CN102021177B - 水稻基因kt473和kt474在提高植物耐盐性上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两个来源于水稻的与耐逆性相关的基因KT473和KT474。实验证明，将本发明的基因分别转化水稻可显著提高水稻对高盐的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

水稻基因KT473和KT474在提高植物耐盐性上的应用

技术领域

本发明涉及植物耐逆性相关的基因与其应用，特别涉及来源于水稻的与抗逆相关的bKT473和KT474基因在提高植物耐盐性中的应用。

背景技术

转录因子是一类调控基因表达的关键基因，对作物的生长发育起着重要的调节作用。利用生物信息手段，根据转录因子的结构特点从基因组水平推测的转录因子基因是一组最有可能具有明确功能的基因。多年以来，转录因子的克隆和功能研究一直是科学研究的热点之一。科学家们利用不同的研究路线分离鉴定了大量的转录因子，丰富了转录因子数据库，也从中发现了一些与农艺性状相关调控因子，为农作物的性状改良提供了重要基因资源。

转录因子是调控基因表达的关键基因，对作物的生长发育起着重要的调节作用。多年以来，转录因子的克隆和功能研究一直是科学研究的热点之一，科学家们利用不同的研究路线分离鉴定了大量的转录因子，也从中发现了一些与农艺性状相关的调控因子，为农作物的性状改良提供了重要基因资源。水稻是单子叶模式植物，又是我国的重要粮食作物。在水稻基因组测序工作完成后，许多数据库对水稻基因组进行了分析。据预测，在籼稻和粳稻中分别包含2,025个和2,384个转录因子，分属于63个转录因子基因家族，如WRKY(111/113，籼稻/粳稻)、bZIP(88/109)、AP2/EREBP(174/182)、AUX/IAA(30/46)、MYB(136/138)、HB(84/103)等。根据以往的文献报道与数据库的功能注释，这里既包含植物所特有的转录因子家族，如WRKY，也包含与植物生长发育、抗逆性等密切相关的其它一些转录因子家族，如bZIP、AP2/EREBP、MYB等。利用这些数据库，结合基因芯片杂交、EST序列等基因表达信息，从基因组水平预测和分离水稻转录因子全长cDNA，并利用已经建立的高效的水稻转化系统使其在水稻中过量表达，对其进行规模化功能验证，进一步通过研究转基因水稻的表型变化及抗逆性能的改变等特性推断转录因子的功能；在大量的重复性的植物转化、表型分析、功能鉴定等工作的基础上，寻找在改良农作物中具有实用价值的植物重要调节因子，并应用于作物的性状改良，从而有效解决农业生产中的实际问题，具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供两个与耐逆性相关的水稻基因KT473和KT474，以用于提高植物的耐逆性能。

发明所提供的与耐逆性相关的基因KT473和KT474，来源于稻属水稻(Oryza sativaL.)，编码具有下述氨基酸序列的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

序列表中的SEQ ID NO：1由371个氨基酸残基组成，为蛋白KT473。

本发明中水稻与耐逆性相关的KT473的编码基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列，或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的编码基因可以具有序列表中SEQ IDNO：2的核苷酸序列。

2)序列表中的SEQ ID NO：3；

序列表中的SEQ ID NO：3由569个氨基酸残基组成，为蛋白KT474。

本发明中水稻与耐逆性相关的KT474的编码基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列，或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的编码基因可以具有序列表中SEQ IDNO：4的核苷酸序列。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增KT473和KT474基因的任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。

本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码本发明与耐逆性相关的KT473和KT474基因导入植物组织、细胞或器官，使植物耐逆性获得提高。

在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的KT473和KT474基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明水稻与耐逆性相关的KT473和KT474基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、Gateway^TW系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明中KT473和KT474基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM_118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

其中，本发明以pCAMBIA1300为出发载体，构建的含有本发明KT473和KT474基因的植物表达载体，分别命名为pCact-KT473，和pCactF-KT474。携带有本发明水稻与耐逆性相关的KT473和KT474基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明KT473和KT474基因或其同源序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

本发明提供了两个与耐逆性相关的水稻基因。实验证明，将本发明的基因分别转化水稻可提高水稻对高盐的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1表达载体pCactF的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示35S基因的启动子；CaMV35S ter表示35S基因的终止子；pAct1表示水稻Actin1基因的启动子；3flag表示3倍的flag标签序列；OCS表示ocs基因的终止子；HindIII、KpnI、SpeI、XbaI、SalI和PstI分别表示限制性内切酶的酶切位点。

图2表达载体pCact的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示35S基因的启动子；CaMV35S ter表示35S基因的终止子；pAct1表示水稻Actin1基因的启动子；OCS表示ocs基因的终止子；HindIII、KpnI、SpeI、XbaI、SalI和PstI分别表示限制性内切酶的酶切位点。

图3KT473转基因株系的耐盐性分析。A：盐处理前苗生长状态；B：盐处理后苗生长状态；C：正常培养一周后苗生长状态；D：盐处理存活率统计。

图4KT474转基因株系的耐盐性分析。A：盐处理前苗生长状态；B：盐处理后苗生长状态；C：正常培养一周后苗生长状态；D：盐处理存活率统计。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《分子克隆》。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成，测序由北京华大基因研究中心完成，载体构建过程中的核酸限制性内切酶及T4DNA连接酶等均购自NEB公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体骨架来自于pCAMBIA1300。

