CN108949774A - 一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法 - Google Patents

一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，首先在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体MsCRISPR/Cas9:PALM1，导入紫花苜蓿细胞并再生成苗，通过剪切后修复造成紫花苜蓿细胞MsPALM1基因出现功能缺失突变，再通过对再生株系基因组目标片段的限制性内切酶酶切和/或靶点深度测序筛选突变植株，获取携带四个等位MsPALM1基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，确认再生植株复叶由三片小叶转为五片小叶。实验表明，本方法可快速获得多叶型紫花苜蓿材料，育种周期短，所获材料除变为五出羽状复叶之外其他农艺性状不变，性状稳定，可快速获得四个等位基因均突变的可稳定遗传的纯合突变体。

Description

一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料 的方法
技术领域
本发明属于紫花苜蓿生物技术育种领域，具体涉及一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.),是一种栽培历史悠久的多年生优质豆科牧草，具有适应性强、营养价值高、种植区域广、生态功能齐全、经济效益高等特点。它是多年生豆科牧草，是世界上种植面积最大的牧草品种，素有“牧草之王”的美誉。紫花苜蓿在我国已有两千多年的栽培历史，目前，我国紫花苜蓿种植的留床面积约146.7万多公顷。目前生产水平：干草产量平均13-17t/hm2，种子产量平均为375-600kg/hm2。所以说，中国的草产业主要是紫花苜蓿的产业化，其在农业和畜牧业发展中具有十分重要的价值和地位。培育产草量和蛋白质含量高的品种，对促进我国牧草优质生产和畜牧业发展具有重要意义。
紫花苜蓿的蛋白质含量主要集中于叶片中，且叶片性状与产量性状相关。紫花苜蓿的叶子一般为三出羽状复叶，检测数据显示：紫花苜蓿60-70％的粗蛋白质和90％的维生素存在于叶片中，因此优质苜蓿应该是多叶的。由此确定了我们的育种目标为多叶性状，即通过变异获得具有多于3个小叶的多出羽状复叶的苜蓿被称为多叶型苜蓿。苜蓿多叶性状被认为具有高产和优质的潜力，培育多叶性状的优良苜蓿对开发与利用高品质苜蓿具有重要作用。苜蓿的多叶性状在自然界中也有发现，已有研究结果表明：多叶型苜蓿与三叶型苜蓿相比，其光合效率、比叶重、茎叶比等生长特性明显增加；此外，苜蓿多叶性状能增加苜蓿的叶面积，苜蓿产草量与叶面积呈正相关；多叶型苜蓿品系产草量明显高于三叶型苜蓿品种；但是苜蓿的多叶性状不稳定，苜蓿多叶性状存在隐藏现象。
虽然多叶型材料品系在紫花苜蓿优质新品种培育具有广阔的应用前景，但是天然的遗传突变资源有限，且紫花苜蓿是异花授粉的同源四倍体植物，具有自交不亲和的特性，通过传统的杂交技术获得纯合的可稳定遗传的紫花苜蓿新品种，育种周期漫长，可行性不高。经检索，专利号为CN104737899B-一种航天诱变多叶型紫花苜蓿选育方法的专利，选育出我国第一个航天诱变多叶型紫花苜蓿新品种，但是这种方法成本高，条件要求十分苛刻，多代杂交选育，反复筛选，而且不稳定，所耗费时间长，可重复操作性不强。
在紫花苜蓿的近源物种蒺藜苜蓿的研究成果中，我们发现调控叶原基发育的主效基因是PALM1基因，该基因为单拷贝的具有单一外显子的基因，该基因的隐性纯合突变体具有五出羽状复叶。高效的定点基因编辑技术同时沉默紫花苜蓿的四个等位的MsPALM1基因可能快速创制出具有多叶性状的可稳定遗传的紫花苜蓿新品种。因此，我们希望获得一种利用紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，同时沉默紫花苜蓿的四个等位的MsPALM1基因，快速定向获得多叶型紫花苜蓿材料。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，该方法包括以下步骤：
步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区选取靶标片段；其中，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；
步骤(2)按照靶标序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述MsCRISPR/Cas9::PALM1载体包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述靶标片段；
步骤(3)将所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1导入紫花苜蓿细胞，使所述sgRNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在紫花苜蓿细胞中共同表达，剪切MsPALM1基因的双链的所述靶标片段，诱发所述紫花苜蓿细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基造成移码突变，实现细胞内MsPALM1基因的功能缺失突变；
步骤(4)，用步骤3中所述的紫花苜蓿细胞再生植株；
步骤(5)，将步骤4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA区段进行PCR扩增后，进行限制性内切酶酶切和/或靶点深度测序；
步骤(6)，选择四个等位基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的复叶表型，挑取所有复叶完全表现多于3个小叶的植株，作为所创制的多叶型紫花苜蓿材料。
优选地，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’-G(N)x-NGG-3’结构，其中，(N)x表示数目为x的一条碱基序列{N1,N2······Nx},N1,N2······Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。X一般为18或19。
优选地，所述sgRNA表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核苷酸序列如Seq IDNO.1所示；所述Cas9核酸酶表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核苷酸序列如Seq IDNO.2所示。也可以说，另一方面本发明还提供了这种重组载体。
