CN102776226A - 利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽天蚕素B（CB）及杂合抗菌肽天蚕素B（CB2、CB3），在植物表达体pCAMBIA1390中插入了CaMV35S启动子，获得pCAMBIA1390R；分别插入CB、CB2、CB3基因，通过农杆菌介导转化至苜蓿中，获得了转基因苜蓿。通过实验证明，CB、CB2、CB3基因已整合到苜蓿的基因组中，转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、沙门杆菌有抑制活性，而野生型苜蓿没有抑制活性，CB3转基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性强、适应范围广、利用年限长、再生性强及每年可以收获多次的特点；而由于转基因苜蓿转入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用转基因苜蓿作为生物反应器生产抗菌肽天蚕素B，可以更大地降低了生产抗菌肽天蚕素B的成本。

Description

利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽的方法
技术领域
本发明涉及生物领域，确切地说，涉及利用苜蓿作为生物反应器生产抗菌肽天蚕素B（Cecropin B,CB）的方法。
背景技术
抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是广泛存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的一类小分子多肽，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。
天蚕素抗菌肽（cecropins）是第一个被发现目前研究比较清楚的抗菌肽，在动物中广泛存在，是最具潜力的抗生素替代品之一。天蚕素（cecropins）对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，构成宿主防御细菌、真菌等入侵的重要分子屏障，而对真菌和真核细胞没有毒性。研究发现， cecropins能够通过抑制大肠杆菌细胞外膜蛋白相关基因的转录，导致细胞的通透性增加，从而抑制细菌生长。cecropins也能通过抑制细胞的呼吸作用杀灭细菌。有些cecropins通过干扰信号传导通路而间接发生，影响病毒基因转录。cecropins可以对烟草花叶病毒(TMV)、疱疹病毒(HSV-1)、I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的复制全过程进行干扰。目前，抗菌肽要广泛使用，目前还需要解决一些问题。首先是来源问题。由于昆虫抗菌肽的天然资源有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，成本较高。而在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。所以，非常有必要再寻找一条新的、能够降低抗菌肽生产成本的途径。
近年来，随着植物分子生物学的飞速发展以及植物遗传分析和遗传工程技术的不断革新，转基因植物在基础研究和生产实践上都具有其重要意义。利用转基因植物作为生物反应器的研究和开发也在快速的发展，近年越来越受到人们的关注。转基因植物生物反应器的研究使植物以极低的费用大量生产外源蛋白，具有极大的商业价值；利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白不仅可以大大降低生产成本，而且简化了它们的贮存运输和使用的方式；用植物作为生物反应器，可以使外源基因以农杆菌或植物病毒为载体介导的在其中表达，因为植物体只表达病原菌的部分免疫蛋白，不含致病微生物，对人畜相对较安全，提高了其表达产物的生物安全性。
由于紫花苜蓿具有抗逆性强，适应范围广，利用年限长，再生性强的特点，每年可以收获多次，而且苜蓿本身能固氮，需肥量少，和其他植物相比投入少、生物量大，所以我们能在低成本的情况下大量生产有抑菌活性的蛋白，有利于植物系统表达外源蛋白的产业化发展。
目前抗菌肽的实际开发和应用也有了诸多的实例。用途主要集中在养殖、植物抗病和应用剂型等方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于表达生产杂合抗菌肽天蚕素B的植物表达载体。
一种植物表达载体，它是在植物表达体pCAMBIA1390中插入了CaMV35S启动子，命名为pCAMBIA1390R；在pCAMBIA1390R中插入其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3、2或1的基因，分别命名为pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2和pCAMBIA1390RCB。
一种杂合抗菌肽天蚕素B的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
    所述的杂合抗菌肽天蚕素B的基因为人工合成。
本发明另一个目的是，提供一种转基因植物的生产方法，pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2或pCAMBIA1390RCB通过农杆菌介导，转化至苜蓿中，获得含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿。
本发明的又一个目的是，提供一种利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽B的方法。
利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽B的方法，种植上述方法获得的含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿，提取抗菌肽天蚕素B。
本发明提供了抗菌肽天蚕素B（CB）及杂合抗菌肽天蚕素B（CB2、CB3），在植物表达体pCAMBIA1390中插入了CaMV35S启动子，命名为pCAMBIA1390R；在pCAMBIA1390R中分别插入CB、CB2、CB3基因，获得植物表达载体pCAMBIA1390RCB、pCAMBIA1390RCB2和pCAMBIA1390RCB3。通过农杆菌介导转化至苜蓿中，获得了转基因苜蓿。通过实验证明，CB、CB2、CB3基因已整合到苜蓿的基因组中，转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、沙门杆菌有抑制活性，而野生型苜蓿没有抑制活性， CB3转基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性强、适应范围广、利用年限长、再生性强及每年可以收获多次的特点；而由于转基因苜蓿转入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用转基因苜蓿作为生物反应器生产抗菌肽天蚕素B，可以更大地降低了生产抗菌肽天蚕素B的成本。
