。本发明提供的方法能够调节稻米直链淀粉含量，改良了稻米蒸煮食味品质，突变后的稻米产量稳定、口味佳。将其应用于水稻品种改良育种工作，具有重要的应用价值。

Description

一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法。
背景技术
水稻是世界上最主要的粮食作物之一。“优质”和“高产”是水稻品种改良的两大永恒主题。近几十年来，随着高产育种、超高产育种、超级稻育种和绿色超级稻育种等计划的实施，水稻产量不断提高，产量已达1152.3公斤/亩(2018年数据)。但在水稻产量大幅度提高的同时，对水稻品质的研究却相对滞后。与之相对的是随着大众消费水平和生活品味的提高，对优质稻米的需求越来越大。
淀粉是水稻胚乳中最主要的成分，约占籽粒干重的80％、稻米食用部分的90％，是决定稻米品质的最主要因素之一。稻米淀粉主要由直链淀粉与支链淀粉两部分组成。其中直链淀粉含量(Amylose content,AC)通常被认为是决定稻米蒸煮食用品质的最重要因素。较低AC的品种常能有很高的最高粘度(PKV)和崩解值，在储存过程中、蒸煮以后比高AC淀粉不易回升，会带来更好的适口性，蒸煮食味品质更佳。例如，优质食味软米“南粳”系列(包括南粳46，南粳9108等)AC显著低于常规的籼稻和粳稻品种。较高AC的品种口感偏硬，适口性较差，但是其富含抗性淀粉，有利于预防II型糖尿病，肥胖症等疾病，更加健康。不同地区和文化偏好的人群对稻米AC的喜好有很大的区别。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的提供了一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，包括步骤：对稻米Wx基因启动子进行改造。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的方法能够调节稻米直链淀粉含量，改良了稻米蒸煮食味品质，突变后的稻米品质好、口味佳。将其应用于水稻品种改良育种工作，具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是CRISPR/Cas9载体构建及各构建T0代突变情况。A为7个靶位点在Wx启动子上的分布情况。B为各个载体构建的靶位点组合。C为各载体构建T0代突变情况。
图2为不同T1代纯合突变类型与野生型序列比对。WT表示野生型，M表示纯合突变材料。
图3为野生型和不同T1代纯合突变类型的表观直链淀粉含量。WT表示野生型，M表示纯合突变材料。
具体实施方式
水稻胚乳中AC主要由蜡质基因(Waxy,Wx)所编码的颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase I,GBSSI)催化合成。Wx基因的广泛变异是导致不同水稻品种中AC变异的关键。截止目前Wx基因的等位变异已经得到了充分的挖掘，至少有8个等位基因已发表。在糯稻中，wx由于第2外显子23bp的缺失造成了转录提前终止，AC通常低于2％。在非糯品种中，携带Wxa的稻米属于高AC类型(25％以上)，Wxlv与之类似。Wxin在第6外显子上发生的A-C变异使AC降至中等水平(18％—22％)。Wxb主要分布在粳稻品种中，其AC属于中等至较低水平(15％—18％)。除了上述常规等位基因外，还有3个“软米基因”即Wxmq、Wxmp和Wxop被克隆，其AC在10％左右。AC不同造成了不同水稻品种间稻米品质，尤其是蒸煮食味品质的显著差异。创建更多Wx等位变异，是调节AC以满足不同地区、不同文化人群需求、改良稻米蒸煮食味品质的重要方法。
CRISPR/Cas9是时下流行的基因组定点编辑技术。在水稻中已经被证明能够高效、便捷的定点编辑多个靶基因。更难得可贵的是，该技术靶位点和T-DNA插入位点可处于不同染色体上，因此在农杆菌介导转化的转基因水稻植株中可通过后代筛选的方法去除转基因痕迹，消除转基因可能带来的安全隐患，进而可应用于生产实践。
利用CRISPR/Cas技术编辑Wx基因为创建新的Wx等位变异提供了可能。然而CRISPR/Cas编辑基因编码区往往会造成基因编码蛋白的移码，功能缺失。编辑Wx基因的编码序列很大概率会获得其功能缺失的糯稻类型，稻米蒸煮食味品质不会显著上升。与之相反，编辑基因启动子上的顺式作用元件可以调节基因的表达。利用CRISPR/Cas技术编辑Wx基因启动子上的顺式作用元件，微调其表达，为创建新的Wx等位变异提供了可能。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术、基因突变技术及相关领域的常规技术。
本发明一实施例的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，包括步骤：对稻米Wx基因启动子进行改造。
可选的，所述稻米选自水稻。