优选地，所述sgRNA表达框包括：蒺藜苜蓿MtU6启动子，其核苷酸序列如Seq IDNO.1第1至500位所示；结构特征为G(N)x的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID NO.1第501至606位所示；和Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID NO.1第607至615位所示，
所述Cas9核酸酶表达框包括：CaMV 35S启动子，其核苷酸序列如Seq ID NO.2第1至345位所示；Cas9编码序列，Seq ID NO.2第487至4756位所示；以及tNOS终止子，Seq IDNO.2第4794至5046位所示。
优选地，所述sgRNA表达框包括CRISPR RNA序列，其具有所述靶标片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或与之互补的序列。
优选地，所述靶标片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或与之互补的序列包含序列：5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGG-3’，该序列为MsPALM1基因单一外显子中自翻译起始密码子ATG后第323-343位的核苷酸序列5’-CCGCGACCGTGCTCGTCTCC-3’的反向互补序列。
在所选的MsPALM1基因外显子上，具有所述5’-G(N)x-NGG-3’结构的片段可选为靶标的共有19个。
步骤6中所提到的功能缺失突变指的是正常MsPALM1编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
所述Cas9核酸酶表达框位于包含在所述sgRNA表达框的同一载体中。
在步骤3中将所获重组载体导入苜蓿细胞，从而使细胞同时含有步骤所述靶标片段的sgRNA，Cas9核酸酶。在sgRNA和Cas9核酸酶的共同作用下，MsPALM1基因的双链靶标片段被剪切，再通过苜蓿细胞自身的DNA修复功能，最终实现细胞内MsPALM1基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
所述方法中，将重组载体导入苜蓿细胞的方法为农杆菌介导的紫花苜蓿愈伤组织稳定转化。由于在将所获重组载体导入紫花苜蓿细胞的过程中，是采用农杆菌介导的方法，重组载体被导入到紫花苜蓿的遗传DNA中，所以在进行剪切时使得紫花苜蓿的遗传DNA的片段受到剪切。
在本发明中，所述再生植物的方法为细胞或组织经过组织培养，获得植株。
在步骤5中，可以通过基因组PCR方法克隆再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA片段，并对扩增产物进行限制性内切酶酶切和/或靶点深度测序。所述基因组PCR方法为，针对包含靶标片段的基因组区域，设计位点特异性引物，以再生植株的基因组DNA为模板，扩增所述包含靶标片段的基因组区域。所述扩增产物的限制性内切酶酶切是指，使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物后回收包含靶标片段的DNA片段，用限制性内切酶酶切回收的包含靶标片段的DNA片段并再次进行琼脂糖凝胶电泳，所得的不能被限制性内切酶酶切的条带即为在靶标位点发生突变的条带。所述靶点深度测序是指，将上述不能被限制性内切酶酶切的条带连接pMD19-T载体后进行深度测序，或者直接将PCR产物连接pMD19-T载体后进行深度测序。
所述四个等位MsPALM1基因都出现功能缺失突变是指回收的包含靶标片段的DNA片段均不能被限制性内切酶酶切，且测序结果在MsPALM1基因靶标位点出现四种功能缺失突变序列，没有出现野生型序列；或者，PCR产物测序结果中在MsPALM1基因靶标位点出现四种功能缺失突变序列，没有出现野生型序列。
其中所述功能缺失突变序列指的是正常MsPALM1编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
进一步地，所述靶标片段中包含一个BstUⅠ限制性内切酶酶切位点。
进一步的，本发明还保护紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1人工定点突变体在紫花苜蓿育种和基因编辑紫花苜蓿育种中的应用。
采用本发明的育种方法，能够快速创制出多叶型的紫花苜蓿品种，时间短，效果明显。
具体而言，相对于传统育种方法，本方法有以下优点：
①，育种周期短，整个材料定向创制过程可在7个月内完成，而传统杂交方法至少需要3-5年时间。
②，只改变了受体品种的一个基因，所获材料除变为五出羽状复叶之外其他农艺性状不变，而传统杂交方法会导入与MsPALM1连锁的其他基因，可能影响受体品种的农艺性状。
③，在严格异花授粉的同源四倍体紫花苜蓿中，可快速获得四个等位基因均突变的可稳定遗传的纯合突变体，传统杂交方法很难获得可稳定遗传的纯合突变体。
附图说明
图1为将含有PALM1基因靶点的MsCRISPR/Cas9::PALM1表达载体的根癌农杆菌侵染紫花苜蓿获得的再生植株，经PCR-RE检测筛选突变植株的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为紫花苜蓿野生型与突变型植株PALM1基因PCR产物测序部分结果；
图3为将含有PALM1基因靶点的CRISPR/Cas9表达载体的根癌农杆菌侵染紫花苜蓿获得的野生型与突变型植株的叶片表型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面描述本发明的一个实施例中所采用的育种方法
一、用于紫花苜蓿MsPALM1基因打把的重组载体的制备。
1.1，选择紫花苜蓿苜蓿MsPALM1基因(HM038483)的单一外显子中自翻译起始密码子ATG后第323-343位的核苷酸序列5’-CCGCGACCGTGCTCGTCTCC-3’的反向互补序列5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGG-3’作为打靶位点,该序列后面为PAM序列“CGG”。该序列中包含一个BstUⅠ限制性内切酶酶切位点。
1.2，按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(MsPA1_1F)和可与之互补的反向寡核苷酸链(MsPA1_1R)，
具体序列为：
MsPA1_1F:TTTGGAGACGAGCACGGTCGCGG
MsPA1_1R:AAACCCGCGACCGTGCTCGTCTC
其中未被下划线标注的部分为上述靶位点中取出NGG的序列或互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。
1.3，经过退火程序，将MsPA1_1F和MsPA1_1R两链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。
