CN107459564A

CN107459564A - 水稻zygo1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用

Info

Publication number: CN107459564A
Application number: CN201710873344.7A
Authority: CN
Inventors: 程祝宽; 张凡凡; 李亚非; 唐丁; 沈懿; 杜桂杰
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2017-12-12

Abstract

本发明公开了水稻ZYGO1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用。本发明提供的ZYGO1蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，ZYGO1基因可以应用于水稻杂交育种，在水稻育种实践中具有重要意义，可以为通过利用杂种优势途径提高水稻产量与品质提供重要资源。

Description

水稻ZYGO1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，水稻ZYGO1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用。

背景技术

水稻是全球最重要的粮食作物之一，世界上近半数的人口都以水稻为主食。水稻是我国的第一大粮食作物，因此如何提高水稻的产量是我国农业生产上的关键问题。经过20世纪60年代的矮化育种使我国水稻单产首次实现飞跃。20世纪70年代，我国开创了水稻杂种优势利用研究，以发掘不育细胞质源为突破口、以回交转育质核互作不育系为主要方法使籼型杂交稻率先在中国获得成功。杂交水稻的研制成功是当代世界农业发展史上的重大事件，使水稻单产获得了大幅度提高，创造了巨大的社会效益和经济效益。三系法杂交水稻由雄性不育系，保持系和恢复系三种不同的水稻品种组成。雄性不育系是一种雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉无生活力，不能自花授粉结实，只有依靠外来的花粉才能受精结实。因此，借助雄性不育系，通过人工辅助授粉的办法，就能大量生产杂交种子。

应用雄性不育系是水稻杂种优势利用的基本途径和必要条件。但是自然界里的自然雄性不育植株极少，鉴定也非常困难。因此，通过人工的基因工程途径获得雄性不育水稻是目前杂交育种的重要课题。雄性不育主要是通过花粉败育而表现的。花粉的发育是一个复杂生物学的过程,由胞原细胞发育到花粉这一过程中涉及到减数分裂、有丝分裂等过程,以及绒毡层和花粉外壁等的正常发育，在这一过程中有大量的基因参与作用。

减数分裂是真核生物形成配子过程中的一种特殊的细胞分裂方式。减数分裂产生染色体数目减半的配子，再通过受精作用形成合子，从而维持有性生殖生物个体世代之间染色体数目的恒定，进而保障了物种遗传物质的相对稳定性。此外，同源染色体非姊妹染色单体间的交叉互换以及非同源染色体的自由组合，使得遗传物质重排，从而增加了遗传的多样性，促进生物物种的进化。近些年来，科学家以酵母菌为模式生物对减数分裂过程进行了研究，获得了许多控制减数分裂的基因。随后在动植物中也已经发现了它们的同源蛋白，表明这些蛋白功能在不同物种间具有保守性。

CRISPR-Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑，该技术以其简便、高效的特点，目前已经成为动植物中广泛使用的基因组编辑工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可以调控植物雄性育性的蛋白质及其编码基因。

本发明首先提供了蛋白质在调控植物雄性育性中的应用，所述蛋白质来源于水稻，其名称为ZYGO1，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的蛋白质；

(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由(a)衍生的蛋白质。

为了使(a)中的ZYGO1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的ZYGO1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的ZYGO1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还提供了与ZYGO1相关的生物材料在调控植物雄性育性中的应用；所述生物材料为下述(c)或(d)：

(c)编码ZYGO1的基因(ZYGO1基因)；

(d)含有(c)所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述基因可为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：

(1)编码区如序列表中序列2自5′末端第22-1275位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同一性且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还提供了ZYGO1或所述生物材料在植物育种中的应用。