所述水稻Wx基因的Genbank号为LOC4340018。
进一步对稻米Wx基因启动子进行改造时，所针对的靶序列如SEQ ID NO：1-7任一所示。
在一种实施方式中，对稻米Wx基因启动子进行改造时，采用CRISPR系统对稻米Wx基因启动子中的靶序列进行编辑。
在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)利用CRISPR系统根据稻米Wx基因启动子序列设计gRNA；
(2)构建含有gRNA片段的中间载体；
(3)利用步骤(2)所述的中间载体构建含有gRNA片段的CRISPR/Cas9载体；
(4)利用步骤(3)所述的CRISPR/Cas9载体获得转基因苗；
(5)培养并筛选步骤(4)所述的转基因苗，获得突变植株。
具体的，步骤(2)可以为：首先合成带粘性末端的gRNA，将接头序列变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的序列链接到经酶切后的中间载体上，经PCR扩增和测序验证阳性质粒。
所述中间载体选自质粒载体。
在一种实施方式中，所述中间载体选自pBlueScript(SK+)载体。
所述CRISPR/Cas9载体选自pC1300-Cas9载体。
可选的，步骤(4)包括以下步骤：
(41)将步骤(3)所述的CRISPR/Cas9载体转入到宿主细胞中；
(42)利用宿主细胞侵染稻米，获得转基因苗。
所述宿主细胞选自工程菌。
在一种实施方式中，所述宿主细胞选自EHA105菌株。
可选的，步骤(5)包括以下步骤：
(51)提取步骤(4)获得的转基因苗的DNA，用引物SEQ ID NO：22-29进行扩增，测序；
(52)将有突变的植株进一步种植，筛选纯合株系，去除转基因痕迹，经过多代筛选，获得纯合突变植株。
实施例1：利用CRISPR/Cas9技术创建Wx基因启动子编辑材料
1.水稻材料
粳稻(Oryza sativa subsp.geng)品种日本晴。
2.载体构建
本研究所使用的是中国农科院水稻所王克剑课题组所提供的CRISPR/Csa9系统。选取Wx基因启动子上7个片段作为靶位点(部分位点在反向互补序列上)(图1A)。具体靶位点序列为：
S1(SEQ ID NO.1)CAATGAGGTTTATGTCCTA
S2(SEQ ID NO.2)CCAACTAACGCCTCGACAA
S3(SEQ ID NO.3)CACGTTAGCGTGCGTACGT
S4(SEQ ID NO.4)CTCATGCAGGGCGAGGCTAG
S5(SEQ ID NO.5)CGCGCGCGCACGTGCGGTT
S6(SEQ ID NO.6)CCCCCGTTTGTTTTCTCCT
S7(SEQ ID NO.7)AGAGGGGGTGGTGGTGTGGG
根据CRISPR/Cas9系统要求，将靶位点设计成引物。具体操作是在靶位点正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC，交由生物公司合成，具体引物序列为：
S1-F(SEQ ID NO.8)GGCAcaatgaggtttatgtccta
S1-R(SEQ ID NO.9)AAACtaggacataaacctcattg
S2-F(SEQ ID NO.10)GGCAccaactaacgcctcgacaa
S2-R(SEQ ID NO.11)AAACttgtcgaggcgttagttgg
S3-F(SEQ ID NO.12)GGCAcacgttagcgtgcgtacgt
S3-R(SEQ ID NO.13)AAACacgtacgcacgctaacgtg
S4-F(SEQ ID NO.14)GGCActcatgcagggcgaggctag
S4-R(SEQ ID NO.15)AAACctagcctcgccctgcatgag
S5-F(SEQ ID NO.16)GGCAcgcgcgcgcacgtgcggtt
S5-R(SEQ ID NO.17)AAACaaccgcacgtgcgcgcgcg
S6-F(SEQ ID NO.18)GGCAcccccgtttgttttctcct
S6-R(SEQ ID NO.19)AAACaggagaaaacaaacggggg
S7-F(SEQ ID NO.20)GGCAagagggggtggtggtgtggg
S7-R(SEQ ID NO.21)AAACcccacaccaccaccccctct
将靶位点引物混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段后连入用Aar I酶切(Ferment公司)过的中间载体SK-gRNA中。转化得到的连接质粒可用通用T3引物和靶位点反向引物搭配进行菌落PCR阳性检测。再利用公用T3或T7引物进行测序检测，验证是否正确。测序正确的中间载体除了S7位点单独连入最终载体，其他都用同尾酶系统酶切后两两连入用Kpn I和BamH I酶切过的最终载体pC1300-Cas9中。S1和S2组合，S2和S3组合，S3和S4组合，S5和S6组合(图1B)。然后用公用引物M13-R和靶位点正向引物进行PCR筛选阳性菌落后用M13-R引物测序验证。
