CN101220363A

CN101220363A - 水稻bZIP及其基因在提高植物耐逆性能上的应用

Info

Publication number: CN101220363A
Application number: CNA2008100568279A
Authority: CN
Inventors: 王喜萍
Original assignee: WEIMINGKAITUO AGRO-BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: BEIJING WEIMING KAITUO CROP DESIGN CENTER CO LTD
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2028-01-25
Also published as: CN101220363B

Abstract

本发明公开了一组来源于水稻的与耐逆性相关的bZIP基因，其编码的蛋白质具有下述氨基酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：1、3或5；2)将序列表中SEQ ID NO：1、3或5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白质具有调控植物耐逆性的功能。实验证明，将本发明的基因转化水稻可提高水稻对高盐、干旱和低温逆境胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

水稻bZIP及其基因在提高植物耐逆性能上的应用

技术领域

本发明涉及植物耐逆性相关的基因与其应用，特别涉及来源于水稻的与耐逆相关的bZIP类转录因子及其编码基因在培育耐逆性植物中的应用。

背景技术

转录因子作为基因表达的直接调节因子在各种生物体的发育和生理过程中都起着很重要的作用。通常是有机体接受各种内外刺激后先调节转录因子的表达水平变化，最终引起效应靶基因的表达变化，进而表现为机体的反应。在众多的转录因子家族中，有几类家族转录因子是在植物和动物中共同存在的，其中包括bZIP(basic leucine zipper)家族。该家族基因数目多且结构多样化，但都包含由一个基本区域和一个亮氨酸拉链(leucinezipper)组成的长度为60-80个氨基酸残基的高度保守的bZIP结构域(Hurst，1994).其中基本区域包括由大约16个氨基酸残基形成的一个N-x7-R/K结构，亮氨酸拉链则由七个重复的亮氨酸或其它的疏水氨基酸(如异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸)组成。在功能上，基本区域高度保守，负责特异的DNA序列结合，而亮氨酸拉链保守性略差，以两性分子的状态，在bZIP蛋白之间形成同源或异源二聚体时起作用。bZIP蛋白单体形成长的α-螺旋结构，当与DNA结合时，N-端结合到双链DNA的主沟，而C-端通过coiled-coil结构与其他蛋白形成二聚体(Landschulz et al.，1988；Ellenberger et al.，1992)。目前只在真核生物中发现有bZIP家族的转录因子，酵母有17个，线虫有31个，果蝇有27个，人基因组有56个，拟南芥有67个(Riechmann et al.，2000；Fassler et al.，2002；Vinson et al.，2002；Deppmann et al.，2004).

在植物中，和其他家族的转录因子一样，bZIP家族的转录因子的表达方式多样且功能广泛，有的是组成型表达的，有的则是器官特异性表达(Schindler et al.，1992；Rodriguez-Uribe and O’Connell，2006)，有刺激应答型的(de Vetten and Ferl，1995)，有发育依赖型的(Chern et al.，1996)，也有细胞周期特异性表达的(Minami et al.，1993)。至今在各种植物中已经鉴定了120多个bZIP家族转录因子，其中，有的bZIP转录因子(如水稻RITA-1和豆科的ROM1)参与了种子成熟和萌发过程的调节(Izawa et al.，1994；Chern et al.，1996)，有的(如拟南芥的PERIANTHIA和FD，玉米的liguleless2和delayed flowering1，烟草的BZI-2/3/4和TGA2)则在花器官诱导过程以及花的发育过程中起作用(Chuang et al.，1999；Walsh and Freeling，1999；Strathmannet al.，2001；Abe et al.，2005；Thurow et al.，2005；Wiggeet al.，2005；Muszynski et al.，2006)，还有的bZIP基因(如拟南芥的HY5和HYH，G-box-bindingfactor 1)在植物的光形态建成和光信号转导途径中起介导作用(Jakoby et al.，2002；Holm etal.，2002；Mallappa et al.，2006)，也有报道bZIP基因(如拟南芥的TGA2/5/6)参与了植物对病原体的防御反应(Zhang et al.，2003；Thurow et al.，2005)。另外，有些研究结果还表明bZIP家族转录因子(如玉米的G-box binding factor，拟南芥的ABI5和ABRE1)在ABA存在时或者其它胁迫条件下表达发生变化(de Vetten and Ferl，1995；Lopez-Molina et al.，2002；Fujita etal.，2005)，少数成员(如烟草的TGA2)还可能参与了植物激素的应答反应(Fukazawa et al.，2000；Niggeweg et al.，2000)。