本发明还提供了培育雄性不育植物的方法，所述方法包括降低植物中ZYGO1的含量和/或活性得到雄性不育植物。

所述方法可包括抑制编码ZYGO1的基因的表达。

所述方法可通过对编码ZYGO1的核酸分子进行突变实现。

所述突变可采用CRISPR/Cas9方法实现。

所述CRISPR/Cas9方法中所用靶DNA可为靶DNA1和/或靶DNA2；

所述靶DNA1为序列表中序列2的第113-132位所示的DNA；

所述靶序列2为序列表中序列2的第423-442位所示的DNA。

本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如盐稻8号水稻。

所述雄性不育具体可体现为不结实和/或花粉呈现败育的表型和/或花粉母细胞的染色体不能均等分离。

本发明提供了ZYGO1蛋白及其编码基因，ZYGO1蛋白通过调控水稻减数分裂进而影响正常配子的产生来控制水稻的育性。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，ZYGO1基因可用于水稻杂交育种。因此，ZYGO1蛋白及其编码基因在水稻育种实践和中具有重要意义，可以为通过利用杂种优势途径提高水稻产量与品质提供重要资源。

附图说明

图1为水稻突变体zygo1-1突变体表型分析。

图2为ZYGO1的基因结构图和突变位点。

图3为ZYGO1基因表达分析结果。

图4为盐稻8号(Wild type)和水稻突变体zygo1花粉母细胞的染色体行为。(A-H)野生型从细线期到终变期的染色体表型。(A)细线期。(B)晚细线期。(C)细线期到偶线期过度时期。(D)早偶线期。(E)偶线期。(F)晚偶线期。(G)粗线期。(H)终变期。染色体团用“CM”指示。(I-L)zygo1突变体从细线期到终变期的染色体表型。(I)细线期。(J)早后细线期。(K)晚后细线期。(L)终变期。部分联会的染色体和单价体用箭头指示。标尺长度，5μm；zygo1为zygo1-1。

图5为CRISPR-Cas9定点突变体的染色体行为。(A-C)zygo1-3的染色体行为。(A)早后细线期。(B)晚后细线期。(C)中期I。(D-F)zygo1-4的染色体行为。(D)早后细线期。(E)晚后细线期。(F)中期I。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

水稻品种盐稻8号：江苏省盐城市明天种业科技有限公司。

根癌农杆菌EHA105：北京天恩泽生物技术有限公司，产品目录号：140383。

籼稻品种中籼3037：为“Wang,K.,Tang,D.,Hong,L.,Xu,W.,Huang,J.,Li,M.,Gu,M.,Xue,Y.and Cheng,Z.(2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit inRice.Plos Genetics,6”一文中的“Zhongxian 3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

SK-gRNA载体：为“Wang,C.,Shen,L.,Fu,Y.,Yan,C.,Wang,K.(2015)A SimpleCRISPR/Cas9System for Multiplex Genome Editing in Rice.Journal of Geneticsand Genomics 42(2015)703-706”一文中的SK-gRNA载体。

pC1300-Cas9载体：为“Wang,C.,Shen,L.,Fu,Y.,Yan,C.,Wang,K.(2015)A SimpleCRISPR/Cas9System for Multiplex Genome Editing in Rice.Journal of Geneticsand Genomics 42(2015)703-706”一文中的pC1300-Cas9载体。

AAM液体培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄170mg，KCl2940mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB11mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O₃7.3mg，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，谷氨酰胺0.877g，水解酪蛋白0.5g，天冬氨酸0.266g，精氨酸0.228g，甘氨酸0.075g,去离子水加至1L，pH为5.2。

NB培养基：(NH4)₂SO₄ 463mg，KNO₃ 2830mg，CaCl₂·2H₂O 166mg，MgSO₄·7H₂O185mg，KH₂PO₄400mg，KI 0.8mg，H₃BO₃ 1.6mg，MnSO₄·4H₂O 4.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，蔗糖30g，植物胶2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。

NBC培养基：(NH4)₂SO₄ 463mg，KNO₃ 2830mg，CaCl₂·2H₂O 166mg，MgSO₄·7H₂O185mg，KH₂PO₄400mg，KI 0.8mg，H₃BO₃ 1.6mg，MnSO₄·4H₂O 4.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，蔗糖30g，葡萄糖10g，植物胶2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.2。倒平板之前加入乙酰丁香酮(AS)并使其浓度为100μM。

NBCS1培养基：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg，MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg，ZnSO₄·7H₂O5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为100mg/l。

NBCS2培养基：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg，MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg，ZnSO₄·7H₂O 5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。

NBA分化培养基：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg，MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg，ZnSO₄·7H₂O 5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，麦芽糖20g，脱落酸(ABA)5mg，植物胶3g，2,4-D 2mg，6-BA 2mg，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。