3.遗传转化
将测序正确的重组载体质粒转入EHA105菌株，采用农杆菌介导的遗传转化方法(刘巧泉等，植物生理学报.1998)侵染水稻愈伤。共培养3天后，在含有潮霉素的筛选培养基上培养。筛选到的抗性愈伤在预分化培养基上培养10天左右，将预分化的愈伤转至分化培养基上培养，一个月左右得到抗性转基因T0代植株(图1C)。
4.突变植株的检测与筛选
采用CTAB方法从T0代水稻叶片中快速提取基因组DNA，用于突变类型检测。取T0代组培苗约1克新鲜水稻叶片剪碎后放入2ml离心管，加入钢珠经液氮冷冻后，在磨样机上粉碎，然后提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100微升超纯水中。
在Wx基因基因组序列上设计引物，扩增包含靶位点的DNA片段，PCR产物直接测序。测序结果用刘耀光老师课题组的在线解码网站DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/ dsdecode/)进行峰图分析，获得突变信息。有突变的单株进一步种植，筛选纯合株系，并潮霉素引物(Hyg-1和Hyg-2)检测去除转基因痕迹。经过多代的筛选，我们获得了21种突变类型共计29个无潮霉素抗性基因的纯合突变系(图2)。
检测突变类型的扩增引物序列和潮霉素检测引物序列分别为：
S123Test-F(SEQ ID NO.22)AGGTAATTGACACCCCACGCA
S123Test-R(SEQ ID NO.23)AACCATCGGTGGATCTCGCT
S4Test-F(SEQ ID NO.24)AGGTAATTGACACCCCACGCA
S4Test-R(SEQ ID NO.25)AACCATCGGTGGATCTCGCT
S56Test-F(SEQ ID NO.26)AGCGAGATCCACCGATGGTT
S56Test-R(SEQ ID NO.27)TGTGCTGTGGCCTGTGTGT
S7Test-F(SEQ ID No.28)CGGGTAAAATGTGTTGCGG
S7Test-R(SEQ ID No.29)ACTTGCAGATGTTCTTCCTGATGA
Hyg-1(SEQ ID No.30)GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT
Hyg-2(SEQ ID No.31)GGTCGCGGAGGCTATGGATGC
5.突变植株稻米AC的测定
将野生型及不同类型纯合突变材料成熟谷粒用砻谷机(Model SY88-TH,Korea)出糙(除去谷壳)，然后用Kett精米机(Tokyo,Japan)磨成精米。精米通过FOSS旋风式磨粉机(FOSS,Sweden)磨成粉，在100目的筛子中过筛后在40℃烘箱中放置3天，再在室温下放置3天后密封。经前处理的米粉按部颁标准NY147-88方法测定米粉直链淀粉含量(AC)。测定过程中选用中国水稻研究所提供的四个标准样品制作标准曲线，其表观直链淀粉含量分别为1.5％、10.4％、16.2％和26.5％。AC测定结果表明相比于野生型对照，大部分纯合转基因材料的AC无显著变化，而在靶位点S7编辑的材料中，不同编辑类型的AC均显著下降，接近软米水平，暗示其稻米蒸煮食味品质显著提高(图3)。
综上所述，我们利用CRISPR/Cas技术成功编辑了Wx基因启动子上7个靶位点，创建了多种不同类型的Wx启动子编辑的新等位变异类型。其中，如SEQ ID No.7所示的S7位点编辑的纯合突变系中AC显著降低，接近软米水平。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。介于CRISPR/Cas系统造成突变的随机性，以及不同Wx基因等位基因、不同水稻品种中的靶位点序列及突变所涉及序列的高度同源性，显然本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员利用不同CRISPR/Cas系统或其他基因编辑技术在不同Wx基因等位基因、不同水稻品种中编辑本发明所公开的Wx基因启动子靶位点或突变所涉及的片段所造成的不同突变类型，均应认为是本发明的保护范围。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caatgaggtt tatgtccta 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 19
<212> DNA
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cacgttagcg tgcgtacgt 19
