CN115820724A - Unopened flower 1基因在调控苜蓿小叶片数量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在调控苜蓿小叶片数量中的应用或敲除所述基因在提高苜蓿小叶片数量中的应用；其中所述UNOPENED FLOWER 1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明同时还提供了一种通过敲除蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1获得小叶片数量高于野生型的转基因豆科植物的方法，实现转基因植物中约49.5％的复叶中包含有4至6个小叶片。本发明所述应用有望在培育新型豆科牧草植物品种中发挥重要的作用，此也为牧草品质改良性提供了新的理论依据和实践基础，对促进我国草业经济作物的生产具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及超长链脂肪酸合成酶基因的应用，尤其涉及蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在调控苜蓿小叶片数量中的应用。属于生物基因工程技术领域。
背景技术
豆科牧草苜蓿是世界上栽培最早、分布最广，也是最为重要的一种多年生优质牧草。但是，国产苜蓿产量少、品质差、货源不稳定，这已成为限制我国草食畜牧业和奶业发展的一个不可忽视的因素。目前我国苜蓿的商业生产正在迅速增长，但由于国内对高质量苜蓿草日益增长的巨大需求，国产苜蓿的短缺情况并没有得到缓解。因此苜蓿的产量和品质改良是我国草业、畜牧业和奶业发展的重大迫切需求。
苜蓿是以收获叶、茎为主的牧草，叶对苜蓿产草量的贡献率最多可达60％。叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是栽培管理及病虫害监测的主要对象。在苜蓿品质评价体系中，叶茎比(叶片与茎秆重量的比值)是其中一个重要的指标。苜蓿70％的蛋白质储藏于叶片中，而且叶片纤维含量仅为茎秆的1/3。因此叶茎比值越大，苜蓿的营养价值就越高，适口性就越好，同时利用价值也就相对越高。苜蓿多叶性状目前已被作为一种形态学标记，被认为具有高产和优质的潜力。选育叶量丰富、叶茎比高的苜蓿新品种一直是育种工作者追求的目标。
植物的叶发育模式分为单叶和复叶。单叶结构是指一个叶柄上只着生一个叶片，而复叶结构是指在一个叶柄上有多个小叶片着生。蒺藜苜蓿的叶为复叶结构，包括三个小叶片。苜蓿的多叶性状是由多基因控制的，其产生是一个复杂的过程而且同时还受环境的影响。到目前为止，只有少数多叶苜蓿品种被商业化。这些品种中大部分植株具有多叶性状，但植株个体多叶频率高低不均：有的植株仅数个复叶为多叶型，多数复叶仍为三出复叶；也有植株不同枝条上混杂出现多叶型复叶和三出复叶，而多叶频率高的植株则非常少见。这些缺陷导致现有的多叶型苜蓿品种在生产性能方面并未表现出明显优势。基于以上原因，对苜蓿复叶发育分子机制进行研究，通过基因工程直接提高苜蓿小叶片数量可为苜蓿优质新品系的分子设计改良和育种提供理论基础和技术手段，有助于高效、优质、高产的苜蓿新品种的培育。
超长链脂肪酸合成酶基因在植物角质层发育中起到关键作用。但是检索发现目前尚未见到有关超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在复叶物种中调控小叶片数量的报道。
发明内容
针对目前多叶苜蓿品种多叶频率不高的不足，本发明要解决的问题是提供一种蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在调控苜蓿小叶片数量中的应用。
本发明所述蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在调控苜蓿小叶片数量中的应用；其中所述蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，本发明所述敲除蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER1在提高苜蓿小叶片数量中的应用；其中所述蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENEDFLOWER 1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述的应用中：所述苜蓿优选是蒺藜苜蓿。
本发明还提供了一种通过敲除蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENEDFLOWER 1获得小叶片数量高于野生型的转基因豆科植物的方法，其特征在于：利用分子生物学方法敲除豆科植物种子或植株中的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的UNOPENEDFLOWER 1基因，获得转基因豆科植物，从而实现其小叶片数量高于野生型豆科植物。
上述的方法中：所述豆科植物优选为苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。
申请人利用特异性引物(atggctactaacgaaggtgacatg和Ttaattgagagaagcagggtatgc)，通过RT-PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆UNOPENED FLOWER 1基因；利用构建的突变体群体，筛选出了UNOPENED FLOWER 1基因的敲除突变体株系，发现基因敲除的植株的小叶片数目由三个变为四个、五个或六个(多达49.5％的叶片的小叶片数目得到了提高)，这一数据远高于目前现有的多叶苜蓿品种(约40％)。这证明，该基因参与了调控豆科植物的小叶片数量，敲除该基因可显著提高小叶片数量，得到小叶片数量高于野生型植株的转基因豆科植物。
