CN109456969A

CN109456969A - 水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用

Info

Publication number: CN109456969A
Application number: CN201811346577.2A
Authority: CN
Inventors: 华红霞; 李翰鹏; 蔡万伦
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-11-13
Also published as: CN109456969B

Abstract

本发明公开一种水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用，所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子命名为：P_AOS1，其长度为1889bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该启动子是从水稻“中花11”基因组中克隆合成茉莉酸(JA)关键基因即为丙二烯氧化物合酶基因OsAOS1的启动子，并对启动子P_AOS1缺失得到6个5’端不同长度缺失片段，研究发现三个区域存在受褐飞虱取食特异表达正调控元件，同时，此三个区域不会受二化螟取食诱导激活。这七个启动子及其相应表达载体制备方法，以及水稻通过农杆菌介导的遗传转化方法，上述启动子特征在水稻抗虫基因工程育种中具有潜在应用价值。

Description

水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地指一种水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，产量及种植面积次于作物玉米，水稻作为众多物种之一，维系着整个生态系统，并且为人类造就福祉(Board M.Ecosystems and human well-being:synthesis.Washington,DC:World Resources Institute.2005)。在进化的物种中，大部分对水稻没有伤害，并且许多物种能提高水稻的肥力和产量，但小部分物种成为水稻害虫，对粮食产量和品质构成威胁，特别是昆虫，在水稻各个生育时期都造成伤害。每年水稻有10％的产量损失是由虫害造成的(Chen H,Lin Y,Zhang Q.Review and prospect oftransgenic rice research.Chin Sci Bull.2009,54:4049–4068)，同时，昆虫的取食还会传播病害，造成水稻产量进一步下降，更为重要的是这些病害产生毒素引发疾病(SavaryS,Teng PS,Willocquet L,Nutter FW Jr.Quantification and modeling of croplosses:a review of purposes.Annu Rev Phytopathol.2006,44:89-112)。最重要的水稻害虫为：褐飞虱，二化螟，稻纵卷叶螟。因此，化学农药成为防治这些害虫的首选工具，农药杀死害虫的同时，也危及到害虫的捕食性天敌，作物与昆虫的生态系统会被严重扰乱(Norton G,Johnson D.Rice pest management:issues and opportunities.Rice in theglobal economy:strategic research and policy issues for food security.2010,297-332)，同时，长期大量施用农药易使害虫产生抗药性，水稻植株药物残留等各种安全问题。由于长时间实施农药，中国飞虱的抗药性与许多昆虫相比提高了二百倍(Matsumura M,Takeuchi H,Satoh M.Current status of insecticide resistance in riceplanthoppers in Asia.Planthoppers:new threats to the sustainability ofintensive rice production systems in Asia.2009,233-243)。之后，又有学者提出采用性诱剂诱杀或释放天敌等方式完成稻田害虫的防治，而性诱剂每次只能用1种诱芯，多个诱芯会有相互干扰的结果，释放天敌方式存在天敌种群的选择，天敌的培育和田间释放等方面问题。渐渐地，利用抗虫基因资源改良植物的抗虫性，在防治虫害的同时又能保护环境，该方法已成为一种防治虫害的新途径。

但目前基因工程体系存在一些不足，最重要的一点是转化载体中使用的是组成型启动子，如Ubiquitin和CaMV5S(Yang Z et al.Development and characterization oftransgenic rice expressing two Bacillus thuringiensis genes.Pest ManagSci.2011,67:414-422；Tang W et al.Development of insect-resistant transgenicindica rice with a synthetic cry1C*gene.Mol Breed.2006,18:1-10；Ling etal.Development of Marker-Free Insect-Resistant Indica Rice by Agrobacteriumtumefaciens-Mediated Co-transformation.Front Plant Sci.2016,7:1608)，虽然此方法不会破坏生态环境，但随之而来的新问题是抗性基因在植株整个生长周期内的各个组织中都无时无刻不高效表达，造成能量浪费的同时，给植株的生长及代谢带来很多潜在负担，严重的甚至导致变异或死亡(Karlowski WM et al.The over-expression of an alfalfaRING-H2gene induces pleiotropic effects on plant growth and development.PlantMol Biol.2003,52:121-33；Miyao M et al.Metabolic consequences ofoverproduction of phosphoenolpyruvate carboxylase in C3plants.Arch BiochemBiophys.2003,414:197-203；Durrant WE et al.Systemic acquired resistance.AnnuRev Phytopathol.2004,42:185-209)。

解决这一问题的方式，可以找到合适的能在特定刺激下激活下游抗性基因表达的诱导型启动子区段。目前，诱导型启动子研究成果更多集中在非生物胁迫诱导中(MishraRC,Grover A.Intergenic sequence between Arabidopsis caseinolytic protease B-cytoplasmic/heat shock protein100and choline kinase genes functions as aheat-inducible bidirectional promoter.Plant Physiol.2014,166:1646-58；Wang Jet al.Characterization of wheat TaSnRK2.7promoter in Arabidopsis.Planta.2018；Roy S et al.Functional analysis of light-regulated promoter region of AtPolλgene.Planta.2012,235:411-32)，生物胁迫诱导成果更多集中在植物病害中(Lin CH,ChenCY.The pathogen-inducible promoter of defense-related LsGRP1gene from Liliumfunctioning in phylogenetically distinct species of plants.Plant Sci.2017,254:22-31；P et al.Promoter elements of rice susceptibility genes arebound and activated by specific TAL effectors from the bacterial blightpathogen,Xanthomonas oryzae pv.oryzae.New Phytol.2010,187:1048-57；Vijayan Jet al.Cloning and functional validation of early inducible Magnaporthe oryzaeresponsive CYP76M7promoter from rice.Front Plant Sci.2015,6:371)，与害虫取食危害诱导型启动子的研究很少(Kumar M et al.Development of insect resistanttransgenic cotton lines expressing cry1EC gene from an insect bite and woundinducible promoter.J Biotechnol.2009,140:143-8；Siddique S et al.The promoterof a plant defensin gene directs specific expression in nematode-inducedsyncytia in Arabidopsis roots.Plant Physiol Biochem.2011,49:1100-7；Hua H etal.Analysis of rice genes induced by striped stemborer(Chilo suppressalis)attack identified a promoter fragment highly specifically responsive toinsect feeding.Plant Mol Biol.2007,65:519-30)。