附图说明
图1为植物表达体pCAMBIA1390R质粒图谱；
图2为植物表达体pCAMBIA1390R-CB结构示意图
图3为pCAMBIA1390R- CB的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二泳道为质粒酶切后片段；
图4为植物表达体pCAMBIA1390RCB的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker；第二泳道为阴性对照；3-7泳道 PCR鉴定LBA4404的菌落。
图5 为Puc-T-CB2的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker；2-3为 PCR鉴定LBA4404的菌落
图6是Puc-T-CB2的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二,三泳道为质粒酶切后片段；
图7为植物表达体pCAMBIA1390R-CB2结构示意图
图8是pCAMBIA1390R- CB2的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二，三泳道为质粒酶切后片段；
图9是pCAMBIA1390R-CB2的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker； 1，2为PCR鉴定LBA4404的菌落
图10为植物表达体pCAMBIA1390R-CB3结构示意图
图11是Puc-T-CB3的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker； 1，2为PCR鉴定的菌落
图12是Puc-T-CB3的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二，三泳道为质粒酶切后片段；
图13是pCAMBIA1390R-CB3的酶切鉴定电泳图，其中第一泳道为marker，第二，三泳道为质粒酶切后片段；
图14是pCAMBIA1390R-CB3的PCR鉴定农杆菌阳性克隆图，其中第一泳道为marker； 1，2为PCR鉴定LBA4404的菌落
图15是潮霉素对苜蓿愈伤组织生长的抗性筛选
图16为pCAMBIA1390R-CB1转基因植株PCR检测图，其中第一泳道为marker DL2000；第二泳道为为阴性对照； 2-5泳道为转基因植株
图17是pCAMBIA1390R-CB2转基因植株的PCR检测图，其中第一泳道为marker， 2-5泳道为转化的苜蓿；
图18为pCAMBIA1390R-CB3转基因植株的PCR检测图，其中第一泳道为marker DL2000；第二泳道为阳性质粒pCAMBIA1390R-CB3；第三泳道为阴性对照； 4-7泳道为转基因植株
图19为pCAMBIA1390R-CB1转基因植株RT-PCR检测图，其中第一泳道为marker DL2000；第二泳道为阳性质粒pCAMBIA1390R-CB3；第3泳道为阴性对照,4-11泳道为转基因植株
图20是转基因植株的Southern Blot 检测图，其中第一泳道为HindIIIDNA size marker，第二泳道为阳性质粒对照; 第三泳道为野生型苜蓿基因组; 第五泳道为pCAMBIA1390RCB转基因植株.六，七泳道为pCAMBIA1390RCB2转基因植株.八，九泳道为pCAMBIA1390RCB3转基因植株
图21是琼脂糖扩散法测抑菌活性检测图，其中:A为金黄色葡萄球菌;B为沙门杆菌; 1为pCAMBIA1390R-CB转基因植株提取的蛋白;2为pCAMBIA1390R-CB2转基因植株提取的蛋白；3,4为pCAMBIA1390-CB3转基因植株提取的蛋白,其中，3为人工合成的CB3，4为按照同尾酶的的方法串联的CB3；－:为阴性对照。
图22为琼脂糖扩散法测抑菌活性检测的抑菌活性柱形图，其中：A为金黄色葡萄球菌;B为沙门杆菌; 1为pCAMBIA1390R-CB转基因植株提取的蛋白;2为pCAMBIA1390R-CB2转基因植株提取的蛋白；3,4为pCAMBIA1390-CB3转基因植株提取的蛋白, 其中，3为人工合成的CB3，4为按照同尾酶的的方法串联的CB3。
具体实施方式
实施例1植物双元表达载体pCAMBIA1390R的构建
pCAMBIA1390R质粒为本实验室构建，是以植物表达载体pCAMBIA1390为基本骨架，用内切酶XhoI与BglI进行酶切，回收得载体大片段；与体外合成的花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子进行连接，获得了含有CaMV35S启动子的植物表达载体，命名为pCAMBIA1390R。pCAMBIA1390R质粒图谱见图1。
实施例2 植物表达载体pCAMBIA1390R-CB构建及转化
1、根据GenBank上登录的CecropinB碱基序列，应用Primer Premier 5.0软件按照植物偏好密码子将CB碱基序列重新改造，人工合成单基因CB，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。设计引物：
P1：CGG GGTACC ATGAACTTCGCGAAGATCCT
    P2：AAAACTGCAG TCACTTCCCTATTGCTTTAG
以人工合成单基因CB模板，PCR扩增。PCR反应条件： 94.0℃预变性5min，94.0℃变性 35s，65.0℃退火 35s，72.0℃延伸 35s，30个循环，72.0℃后延伸 2min， 4℃ 保存至结束。1%琼脂糖凝胶电泳检测条带正确且无非特异性条带后，用PCR清洁回收试剂盒纯化回收，回收单基因CB。
将回收的单基因CB片段与Puc19-T在16℃水浴下过夜连接，连接体系如下：
表1连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
pUC19-T 0.5μl
CB基因 4.5μl
Total volume 10μl
获质粒Puc19-T- CB。将质粒转化感受态大肠杆菌DH5-α中，扩大培养。
2、植物双元表达载体pCAMBIA1390R-CB的构建
用限制性内切酶Kpn I和PstI，将测序正确的Puc19-T- CB1和pCAMBIA1390R分别进行酶切，回收小片段CB和大片段pCAMBIA1390R。
 