根据bZIP家族成员的结构和序列的保守特征，从水稻基因组中预测出来约90个bZIP家族转录因子，到目前为止，分离鉴定了14个，通过分析发现它们分别参与了水稻的多种生理生化反应和生长发育过程。其中，OSBZ8主要在营养器官表达，在盐和ABA处理时表达升高，进而促进其它ABA反应的基因如Rab16a和Osem等基因的高表达(Nakagawa et al.，1996)，TRAB1则更多地在发育中的种子中表达，也参与调节ABA信号诱导的基因的表达(Hobo et al.，1999)。OsZIP-1a在ABA激活的Em基因启动子的表达中起调节作用(Nantel andQuatrano，1996)，LIP19和OsOBF1在低温处理时表达水平上升(Aguan et al.，1993；Shimizu etal.，2005)，RITA-1对种子发育过程中特异表达的基因有调节作用(Izawa et al.，1994)，REB首先被证明是水稻胚乳中alpha-globulin基因的启动子的主要的结合蛋白，随后又发现也是水稻穗中重要的转录激活因子，可以促进其它重组蛋白的表达(Nakase et al.，1997；Yang etal.，2001)。OsZIP-2a和OsZIP-2b则可能选择性地抑制一些G-box结合因子(Nantel andQuatrano，1996)，RF2a和RF2b在维管束发育中以及在水稻tungro症状形成中起作用(Yin etal.，1997；Dai et al.，2003；Dai et al.，2004)，RISBZ1对胚乳特异的储存蛋白的基因表达以及对发育的种子中某些代谢酶的表达有调节作用(Onodera et al.，2001；Yamamoto et al.，2006)。被分离的还有RISBZ4和RISBZ5基因，但是功能未知，推测可能和RISBZ1形成二聚体一起发挥作用(Onodera et al.，2001)。最近，Nijhawan等通过对水稻基因芯片杂交分析了预测的89个bZIP家族成员在干旱、盐和低温胁迫时的表达谱，发现有26个bZIP基因在至少一种胁迫条件下上调表达，11个bZIP基因下调表达，表明水稻的bZIP家族成员在环境胁迫时可能起重要作用(Nijhawan et al.，2007)，但是这些受胁迫条件上调的基因在高表达时是否能够提高植物的抗逆性，并没有进一步的实验证据。

综上所述，通过对拟南芥、烟草和玉米等植物中对bZIP家族成员的功能分析，我们发现bZIP家族成员功能广泛，除了在种子和花等器官发育过程中起作用外，还在植物对各种外界环境条件包括光、病原体、胁迫和ABA等激素的反应中起很广泛的作用。到目前为止，在水稻中已经分离的bZIP家族成员功能的研究还很少，现有数据多数只是根据胁迫处理时某些基因表达水平上调或下调而推测这些基因可能参与某些生长发育过程(如种子发育的调节)或对外界刺激有反应，而没有直接的实验证据证明相关的功能。真正确定基因的功能必须通过基因缺失或过量表达来看突变植物或转基因植物对胁迫条件的反应是否有变化，所研究的基因是否能够有效地改善植物对抗外界胁迫的能力。