因此，迫切需要分离出抗虫基因工程启动子，解决上述抗虫植株再生长及代谢方面很多潜在负担的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足,提供了一种水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用，该启动子是从水稻“中花11”(中国农业科学院作物研究所商业经营品种)基因组中克隆合成茉莉酸(JA)关键基因即为丙二烯氧化物合酶基因OsAOS1(LOC_Os03g12500)的启动子，将该启动子及其衍生的其它启动子融合报告基因β-葡糖醛酸酶基因(GUS)导入水稻“中花11”，通过souther blot及潮霉素发芽实验，获得单拷贝纯合家系转基因植株，用于后续GUS酶活检测实验，鉴定出了褐飞虱取食诱导型启动子P_AOS1及控制其表达量的核心区域，丰富了褐飞虱诱导型启动子的种类，同时获得的取食诱导正调控区域，为水稻抗褐飞虱基因工程和分子育种提供了新的启动子资源；该启动子可以用于抗虫转基因水稻培育及水稻基因工程改良，该水稻褐飞虱为害诱导型启动子能极大丰富抗虫基因工程启动子工具的可选性。

为实现上述目的，本发明所设计一种水稻褐飞虱为害诱导型启动子P_AOS1，所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子命名为：P_AOS1，其长度为1889bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子是截取启动子P_AOS1核心区1573bp的序列，命名为P-1573，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子是截取启动子P_AOS1核心区979bp的序列，命名为P-979，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子是截取启动子P_AOS1核心区426bp的序列，命名为P-426，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

查阅分析得到与茉莉酸(JA)合成相关的基因，并通过qRT-PCR检测受褐飞虱取食特异诱导上调且不受二化螟取食上调的基因OsAOS1，分离其启动子，得到不同长度的启动子片段，命名为：P_AOS1，P-1573，P-1311，P-979，P-646，P-426和P-180其序列如序列表SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:7，然后进行功能鉴定。融合入转化载体DX2181后，申请人分别将其命名为DX2181-P_AOS1，DX2181-P-1573，DX2181-P-1311，DX2181-P-979，DX2181-P-646，DX2181-P-426和DX2181-P-180。通过分析该启动子驱动GUS报告基因在转基因水稻中表达模式发现：该启动子能在褐飞虱取食后特异驱动GUS报告基因表达，同时，GUS酶活检测与GUS组织化学染色结果一致。所述启动子P-1573，P-1311，P-979，P-646，P-426和P-180序列，分别是序列表SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7所示的序列。他们分别是由启动子P_AOS1截断的核心区1573bp，1311bp，979bp，646bp，426bp，180bp的序列。对这六种转基因植株接褐飞虱后发现有三段区域含褐飞虱取食正调控元件，该三个调控元件分别位于启动子区域-1573至-1311，-979至-646，-426至-180的三段。

上述克隆的OsAOS1启动子能被褐飞虱取食后特异响应，而对二化螟取食没有响应，对该启动子的研究有利于进一步理解褐飞虱与二化螟取食后引起的防御反应之间的差异；该启动子有利于用于褐飞虱抗性水稻基因工程的改良。

本发明提供了一种在褐飞虱为害条件下，提高抗虫基因在转基因水稻中表达水平的方法，利用上述任意一个启动子序列与外源基因GUS融合构建成重组植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻，在褐飞虱取食诱导条件下，该外源基因在转基因水稻中表达量显著上升。本发明的具体步骤如下：

通过qRT-PCR检测二化螟或褐飞虱取食后水稻叶鞘组织中合成茉莉酸激素关键基因的表达量，序列查询使用的数据库是NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，OsAOS1基因共2022bp，序列如SEQ ID NO:8所示，以这2022bp的序列设计qRT-PCR引物，用于上述检测，结果显示，OsAOS1基因能受褐飞虱取食特异诱导上调表达，不受二化螟取食诱导上调表达。

在此结果上，设计引物，用PCR方法从水稻“中花11”基因组中扩增得到一个被命名为P_AOS1的启动子候选片段，将其插入启动子功能分析载体DX2181(该载体为华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室林拥军教授馈赠)的多克隆位点(载体图及多克隆位点等信息见图2)处，组装成DX2181-P_AOS1载体(图3)，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法，将DX2181-P_AOS1载体转化入水稻“中花11”，T₀代转基因植株通过southern blot方法确定单拷贝家系植株(图4)，T₀代种子通过潮霉素发芽试验，确定纯合家系植株，获得的单拷贝纯合家系植株用于做后续接虫实验。

通过GUS酶活检测及GUS组织化学染色，考察上述启动子在水稻叶鞘组织中的表达情况。检测结果显示，该启动子在受到褐飞虱取食后有表达活性，未处理及机械损伤处理条件都无表达活性(图5)。

采用片段缺失方法，构建了6个来源于DX2181-P_AOS1的5’端缺失片段，并连入转化载体DX2181(图3)，同样方式转化水稻“中花11”，并获得单拷贝纯合家系植株用于实验。片段表达模式显示：启动子区域-1573至-1311，-979至-646，-426至-180存在受褐飞虱取食特异表达正调控元件(图6)；由DX2181-P-426进一步截断到DX2181-P-180则不再具有独立启动基因表达功能。同时，我们对DX2181-P-1573，DX2181-P-979，DX2181-P-426这3种含正调控序列的转基因植株进行二化螟取食诱导实验，结果发现，该3种启动子不能激活GUS报告基因的表达(图7)，通过上述实验，我们发现-1573至-1311，-979至-646，-426至-180含有受褐飞虱取食特异诱导正调控元件，不含有二化螟取食诱导相关元件。

本发明还提供了一种上述任意一个启动子在抗褐飞虱转基因水稻培育中应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明鉴定了褐飞虱取食诱导型启动子P_AOS1及控制其表达量的核心区域，丰富了褐飞虱诱导型启动子的种类。