1.4，用AarI内切酶(NEB公司)在37℃酶切包含能够在苜蓿细胞内表达的sgRNA表达框(核苷酸序列如Seq ID NO.1所示)和能够在苜蓿细胞内表达的Cas9核酸酶表达框的苜蓿CRISPR/Cas9双元表达载体MsCRISPR/Cas9(核苷酸序列如Seq ID NO.2所示)，使用AarI内切酶切紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因工程载体8小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。
1.5，用T4DNA连接酶(NEB公司)将MsCRISPR/Cas9载体骨架片段和插入片段相连构建针对MsPALM1打靶的载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，转入大肠杆菌中。经测序验证后，提取阳性转化子，构成用于紫花苜蓿MsPALM1基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体MsCRISPR/Cas9::PALM1。
农杆菌稳定转基因介导的紫花苜蓿MsPALM1基因打靶和多叶型紫花苜蓿材料的获得。
2.1，利用冻融法将上面获得的所述用于紫花苜蓿MsPALM1基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体MsCRISPR/Cas9::PALM1转入根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(广东三杰牧草生物科技有限公司保存)，获得阳性克隆。
2.2，取苜蓿品种成熟种子，用无菌水清洗5遍，用75％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精，用无菌水清洗5遍，用0.1％升汞溶液浸泡20min，用无菌水清洗5遍。将种子接种于发芽培养基上。26-28℃光照培养7天，等两片子叶刚开张开时，将子叶和胚轴切下用于农杆菌转化。
2.3，采用上述转入了重组表达载体的根瘤农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，具体的转化方式如下：
1.紫花苜蓿种子萌发：挑选饱满、色泽圆润的紫花苜蓿种子，75％酒精浸泡2分钟，无菌水洗两次，每次1分钟；0.1％升汞浸泡并手摇10分钟，无菌水洗五次。将灭菌种子摊开于含滤纸的无菌大培养皿中，风干。接种于MS固体培养基上，光照培养箱或培养室中萌发7-14天；
2.愈伤组织诱导：取上述萌发苗的子叶和下胚轴，无菌手术刀切成小块，接种于愈伤诱导培养基中，25±1℃培养箱或培养室中暗培养3天。愈伤诱导培养基成分为：SH基础培养基+2mg/L 2,4-D+0.2mg/L KT+0.3mg/L水解络蛋白+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；；
3.侵染：提前1-2天将上述制备的根癌农杆菌菌株接种于50-100ml的YM液体培养基中，28℃摇床上200r/min培养至OD值260/280在0.5-0.8之间；将菌液转移到50ml无菌离心管中，离心机中4℃条件下4000r/min离心12分钟，取出离心管，弃上清液，加入重悬液重悬至OD值260/280在0.5-0.8之间，依据每升加入100umol乙酰丁香酮加入对应体积的100umol/ml的乙酰丁香酮，重悬液为MS液体培养基(MS+30g/L蔗糖)；将步骤2中诱导的外殖体收集到带透气塑料封口膜的100ml无菌三角瓶，倒入适量重悬后的菌液(能没过材料即可)，用三角瓶自带的封口膜封口，真空泵中抽真空到0.5kpa，一共抽1h，期间每15min的时候轻轻摇晃一下；取出三角瓶，28℃摇床上120r/min摇1h，倒干菌液，将材料摊开在铺了滤纸的无菌培养皿中晾干；
4.共培养：将上述晾干的侵染过的材料接种于共培养培养基(培养基中铺一张灭菌滤纸)，共培养培养基成分为：MS基础培养基+2mg/L 2,4-D+0.2mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+100umol/L乙酰丁香酮。25±1℃培养箱或培养室中暗培养3天。
5.筛选：将上述共培养材料接种于筛选培养基,筛选培养基成分为：SH基础培养基+2mg/L2,4-D+0.2mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+250mg/L头孢噻亏+250mg/L羧苄青霉素+15mg/L潮霉素；25±1℃培养箱或培养室中光照培养30-60天；
6.分化：将上述恢复的材料转接至分化培养基，分化培养基成分为：UM基础培养基+2g/L水解络蛋白+0.4mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+250mg/L头孢噻亏+5mg/L潮霉素；25±1℃培养箱或培养室中光照培养15-30天；
7.生根：将上述分化出的1-3cm的芽转接至生根培养基，生根培养基成分为：MS基础培养基+1mg/L IBA+15g/L蔗糖+8g/L琼脂+250mg/L头孢噻亏。
共获得25株再生紫花苜蓿植株。
2.4，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取所获25株含有所述紫花苜蓿MsPALM1基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体的转基因苜蓿植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用ExTaq DNA聚合酶(Takara公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为：
MsPA1genome F:AATTTCATCCCCCACCCCATTA
MsPA1genome R:TTCTCCACACACTGAAAAAGAGAGA
2.5，以BstUⅠ限制性内切酶(NEB公司)对所获PCR扩增片段进行酶切，筛选突变株。酶切结果表明，在所测25株植株中，13株带有MsPALM1基因靶标序列上的突变，突变效率为52％，结果如图1所示，其中四个等位MsPALM1基因都出现功能缺失突变的再生株系为3株，同时出现等位基因功能缺失突变的效率为12％。
2.6，将不能被BstUⅠ限制性内切酶酶切的条带进行TA克隆连接pMD19-T载体(Takara公司)并转化大肠杆菌DH5ɑ(广东三杰牧草生物科技有限公司保存)，挑选10个单克隆，使用M13F通用引物对单克隆测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在上述筛选所得的突变植株中，均存在靶标位点的突变。部分结果如图2所示(图中阴影部分，即第10位开始的CCGCGACCGTGCTCGTCTCC为打靶的目标位)突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。