发明内容

本发明的目的是对水稻的bZIP家族成员进行功能研究，从而获得与耐逆性相关的水稻bZIP转录因子及其基因，以用于提高植物的耐逆性能。

本发明利用TIGR和华大BGI数据库中推测的基因序列，对水稻的bZIP家族成员进行细致的比较和分析，筛选、克隆了三个基因OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73，并证明它们都具有增强水稻耐逆性的功能。

本发明所提供的与耐逆性相关的bZIP基因，来源于稻属水稻(Oryza sativa L.)，编码具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)序列表中的SEQ ID NO：3；

3)序列表中的SEQ ID NO：5；

4)将序列表中SEQ ID NO：1、3或5的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白质具有调控植物耐逆性的功能。

序列表中的SEQ ID NO：1由301个氨基酸残基组成，为蛋白OsbZIP52，其中，自氨基端第140-221位氨基酸残基为高度保守的bZIP结构域；序列表中的SEQ ID NO：3由153个氨基酸残基组成，为蛋白OsbZIP71，其中，自氨基端第14-110位氨基酸残基为高度保守的bZIP结构域；序列表中的SEQ ID NO：5由173个氨基酸残基组成，为蛋白OsbZIP73，其中，自氨基端第77-151位氨基酸残基为高度保守的bZIP结构域；所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白。通过在植物中表达所述蛋白，并测试这些植物的耐逆性，可以判断发生这些变化后的蛋白是否还具有调控植物耐逆性的功能。

本发明中水稻与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73的编码基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列，或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如：具有SEQ ID NO：1、3、5所示氨基酸序列的bZIP转录因子的编码基因分别可以具有序列表中SEQ ID NO：2、4、6的核苷酸序列。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。

本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码本发明与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71和/或OsbZIP73基因导入植物组织、细胞或器官，植物耐逆性获得提高。

在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明水稻与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71、OsbZIP73基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、Gateway^TW系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明中水稻与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71、OsbZIP73基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM 118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

其中，本发明以pH2GW7(Invitrogen公司的Gateway^TW vector载体)为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73基因的植物表达载体分别命名为pH2GW7-OsbZIP52、pH2GW7-OsbZIP71和pH2GW7-OsbZIP73。携带有本发明水稻与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71、OsbZIP73基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明水稻与耐逆性相关的OsbZIP52、OsbZIP71、OsbZIP73基因或其同源序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

本发明提供了三个与耐逆性相关的bZIP转录因子家族基因。实验证明，将本发明的基因转化水稻可提高水稻对高盐、干旱和低温逆境胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73蛋白的氨基酸序列比较图。

图2为OsbZIP73 T₁代转基因水稻不同株系耐旱(A)、耐盐(B)和耐低温(C)苗比例的柱形图。

图3为OsbZIP71 T₁代转基因水稻不同株系耐旱(A)、耐盐(B)和耐低温(C)苗比例的柱形图。

图4为OsbZIP52 T₁代转基因水稻不同株系耐旱(A)和耐盐(B)苗比例的柱形图。

图5为经干旱胁迫的OsbZIP73/OsbZIP7 1/OsbZIP52 T₁代转基因耐旱植株与野生型植株照片。

图6为经盐溶液胁迫的OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52 T₁代转基因耐盐植株与野生型植株照片。

图7为经低温胁迫的OsbZIP73/OsbZIP71 T₁代转基因耐低温植株与野生型植株照片。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例1、耐逆基因的获得

OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73基因的分离

检索TIGR数据库、华大BGI数据库、以及NCBI等一些其它综合数据库，获得三个基因的推测编码序列，分别从这三个基因的编码起始位点ATG开始设计5’端引物，于终止密码处设计3’端引物：