(2)本发明获得的褐飞虱取食诱导正调控区域，为水稻抗褐飞虱的基因工程和分子育种提供了新的启动子资源。

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图。

图2：pDX2181质粒图，本发明使用的转化载体。

图3：P_AOS1及其系列缺失片段载体示意图。

图4：souther blot检测P_AOS1T₀代植株拷贝数检测。M：代表marker；1-17：分别代表不同转基因植株样品，其中4，9，11，17号孔样品为单拷贝材料。

图5：P_AOS1GUS组织化学染色。1为褐飞虱未取食材料；2为褐飞虱取食材料；3为机械损伤材料。

图6：由P_AOS1及其系列缺失片段受褐飞虱取食前后驱动GUS基因的转基因植株GUS酶活性检测及GUS组织化学染色。a为GUS酶活检测；b为GUS组织化学染色，1为未被褐飞虱取食材料，2为褐飞虱取食材料。

图7：褐飞虱取食诱导正调控序列特异性GUS酶活检测。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：褐飞虱取食诱导响应启动子即水稻褐飞虱为害诱导型启动子P_AOS1及相应缺失片段的获得

本发明若无特别说明，所使用的参考方法及相应分子生物学基本操作都参考了：J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》(中译本)，科学出版社1996版的相关信息。抽提水稻“中花11”基因组DNA：取分蘖期水稻新鲜叶片3cm，方法参照Murray于1980年发表的CTAB抽提法(Murray MG,Thompson WF.Rapid isolation of high molecular weightplant DNA.Nucleic Acids Res.1980,8:4321-5)，抽提出的DNA完全溶解后置于-20℃冰箱保存。

在NCBI和TIGR数据库获得OsAOS1(LOC_Os03g12500)基因序列起始密码子ATG上游序列，设计特异引物AOS1-F，AOS1-R(表1)并扩增得到褐飞虱为害诱导型启动子，-1889至-1(起始密码子碱基A为+1)共1889bp，将其命名为P_AOS1，PCR反应条件：94℃5min，94℃1min，60℃30sec，72℃2min，32个循环，72℃7min，其核酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

取P_AOS1的PCR产物用0.8％琼脂糖电泳检测。剩余产物用于做TA克隆。使用的试剂盒为北京全式金生物技术公司的Peasy-T3载体系统。反应体系为5.0μl，具体操作见试剂盒说明书。待克隆长出后，挑取单克隆用相应抗性LB培养基培养8-10h，抽提质粒，用HindIII和BamHI双酶切质粒并跑胶检测，将阳性单克隆质粒送南京金斯瑞生物科技公司测序，保留阳性单克隆质粒，用于后续DX2181载体连接。

6个5’端缺失片段与全长启动子共用同一个右引物AOS1-R(表1)，左引物根据扩增片段大小不同，分别命名为AOS1-1F，AOS1-2F，AOS1-3F，AOS1-4F，AOS1-5F，AOS1-6F(表1)。PCR模板为测序正确的TA-PAOS1质粒。后续操作同构建TA-P_AOS1的方式进行，即得到六个缺失启动子，分别命名为：

P-1573，P-1311，P-979，P-646，P-426和P-180其序列如序列表SEQ ID NO:2～SEQID NO:7。

实施例2：植物表达载体的构建

利用HindIII和BamHI双酶切载体DX2181，并用天根生化科技有限公司的DNA胶回收试剂盒回收载体片段，具体操作见试剂盒说明书，电泳检测其酶切完整性，置于-20℃冰箱保存。

利用HindIII和BamHI双酶切P_AOS1及相应缺失片段的TA克隆质粒。用同样方式回收目的片段及检测片段完整性。置于-20℃冰箱保存。

将酶切回收的P_AOS1片段及相应缺失片段通过酶切位点的粘性末端构建到载体DX2181上(载体图及多克隆位点等信息见图2)，电转化入大肠杆菌DH5α。酶切检测与测序后，得到重组表达载体DX2181-P_AOS1及相应缺失片段载体。通过电转法将载体DX2181-P_AOS1导入农杆菌菌株EHA105，并于-70℃冰箱保存转化菌株，待用于农杆菌介导的遗传转化。

表1本发明中使用的引物序列

表1的说明：^a下划线序列表示酶切位点。AAGCTT序列表示HindIII酶切位点，GGATCC序列表示BamHI酶切位点。

实施例3：农杆菌介导的遗传转化

本发明农杆菌介导的遗传转化方法参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所述方法(林拥军等，2002)。转化水稻“中花11”(来源于中国农业科学院作物科学研究所)品种所诱导产生的胚性愈伤组织。分别经过愈伤诱导培养，愈伤继代培养，农杆菌侵染，共培养，筛选得到具有潮霉素抗性的抗性愈伤，再经过分化，生根，炼苗和移栽，得到转基因植株。本发明涉及的农杆菌介导的遗传转化步骤及培养基配方如下所述。

1.试剂和溶液缩写

6-BA(6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

2.农杆菌介导的遗传转化

1)诱导愈伤

a.成熟种子去掉颖壳，用75％乙醇浸泡30sec-1min，再用0.15％HgCl₂浸泡15-20min，最后用无菌蒸馏水漂洗6～8次，洗净残留HgCl₂溶液。

b.每瓶诱导培养基接入8～10粒种子，26℃暗培养35d。

2)愈伤继代

a.提前2-3d准备好继代培养基，使培养基干燥；

b.挑取淡黄色，致密，干燥，活力强的胚性愈伤组织转入继代培养基中，26℃暗培养20d。

3)预培养

挑选近视且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25℃。

4)农杆菌培养

a.冰上融化电转化好含转化载体的农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司商业化农杆菌菌株)，并划线于对应抗性LA培养基上，28℃培养2d；