2.7，观察具有四个等位MsPALM1基因都出现功能缺失突变的再生植株的复叶表型，其中3株紫花苜蓿的复叶明显表现为五出羽状复叶，表明所述3株具有四个等位MsPALM1基因都出现功能缺失突变的转基因株系为所定向创制多叶型紫花苜蓿材料，见图3。
相对于传统育种方法，本方法有以下优点：
①，育种周期短，整个材料定向创制过程可在7个月内完成，而传统杂交方法至少需要3-5年时间。
②，只改变了受体品种的一个基因，所获材料除变为五出羽状复叶之外其他农艺性状不变，二传统杂交方法会导入与MsPALM1连锁的其他基因，可能影响受体品种的农艺性状。
③，在严格异花授粉的同源四倍体紫花苜蓿中，可快速获得四个等位基因均突变的可稳定遗传的纯合突变体，传统杂交方法很难获得可稳定遗传的纯合突变体。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东三杰牧草生物科技有限公司
<120> 一种利用CRISPR/Cas9系统获得多叶型紫花苜蓿材料的方法
<130> 20180621
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atccaacatt tcacttgagt taactcaata gcaagaataa cgtccatagt ttcagcattc 60
aagcaaaacg gccaagaaaa tcagcttggt aatttcagtg agacctggac taccataagc 120
agcaccgcct attacactta atggggtaaa gtaaaacgag ccacatcacc tccttgattt 180
taaggagcat ttgaaggagt ataaaaagaa tgtatgtaat gtaaggttgt gttgtgtcat 240
tcaagatagc aagacggacc aaagcttcta tgtatctatc tatgtctatg atatgatgat 300
tgtattgatt tggtttgagt acagtgaggg agagggagga acttcttcac ttgtttattt 360
aacctgaaac tcaactcaaa tcactgagag tgaatgttga gaaataagta ttatgttatg 420
tttgctttgc tattagtccc acatcgctta catatacttc agttatattg tttatatagc 480
ctagacgaac agcagggttt ggctcgcagg tgaacacaac acctgcacac gttttagagc 540
tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt 600
cggtgctttt ttttt 615
<210> 2
<211> 5048
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgagactttt caacaaaggg tgatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 120
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240
ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 300
agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacctcga cctcaacaca 360
acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc tacttctatt gcagcaattt 420
aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt ttcaccattt acgaacgata 480
ctcgagatgg actataagga ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa 540
gacgatgacg ataagatggc cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca 600
gcagccgaca agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc 660
gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg caacaccgac 720
cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc 780
gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc 840
tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac 900
agactggaag agtccttcct ggtggaagag gataagaagc acgagcggca ccccatcttc 960
ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga 1020
aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc 1080
cacatgatca agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc 1140
gacgtggaca agctgttcat ccagctggtg cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac 1200
cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc 1260
agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg cctgttcgga 1320
aacctgattg ccctgagcct gggcctgacc cccaacttca agagcaactt cgacctggcc 1380
gaggatgcca aactgcagct gagcaaggac acctacgacg acgacctgga caacctgctg 1440
gcccagatcg gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc 1500
atcctgctga gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc 1560
tctatgatca agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg 1620