5’端引物

OsbZIP52：CACCACAAAATGGGTCGGAGGAAGGCGATGATG

OsbZIP71：CACCACAAAATGTCGAGTGGGACCTCGTCCGGG

OsbZIP73：CACCACAAAATGCTGCACCACCATTACCATGGC

3’端引物

OsbZIP52：AGGCCACACATCAGCCGAGCAGCT

OsbZIP71：GAAGCACTGGTACTGGTACAAGTC

OsbZIP73：AATATTCTCGCATGGCTGTGAGGA

提取灌浆期的广陆矮4号水稻的总RNA，通过反转录得到cDNA，RT-PCR方法，以三对引物分别扩增得到全长基因，OsbZIP52、OsbZIP71和OsbZIP73的基因大小分别为903、459和519bp，三个全长基因的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：2、4、6所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：1、3、5所示。

具体反应为：取约2μg的总RNA，加入2μl Oligo(dT)₁₈ primer(0.1μg/μl)，小心混匀，65℃保温5分钟。室温放置10分钟，然后分别加入4μl 5×First-strand buffer，0.5μlRibonuclease inhibitor(40U/μl)，2μl 100mM DTT，2μl 4×dNTP(各10mM)，1μl MMLV ReverseTranscriptase(200U/μl)，小心混匀，37℃保温1小时。然后90℃处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA稀释10倍，取1μl作为PCR反应的模板，上、下游引物(10μM)各1μl，LA Taq酶(5U/μl)0.5μl，4×dNTPs(各10mM)1μl，2×GC buffer(Mg²⁺)25μl，H₂O 20.5μl。PCR反应条件为预热95℃ 5min，变性94℃ 1min，退火56℃1min，延伸72℃3min，35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小与预期结果相符的DNA片段。回收并纯化上述片段，将其分别连接入载体pENTER-TOPO(Invitrogen公司)中，通过CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)TOP10菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm的摇床中培养12-16小时，提取质粒，得到含有目的片段的重组质粒，分别命名为pENTER-TOPO Vector-OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73。对上述质粒进行测序，测序结果表明获得了序列正确的OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73基因。

实施例2、水稻中耐逆相关OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73的转基因水稻的获得

用农杆菌介导法将实施例1获得的与耐逆性相关的基因OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73转化水稻，具体方法如下：

1)转化农杆菌

通过LR反应将实施例1中构建的重组质粒pENTER-TOPO Vector-OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73中的OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73基因重组到表达载体pH2GW7上，LR反应体系为2μl缓冲液、2μl(150-300ng)线性化的pH2GW7质粒DNA、2μl(100-300ng)pENTER-TOPO Vector-OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73质粒DNA、2μlH₂O，再加入2μl LR Clonase，LR反应条件为25℃水浴保温1h，加入1μl 2U/μl蛋白酶K，37℃水浴10min。然后，通过热激法将上述重组载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L的壮观霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提取质粒，用限制性内切酶进行酶切鉴定，经酶切获得了与预期大小相符的酶切产物，再在实施例1中引物的引导下进行PCR鉴定，鉴定结果表明获得了含有OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73的重组植物表达载体，分别命名为pH2GW7-OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73，随后将上述重组载体转化农杆菌AGL0菌株(中国科学院遗传所赠送)。

2)侵染水稻愈伤组织

挑取步骤1)获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mL YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2-3天，再于4℃、5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基(Co(NO₃)₂·6H₂O 0.15mg/L，CaCl₂ 110mg/L，MgSO₄ 122mg/L，KI 3.75mg/L，NaH₂PO₄·H₂O150mg/L，Na₂-EDTA 0.01mM，FeSO₄·7H₂O 139mg/L，KCl 2.95g/L，MnSO₄·4H₂O 84.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 6.25mg/L，H₃BO₃ 5mg/L，Gly 37.5mg/L，CuSO₄ 0.005mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O1.25mg/L，盐酸硫胺素VB₁ 5mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB₆ 5mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Gln 87.6mg/L，L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28℃下避光振荡培养1-2小时至OD₆₀₀＝0.6-0.9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述转化有pH2GW7-OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于N₆共培养基(N₆培养基+10g/L葡萄糖+1mg/L乙酰丁香酮+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2mg/L)上培养，其中N₆基本培养基的配方为(NH₄)₂SO₄ 0.46g/L，KNO₃ 2.83g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 0.092g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，Na₂-EDTA 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.11g/L，MnSO₄·4H₂O 0.44g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.17g/L，H₃BO₃ 0.14g/L，CoCl₂·6H₂O 0.0005g/L，CuSO₄·5H₂O 0.0005g/L，Na₂MoO₄·2HXO 0.005g/L，盐酸硫胺素VB₁ 0.01g/L，烟酸0.001g/L，盐酸吡哆醇VB₆ 0.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，pH5.8。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上晾干，最后转入筛选培养基(N₆基本培养基+2，4-D 2mg/L+头孢霉素250mg/L)筛选。