1/2MS培养基：NH₄NO₃ 825mg，KNO₃ 950mg，CaCl₂·2H₂O 220mg，MgSO₄·7H₂O185mg，KH₂PO₄85mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，蔗糖30g，多效唑(MET)6mg，植物胶2g，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。

实施例1、ZYGO1蛋白及其编码基因的获得

一、水稻突变体zygo1的获得及其表型分析和遗传分析

取盐稻8号，进行Co⁶⁰辐射诱变，获得一个不育突变体，命名为水稻突变体zygo1-1。在营养生长时期该突变体与野生型相比无明显差异。但是在生殖生长阶段，该突变体表现为不结实(图1中A-B)。图1中A为抽穗期的盐稻8号，B为抽穗期的水稻突变体zygo1-1。

对水稻突变体zygo1-1花粉进行1％I₂-KI染色分析，结果发现相比于野生型(盐稻8号)饱满可染的花粉，突变体花粉不着色，形状不规则，说明水稻突变体zygo1-1花粉败育(图1中C-D)。图1中C为盐稻8号花粉，D为水稻突变体zygo1-1的不育花粉，标尺长度50μm。

在分离出不育突变体的株系中，按单株收获可育植株的种子，并将这些种子按单株进行种植。对再次分离出不育突变体的株系中的可育株与不育株的数目进行统计后发现，在320株的群体中，有可育株235株，不育株85株，其比例符合3:1的分离比(χ² _[3；1]＝0.42，P>0.05)，说明突变体的不育性状由一个隐性单核基因控制的。

二、图位克隆

选取后代存在分离株系(可育和不育植株)的正常植株(包含AA基因型和Aa基因型)与籼稻品种中籼3037杂交，对F2群体中240株不育隐性个体进行突变基因的初步定位。利用STS标记，将该基因初步定位于1号染色体短臂约201Kb的物理范围内。进一步分析，发现该突变体缺失了82877bp。通过查找水稻功能基因组表达数据库RiceGE(RiceFunctional Genomic Express Database，http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)，在这个82877bp的缺失区间内，获得了一个T-DNA插入突变体(PFG_2d-00585)。PFG_2d-00585仅在水稻染色体组上存在一处T-DNA插入，该T-DNA插入在一个未知基因(LOC_Os01g11990)的第一个内含子处(图2)。进一步表型分析发现，PFG_2d-00585与zygo1-1表型一样，将这个PFG_2d-00585突变体命名为zygo1-2。

三、ZYGO1蛋白及其编码基因的获得

提取日本晴的总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，分别进行ORF扩增、5’RACE和3’RACE，拼接后得到全长序列，该序列编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为ZYGO1蛋白。将编码ZYGO1蛋白的基因命名为ZYGO1基因(LOC_Os01g11990)，ZYGO1基因全长3265bp，包含8个外显子和7个内含子(图2)，ZYGO1基因cDNA如序列表的序列2所示，序列2的第22-1275位编码序列1所示的ZYGO1蛋白。

实施例2、ZYGO1基因表达分析

待测样本为：日本晴的根、茎、叶、幼穗(5cm)。

1、提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，进行Real-time PCR反应，采用引物ZYGO1-RT-F和引物ZYGO1-RT-R检测ZYGO1基因的表达水平，采用引物Actin-RT-F和引物Actin-RT-R检测内参基因(Actin基因)的表达水平。采用CFX96Real Time检测系统(Bio-Rad)和Eva Green(Biotium)荧光染料，得到的结果用Bio-Rad CFX Manager软件分析。