b.将划线培养的农杆菌刮入悬浮培养基(每100ml培养基加入100μl AS)，28℃，200rpm振荡培养2～3h，然后调整菌液浓度至OD₆₀₀≈0.5。

5)农杆菌侵染

a.将诱导好的愈伤组织收集于灭菌过的瓶内；

b.调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30min；

d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；放于共培养基上培养3d，温度19-20℃。

6)愈伤水洗与筛选培养

a.灭菌水洗涤愈伤直至看不见农杆菌；

b.浸泡于含400mg/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30min；

c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

d.转移愈伤至筛选培养基上培养2周，如此2-3次。

7)愈伤分化

将生长旺盛的抗性愈伤转入分化培养基中，置于光照培养室进行光照培养至分化出再生小苗。

8)生根

待再生小苗的芽长至2-3cm高时即可进行生根。用剪刀和镊子将再生植株生分化培养基上长出的根清除干净，并插入生根培养基中，置于光照培养室培养，直至长出白色新根。

9)炼苗及移栽

待新根生长到2cm左右时，可进行炼苗：揭掉生根培养基封口膜，加入适量自来水，于光照培养室继续培养3d。移栽：洗掉根上残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初几天保持水分湿润。

3.主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

4.培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)筛选培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值至6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的HN和400ul 250mg/ml CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。(注：第一次筛选培养基羧苄青霉素浓度为400mg/l，第二次及以后筛选培养基羧苄青霉素浓度为250mg/l)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的HN和250ul 250mg/ml CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

实施例4：PCR法检测转基因阳性植株

转化苗移入温室后，待其返青，然后分单株取1-2cm幼嫩叶片，抽提其基因组DNA为模板，用PCR法检测阳性植株。扩增片段为报告基因GUS的部分片段，片段大小为699bp。引物序列为GUS-F：GGGCGAACAGTTCCTGATTA，GUS-R：AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR反应条件：94℃5min，94℃50sec，57℃30sec，72℃50sec，30个循环，72℃7min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。对所有T₀代，T₁代及T₂代植株进行PCR检测，根据结果剔除假阳性转化植株。

利用小量叶片基因组DNA抽提方法提取基因组DNA：取适量幼嫩叶片，加800μl1.5x CTAB(1.5x CTAB配方：1.5％CTAB，75mM Tris-HCL，15mM EDTA及1.05M NaCl)研磨，转入1.5ml离心管中；65℃水浴30min；加入600μl氯仿/异戊醇(体积比为24:1)上下颠倒数次(约15min)，室温下12000r/min离心10min；取500μl上清于一新1.5ml离心管，加入预冷95％乙醇1ml。混匀后置于-20℃，30min；室温下12000r/min离心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μl ddH₂O溶解，备用。

实施例5：单拷贝纯合家系植株检测

抽提水稻“中花11”基因组DNA：取分蘖期水稻新鲜叶片1g，方法参照Murray于1980年发表的CTAB抽提法(Murray MG,Thompson WF.Rapid isolation of high molecularweight plant DNA.Nucleic Acids Res.1980,8:4321-5)，抽提出的DNA完全溶解后置于-20℃冰箱保存，用于southern blot实验。

Southern blot探针的制备：用PCR法对探针进行地高辛(DIG)标记，以DX2181载体为模板，扩潮霉素基因(HPT)序列作为探针序列，引物序列为HPT-F：AGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGA，HPT-R：TCAAGACCAATGCGGAGC ATATAC。PCR反应条件为：94℃5min，94℃1min，58℃30sec，72℃30sec，32个循环，72℃7min。

水稻基因组酶切，载体DX2181中含有筛选标记基因潮霉素，且不含HindIII酶切位点，因此，选用HindIII对8μg水稻基因组进行完成酶切。对酶切好的DNA样品进行30v，24h的1％TAE琼脂糖凝胶电泳。用标记好的潮霉素探针与T-DNA杂交，具体步骤参见Southern1975年发表的方法(Southern EM.Detection of specific sequences among DNAfragments separated by gel electrophoresis.J.Mol.Biol.1975,98:503–517)。DX2181-P_AOS1单拷贝结果见图4。同样方式对缺失片段转基因植株进行单拷贝检测。

对获得的T₀代单拷贝植株进行单株收种，后期单株播种，同时，每个T₁代单株独立收种。对获得的种子进行发芽实验，确定其是否为单拷贝纯合家系。具体方法为：成熟种子去掉颖壳，用75％乙醇浸泡30sec-1min，再用0.15％HgCl₂浸泡15-20min，最后用无菌蒸馏水漂洗6～8次，洗净残留HgCl₂溶液。置于上面所述的含潮霉素的生根培养基中(圆皿)，每皿放50粒种子，置于光照培养室培养7天，之后统计发芽率，若是纯合阳性植株则种子发芽率在95％以上，若为杂合阳性植株则种子发芽率在75％左右，若是纯合阴性植株则种子发芽率在0％左右。

实施例6：GUS组织染色法分析P_AOS1候选片段及相应缺失片段受褐飞虱取食诱导表达情况

对DX2181-P_AOS1阳性单拷贝纯合家系植株进行褐飞虱接虫实验检测，当褐飞虱取食6小时后，取叶鞘组织进行GUS组织化学染色，未接虫水稻作为对照，同时，用机械损伤模拟褐飞虱造成的物理危害。将叶鞘切成0.5-1cm长度，浸入约400μl GUS染液，37℃过夜反应，之后用75％酒精脱色。染色液配方参照Jefferson所报道的方法(Jefferson et al.,1987)。结果如图5所示，DX2181-P_AOS1仅在褐飞虱取食后有表达，机械损伤与未取食植株都检测不到表达。这一结果证实，P_AOS1为一个褐飞虱取食诱导表达启动子。

用同样的办法分析了P_AOS1系列缺失片段驱动下GUS的表达情况(见图6b)。结果表明DX2181-P-1573，DX2181-P-979，DX2181-P-426均具有被褐飞虱取食诱导表达的功能，同时发现，当截短到DX2181-P-180后，无论被褐飞虱取食与否都不在有激活表达功能。