3)阳性转基因水稻的获得

将侵染后的水稻愈伤组织于N₆共培养基中共培养3-5天后，转至含30mg/L潮霉素和400mg/L头饱霉素的N₆固体培养基(N₆大量元素+B₅微量元素+B₅有机成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH 5.8)上筛选3周，再转入含50mg/L潮霉素和200mg/L头饱霉素的N₆固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3周，再转入分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤)上进行分化，将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2 MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上进行生根培养后移至温室中，在28℃、15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’和反向引物5’-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’的引导下，PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得1009bp DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果表明用上述方法获得了转化有pH2GW7-OsbZIP52/OsbZIP71/OsbZIP73的转基因水稻。

实施例3、转基因T₁代植株耐旱性鉴定

收获OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52 T₁代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52 T₁转基因株系，继续培养一周后进行干旱处理，同时设未转基因的水稻中花11植株作对照。将水稻幼苗种入装箱的土壤中，采用蛭石∶营养土混合比例为3∶1的混合土，土壤的含水量限定为55-65％之间(采用烘干法测量土壤含水量，根据土壤烘干前后土壤重量的差值计算土壤的含水量)。从处理即日起不再浇水，直至绝大多数的未转基因水稻苗的叶片干枯、茎杆脱水弯曲、死亡，而各转基因株系的生长状态良好，叶片稍下垂，茎杆直立，停止筛选，复水培养。去除干旱协迫条件，在正常的复水培养条件下恢复生长2周后统计各转基因株系的成活苗数，计算耐旱苗比例，OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52 T₁代转基因水稻的耐旱筛选结果如图2、图3和图4中所示(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐旱苗百分比)，与野生型对照植株相比，OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52转基因水稻T₁代植株对干旱胁迫的耐受性均有提高。从数据上分析，OsbZIP71转基因T₁代植株的耐旱性强于OsbZIP73及OsbZIP52转基因T₁代植株。OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52转基因水稻T₁代经耐旱处理后的植株与经耐旱处理后的未转基因对照植株(WT)如图5所示，筛选出的转基因耐旱苗在大田中继续生长。收获转基因植株的种子，并在实验室和田间进行更大规模的筛选验证。

实施例4、转基因T₁代植株耐盐性鉴定

收获OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52 T₁代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，获得具有单位点插入的OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52转基因株系。继续培养10天后，将苗转移到大试管中，加入含有150mM NaCl的盐溶液，进行盐胁迫处理7天(温度：28℃，光强：2500lux，光15h/暗9h)，期间每天更换盐溶液，以保持盐浓度的稳定，筛选7天后除去盐溶液，改为正常培养，一周后统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图2、图3和图4(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)，同时以未转基因的中花11水稻苗为对照。实验结果显示，T₁代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52转基因水稻T₁代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(如图6所示，图6中OsbZIP73、OsbZIP71和OsbZIP52分别是盐溶液胁迫后的OsbZIP73、OsbZIP71和OsbZIP52转基因T₁代植株；WT/盐是盐溶液胁迫后未转基因对照植株；WT/H₂O是正常培养未转基因对照植株)。OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52转基因水稻T₁代植株对盐胁迫的耐受性均明显提高。将筛选得到的OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52转基因T₁代耐盐阳性植株移栽大田，继续生长。收获转基因植株的种子，并进行更大规模的筛选验证。