所用引物如下：

ZYGO1-RT-F:AGCAGCAGGCACATTGGGG

ZYGO1-RT-R:GAAGTCGGTGATCCAGATGCCA

ACTIN-RT-F:CTGACAGGATGAGCAAGGAG

ACTIN-RT-R:GGCAATCCACATCTGCTGGA

结果显示ZYGO1基因在幼穗中表达量最高，其他部位表达量较低(图3)。

实施例3、水稻突变体zygo1细胞学表型分析

待测样本为：盐稻8号减数分裂时期的幼穗、水稻突变体zygo1-1和zygo1-2减数分裂时期的幼穗。

依次进行如下步骤：

1、取待测样本，用卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3：1；体积比)固定24h。

2、用解剖针将花药拨出至载玻片上，加少许醋酸洋红，用解剖针迅速将花药敲碎，使花粉母细胞游离出来，盖上盖玻片。

3、取载玻片，在盖玻片一侧加适量45％醋酸水溶液，在另一侧放置一张大小合适的滤纸条，反复重复此步骤，直到将载玻片上的醋酸洋红清除干净，然后将载玻片放入液氮中浸泡20sec，迅速取出，用刀片揭去盖玻片。

4、取载玻片，依次放入70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液和100％乙醇中浸泡各5min，进行梯度脱水，干燥后滴加4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)，然后用荧光显微镜观察染色体表型。

结果如图4所示。

野生型盐稻8号中，染色体在细线期呈现松散的单股状态(图4中A-B)。从细线期到偶线期，染色体开始聚集。在松散的染色体中间，有一个小的染色体团(图4中C)。早偶线期，伴随着同源染色体配对的进行，这个染色体团逐渐增大。然而在染色体团外围的染色体仍然呈现单股状态(图4中D)。在典型的偶线期，所有染色体聚集在一起形成一个紧实的染色体团(图4中E)。晚偶线期，这个染色体团逐渐解聚，并且外围的染色体呈联会的双股状态(图4中F)。粗线期，我们观察不到染色体团的存在，并且联会的染色体重新散布在整个细胞核内(图4中G)。在终变期，12个二价体清晰可见(图4中H)。

水稻突变体zygo1-1和zygo1-2具有相同的表型，具体如下：细线期花粉母细胞染色体行为与野生型相比无明显区别(图4中I)；然而，在突变体花粉母细胞中，在整个早前期I都观察不到染色体团和完全联会的染色体(图4中I-K)；虽然能在突变体中观察到某些染色体发生了部分联会，但是大部分染色体仍然呈现单股状态(图4中K)；此外，在终变期有大量的单价体(图4中L)。综上所述，水稻突变体zygo1-1和zygo1-2的减数分裂缺陷，最终导致其花粉败育。

实施例4、ZYGO1基因功能分析

一、ZYGO1基因CRISPR-Cas9定点突变体的获得及验证

为了进一步确认ZYGO1基因的突变是造成突变体不育的原因，发明人对ZYGO1基因进行了CRISPR-Cas9定点突变，并进一步观察定点突变植株的表型是否与zygo1-1和zygo1-2突变体表型一致。ZYGO1基因CRISPR-Cas9定点突变体的方法如下：

一)重组载体的构建

分别选取ZYGO1基因第一外显子的特异序列“TGAGGAAGCGCCCGAGGCCG”(序列2的第113-132位)和第二外显子的特异序列“GTACGAGGCGGACATGTGGA”(序列2的第423-442位)所示的DNA片段为靶DNA，将这两条DNA片段分别记为靶DNA1和靶DNA2。使用AarI(Ferment)酶切中间载体SK-gRNA载体，随后将靶DNA插入其中，分别将得到的含有靶DNA1和靶DNA2的序列正确的重组载体记为SK-gRNA-1和SK-gRNA-2。

在重组载体构建过程中，SK-gRNA-1通过将Cas9-zygo1-3-F和Cas9-zygo1-3-R退火形成的DNA片段与AarI酶切SK-gRNA载体得到的骨架载体相连得到；SK-gRNA-2通过将Cas9-zygo1-4-F和Cas9-zygo1-4-R退火形成的DNA片段与AarI酶切SK-gRNA载体得到的骨架载体相连得到；