本发明的有益效果是：首次提出了敲除蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在提高苜蓿小叶片数量中的应用。实验表明，敲除UNOPENED FLOWER 1基因可以显著增加小叶片数目。野生型的复叶包括三个小叶片，而突变体植株中约49.5％的复叶中包含有4个至6个小叶片(见图1)。同时还提供了一种通过敲除蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1获得小叶片数量高于野生型的转基因豆科植物的方法，实现转基因植物中约49.5％的复叶中包含有4至6个小叶片。预示本发明所述应用有望在培育新型豆科牧草植物品种中发挥重要的作用，此也为牧草品质改良性提供了新的理论依据和实践基础，对促进我国草业经济作物的生产具有重大意义。
附图说明
图1：蒺藜苜蓿UNOPENED FLOWER 1基因突变体的花和叶片表型分析。
其中，A-D：野生型花不同发育时期的表型；E-H：突变体花不同发育时期的表型；I：野生型叶片表型；J-L：突变体叶片表型；M：野生型和突变体叶片中小叶片数目的比较。
结果表明，敲除UNOPENED FLOWER 1基因导致花不能开放，不能结荚；还可以显著增加叶片的小叶片数目。野生型的复叶包括三个小叶片，而突变体植株中约49.5％的复叶中包含有4个至6个小叶片。
图2：蒺藜苜蓿UNOPENED FLOWER 1(UOF1)基因的克隆和表达分析。
其中，A：UNOPENED FLOWER 1基因结构及突变体中Tnt1逆转录转座子的插入位置；B：野生型和突变体中UNOPENED FLOWER 1基因的RT-PCR结果；C-I:UNOPENED FLOWER 1基因的表达模式分析。SAM，顶端分生组织；P，叶原基；TL，末端小叶原基；LL，侧生小叶原基；ST，托叶原基。
通过对proUOF1:GUS-GFP转基因植株进行GUS染色(C-D)显示UNOPENED FLOWER 1基因在成年叶和花中均有较强表达；GFP荧光观察(E-I)分析其表达模式，显示UNOPENEDFLOWER 1基因在顶端分生组织、叶原基和叶边缘的最外层细胞中表达。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。
下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、载体等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例中所述的pBGWFS7载体构建见“Mansour Karimi,Dirk Inzé,AnnDepicker.2002.GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated planttransformation.Trends Plant Sci.”一文。
实施例1蒺藜苜蓿UNOPENED FLOWER 1基因突变体的获得及表型分析
通过对蒺藜苜蓿22000个Tnt1插入的突变体进行遗传筛选，获得了四个柱头外露，花瓣不能开放的突变体株系NF15330、NF4215、NF5617和NF12035，分别命名为unopenedflower1-1(uof1-1)、uof1-2、uof1-3和uof1-4(图1E-H，2A)。
蒺藜苜蓿野生型和uof1突变体的花表型观察结果见图1。图1中，A-D为野生型花不同发育时期的表型图；E-H为uof1突变体花发育不同时期的表型图；uof1突变体由于萼片的束缚，导致花瓣不能开放，柱头伸出不能完成正常授粉，最后不能形成果荚。
此外，对蒺藜苜蓿UNOPENED FLOWER 1基因突变体植株叶片的表型进行分析，表明敲除UNOPENED FLOWER 1基因可以显著增加叶片的小叶片数目(图1I-L)。野生型的复叶包括三个小叶片，而突变体植株中约49.5％的复叶中包含有4个至6个小叶片(图1M)。
实施例2蒺藜苜蓿UNOPENED FLOWER 1基因及其编码蛋白的获得
1、提取蒺藜苜蓿野生型花的RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用引物UOF1-F和引物UOF1-R组成的引物对进行扩增，得到PCR扩增产物。
UOF1-F:GCTACTAACGAAGGTGAC；UOF1-R:ATTGAGAGAAGCAGGGTATGCA
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序，得到目标基因的编码区序列，该蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，UNOPENED FLOWER 1基因的基因组序列为3349bp，编码区CDS为1614bp，包含3个外显子和2个内含子，编码537个氨基酸(图1A)，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例3蒺藜苜蓿花不能打开表型和UNOPENED FLOWER 1基因连锁关系的确认
1、根据Tnt1突变体网站(https://medicago-mutant.dasnr.okstate.edu/mutant/index.php)公布的NF15330的侧翼序列，设计对应的引物，组成相应的引物对，即UOF1-F/LTR-6R和LTR-4F/UOF1-R，检测突变体与基因的连锁性。最终发现了一个与突变体连锁的基因UNOPENED FLOWER 1。