实施例6、转基因T₁代植株耐低温性鉴定

收获OsbZIP73/OsbZIP71 T₁代阳性转基因水稻种子，用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsbZIP73/OsbZIP71/OsbZIP52转基因株系。继续培养一周后，将培养苗放入4℃(光强：2500lux，光15h/暗9h)培养条件下进行低温处理7天，然后恢复室温继续培养，同时以未转基因的中花11为对照，分别统计成活苗数，计算耐低温苗比例。OsbZIP73/OsbZIP71-T₁代转基因水稻的耐低温筛选结果如图2和图3中所示，耐低温处理后的转基因T₁代植株和对照植株如图7所示，4℃处理7天后，阳性转基因株系的T1代植株仅叶尖部分稍有卷曲，室温培养后能够继续恢复生长，而未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片萎蔫、卷曲、干枯，茎杆不能直立，室温培养后不能恢复生长，并很快死亡，表明转基因植株对低温的耐受抵抗能力明显高于未转基因植株。从数据上分析，OsbZIP71转基因水稻T₁代植株对低温的耐受性好于OsbZIP73转基因水稻T₁代植株。筛选出的转基因耐低温苗在大田中继续生长。收获转基因植株的种子，并进行更大规模的筛选验证。

由图2、图3和图4可见，OsbZIP73/osbZIP71/OsbZIP52 T₁代转基因水稻植株的耐旱及耐盐能力，以及OsbZIP73/OsbZIP71 T1代转基因水稻植株的耐低温能力都好于未转基因中花11植株的耐性，而筛选的三种逆境中，转基因水稻植株耐盐性的提高尤为明显。

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序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京未名凯拓农业生物技术有限公司

<120>水稻bZIP及其基因在提高植物耐逆性能上的应用

<130>JSP080020

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>301

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>1

Met Gly Arg Arg Lys Ala Met Met Lys Lys Cys Pro Ser Glu Leu Gln

1 5 10 15

Leu Glu Ala Phe Ile Arg Glu Glu Ala Gly Ala Gly Asp Arg Lys Pro

20 25 30

Gly Val Leu Ser Pro Gly Asp Gly Ala Arg Lys Ser Gly Leu Phe Ser

35 40 45

Pro Gly Asp Gly Glu Met Ser Val Leu Asp Gln Ser Thr Leu Asp Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Gly His Gln Leu Trp Trp Pro Glu Ser Val Arg Thr Pro

65 70 75 80

Pro Arg Ala Ala Ala Ala Phe Ser Ala Thr Ala Asp Glu Arg Thr Pro

85 90 95

Ala Ser Ile Ser Asp Asp Pro Lys Pro Thr Thr Ser Ala Asn His Ala

100 105 110

Pro Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Cys Asp Ser Leu Leu Glu Ala Glu

115 120 125

Arg Ser Pro Arg Leu Arg Gly Thr Lys Ser Thr Glu Thr Lys Arg Ile

130 135 140

Arg Arg Met Val Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Arg Arg

145 150 155 160

Lys Gln Ala Gln Leu Ser Glu Leu Glu Ser Gln Val Glu Gln Leu Lys

165 170 175

Gly Glu Asn Ser Ser Leu Phe Lys Gln Leu Thr Glu Ser Ser Gln Gln

180 185 190

Phe Asn Thr Ala Val Thr Asp Asn Arg Ile Leu Lys Ser Asp Val Glu

195 200 205

Ala Leu Arg Val Lys Val Lys Met Ala Glu Asp Met Val Ala Arg Ala

210 215 220

Ala Met Ser Cys Gly Leu Gly Gln Leu Gly Leu Ala Pro Leu Leu Ser

225 230 235 240

Ser Arg Lys Met Cys Gln Ala Leu Asp Met Leu Ser Leu Pro Arg Asn

245 250 255

Asp Ala Cys Gly Phe Lys Gly Leu Asn Leu Gly Arg Gln Val Gln Asn

260 265 270

Ser Pro Val Gln Ser Ala Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Asn Trp Ile