引物序列如下：

Cas9-zygo1-3-F:GGCATGAGGAAGCGCCCGAGGCCG

Cas9-zygo1-3-R:AAACCGGCCTCGGGCGCTTCCTCA

Cas9-zygo1-4-F:GGCAGTACGAGGCGGACATGTGGA

Cas9-zygo1-4-R:AAACTCCACATGTCCGCCTCGTAC

将pC1300-Cas9载体使用KpnI和BglII酶切得到骨架载体；将SK-gRNA-1使用KpnI和BglII酶切得到的含有靶DNA1的DNA片段与骨架载体相连，将得到的序列正确的重组载体命名为pC1300-Cas9-1；将SK-gRNA-2使用KpnI和BglII酶切得到的含有靶DNA2的DNA片段与骨架载体相连，将得到的序列正确的重组载体命名为pC1300-Cas9-2；将SK-gRNA使用KpnI和BglII酶切得到的小DNA片段与骨架载体相连，将得到的序列正确的重组载体命名为pC1300-Cas9-CK，作为对照。

将pC1300-Cas9-1、pC1300-Cas9-2和pC1300-Cas9-CK分别导入农杆菌EHA105中得到重组菌EHA105/pC1300-Cas9-1、EHA105/pC1300-Cas9-2和EHA105/pC1300-Cas9-CK。

二)ZYGO1基因CRISPR-Cas9定点突变体的获得

1、取步骤一)得到的pC1300-Cas9-1，导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105/pC1300-Cas9-1。

2、将步骤1得到的重组菌EHA105/pC1300-Cas9-1的单菌落接种于3mL含50mg/L卡那霉素和10mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养直至OD_600nm为0.6-0.8，用含有200μM乙酰丁香酮的AAM液体培养基重悬菌体，将OD_600nm值调为0.8-1.0，得到菌悬液。

3、选取饱满的盐稻8号成熟种子，小心去除颖壳(避免胚受到损伤)。用70％乙醇水溶液浸泡消毒2min后，使用0.1％HgCl₂水溶液浸泡12min，无菌水冲洗5次，每次5min。

4、将经过步骤3处理后的种子在NB培养基中26℃避光培养14天以诱导愈伤组织。

5、将步骤4挑选的愈伤组织浸泡于步骤2制备的菌悬液中，侵染20min，侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后转入NBC培养基，26℃避光培养3天。

6、将步骤5培养的愈伤组织转入NBCS1培养基，26℃避光培养14天。

7、将步骤6培养的愈伤组织转入NBCS2培养基，26℃避光培养14天。

8、将步骤7生长状态较好的愈伤组织转入NBA分化培养基，26℃光照培养20天。

9、将步骤8分化出的幼苗转入1/2MS培养基，26℃光照培养至生根。

10、完成步骤9后，取出幼苗，洗净培养基，将幼苗用清水浸泡，26℃光照培养2天，然后移入大田，常规栽培管理。

采用pC1300-Cas9-2载体替代pC1300-Cas9-1按照步骤1-10进行操作。

采用pC1300-Cas9-CK载体替代pC1300-Cas9-1按照步骤1-10进行操作，得到转空载体植株。

三)ZYGO1基因CRISPR-Cas9定点突变体的筛选与验证

分别使用ZFF-9-F/R和ZFF-10-F/R引物对步骤二得到的转基因株系进行鉴定。引物ZFF-9-F和ZFF-9-R用于扩增包含靶DNA1的基因组DNA以及对相应的基因组DNA进行测序；引物ZFF-10-F和ZFF-10-R用于扩增包含靶DNA2的基因组DNA以及对相应的基因组DNA进行测序。

ZFF-9-F:AGCTCCGGTTCAAATCTCC

ZFF-9-R:CAACCCGAGGAACTCCAAG

ZFF-10-F:GGATTCAAATTCGTAGGAGC

ZFF-10-R:CTTACCAATGTGCCTGCTGC

利用上述引物通过对目的条带的扩增及测序的方法筛选出T0及T1代转基因株系中ZYGO1基因外显子发生相同突变且导致其编码的氨基酸序列发生突变的株系，其中一个利用pC1300-Cas9-1得到的株系的第一外显子缺失1bp，另一个利用pC1300-Cas9-2得到的株系的第二外显子插入1bp(图2)，导致了读码框改变，翻译提前终止，将这两个突变体分别被命名为zygo1-3和zygo1-4。

二、ZYGO1基因CRISPR-Cas9定点突变体的表型分析

待测样本为：5株野生型植株(盐稻8号)、5株转空载体植株、5株CRISPR-Cas9定点纯合突变体zygo1-3、5株CRISPR-Cas9定点纯合突变体zygo1-4。