表3 Kpn I的酶切反应体系
Component Volume
10×L buffer 5μl
Kpn I 1.5μl
PucT-CB∕pCAMBIA1390R 35μl∕15μl
ddH2O 8.5μl∕28.5μl
Total volume 50μl
表4 Bgl II的酶切反应体系
Component Volume
10×H buffer 5μl
PstI 1.5μl
Puc-T-CB∕pCAMBIA1390R 35μl∕15μl
ddH2O 8.5μl∕28.5μl
Total volume 50μl
将经酶切后的大小片段按反应体系与连接酶混合，连接反体系见表5，在16 ℃连接反应120min。将10 μl连接反应液全部加入到含100 μl感受态大肠杆菌DH5α的EP管中，置于冰浴30 min，然后在42 ℃恒温水浴中进行热击90 s (此时勿动)，立即将热击后的EP管置冰上静置5 min，加入500 μl新鲜LB培养液，37 ℃，150～180 rpm振荡培养45～60 min，然后取50～100 μl菌液涂布于含kan50 μg/ml的LB平板上，37 ℃过夜培养。
 
表5连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
大片段（pCAMBIA1390） 0.5μl
小片段（目的基因CB） 4.5μl
Total volume 10μl
挑取平板上生长的抗性单菌落，用P1， P2引物对其进行菌落PCR鉴定筛选阳性单菌落。
表6 PCR扩增反应体系 
Component Volume
Promix TagE  10μl
引物P1 1μl
引物P2 1μl
模板（单菌落） 2μl
ddH2O 6μl
Total volume 20μl
PCR反应条件： 94.0℃预变性5min，94.0℃变性 40s，65.0℃退火 40s，72.0℃延伸 40s，30个循环，72.0℃后延伸 3min， 4℃ 保存至结束。用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR鉴定为阳性的单菌落接种含kan50 μg/ml的5 ml LB液体培养液中，37 ℃ 180 rpm振荡过夜培养并保种，将携带单基因CB的载体pCAMBIA1390R，命名为pCAMBIA1390R-CB；其结构示意图如图2所示；用Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0质粒提取试剂盒提取阳性克隆菌质粒，用Pst I和KpnI双酶切做进一步酶切鉴定，鉴定大小正确的菌株即为含目的基因的转化菌株。
3、植物双元表达载体pCAMBIA1390 R-CB转染农杆菌菌株LBA4404
1)将重组质粒pCAMBIA1390R-CB 1 μl加入到LBA4404感受态农杆菌中；
2) 在液氮中冻藏5 min；
3) 42 ℃水浴热击1 min；
4) 加800μlLB（含Rif 50㎎/L,Str 50㎎/L）培养液至Ep管中，28 ℃，180 rpm震荡培养2～4小时；
5) 取50 μl～100 μl转化菌液涂布于含50 μg/ml Kan、50 μg/ml Str和100 μg/ml Rif的LB平板上，于28 ℃培养2～3天，筛选转化子。
利用冻融法将重组质粒pCAMBIA1390R-CB转化入农杆菌菌株LBA4404中；用菌落PCR的方法对转化菌落进行鉴定（见图3），经鉴定为阳性的菌落即为含重组质粒pCAMBIA1390R-CB的农杆菌菌菌株LBA4404。对阳性菌株进行扩大培养并-80℃冰箱保存，用作对植物的转化。
实施例3植物表达载体pCAMBIA1390R-CB 2 构建
1、设计引物：
P3：CGG GGTACC AGATCTATGAAC TTCGCGAAGATCCT
P4：AAAA CTGCAG GGATCCCTTCCCTATTGCTTTAGCAGAC
以其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，人工合成的单基因CB为模板，按表7反应体系；
表7 第一轮PCR反应体系
Component Volume
dNTP Mix   4μl
10× Buffer 5μl
引物P3 1μl
引物P4 1μl
Pyrobest DNA polymerase 0.25μl