275 280 285

Ser Ser Glu Val Thr Ser Cys Ser Ala Asp Val Trp Pro

290 295 300

<210>2

<211>906

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

atgggtcgga ggaaggcgat gatgaagaag tgcccgtcgg agctgcagct ggaggcgttc 60

atccgggagg aggccggcgc cggcgaccgc aagcccggcg tgttatctcc cggcgacggc 120

gcgcgtaagt ccggcctgtt ctctcccggc gacggcgaga tgtccgtgtt ggatcagagt 180

acactggacg gaagcggcgg cggccaccag ctgtggtggc cggagagcgt ccgtacgccg 240

ccgcgcgccg ccgccgcctt ctcggccacg gccgacgagc ggacgccggc gtccatctcc 300

gatgacccca aaccaaccac ctcagcgaac cacgcgcctg aaagcgactc ggactccgat 360

tgcgattcgc tgttagaagc agagaggagt ccacgcctgc gtggcacgaa atccacagaa 420

acaaagcgaa taagaaggat ggtgtccaac agggagtccg ctcgacgatc caggaggaga 480

aagcaggcac agttatctga actcgaatca caggtcgagc aactcaaagg cgaaaactca 540

tccctcttca agcagctcac agagtccagc cagcagttca atacagcggt cacggacaac 600

aggatcctca aatcggatgt agaggcctta agagtcaagg tcaagatggc tgaagacatg 660

gtcgcgaggg ccgcgatgtc gtgtggcctg ggccagctcg ggctggcgcc attgctcagc 720

tccaggaaga tgtgccaagc tttggatatg ctcagtttac cacggaacga tgcctgtggt 780

ttcaaaggct tgaacctggg tcgacaggtt cagaactcac cggttcaaag cgctgcaagc 840

ctagagagcc tggacaactg gatatccagc gaggtgacca gctgctcggc tgatgtgtgg 900

ccttaa 906

<210>3

<211>153

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>3

Met Ser Ser Gly Thr Ser Ser Gly Ser Ser Gln Gly Thr Arg Ser Ser

1 5 10 15

Arg Ser Glu Asp Asp Leu Asn Leu Gln Ala Gln Met Glu Lys Lys Arg

20 25 30

Lys Arg Arg Lys Glu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Met

35 40 45

Arg Lys Gln Gln His Leu Asp Glu Leu Thr Ser Gln Val Asn Gln Leu

50 55 60

Lys Asn Gln Asn Gln Gln Leu Ser Met Ala Leu Ser Leu Thr Thr Gln

65 70 75 80

Asn Leu Val Ala Val Gln Ala Gln Asn Ser Val Leu Gln Thr Gln Glu

85 90 95

Leu Glu Leu Gln Ser Arg Leu Cys Ala Leu Thr Asp Ile Leu Met Cys

100 105 110

Met Asn Asn Thr Ser Ala Thr Pro Thr Pro Thr Ile Pro Ala Thr Thr

115 120 125

Thr Ser Ala Cys Asp Ile Phe Gly Ala Ser Ser Trp Asn Gln Pro Pro

130 135 140

Ile Asp Leu Tyr Gln Tyr Gln Cys Phe

145 150

<210>4

<211>462

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>4

atgtcgagtg ggacctcgtc cgggtcgagc cagggaaccc ggagctccag gtcggaagat 60

gacctgaacc tccaggccca gatggagaag aagaggaaga ggaggaagga gtcgaaccga 120

gagtcggctc ggaggtctag gatgaggaag caacagcacc tcgacgaact cacctcgcag 180

gtgaaccagc tgaagaatca gaaccagcag ctgagcatgg cactgagcct gaccacacag 240

aaccttgtgg cagtgcaggc acagaactca gtgctgcaaa cccaggagtt ggagctgcag 300

agcaggctgt gtgccctaac tgacatcctg atgtgcatga acaacaccag tgctactcct 360

actcctacaa ttccagccac cactacaagt gcttgtgata tttttggtgc cagctcatgg 420

aaccagccac ccatagactt gtaccagtac cagtgcttct ga 462

<210>5

<211>173

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>5