1、KT473和KT474基因的分离

从KT473和KT474两个基因的编码起始位点ATG开始设计5’端引物，于终止密码处设计3’端引物。

KT473基因的扩增引物：

引物1：5’GCACGCactagtATGACCTCGGCGTCGACGCAGTTCG 3’

引物2：5’GCACGCtctagaTTAGCTTATCCCTGAATCGCGCGG 3’

引物1中序列actagt为限制性内切酶SpeI的酶切位点，下划线标识的序列为KT484基因的编码序列；引物2中tctaga序列为限制性内切酶XbaI的酶切位点，下划线标识的序列为KT473基因的编码序列。

KT474基因的扩增引物：

引物3：5’GCACGCtctagaATGGCGGAGCCGGACCTACTCGCG 3’

引物4：5’GCACGCctgcagTTACAAGTGAGGGCTATGGCTTTTG 3’

引物3中tctaga序列为限制性内切酶XbaI的酶切位点，下划线标识的序列为KT484基因的编码序列；引物4中ctgcag序列为限制性内切酶PstI的酶切位点，下划线标识的序列为KT474基因的编码序列。

提取幼苗期的日本晴水稻的总RNA，通过反转录得到cDNA作为模板，用以上引物分别配对扩增各个基因的全长，KT473和KT474的基因大小分别为1113bp和1707bp，其核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示，所编码的蛋白质氨基酸序列依次如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。

具体反应为：取约2μg的总RNA，加入1μl 10×DNase buffer，1μl的DNase，补DEPC处理过的水至10μl体系，混匀，37℃温育30min后，加入1μl的RQ DNase stop solution，65℃温育10min以终止反应后，加入2μl Oligo(dT)18 primer(0.1μg/μl)，4μl 5×First-strand buffer，1μl Ribonuclease inhibitor(40U/μl)，2μl 4×dNTP(各10mM)，1μl MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，小心混匀，37℃保温1小时。然后90℃处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA稀释10倍，取1μl作为PCR反应的模板，上、下游引物(10μM)各1μl，LA Taq酶(5U/μl)0.5μl，4×dNTPs(各10mM)1μl，2×GCbuffer(Mg²⁺)25μl，H₂O 20.5μl。PCR反应条件为预热95℃5min，变性94℃1min，退火56℃30sec，延伸72℃1min50sec，34个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得了大小分别与预期结果相符的DNA片段。分别回收并纯化上述片段，将其连接入载体pEASY-T1(全式金公司)中，通过热激法转化大肠杆菌(E.coli)TOP10菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm的摇床中培养12-16小时，提取质粒，分别得到含有目的片段的重组质粒，测序验证正确后，用SpeI和XbaI双酶切切下目的片段KT473，连入进行相同双酶切的pCact植物表达载体；用XbaI和PstI双酶切切下目的片段KT474，连入进行相同双酶切的pCactF植物表达载体，分别构建得到载体pCact-KT473和pCactF-KT474。挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落进行测序验证。植物表达载体pCactF和pCact的T-DNA区图谱依次如图1和2所示。

2、KT473和KT474转基因水稻的获得

利用热激法将上述重组载体pCact-KT473和pCactF-KT474转入农杆菌AGL0菌株，利用农杆菌对水稻进行共转化。

3、KT473和KT474转基因植株的耐盐性鉴定

收获KT473和KT474的T1代转基因水稻种子，选取5个以上的株系进行盐筛。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的KT473和KT474的T₁转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期(第3片叶完全舒展)，生长状态如图3A和4A所示。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液进行盐筛，约3天左右，对照出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至全卷时(图3B，图4B)，洗去盐溶液，正常培养。期间每1.5天更换一次盐溶液。复水第二天再更换一次营养液，以去除剩余的盐分。三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。一周后照相(图3C，图4C)，统计成活苗数，计算耐盐苗比例，盐筛结果如图3D和图4D(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)。实验结果显示，KT473和KT474的T₁代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，KT473和KT474的转基因水稻T₁代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，转空载体的中花11对照(CK)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(图3C，图4C)。

在获得KT473和KT474转基因水稻T2代的种子后，我们再一次进行了耐盐性实验，结果与上述实验结果相一致。此实验说明KT473和KT474基因分别具有增强水稻耐盐性的作用。

Claims (7)

1.一种增强水稻对盐的耐受性的方法，其特征是将植物抗逆相关蛋白的编码基因插入表达载体，获得含有植物抗逆相关蛋白编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述植物抗逆相关蛋白的植株或所述植物抗逆相关蛋白表达量增加的植株中筛选得到对盐的耐受性增强的植株；其中，所述植物抗逆相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物抗性相关蛋白的编码基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述抗逆相关蛋白编码基因导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到对高盐的耐受性提高的转基因植物。

4.权利要求1所述的方法，其中所述表达载体的特征是：用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。

5.权利要求4所述的方法，其中所述表达载体的特征是：用所述抗逆相关蛋白编码基因构建植物表达载体时，用一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子来驱动其表达。

6.权利要求4所述的方法，其中所述出发载体为pCAMBIA系列载体。

7.权利要求6所述的方法，其中所述出发载体为pCAMBIA1300。

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