H2O 38.75μl
Total volume 50μl
PCR反应条件： 94.0℃预变性5min，94.0℃变性 35s，65.0℃退火 35s，72.0℃延伸 35s，30个循环，72.0℃后延伸 2min， 4℃ 保存至结束。1%琼脂糖凝胶电泳检测条带正确且无非特异性条带后，用PCR清洁回收试剂盒纯化回收，回收产物单基因CB。
   将回收产物单基因CB片段与Puc19-T在16℃水浴下过夜连接，连接体系如下：
表8连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
pUC19-T 0.5μl
CB基因 4.5μl
Total volume 10μl
将质粒命名为质粒Puc19-T-CB。
质粒Puc19-T-CB转化大肠杆菌DH5-α
1) 将上述所得的连接反应液加到预先制备好的装有100μl感受态大肠杆菌DH5-αEP管中，冰浴30min；
2) 42℃，热击90s（静置，勿动），然后立即冰上静置5min；
3) 立即加入500μl新鲜LB培养基，37℃，150～180r/min，培养45～60min；
4) 取50～100μl培养液涂布于含Amp(100μg/ml)及80μg/mlX-Gal 和0.5mM IPTG的LB固体培养基中，37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选。
5) 挑选白色菌落用菌落PCR法鉴定阳性重组子，然后将经筛选到的抗性单菌落于附加Amp(100μg/ml)的LB培养液中摇菌培养，用DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒，将质粒进行进一步的酶切鉴定，酶切条件及方法如上所述，将鉴定为阳性的质粒送测序公司进行测序，测序工作由北京三博远志有限公司完成。测序结果正确。
将Puc-T-CB质粒用BamH I和PstI在37℃水浴进行过夜酶切进行双酶切，酶切体系如下：
表9 第一轮酶切反应体系
Component Volume
10×H buffer 5μl
BamH I 0.75μl
PstI 0.75μl
Puc19-T-CB质粒 15μl
ddH2O  28.5μl
Total volume 50μl
经1%琼脂糖凝胶电泳，在长波长紫外光照射下用手术刀片切下目的片段，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒纯化回收，命名为串联体CB。
表10第二轮酶切反应体系
Component Volume
10×H buffer 5μl
PstI 0.75μl
BagI I 0.75μl
Puc19-T-CB质粒 15μl
ddH2O  28.5μl
Total volume 50μl
同时将Puc19-T-CB质粒用PstI和 BagI I在37℃水浴进行过夜酶切。经1%琼脂糖凝胶电泳，在长波长紫外光照射下用手术刀片切下目的片段，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒纯化回收，命名为串联体Puc-T-CB。将串联体Puc-T-CB与串联体CB在16℃水浴下过夜连接，连接体系如下：
表11连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
Puc-T-CB 0.5μl
CB 4.5μl
Total volume 10μl
连接后的产物——携带CB-CB基因的Puc19-T命名为Puc19-T-CB2。
Puc19-T-CB2转化大肠杆菌DH5-α
1) 将上述所得的连接反应液加到预先制备好的装有100μl感受态大肠杆菌DH5-αEP管中，冰浴30min；
2) 42℃，热击90s（静置，勿动），然后立即冰上静置5min；
3) 立即加入500μl新鲜LB培养基，37℃，150～180r/min，培养45～60min；
4) 取50～100μl培养液涂布于含Amp(100μg/ml)及80μg/mlX-Gal 和0.5mM IPTG的LB固体培养基中，37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选。
