CN107827975A

CN107827975A - 一种用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法

Info

Publication number: CN107827975A
Application number: CN201711336264.4A
Authority: CN
Inventors: 王大勇; 陈林涛
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN107827975B

Abstract

一种利用紫花苜蓿（Medicago sativa L.）表达的基因重组人血清白蛋白及其表达方法，涉及将重组的人血清白蛋白基因转化到紫花苜蓿当中，并加以表达的方法。目的是解决目前人血清白蛋白来源有限且价格昂贵的问题。方法：一、以紫花苜蓿5‑7日龄籽苗的子叶为外植体诱导愈伤组织；二、农杆菌的活化及愈伤组织的转染；三、愈伤组织的筛选培养；四、抗性愈伤组织的分化培养；五、诱导抗性植物再生，对转基因紫花苜蓿的性状进行观测，最终分子鉴定为阳性的即为转基因紫花苜蓿。本发明用于获得利用紫花苜蓿转基因表达的基因重组人血清白蛋白。

Description

一种用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法

技术邻域

本发明涉及一种利用紫花苜蓿(Medicago sativa L.)转基因表达基因重组人血清白蛋白，及其表达方法。

技术背景

人血白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人血液中的主要蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右，每升人血中含有人血白蛋白约40g。除了血浆之外，人血白蛋白还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。HSA前体(preproHSA)在肝脏中合成，并且在高尔基体中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，释放到血液中，对保持血液的正常渗透压具有重要作用；它在血液中作为多种疏水性分子的载体，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等，从而调节人体内的多种生理功能。在体外，它作为多种药物的稳定剂被广泛用于多种疾病的治疗、药物载体、动物细胞培养、血浆替代物等。因此，人血白蛋白是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。在国际市场上具有巨大的需求，每年的需求量高达500吨以上。

目前，临床使用的人血白蛋白主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求。另一方面血液自身也可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的人血白蛋白存在巨大的担忧。随着基因工程和分子生物学的发展，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产重组人血白蛋白，例如利用原核生物如大肠杆菌(MartinLatta,Michael Knapp,et al.Nature Biotechnology,1309-1314(1987))、枯草芽抱杆菌(Charles W,Saunders CW,et al.Journal of Bacteriology,169:2917-2925(1987))，真核生物如酵母(Kaoru Kobayashi.Biologicals.34:55-59(2006))、转基因动物培养(ShaniM,Barash I,et al.Transgenic Res,1:195-208(1992))等，此外，转基因植物邻域已有研究表明在转基因水稻(He Y,Ning T,et al.Proc Natl Acad Sci.U.S.A.108 19078–19083(2011))表达的重组人血白蛋白，在理化性质及其功能与人源血清白蛋白相似。以上这些方法中，有的表达体系表达出的重组蛋白不能正确折叠，有的纯化体系不能避免携带病原体以及生产成本较高，用于规模化生产有一定的困难与局限。

发明内容

本发明是针对现有原核与真核生物反应器的表达量低、无生物活性或不安全等特点，为解决目前人血白蛋白来源有限及价格昂贵的问题，提供一种转基因紫花苜蓿新品种以表达重组人血白蛋白。

本发明利用转基因紫花苜蓿表达基因重组人血清白蛋白的过程，按照以下步骤进行：

一、选择籽粒饱满的紫花苜蓿种子进行表面消毒，先将种子于75％的乙醇中消毒1-2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，25℃暗培养2d后，移至节律光照培养3-5d；

二、分离5-7日龄的紫花苜蓿籽苗的子叶，接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；将培养15-20d的愈伤组织转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；

三、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50-1:100接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD₆₀₀达0.6-0.8，获得活化菌液；

四、取活化后的菌液3500g离心10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD₆₀₀为0.5-0.6，将步骤二中培养的胚性愈伤组织置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养2-3d；

五、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠的MS培养基清洗3次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织分化出抗性芽；

六、将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，对再生植株进行观测；

七、对再生植株进行分子鉴定，获得阳性植株即为转基因紫花苜蓿。

人血清白蛋白具有相对稳定的结构特性，相对于原核表达体系和酵母表达体系，采用转基因紫花苜蓿作为生物反应器能更好的进行转录翻译后的修饰，以保证基因重组人血清白蛋白能正确折叠形成具有生物活性的功能蛋白。紫花苜蓿是重要的豆科多年生草本植物，其分蘖多，产量高，欧亚大陆和世界各国广泛种植为饲料和牧草。此外，紫花苜蓿根粗壮，深入土层，根颈发达，枝叶繁茂，比较耐旱。紫花苜蓿含有5种维生素B、维生素C、维生素E、10种矿物质及类黄酮素、类胡萝卜素、酚型酸三种植物特有的营养素，具有较高的营养价值，从而使它成为了外源蛋白物质表达的良好生物反应器。