实施例7：启动子P_AOS1及相应缺失片段受褐飞虱取食诱导GUS酶活检测

用全长或不同缺失片段启动子单拷贝纯合家系植株进行接褐飞虱实验检测，取褐飞虱取食植株及未取食植株(对照)叶鞘组织，抽提其总蛋白，测其GUS酶活(见图6a)。具体方法参考Bradford于1976年报道的方法(Bradford MM.A rapid and sensitive methodfor the quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding.Anal Biochem.1976,72:248-54)。结果表明，DX2181-P-1573，DX2181-P-979，DX2181-P-426植株在受褐飞虱后都比未取食植株有更高显著的表达活性。通过GUS酶活结果可知，其中-1573至-1311，-979至-646，-426至-180区间含有受褐飞虱取食正调控元件存在，并且调控能力显示：-1573至-1311区间有更强的诱导激活表达能力，-979至-646和-426至-180区间诱导激活表达能力较弱。

实施例8：三个诱导正调控区间受褐飞虱取食诱导专一性检测

上述实验，我们发现-1573至-1311，-979至-646，-426至-180这3个区间含有受褐飞虱取食诱导表达能力，我们对这3个区域是否受咀嚼式口器害虫二化螟取食诱导做了特异性检测。利用分别包含这3个区间的转基因植株(DX2181-P-1573，DX2181-P-979，DX2181-P-426)进行二化螟取食诱导激活实验，结果如图7所示，二化螟取食后，3种转基因植株的GUS酶活并没有差异变化，由此可知，该3个区域含有受褐飞虱取食特异响应正调控元件存在，同时该区域不会被二化螟取食诱导激活。

本发明获得了一个水稻褐飞虱取食诱导型启动子P_AOS1，为基因工程和分子育种提供了高效的褐飞虱诱导型启动子资源。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1889

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1889)

<400> 1

ggtatgtaat catggattgt gaaataaagt taaatttgag ttgttttgtt gataggtata 60

gatatgaatc gaattattat aactaggtat atactcacaa tttgaaaatt ttgaaaaatt 120

tgagtgattt tgtacattag ataccatggt gccccatatg agtgtcctat atagtaaatt 180

tgtcctatat atatatatat atatatatat gtttgttttg tgttgaaaat atttctaatt 240

ttttctataa acttgtttgg acttaaaaaa aatattgact agaaaaaaat tcaaaacaac 300

gtaaagaaag gaagtagaat ttagaagttg ccctattttg gccatgtttc tttccataag 360

tcttagggct aaaaattagt tctagggcta aaacataagt catctttagt cataccctgt 420

ttgtttggag ggactaaaag ggactaaaac ctcattaaat gacctatctt ttagcacttc 480

atccaacacc tacatgcttc atccattcaa tagtaggtgc gctataggcc tttagtctaa 540

attagcacct cccctagaga tttatggacc taggtaattt tagcctcttt tagtccctcc 600

tgtttagtat tttaggggct aaaatagact aaagtgaagg gacttatgat tagcccctcc 660

aaacaaacaa cccgaaggga gtactgttac atagtgattg acacatgaac tgttgacaga 720

tggaactgtc agtacacgtt ggatccatgc tttagacgtc tcgacaataa ctttggattt 780

ggatatacta gggaaacaac gagggaatac aatcttcgaa ttctagcctt cgaccaagtc 840

acccgcgcgc atgtaccttg gacgacgatg ttgtccactt gccgtgcgaa cgtgtggagg 900

taaagcgaaa aaagactagg taaaaccatg caagcagcac acgcgtgctt atttactgtt 960

tagttacatg gacggatgca ccaaataatt tcagctagac agcaatcatt ccacacgttc 1020

tcctctcctg ctccagctcc ccatcccaga tgaggtggca acaacactgc ttaaacacgc 1080

caccatctcg gccgccgtcc ggccggccgt cttcgcgagt gacgcagctc ccatcagcag 1140

caacgagctc tgctagcttt cgtctcagcg ctccgtcctg cggtcttttg ggtctcgaat 1200

cgcctcatgt ggaccccaca atcacgttgg caaatagcag ctgccctggt gctgcttctc 1260

acgttttaga gcaagtttaa tagtggccac tgctagctcc aattcatcaa tagccaataa 1320

aataattgct tactatacta ttaatatatg gtctcatctg tcatacatat attatgtctt 1380

agagtccgcg ctgcagctgg ttacagatct atagcctgct gctcttctct ctcatctttt 1440

atctcattaa aatatgttta caggctatta gcctgctatt gtacctgctc ttagagagag 1500

tgtgtcgtgg gtgactattc agtctcccct ctcatttctc tgccacctca tcacttttgc 1560

catcgtggac acactatcac caggctccag ctaatttttt tcaattgtac gtgctcttag 1620

tcgacgtacg tccaatttct ttctccaaga aagaacgccg aacaagcgcc gacgaaaaac 1680

ggttcctcgt tatttctctc caacgcgcgc gcacgggcta tttctacccc cgccgccgag 1740

tagttaggcg tccaaagttt cgggagttca tcgtgaacgg tgatcgatcc aaagaacaac 1800

aactcggagc aaagctagct aacgaagtta gttccaaaca aagctagctt atcgcgatta 1860

gctagctaga agagagttag ctaggcgcc 1889

<210> 2

<211> 1573

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1573)