5) 挑选白色菌落用菌落PCR法鉴定阳性重组子（如图5），然后将经筛选到的抗性单菌落于附加Amp(100μg/ml)的LB培养液中摇菌培养，用DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒进行进一步的酶切鉴定（如图6），酶切条件及方法如上所述，重组质粒命名为Puc-T-CB2，将鉴定为阳性的质粒送测序公司进行测序，测序工作由北京三博远志有限公司完成。测得CB2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示
2、植物双元表达载体pCAMBIA1390R- CB2的构建
将测序正确的Puc19-T-CB2和pCAMBIA1390R用限制性内切酶Kpn I和PstI进行酶切，回收小片段CB2和大片段pCAMBIA1390R，连接并转化大肠杆菌感受态E.coli DH5α通过菌落PCR筛选阳性克隆菌，摇菌并保种，命名为pCAMBIA1390R-CB2。其结构示意图见图4，提取质粒进行酶切鉴定（见图8）。
3、将鉴定正确的植物双元表达载体pCAMBIA1390-CB2,用冻融法转入农杆菌LBA4404制备工程菌，用PCR法对转化菌落进行鉴定，经鉴定所得阳性单菌落为含目的基因CB2的农杆菌LBA4404（见图9）。
实施例5 植物双元表达载体pCAMBIA1390R-CB 3 构建
1、设计引物：
P5 ：CGG  GGTACC  TCATGA  ATGAAC TTCGCGAAGATCCT
P6：AAAA  CTGCAGCCATGG  CTTCCCTATTGCTTTAGCAGAC
以其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，人工合成的单基因CB为模板，表12反应体系；
表12 第一轮PCR反应体系
Component Volume
dNTP Mix   4μl
10× Buffer 5μl
引物P5 1μl
引物P6 1μl
Pyrobest DNA polymerase 0.25μl
H2O 38.75μl
Total volume 50μl
PCR反应条件： 94.0℃预变性5min，94.0℃变性 35s，65.0℃退火 35s，72.0℃延伸 35s，30个循环，72.0℃后延伸 2min， 4℃ 保存至结束。1%琼脂糖凝胶电泳检测条带正确且无非特异性条带后，用PCR清洁回收试剂盒纯化回收，回收产物命名为单基因CB。
将回收的单基因CB片段与Puc19-T在16℃水浴下过夜连接，连接体系如下：
表13连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
pUC19-T 0.5μl
CB基因 4.5μl
Total volume 10μl
转化大肠杆菌DH5-α
1) 将上述所得的连接反应液加到预先制备好的装有100μl感受态大肠杆菌DH5-αEP管中，冰浴30min；
2) 42℃，热击90s（静置，勿动），然后立即冰上静置5min；
3) 立即加入500μl新鲜LB培养基，37℃，150~180r/min，培养45~60min；
4) 取50~100μl培养液涂布于含Amp(100μg/ml)及80μg/mlX-Gal 和0.5mM IPTG的LB固体培养基中，37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选。
5) 挑选白色菌落用菌落PCR法鉴定阳性重组子，然后将经筛选到的抗性单菌落于附加Amp(100μg/ml)的LB培养液中摇菌培养，用DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒，将质粒命名为Puc19-T-CB，将质粒进行进一步的酶切鉴定，酶切条件及方法如上所述，将鉴定为阳性的质粒送测序公司进行测序，测序工作由北京三博远志有限公司完成。测序结果正确。
将Puc19-T-CB质粒 用Bsph I和PstI进行双酶切，酶切体系如下：
表14 第一轮酶切反应体系
Component Volume
10×H buffer 5μl
Bsph I 0.75μl
PstI 0.75μl
Puc19-T-CB质粒 15μl
ddH2O  28.5μl
Total volume 50μl
在37℃水浴进行过夜酶切。经1%琼脂糖凝胶电泳，在长波长紫外光照射下用手术刀片切下目的片段，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒纯化回收，命名串联体CB。
