CN107586324A - TabZIP15蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TabZIP15蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了蛋白，命名为TabZIP15，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明了，本发明通过对小麦逆境胁迫处理，筛选出响应逆境胁迫的转录因子TabZIP15基因，其受盐、PEG、冷胁迫和ABA诱导，将其导入拟南芥总，得到转TabZIP15拟南芥，将其进行功能鉴定，表明TabZIP15提高了转基因拟南芥的抗旱性和抗冻性，为培育抗性植物提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种TabZIP15蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
恶劣的生长环境(极端温度、盐碱、干旱等)严重影响植物的生长发育、降低作物的产量。植物不能通过移动来避免逆境胁迫，因此为了消除或是降低逆境胁迫对自身造成的危害，植物在进化的过程中，形成了复杂的调控网络，使得植物在面临逆境胁迫时能通过细胞水平，分子水平等的调节来适应不适宜的生长环境。为了降低不利的生长环境造成的农作物的巨额损失，保证粮食安全，如何提高农作物的抗逆性，受到了世界各国政府的关注。对农作物进行基因改良提高自身的抗逆性，是一种有效的方法。
转录因子是一种调节基因，是调控网络中重要的分子，它通过信号转导和对逆境响应基因的调控，几乎参与生物体所有的生命过程，其中bZIP是一大类转录因子家族，且广泛参与植物应答生物与非生物胁迫，在植物应答胁迫过程当中起了关键的作用。但在小麦中抗逆相关的TabZIP转录因子的功能研究相对较少。
发明内容
本发明的一个目的是提供TabZIP15蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白，命名为TabZIP15，是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
为了使(1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列1第100-855位所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
重组载体为将序列1第100-855位核苷酸插入pEarleyGate 100载体的两个attB位点间得到的载体，为过表达TabZIP15基因载体，命名为pEarleyGate 100-TabZIP15。
扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌在培育抗逆性提高转基因植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述抗逆性为抗干旱和/或抗低温；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
本发明另一个目的是提供一种培育抗逆性提高转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物；
所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物；
上述方法中，所述抗逆性为抗干旱和/或抗低温；
上述方法中，上述转基因植物的抗干旱高于所述目的植物体系在干旱胁迫下所述转基因植物的存活率高于所述目的植物；
上述转基因植物的抗低温高于所述目的植物体系在低温胁迫下所述转基因植物的存活率高于所述目的植物。
干旱胁迫为不浇水；低温胁迫为-10℃；
上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
所述双子叶植物具体为十字花科植物，具体为拟南芥。
本发明的实验证明，本发明的通过对小麦逆境胁迫处理，筛选出响应逆境胁迫的转录因子TabZIP15基因，其受盐、PEG、冷胁迫和ABA诱导，将其导入拟南芥中，得到转TabZIP15拟南芥，将其进行功能鉴定，表明TabZIP15提高了转基因拟南芥的抗旱性和抗冻性，为培育抗性植物提供基础。
附图说明
图1为TabZIP15在不同胁迫处理下的表达模式。
图2为转TabZIP15拟南芥的抗旱性鉴定。
图3为转TabZIP15拟南芥抗旱处理成活率。
图4为转TabZIP15拟南芥抗冻性鉴定。
图5为转TabZIP15拟南芥抗冻处理成活率。
上述各图中，WT：野生型；L1,L2,L3:转TabZIP15拟南芥植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、TabZIP15基因的发现
一、TabZIP15基因的发现
实验室前期的工作构建了几个小麦全长cDNA文库，通过对cDNA质粒的测序，根据转录因子结构特点预测到bZIP转录因子，得到了TabZIP15基因的全长cDNA序列。