Met Leu His His His Tyr His Gly Glu Val Ala Ser Leu His Cys Leu

1 5 10 15

Ser Pro Pro Ser Leu Pro Phe Ser Ser His Tyr His Ser Asn Met Ile

20 25 30

Thr Met Ala Pro Ser Pro Phe His Phe Pro Ala Ala Thr Cys Glu Pro

35 40 45

Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Val Ala Gly Asn Arg Pro Ala Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Thr Asp Asp Ala Tyr Gln Met Ala Ala Glu Glu Glu Arg Arg

65 70 75 80

Arg Arg Arg Met Ile Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Met

85 90 95

Arg Lys Gln Arg Gln Leu Ser Glu Leu Arg Gly Gln Val Val His Leu

100 105 110

Arg Asp Ala Asn Arg Arg Leu Leu Asp Glu Leu Asn Gln Ala Met Arg

115 120 125

Gly Cys Ser Asp Val His Cys Glu Asn Ala Arg Leu Arg Lys Glu Arg

130 135 140

Ala Glu Leu Gln Thr Lys Leu Glu His Leu Met Gln Ala Gln Lys Asn

145 150 155 160

Asn Thr Ser Pro Ser Ser Ser Gln Pro Cys Glu Asn Ile

165 170

<210>6

<211>522

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>6

atgctgcacc accattacca tggcgaggtg gccagcctgc actgcctctc acctccaagc 60

ctaccattca gttcccacta ccacagcaac atgatcacca tggcaccctc gcccttccac 120

ttcccagcag ctacctgtga acctatccag gaattgctcc ctgtggtagc gggcaatcgc 180

ccagccggct ctggcagcac agatgacgcc taccagatgg cagcggagga ggagcggagg 240

cggcggagga tgatctccaa ccgggagtcg gcacggcggt cgcgcatgcg caagcagcgg 300

cagctcagcg agctgagggg gcaggttgtc cacctccgtg acgccaaccg ccgcctcctt 360

gatgagctca accaagcaat gaggggctgc agtgatgtcc actgcgagaa cgcccggctc 420

aggaaggaga gggccgagct ccagaccaag ctcgagcacc tcatgcaagc acagaagaat 480

aacacctcgc cgagctcctc acagccatgc gagaatattt ga 522

Claims

1.一种水稻bZIP基因及其编码的蛋白质在提高植物耐逆性能上的应用，所述bZIP基因编码具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)序列表中的SEQ ID NO：3；

3)序列表中的SEQ ID NO：5；

4)将序列表中SEQ ID NO：1、3或5的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白质具有调控植物耐旱性的功能。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述bZIP基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐逆性提高的转基因植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述bZIP基因的序列为该基因的cDNA序列或基因组基因序列，或者是与所述cDNA序列或基因组基因序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述bZIP基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：2；

2)序列表中的SEQ ID NO：4；

3)序列表中的SEQ ID NO：6；

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述bZIP基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体为pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway^TM系列载体、pCAMBIA系列载体、per8或pX6；所述可在原核生物中复制的载体为pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：用所述bZIP基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：用所述bZIP基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在所述植物表达载体中加入选择性标记基因，所述选择性标记基因包括但不限于：可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶的基因、发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物和抗化学试剂标记基因。