CN108977459A - 一种植株突变体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；T2.农杆菌转化；T3.基因敲除检测；T4.转基因植株表型鉴定。本发明植株突变体的制备方法方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。

Description

一种植株突变体的制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物血植物不育突变体创制技术领域，特别涉及一种植株突变体的制备方法。
背景技术
雄性不育性是与作物杂种优势利用密切相关的重要性状。水稻是利用杂种优势最为成功的作物之一，也是迄今发现雄性不育多样性最为丰富的作物之一。雄性不育系成为杂种优势利用的最有效武器，其中三系”法是我国推广杂交水稻最早，也是最普遍的一种育种和制种方法，“三系法”主要是利用了核质互作雄性不育系统，完成了“恢复系”、“保持系”和“繁殖系”的三系配套。
其中的不育是由细胞质的遗传物质和细胞核的遗传物质共同决定。而光温敏雄性不育系材料为基础的“两系法”，虽然它打破了恢保关系的限制，极大的提高了配组自由度，繁殖和配组程序也极大的简化，但育性的转换收环境温度和光照的影响，制种风险较大，这也是两系杂交育种无法大面积推广的原因。
自1966年袁隆平先生报道隐性核不育水稻后，相继发现了许多不育材料。这类不育材料的共同特点是不育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。针对这一问题，科学家们一直在研究利用分子设计方法，解决不育系繁殖的难题，也先后提出了一些解决方案。
针对解决隐性核雄性不育材料的繁殖问题，1993年6月11日，PLANT GENETICSYSTEM公司(Albertsen)提出了一项PCT专利申请，该专利提出了一种技术思想：在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因、花粉失活(败育)基因以及用于筛选的标记基因，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。
2002年，Perez-Prat等人提出，除了利用上述三套元件的思想可以实现不育系创制和繁殖以外，还可以通过在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因和用于筛选的标记基因两套元件，由此也可以获得该雄性不育植株的保持系，并进一步繁殖不育系(Perez-Prat，2002)。
这些报道提出了利用分子生物学技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的繁殖问题，为开展分子设计杂交育种提供了新的思想。
以上分子设计育种的新思想基于的是水稻细胞核上一对控制育性的基因。当此基因发生突变后，成为无功能的基因后，水稻花粉发育形成的过程受阻，从而产生无活性或不产生花粉，最终表现为不育。因此，突变体的获取是后续基因改造的基础，如何获取育性基因突变的突变体成为制约此项工作的关键点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种植株突变体的制备方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：
T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；
T2.农杆菌转化；
T3.基因敲除检测；
T4.转基因植株表型鉴定。
所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：
5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’
5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种敲除基因中使用的sgRNA序列，其序列结构如下：
5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’
5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如所述敲除基因中使用的sgRNA序列，在构建基因敲除载体中的应用。
所述步骤T2中用到的培养基包括：
筛选培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；Hyg 20-25mg/L，Timentin 200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；
分化培养基：NB；Pro 0.3-0.5g/L；CH 0.2-0.3g/L；6-BA 1.8-2.0mg/mL；KT 0.8-1.0mg/mL；NAA 0.3-0.5mg/mL，IAA 0.4-0.5mg/mL；Hyg 20-25mg/L；Timentin 200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L；
生根培养基：NB；NAA 0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
含有CYP78A13基因敲除载体质粒的农杆菌在28℃固体YEB培养基上暗培养2天后，用适量100μM/L乙酰丁香酮的培养基将农杆菌洗脱；
调整菌液浓度至OD600nm＝0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液；
取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃中暗培养3天。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
3天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体
用含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干；
第二天转移至选择培养基筛选抗性愈伤。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
每两周将愈伤转移至新的选择培养基上，18-24天可见瘤状抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出；
抗性愈伤继续继代于附加潮霉素50mg/l的选择培养基中，观察其色泽，一周后将颜色鲜黄的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，无光泽，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
待抗性愈伤在筛选培养基上筛选3-5d后，挑选部分转移至分化培养基上；
二周后抗性愈伤出现绿芽，3周后长出幼芽，随后根也长出；
将幼苗移至生根培养基上；
待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至大田栽种。
所述步骤T4.转基因植株表型鉴定，进一步包括：花粉活力检测：转基因阳性植株花粉活性丧失；从株型上看，转基因植株呈现植株营养生长延长，抽穗慢或抽穗不彻底。