LTR-4F:CTCCTCTCGGGGTCGTGGTT；LTR-6R:GCTACCAACCAAACCAAGTCAA
2、NF15330(uof1-1)突变体中Tnt1插入在UNOPENED FLOWER 1基因的第二个外显子上。为了证明突变体表型是由于UNOPENED FLOWER 1基因被Tnt1插入导致，我们对该基因的另外三个突变体也进行了连锁分析。在uof1-2和uof1-3中，Tnt1分别插入在该基因的第二个外显子上；在uof1-4中，Tnt1插入在该基因的第三个外显子上(图2A)。
3、转录水平上进一步分析四个突变体中UNOPENED FLOWER 1基因的转录情况，分别提取野生型和四个突变体的总RNA，反转录成cDNA，以UNOPENED FLOWER 1CDS扩增引物UOF1-F/UOF1-R组成的引物对扩增UNOPENED FLOWER 1基因，并以引物MtActin-F(ACGAGCGTTTCAGATG)/MtActin-R(ACCTCCGATCCAGACA)组成的引物对扩增蒺藜苜蓿内参基因MtActin，进行RT-PCR，扩增产物结果显示，与野生型相比uof1突变体中UNOPENED FLOWER1基因的表达均被终止(图2B)。
实施例4蒺藜苜蓿UNOPENED FLOWER 1基因的表达模式分析
1、UNOPENED FLOWER 1基因启动子的克隆
以蒺藜苜蓿野生型DNA为模板，利用引物组合proUOF1-F/proUOF1-R，并用诺唯赞生物科技有限公司2×Phanta Max Master Mix(货号P515-01)扩增启动子片段，电泳回收获得的启动子片段。
proUOF1-F：CACCTAGACGGTCTAAAGGACCGAAG
proUOF1-R：AGTTGGAACAGCAGAATATTGTGTTTAC
2、proUOF1:GFP-GUS双元载体的构建
利用同源重组技术将UNOPENED FLOWER 1基因启动子片段连接到pBGWFS7载体中，将经测序验证正确后的载体转入农杆菌EHA105。
3、proUOF1:GFP-GUS转基因植株的获得
3.1将proUOF1:GFP-GUS载体单菌落接种于含50mg/mL利福平和50mg/mL壮观霉素的YEP液体培养基，28℃、200rpm振荡培养过夜，得到培养菌液1；
3.2将500μL培养菌液1接种于5mL YEP液体培养基，28℃、200rpm振荡培养，得到OD600nm值为0.8的培养菌液2；
3.3取培养菌液2，4000rpm离心15min，收集菌体；
3.4取生长至4周的蒺藜苜蓿R108植株的复叶，并用刀片将叶片切割4-5个切口。将所述叶片小块置于制得的菌体侵染液中，抽真空并慢摇10min，之后将所述叶片小块转移至愈伤诱导固体培养基(含有PPT植物抗性)，24℃暗培养4周，得到白色胚性愈伤组织；
3.5将白色胚性愈伤组织转移至分化培养基，24℃光培养4周，分化出绿色胚状体。将绿色胚状体转移至生根培养基，24℃光培养，生根长叶后移至蛭石中，直至成苗；
3.6利用CTAB法提取所获的含有所述proUOF1:GFP-GUS载体的转基因蒺藜苜蓿植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用引物组合proUOF1-F/GFP-R，用
DNAPolymerase鉴定阳性植株，确定得到蒺藜苜蓿转基因植株，命名为proUOF1:GFP-GUS转基因植株。
GFP-R:CGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCG
PCR所用的酶为北京全式金生物的
DNA Polymerase(目录号：AP111-01)，具体使用方法见说明书。
4、GUS染色和GFP荧光观察分析
GUS染色观察显示4周龄proUOF1:GUS-GFP转基因植株的花和叶片中GUS报告基因表达量较高(图2C-D)，表明UNOPENED FLOWER 1在蒺藜苜蓿花和叶片发育过程中起着重要的作用。利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光，显示UNOPENED FLOWER 1基因在顶端分生组织、叶原基和叶边缘的最外层细胞中表达(图2E-I)。
Claims (5)
1.蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在调控苜蓿小叶片数量中的应用；其中所述蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2.敲除蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1在提高苜蓿小叶片数量中的应用；其中所述蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述苜蓿是蒺藜苜蓿。
4.一种通过敲除蒺藜苜蓿超长链脂肪酸合成酶基因UNOPENED FLOWER 1获得小叶片数量高于野生型的转基因豆科植物的方法，其特征在于：利用分子生物学方法敲除豆科植物种子或植株中的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的UNOPENED FLOWER 1基因，获得转基因豆科植物，从而实现其小叶片数量高于野生型豆科植物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述豆科植物为苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。
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