表15第二轮酶切反应体系
Component Volume
10×H buffer 5μl
PstI 0.75μl
Nco I 0.75μl
Puc19-T-CB质粒 15μl
ddH2O  28.5μl
Total volume 50μl
将各基因片段在37℃水浴进行过夜酶切。经1%琼脂糖凝胶电泳，在长波长紫外光照射下用手术刀片切下目的片段，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒纯化回收，命名为串联体Puc-T-CB。将串联体Puc-T-CB与串联体CB在16℃水浴下过夜连接，连接体系如下：
表16连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
Puc19-T-CB 0.5μl
CB 4.5μl
Total volume 10μl
连接后的产物命名为Puc19-T-CB2串联体。
将Puc19-T- CB2质粒 用Bsph I和 Nco I进行双酶切，酶切体系如下：
表17 第一轮酶切反应体系
Component Volume
10×H buffer 5μl
PstI 0.75μl
Nco I 0.75μl
Puc-T- CB2质粒 15μl
ddH2O  28.5μl
Total volume 50μl
将各基因片段在37℃水浴进行过夜酶切。经1%琼脂糖凝胶电泳，在长波长紫外光照射下用手术刀片切下目的片段，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒纯化回收，得Puc19-T-CB2。
将串联体Puc- CB2与串联体CB在16℃水浴下过夜连接，连接体系如下：
表18连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
Puc19-T- CB2 0.5μl
串联体CB 4.5μl
Total volume 10μl
连接后的产物命名为Puc-T- CB3串联体。
转化大肠杆菌DH5-α
感受态大肠杆菌DH5-α制备方法与转化大肠杆菌方法。同实施例3。
挑选白色菌落用菌落PCR法鉴定阳性重组子（如图11），然后将经筛选到的抗性单菌落于附加Amp(100μg/ml)的LB培养液中摇菌培养，用DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒进行进一步的酶切鉴定（如图12），酶切条件及方法如上所述，重组质粒命名为Puc-T-CB3，将鉴定为阳性的质粒送测序公司进行测序，测序工作由北京三博远志有限公司完成。CB3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
或人工合成其碱基序列如SEQ ID NO.3所示的CB3，用常规方法插入Puc-T中。
2、植物双元表达载体pCAMBIA1390 R-CB3的构建
将测序正确的Puc-T- CB3和pCAMBIA1390R用限制性内切酶Kpn I和PstI进行酶切，酶切反应体系见表19和20。
表19 Kpn I的酶切反应体系
Component Volume
10×L buffer 5μl
Kpn I 1.5μl
Puc- CB3∕pCAMBIAR1390R 35μl∕15μl
ddH2O 8.5μl∕28.5μl
Total volume 50μl
表20 PstI的酶切反应体系
Component Volume
10×H buffer 5μl
PstI 1.5μl
Puc-T- CB3∕pCAMBIAR1390R 35μl∕15μl
ddH2O 8.5μl∕28.5μl
Total volume 50μl
将经酶切后的大pCAMBIAR1390R和小片段CB3按表3-12反应体系与连接酶混合，在16 ℃连接反应120min。将10 μl连接反应液全部加入到含100 μl感受态大肠杆菌DH5α的EP管中，置于冰浴30 min，然后在42 ℃恒温水浴中进行热击90 s (此时勿动)，立即将热击后的EP管置冰上静置5 min，加入500 μl新鲜LB培养液，37 ℃，150～180 rpm振荡培养45～60 min，然后取50～100 μl菌液涂布于含kan50 μg/ml的LB平板上，37 ℃过夜培养。
 