小麦中的TabZIP15基因的核苷酸序列为序列1，开放阅读框为序列1第100-855位核苷酸；编码的蛋白TabZIP15，其氨基酸序列为序列2。
二、TabZIP15基因在逆境条件下的表达
将用于胁迫处理的中国春，抗旱小麦旱选10号，抗盐小麦茶淀红，分别在25℃、16h光照/8h黑暗光周期下培养10天，然后进行不同的胁迫处理。中国春用于4℃冷处理及ABA处理，冷处理时于0、1、3、7、12、24、和48h时取叶片组织，ABA处理时于0、1、3、7、12、24和48h时取根组织。抗旱小麦旱选10号，用于16.1％PEG6000处理，于0、1、3、7、12、24和48h时取根组织。抗盐小麦茶淀红，用于250mM的盐处理，于0、1、3、7、12、24和48h时取根组织。提取所取样品的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用基因的特异性引物(F引物，GCTAGCCCGAGGGAAACAAT；R引物，TGCTTGAAGAGGGTTGCACT)进行扩增，以TaTubulin基因(F引物，ACCGTGGTGATGTTGTGC；R引物，TGGTGGCTGGTAGTTGATA)为内参。
结果如图1所示，可以看出，在NaCl处理条件下，TabZIP15的表达量迅速升高，在处理1h时表达量即达到最大值，且表达量持续升高至48h。在PEG处理下，TabZIP15受PEG的诱导程度较低，只是随着PEG诱导时间的增长，表达量稍有下降。在冷处理的条件下，TabZIP15受冷的强烈诱导，在处理1h时，表达量即明显上升，然后随着处理时间的增加持续上升至7h，并达到了最大表达量，随后表达量逐渐下降，且在48h时表达量仍高于处理前的表达量水平。在ABA处理的条件下，TabZIP15在处理1h时表达量即明显升高，随后随着处理时间的增长，表达量又逐渐下降。
实施例2、TabZIP15基因在抗逆性的应用
一、转TabZIP15拟南芥的制备
1、利用Gateway方法构建拟南芥转化的过表达载体
BP质粒为将序列1第100-855位所示的TabZIP15基因插入入门载体pDONRTM/Zeo(Invitrogen,12535035)得到的质粒。
LR反应：将上述BP质粒与pEarleyGate 100过表达载体通过Gateway技术的方法进行LR反应，得到重组载体。LR反应体系如下表2：
表2为LR反应
重组载体为将序列1第100-855位核苷酸插入pEarleyGate 100载体的两个attB位点位点间得到的载体，为过表达TabZIP15基因载体，命名为pEarleyGate 100-TabZIP15。
2、农杆菌的转化
将重组载体pEarleyGate 100-TabZIP15转入农杆菌GV3101(GV3101农杆菌感受态细胞、上海超研生物科技有限公司、CC3201)中，得到重组菌GV3101/pEarleyGate 100-TabZIP15(提取质粒，测序正确)。
3、农杆菌侵染转化拟南芥及转基因植株的筛选
A)拟南芥的培养
1)在无菌条件下，用10℅的次氯酸钠溶液将野生型拟南芥clo-0(Nitschke S,Cortleven A,Iven T,Feussner I,Havaux M,Riefler M,Schmülling T.2016.CircadianStress Regimes Affect the Circadian Clock and Cause Jasmonic Acid-DependentCell Death in Cytokinin-Deficient Arabidopsis Plants.Plant Cell.[Epub aheadof print])种子消毒15min，用无菌水清洗干净，然后将种子铺于MS培养基上培养。
2)将MS培养皿放于4℃春化2天后，再转移至22℃温室中培养，待在MS培养基上培养1周后，将幼苗移入土壤中继续培养，当转移至土壤中时，需保湿2-3天。
3)待拟南芥植株生长至大部分花蕾即将开花时，开始进行农杆菌侵染转化。
B)农杆菌侵染转化拟南芥
1)用无菌牙签沾取经GV3101/pEarleyGate 100‐TabZIP15菌液PCR鉴定正确的农杆菌菌液，在YEB固体培养基(含有抗生素Rif:30μg/mL,Gen:30μg/mL,Kan:50μg/mL)划线，倒置于28℃培养箱中，暗培养2-4天。
2)待长出单克隆后，向YEB液体培养基(含有抗生素Rif:30μg/mL,Gen:30μg/mL,Kan:50μg/mL)中，接种单菌落，放于28℃摇床，210rpm培养过夜。
3)准备200ml YEB液体培养基(含有抗生素Rif:30μg/mL,Gen:30μg/mL,Kan:50μg/mL)，向其中加入1mL过夜培养的农杆菌菌液。于28℃摇床，210rpm过夜培养，直至菌液颜色呈现为橘黄色为止。
4)将上述培养好的200mL农杆菌菌液倒入无菌的离心管中，于室温收集菌体，5000rpm，离心15min。
5)以1/2MS+5％蔗糖+20μlsilwet比例，准备100mL的转化渗透液中，将收集的农杆菌菌体悬浮于转化渗透液中。