<400> 2

gaatttagaa gttgccctat tttggccatg tttctttcca taagtcttag ggctaaaaat 60

tagttctagg gctaaaacat aagtcatctt tagtcatacc ctgtttgttt ggagggacta 120

aaagggacta aaacctcatt aaatgaccta tcttttagca cttcatccaa cacctacatg 180

cttcatccat tcaatagtag gtgcgctata ggcctttagt ctaaattagc acctccccta 240

gagatttatg gacctaggta attttagcct cttttagtcc ctcctgttta gtattttagg 300

ggctaaaata gactaaagtg aagggactta tgattagccc ctccaaacaa acaacccgaa 360

gggagtactg ttacatagtg attgacacat gaactgttga cagatggaac tgtcagtaca 420

cgttggatcc atgctttaga cgtctcgaca ataactttgg atttggatat actagggaaa 480

caacgaggga atacaatctt cgaattctag ccttcgacca agtcacccgc gcgcatgtac 540

cttggacgac gatgttgtcc acttgccgtg cgaacgtgtg gaggtaaagc gaaaaaagac 600

taggtaaaac catgcaagca gcacacgcgt gcttatttac tgtttagtta catggacgga 660

tgcaccaaat aatttcagct agacagcaat cattccacac gttctcctct cctgctccag 720

ctccccatcc cagatgaggt ggcaacaaca ctgcttaaac acgccaccat ctcggccgcc 780

gtccggccgg ccgtcttcgc gagtgacgca gctcccatca gcagcaacga gctctgctag 840

ctttcgtctc agcgctccgt cctgcggtct tttgggtctc gaatcgcctc atgtggaccc 900

cacaatcacg ttggcaaata gcagctgccc tggtgctgct tctcacgttt tagagcaagt 960

ttaatagtgg ccactgctag ctccaattca tcaatagcca ataaaataat tgcttactat 1020

actattaata tatggtctca tctgtcatac atatattatg tcttagagtc cgcgctgcag 1080

ctggttacag atctatagcc tgctgctctt ctctctcatc ttttatctca ttaaaatatg 1140

tttacaggct attagcctgc tattgtacct gctcttagag agagtgtgtc gtgggtgact 1200

attcagtctc ccctctcatt tctctgccac ctcatcactt ttgccatcgt ggacacacta 1260

tcaccaggct ccagctaatt tttttcaatt gtacgtgctc ttagtcgacg tacgtccaat 1320

ttctttctcc aagaaagaac gccgaacaag cgccgacgaa aaacggttcc tcgttatttc 1380

tctccaacgc gcgcgcacgg gctatttcta cccccgccgc cgagtagtta ggcgtccaaa 1440

gtttcgggag ttcatcgtga acggtgatcg atccaaagaa caacaactcg gagcaaagct 1500

agctaacgaa gttagttcca aacaaagcta gcttatcgcg attagctagc tagaagagag 1560

ttagctaggc gcc 1573

<210> 3

<211> 1311

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1311)

<400> 3

tttagcctct tttagtccct cctgtttagt attttagggg ctaaaataga ctaaagtgaa 60

gggacttatg attagcccct ccaaacaaac aacccgaagg gagtactgtt acatagtgat 120

tgacacatga actgttgaca gatggaactg tcagtacacg ttggatccat gctttagacg 180

tctcgacaat aactttggat ttggatatac tagggaaaca acgagggaat acaatcttcg 240

aattctagcc ttcgaccaag tcacccgcgc gcatgtacct tggacgacga tgttgtccac 300

ttgccgtgcg aacgtgtgga ggtaaagcga aaaaagacta ggtaaaacca tgcaagcagc 360

acacgcgtgc ttatttactg tttagttaca tggacggatg caccaaataa tttcagctag 420

acagcaatca ttccacacgt tctcctctcc tgctccagct ccccatccca gatgaggtgg 480

caacaacact gcttaaacac gccaccatct cggccgccgt ccggccggcc gtcttcgcga 540

gtgacgcagc tcccatcagc agcaacgagc tctgctagct ttcgtctcag cgctccgtcc 600

tgcggtcttt tgggtctcga atcgcctcat gtggacccca caatcacgtt ggcaaatagc 660

agctgccctg gtgctgcttc tcacgtttta gagcaagttt aatagtggcc actgctagct 720

ccaattcatc aatagccaat aaaataattg cttactatac tattaatata tggtctcatc 780

tgtcatacat atattatgtc ttagagtccg cgctgcagct ggttacagat ctatagcctg 840

ctgctcttct ctctcatctt ttatctcatt aaaatatgtt tacaggctat tagcctgcta 900

ttgtacctgc tcttagagag agtgtgtcgt gggtgactat tcagtctccc ctctcatttc 960

tctgccacct catcactttt gccatcgtgg acacactatc accaggctcc agctaatttt 1020

tttcaattgt acgtgctctt agtcgacgta cgtccaattt ctttctccaa gaaagaacgc 1080

cgaacaagcg ccgacgaaaa acggttcctc gttatttctc tccaacgcgc gcgcacgggc 1140

tatttctacc cccgccgccg agtagttagg cgtccaaagt ttcgggagtt catcgtgaac 1200

ggtgatcgat ccaaagaaca acaactcgga gcaaagctag ctaacgaagt tagttccaaa 1260

caaagctagc ttatcgcgat tagctagcta gaagagagtt agctaggcgc c 1311

<210> 4

<211> 979

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(979)

<400> 4

aaagactagg taaaaccatg caagcagcac acgcgtgctt atttactgtt tagttacatg 60

gacggatgca ccaaataatt tcagctagac agcaatcatt ccacacgttc tcctctcctg 120

ctccagctcc ccatcccaga tgaggtggca acaacactgc ttaaacacgc caccatctcg 180

gccgccgtcc ggccggccgt cttcgcgagt gacgcagctc ccatcagcag caacgagctc 240

tgctagcttt cgtctcagcg ctccgtcctg cggtcttttg ggtctcgaat cgcctcatgt 300

ggaccccaca atcacgttgg caaatagcag ctgccctggt gctgcttctc acgttttaga 360

gcaagtttaa tagtggccac tgctagctcc aattcatcaa tagccaataa aataattgct 420

tactatacta ttaatatatg gtctcatctg tcatacatat attatgtctt agagtccgcg 480

ctgcagctgg ttacagatct atagcctgct gctcttctct ctcatctttt atctcattaa 540

aatatgttta caggctatta gcctgctatt gtacctgctc ttagagagag tgtgtcgtgg 600

gtgactattc agtctcccct ctcatttctc tgccacctca tcacttttgc catcgtggac 660

acactatcac caggctccag ctaatttttt tcaattgtac gtgctcttag tcgacgtacg 720

tccaatttct ttctccaaga aagaacgccg aacaagcgcc gacgaaaaac ggttcctcgt 780

tatttctctc caacgcgcgc gcacgggcta tttctacccc cgccgccgag tagttaggcg 840

tccaaagttt cgggagttca tcgtgaacgg tgatcgatcc aaagaacaac aactcggagc 900

aaagctagct aacgaagtta gttccaaaca aagctagctt atcgcgatta gctagctaga 960

agagagttag ctaggcgcc 979

<210> 5

<211> 646

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(646)