本发明采用农杆菌介导的植物基因转化技术将基因重组人血清白蛋白基因导入紫花苜蓿基因组中，通过对转基因再生植株的性状特征进行测量及筛选鉴定后获得含基因重组人血清白蛋白基因的转基因紫花苜蓿植株。目的在于以转基因紫花苜蓿为生物反应器规模化生产基因重组人血清白蛋白，从而解决人血白蛋白的来源短缺和价格昂贵的问题。

附图说明

图1.基因重组人血清白蛋白植物表达载体质粒图谱。

图2.紫花苜蓿遗传转化过程A：无菌子叶；B：子叶诱导形成的愈伤组织；C：脆性胚性愈伤组织；D：农杆菌转染后筛选培养的愈伤组织；E：抗性愈伤组织形成的胚状体；F：抗性再生植株；G：炼苗移栽土壤的再生植株；H：自然条件生长的抗性植株。

图3.转基因紫花苜蓿性状特征A：植株生长习性；B：叶的性状特征；C：荚果的类型。

图4.转基因紫花苜蓿基因组DNA PCR检测结果M：DL5000DNA Marker；-：野生型紫花苜蓿基因组PCR产物(空白对照)；泳道1-8：转基因抗性植株基因组PCR产物；+：质粒pCAMBIA1300-35S-ALB PCR产物(阳性对照)。

图5.转基因紫花苜蓿基因组DNA PCR产物第1位至第300位核苷酸测序峰图。

图6.转基因紫花苜蓿基因组DNA PCR产物第301位至第600位核苷酸测序峰图。

图7.转基因紫花苜蓿基因组DNA PCR产物第601位至第900位核苷酸测序峰图。

图8.转基因紫花苜蓿基因组DNA PCR产物第901位至第1200位核苷酸测序峰图。

图9.转基因紫花苜蓿基因组DNA PCR产物第1201位至第1500位核苷酸测序峰图。

图10.转基因紫花苜蓿基因组DNA PCR产物第1501位至第1761位核苷酸测序峰图。

图11.部分转基因紫花苜蓿蛋白质提取物Western blotting结果。M为分子标记，+为阳性对照(人血清白蛋白)，-为阴性对照(野生型紫花苜蓿)，泳道1-7分别是PCR检测呈阳性的紫花苜蓿叶片蛋白粗提物。

具体实施方式

一种利用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白及其表达方法，用于本发明的进一步说明，但不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式利用转基因紫花苜蓿表达基因重组人血清百蛋白的过程，按以下步骤进行：

一、将籽粒饱满的紫花苜蓿种子进行表面消毒，先将种子于75％的乙醇中消毒1-2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，25℃暗培养2d后，移至节律光照培养3-5d；

本实施方式步骤一中紫花苜蓿种子为紫花苜蓿选育和改良品种赛迪(SARDI)和游客+(Eureka)，购自百绿(天津)国际草业有限公司(百绿中国)。

本实施方式步骤三中YEP培养基成分为：10g/L蛋白胨、10g/L酵母浸膏、10g/L氯化钠，pH值为7.0，固体培养基添加琼脂粉15g/L，常规高温高压灭菌。

本实施方式步骤三中基因重组人血清白蛋白转基因工程菌即把携带基因重组人血清白蛋白基因的pCAMBIA1300载体重组质粒pCAMBIA1300-35S-ALB(图1)转入根癌农杆菌菌株GV3101所筛选鉴定获得的阳性菌株。所述基因重组人血清白蛋白转基因工程菌转入了基因重组人血清白蛋白基因。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中愈伤组织诱导培养基MS基本培养基附加2mg/L 2,4-D,0.25mg/L KT和2g/L水解酪蛋白。愈伤组织继代培养基MS基本培养基附加2mg/L 2,4-D,0.25mg/L KT和1g/L水解酪蛋白。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤四中共培养基为MS基本培养基附加2mg/L 2,4-D,0.25mg/L KT和1g/L水解酪蛋白，乙酰丁香酮100uM。其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三不同的是步骤五中的不定芽诱导分化培养基为MS基本培养基附加0.5mg/L KT和1g/L水解酪蛋白。筛选分化培养基为MS基本培养基附加0.5mg/L KT和1g/L水解酪蛋白，25mg/L潮霉素和300mg/L头孢噻肟钠。其他与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四不同的是步骤五中共培养基为MS基本培养基附加2mg/L 2,4-D,0.25mg/L KT和1g/L水解酪蛋白，乙酰丁香酮100uM。其他与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五不同的是步骤六中的生根培养基为1/2MS基本培养基附加0.1mg/L IBA。培养的条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。其他与具体实施方式一至五相同。