表21连接反应体系
Component Volume
Solution I 5.0μl
大片段（pCAMBIA1390R） 0.5μl
小片段（目的基因CB3） 4.5μl
Total volume 10μl
挑取平板上生长的抗性单菌落，用P3， P2引物对其进行菌落PCR鉴定筛选阳性单菌落。
 
表22 PCR扩增反应体系 
Component Volume
Promix TagE  10μl
引物P5 1μl
引物P6 1μl
模板（单菌落） 2μl
ddH2O 6μl
Total volume 20μl
PCR反应条件： 94.0℃预变性5min，94.0℃变性 40s，65.0℃退火 40s，72.0℃延伸 40s，30个循环，72.0℃后延伸 3min， 4℃ 保存至结束。用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR鉴定为阳性的单菌落接种含kan50μg/ml的5 ml LB液体培养液中，37℃ 180 rpm振荡过夜培养并保种，命名为pCAMBIA1390R -CB3；其结构示意图见图10。用Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0质粒提取试剂盒提取阳性克隆菌质粒，用Pst I和KpnI双酶切做进一步酶切鉴定，鉴定大小正确的菌株即为含目的基因的转化菌株（如图13）。
3、利用冻融法将重组质粒pCAMBIA1390R- CB3转化入农杆菌菌株LBA4404中；用菌落PCR的方法法对转化菌落进行鉴定，经鉴定为阳性的菌落即为含目的基因的农杆菌工程菌菌株（如图14）。对阳性菌株进行扩大培养并-80℃冰箱保存，用作对植物的转化。
实施例6  农杆菌介导的紫花苜蓿转化
将在种子培养基（MS培养基+琼脂7g/L+蔗糖30 g/L）上培养5～7d的紫花苜蓿无菌苗子叶剪成0.3～0.5cm小段；分别用含pCAMBIA1390RCB; pCAMBIA1390R-CB2; pCAMBIA1390R- CB3的农杆菌LBA4404（OD600=0.5～0.6） 浸染5～8 min，然后吸去外植体表面残余菌液，置共培养基（TM-1+ 2,4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30 g/L)上共培养3d（25℃黑暗条件）；转入选择培养基（TM-1+2,4-D2 mg/L+6-BA1 mg/L +NAA0.1 mg/L +Tim300mg/L+ Hyg20 mg/L +琼脂6 g/L+蔗糖30 g/L）进行筛选，每两周继代一次诱导胚性愈伤组织；待组织有绿色芽点出现，将其转移到分化培养基（MS培养基+Tim 300 mg/L+ Hyg 20 mg/L +琼脂7 g/L+ 蔗糖10 g/L）上继续培养，每两周继代一次，待芽长至约3～5cm高时, 将其从外植体上分离开，转移到生根培养基（MS培养基+ Hyg 20 mg/L +琼脂7 g/L + 蔗糖10 g/L）中继续伸长及生根。培养温度25～26℃，每天光照16小时。3～4周后待根系发达后，打开瓶盖，炼苗2～3天，移栽到灭菌的土中继续培养。
实施例7紫花苜蓿抗性植株的PCR检测
取培养185天的潮霉素抗性苗和未转基因植株新鲜叶片各100㎎，置于液氮中研成细粉按照植物基因组DNA提取试剂盒操作方法提取总DNA。取1μL总DNA为模板，用CB基因上游引物P1和下游引物P2为引物，以非转基因植株为阴性对照，分别以表达载体pCAMBIA1390R-CB；pCAMBIA1390R-CB2；pCAMBIA1390R- CB3为阳性对照，对基因进行PCR扩增检测。反应体系为：2×Power Taq PCR MasterMix 10μL,模板DNA1μL，上下游引物各 1μL（10μmol/μL），加ddH2O至20μL。扩增反应条件为：94℃预变性5min ；94℃变性45s，64℃退火45s，72℃延伸45s ，30个循环；72℃后延伸3min。通过0.8%核酸琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下分析扩增的DNA片段。结果显示有目的条带出现，初步证明CB及其串联体已整合进苜蓿基因组。
实施例8  转基因紫花苜蓿的 Southern blot分析
取PCR检测为阳性的紫花苜蓿植株叶片4g，用CTAB法提取苜蓿基因组DNA。每个苜蓿植株样品取40～50μg基因组DNA，用限制性内切酶KpnI酶切过夜。将酶切好的基因组样品用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，使个片段按照分子大小分开，用碱变性法处理凝胶后再利用毛细转移法将酶切后的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上。根据DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ试剂盒制备探针，42℃进行杂交过夜，显色，分析杂交信号。结果在膜上均有杂交信号显示，说明目的基因已成功整合到植物基因组中。
实施例9  CB转基因及其串联体植株体外抗菌活性鉴定
     挑取沙门氏菌和金黄色葡萄球菌单克隆平板培养过夜，调整其浓度达到1×104。提取转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿叶总蛋白，将蛋白滴入到平板上，在适当温度下进行培养。结果显示转基因苜蓿对测试菌有抑制活性，而野生型苜蓿没有抑制活性，并且CB3转基因植株的抑菌活性最高。见图21、22。
<110> 吉林农业大学
 