<400> 5

ccctggtgct gcttctcacg ttttagagca agtttaatag tggccactgc tagctccaat 60

tcatcaatag ccaataaaat aattgcttac tatactatta atatatggtc tcatctgtca 120

tacatatatt atgtcttaga gtccgcgctg cagctggtta cagatctata gcctgctgct 180

cttctctctc atcttttatc tcattaaaat atgtttacag gctattagcc tgctattgta 240

cctgctctta gagagagtgt gtcgtgggtg actattcagt ctcccctctc atttctctgc 300

cacctcatca cttttgccat cgtggacaca ctatcaccag gctccagcta atttttttca 360

attgtacgtg ctcttagtcg acgtacgtcc aatttctttc tccaagaaag aacgccgaac 420

aagcgccgac gaaaaacggt tcctcgttat ttctctccaa cgcgcgcgca cgggctattt 480

ctacccccgc cgccgagtag ttaggcgtcc aaagtttcgg gagttcatcg tgaacggtga 540

tcgatccaaa gaacaacaac tcggagcaaa gctagctaac gaagttagtt ccaaacaaag 600

ctagcttatc gcgattagct agctagaaga gagttagcta ggcgcc 646

<210> 6

<211> 426

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(426)

<400> 6

gctattagcc tgctattgta cctgctctta gagagagtgt gtcgtgggtg actattcagt 60

ctcccctctc atttctctgc cacctcatca cttttgccat cgtggacaca ctatcaccag 120

gctccagcta atttttttca attgtacgtg ctcttagtcg acgtacgtcc aatttctttc 180

tccaagaaag aacgccgaac aagcgccgac gaaaaacggt tcctcgttat ttctctccaa 240

cgcgcgcgca cgggctattt ctacccccgc cgccgagtag ttaggcgtcc aaagtttcgg 300

gagttcatcg tgaacggtga tcgatccaaa gaacaacaac tcggagcaaa gctagctaac 360

gaagttagtt ccaaacaaag ctagcttatc gcgattagct agctagaaga gagttagcta 420

ggcgcc 426

<210> 7

<211> 180

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(180)

<400> 7

cgcacgggct atttctaccc ccgccgccga gtagttaggc gtccaaagtt tcgggagttc 60

atcgtgaacg gtgatcgatc caaagaacaa caactcggag caaagctagc taacgaagtt 120

agttccaaac aaagctagct tatcgcgatt agctagctag aagagagtta gctaggcgcc 180

<210> 8

<211> 2022

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2022)

<220>

<221> CDS

<222> (263)..(1699)

<400> 8

acgtccaatt tctttctcca agaaagaacg ccgaacaagc gccgacgaaa aacggttcct 60

cgttatttct ctccaacgcg cgcgcacggg ctatttctac ccccgccgcc gagtagttag 120

gcgtccaaag tttcgggagt tcatcgtgaa cggtgatcga tccaaagaac aacaactcgg 180

agcaaagcta gctaacgaag ttagttccaa acaaagctag cttatcgcga ttagctagct 240

agaagagagt tagctaggcg cc atg gag cta ggc gtg cca ctg cca cga cgg 292

Met Glu Leu Gly Val Pro Leu Pro Arg Arg

1 5 10

ccc gtg ccc ggt agc tac ggc gtg ccg ttc gtc tcg gcg gtg cgc gac 340

Pro Val Pro Gly Ser Tyr Gly Val Pro Phe Val Ser Ala Val Arg Asp

15 20 25

cgc ctc gat ttc tac tac ttg cag ggg cag gac aag tac ttc gag tcg 388

Arg Leu Asp Phe Tyr Tyr Leu Gln Gly Gln Asp Lys Tyr Phe Glu Ser

30 35 40

cgc gcc gag agg tac ggc tcc acc gtc gtc cgc atc aac gtc ccg cct 436

Arg Ala Glu Arg Tyr Gly Ser Thr Val Val Arg Ile Asn Val Pro Pro

45 50 55

ggc cca ttc atg gcg cgc gac ccc cgc gtg gtg gcg ctc ctc gac gcc 484

Gly Pro Phe Met Ala Arg Asp Pro Arg Val Val Ala Leu Leu Asp Ala

60 65 70

aag agc ttc ccc gtc ctc ttc gac gtc gcc aag gtc gag aag cgg gac 532

Lys Ser Phe Pro Val Leu Phe Asp Val Ala Lys Val Glu Lys Arg Asp

75 80 85 90

gtg ttc acc ggc acg ttc atg ccg tcc acc tcc ctc acc ggc ggc tac 580

Val Phe Thr Gly Thr Phe Met Pro Ser Thr Ser Leu Thr Gly Gly Tyr

95 100 105

cgc gtc tgc gcc tac ctc gac ccg tcc gag ccc aac cac gcc aag atc 628

Arg Val Cys Ala Tyr Leu Asp Pro Ser Glu Pro Asn His Ala Lys Ile

110 115 120

aag cag ctg ctc ctc tcc ctc ctg gtc tct cgc aag gac gcc ttc gtc 676

Lys Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Val Ser Arg Lys Asp Ala Phe Val

125 130 135

ccg gtc ttc cgc tcc aac ttc ggc gcg ctc ctc gac acc gtc gag tcg 724

Pro Val Phe Arg Ser Asn Phe Gly Ala Leu Leu Asp Thr Val Glu Ser

140 145 150

cag ctc gcg agc ggc ggc ggc aag tcc gac ttc acc gcc ctc aac gat 772

Gln Leu Ala Ser Gly Gly Gly Lys Ser Asp Phe Thr Ala Leu Asn Asp

155 160 165 170

gcc acc tcc ttc gag ttc atc ggc gag gcg tac ttc ggc gtg cgt ccc 820

Ala Thr Ser Phe Glu Phe Ile Gly Glu Ala Tyr Phe Gly Val Arg Pro

175 180 185

tcc gcg tcg agc tcc ctc ggc acc ggc ggg ccg acc aag gcc gcc ctg 868

Ser Ala Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gly Gly Pro Thr Lys Ala Ala Leu