cggcagcagc tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa gaacggctac 1680
gccggctaca ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat caagcccatc 1740
ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg 1800
cggaagcagc ggaccttcga caacggcagc atcccccacc agatccacct gggagagctg 1860
cacgccattc tgcggcggca ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag 1920
atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac 1980
agcagattcg cctggatgac cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag 2040
gaagtggtgg acaagggcgc ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac caacttcgat 2100
aagaacctgc ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc 2160
gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc 2220
ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg 2280
accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa 2340
atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa 2400
attatcaagg acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc 2460
gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat 2520
gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata caccggctgg 2580
ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg caagacaatc 2640
ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct gatccacgac 2700
gacagcctga cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc 2760
ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag 2820
acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc 2880
gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag 2940
agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct gaaagaacac 3000
cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg 3060
cgggatatgt acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac 3120
catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga 3180
agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg 3240
aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat 3300
ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt catcaagaga 3360
cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg 3420
aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag 3480
tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac 3540
aactaccacc acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa 3600
aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg 3660
aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac 3720
agcaacatca tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag 3780
cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat 3840
tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag 3900
gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg 3960
atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg 4020
gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt 4080
gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc 4140
gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct 4200
aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa 4260
ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc 4320
agccactatg agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg 4380
gaacagcaca agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga 4440
gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat 4500
aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga 4560
gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc 4620
aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg 4680
atcgacctgt ctcagctggg aggcgacaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag 4740
gcaaaaaaga aaaagtaagg atcctgattg atcgatagag ctcgaatttc cccgatcgtt 4800
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 4860
tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 4920
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 4980
aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 5040
tagatcgg 5048

Claims (9)

1.一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区设计靶序列；其中，所述靶序列的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；
步骤(2)按照靶序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述MsPALM1靶标片段；
步骤(3)将所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1通过根癌农杆菌转化导入紫花苜蓿细胞，使所述sgRNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在紫花苜蓿细胞中共同表达，剪切MsPALM1基因的双链的所述靶标片段，诱发所述紫花苜蓿细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内MsPALM1基因的功能缺失突变；
步骤(4)，用步骤3中所述的紫花苜蓿细胞再生植株；
步骤(5)，将步骤4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA区段进行PCR扩增后，使用限制性内切酶酶切检测和/或靶点深度测序检测；
步骤(6)，选择四个等位基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的复叶表型，挑取所有复叶完全表现多于3个小叶的植株，作为所创制的多叶型紫花苜蓿材料。
2.根据权利要求1所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’-G(N)x-NGG-3’结构，其中(N)x表示数目为x的一条碱基序列{N1,N2······Nx},N1,N2······Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。
3.根据权利要求1所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述sgRNA表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核苷酸序列如Seq IDNO.1所示。
4.根据权利要求1所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述Cas9核酸酶表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核苷酸序列如SeqID NO.2所示。
5.根据权利要求2所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述sgRNA表达框包括：蒺藜苜蓿MtU6启动子，其核苷酸序列如Seq IDNO.1第1至500位所示；结构特征为(N)x的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID NO.1第501至606位所示；和Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID NO.1第607至615位所示，
所述Cas9核酸酶表达框包括：CaMV 35S启动子，其核苷酸序列如Seq ID NO.2第1至345位所示；Cas9编码序列，Seq ID NO.2第487至4756位所示；以及tNOS终止子，Seq ID NO.2第4794至5046位所示。
6.根据权利要求3所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述sgRNA表达框包括CRISPR RNA序列，其具有所述靶标片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或与之互补的序列。
7.根据权利要求2或6所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述靶标片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或与之互补的序列包含序列：5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGG-3’，该序列为MsPALM1基因单一外显子中自翻译起始密码子ATG后第323-343位的核苷酸序列5’-CCGCGACCGTGCTCGTCTCC-3’的反向互补序列。
8.如权利要求7所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于所述靶标片段中包含一个BstUⅠ限制性内切酶酶切位点。
9.如权利要求1-8任一权利要求所述的MsPALM1人工定点突变体在紫花苜蓿育种和基因编辑紫花苜蓿育种中的应用。
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