1、观察植株表型，在营养生殖阶段，野生型植株、转空载体植株、zygo1-3和zygo1-4的生长状况无明显差异。在抽穗后，zygo1-3和zygo1-4均表现出完全败育，同zygo1-1表型相同，而转空载体植株和野生型植株结实正常。

2、进一步观察待测样本花粉母细胞减数分裂细胞学表型，方法同实施例3。

结果显示，zygo1-3和zygo1-4花粉母细胞的染色体表型和zygo1-1及zygo1-2基本一致(图5)，表现为偶线期染色体不聚集，粗线期同源染色体部分联会，中期I二价体和单价体共存。以上结果说明ZYGO1基因的突变是引起突变体不育表型的原因。转空载体植株和野生型植株染色体表型正常。表明，ZYGO1基因可以通过调控水稻花粉母细胞的减数分裂过程进而调控花粉的育性。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 水稻ZYGO1蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 417

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 1

Met Gly Lys Ala Ile Ser Leu Leu Arg Pro Pro Arg Glu Pro Gln Pro

1 5 10 15

Arg Glu Ser Glu Gly Glu Gly Glu Arg Gly Arg Met Met Glu Leu Arg

20 25 30

Lys Arg Pro Arg Pro Arg Arg Val Asp Pro Asp Phe Val Ser Ser Pro

35 40 45

Pro Ala Ser Leu Leu Leu Pro Pro Pro Arg Lys Arg Ala Arg Arg Gln

50 55 60

Ala Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Arg Pro

65 70 75 80

Ser Pro Ala Ala Arg Arg Arg Pro Thr Cys Ala Arg Val Ile Ile Gln

85 90 95

Ser Pro Val Ala Gly Leu Gln Pro Ser Val Cys Cys Pro Cys Glu Ala

100 105 110

Pro Leu Arg Ala Cys Arg Leu Pro Arg Ala Ser Phe Leu Ala Arg Arg

115 120 125

Arg Pro Pro Phe Asp Trp Tyr Glu Ala Asp Met Trp Thr Glu Val Ala

130 135 140

Lys Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Leu Val Arg Leu Ser Ser Thr Cys Arg