190 195 200

tgg ctc cta tgg cag ctc gcc ccg ctc acc acg ctc ggc ctg ccc atg 916

Trp Leu Leu Trp Gln Leu Ala Pro Leu Thr Thr Leu Gly Leu Pro Met

205 210 215

atc atc gag gat ccg ctc ctc cac acg ctg ccg ctg cca ccc ttc ctc 964

Ile Ile Glu Asp Pro Leu Leu His Thr Leu Pro Leu Pro Pro Phe Leu

220 225 230 235

atc agc tcc gac tac aag gcg ctg tac gcg tac ttc gcc gcc gcg gcg 1012

Ile Ser Ser Asp Tyr Lys Ala Leu Tyr Ala Tyr Phe Ala Ala Ala Ala

240 245 250

tcg cag gcg ctc gac gcc gcc gag ggc ctt ggc ctg tcg cgg gag gag 1060

Ser Gln Ala Leu Asp Ala Ala Glu Gly Leu Gly Leu Ser Arg Glu Glu

255 260 265

gcc tgc cac aac ctg ctg ttc gcg acg gtg ttc aac agc tac ggc ggc 1108

Ala Cys His Asn Leu Leu Phe Ala Thr Val Phe Asn Ser Tyr Gly Gly

270 275 280

ttc aag ctg ctg ctc ccg cag atc ctg tcg cgc gtc gcg cag gcc ggc 1156

Phe Lys Leu Leu Leu Pro Gln Ile Leu Ser Arg Val Ala Gln Ala Gly

285 290 295

gag aag ctc cac gag agg ctc gcc gcg gag ata cgg agc gcg gtg gcc 1204

Glu Lys Leu His Glu Arg Leu Ala Ala Glu Ile Arg Ser Ala Val Ala

300 305 310 315

gac gcc ggc ggc aac gtg acg ctg gcc gct ctg gag aag atg gag ctg 1252

Asp Ala Gly Gly Asn Val Thr Leu Ala Ala Leu Glu Lys Met Glu Leu

320 325 330

acc agg tcg gtg gtg tgg gag gcg ctg cgg ctg gac ccg ccg gtc agg 1300

Thr Arg Ser Val Val Trp Glu Ala Leu Arg Leu Asp Pro Pro Val Arg

335 340 345

ttc cag tac ggg cgc gcc aag gcc gac ctg gag atc gag agc cac gac 1348

Phe Gln Tyr Gly Arg Ala Lys Ala Asp Leu Glu Ile Glu Ser His Asp

350 355 360

gcg tcg ttc gcg atc aag aag ggg gag atg ctg ttc ggc tac cag ccg 1396

Ala Ser Phe Ala Ile Lys Lys Gly Glu Met Leu Phe Gly Tyr Gln Pro

365 370 375

tgc gcc acc agg gac ccg cgg gtg ttc ggc gcc acg gcg agg gag ttc 1444

Cys Ala Thr Arg Asp Pro Arg Val Phe Gly Ala Thr Ala Arg Glu Phe

380 385 390 395

gtc ggc gac cgg ttc gtc ggc gag gag ggg agg aag ctg ctg caa tac 1492

Val Gly Asp Arg Phe Val Gly Glu Glu Gly Arg Lys Leu Leu Gln Tyr

400 405 410

gtg tac tgg tcg aat ggg cga gag acg gag aac cct agc gtt gac aac 1540

Val Tyr Trp Ser Asn Gly Arg Glu Thr Glu Asn Pro Ser Val Asp Asn

415 420 425

aag cag tgc ccc ggc aag aac ctg gtg gtg ctc gtc gga agg ctg ttg 1588

Lys Gln Cys Pro Gly Lys Asn Leu Val Val Leu Val Gly Arg Leu Leu

430 435 440

ctc gtc gag ctc ttc ctc cgg tac gac acc ttc acc gcc gag gcc ggc 1636

Leu Val Glu Leu Phe Leu Arg Tyr Asp Thr Phe Thr Ala Glu Ala Gly

445 450 455

aaa aag gtg gtc atc acc ggg gtc acc aaa gct tca acc tcc gcc gtc 1684

Lys Lys Val Val Ile Thr Gly Val Thr Lys Ala Ser Thr Ser Ala Val

460 465 470

aat cgt act gct taa gccggccatc acttcaggcg tgggtcgtcg atcatccact 1739

Asn Arg Thr Ala

475

caaccagctc cgtcctacgc atatgcaata agaaatactc gtacctgaat tcttgcatgg 1799

ctaaacacta ctaataagtg tatgtattct gtttatttgt tcgattccat atttgtaatt 1859

ttgttgttat tgtttgctgt tgaattacga ttgtgtattt tacagggctg acagtgtctt 1919

taaacacctc taatatgtat cggatcaatc tgccctagtc atgtctaatt tgtgaagatc 1979

cactttcttt aattattcaa tcatgcattt ttttttcttc ttt 2022

Claims

1.一种水稻褐飞虱为害诱导型启动子，其特征在于：所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子命名为：P_AOS1，其长度为1889bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子，其特征在于：所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子是截取启动子P_AOS1核心区1573bp的序列，命名为P-1573，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子，其特征在于：所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子是截取启动子P_AOS1核心区979bp的序列，命名为P-979，其核苷酸序列如SEQID NO：4所示。

4.根据权利要求1所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子，其特征在于：所述水稻褐飞虱为害诱导型启动子是截取启动子P_AOS1核心区426bp的序列，命名为P-426，其核苷酸序列如SEQID NO：6所示。

5.一种在褐飞虱为害条件下，提高外源基因在转基因水稻中表达水平的方法，其特征在于，利用权利要求1～4中任意一个启动子序列与外源基因GUS融合构建成重组植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻，在褐飞虱取食诱导条件下，该外源基因在转基因水稻中表达量显著上升。

6.一种权利要求1～4任意一项所述的启动子在抗褐飞虱转基因水稻培育中应用。