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 19
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<211> 19
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cccccgtttg ttttctcct 19
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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<211> 20
<212> DNA
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<210> 24
<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agcgagatcc accgatggtt 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtgctgtgg cctgtgtgt 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgggtaaaat gtgttgcgg 19
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acttgcagat gttcttcctg atga 24
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcttctgcgg gcgatttgtg t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggtcgcggag gctatggatg c 21

Claims (10)

1.一种基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，包括步骤：对稻米Wx基因启动子进行改造。
2.如权利要求1所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.对稻米Wx基因启动子进行改造时，所针对的靶序列如SEQ ID NO：1-7任一所示；
b.所述稻米选自水稻。
3.如权利要求2所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，对稻米Wx基因启动子进行改造时，采用CRISPR系统对稻米Wx基因启动子中的靶序列进行编辑。
4.如权利要求3所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，包括如下步骤：
(1)利用CRISPR系统根据稻米Wx基因启动子序列设计gRNA；
(2)构建含有gRNA片段的中间载体；
(3)利用步骤(2)所述的中间载体构建含有gRNA片段的CRISPR/Cas9载体；
(4)利用步骤(3)所述的CRISPR/Cas9载体获得转基因苗；
(5)培养并筛选步骤(4)所述的转基因苗，获得突变植株。
5.如权利要求4所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述中间载体选自质粒载体；
b.所述CRISPR/Cas9载体选自pC1300-Cas9载体。
6.如权利要求5所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，所述中间载体选自pBlueScript(SK+)载体。
7.如权利要求4所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：
(41)将步骤(3)所述的CRISPR/Cas9载体转入到宿主细胞中；
(42)利用宿主细胞侵染稻米，获得转基因苗。
8.如权利要求4所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，步骤(5)包括以下步骤：
(51)提取步骤(4)获得的转基因苗的DNA，用引物SEQ ID NO：22-29进行扩增，测序；
(52)将有突变的植株进一步种植，筛选纯合株系，去除转基因痕迹，经过多代筛选，获得纯合突变植株。
9.如权利要求7所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，所述宿主细胞选自工程菌。
10.如权利要求9所述的基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法，其特征在于，所述宿主细胞选自EHA105菌株。
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