145 150 155 160

Trp Phe Arg Arg Leu Leu Ala Asp Glu Phe Ile Trp Arg His Ala Phe

165 170 175

Leu Arg Asp Leu Ser Leu Leu Pro Ala Ala Ala Asp Arg Tyr Pro Pro

180 185 190

Arg Pro Leu His Arg Ser Trp Arg Leu Leu Tyr Ala Ala Ala Phe Asn

195 200 205

Gly Ala His Ser Tyr Trp Phe Arg Arg Ser Ser Arg His Ile Gly Ala

210 215 220

Tyr Arg Ile Gly Gly Phe Leu Leu Glu Ser Pro Tyr Met Leu Leu Thr

225 230 235 240

Ala Lys Leu Ala Val Pro Gln Trp Leu Pro Pro Gln Glu Asp Gly Pro

245 250 255

Gln Ile Ala Ile Glu Met Thr Gly Ala Cys Val Leu Pro Asn Ala Arg

260 265 270

Pro Gly Ile Trp Ile Thr Asp Phe His Leu Val Arg Cys Pro Asn Cys

275 280 285

Thr Leu Asn Lys Cys Ala Gly Val Leu Gln Val Leu Asp Ala Arg His

290 295 300

Cys Glu Leu Phe Leu Glu Gln Gly Phe Trp Asn Gly Thr Trp Glu Tyr

305 310 315 320

Glu Asp Leu Gly Asp His Tyr Asn Asp Glu Glu Thr Pro Thr Ala Ala

325 330 335

Cys Ala Ile Phe Asn Ala Ser Thr Arg Ala His Glu Ser Ile Ser Cys

340 345 350

Val Leu His Ser Lys Ser Trp Val Arg Arg Cys Asp Asp Pro Gln Pro

355 360 365

Lys Ala His Cys Arg Pro Tyr Ala Val Ala Leu Asn Ser Asn Leu Leu

370 375 380

Ser Asn Ser Asn Gln Gly Leu Val Ser Arg Phe Gln Ala Met Arg Asp

385 390 395 400

Thr Thr Gly Asn Gly Gln Ile Val Ser Ile Arg Ile Ile Gln Gln Ile

405 410 415

Tyr

<210> 2

<211> 1613

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 2

acacgtcgcc cccatcgctg catgggcaaa gcgatctccc ttctccggcc accgcgagag 60

ccacagccac gagagagcga gggcgagggc gagaggggga ggatgatgga gctgaggaag 120

cgcccgaggc cgcggcgcgt cgaccccgac ttcgtctcgt caccgccggc ttcgctgctg 180

ctgccgccgc cgaggaagcg ggcgaggagg caggccgcgc cgccggcggc tccggctccg 240

gctcctgctc ctgcgcgccc atcaccagcg gcgaggaggc ggccgacgtg cgcgcgggtg 300

atcatccaga gccccgtcgc tgggcttcag ccatccgtgt gctgcccgtg cgaggcgccg 360

ctccgggcgt gcaggcttcc gcgcgcctcc ttcctcgctc gccgtcgccc tcccttcgac 420

tggtacgagg cggacatgtg gacggaggtg gccaagtacc tgttcggcgc ggagctggtg 480

cgcctctcct ccacctgccg ctggttccgc cgcctcctcg ccgacgagtt catctggcgc 540

cacgccttcc tccgcgacct ctccctcctc cccgccgccg ccgaccggta ccctccccgc 600

ccgctccacc gctcctggcg cctcctctac gccgccgcct tcaacggcgc ccactcgtac 660

tggttccgcc ggagcagcag gcacattggg gcgtaccgga ttggtgggtt cctgctcgag 720

tcgccttaca tgctcctgac ggcgaagctg gcggtgccgc agtggctgcc gccgcaggag 780

gacggcccgc agatcgccat cgagatgacc ggcgcgtgcg tgctccccaa cgcgcgccct 840

ggcatctgga tcaccgactt ccatcttgtg aggtgtccca attgcaccct caacaagtgc 900

gcaggggtcc tgcaggttct ggacgcgcga cactgcgagc tgttcctgga gcagggattc 960

tggaatggca cctgggagta cgaggacctg ggcgaccact acaacgacga ggagaccccc 1020

accgcagcct gcgccatctt caacgccagc acccgcgctc atgagtccat ttcatgtgtt 1080

ctccactcga agtcttgggt caggagatgc gacgacccac agcccaaggc acattgccgc 1140

ccatacgctg ttgccctcaa ttccaacctc ctgtccaact ccaaccaggg gttggtgtca 1200

aggttccagg cgatgcgaga cacgaccggg aacgggcaga tagtgtctat ccggatcata 1260

cagcagattt actgattcaa gtgcctggtt cgtttctggt gctgggttcc tgctctgttg 1320

tttaatgtgt taatgccttg tttgcgatga tataagttct gtcagggata aatcatgaga 1380

gggagtacag ttatactata gatggttagg cctctgttaa gattacaaaa attgtttaga 1440

gtacggaagt agagagcgcc caaaaggagc agatttcgtg ttgtttatat cgaatcattg 1500

agtcatgtcg gtaatattct gtgcttcatt gagaagtagc agcttgtttt aacaaaacat 1560

agtactatgt ctatgactat aaagccaaga atttgcttat tgtacatact tca 1613

Claims

1.蛋白质在调控植物雄性育性中的应用，所述蛋白质是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的蛋白质；

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物雄性育性中的应用；所述生物材料为下述(c)或(d)：

(c)编码权利要求1中所述蛋白质的基因；

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述基因为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

4.权利要求1中所述蛋白质或权利要求2中所述生物材料在植物育种中的应用。

5.培育雄性不育植物的方法，包括降低植物中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性得到雄性不育植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法包括抑制编码权利要求1中所述蛋白质的基因的表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法通过对编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子进行突变实现。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述突变采用CRISPR/Cas9方法实现。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法中所用靶DNA为靶DNA1和/或靶DNA2；

所述靶DNA1为序列表中序列2的第113-132位所示的DNA；

所述靶序列2为序列表中序列2的第423-442位所示的DNA。

10.根据权利要求1-4中任一所述的应用或权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。