<120>利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽的方法
 
<160>  3   
 
<210>  1
<211>  192
<212>  DNA
<213>  人工
 
<400>  1
 
atgaacttcg cgaagatcct cagttttgtc ttcgcacttg tgctagcgct tagtatgaca     60
agtgcggcgc ctgaaccccg ttggaagatc tttaagaaaa tagaaaaaat gggtcgtaat  120
attcgtgacg gaatagtcaa agcgggtcca gctatagaag ttctagggtc tgctaaagca  180
atagggaagt ga                                            192
 
<210>  2
<211>  384
<212>  DNA
<213>  人工
 
<400>  2
atgaacttcg cgaagatcct cagttttgtc ttcgcacttg tgctagcgct tagtatgaca     60
agtgcggcgc ctgaaccccg ttggaagatc tttaagaaaa tagaaaaaat gggtcgtaat  120
attcgtgacg gaatagtcaa agcgggtcca gctatagaag ttctagggtc tgctaaagca  180
atagggaagg gatctaactt cgcgaagatc ctcagttttg tcttcgcact tgtgctagcg   240
cttagtatga caagtgcggc gcctgaaccc cgttggaaga tctttaagaa aatagaaaaa  300
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tctgctaaag caatagggaa gtga                                  384
 
<210>  3
<211>  642
<212>  DNA
<213>  人工
 
<400>  3
 
atgaacttcg cgaagatcct cagttttgtc ttcgcacttg tgctagcgct tagtatgaca     60
agtgcggcgc ctgaaccccg ttggaagatc tttaagaaaa tagaaaaaat gggtcgtaat  180
attcgtgacg gaatagtcaa agcgggtcca gctatagaag ttctagggtc tgctaaagca  240
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tttaagaaaa tagaaaaaat gggtcgtaat attcgtgacg gaatagtcaa agcgggtcca  600
gctatagaag ttctagggtc tgctaaagca atagggaagt ga                  642
 

Claims (7)

1.一种植物表达载体，它是在植物表达体pCAMBIA1390中插入了CaMV35S启动子，命名为pCAMBIA1390R；在pCAMBIA1390R中插入其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3、2或1的基因，分别命名为pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2和pCAMBIA1390RCB。
2.根据权利要求1所述的一种植物表达载体，其特征在于：所述的表达载体为pCAMBIA1390RCB3。
3.一种杂合抗菌肽天蚕素B的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
4.  根椐权利要求3所述的一种杂合抗菌肽天蚕素B的基因，所述的杂合抗菌肽天蚕素B的基因为人工合成。
5.一种转基因植物的生产方法，其特征在于：权利要求1所述的植物表达载体通过农杆菌介导，转化至苜蓿中，获得含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿。
6.根据权利要求5所述的一种转基因植物的生产方法，所述的植物表达载体为权利要求2所述的植物表达载体。
7.利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽B的方法，种植按权利要求5方法获得的含抗菌肽天蚕素B的转基因苜蓿，提取抗菌肽天蚕素B。
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