本发明有益效果包括：提供了一种植株突变体的制备方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。
附图说明
图1为本发明实施例所述花粉活力检测结果；其中，左图是对照植株，右图是转基因植株；
图2为本发明实施例所述育性表现图；其中，左图为对照植株；右图是CYP78A13基因被敲除的植株。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：
T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；
T2.农杆菌转化；
T3.基因敲除检测；
T4.转基因植株表型鉴定。
所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：
5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’
5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种敲除基因中使用的sgRNA序列，其序列结构如下：
5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’
5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如所述敲除基因中使用的sgRNA序列，在构建基因敲除载体中的应用。
所述步骤T2中用到的培养基包括：
筛选培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；Hyg 20-25mg/L，Timentin 200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；
分化培养基：NB；Pro 0.3-0.5g/L；CH 0.2-0.3g/L；6-BA 1.8-2.0mg/mL；KT 0.8-1.0mg/mL；NAA 0.3-0.5mg/mL，IAA 0.4-0.5mg/mL；Hyg 20-25mg/L；Timentin 200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L；
生根培养基：NB；NAA 0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
含有CYP78A13基因敲除载体质粒的农杆菌在28℃固体YEB培养基上暗培养2天后，用适量100μM/L乙酰丁香酮的培养基将农杆菌洗脱；
调整菌液浓度至OD600nm＝0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液；
取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃中暗培养3天。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
3天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体
用含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干；
第二天转移至选择培养基筛选抗性愈伤。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
每两周将愈伤转移至新的选择培养基上，18-24天可见瘤状抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出；
抗性愈伤继续继代于附加潮霉素50mg/l的选择培养基中，观察其色泽，一周后将颜色鲜黄的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，无光泽，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。
所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
待抗性愈伤在筛选培养基上筛选3-5d后，挑选部分转移至分化培养基上；
二周后抗性愈伤出现绿芽，3周后长出幼芽，随后根也长出；
将幼苗移至生根培养基上；
待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至大田栽种。
所述步骤T4.转基因植株表型鉴定，进一步包括：花粉活力检测：转基因阳性植株花粉活性丧失；从株型上看，转基因植株呈现植株营养生长延长，抽穗慢或抽穗不彻底。
本发明植物不育突变体的创制，具体涉及一种利用基因敲除技术，构建基因敲除载体，并利用农杆菌介导的方法，将载体介导入胚性细胞中，从而获得育性基因被沉默的细胞，并发育成完整的突变体的方法。
突变体载体创制实验步骤
1、CRISPR/cas9载体的构建
(1)本发明实施例所用基因为CYP85A5基因，sgRNA序列设计如下：
5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’
5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’
2、按照唯尚立德试剂盒(Catelog.NO.Vk005-103)中的实验步骤，完成载体的构建，并完成农杆菌的转化。
3、水稻转基因过程中用到的培养基配方
诱导培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；琼脂粉10-15g/L；
继代培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；CH 0.2-0.3g/L；蔗糖28-30g/L；琼脂粉10-15g/L；
共培养培养基：NB；AS 100-200umol/L；
筛选培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；Hyg 20-25mg/L，Timentin 200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；
分化培养基：NB；Pro 0.3-0.5g/L；CH 0.2-0.3g/L；6-BA 1.8-2.0mg/mL；KT 0.8-1.0mg/mL；NAA 0.3-0.5mg/mL，IAA 0.4-0.5mg/mL；Hyg 20-25mg/L；Timentin 200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L；
生根培养基：NB；NAA 0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L
农杆菌培养所需的YEB培养基：酵母提取物0.8-1.2g/L；蛋白胨4.5-5.0g/L；牛肉膏4.5-5.0g/L；蔗糖4.0-6.0g/L；硫酸镁0.3-0.5g/L；琼脂12-15g/L；pH 6.8-7.2；
生根培养基：NB；NAA 0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L
4、水稻转基因实验操作步骤为：