具体实施方式七：本实施方式本实施方式利用转基因紫花苜蓿表达基因重组人血清百蛋白的过程，按以下步骤进行：

一、选择籽粒饱满的紫花苜蓿种子进行表面消毒，先将种子于75％的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，25℃暗培养2d后，移至节律光照培养5d；

二、分离7日龄的紫花苜蓿籽苗的子叶，接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；将培养20d的愈伤组织转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；

三、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:100接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD₆₀₀达0.6，获得活化菌液；

四、取活化后的菌液3500g离心10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD₆₀₀为0.6，将步骤二中培养的胚性愈伤组织置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；

表1.具体实施步骤中所用的培养基

本实施方式中基因重组人血清白蛋白转基因工程菌株中的穿梭质粒T-DNA部分含有潮霉素抗性基因，对潮霉素具有抗性，因此筛选培养和生根培养后可初步证明目的基因(基因重组人血清白蛋白基因)导入到受体植物中。

表2.对阳性转基因紫花苜蓿的性状鉴定结果(参照GB/T 19557.1)

为了进一步排除假阳性植株的存在，需进一步鉴定，对抗性再生植株鉴定方法包括PCR检测。具体步骤如下：

使用北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech)的TransDirect PlantTissue PCR Kit提取步骤六中获得的抗性再生紫花苜蓿的基因组DNA；以再生紫花苜蓿gDNA作为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增(同时设置阳性对照为含目的基因片段的转基因工程菌株质粒，空白对照为非转基因紫花苜蓿基因组DNA)，反应体系如下：

PCR反应条件：

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果(图4)显示的带型与阳性对照一致，将PCR检测呈阳性的植株的PCR产物委托上海生物工程技术服务有限公司进行DNA测序，测序结果与目的基因序列保持一致，说明相对应的转基因紫花苜蓿基因组中已成功插入基因重组人血清白蛋白的基因片段。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法

<130> 2017-12-12

<141> 2017-12-14

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gctttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740

gctgccttag gcttataa 1758

<210> 2

<211> 585

<212> PRT

<213> 人(Human)

<400> 2

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggggtaccg ccaccatgga tgcacacaag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgtcgact tattattata agcctaaggc 30

Claims

1.利用紫花苜蓿转基因表达的基因重组人血清白蛋白，及其表达方法，其特征在于将人类血清白蛋白基因转入紫花苜蓿并加以表达。

2.按以下步骤将人类血清白蛋白基因转入紫花苜蓿并表达：

五、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium)的MS培养基清洗3次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织分化出抗性芽；

3.根据权利要求2所述的一种利用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤二中的愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基附加2mg/L 2,4-D,0.25mg/L KT和2g/L水解酪蛋白。愈伤组织继代培养基为MS基本培养基附加2mg/L 2,4-D,0.25mg/L KT和1g/L水解酪蛋白。

4.根据权利要求2所述的一种利用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤四中共培养基为MS基本培养基附加2mg/L 2,4-D,0.25mg/L KT和1g/L水解酪蛋白，乙酰丁香酮100uM。

5.根据权利要求2所述的一种利用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤五中的不定芽诱导分化培养基为MS基本培养基附加0.5mg/L KT和1g/L水解酪蛋白。筛选分化培养基为MS基本培养基附加0.5mg/L KT和1g/L水解酪蛋白，25mg/L潮霉素和300mg/L头孢噻肟钠。

6.根据权利要求2所述的一种利用紫花苜蓿转基因表达的基因重组人血清白蛋白及其表达方法，其特征在于步骤六中的生根培养基为1/2MS基本培养基附加0.1mg/L IBA。培养的条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。