6)用大培养皿装上农杆菌的转化渗透液，将拟南芥整个花序侵入渗透液中30s，侵染后的拟南芥平放于托盘中，在黑暗条件下放置培养24h，然后将侵染的拟南芥放置在正常培养条件下培养。根据拟南芥的生长状态，一周后可选择再次侵染拟南芥，以提高转化效率，收获得到T1代转TabZIP15拟南芥的种子。
4、转TabZIP15拟南芥鉴定
提取上述阳性转TabZIP15拟南芥叶片的RNA，反转录得到cDNA为模板，用F引物，GCTAGCCCGAGGGAAACAAT；R引物，TGCTTGAAGAGGGTTGCACT；引物进行RT-PCR扩增，以AtActin基因为内参(F引物，GTCTGGATTGGAGGGTC；R引物，TGAGAAATGGTCGGAAA)，得到253bpPCR产物的为阳性T1代转TabZIP15拟南芥。
阳性T1代转TabZIP15拟南芥经过扩繁继代，得到T2代转TabZIP15拟南芥，即为纯合转TabZIP15拟南芥株系。
采用同样的方法，将空载体pEarleyGate 100转入野生型拟南芥中，得到转pEarleyGate 100拟南芥。
二、转TabZIP15拟南芥的抗逆性研究
选取纯合转TabZIP15拟南芥和野生型拟南芥进行如下处理，每个株系10株，实验重复3次，结果取平均值：
1)抗干旱处理
野生型拟南芥、纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3和转pEarleyGate 100拟南芥幼苗在MS培养基上培养1周后分别转移至土壤中，在22℃9h短日照条件下继续培养。在前期拟南芥植株生长于正常培养条件，待幼苗生长3周，较为健壮时，停止浇水，随时观察幼苗的生长状态，待植株出现严重萎蔫、干枯时，对植株进行复水，复水5天后再观察拟南芥植株的生长状态。以一直正常培养为对照。
结果如图2所示，可以看出，干旱处理后，纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3生长好于野生型拟南芥，表明纯合转TabZIP15拟南芥抗旱性提高。
复水5天后，大多数野生型植株基本死亡，而一些转基因植株可以恢复正常生长状态，分别统计纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3株系和野生型拟南芥的存活率＝(成活植株数/总植株数)*100％。
结果如图3所示，干旱处理后，纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3株系的成活率显著高于野生型株系。
转pEarleyGate 100拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
2)抗低温处理
22℃16h光照培养3周龄阳性纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3、野生型拟南芥(WT)和转pEarleyGate 100拟南芥，在-10℃生长3h。以正常培养为对照(CK，未进行-10℃低温处理)。
结果如图4所示，可以看出，在-10℃条件下，纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3生长好于野生型拟南芥，表明纯合转TabZIP15拟南芥抗低温性提高。
冻处理后，大多数野生型植株基本死亡，而一些转基因植株可以恢复正常生长状态，分别统计纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3和野生型的存活率＝(成活植株数/总植株数)*100％。
结果如图5所示，纯合转TabZIP15拟南芥株系L1、L2、L3的成活率显著高于野生型株系。
转pEarleyGate 100拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
上述结果中，过表达TabZIP15的拟南芥具有抗逆性，表明TabZIP15具有抗逆性。
Claims (10)
1.一种蛋白，是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列1第100-855位所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用；
或权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育抗逆性提高转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述抗逆性为抗干旱和/或抗低温；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.一种培育抗逆性提高转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，
所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述抗逆性为抗干旱和/或抗低温。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
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