1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；
2)侵染：将1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于2(指的是实验步骤2中的制备好的农杆菌，将此农杆菌经过活化培养后，获得农杆菌菌悬液)中获得的农杆菌悬浮液中侵染，之后晾干待用；
3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，培养至愈伤组织表面出现菌体；
4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织；
5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上培养至分化出幼苗；
6)生根：将幼苗接种到生根培养基上生根，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株作为转化得到的植株；
含有CYP78A13基因敲除载体质粒的农杆菌在28℃固体YEB培养基上暗培养2天后，用适量添加有100μM/L乙酰丁香酮的培养基将农杆菌洗脱。调整菌液浓度至OD600nm＝0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液。取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃中暗培养3天。
3天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干。第二天转移至选择培养基(添加250mg/L羧卞青霉素，以及30mg/L潮霉素)筛选抗性愈伤。
每两周将愈伤转移至新的选择培养基上，约需三周即可见瘤状抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出。抗性愈伤继续继代于附加潮霉素50mg/l的选择培养基中(可不加羧卞青霉素)，观察其色泽，一周后将颜色鲜黄的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，无光泽，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。
待抗性愈伤在筛选培养基上筛选3-5d后，挑选一部分转移至分化培养基上。2周后抗性愈伤开始出现绿芽，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至大田栽种。
4、基因敲除检测
取再生苗，剪取100mg的鲜嫩的叶片，利用CTAB法提取DNA，具体步骤如下：
(1)取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5ml Eppendorf管中；
(2)加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；
(3)小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μl)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；
(4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。
(5)重复步骤(4)1-2次，以蛋白层不出现为止；
(6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，离心10min；
(7)弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；
(8)室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。
(2)以上述提取的DNA为模板，以：F 5’AGGGAGCTCTCTTGCGCCGC 3’/R 5’CGTCCTCGCCGCGCTCCTCCTG 3’按照以下体系和程序进行片段扩增，并检测阳性植株。
(6)扩增程序：
实验结果
扩增结束后，对PCR产物进行测序，测序结果与原有系列进行比对分析，发现在靶位点设置区域有两个碱基的突变。
5、转基因植株表型鉴定
花粉活力检测，转基因阳性植株花粉活性丧失。从株型上看，转基因植株呈现植株营养生长延长，抽穗慢或抽穗不彻底。
(1)取阳性植株上成熟的花药于载玻片上，加一滴蒸馏水
(2)用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加一滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察，凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。镜检结果如图1所示。图1为本发明实施例中花粉活力检测结果。其中，左图是对照植株，右图是转基因植株。图2是育性表现图，其中：左图为对照植株；右图是CYP78A13基因被敲除的植株。CYP78A13基因序列如序列表中序列1所示。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。
序列表
<110> 青岛袁策集团有限公司
<120> 一种植株突变体的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2036
<212> DNA
<213> Oryza glaberrima
<400> 1
acgtcttctt cctcccaaga aaactcctct cacttcgcga acgcttccca tggcgctctc 60
ctccatggcc gcggcgcaag agagctccct cctcctcttc ctcctcccga cgtcggccgc 120
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gcgccgcgtg gccgggtccg cgcccgagcg cgaggccatc ggcgcccgca tagtcggcga 600
cgtcgcctcc ctcatgtccc gccgcggcga ggtccccctc cgccgcgtcc ttcacgccgc 660
gtcgctcggc cacgtcatgg cgaccgtctt cggcaagcgg cacggcgaca tctcgatcca 720
ggacggcgag ctcctggagg agatggtcac cgaagggtac gacctcctcg gcaagttcaa 780
ctgggccgac cacctgccat tgctcaggtg gctcgacctc cagggcatcc gccgccggtg 840
caacaggcta gtccagaagg tggaggtgtt cgtcggaaag atcatacagg agcacaaggc 900
gaagcgagct gccggaggcg tcgccgtcgc cgacggcgtc ttgggcgact tcgtcgacgt 960
cctcctcgac ctccagggag aggagaagat gtcagactcc gacatgatcg ctgttctttg 1020
ggtaagtctc ctcgtcgtcg tcttcgtcgt aaagcttgag aaggaaacgt ccatggcgtt 1080
ttcatggatt ggtttcttgt ttttttcttc aggagatgat ctttagaggg acggacacgg 1140
tggcgatctt gatggagtgg gtgatggcga ggatggtgat gcacccggag atccaggcga 1200
aggcgcaggc ggaggtggac gccgccgtgg ggggacgccg cggccgcgtc gccgacggcg 1260
acgtggcgag cctcccctac atccagtcca tcgtgaagga gacgctgcgc atgcacccgc 1320
cgggcccgct cctgtcgtgg gcgcgcctcg ccgtgcacga cgcgcgcgtc ggtggccacg 1380
ccgtccccgc cgggacgacg gcgatggtga acatgtgggc gatcgcccac gacgccgccg 1440
tctggccgga gccggatgcg ttccgcccgg agcgcttctc ggagggggag gacgtcggcg 1500
tgctcggcgg cgacctccgc ctcgcgccgt tcggcgccgg ccgccgcgtc tgccctggca 1560
ggatgctggc gctcgccacc gcccacctct ggctcgccca gctgctgcac gccttcgact 1620
ggtcccccac cgccgccggc gtcgacctgt ccgagcgcct cggcatgtcg ctggagatgg 1680
cggcgccgct cgtgtgcaag gccgtggcta gggcctgagc cctagccgcc gccgccgcca 1740
ttattgccat tgatgtggct agcgacgttg tcgtgctcgc atccatactc ctccataggc 1800
aactcgtcta gccaatgaag aaagctacta tctatctatc tatcaagcta gctgctacta 1860
tcacaaaccg catttcggca tcatcttaaa ttagctctta ggggtgtagg cgattttggt 1920
ttcccccaaa aatttgcttt gccagtcttt tggtttaaat cgaggcatta gttgtgaaac 1980
atcatgagaa gttatttaaa tctgaggaat tttgtttgaa ccttttctgg tgtgct 2036

Claims (10)

1.一种植株突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；
T2.农杆菌转化；
T3.基因敲除检测；
T4.转基因植株表型鉴定。
2.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：
5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’
5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。
3.一种敲除基因中使用的sgRNA序列，其特征在于，其序列结构如下：
5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’
5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。
4.一种如权利要求3所述敲除基因中使用的sgRNA序列，在构建基因敲除载体中的应用。
5.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2中用到的培养基包括：
筛选培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；Hyg 20-25mg/L，Timentin200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；
分化培养基：NB；Pro 0.3-0.5g/L；CH 0.2-0.3g/L；6-BA 1.8-2.0mg/mL；KT 0.8-1.0mg/mL；NAA 0.3-0.5mg/mL，IAA 0.4-0.5mg/mL；Hyg 20-25mg/L；Timentin 200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L；
生根培养基：NB；NAA 0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L。
6.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
含有CYP78A13基因敲除载体质粒的农杆菌在28℃固体YEB培养基上暗培养2天后，用适量100μM/L乙酰丁香酮的培养基将农杆菌洗脱；
调整菌液浓度至OD600nm＝0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液；
取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃中暗培养3天。
7.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
3天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体
用含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干；
第二天转移至选择培养基筛选抗性愈伤。
8.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
每两周将愈伤转移至新的选择培养基上，18-24天可见瘤状抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出；
抗性愈伤继续继代于附加潮霉素50mg/l的选择培养基中，观察其色泽，一周后将颜色鲜黄的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，无光泽，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。
9.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：
待抗性愈伤在筛选培养基上筛选3-5d后，挑选部分转移至分化培养基上；
二周后抗性愈伤出现绿芽，3周后长出幼芽，随后根也长出；
将幼苗移至生根培养基上；
待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至大田栽种。
10.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T4.转基因植株表型鉴定，进一步包括：花粉活力检测：转基因阳性植株花粉活性丧失；从株型上看，转基因植株呈现植株营养生长延长，抽穗慢或抽穗不彻底。
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